Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
DEPARTAMENT DE BIOQUIMICA I BIOTECNOLOGIA
FACULTAT D’ENOLOGIA
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA IMPOSICIÓN DE UNA
CEPA INOCULADA DE Acetobacter pasteurianus PARA LA
ELABORACIÓN DE VINAGRE DE VINO POR MÉTODO
SUPERFICIAL Y SUMERGIDO
Trabajo presentado por:
CLAUDIO ESTEBAN HIDALGO ALBORNOZ
para la defensa del TRABAJO DE INVESTIGACIÓN DEL MASTER EN ENOLOGÍA
TARRAGONA, 2008.
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA IMPOSICIÓN DE UNA
CEPA INOCULADA DE Acetobacter pasteurianus PARA LA
ELABORACIÓN DE VINAGRE DE VINO POR MÉTODO
SUPERFICIAL Y SUMERGIDO
Claudio Hidalgo, Estibaliz Mateo, Carlos Vegas, José Manuel Guillamón, Montse
Poblet, Wendu Tesfaye, Ana María Troncoso, Albert Mas y Mª Jesús Torija
UE-CeRTA. Dept. Bioquímica i Biotecnologia, Facultat d‘Enologia. Universitat Rovira
i Virgili. C/ Marcel.lí Domingo s/n. 43007 Tarragona. Tlf 977558855; Fax: 977558232.
e-mail: [email protected]
Palabras claves: Inoculación, RFLPs-16S rDNA, (GTG)5-PCR
RESUMEN
La producción de vinagre de vino se puede realizar a través del método superficial y
sumergido, cuya diferencia fundamental entre ellos es el aporte de oxigeno durante el
proceso de acetificación. Son muy pocos los estudios realizados sobre la identificación
de la microbiota que interviene en ambos métodos, no existiendo aún estudios sobre la
eficacia de la inoculación de bacterias acéticas puras en elaboración de vinagre de vino.
El objetivo de este estudio se centra en el análisis de la imposición de una cepa
seleccionada de bacteria acética para la acetificación. Dicha imposición se ha analizado
en primer lugar, por comparación entre los dos sistemas de producción de vinagre:
tradicional o superficial y sumergido. Asimismo, en el sistema tradicional se ha
analizado en barricas que se diferencian en su elaboración por el tipo de madera, con
diferente porosidad y diferentes formas, lo que produce diferente aireación o
disponibilidad de oxígeno. La imposición se ha analizado por técnicas moleculares,
identificándose a nivel de cepa ((GTG)5-PCR) y especie (PCR-RFLP 16S rDNA).
Los resultados muestran una falta de efectividad de la inoculación, ya que dependiendo
de las condiciones de acetificación se puede obtener una u otra cepa. Las especies
identificadas por método superficial fueron Acetobacter pasteurianus y
Gluconoacetobacter europaeus, mientras que en el método sumergido solo se
consiguieron aislar cepas del género Ga. europaeus. Esto parece confirmar que una
mayor presencia de oxígeno favorece la multiplicación y desarrollo de cepas de la
especie Ga. europaeus frente a cepas de Ab. pasteurianus. En relación a la cinética de
acetificación por método superficial, no se obtuvieron resultados concluyentes que
muestren diferencias importantes entre los tres tipos de madera utilizadas, observándose
que la mejora en la difusión de oxígeno no está tan relacionada con el tipo de madera
como con el tipo o forma de la barrica ya que en este caso resulta evidente su influencia
sobre la cinética de acetificación.
INTRODUCCION
El vinagre de vino es producto de la oxidación incompleta del alcohol en ácido acético,
el cual es utilizado extensamente como condimento y agente conservador de alimentos.
Históricamente ha sido considerado como un subproducto vitivinícola no deseable y de
bajo precio (Ribereau-Gayon et al., 2005). Sin embargo, hoy en día, debido a cambios
en la gastronomía y en las preferencias de los consumidores, la industria ha modificado
este concepto, prestando una mayor atención a su elaboración y transformándose, en
algunos casos, en un producto de alto coste y protegido bajo Denominaciones de Origen
(Barja et al., 2003; Morales et al., 2003). Tradicionalmente la producción de vinagres
no se ha realizado ni en barricas ni en maderas adecuadas, ya que se utilizan barricas
muy viejas y en su mayoría desechadas por la industria enológica, donde la porosidad es
prácticamente nula, obteniéndose una baja difusión de oxigeno. Por otra parte, las
barricas utilizadas en la elaboración de vino están diseñadas para permitir una mínima
difusión de oxígeno, al contrario de aquello que es necesario para la producción de
vinagre. Asimismo, la madera más habitualmente utilizada es el roble, adecuada para el
envejecimiento de los vinos, pero no necesariamente para la producción de vinagres.
La elaboración de vinagre se puede realizar por dos métodos bien diferenciados: cultivo
superficial o cultivo sumergido. El primero es un método estático donde las bacterias
acéticas se encuentran o bien en la superficie de los acetificadores en contacto con el
aire o bien fijadas a soportes de materiales tales como virutas y la transferencia de
oxígeno se hace por difusión. El método sumergido, por su parte, se basa en la presencia
de un cultivo de bacterias que se encuentra en suspensión dentro del acetificador y con
un aporte continuo de aire (solo o enriquecido con oxígeno) por convección forzada.
Con el método superficial se obtienen vinagres de mejor calidad debido principalmente
al metabolismo de las bacterias acéticas y al aporte aromático y sensorial proporcionado
por la madera utilizada en la elaboración. Sin embargo, presenta los inconvenientes de
ser un método lento, con alto riesgo de contaminación de anguílulas y con variaciones
de temperatura difícilmente controlables lo que puede generar pérdidas de alcohol por
evaporación (Llaguno y Polo, 1991). Por su parte, con el método sumergido se obtiene
un mayor rendimiento y velocidad de acetificación, además de un producto más
uniforme en comparación con el método superficial. Sin embargo, un elevado
suministro de aire puede causar el fenómeno de sobreoxidación y arrastre de los
componentes volátiles causando una pérdida aromática, así como también la falta de
contribución del metabolismo de las bacterias acéticas, convertidos en biorreactores
(Tesfaye et al., 2002). Además la carencia de oxigeno puede paralizar la acetificación
dado el carácter aerobio de las bacterias acéticas.
Las bacterias acéticas son los principales microorganismos implicados en la
transformación de etanol a ácido acético. Pocos son los estudios poblacionales
realizados sobre bacterias acéticas, la mayoría de ellos se han centrado en el vino (Du
Toit y Lambrechts, 2002; Bartowsky et al., 2003; González et al., 2004; 2005), vinagres
de vino (Gullo et al., 2006; Vegas et al., 2007), vinagres industriales (Sokollek et al.,
1998; Schüller et al., 2000), u otros tipos de vinagre: vinagre de caqui (Jin-Nam et al.,
2005) o vinagre de arroz (Nanda et al., 2001, Haruta et al., 2006). En cambio, no
existen estudios sobre la eficacia de la inoculación de bacterias acéticas puras para la
obtención de vinagres, a diferencia de lo que sucede en la utilización de inóculos puros
de levaduras en la fermentación alcohólica o de bacterias lácticas en la fermentación
maloláctica del vino, las cuales han sido extensamente investigadas. Dichos estudios
con levaduras y bacterias lácticas han demostrado la utilidad de la inoculación, ya que
parte de la calidad del vino radica en la intervención seleccionada de estos
microorganismos (Ribereau-Gayon et al., 2005).
La limitación fundamental para la realización de estudios con bacterias acéticas, se debe
a los problemas de cultivabilidad que presentan. Estos pueden ser debidos por un lado, a
la ausencia de medios adecuados para su cultivo y por otro a la existencia del estado
“viable pero no cultivable” (VBNC) (Millet y Lonvaud, 2000). Aunque no se puede
asegurar que los medios de cultivo sean siempre los adecuados, la recuperación de cepas
de bacterias acéticas se ha venido realizando en medios de cultivo óptimos, donde
suelen demostrar un buen crecimiento. No obstante, es difícil asignar un medio de
cultivo “adecuado” para células provenientes de un medio extremo, como podría ser el
vinagre. Un problema adicional que justifica diferencias entre el crecimiento en placa y
los contajes en el microscopio es la asociación que tienen las bacterias acéticas, ya que
es frecuente observarlas en parejas, cadenas de longitud variable o grumos, lo que
generalmente desarrollaría una sola colonia.
Para la caracterización de bacterias acéticas, a falta de la puesta a punto de métodos
independientes de cultivo, se utilizan técnicas de biología molecular rápidas, fiables y
de fácil manejo. La identificación a nivel de género y especie se realiza por PCR-RFLPs
(Restriction Fragment Length Polymorphisms) del 16S rDNA y de los ITS 16S-23S
rDNA (Ruiz et al., 2000); DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) (López et
al., 2003; De Vero et al., 2004) o FISH (Fluorescence in situ hybridisation) (Baena-
Ruano et al., 2006). La tipificación a nivel de cepa, por su parte, se realiza mediante
técnicas como ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) y REP-
PCR (Repetitive Extragenic Palindromic) (González et al., 2004); (GTG)5-PCR (De
Vuyst et al., 2007); RAPD-PCR (Random amplified polymorphic DNA-PCR) (Nanda
et al., 2001).
El objetivo fundamental del presente estudio es el análisis de la imposición de una cepa
seleccionada de bacteria acética para la acetificación. La cepa seleccionada se aisló de la
misma vinagrería donde se realizó el análisis de imposición. Dicha imposición se ha
analizado en primer lugar, por comparación entre los dos sistemas de producción de
vinagre: tradicional o superficial y sumergido. Asimismo, en el sistema tradicional se ha
analizado en barricas que se diferencian en su elaboración por el tipo de madera, con
diferente porosidad y diferentes formas, lo que produce diferente aireación o
disponibilidad de oxígeno. La imposición se ha analizado por técnicas moleculares,
identificándose a nivel de cepa ((GTG)5-PCR) y especie (PCR-RFLP 16S rDNA).
MATERIALES Y METODOS
Inoculación, muestreo y condiciones de acetificación
El estudio de inoculación se realizó en acetificaciones llevadas a cabo por el método
superficial en la vinagrería La Guinelle de Banyuls (Francia) y por el método sumergido
en la Universidad de Sevilla. Para realizar dichas acetificaciones se utilizó la cepa de
Acetobacter pasturianus AVF2, aislada e identificada en un estudio ecológico previo
(Vegas, 2007) donde dicha cepa fue la mayoritaria. En la preparación del inóculo la
multiplicación de la madre se realizó inicialmente en el laboratorio y posteriormente en
la vinagrería La Guinelle para conseguir el volumen suficiente para la inoculación de
todas las barricas. Esta madre se utilizó tanto para el método superficial como para el
método sumergido.
En el caso del método superficial, el estudio se realizó por triplicado en barricas de 60
litros. Se inocularon un total de 24 barricas, repartidas en 3 tipos o formas diferentes: la
que denominaremos Barrica normal (forma clásica de las barricas) y dos barricas de
diseño nuevo (prototipo 1 y 2), en las cuales se buscaba aumentar la superficie de
contacto con el oxígeno. Así, considerando dicha superficie de intercambio gaseoso,
pueden ordenarse de menor a mayor: la barrica normal, prototipo 1 y prototipo 2. En
este estudio también se probaron tres maderas: cerezo, acacia y roble. En el caso del
roble solo se utilizaron dos tipos de barrica: normal y prototipo 2. Para el estudio
comparativo entre el método superficial y el método sumergido, se utilizó la
acetificación superficial realizada en la barrica normal de roble por ser la utilizada
habitualmente.
Se tomaron muestras en tres puntos de la acetificación: T0 (inicio), TM (3% acidez), TF
(6% acidez). En estos puntos se realizaron controles de temperatura, oxígeno disuelto,
etanol, pH y recuento de bacterias acéticas por microscopía y siembra en placa. Dicha
siembra se realizó en un sembrador automático en espiral WASP II (Don Whitley
Scientific Limited, England) en medio agar GY (1% de extracto de levadura (Cultimed,
Barcelona, España); 5% de glucosa (Cultimed); 1,5% de Agar (Cultimed) (g/l),
suplementado con natamicina E-325/Delvocid (100 mg/l) (DSM; Delft; The
Netherlands) para inhibir el crecimiento de levaduras y hongos. Todas las muestras
fueron incubadas a 28ºC durante 2-4 días. Se seleccionaron 10 colonias aleatoriamente
y fueron replicadas nuevamente en placas del mismo medio de cultivo con 2% de
CaCO3 con el propósito de asegurar que las colonias aisladas producían ácido acético.
En el caso del método sumergido se utilizó un fermentador de laboratorio de B. Braun
Biotech S.A. de 5 litros de capacidad. Las condiciones de acetificación habían sido
previamente optimizadas (Tesfaye et al., 2000): temperatura 30ºC, flujo de aire 150 l/h,
agitación 450 rpm., etc. Se realizaron 5 ciclos de acetificación, aunque el estudio
microbiológico sólo se llevó a cabo en los últimos tres ciclos (ciclo 4, 5 y 6). Los ciclos 1 y
2 no se consideraron ya que en éstos se produce la estabilización del proceso.
La determinación del ácido acético (acidez total) se efectuó mediante una valoración
ácido-base en presencia de fenolftaleína como indicador. La cantidad de etanol y de
azúcares residuales presentes en la muestra se realizó mediante un kit enzimático
comercial (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), según las especificaciones del
fabricante.
Análisis de RFLPs-PCR del 16S rDNA y (GTG)5-PCR
La extracción del DNA se realizó mediante el método CTAB de Ausubel et al., (1992).
Para la identificación a nivel de especie, se utilizó la técnica de los RFLPs del 16S
rDNA descrita por Ruiz et al., (2000). El producto amplificado del gen del 16S rDNA
fue digerido con dos enzimas de restricción: TaqI y BccI. Esta última, se utilizó para
diferenciar las especies Ga. hansenii, Ga. europaeus y Ga. xylinus que presentan el
mismo perfil con la enzima anterior. Para la tipificación de las cepas se utilizó la técnica
del (GTG)5-PCR (De Vuyst et al., 2007). De forma rutinaria las muestras se analizaron
en geles de agarosa.
RESULTADOS
En este estudio se quiere determinar la imposición de una cepa inoculada tanto en el
método superficial como en el sumergido. Además se quiere comparar dentro del
método superficial, el efecto de los tipos de madera y formas de barricas sobre la
cinética y microbiología de la acetificación, tomando como control la barrica normal de
roble.
Todas las acetificaciones se realizaron utilizando vino de Banyuls con un elevado grado
alcohólico (15,2%), en el caso de las acetificaciones superficiales, éstas empezaron con
una acidez inicial de 0,9 y un contenido de etanol de 9,5% (Tabla 1). En cambio para
poder arrancar el cultivo sumergido se necesita una acidez mayor, alrededor de 3,5%.
En el método superficial, a lo largo de las acetificaciones, los parámetros de temperatura
y oxígeno no mostraron diferencias entre maderas, excepto en el prototipo 2 donde se
evidenció un aumento de oxigeno disuelto (10 mg/ml en las barricas normales y
prototipo 1, por valores superiores a 20 mg/ml en los prototipos 2). A pesar de lo
anterior, la concentración de oxígeno en las barricas se mantuvo en niveles muy bajos
en todos los puntos estudiados.
Cinética de las acetificaciones
En las acetificaciones por cultivo sumergido, los ciclos duraban un tiempo medio de 33
horas para conseguir vinagres que contenían una acidez final de 7,4%, respecto a la
acidez inicial (3,5%).
En las acetificaciones por el método superficial se obtuvieron diferencias cinéticas en
función del tipo de barrica, no así a nivel de maderas. En la figura 1 se muestra la
cinética de los tres tipos de barrica respecto a las 3 maderas utilizadas.
Independientemente de la madera utilizada, se observó una mayor velocidad en la
oxidación del etanol y por tanto un mayor aumento de acidez, en el prototipo 2, seguido
del prototipo 1 y de la barrica normal. La acetificación en la barrica normal es mucho
más lenta respecto a los dos prototipos, estando alrededor del 4-5% cuando los otros
prototipos ya estaban al 6%. Aunque la velocidad inicial del prototipo 2 es superior al
prototipo 1, especialmente en el caso del cerezo (Fig 1a), en ambos casos se necesitaron
los mismos días para alcanzar el 6% de acidez (36 días). En el caso del prototipo 2 se
observó un consumo o perdida total de etanol en el día 36, mientras que en las otros dos
tipos de barrica, y muy particularmente en el caso del prototipo 1 que en ese mismo
punto presentaba una acidez similar, todavía mostraban un contenido de etanol
alrededor de un 2,5%.
Identificación a nivel de especie y cepa
En la tabla 2 se recogen los resultados de identificación a nivel de especie y tipificación
a nivel de cepa de los aislamientos obtenidos en los diferentes puntos de acetificación
tanto por el método superficial como por el sumergido.
Las especies identificadas por método superficial fueron Acetobacter pasteurianus y
Gluconoacetobacter europaeus, mientras que en el método sumergido solo se
consiguieron aislar cepas del género Ga. europaeus.
En la barrica de roble normal (barrica control) se observó durante toda la acetificación
una imposición del 100% de la cepa inoculada de Ab. pasteurianus. Por el contrario en
el método sumergido solo aparecen dos cepas de Ga. europaeus. En el ciclo III se
observa la imposición de la cepa GE4 en un 100%. Sin embargo, ésta disminuye en los
siguientes ciclos debido a la aparición de la cepa GE2 en un 55% en el ciclo IV y
aumentando su presencia hasta el 70% en el ciclo V.
En las distintas maderas y tipos de barricas estudiados en el método superficial no se
observó imposición del 100% de la cepa inoculada como ocurrió durante toda la
acetificación en la barrica de roble normal (barrica control). En el punto TM se
observaron 6 cepas diferentes de Ab. pasteurianus, correspondiendo a la cepa inoculada
las aisladas en la barrica normal de roble y acacia. Por otra parte, en el punto TF sólo se
recuperaron cepas de Ab. pasteurianus en roble normal, y prototipo 1 de acacia y
cerezo, detectándose únicamente en acacia y roble la cepa inoculada. Además en este
punto se aislaron 3 cepas diferentes de Ga. europaeus, una de las cuales ya había sido
aislada en la acetificación por método sumergido.
Cabe destacar dentro de las acetificaciones por método superficial, el prototipo 2, ya
que en todas las maderas sigue una evolución idéntica, imposición total de cepas de Ab.
pasteurianus en el punto TM y de Ga. europaeus en el punto TF .
DISCUSION
Las bacterias acéticas son conocidas por su capacidad de oxidar rápidamente sustratos
de carbono de forma incompleta, sobre todo azúcares y alcoholes. Este rasgo es
utilizado en varios procesos biotecnológicos entre los cuales se encuentra la producción
de vinagre, donde el ácido acético es producido a partir de etanol. Varios tipos de
vinagres son producidos en todo el mundo; ellos se diferencian por las materias primas
utilizadas, las tecnologías de elaboración y su forma de empleo como condimento,
conservación de alimentos, etc. (Giudici et al., 2006). Es por ello que en el último
tiempo no solo se han realizado estudios sobre bacterias acéticas en vino (Du Toit y
Lambrechts, 2002; Bartowsky et al., 2003; González et al., 2004; 2005), sino también
en vinagres industriales (Sokollek et al., 1998; Schüller et al., 2000) y otros tipos tales
como vinagre de caqui (Jin-Nam et al., 2005), vinagre de arroz (Nanda et al., 2001,
Haruta et al., 2006), o vinagre de cebolla (Horiuchi et al., 1999). Los estudios sobre las
bacterias responsables de la producción de vinagres de vino por los métodos
tradicionales son asimismo limitados (Gullo et al., 2006; 2007; Vegas, 2007). El mayor
riesgo en el proceso de producción de vinagres por el método tradicional es el tiempo
excesivo de elaboración ya que se favorece el crecimiento de cepas distintas a las que
interesan que controlen el proceso. Una reducción efectiva del tiempo de acetificación
podría conseguirse mediante un aumento de la aireación, lo cual se consigue con el
método sumergido. Sin embargo, esto conlleva a una pérdida de calidad del producto
final (Tesfaye et al, 2002). Con el propósito de evitar la pérdida de calidad y evitar
tiempos excesivos de elaboración, en este trabajo se estudia la imposición de un inóculo
tanto en el método superficial como sumergido para obtener un mayor control del
proceso de elaboración de vinagre.
En el caso de las fermentaciones alcohólicas y malolácticas se emplean criterios de
selección de cepas para utilizarlas como inóculos y lograr así su utilización debido a la
presencia de características fisiológicas que son apropiadas para ciertas elaboraciones de
vino (Ribereau-Gayon et al., 2005). Estos criterios pueden ser aplicables a la
elaboración del vinagre en función de la cepa, el método de producción y el producto
final que se busca.
En relación a la cinética de acetificación por método superficial, no se obtuvieron
resultados concluyentes que muestren diferencias importantes entre los tres tipos de
madera utilizadas. Esto parece indicar que la mejora en la difusión de oxígeno no esté
tan relacionada con el tipo de madera como con el tipo o forma de la barrica, ya que en
este caso resulta evidente su influencia sobre la cinética de acetificación. Los resultados
mostraron una mayor velocidad de acetificación en el prototipo 2 independientemente
del tipo de madera utilizada, aunque las mayores diferencias en la velocidad inicial se
aprecian en las barricas de cerezo. Esta mayor velocidad estaría relacionada con una
mayor superficie de contacto con el aire en este prototipo con respecto a los otros dos
tipos de barrica. Aunque esta mayor velocidad de acetificación unida a la mayor pérdida
por evaporación tiene como resultado una disminución excesiva del etanol que puede
influir negativamente en la elaboración de vinagre, ya que algunas bacterias acéticas son
capaces de oxidar el ácido acético generando agua y CO2. La pérdida por evaporación
está en función de diferentes parámetros como el tamaño de la barrica, la temperatura, la
humedad relativa o la circulación del aire alrededor del barril (Guymon, 1972).
Las acetificaciones más lentas se obtuvieron con las barricas normales en los tres tipos
de maderas, lo cual confirma que el aumento de la superficie de contacto, reduce el
tiempo de acetificación, tal y como se postulaba. Estos datos reafirman la hipótesis que
las barricas que se utilizan de forma habitual en la elaboración de vinagres presentan un
diseño correcto para el envejecimiento de vino y no para la producción de vinagre. Por
tanto, en vistas de los resultados obtenidos, para el diseño de barricas de vinagre es
necesario llegar a un compromiso entre una rápida acetificación y una disminución de
las pérdidas de etanol por evaporación en el momento de la elección del prototipo.
La imposición de bacterias acéticas utilizadas como inóculo en la producción de vinagre
no parece ser tan efectivo como la inoculación de levaduras y bacterias lácticas en la
industria del vino (Ribereau-Gayon et al., 2005). Al realizar la comparación de la
barrica de roble normal (barrica control) del método superficial con el método
sumergido, se observa que sólo en el método superficial se impone con un 100% la cepa
inoculada. Lo cual es normal ya que esta cepa se había aislado en condiciones similares
en un estudio ecológico previo (Vegas, 2007). En cambio en el método sumergido esta
cepa no aparece en ninguno de los ciclos, imponiéndose cepas de la especie Ga.
europaeus. De hecho, la elaboración de vinagres por cultivos sumergidos siempre se ha
asociado con cepas del género Gluconoacetobacter, y más concretamente Ga.
europaeus (Sievers et al., 1992, Trcek et al., 2000), Ga entanii (Schüller et al., 2000),
Ga. obodiens (Sokollek et al., 1998), Ga intermedius (Boesch et al., 1998, Trcek et al.,
2000), lo cual parece confirmar que una mayor disponibilidad de oxígeno favorece el
desarrollo de estas especies. La aparición de esta especie se debe a que probablemente
durante la multiplicación en la vinagrería aunque continuaba siendo mayoritaria la cepa
AVF2 proliferaban también otras cepas minoritarias que, en condiciones adecuadas
como puede ser una mayor disponibilidad de oxigeno, se han desarrollado e impuesto
sobre la cepa inoculada.
Al realizar la comparación de la barrica de roble normal (barrica control) con las otras
maderas y prototipos utilizados en el método superficial, se observa una falta de
efectividad de la inoculación, ya que dependiendo de las condiciones de acetificación se
puede obtener una u otra cepa. Además en el prototipo 2 donde se detectó mayor
contenido de oxigeno disuelto se favoreció el aumento de la velocidad de acetificación,
lo que conllevó la imposición de cepas de Ga. europaeus. Esto parece corroborar que
una mayor presencia de oxígeno favorece la multiplicación y desarrollo de cepas de la
especie Ga. europaeus frente a cepas de Ab. pasteurianus. Además el aislamiento de
una cepa de Ga. europaeus (GE2) en ambos tipos de acetificación (superficial y
sumergida) determina que estas cepas son provenientes de la vinagrería y no debidas a
contaminaciones externas, lo que se vería ratificado además por el hecho de que esta
cepa también fue aislada en el estudio ecológico previo en un bajo porcentaje (Vegas,
2007). No obstante, cabe destacar que, en relación a este estudio ecológico previo,
donde la acetificación empezó con un cultivo mixto, en todos los casos del presente
estudio, la acetificación con las barricas normales procedió a mayor velocidad. Este
hecho, unido a la falta de imposición clara del inóculo parece indicar que en este caso se
producía un efecto positivo debido a la inoculación en sí, posiblemente relacionado con
un inicio más rápido del proceso de acetificación, aunque dicho inicio rápido no asegure
la imposición de la cepa inoculada.
Finalmente se concluye que no hay imposición de la cepa inoculada, lo que se atribuye a
las diferentes condiciones de acetificación. Sin embargo, en cultivo superficial los
prototipos normal y 1 muestran imposición final de la especie Ab. pasteurianus, al
contrario de lo que sucede con el prototipo 2, en donde finalmente se impone la especie
Ga. europaeus. Esto al igual que en el cultivo sumergido, es probablemente debido a la
mayor disponibilidad de oxigeno como resultado de la mayor superficie de intercambio
gaseoso, lo que también aumentó la velocidad de acetificación.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se ha realizado gracias a la financiación de los proyectos: CRAFT nº
017269 del 6º Programa Marco de Investigación de la Unión Europea y nº AGL2004-
07494-C02-02 del Ministerio de Educación y Ciencia.
BIBLIOGRAFIA
Ausubel F., Brent R., Kingston R., Moore D., Seidman J., Smith J., Struhl K.
(1992). Short protocols in molecular biology. 2nd edition. Jonh Wiley & Sons Ltd.
Baena-Ruano S., Jiménez-Ot C., Santos-Dueñas I.M., Cantero-Moreno D. (2006).
Rapid method for total, viable and non-viable acetic acid bacteria determination during
acetification process. Process Biochemistry 41, 1160-1164
Barja F., Mesa M.M., Macías M., Bermudez I., Cantero D., Lopez J. (2003).
Aspectos bioquímicos, moleculares y morfológicos de las bacterias acéticas. Primeras
jornadas en I+D+I en la elaboración de vinagre de vinos. 17-20. Editores: A. Mas y JM
Guillamon. Servei de publicacions URV, Tarragona.
Bartowsky E.J., Xia D., Gibson R.L., Fleet G.H., Henschke P.A. (2003). Spoilage of
bottled red wine by acetic acid bacteria. Letters in Applied Microbiology 36, 307-314
Boesch C., Trcek J., Sievers M., Teuber M., (1998). Acetobacter intermedius, sp.
nov. Systematic and Applied Microbiology 21, 220-229
De Ley J., Gilli M., Swings J. (1984). Family VI. Acetobacteraceae. En: Krieg, N.R,
Holt, J. G. (Eds). Bergey’s manual of systematic bacteriology 267-278, vol. 1. Williams
and Wilkins, Baltimore.
De Vero L., Gullo M., Solieri L., Landi S., Giudici P. (2004). A new approach to
study the acetic acid bacteria: the DGGE. 27-37. En: I microorganismi dell’aceto
balsamico. Modena. Italia.
De Vuyst L., Camu N., De Winter T., Vandemeulebroecke K., Van de Perre V.,
Vancanneyt M., De Vos P., Cleenwerk I. (2007). Validation of the (GTG)5-PCR
fingerprinting technique for rapid classification and identification of acetic acid
bacteria, with a focus on isolates from Ghanaian fermented cocoa beans. International
Journal of Food Microbiology (in press). doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2007.02.030
Du Toit W.J., Lamberchts M.G. (2002). The enumeration and identification of acetic
acid bacteria from South African red wine fermentations. International Journal of Food
Microbiology 74, 57-64
Giudici P., Gullo M., Solieri L., De Vero L., Landi S., Pulvirenti A., Rainieri S.
(2006). Gli aceti del mondo. Le fermentazioni dell’aceto balsamico tradizionale. 7-13.
ISBN: 888103421. Diabasis, Reggio Emilia, Italy.
González A., Hierro N., Guillamón J.M., Mas A., Poblet M. (2006). Enumeration
and detection of acetic acid bacteria by real-time PCR and nested-PCR. FEMS
Microbiology Letters 254, 123-128
González A., Hierro N., Poblet M., Mas A., Guillamón J.M. (2005). Application of
molecular methods to demonstrate species and strain evolution of acetic acid bacteria
population during wine production. International Journal of Food Microbiology 102,
295-304
González A., Hierro N., Poblet M., Rozés N., Mas A., Guillamón J.M. (2004).
Application of molecular methods for the differentiation of acetic acid bacteria in a red
wine fermentation. Journal of Applied Microbiology 96, 853-860
Gullo M, Caggia C., De Vero, L., Guidici P. (2006). Characterization of acetic acid
bacteria in “traditional balsamic Vinegar”. International Journal of Food Microbiology
106, 209-212
Gullo M., Giudici P. (2007). Acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar:
Phenotypic traits relevant for starter cultures selection, International Journal of Food
Microbiology, (in press); doi:.10.1016/j.ijfoodmicro.2007.11.076
Guymon J.F. (1972). Influence of warehouse temperatures on the aging of California
brandy. Wines & Vines 54, 36-38
Haruta S., Ueno S., Egawa I., Hashiguchi K., Fujii A., Nagano M., Ishii M.,
Igarashi Y. (2006). Succession of bacterial and fungal communities during a traditional
pot fermentation of rice vinegar assessed by PCR-mediated denaturing gradient gel
electrophoresis. International Journal of Food Microbiology 109, 79-87
Horiuchi J.I., Kanno T., Kobayashi M.I. (1999). New Vinegar Production from 524
Onions. Journal of Bioscience and Bioengineering 88, 107-109
Jin-Nam K., Jong-Sok Ch., Young-Jung W., Jong-Sun Y., Hwa-Won R.
(2005). Culture medium optimization for acetic acid production by a persimmon
vinegar-derived bacterium. Applied Biochemistry and Biotechnology 123, 1-3
Lopez I., Ruiz-Larrea F., Cocolin L., Orr E., Phister T., Marshall M.,
VanderGheynst J., Mills D.A. (2003). Design and evaluation of PCR primers for
analysis of bacterial populations in wine by denaturing gradient gel electrophoresis.
Applied and Environmental Microbiology 69, 6801-6807
Llaguno C., Polo M.C. (1991). El Vinagre de Vino. Consejo Superior de
Investigaciones Científicas. Madrid. España.
Millet V., Lonvaud-Funel A. (2000). The viable but non-culturable state of wine
microorganisms during storage. Letters in Applied Microbiology 30, 126-141
Morales M.L., Benitez B., Troncoso A. M. (2003). El vinagre de vino: Análisis de sus
compuestos volátiles y su evolución durante la acetificación y el envejecimiento.
Aspectos bioquímicos, moleculares y morfológicos de las bacterias acéticas. Primeras
jornadas en I+D+I en la elaboración de vinagre de vinos. Pp. 31-38. Editores: A. Mas y
J.M. Guillamon. Servei de publicacions URV, Tarragona.
Nanda K., Taniguchi M., Ujike S., Ishihara N., Mori H., Ono H., Murooka Y.
(2001). Characterization of acetic acid bacteria in traditional acetic acid fermentation of
rice Vinegar (komesu) and unpolished rice vinegar (kurosu) produced in Japan. Applied
and Environmental Microbiology 67, 986-990
Ribéreau-Gayon P., Dubordieu D., Donèche B., Lonvaud A. (2005). The
microbiology of wine and vinifications. 183-192. Handbook of Enology Vol. 1. John
Wiley & Sons Ltd.,
Ruiz A., Poblet M., Mas A., Guillamón J.M. (2000). Identification of acetic acid
bacteria by RFLP of PCR-amplified 16S rDNA and 16S-23S rDNA intergenic spacer.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50, 1981-1987
Sievers M., Sellmer S., Teuber M. (1992). Acetobacter europaeus sp. nov., a main
component of industrial vinegar fermenters in Central Europe. Systematic and Applied
Microbiology 15, 386-392
Sokollek S.J., Hertel C., Hammes W.P. (1998). Description of Acetobacter oboediens
sp. nov. and Acetobacter pomorum sp. nov., two new species isolated from industrial
vinegar fermentations. International Journal of Systematic Bacteriology 48, 935-940
Schüller G., Hertel C., Hammes W.P. (2000). Gluconacetobacter entanii sp. nov.,
isolated from submerged high-acid industrial vinegar fermentations. International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50, 2013-2020
Tesfaye W., Morales M.L., García-Parrilla M.C., Troncoso A.M. (2002). Wine
Vinegar: technology, authenticity and quality evaluation. Trends in Food Science &
Technology 13, 12-21
Trcek J., Raspor P., Teuber M. (2000). Molecular identification of Acetobacter
isolates from submerged vinegar production, sequence analysis of plasmid pJK2-1 and
application in the development of a cloning vector. Applied Microbiology and
Biotechnology 53: 289-295
Vegas C.A. (2007). Estudio de la dinámica poblacional de bacterias acéticas en la
producción de vinagre por el método tradicional. Tesis de DEA. Facultad de Enología.
Departamento de Bioquímica y Biotecnología. URV.
TABLAS
Tabla 1. Análisis físico-químicos iniciales
Tabla 2. Identificación a nivel de especie y diversidad de cepas en las diferentes
maderas y prototipos en el método superficial y sumergido.
TM (3%) TF (6%) Madera Prototipo Especie Cepa Especie Cepa
Mét
odo
supe
rfic
ial
Cerezo Normal 75% Ab. pasteurianus 25% Ga. europaeus
4 GE2
Ga. europaeus
GE2
1 Ab. pasteurianus 3 Ab. pasteurianus
5
2 Ab. pasteurianus 1 Ga. europaeus
GE1
Acacia Normal Ab. pasteurianus
80% AVF2 20% 5
Ga. europaeus
GE3
1 Ab. pasteurianus 6 Ab. pasteurianus
60% AVF2 40% 6
2 Ab. pasteurianus
3 Ga. europaeus GE2
Roble Normal Ab. pasteurianus
AVF2 Ab. pasteurianus AVF2
2 Ab. pasteurianus
1 Ga. europaeus GE1
Mét
odo
sum
ergi
do Ciclo III Ga. europaeus GE4
Ciclo IV Ga. europaeus 45% GE4 55% GE2
Ciclo V Ga. europaeus 30% GE4 70% GE2
Acidez (%) Etanol (%, v/v) pHVino 0,6 15,2 3,42
Madre 5,1 1,8 2,6T0 0,9 9,5 3,18
FIGURAS
Figura 1. Evolución de la acidez y etanol vs. Tiempo en barrica de madera de cerezo
(A), acacia (B) y roble (C), en función del prototipo: Evolución acidez, Prototipo
Normal (◊), Prototipo 1 (□) y Prototipo 2 (∆). Evolución etanol, Prototipo Normal (-◊-
), Prototipo 1 (-□-) y Prototipo 2 (-∆-).
A)
0
2
4
6
8
0 10 20 30 40
Tiempo (días)
0
2
4
6
8
10
B)
0
2
4
6
8
0 10 20 30 40
Tiempo (días)
0
2
4
6
8
10
C)
0
2
4
6
8
0 10 20 30 40
Tiempo (días)
0
2
4
6
8
10
Ac
ide
z (
%)
Ac
ide
z (
%)
Ac
ide
z (
%)
Eta
no
l (%)
Eta
no
l (%)
Eta
no
l (%)
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
DEPARTAMENT DE BIOQUIMICA I BIOTECNOLOGIA
FACULTAT D’ENOLOGIA
Proyecto de tesis Doctoral:
ANÁLISIS Y CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL
PROCESO DE ELABORACIÓN DE CONDIMENTOS A
PARTIR DE FRUTAS
Proyecto presentado por:
CLAUDIO ESTEBAN HIDALGO ALBORNOZ
COMO PROYECTO DE TESIS DOCTORAL EN EL PROGRAMA DE
DOCTORADO EN ENOLOGIA
TARRAGONA, 2008.
ANTECEDENTES El vinagre es un condimento obtenido a partir de substratos azucarados o amiláceos por
fermentación y luego oxidación del etanol. Su producción tradicionalmente ha
permitido utilizar subproductos de frutas o derivados de otras industrias fermentativas
(vino y sidra). No obstante, otros productos agrícolas también se han utilizado para
producción de vinagres. Por tanto, la elaboración de vinagres puede ser un sistema
secundario de utilización de productos agrícolas y contribuir a la reducción de
excedentes, transformándolos en condimentos alimentarios de larga durabilidad y de
interesantes propiedades organolépticas.
La elaboración de vinagre es un proceso biotecnológico que se obtiene por la sucesión
de fermentaciones naturales, las cuales dependen de la coexistencia de los
microorganismos que intervienen en estos procesos (levaduras y bacterias acéticas).
El estudio de la fermentación alcohólica ha sido amplio sobre todo en bebidas como
vino, cerveza y sidra. Los microorganismos que conducen este proceso son
fundamentalmente S. cerevisiae y S. bayanus. Por otra parte, el estudio de la
acetificación de substratos distintos al vino es muy limitado existiendo solo algunas
experiencias en vinagre de caqui, vinagre de arroz, vinagre de cebolla y vinagres
elaborados a partir de banana y castaña.
Por tanto, existe un interés en la elaboración de este tipo de condimentos, tanto desde el
punto de vista comercial como biotecnológico, ya que el conocimiento de estos
procesos permitirá la elaboración de un nuevo producto para el mercado gastronómico
así como un posible control de la microbiota implicada en los mismos.
HIPÓTESIS
La elaboración de condimentos alimentarios a partir de frutas por métodos tradicionales
permitirá:
- la producción de nuevos productos no existentes en el mercado,
- el conocimiento de la microbiota autóctona presente en la superficie de frutas,
- la obtención de productos de larga duración y que conserven las características
saludables de la fruta.
En esta tesis se desarrollaran los dos primeros aspectos.
OBJETIVOS
Objetivos generales:
- Elaboración de condimentos de frutas mediante fermentación alcohólica y
acetificación.
- Análisis y control microbiológico del proceso de elaboración de condimentos a partir
de fruta.
Objetivos específicos:
- Estudio de parámetros físico químicos de los procesos de producción de dichos
productos.
- Caracterización microbiológica de la fermentación alcohólica. Identificación y
tipificación de las levaduras tanto a nivel de especie como de cepa.
- Caracterización microbiológica de la acetificación. Identificación y tipificación de las
bacterias acéticas tanto a nivel de especie como de cepa.
- Selección y empleo a escala industrial de cultivos iniciadores tanto de levaduras como
de bacterias acéticas.
Metodología y Plan de Trabajo
- Obtención de mostos y pastas de fruta para la doble fermentación
Para esto se realizarán ensayos con enzimas pectolíticas para la obtención y
caracterización de los mostos y pastas de fruta.
- Proceso fermentativo
Se contempla la caracterización microbiológica de la fermentación alcohólica y acética.
Para esto se realizará una fermentación alcohólica espontánea y otra inoculada. En el
caso de las fermentaciones inoculadas, se hará un seguimiento de la cepa mediante el
análisis de restricción del DNA mitocondrial (RFLPs DNA mt). Para el estudio
ecológico, a nivel de especie se empleará el análisis de restricción del DNA ribosomal y
para tener una visión más global, las técnicas de gradientes desnaturalizantes (DGGE y
TGGE). Mientras que para la caracterización de las cepas se utilizarán dos técnicas
moleculares: RFLPs del rDNA para cepas de Saccharomyces y AFLPs para cepas de
no-Saccharomyces.
Igualmente también se realizarán fermentaciones acéticas espontáneas e inoculadas.
Para el seguimiento de la cepa de bacteria acética inoculada se utilizarán las técnicas de
ERIC-PCR y PCR (GTG)5. Para el estudio de la acetificación espontánea se emplearán
los RFLPs 16S rDNA y las técnicas de gradientes desnaturalizantes (DGGE y TGGE) a
nivel de especie, mientras que para el estudio a nivel de cepa se utilizarán las mismas
técnicas descritas para las acetificaciones inoculadas.
- Selección de cultivos iniciadores tanto de levaduras como de bacterias acéticas
Entre las cepas predominantes en las fermentaciones espontáneas, se hará un proceso de
selección masivo, que consistirá en hacer un inóculo mixto y dejar que fermenten de
forma conjunta. Para el seguimiento de las especies y cepas de levaduras y bacterias
acéticas en estas inoculaciones se utilizarán los mismos métodos moleculares que se
describieron en el apartado anterior.
- Pruebas de laboratorio con los cultivos iniciadores de levaduras y bacterias
acéticas
Con las cepas mayoritarias durante la selección masiva, se realizarán pruebas
individualizadas en el laboratorio. Con las cepas de levaduras seleccionadas se realizará
la fermentación alcohólica. Luego con los vinos de frutas obtenidos se realizarán las
acetificaciones.
- Producción de condimentos de frutas a nivel de planta piloto
Las pruebas se realizarán con las cepas seleccionadas en ensayos por triplicado,
utilizando para la fermentación alcohólica, la levadura seleccionada y una temperatura
controlada (25 ºC). La acetificación se realizará mediante sistema superficial y sistema
sumergido. Para el método de Orleáns, el vino de frutas se pasará a barricas de roble de
60 litros. Estas barricas se inocularán con el cultivo iniciador de bacteria acética elegido
para cada fruta. Para el cultivo sumergido, el vino de frutas se pasará a un fermentador
de laboratorio de 5 litros de capacidad y se inoculará con el mismo cultivo iniciador.
Finalmente al final de ambos procesos se realizará el estudio microbiológico para
determinar el porcentaje de imposición de los cultivos inoculados.
