ASSOCIACIÓ DE FARMACOLOGIA

ESTUDIO CINÉTICO PRELIMINAR DE LA CIANAMIDA EN LA RATA*

R. ÜBACH VrnAL, J. M. VALLÉS PLANA, J. DoMÉNECH BERROZPE

INTRODUCCIÓN.- La cianamida, cuya fórmula de constitución es:

N = C-NH2, es un fármaco que se utiliza en el tratamiento aversivo del

etilismo crónico. Para centrar la acción farmacológica de la cianamida en el metabolismo del alcohol, se esboza a continuación una visión muy

panorámica del proceso. El alcohol (CHlCH20H), una vez ingerido, se absorbe muy rápi­

damente a través del tracto gastrointestinal. El metabolismo del alcohol

es una oxidación cuyo primer paso es su transformación en acetaldehido,

proceso que se desarrolla en un 90 % en el hígado. La parte minoritaria restante sufre transformación oxidativa y excreción a nivel de riñón y

pulmones (excepcionalmente a través de bilis, saliva y lágrimas). El enzima responsable del paso alcohol-acetaldehido es la alcohol­

deshiclrogenasa (modernamente E 1.1.1.1.), que, en la especie humana,

está localizada en la fracción acuosa del citoplasma del hepatocito. Este

enzima, que contiene cinc, no es específico del alcohol. Distintos sus­tratos sou susceptibles de reaccionar con él, como el metano! y el etilen­

glicol, entre otros . La alcohol-deshicl rogenasa interacciona con el alcohol en presencia

de un coenzima, el difosfopiridín-nucleótido (NAD+ ), que se reduce a NADH.

El alcohol es oxidado en el organismo en dos etapas: en la primera

se transforma en aldehído acético, l iberando dos protones y dos elec­trones según la siguiente reacción:

La alcohol-deshiclrogenasa responsable de la reacción requiere, como

se ha indicado, la presencia de un coenzima, el difosfopiridin-nucleótido

• Sessió de l dia 9 de juny de 1978.

46 ANNALS DE M EOICINA

(NAD+ ), que se combina con un protón y los dos electrones liberados en la transformación anterior, es decir, un conjunto equivalente a un ión hidrmo (H + ), quedando libre en el medio otro protón. La reacción es, por tanto :

alcohol-des-CH3-CH20H+NAD+ CHJCHO+NADH+H+ (1)

h idrogenasa

La oxidación del alcohol a acetaldehido en el organismo no es un proceso de detoxicación, sino todo lo contrario, puesto que los aldehí­dos son más reactivos y tóxicos que los alcoholes precursores. Sin em­bargo, la mencionada transformación es útil para el organismo simple­mente por la rapidez con que se oxida el aldehído fo.rmado, en condi­ciones normales.

La segunda etapa del metabolismo del alcohol consiste en la oxida­ción del acetaldehido a ácído acético por acción de una aldehido-deshi­drogenasa existente en el hígado y que también requiere el difosfopi­ridín-nucleótido como cofactor. La mayor parte del ácido acético for­mado entra en el ciclo de Krebs en forma de acetil CoA y es oxidado totalmente.

En individuos normales se asegura la reoxidación del NADH a NAD+ en el interior de las rnitocondrias, a través del sistema flavopro­teín-citocromo, a fin de que progrese el metabolismo oxidativo del alcohol. El NADH no puede franquear la membrana mitocondrial, siendo necesario un transportador de ión hidrógeno, función que realiza el glicerofosfato.

Las investigaciones en este campo, fundamentadas en trabajos expe­rimentales, han demostrado que existen otras vías de oxidación del alcohol en ciertas condiciones patológicas . La oxidación etanólica por el sistema catalasa-xantín-oxidasa y por el «microsomal ethanol oxidizing system» (MEO$) son las vías alternativas en el metabolismo del al­cohoF

La cianamida es un bloqueante del metabolismo del alcohol. Su mecanismo de acción radica en la inhibición no competitiva de la alde­hido-desh idrogenasa,l lo que conlleva a incrementar la tasa de acetal­dehido en sangre, predisponiendo al paciente a una serie de manifes­taciones orgánicas desagradables después de una nueva ingesta de al­cohol.

El tratamiento aversivo del etilismo cromco es, hoy día, de uso común y en este sentido se han utilizado varios principios activos de acción farmacológica similar a la de la cianamida. Muchas de las subs­tancias inhibidoras de la aldehido-deshidrogenasa, bien por su toxicidad o por su actividad farmacológica propia, no se utilizan en terapéutica;

R. OOACH Y COLS. CIANAMIDA: ESTUDIO CINáTICO 47

de todas estas substancias, sólo dos son las utilizadas en la terapéutica avers.iva del etilismo crónico: el disulfiram y la cianamida.

El hecho de que la reacción cianamida-alcohol sea una reacción más tolerable, manejable y específica y a su vez entrañe un menor riesgo para el paciente que la utilización de otros bloqueadores de la aldehido­deshidrogenasa confiere a este fármaco un gran interés en clínica,4• 5 ya que el alcoholismo es un fenómeno que constituye un verdadero pro­blema clínico tanto en su faceta terapéutica como social.

Sorprendentemente, no hemos hallado en la literatura ninguna refe­rencia al comportamiento farmacocinético de la cianamida, que juzga­mos indispensable para dirigir y optimizar su acción. Hemos conside­rado muy interesante estudiar las características cinéticas de la ciana­mida en animales como paso previo a su estudio en humanos en trabajos ulteriores, con la esperanza de que ello pueda contribuir a una mejor utilización del medicamento.

. MATERIAL Y MÉTODOS. - Se utilizaron ratas albinas macho de la raza Sprague-Dawley, cepa CD, de nuestro laboratorio, mantenidas en condiciones normales de estabulación y de peso comprendido entre 210 y 290 g.

Las soluciones de cianamida a administrar se han preparado disol­viendo en 100 ml de agua 3,5 g de cianamida pesados analíticamente; a partir de esta solución madre y mediante dos diluciones 1 : 2 suce­sivas se han obtenido otras dos soluciones de principio activo.

La ciananúda se ha administrado en solución acuosa, inyectando 0,5 ml de solución por cada 250 g de animal. Las dosis utilizadas fue­ron 17,5, 35 y 70 mg/Kg.

T ÉCNICA QUIRÚRGICA. - La técnica puede esquematizarse en líneas generales como sigue:

Preparación del mtimal: La rata, después de pesada, se introduce en una campana pequeña de gases que contiene una torunda de algodón empapada con éter. Cuando el animal está completamente anestesiado (desaparición del reflejo palpebral), se fija por las patas al tablero qui­rúrgico, manteniendo la anestesia mediante un algodón empapado con éter junto al hocico del animal.

Administración de las soluciones: El modo de operar fue exacta­mente el mismo para las tres soluciones. Se practica una incisión a lo largo de la piel Jd cuello, dislacerando cuidadosamente hasta dejar al descubierto la zona muscular, operación que se realiza con ayuda de una tijera grande y una pinza en punta de diente de ratón. A conti­nuación, con pinza lisa grande y tijera pequeña, se va desbridando hasta que se ponen al descubierto las dos yugulares .

Se inyecta ahora, mediante jetinga de insulina provista de agu¡a

48 ANNALS DE MEDICINA

de 30 X 7 y por debajo del músculo, la solución medicamentosa en la yugular derecha. I nmediatamente después de agotada la solución, se pone en marcha el cronómetro .

Si la toma de 1mrest ras debe hacerse antes de los 15 minutos, se mantiene al animal sobre el tablero mediante anestesia hasta el momento de dicha toma. P ara tiempos superiores a 15 minutos, se dan, después de la administración, unos puntos de sutura en la herida y se traslada el animal a una jaula metálica, donde se mantiene hasta 5 minutos antes del tiempo de extracción, durante los cuales se anestesia y fija de nuevo al tablero.

Toma de muestras: Una vez transcurrido el tiempo preciso, exacta­mente un minuto ames del previsto para la toma de muestra, se intro­duce, con una jeringa de 10 ml de capacidad, una aguja de 30 X 7 (ambas lavadas previamente con una solución anticoagulante de citrato sódico al 20 %) por debajo del músculo, en la yugular izquierda de la rata . Q uince segundos antes del tiempo de toma se inicia la extracción de sangre, operación que se prolonga hasta 15 segundos después de dicho instante.

Las dosis utilizadas no produjeron trastorno aparente alguno en los animales de experimentación.

VALORACIÓN EN SANGRE. - La valoración de la cianamida en las muestras correspondientes a los d istin tos tiempos se realiza en sangre total. La técnica utilizada es la de BuYSKE y col.,6 p rácticamente selec­tiva de la cianamida y que se basa en la formación de un complejo coloreado con el reactivo pentacianaminoferrato sódico. A 2 ml de san­gre total se le añaden, para desproteinizar, 2 ml de solución de ácido tricloroacético al 1 O % . Se agita y se centrifuga. Se toman 1,3 ml de sobrenadantes y se tamponan con 2 mi de solución 0,2 M de Na2CÜ3 a pH 10,5. A esta mezcla se le adicionan 0,2 ml de la solución reactivo (solución 0,2 M de pentacianaminoferrato sódico) y se deja en reposo 45 minutos a fin de que se desarrolle completamente la reacción y se estabilice el color.

Se procede a con tinuación a valorar espectrofotométricamente a 530 nm frente a un banco de sangre patrón tratada del m ismo modo.

Las rectas de calibración se construyen a partir de muestras de sangre de ratas no tratadas adicionadas de cantidades crecientes y cono­cidas de cianamida tratadas de la misma forma; la concentración de los problemas se determina por interpolación en dichas rectas.

TRATAMIENTO CINÉTICO. - Para los cálculos cinéticos se utilizaron cuatro animales por punto, obtenidos éstos a distintos tiempos para cada dosis, como se detalla en apartado de resultados .

R. OBACH Y COLS. CIANAMIDA: ESTUDIO CINÉTICO 49

Los datos experimentales obtenidos satisfacen !as pautas bicompar­timentales para la interpretación cinética del medicamento.

Las constantes características de la cianamida se determinan siguien­do el desarrollo matemático clásico del modelo bicompartimental, bien documentado en la literatura.7

• 8

Con esta metódica para cada una de las dosis, se calculan las cons­tantes híbridas de disposición, las constantes reales de distribución, retorno y eliminación, así como los volúmenes de distribución.

DETERMINACIÓN EN BILIS. - Técnica quirúrgica: Se anestesia al animal con uretano (solución al 10 %) por vía intraperitoneal, inyec­tando 1,2 ml por cada 100 g de animal. Se practica a continuación una laparotomía parcial dejando al descubierto la zona abdominal supe­rior, se separa el duodeno y se localiza el colédoco. Eliminando la grasa de la zona se pone el descubierto éste y se procede, previa incisión, a su canulación mediante una sonda de polietileno de 0,3 mm de diá­metro y posterior fijación de la misma.

Toma de muestras: La bilis recolectada en el transcurso de la pri­mera hora del ensayo se utilizará posteriormente para confeccionar las rectas de calibración; a continuación se procede a la administración del medicamento por vía intravenosa. La bilis secretada posteriormente se recoge v se mide a intervalos de quince minutos durante un período de tres horas y media.

VALORACIÓN EN BILIS. -Con los datos experimentales obtenidos se procede al cálculo de la cantidad máxima de medicamento excre­tado por b bilis y de la constante de eliminación biliar. Para la estima­ción de estos parámetros se utilizan las ecuaciones de las curvas acumu­lativas de excreción, con las limitaciones derivadas del funcionalismo orgánico en el caso de la excreción biliar.

La expresión exponencial de la ecuación representativa de la curva acumulativa es la siguiente:

-Kb.t B = Boo (1- e ) (Ec 1)

El valor asintótico de dicha culva acumulativa es pues BBoo y su estimación cuantitativa se ha realizado mediante el método basado en el cálculo iterativo de Boo a partir de la ecuación logrítmica:

1n (Boo-B) = -Kb. t + ln B..., (Ec 2)

Dando distintos valores a Boo en la ecuación 2 hasta obtener el mejor coeficiente de correlación de la recta semilogarítmíca, se obtiene el Boo óptimo.

50 ANNALS DE MEDICINA

Una vez hallado el Boo, se calculan las cantidades remanentes por excretar (Boo - B) en función del tiempo, que definen una ecuación exponencial:

-Kb.t (Boo - B) = Boo . e

La expresión logarítmica de dicha ecuación exponencial es la ecua­ción 2, ecuación de una recta cuya pendiente en valor absoluto repre­senta la constante de eliminación biliar Kb.

RESULTADOS.- Las ecuaciones de las cutvas teóricas de nivel he­mático halladas para cada dosis se detallan en los cuadros I, II y III donde se muestra el desdoblado de las mismas en las dos exponencia­les que las forman.

CUADRO I

D = 17.5 mg/Kg

Nivel Nivel Tiempos e.xperi- teórico Nivel

(minutos) mental extrapolado residual Ecuación representativa

1 26.84 5.07 21.27

- 0.17487.t 5 14.76 5.01 9.75 A = 24.9842 . e

10 9.44 4.96 4.48

120 3.73

180 3.22 - 0.00258 . t

B = 5.0783. e 240 2.68

420 1.72

- 0.17487 . t - 0.00258 . t Ecuación general: C = 24.9842 . e + 5.0783 . e

/ R. OBACH Y COLS. CI!\NAMIDA: ESTUDIO CINéTICO 51

CuADRO II

D = 35 mg/Kg

Nivel Nivel Tiempos experi- teórico Nivel

(minu tos) mental extrapolado residual Ecuación representativa

1 45.45 11.12 34.33

3 38.34 11.07 27.27

-0.08226. t 10 27 .93 10.87 17.06 A= 36.58 . e

15 21.06 10.74 10.32

120 8.63

180 6.76

-0.00251. t 300 5.06 B = 11.15 . e

480 3.51

720 1.79

- 0.08226 . t -0.00251 . t Ecuación general: e = 36.58. e + 11.15. e

Las constantes y parámetros intravenosos obtenidos para la ciana­mida en nuestras condiciones experimentales a las tres dosis utilizadas se detallan en el cuadro IV.

En la figura 1 se representan las curvas superpuestas de nivel hemá­tico de cianamida a las tres dosis utilizadas; puede comprobarse la clara bicompartimentalidad de la misma y la aparición de unos puntos atípi­cos en la fase subínicial de la disposición que se hacen más ostensi­bles al aumentar la dosis.

52 ANNALS DE M EDlCINA

En la figura 2 se detallan, en papel semilogarítmico, las curvas acu­muJativas de excreción biliar de cianamida y las rectas representativas de la velocidad del proceso para las tres dosis utilizadas.

La figura 3 muestra la linealidad existente entre las dosis utilizadas y la cantidad má.xima de cianamida excretada en bilis (B00).

CUADRO III

D = 70 mg/Kg

Nivel Nivel Tiempos experi- teórico Nivel

(minutos) mental extrapolado residual Ecuación representativa

1 107.49 48.78 58.71

3 86.00 48.52 37.48

-0.09346. t 10 66.89 47.66 19.23 A= 55.71. e

15 62.21 47.05 15.16

90 36.62

120 38.23

180 30.90

-0.00258. t 240 24.79 B = 48.90 . e

300 21.74

360 21.47

1140 2.57

- 0.09346 . t - 0.00258 . t Ecuación ·general: C = 55.71 . e + 48.90. e

R. OBACH Y COLS. CIANAMIDA: ESTUDIO CIN~TICO 53

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Pto 1

DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS. - Los resultados eA'Perimentales

obtenidos ponen de manifiesto el evidente carácter bicompartimental

de la cianamida tras su administración intravenosa en las tres dosis ensayadas.

El estudio comparativo de las constantes «híbridas» de disposición,

de las reales de distribución, retorno y eliminación, así como de los

volúmenes de distribución, pone de manifiesto el comportamiento no lineal de la ciananúda ya que dichos parámetros no permanecen cons­

tantes al variar las dosis. La fase de disposición alfa es muy rápida respecto a la fase beta

y varía al incrementar las dosis; no ocune lo mismo con la fase beta

que permanece constante en las tres dosis ensayadas (ver cuadro IV).

A fin de esclarecer este punto se procedió a determinar la cantidad de cianamida excretada por bilis a distintos tiempos para las tres dosis

utilizadas.

54 ANNALS DE MEDJClNA

CUADRO IV

Constantes D = 17.5 mg/Kg D =J5 mg/Kg D = 70 mg/Kg Unidades

e, 30.06 47.73 104.61 mcg/ml

Ao 24.98 36.58 55.71 mcg/ml ('f. 0.17487 0.08226 0.09346 min-1

S 0.00258 0.00251 0.00258 min- 1

t:~_, /2 3.96 8.42 7.41 minutos

t,81¡2 268.60 276.06 268.60 minutos

kl2 0.13153 0.05386 0.04563 min-1

k2l 0.03168 0.02114 0.04506 min- 1

k u 0.01424 0.00977 0.00535 min-1

Ve 0.338 0.425 0.388 1/Kg Vp 1.401 1.083 0.393 1/Kg

Vd(••> 1.739 1.508 0.781 1/Kg

AUC mcg calculada 2110.96 4885.36 19553.27 --. h

ml

normalizada 1.000 2.314 9.263 Relación

Se ha puesto de manifiesto en estos estudios que las cantidades eli­minadas por bilis aumentan con la dosis (ver valores asintóticos de las curvas acumulativas en la figura 2) y es de resaltar el paralelismo en las tres rectas, lo que implica que el proceso transcurre a velocidad cons­tante y no depende de la dosis (en el rango de dosis utilizadas). Esto nos pone de manifiesto que el proceso de eliminación biliar discurre de forma lineal. Dicha linealidad se ratifica al representar gráficamente en coordenadas cartesianas la cantidad total excretada en bilis frente a las dosis (ver figura 3 ). Sin embargo la ecuación representativa:

Boo = 1,2327 D - 8,5000

indica con probabilidad, que la relación es sigmoidea, ya que no puede existir una ordenada en el origen negativa en este caso.

R. OBACH Y COLS. CIANAMIDA: ESTUO!O CINéTICO 55

80 Bc:o = 78 . O mc:9

so

30

20

Bco= 13. 5 mcg

;; ~ 10

"' B ., ::;

"' 2 ... ~ ,._

"' "" V >< "' ~

2

[•

5 •

(J JO 60 90 120 150 180 210 240

'1'1 EMPO (mi nllt.Oti }

FH::. 2.

El paralelismo en la velocidad de eliminación y la linealidad encon·

tracia en la eHminación biliar junto al hecho de que la concentración de

cianamida en bilis no sea superior a la concentración hemática a tiem· pos .fijos, hace sospechar que dicha eliminación bil.iar transcurra según

una cinética de primer orden. Por otra parte la cantidad total excre­

tada en bilis es una cantidad muy pequeña respecto a la administrada

y respecto a la que corresponde al área supletoria subinicial objetivada en las curvas de nivel hemático. No podemos por tanto achacar a la

eliminación biliar la no linealidad observada en la cianamida. Las áreas supletorias que se observan en la fase subinicial de la

disposición se incrementan más que en proporción lineal al aumentar

las dosis y dicho incremento es prácticamente paralelo al observado en

el área total bajo la curva; ello nos indica que el fenómeno, por el mo­

mento desconocido, que provoca la aparición de estos puntos atípicos, pudiera ser la causa o una de las causas que provocan el comportamien­to cinético no lineal de la cianamida.

56 ANNALS DE MEDICINA

Para intentar determinar con exactitud el factor o factores respon­sables del citado comportamiento cinético no lineal estamos desarrollan­do estudios metabólicos y de distribución del medicamento.

La constante de distribución Ku disminuye al incrementar la dosis; lo mismo le ocurre a la constante de eliminación K13. La constante de retorno !<lt se modifica de forma alternativa al incrementar la dosis.

El volumen de distribución en compartimiento central permanece prácticamente constante al incrementar la dosis administrada. Por el contrario el volumen en compartimiento periférico disminuye al incre­mentar la dosis.

¡;;lOO

-; 90

~ e o

~

= 70

ID

ilí 60

i so

0: 40 u ¡j

~ 30

t 20

5 10

800 = 1.2327 . 0 - 8 . 5000

(r = 0.9999)

/ 10 20 3o 40 so 60 10 eo 9o

DOSIS (mg/Kg)

¡,;lG. 3

Las variaciones que experimenta la constante híbrida de disposición alfa en las tres dosis ensayadas repercuten , como es lógico, en los res­peclivos valores Je las constantes reales de dist ribución, retorno y eli­minación así como en los volúmenes de distribución correspondientes.

El mismo medicamento, administrado a distintas dosis, puede dar lugar a varias alternativas en la interpretación cinética del mismo.

Así por ejemplo, centrándonos en los datos obtenidos con la dosis de 17,5 mg/Kg podríamos deducir que se trata de un medicamento

R. OBACH Y COLS. CIANAMIDA: ESTUDIO CINÉTICO 57

con tendencia a acumularse en compartimiento periférico (K12 > K21) (K12 > K13) lo cual se trad uce con un valor para el volumen de distri­bución en dicho compartimiento muy elevado. Sin embargo, si contem­plamos razonadamente los resultados obtenidos al utilizar la dosis de 70 mg/Kg, el comentario al respecto sería de que se trata de un medi­camento sin tendencia a acumularse (K12 = K21), con una constante de eliminación relativamente rápida y un equilibrio en sus volúmenes de distribución (Ve = Vp).

Estas variaciones de los parámetros farmacocinéticos a distintas do­sis nos indican, como ya comentábamos antes, que estamos ante un principio activo que posee un comportamiento cinético no lineal.

Si observamos el área bajo la curva de nivel hemático nos daremos cuenta que ésta se incrementa más que en proporción lineal al aumen­tar la dosis (obsérvense los valores de las áreas normalizadas que figuran en el cuadro IV); este hecho ratifica el comportamiento no lineal obser­vado en la cianamida.

Al abordar el problema del comportamiento mencionado, se pensó en principio que pudiera ser debido a la excreción biliar de este com­puesto, idea que podía compaginarse con las alternancias de concentra­ción en la fase subinkial (posible ciclo enterohepático ).

BIBLIOGRAFIA

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Departament de Farmacia Galenica ( Secció de Biofarmacia) i Laboratorios Lasa (Departament I nvestigació)