UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

TESIS DOCTORAL

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Patricio Aller Tresguerres

DIRECTOR:

José Luis Díez Cortés

Madrid, 2015

© Patricio Aller Tresguerres, 1979

Estudios sobre la transcripción en cromosomas politénicos

de Chironomus

BIBLIOTECA UCM

53060741IX

T 57 * 2 ML^ L

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Pacultad de Ciencias Bioldgicas

ESTUDIOS SOBRE LA TRANSCRIPCION EN CROMOSOMAS POLITENICOS DE CHIRONOMUS

*«4

f?. 2 2 , 019

Tesis Doctoral presentada per PATRICIO ALLER TRESGÜERRES

Licenciado en Ciencias Biolôqicas para optar al qrado de Doctor.

Diciembre de 1978

V° B°El Director de la Tesis

Dr. Jose Luis Diez Cortes

Los trabajos que han dado lugar a esta Tesis han sido realizados en el Departamen- to de Citologîa del Institute de Biologîa Celular ( C.S.I.C. ). Vaya mi mâs sincero agradecimiento para todos sus miembros, por la colaboraoidn que, de un modo u otro, me han prestado.

De una manera especial deseo agradecer al Dr. José Luis Diez Cortes, director del trabaio, todo el esfuerzo desarrollado pa­ra hacer posible su feliz realizaciôn.

Por ûltimo, expreso también mi reconoci- miento al Profesor Dr. Juan Ramôn Lacadena, quien se ha brindado amablemente a ser el ponente de esta Tesis.

I N D I C E

pag.

RESUMEN ................................................. IINTRODUCCION1. NATURALEZA Y SIGNIFICADO DE LOS CROMOSOMAS POLITENICOS

1.1. Generalidades ........ 11.2. Estructura del cromosoma politénico ........... 21.3. El fenômeno de puffing y su significado ...... 31.4. Caracterîsticas de la transcripcidn en glândulas

salivales de Chironomus ....................... 52. CONTROL DE LA TRANSCRIPCION EN ORGANISMOS EUCARIOTICOS.. 8

2.1. Empleo de inhibidores de la sintesis de proteinas.. 92.2. Interés de las células politenizadas para los es-

tudios sobre la expresiôn gënica y su regulaciôn ..11TESIS A PLANTEAR ....... 13

MATERIAL Y METODOS1. CONDICIONES DE CULTIVO .............................. 162. CONDICIONES DE TRATAMIENTO

2.1. Extracciôn de las glândulas salivales ......... 172.2. Tratamiento " in vivo " e " in vitro " ........ 172.3. Tratamiento comparado de glândulas hermanas .... 182.4. Medios de incubaciôn " in vitro " .............. 19

3. METODOS CITOLOGICOS3.1. Preparaciones citolôgicas ..................... 233.2. Técnica autorradiogrâfica ..................... 24

4. METODOS BIOQUIMICOS4.1. Extracciôn y purificaciôn de los âcidos nucleicos

4.1.1. Fijaciôn de las glândulas ............... 244.1.2. Digestiôn enzimâtica de las glândulas .... 254.1.3. Purificacidn del extracto ................ 26

4.2. Medida de la concentraciôn en âcidos nucleicos . 284.3. Condiciones de marcado radiactivo

4.3.1. Proteinas ............................. 284.3.2. RNA ....... ............................... 28

4.4. Estimacidn de la radiactividad âcido-soluble .... 294.5. Estimaciôn de la radiactividad incorporada en ma-

cromolêculas ......... 294.5.1. Incorporaciôn en proteinas ............... 3 04.5.2. Incorporaciôn en RNA .................... 3 0

4.6. Medida de la actividad RNA polimerasa ......... 314.7. Contaje de la radiactividad .................. 324.8. Anâlisis electroforético............ .............

4.8.1. Soluciôn tampôn de electroforesis ....... 3 24.8.2. Preparaciôn de los geles ................. 334.8.3. Preparaciôn de la muestra.. ................ 3 34.8.4. Condiciones de la separaciôn electroforêtica. 334.8.5. Procesamiento de los geles. Perfiles de ab-

sorciôn y radiactividad ..................... 3 4

5. CONDICIONES DE ESTERILIDAD ........................... 356. MATERIALES .

6.1. Productos qulmicos ............................. 3 66.2. Equipo ........................................... 386.3. Otros ............................................ 39

RESULTADOS1. ESTUDIOS PRELIMINARES

1.1. La glândula salivai de Chironomus .......... 4 01.2. Extracciôn y purificaciôn del RNA glandular

1.2.1 Rendimiento comparado de la extracciôn utili-zando proteinasa K y pronasa ............... 4 2

1.2.2. Cinética de la extracciôn con pronasa ..... 441.2.3. Caracterizaciôn del grado de pureza en âci­

dos nucleicos ............................. 4 631.3. Incorporaciôn de uridina-H en RNA

1.3.1. Caracterizaciôn enzimâtica de la radiactivi­dad incorporada ........................... 51

1.3.2. Cinética de la incorporaciôn " in vitro "a.- Incorporaciôn en medio C.R.............. 52b.- Incorporaciôn en medio de Cannon ...... 55

1.4. Anâlisis electroforético del RNA1.4.1. Perfil del RNA recién sintetizado ........ 571.4.2. Consideraciones metodolôgicas

a.- Dependencia del perfil con la concentra­ciôn de agarosa ....................... 61

b .- Fijaciôn y lavado del gel ............ 65

1.4.3. Caracterizaciôn enzimâtica del perfil de radiactividad ............................ 67

1.4.4. Perfil del RNA estable .................. 691.5. Valoraciôn relativa de la actividad de trans-

cripciôn .................................... 69INCORPORACION DE URIDINA EN AUSENCIA DE SINTESIS DE PROTEINAS2.1. Efecto " in vivo " de la cicloheximida sobre la

3 3incorporaciôn de lisina-H y uridina-H ...... 742.2. Efecto " in vitro " de la cicloheximida y aniso-

micina sobre la incorporaciôn de lisina-H^ .... 772.3. Efecto " in vitro " de la cicloheximida y aniso-

micina sobre la incorporaciôn de uridina-H^ ... 7 92.4. Efecto " in vitro " de la cicloheximida sobre

la estabilidad del RNA recién sintetizado .... 84ESTUDIO SOBRE PERMEABILIDAD CELULAR A LA URIDINA .. 8 93.1. Medida de la tasa da captaciôn de uridina .... 903.2. Medida de la captaciôn e incorporaciôn " in vi­

tro " de uridina, en funciôn de su concentraciôn externa ........................................ 94

3.3. Efecto " in vitro " de diverses inhibidores so­bre la tasa de captaciôn e incorporaciôn de uri­dina ............................................. 99

3.4. Efecto del choque térmico sobre la tasa de cap­taciôn e incorporaciôn de uridina. Relaciôn con el estado de puffing.

3.5. Efecto de la cicloheximida y anisomicina sobrela tasa de captaciôn de uridina .............. 113

3.6. Determinaciôn de la radiactividad incorporada" corregida " 120

4. EFECTO " IN VITRO " DE LA CICLOHEXIMIDA Y ANISOMI­CINA SOBRE LA SISTESIS DE RNA . .4.1. Modificaciôn de la radiactividad incorporada

" corregida " 1254.2. Efecto de la cicloheximida y anisomicina so­

bre las distintas especies de RNA4.2.1. Mediciôn de la radiactividad âcido-soluble

bajo condiciones de fijaciôn con etanol... 1344.2.2. Anâlisis electroforético ................. 137

5. EFECTO " IN VIVO " DE LA CICLOHEXIMIDA SOBRE LA SIN­TESIS DE RNA5.1. Efecto de la cicloheximida sobre la sîntesis de

RNA total, y en sus diferentes especies ...... 1475.2. Anâlisis autorradiogrâfico de la incorporaciôn

de uridina-H^ . ................. 1556. EFECTO DE LA CICLOHEXIMIDA SOBRE LA ACTIVIDAD RNA

POLIMERASA ....................................... 160

DISCUSION 1651. ASPECTOS METODOLOGICOS

1.1. Sobre los estudios preliminares ............... 1661.2. Sobre la actividad de captaciôn de uridina ... 168

2. RESPUESTA DE LA ACTIVIDAD DE TRANSCRIPCION A LA INHI- BICION DE LA SINTESIS DE PROTEINAS2.1. Sobre el incremento de la sîntesis de RNA ..... 1712.2. Sobre el carâcter selective de la inhibiciôn ... 175

2.2.1. RNA nucleoplâsmico .................. 1762.2.2. RNA nucleolar ............................ 178

2.3. En torno a un modelo de regulaciôn de la trans-cripciôn ...................................... 185

2.3.1. Restricciôn y relajaciôn. Modelo de Grossy Pogo .................................... 185

2.3.2. Posibles mécanismes de control de la ex- presiôn génica en células politenizadas .. 189

2.3.3. Sobre la activaciôn de la sîntesis deRNA nucleolar ............................. 193

CONCLUSlONES ........................................ 195

BIBLIOGRAFIA ................. '.................... 197

RESUMEN

Los resulta dos que han dado lugar a esta Tesis p u e d e n agru- parse en dos grandes a p a r t a d o s : uno de carâc t e r m e t o d o l ô g i c o , co nsi stente en la pu esta a punto de las têcnicas bioq u i m i c a s ap- tas para el anâlisis de la act i v i d a d de tr a n s c r i p c i o n en g l â n d u ­las salivales de Chironomus; otro de c a râter temâtico, donde se estudia la respuesta de la a c t i vi dad de tr an s c r i p c i o n a la inhi- biciôn de sîntesis de proteinas.

1.- En p r i m e r lugar se han c a r a c t e r i z a d o las c on dicione s de marcado radiact ivo del RNA, esp ec i a l m e n t e bajo incubac io n " in vitro " de las glândulas aisladas, asî como las condicio nes de extracciôn enz imâ ti ca y pos t e r i o r p u r i f i c a c i ô n del ex tracto que p r opor ci onan una soluci ôn de elevada p u r e z a en âcidos nucleicos. Se ha elaborado tambien un metodo de anâli si s e l e c t r o f o r é t i c o del RNA glandular, mediant e geles de ag a r o s a en columna, carâc- terizândose de este modo los p e r fil es de RNA recien s in te tizado y estable en Chirono mus p a l l i d i v i t t a t u s y Chiro no mus t h u m m i .

De especial interés, por su total no v e d a d en este sistemabiologico, ha sido la p u es ta a punto de un método que nos per-

3mite estimar la tasa de cap tac iô n ( " upt ak e-" ) de u r i d i n a - H ,medida como ra dia c t i v i d a d âc ido-solubl e, en glân dulas salivales. Su uso nos ha permitido :

+) Observar que la tasa de c a p t ac iô n de uridina es diferen- cialmente mo d i f i c a d a por ap li c a c i ô n " in vitro ” de diverses i n h i b i d o r e s .

+) Comprobar que la di scr e p a n c i a o b s e r v a d a entre el tamaho e intensidad de marc ado a u t o r r a d i o g r â f i c o en algun puf f p a r t i ­cular, como c o n s e c u e n c i a de un choque térmico, es explica bl e por los cambios inducidos en la tasa de c a p t a c i ô n de u r i di na por efecto del tratamiento.

Estas obs er v a c i o n e s nos han l l e v a d o , . p ara una e s t i m a c i ô n re-? lativa de la activ id ad de t r a n s c r i p c i ô n , a la n e c e s i d a d de elabo rar factores de c orrec ci ôn que eli mi nen el influjo de po s i b l e s

II

cambios en la tasa de ca ptaci ôn del nuc l e o s i d o precursor. Su a pl ic aciôn puede modificar c u a n t it at iva o, incluse, cualitat iva- mente, las conclusiones inicia lmente alcanzad as de la sôla con- s id er aciôn de la r ad iactivi da d i ncorpo ra da en RNA.

2.- En el aspecto temâtico, se ha o b s ervad o que la a p l i c a ­ciôn de c l ic lohexim id a o anisomicina, a dosis fuertemente inhi- bitor ia s de la sîntesis de proteinas, inducen un in cr eme nto de la ra d i a c t i v i d a d incorp orada en RNA. Dicho inc re me nto no es e x ­p l i c a b l e ni por una m o d i f i c a c i ô n en la es ta b i l i d a d del RNA r e ­cien s in tetiza do ni, al menos total mente, por el au mento produ- cido en la tasa de captaciô n de uridina-H^. Elle parec e indicar que en taies condic iones se induce una act i v a c i ô n de la sîntesis de RNA.

La medida de la a c t ivid ad RNA p o l i m e r a s a en celulas fijadas ha confirmado, de un modo directo, la existen ci a de dicho a u m e n ­to de la activ idad de trans cripc iôn, y que este es debido, al menos en parte, a una mayor a c t i vi dad de " iniciaciôn ".

Por ultimo, el anâlisis e l e c t r o f o r é t i c o ha de mostra do que la respuesta a la inhibiciôn de la sîntes is de pr o t e i n a s es di- ferente para las distintas especies de RNA recién sintetizado:

+) Se produce un increm ento mâ ximo par a el RNA de pe qu eno tamano ( 4-5S ).

+) En menor medida, dicho incr emento afecta también al hnRNA de grande y mediano pes o molecul ar.

+) La respuesta d e 1 RNA de origen n u c l e o l a r ( p r e - r R N A ) es di s t i n t a segûn los in hibidore s sean apl ic ados " in vitro " ( pro-d uc ié ndose act iva ci ôn ) o " in vivo " ( p r o d u c i é n d o s e entoncesuna i n h i biciôn selectiva de esta especie de RNA ).

Estes datos, y otras evidencias m o r f o l ô g i c a s aducidas, su- gieren la existencia de distintos m é c a n i s m e s de r e g u laciô n de la t r a n s c r i p c i ô n en células p o l i t enizad as , con alta esp ec ificida d local de acciôn. Estos m é c a nisme s son d iscuti do s a la luz del fe- nômeno de " control estri cto ", y su o b s e r v a c i ô n en orga nismes e u c a r i ô t i c o s .

I N T R O D U C C I O N

1. NATURALEZA Y SIGNIFICADO DE LOS CROMOSOMAS POLITENICOS.

1.1. Generalidades.El descubrimiento de los cromosomas politênicos se debe a

Balbiani, quien, en 1881, detectô la presencia de unos cor- pûsculos nucleares, de naturaleza desconocida, en células de glândulas salivales de Chironomus. Sin embargo, su naturale­za cromosémica no fue reconocida hasta cincuenta ahos mâs tar­de, gracias a los trabajos de Heitz y Bauer ( 1933 ),y Painter ( 1933 ), Desde entonces hasta nuestros dîas han sido muy abundantes las investigaciones llevadas a cabo usando como ma­terial este tipo peculiar de cromosomas.

La cêlula politenizada se origina a partir de la célula diploide, mediante sucesivos ciclos de replicacién de cada cromatidio, sin que tengan lugar paralelamente otros procesos caracterîsticos del ciclo celular: p.e., la disgregacién de la membrana nuclear, o la divisién en células hijas. En la mayorîa de los casos ésto da como resultado final una célula poliploide ( fenémeno de " endopoliploidîa " ). Pero en otras ocasiones los cromatidios, al término de cada ciclo replicati- vo, no se segregan: pueden entonces permanecer como un conjun­to de fibras o manojos de fibras lâxamente unidas - p.e., en células nuctricias del ovario de Calliphora erytrocephala ( Beermann, 1962 ) - o bien, y es lo mâs frecuente, quedar como un haz muy compacto de filamentos întimamente apareados. El resultado final es, en este caso, la formacién de estruc-

turas cromosômicas gigantes, interfâsicas, conocidas como " cromosomas politênicos

Endopoliploidîa y politenia son, pues, fenômenos estre- chamente relacionados por un origen comûn, que incluso, en ocasiones, pueden coexistir simultâneamente ( p.e., en Ce- cidômidos ).

Aunque estudiado fundamentalmente en Dipteros, la exis­tencia de células politenizadas esté ampliamente extendida en la Naturaleza: p.e., en otro orden de insectos, Colémbo- los ( Prabhoo, 1961; Cassagneau, 1971 ); en protozoos ( p.e., Alonso y Pêrez-Silva, 1961; Ammermann, 1965 ), y en plantas superiores ( p.e., Nagl, 1969 a,b ). Su significado biolégi- co radica en ser un eficiente mecanismo de multiplicacién del material genêtico en orden a la producciôn en gran cantidad de ciertos metabolites précisés para el desarrollo del orga­nisme . De este modo, la acumulacién de muchas copias de ma­terial genêtico en unas pocas células, acompanado de un ex- traordinario crecimiento de las mismas, se présenta como una alternativa a su mayor proliferacién numêrica.

1.2. Estructura del cromosoma politénico.Considerado transversalmente, la estructura del cromoso­

ma politénico responde al apareamiento estrecho de muchas co­pias del mismo cromatidio. Por lo general, ademâs, los homô- logos permanecen întimamente unidos, con lo que el nûcleo aparece como dotado de un nûmero haploide. En cuanto al gra­do de politenia, depende del nûmero de ciclos de replicacién.

lo cual es propio de cada especie y, dentro de ella, del teji- do considerado. En el caso de los Dipteros, la politenizaciôn mâxima ocurre generalmente en las glândulas salivales: en Chironomus se ha estimado en 12 - 13 ciclos ( Daneholt y Eds- trom, 1967 ).

Examinado longitudinalmente, el cromosoma aparece estruc- turado como una sucesiôn de bandas e interbandas, con una dis- posiciôn regular y constante para cada especie. El concepto de banda e interbanda, a nivel del cromosoma completo, mues­tra una Clara relaciôn con el concepto de cromômero e inter- cromômero, a nivel del simple cromatidio. Si el cromômero es el resultado de un grado mâximo de espiralizaciôn de la fibra y, por tanto, de concentraciôn de DNA y proteinas asociadas, la banda es la consecuencia del apareamiento exacto de los cientos o miles de cromômeros hermanos y homôlogos résultan­tes del proceso de politenizaciôn; De ahi que, aproximadamen-, te, el 95% del DNA cromosômico estâ localizado en las bandas, y sôlo el 5% restante en las interbandas ( Swift, 1962; Beermann, 1972 ). Lo mismo que el cromômero, la banda es en­tonces una unidad de replicacién ( Keyl y Pelling, 1963; Plaut, 1963 ) y de transcripciôn ( Pelling, 1964; Beermann, 1972 ) .

1.3. El fenémeno de puffing y su significado.Esta estructura regular del cromosoma politénico se ve

alterada por la apariciôn de expansiones latérales en ciertas

regiones, conocidas como " puffs El puff puede definirse como una modificaciôn local en la disposiciôn estructural del DNA y proteinas asociadas, lo cual supone la desespiraliza- ciôn de las fibras y la acumulaciôn de ribonucleoproteinas en tal lugar. Por lo general el puff estâ restringido a una sola banda ( implicando probablemente también las interbandas adyacentes: Beermann, 1962 y 1967 ), aunque en ocasiones pue­de ser originado por varias bandas vecinas ( p.e., los ani- llos de Balbiani 1 y 2 en Ch. tentans: Beermann, 1962; Lam­bert, 1975 ). En todo caso, el nûmero de cromômeros que par- ticipan activamente en el puff - es decir, que estân actual- mente desespiralizados - puede variar. Como discutiremos mâs adelante, esa mayor o menor participaciôn constituye probabla- mente un modo peculiar de regulaciôn local de la expresiôn génica en las células politenizadas.

Respecto a su significado funcional, se admite que el fe- nômeno de puffing indica cambios y, mâs exactamente, creci­miento en la actividad génica de los loci implicados ( Beer­mann, 1956 ). En efecto, mediante anâlisis autorradiogrâfi- cos parece probarse que, si bien existe incorporaciôn a lo largo de todo el cromosoma, ésta es considerablemente mâs in­tense en las regiones desespiralizadas ( Berendes, 1973 ), y que parece darse una relaciôn directe entre el tamaho del puff y la actividad local de transcripciôn ( Pelling, 1964 ).

Por lo general, los puffs son estructuras transitoriàs y

y de pequehas dimensiones, ligadas en su apariciôn a pério­des concretos del desarrollo y a determinadas condiciones am- bientales. ( Como revisiôn sobre el fenômeno de puffing y su regulaciôn puede verse Ashburner, 1970 y 1972 a,b; Beren­des, 1972; Bostock y Sumner, 1978 ). Sin embargo se ha detec- tado en algunas especies la presencia de puffs gigantes que muestran una actividad especialmente intensa de sîntesis y acumulaciôn de RNA { Pelling, 1964; Daneholt et al., 1969 a,b ). Tal es el caso del genoma de Chironomus, donde se originan y permanecen desde los comienzos de la politenizaciôn. A estas estructuras , por lo general de carâcter permanente, se les conoce como " anillos de Balbiani " ( BRs ), para diferenciar-los de los pequehos puffs transitorios.

El valor de estos anillos de Balbiani estriba en que cons- tituyen un sistema extraordinariamente favorable para el abor- daje del problema de la expresiôn génica y su regulaciôn en organismes eucariôticos, por cuanto permiten una fâcil caracte­rizaciôn morfolôgica y un anâlisis directo de los productos detranscripciôn del locus o loci implicados.

1.4. Caracterîsticas de la transcripciôn en glândulas sali­vales de Chironomus.

Dada la finalidad de este trabajo, se hace necesaria una referenda especial a las propiedades y distribuciôn del RNA recién sintetizado - i.e., el RNA râpidamente marcado en un corto pulso - en glândulas salivales de Chironomus. Las es-

pecies de RNA pueden ser agrupadas en très grandes familias: RNA heterogéneo, RNA nucleolar, y RNA de bajo peso molecular.

a .- RNA heterogéneo ( hnRNA ).Se incluye bajo esta categorîa una gran variedad de es­

pecies de RNA recién sintetizado, que forman una distribuciôn continua en los perfiles obtenidos mediante diverses técnicas de fraccionamiento. Como en otros géneros de Dipteros, en Chi- ronomus tiene una especial relevancia la fracciôn de hnRNA de alto peso molecular, con una distribuciôn 15S - lOOS ( p.e., en Ch. tentans: Edstrom y Daneholt, 1967; Daneholt, 1972; en Ch. thummi: Serfling et al., 1972 ). Aunque la mayor parte de este RNA es de muy corta vida, siendo râpidamente degradado en el nûcleo, su importancia radica en la presencia de algu- nos transcriptos gigantes, dotados de caracterîsticas peculia- res. A saber:

+) Sintetizados a nivel de los grandes anillos de Balbia­ni, son procesados y exportados al citoplasma sin apenas de- gradaciôn parcial.

+) Mantienen, ya en el citoplasma, una vida media muy larga.

+) Se estima que su papel estriba en ser los mensajeros de las proteinas especîficas de secreciôn sintetizadas por las células politenizadas.

Un ejemplo de estos mensajeros especîficos lo constituye

el transcripto 75S, del que se ha obtenido un grado de carac­terizaciôn casi ûnico en el campo de la biologîa molecular de células eucariôticas. La conjunciôn de técnicas citolôgicas y bioquîmicas ha permitido aislar e identificar los genes responsables de su sîntesis, conocer su procesamiento y se- guir su exportaciôn al citoplasma, y finalmente aislarlo en forma polisomal.

Para una informaciôn mâs compléta sobre este tema puede verse Daneholt ( 1974 y 1975 ), y Case y Daneholt ( 1978 ).

b . - RNA de_orig_en nueleol^ar £re-rRNA_) .El transcripto inicial ribosomal, pre-rRNA 38S, es sin­

tetizado en la regiôn del organizador nucleolar, segûn ha si­do demostrado en Chironomus por técnicas de hibridaciôn in situ ( Lambert et al., 1972 ). Es procesado en el propio nu- cleolo a las formas preribosomales intermedias 30S y 23S, que a su vez darân lugar a las especies ribosomales estables 28S y 18S ( Edstrom y Daneholt, 1967; Ringborg et al., 1970;Ringborg y Rydlander, 1971; Serfling et al., 1974 ).

c .- RNA de bajo peso molecular.La fracciôn prédominante de esta categorîa estâ consti-

tuida por el RNA de transferencia ( Egyhazi et al., 1969 ). Técnicas de hibridaciôn in situ han permitido demostrar que los loci responsables de su sîntesis se hallan disperses por todo el genoma ( Edstrom et al., 1971 ). Sintetizado como un pre-tRNA 4-5S, es râpidamente procesado, probablemente en el

interior del nûcleo, a la forma estable 4S.En menor proporciôn se incluye también aquî el pequeno

componente ribosomal 5S. Como en otros Dipteros, su sîntesis se localize fuera de los genes nucleolares, sin aparente re­laciôn con las otras especies ribosomales ( Wieslander et al., 1975 ).

Por ûltimo, se incluyen también aquî otras pequehas espe­cies, como los RNAs 7S y 8S { Egyhâzi et al., 1971 ), de fun­ciôn desconocida.

2. CONTROL DE LA TRANSCRIPCION EN ORGANISMOS EUCARIOTICOS.Dentro del conjunto de los procesos implicados en la ex­

presiôn génica, la transcripciôn puede considerarse su nivel primario. Por lo tanto, el conocimiento de los mecanismos de regulaciôn de la transcripciôn constituye una de las piezas clave para la comprensiôn, a nivel molecular, de los proce­sos de desarrollo y diferenciaciôn celular, por los cuales, a partir de una célula inicial indiferenciada, se desemboca en un organisme completo como conjunto.bien estructurado en ôrganos, tejidos y células morfolôgica y funcionalmente es- pecializados.

El mecanismo de transcripciôn y su regulaciôn ha sido fundamentalmente caracterizado en procariotes. Por el contra­rio, son escasos los resultados obtenidos hasta el momento en células eucariôticas, donde la aproximaciôn experimental se ve sensiblemente dificultada por la mayor complejidad del

sistema biolôgico y, en particular, de la estructura del ge­noma. De ahi que se haya recurrido frecuentemente a:

+) Extrapolar las conclusiones alcanzadas en organismes eucariôticos.

+) Establecer modelos de regulaciôn muy teôricos y aprio- rîsticos, pero carentes de una suficiente base experimental.

2.1. Empleo de inhibidores de la sîntesis de proteinas.No obstante, se estâ efectuando en los ûltimos ahos un

serio esfuerzo experimental para abordar directamente estos problemas en células eucariôticas. Uno de los modos de apro­ximaciôn a este problema es el estudio de la dependencia del mecanismo de transcripciôn con el aporte proteico; es decir, analizar las modificaciones en la actividad de sîntesis de RNA bajo condiciones de inhibiciôn de la sîntesis de proteinas Para lograrlo se utilizan:

+) Tratamientos fîsicos; p.e., dieta déficiente en algûn componente esencial; modificaciôn de la temperatura en lîneas celulares termosensibles, etc.

+) Tratamientos quîmicos; por aplicaciôn de inhibidores especîficos de la sîntesis de proteinas.

Han sido muchos los inhibidores empleados con esta fina­lidad. Aquî nos referiremos sôlamente a la cicloheximida ( CHM ) y anisomicina ( ANS ), que serân los dos utilizados a lo largo del présente trabajo.

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a.- La cicloheximida ( actidione ) es un inhibidor amplia­mente utilizado para estudios teôricos. Aislado por Whiffen et al.( 1946 ) a partir de Streptomyces griseus, estâ dotado de peso molecular 281,34, siendo su fôrmula;

0 //OH

H-C3

CHH

NHCH 2

La CHM es enormemente tôxica en todos los organismos euca­riôticos donde ha sido ensayada, inhibiendo violentamente lasîntesis de proteinas, pero no parece tener efecto alguno enbacterias. La molêcula actûa uniêndose a los ribosomas ( subunidad 60S ), impidiendo la translocaciôn del peptidil tRNA durante la fase de " elongaciôn " de la cadena peptî- dica en formaciôn. Algunos resultados parecen indicar también posibles interferencias con otras fases del mecanismo de tra- ducciôn.

Por lo demâs, la CHM produce otras alteraciones metabô- licas: p.e., acumulaciôn de ciertos metabolitos, en particular nucleôtidos ( Siegel y Sisler, 1964 ), inhibiciôn parcial dela sîntesis de DNA ( Kerridge, 1958; Bennet et al., 1964;Venkatesan, 1977 ), y, en particular, la inhibiciôn preferen- cial de la actividad RNA polimerasa nucleolar ( Fiala y Da­vis, 1965; Muramatsu et al., 1970; Onishi et al., 1977 ). Se

11

admite comunmente que estos efectos no son directos, sino me- diados por la inhibiciôn de la sîntesis de proteinas,

b.- La anisomicina, por el contrario, ha sido escasamente utilizada en estudios teôricos. Aislada a partir de varias es­pecies de Streptomyces ( Sobin y Tanner, 1954 ), présenta un peso molecular de 265,3, siendo su fôrmula:

H3CO

CH

OCOCH? OH\ L :NIH

La ANS inhibe especîficamente la sîntesis de proteinas en células eucariôticas, sin afectar aparentemente a bacterias. Su sitio de acciôn son los ribosomas, uniêndose de manera muy reversible a la subunidad 60S, donde actûa impidiendo la for­maciôn del enlace peptîdico, a nivel de la fase de " elonga­ciôn ". Por lo demâs présenta otros efectos sobre la sîntesis de DNA ( inhibiciôn parcial ) y de RNA ( Grollman , 1967 ).

Una informaciôn mâs compléta sobre estos y otros inhibido­res, y su mecanismo de acciôn, puede verse en las revisiones de Jimênez ( 1974 ) y Vâzquez ( 1975 ).

2.2. Interés de las células politenizadas para los estudios sobre la expresiôn génica y su regulaciôn.

En el contexte de esta problemâtica, la glândula salivai

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de Chironomus constituye un sistema biolôgico de caracterîsticas idôneas para el abordaje de las cuestiones relacionadas con el control de la expresiôn génica. En efecto:

a.- En primer lugar, présenta una elevada especializaciôn funcional. Sus células politenizadas estân altamente diferencia- das en orden a la producciôn de unas pocas proteinas de secre­ciôn. Sintetizados a partir de los grandes mRNAs especîficos, estas proteinas , en nûmero no superior a doce, suponen al me­nos el 80% del total de la actividad de traducciôn { Doyle y Laufer, 1969; Wobus et al., 1970 ).

b .- En segundo lugar, los cromosomas politênicos son cromo- somas interfâsicos - y, por ello, génicamente activos - dota­dos de caracterîsticas morfolôgicas que permiten compatibilizar los resultados obtenidos por métodos bioquîmicos con determina- ciones citolôgicas complementarias. Asî:

+) Su gran tamano hace fâcilmente aplicables técnicas auto­rradiogrâf icas y de hibridaciôn in situ.

+) El control del modelo de puffing y sus modificaciones, co­mo expresiôn morfolôgica de cambios en la actividad génica, per- mite establecer relaciones estructura - funciôn.

c .- Por ûltimo, la aplicaciôn de técnicas de microdisecciôn posibilita el aislar zonas muy definidas del genoma, incluso a nivel de genes individuales, y caracterizar sus productos de transcripciôn.

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TESIS A PLANTEAR.

Como se indicô previamente, los inhibidores especîficos de la sîntesis de proteinas constituyen una herramienta efi- caz para la aproximaciôn al conocimiento de las relaciones transcripciôn - traducciôn, y de los mecanismos implicados en la regulaciôn de la sîntesis de RNA, por cuanto permiten observar la respuesta del sistema de transcripciôn a un cese en el aporte de nuevas proteinas. Entre dichos inhibidores, la cicloheximida es sin duda alguna el mâs empleado en cêlu- las eucariôticas, habiéndose desarrollado, en los ûltimos quince anos, una amplîsima bibliografîa sobre su aplicaciôn en diverses sistemas biolôgicos: protozoos ( Rudick y Weis- man, 197 3; Eckert et al., 197 5 ), levaduras ( Siegel y Sis­ler, 1964; De Kloet, 1965; Fukuhara, 1965; Foury y Goffeau, 1973; Gross y Pogo, 1974, 1976 a,b ), hongos ( Fiala y Davis, 1965; Horgen y Griffin, 1971 ), plantas superiores ( Key, 1966;^Ross, 1968; Delseny et al., 1977 ), y en células de ma- mîferos ( p.e., células HeLa: Summers et al., 1966; Willems et al., 1969; Smulson y Thomas, 1969; células de tumor ascî- tico: Franze-Fernândez y Fontanive-Sangliesa, 1973; Cereghini y Franze-Fernândez, 1974; Grummt et al., 1976; células he- pâticas: Higashi et al., 1968; Rizzo y Webb, 1969; Muramatsu et al., 1970 ).

En células politenizadas, la CHM y otros inhibidores han sido utilizados primordialmente en estudios citolôgicos, con

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Gl fin de examiner el efecto de la sîntesis de proteinas so­bre el estado de puffing ( Villanueva, 1978; Santa-Cruz, en preparaciôn ), sobre la inducciôn de nuevos puffs ( Clever, 1967; Serfling et al., 1969; Schoon y Rensing, 1973 ), o so­bre la formaciôn de " droplets " ( Dîez y Stockert, 1976 ). Por el contrario, son muy escasas las determinaciones de ca- râcter bioquîmico en este sistema biolôgico. Con tal motivo, esta Tesis busca iniciar, en cierta medida, una complementa- ciôna nivel bioquîmico de los conocimientos citolôgicos ya alcanzados,

Los cinco aspectos fundamentales del trabajo a realizar serân:

1.- Poner a punto las técnicas fundamentales que nos per- mitan estimar la actividad de transcripciôn: extracciôn, pu- rificaciôn, medida y caracterizaciôn de la sîntesis de RNA.

2.- La actividad de transcripcidn es medida como incor- raciôn en RNA de un precursor marcado, por lo que es preciso contrôler toda posible alteraciôn previa en la tasa de cap- taciôn { " uptake " ) por las células de dicho precursor. Da­do que este, parâmetro nunca habîa sido abordado experimental- mente en células politenizadas, intentaremos elaborar un mê- todo apto para medir la tasa de captacién de uridina en glân- dulas salivales, y estudiaremos las modificaciones inducidas en dicha tasa por diversos tratamientos fîsicos y quîmicos.

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G

3.- Se examinarâ el efecto de la inhibiciôn de la sîn­tesis de proteinas, por aplicaciôn " in vivo" e " in vitro " de CHM y ANS, sobre la sîntesis de RNA total glandular.

4.- Con el fin de observer si la acciôn de dichas dro- gas présenta o no un carâcter selectivo, su efecto serâ exa- minado en las distintas especies de RNA recién sintetizado, y se intentarâ corroborer las conclüsiones alcanzadas me- diante anâlisis autorradiogrâfico.

fV 5.- Por ûltimo, al menos en algûn caso, se buscarâ laconfirmaciôn de los fenômenos observados mediante estima- ciôn directe de la actividad RNA polimerasa.

M A T E R I A L M E T 0 D 0 S

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1. CONDICIONES DE CULTIVO.

Se us6 como material biolôgico glândulas salivales de lar­ves de Chironomus pallidivittatus y Chironomus thummi. Las larves de Ch. pallidivittatus provenîan de Tubingen ( Repûbli- ca Federal de Alemania ), y las de Ch. thummi fueron recogi- das en Masamagrell ( Valencia ). En todo caso, las larves usa- das en los experimentos estaban adaptadas a las condiciones ar- tificiales de mantenimiento en el laboratorio por desarrollo durante varias generaciones.

En este trabajo se utilizaron sôlamente larves en el cuar- to estadîo larvario, anteriores al perîodo prepupal.

El cultivo de las larves se efectuô esencialmente de acuer- do a lo descrito por Beermann ( 1952 ). Las puestas eran re- cogidas e implantadas individualmente en cubetas de plâstico conteniendo aproximadamente 0,5 litros de medio artificiel de cultivo, de composiciôn;

Componente por 10 1 de H^O dest.— ■- —~ ■ d' - ■ ■ ■ClNa ............... 0,35 gSO^Mg ......................... 0,61 gClgCa ......... 0,36 gCO^HNa ......................... 0,05 gPO^HK ......................... 0,02 gClgFe ( soluciôn al 1% ) .... 1 ml.

Al medio de cultivo se le adicionaban algunas lâminas de celulosa. El desarrollo de las larves tenîa lugar en una câ-

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mara de cultivo , bajo condiciones constantes de 18®C de tem­perature y un perîodo de 18 h de luz - 6 h de oscuridad. La alimentaciôn se realizaba dos veces por semana con polvo de or- tige , y el ague de cultivo era renovada aproximadamente cada 15 dies.

El apareamiento de los adultos se efectuaba de distinto modo, segûn especies. En el caso de Ch. thummi, tenîa lugar libremente, en su propia cubeta de cultivo, recubierta de una gasa fine. En el caso de Ch. thummi, se establecîan parejas individualmente en tubos de vidrio conteniendo un pequeho volumen del agua de cultivo.

2. CONDICIONES DE TRATM4IENT0.

2.1. Extracciôn de las glândulas salivales.Las larvas eran previamente lavadas en un volumen amplio

de agua de cultivo estêril, a fin de eliminar en lo posible todo c o n t a m i n a n t e externo, siendo entonces decapitadas bajo la lupa. Las glândulas eran extraidas fâcilmente aplicando una ligera presiôn con ayuda de una aguja enmangada.

2.2. Tratamiento " in vivo " e " in vitro ".La terminologîa aquî utilizada no se corresponde con el

significado usual en la literatura , donde " in vivo " e " in vitro " hacen referencia, respectivamente, a los ensayos realizados con células vivas complétas, o con fracciones o extractos celulares. En nuestro caso entendemos por tratamien-

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to " in vivo" al aplicado sobre la larva compléta, en tanto tratamiento " in vitro " es el que se aplica directamente sobre las glândulas salivales previamente explantadas, Por lo demâs, esta terminologîa es la usual en los estudios reali­zados con glândulas salivales de Dîpteros.

Para aplicar el tratamiento " in vivo ", las larvas eran mantenidas en un cristalizador conteniendo un volumen adecua- do de su propio medio de cultivo, previamente filtrado. La pro- porciôn usualmente empleada era de 4 - 8 larvas por 50 ml del medio.

Para aplicar un tratamiento " in vitro ", las glândulas extraidas eran transportadas individualmente, con ayuda de una fina aguja de vidrio, a un pocillo de fijaciôn contenien­do un volumen adecuado del medio de incubaciôn ( véase 2.4.). Conforme a Lambert y Daneholt ( 1975 ), la proporcion era de 2 - 4 glândulas por 25 jil del medio.

2.3. Tratamiento comparado de glândulas hermanas.Cuando la técnica " in vitro " tenîa que ser aplicada pa­

ra comparar entre sî el efecto de dos tratamientos, o de un tratamiento respecto a su control ( no tratado ), se recurriô habitualmente a la incubaciôn en paralelo de grupos de glân­dulas hermanas. Para elle, cada glândula del par de la misma larva era transferida a un pocillo distinto, conteniendo el mismo medio de incubaciôn, conforme se muestra en el esquema 1,

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//

/ / / /

/ // /

/ // X/ /I ( etc )

Latva 1

Larva 2

I I / I I /I I /I I /

Tratamiento A

Esquema 1

s \\ ’\ \ Larva 3

\ \

\

titTratamiento B ( o control )

De este modo, al comparar resultados obtenidos con glân­dulas hermanas, se evitan los efectos de variabilidad consecuen- tes a la utilizaciôn de larvas distintas.

2.4. Medios de incubaciôn " in vitro ".Se emplearon dos medios de incubaciôn distintos para los

tratamientos " in vitro Chironomus ringer ( C.R. ) y medio de Cannon.

El medio C.R. ( Robert, 1971 ) es una soluciôn salina apro- piada para périodes breves de incubaciôn. Su composiciôn es:

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ClNa ..................... 0,51 gCIK ..... 23,86 mgCl 2 Ca ................... 14,43 mgen 100 ml de tampôn Tris-CIH 10 mM, pH 7,3.

El medio de Cannon, segdn modificaciôn de Ringborg y Ryd- lander ( 1971 ), es un complejo fisiolôgico mâs apto para in- cubaciones prolongadas. Su composiciôn es :

a.- Sales inorgânicas:PO^HNa2.2H20 .......... 356 mgCl2Mg.6H20 .......... - 93,5 mgCIK 82 mgClNa 420 mgSO^Na2 .1 0 H 2 O ........ ..2.000 mgCl 2 Ca. 2 H 2 O .......... 56 mg

b .- Azûcares;Glucosa 140 mgFructosa 80 mg

Sacarosa 8 0 mgTrehalosa .......... 1.000 mg

c .- Acidos orgânicos.Mâlico 13 4 mg<X-Cetoglutârico ..... 74 mgSuccînico .......... 12 mgFumârico 11 mg

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d . - ^^noâc ido^.L - Arginina mono ClH 14 0 mgDL - Lisina mono ClH ......... 250 mgL - Histidina 500 mgL - Acido aspârtico 7 0 mgL - Asparagina 70 mgL - Acido glutâmico ......... 120 mgL - Glutamina 120 mg

Glicina 130 mgDL - Serina 220 mgL - Alanina 4 5 mgL - Prolina 70 mgL - Tirosina 10 mgDL - Treonina 7 0 mgDL - Metionina 180 mgL - Fenilalanina 30 mgDL - Valina 4 0 mgDL - Isoleucina 20 mgDL - Leucina . . 30 mgL - Triptôfano 20 mgL - Cistina 5 mgL - Cisteina mono ClH ...... 16 mg

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e.- Complejo vitamînico B.Tiamina - mono ClH ........... 0,.004 mgRiboflavina ........... 0,,004 mgAcido nicotînico ........... 0,,004 mgAcido pantoténico ( sal câlcica ) 0,,004 mgBiotina ........... 0,,004 mgAcido fôlico ........... 0,,004 mgInositol ........... 0,,004 mgColina ........... 0,.004 mg

f.- Otros componentes.Colesterol 6 mgPenicilina ( sal potâsica ) .... 12 mgRojo fenol 2 0 mgEstreptomicina ( sulfato ) .... 3 0 mg

Los solutos se disuelven en aqua bidestilada. Las sales inorgânicas, salvo el Cl2 Ca, se disuelven en 60 ml. El Cl 2 Ca

en 15 ml. Los azûcares y âcidos orgânicos, en 30 ml. Los ami- noâcidos ( excepto la L - Glutamina ), en 7 5 ml. Colesterol, penicilina, estreptomicina y rojo fenol, en 5 ml. Las vitaminas se preparan disolviendo 1 mg de cada componente en 1.000 ml, de los cuales se tomarân 4 ml. Las soluciones son entonces mez- cladas, siendo el Cl 2 Ca lo ûltimo que se anade. El pH se ajus­ta a 7,2 , por adiciôn de NaOH IN. Finalmente, con agua bides­tilada se compléta hasta un volumen final de 3 00 ml.

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La soluciôn es filtrada a través de filtres Millipore, de tamano de filtro 0,45 yim, dividida en porciones de 2,5 ml, y conservadas en congelaciôn.

Para su uso, una porciôn es râpidamente descongelada, aha- diôndosele la L - Glutamina ( 1 mg/ 2,5 ml ). El sobrante se desecha.

3. METODOS CITOLOGICOS.

3.1. Preparaciones citolôgicas.Las glândulas eran fijadas durante 1 - 2 min en etanol—acê-

tico ( 3:1 ), y tenidas durante 30 - 60 min con una mezcla de carmin - orceina ( .2:1 ) , tras lo cual eran montadas sobre el portaobjetos en una gota de âcido acêtico al 50%, o bien de acético - lâctico ( 1:1 ). Previamente a la colocaciôn del cu- breobjetos la secreciôn glandular era retirada, pues en caso contrario impediria un buen aplastamiento. Tras colocar el cu- breobjetos se golpeaba suavemente con una aguja anmangada, pa­ra romper los nûcleos y disperser los cromosomas. El proceso se completaba aplastando el material mediante una suave pre- siôn dactilar.

Para obtener preparaciones permanentes se empleaba una tin- ciôn mâs prolongada ( 90 - 120 min ) . Las preparaciones eran efectuadas conforme se ha descrito arriba, y el material era inmediatamente congelado manteniendo las preparaciones en nie- ve carbônica durante 7 - 1 0 min. Tras levantar el cubreobjetos,

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el material era deshidratado sumergiendo la preparaciôn en alcohol isopropilico durante 3 min. El montaje definitive se llevaba a cabo en una gota de euparal, colocando sobre esta el cubreobjetos.

3.2. Técnica autorradiogrâfica.Las glândulas eran marcadas " in vitro " durante 10 min

en presencia de 100 ^Ci/ml de uridina-H^, deteniêndose la incorporaciôn del precursor por fijaciôn en etanol— acético ( 3:1 ). La tinciôn, montaje, congelaciôn y deshidrataciôn del material se llevaba a cabo del mismo modo que para las preparaciones permanentes ( véase 3.1.), utilizando en este caso portaobjetos gelatinados, y suprimiendo el montaje defi­nitive en euparal. En su lugar, el material era sometido a una postfijaciôn, manteniendo las preparaciones en una mez­cla de formalina - etanol ( 7:3 ),. durante 24 h, en frîo.

Al cabo de ese tiempo era colocado el film, siendo ex- puestas las preparaciones en la oscuridad durante una semana a 4®C, tras lo cual se efectuaba el revelado.

4. METODOS BIOQUIMICOS.

4.1. Extracciôn y purificaciôn de los âcidos nucleicos.4.1.1. Fijaciôn de las glândulas.

Tras ser extraidas ( y, por lo general, tras un tratamien­to " in vitro " ), las glândulas eran fijadas en el mismo pocillo de fijaciôn , bien sea con etanol absoluto frîo,du-

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rante 2 - 4 min, o bien con TCA al 10% en frîo durante 10 min. El primer método fue el preferido cuando el RNA tenîa que ser analizado electroforéticamente, pues permite condiciones mâs suaves de digestiôn ( ver punto siguiente ) con menor riesgo de degradaciôn parcial del RNA. El segun- do método fue el empleado habitualmente cuando se desaba medir la radiactividad soluble intracelular.4.1.2. Digestién enzimâtica de^las__gyndulas.

En nuestras condiciones de experimentacién los âcidos nu­cleicos eran extraidos mediante digestién enzimâtica de las glândulas salivales, siendo transferidas a un vial contenien­do un volumen adecuado del medio de digestién. Con tal fin se han empleado dos enzimas proteolîticos; proteinasa K y pronasa.

a . - Extraccién_med^ante pi^oteina£a__K^La composiciôn del .medio de digestién fue la descrita

por Gross-Bellard ( 1973 ) :125 ^g/ml de proteinasa K EDTA 10 mM ClNa 10 mM 0,5% de SDSen soluciôn tampôn Tris-CIH lOmM, pH 8.

La digestién se llevô a cabo durante 24 h a 37°C.b .- Extracciôn mediante pronasa.La composiciôn del medio de digestién fue la descrita por

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Daneholt y Hosick ( 1973 ):1 mg/ml de pronasa0,5% de SDSen soluciôn tampôn Tris-CIH 20 mM, pH 7,4.Las condiciones de digestiôn dependian del método de fi­

jaciôn previamente aplicado: tras fijaciôn con etanol, 15 min de digestiôn a temperatura ambiente; tras fijaciôn con TCA era preciso aplicar unas condiciones mâs enérgicas ( habitual­mente, 1 h a 37°C ). •4.1.3. Purificaciôn del extracto.

a.- Purificaciôn simple.Una desproteiniciôn simple del extracto fue llevada a ca­

bo por precipitaciôn alcohôlica. El digesto era transferido a un tubo de centrifuga, y los âcidos nucleicos precipitados con 2 volûmenes de etanol absoluto, 0,3 M de ClNa, a -20°C durante toda la noche. Habitualmente se adicionaba ademâs 2 5 - 5 0 jiq de RNA exôgeno ( procedente de ribosomas de leva- dura ) para favorecer la precipitaciôn. El precipitado era recogico por centrifugaciôn durante 10 min a 12.100 g , se- cado parcialnente mediante corriente de nitrôgeno, y redisuel- to en un yolumen adecuado de soluciôn tampôn de electrofore- sis ( véase su composiciôn mâs adelante, en 4.8.1. ).

b .- Purificaciôn exahustiva.Alternativamente, una purificaciôn mâs rigurosa del ex­

tracto fue llevada a cabo, de acuerdo bâsicamente al método

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descrito por Hastings y Kirby ( 1966 ). Tras ser transferido a un tubo de centrifuga, el digesto era desproteinizado me­diante dos sucesivas fenolizaciones. En cada una de ellas se procediô a adicionar un volumen igual de una mezcla de fenol- - cloroformo ( l:f ) ( fenol saturado con un tampôn Tris-CIH20 mM, pH 7,4, conteniendo 0,1% de 8-hidroxiquinoleina ), agitando el tubo suavemente durante 10 min, tras lo cual las fases eran separadas por centrifugaciôn durante 10 min a 12.100 g. Tras la primera centrifugaciôn se eliminaba la fasefenôlica, conservando la fase acuosa mas la interfase. Trasla segunda centrifugaciôn la fase acuosa era recogida y trans­ferida a otro tubo de centrifuga, y sometida a precipitaciôn alcohôlica, conforme se describiô en el apartado anterior.

Para eliminar todo posible residuo de fenol, el precipi­tado recogido era sometido a una purificaciôn ulterior median­te sucesivos lavados con:

+) etanol al 75%, conteniendo 1% de acetato potâsico.+) etanol al 95%, conteniendo 1% de acetato potâsico.+) etanol al 95%.

En cada caso se adicionaba un volumen adecuado de la solu­ciôn alcohôlica, se agitaba suavemente durante 5 min, y se centrifugaba en las condiciones habituales, eliminando el so- brenadante. El sedimento final era secado parcialmente con corriente de nitrôgeno, y redisuelto en un volumen adecuado de soluciôn tampôn de electroforesis.

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4.2. Medida de la concentraciôn en âcidos nucleicos.La estimaciôn del contenido en âcidos nucleicos de una

muestra purificada se realizô por anâlisis espectrofotomê- trico, midiendo la absorciôn a luz U.V. 260 nm, utilizando cubetas de cuarzo de 1,5 ml de capacidad y 1 cm de paso de luz. Previamente el fonde de absorciôn del medio de redisolu- ciôn empleado ( tampôn de electroforesis ) era medido, y de- ducido de la absorciôn obtenida para las muestras problema.

Para estimar la concentraciôn en âcidos nucleicos de la muestra, a partir de su valor de absorciôn, se adoptô la re- laciôn 50 yig/ml = 0,9 D.O. Dicha relaciôn fue obtenida con anterioridad mediante una curva de calibrado, utilizando so­luciones de diferente concentraciôn de âcidos nucleicos co- merciales.

4.3. Condiciones de marcado radiactivo.4.3.1. P^roteina£.

El marcado de las proteinas glandulares se realizô " in vitro ", por incubaciôn de las glândulas durante 20 min en medio C.R. conteniendo 7 50 yuCi/ml de lisina-H^.4.3.2. RNA.

El marcado del RNA glandular se realizô " in vivo " o " in vitro ".

3" In vivo ", se llevô a cabo por adiciôn de uridina-H y citidina-H^ al medio de cultivo, en una proporciôn de 10 yaCi de cada nucleôsido por mililitro del medio.

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" In vitro ", se llevô a cabo incubando las glândulas en medio C.R. o en medio de Cannon, conteniendo uridina-H^ a concentraciôn y tiempo variables.

4.4. Estimaciôn de la radiactividad âcido - soluble intrace­lular .

Esta técnica ha tenido como finalidad medir el total de radiactividad intracelular no incorporada en macromoléculas,

3tras un marcado ” in vitro " con uridina-H . El método emplea­do para ello ha consistido en una adaptaciôn a nuestro siste­ma biolôgico del descrito por Tamm et al. ( 197 6 ) para célu­las de mamîferos.

Tras el marcado, el medio de incubaciôn conteniendo la uridina-H^ era retirado. Para eliminar en lo posible todo re­siduo de radiactividad en el pocillo o externamente adherido a las glândulas, estas eran sometidas sucesivamente a tres la­vados, adicionando cada vez 1 ml del medio de incubaciôn, en frîo. ( El tiempo total de estos lavados suponîa aproximada­mente 6 min ). Posteriormente las glândulas eran fijadas adi- cionando 1 ml de TCA al 10%, en frîo, durante 10 min. La ra­diactividad âcido - soluble era estimada entonces, tomando alîcuotas de 50 jil del medio de fijaciôn, que eran deposita- das en filtres de fibra de vidrio GF/A.

4.5. Estimaciôn de la radiactividad incorporada en macromo­léculas .

La actividad de sîntesis de proteinas o RNA ha sido estimada

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a partir de la tasa de incorporaciôn en macromoléculas del precursor radiactivo apropiado, medida tal incorporaciôn co­mo radiactividad âcido-insoluble.

4.5.1. I.ncorpo^rac_i6n enjp£Ote^nas.Las proteinas fueron extraidas por digestién quîmica de

las glândulas salivales. El método de extracciôn y valora- ciôn aquî utilizado ha sido bâsicamente el descrito por Cle­ver et al.( 1969 ) .

3Tras el marcado con lisina-H , el medio de incubaciôn era retirado y las glândulas fijadas con TCA al 10% conte­niendo 0,1% de lisina, durante 5 min, en frîo. Tras ello, eran digeridas en 1 ml de NaOH IM, durante 20 min, a 45°C.

Para medir la radiactividad âcido-insoluble se tomaban alîcuotas de 100 ^1 del digesto, adicionando a cada una de ellas 2 5 yul de albûmina bovina y 100 jil de TCA al 40% con­teniendo 0,1% de lisina, y haciendo precipitar con exceso de TCA al 5% conteniendo 0,1% de lisina, durante 15 min, en frîo. Los precipitados eran recogidos por filtraciôn en fil­tres de fibra de vidrio GF/C, y lavados con amplios volûmenes del medio usado para precipitar, (

4.5.2. Incorporaciôn en RNA.Tras el marcado radiactivo, las glândulas eran fijadas

y los âcidos nucleicos extraidos por digestiôn enzimâtica y, eventualmente, purificados, conforme ha sido anteriormente descrito ( véase 4.1. ). Para valorar la radiactividad âci-

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do-insoluble, bien sea directamente sobre el digesto o sobre el extracto purificado, se tomaban alîcuotas de la muestra a las que se adicionaba 2 5 yag de RNA comercial, precipitando con TCA al 5% en exceso, durante 15 min, en frîo. Los precipi­tados eran entonces recogidos por filtraciôn en filtros de fibra de vidrio GF/C, siendo lavados con amplios volûmenes de TCA al 5%.

Cuando paralelamente se deseaba valorar la radiactividad total de la muestra, se tomaban alîcuotas de la misma, que eran directamente depositadas en filtros de fibra de vidrio GF/A.

4.6. Medida de la actividad RNA polimerasa.La técnica aquî utilizada es una adaptaciôn realizada en

nuestro laboratorio para estudios bioquîmicos ( Vadillo, 1978 ) del método citolôgico usualmente empleado para el ensayo " in situ " de la actividad RNA polimerasa endôgena en células fi­jadas ( Moore, 1971 y 1978; Moore y Ringertz, 1973 ).

Las glândulas salivales eran fijadas durante 5 min en una mezcla de etanol - acetona ( 1:1 ), siendo a continuaciôn lava­das repetidamente en un tampôn Tris-CIH 0,1M, pH 7,9, conte­niendo: sacarosa 0,15M

mercaptoetanol 12 itiM ClgMg 12 mM

Las glândulas eran entonces incubadas durante 20 min a a 37°C en 100 jil de mezcla reactiva. La composiciôn de esta

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mezcla era 300 nmoles de cada uno de los nucleôtidos ATP,3GTP, CTP, y 24 nmoles de UTP-H , en 0,5 ml del tampôn antes

indicado. Tras la incubaciôn, las glândulas eran sometidas a una postfijaciôn durante 5 min con etanol absoluto frîo conteniendo pirofosfato sôdico 10 mM, y lavadas luego breve- mente con etanol al 70%. Finalmente los âcidos nucleicos eran extraidos y purificados por simple precipitaciôn alohôlica, y la radiactividad incorporada en RNA era valorada, segûn ha sido anteriormente descrito ( 4.1.2., 4.1.3. y 4.5.2.).

4.7. Contaje de la radiactividad.Los filtros, en los que la muestra radiactiva habîa sido

recogida, eran introducidos en miniviales de vidrio de 3 ml de capacidad, y secados en la estufa a 90 - 100°C durante 1 h. Tras ello eran llenados con 2,5 ml de mezcla de cente- lleo ( tolueno conteniendo 5%o de butil-PBD ) , y la radiac­tividad medida en un contador de centelleo lîquido.

4.8. Anâlisis electroforêtico.El anâlisis de los âcidos nucleicos ha sido llevado a ca­

bo mediante geles de agarosa en columna. El sistema empleado ha consistido en una técnica personal elaborada a partir de los métodos descritos por Steinemann ( 1971 ) y Estrom y Tan- guay ( 1974 ) .4.8.1. S^ol_u£iô^n__tænpôn de__e^ectro^ore£i£.

Con tal finalidad se ha empleado un tampôn Tris-BO^H^90 mM, pH 8, conteniendo ademâs:

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EDTA 2,5 mM 0,1% de SDS.

4.8.2. Prep£rac£6n de__los__geles^La agarosa era disuelta en el tampôn de electroforesis

por calentamiendo en un autoclave ( a 120°C y 1 atmôsfera de presiôn durante 20 min ). Habitualmente se empleaba una con­centraciôn del 1% en agarosa.

Para preparar los geles, là soluciôn de agarosa era ver- tida en tubos de cuarzo de 6 mm de diâmetro interno y 17 cm de longitud, dispuestos verticalmente, hasta aproximadamente 1,5 cm del borde superior. A fin de prévenir la desecaciôn del gel, el resto de la columna era completada con agua destilada. Las columnas eran dejadas gelificar durante toda la noche a 37°C.,

4.8.3. Preparaciôn de la muestra.Los extractos de âcidos nucleicos, tras ser purificados

por precipitaciôn alcohôlica, eran redisueltos en un volumen apropiado del tampôn de electroforesis conteniendo 5% de sa­carosa. Para la separaciôn electroforética se tomaban alî­cuotas de 50 yal, que contenîan el équivalente al contenido de 2 - 3 glândulas en âcidos nucleicos, y 10 yug de rRNA exô­geno no marcado de levadura.

4.8.4. Çond£c_ione£ de__la £eparaciôn_e^ectro£o£ética.El proceso de separaciôn se llevô a cabo en el interior de una

34

câmara frîa, a 4°C.La fracciôn superior de las columnas ( interfase agua -

- gel ) era eliminada, y los geles sometidos entonces a un la-vado previo ( preelectroforesis ) en un campo elêctrico de 4 mA/gel durante 30 min. Las muestras eran entonces coloca- das en la parte superior de cada columna, y los âcidos nuclei­cos separados, sucesivamente, en un campo elêctrico de :

+) 2 mA/gel, durante 30 min ( electroforesis A )+) 4 mA/gel, durante - habitualmente - 4 5 min ( elec­

troforesis B ) .

4.8.5. Proc£sam_iento de_los_^geles^ Perf^les_jde absorc_î6n y radiactividad.

Tras la separaciôn electroforética, los geles eran some­tidos a un barrido por un haz de luz U.V. 254 nm, obtenién- dose asî los perfiles de absorciôn.

Tras ser extraidos de sus tubos de cuarzo, los geles eran, por lo general, sometidos a fijaciôn con TCA al 5% durante 2 h, a 4°C, y posteriormente lavados durante toda la noche en un volumen amplio de agua destilada. Tanto el TCA como el agua eran mantenidos en agitaciôn constante mediante un agitador magnêtico. Cada gel era entonces cortado en fracciones de 1 mm con un cortador de geles, y cada dos fracciones depositadas en un minivial de vidrio de 3 mm de capacidad. Los miniviales eran completados con 2,5 ml de una mezcla de centelleo compuesta por :

35

Solueno 350 50 mlPPO 6 gPOPOP 0,2 gMetanol 20 mlTolueno ; completando hasta 1 litro.

Las muestras eran dejadas digerir durante toda la noche a 37°C. Los perfiles de radiactividad se obtenfan por contaje de las muestras en un contador de centelleo lîquido.

5. CONDICIONES DE ESTERILIDAD.

La extracciôn y procesamiento del RNA se llevaba a cabo habitualmente en presencia de SDS, para minimizar toda posible acciôn degradativa por parte de las nucleasas. Para una mayor protecciôn, todos los precesos se desarrollaban, en lo posible, en condiciones de esterilidad.

SolucionesLas soluciones tampôn, soluciones salinas y medios de in­

cubaciôn, fueron esterilizados habitualmente al autoclave ( a 120°C y 1 atmôsfera de presiôn, durante 20 min ).

El medio de Cannon, por incluir sustancias termodegrada- bles, era esterilizado por filtraciôn, utilizando una bomba de vacîo, y a través de filtros Millipore de 0,45 jim de tamano de poro.

36

InstrumentalEl instrumental de vidrio resistente a altas temperaturas

fue esterilizado por calor seco, en una estufa a 180°C duran­te 2 h.

El material de plâstico, metâlico, y de vidrio no resisten* te, fue esterilizado al autoclave o expuesto a una radiaciôn con luz U.V. germicida.

6. MATERIALES.

6.1. Productos quîmicos.Se incluyen aquî solamente aquellos productos quîmicos

cuyas caracterîsticas detalladas y referencia comercial pue- den resultar de interés.

a , - C^o^ponente£ de^ medio de__Cannon.• Todos los componentes del medio de Cannon ( sales inor-

gânicas, azûcares, âcidos orgânicos, aminoâcidos, complejo vitamînico B, y otros componentes ) han sido obtenidos de Merck. Se excepctûan la colina, de Serva Feinbiochemica, y la penicilina ( G sôdica cristalizada ), de la Compahîa Espaho- la de Penicilina y Antibiôticos, S.A.

b .- Drogas^La actinomicina D ( actinomycin D, grade III ),cK-amani-

tina, DMSO ( dimetyl sulfoxide, grade I ), provienen de Sigma. La cicloheximida ( actidione, from Streptomyces griseus ), de Koch - Light Laboratories; y la anisomicina, de Pfizer.

37

c . - Nucle6£ido£,__nuc^e6t£dos^ âc£dos__nuc^e£cos.La uridina se adquiriô de Koch - Light Laboratories.

El ATP ( adenosine 5"'“triphosphate, disodium ), CTP ( cytidi- ne 5'- triphosphate, disodium ), GTP ( guanosine 5'- triphos­phate, disodium ) provenîan de Schwarz/Mann, El RNA ( Ribo­nucleic acid from yeast, type XI ),de Sigma. El rRNA utiliza­do como marcador en los geles de electroforesis fue obtenido por desproteinizaciôn de ribosomas de levadura, donados por el Dr. A. Jiménez.

d.- En£ima£.La DNasa ( deoxyribonuclease I, from bovine pancreas )

provenia de Calbiochem, y la RNasa ( ribonuclease A, type I, from bovine pancreas ), de Sigma Chemical Chemical Co. La pronasa ( pronase, free of nucleases, B grade ) se adquiriô de Calbiochem, y la proteinasa k de Merck.

e . - ProducW£ radiactivo^.3 3La citidina-H : (5- H)Cytidine , de actividad especîfica

25-3 0 Ci/mmol; la uridina-H^: (5,6-^H)Uridine, de actividad especîfica 40-60 Ci/mmol; la lisina-H^: L - (4,5(n)-^H)Lysine, de actividad especîfica 10-30 Ci/mmol; y el UTP-H^; (5-^H)Uri­dine 5'- triphosphate, ammonium salt, de actividad especîfica 10-30 Ci/mmol, se obtuvieron de Amersham.

Para evitar las posibles incidencias de una variaciôn en la radiactividad especîfica, para cada experimento o experi-

38

mentos de una misma serie, se utilizd el mismo lote del pro- ducto radiactivo.

f. - D^eterm^nac^ôn de__la radiactividad.El butil-PBD se obtuvo de Ciba Limited. El tolueno, de

FEROSA.

g . - Anâl_is^s__e]^ectroforéyco_^La agarosa ( agarosa C ) fue una donaciôn de Pronadisa.

La sacarosa empleada ( sucrose p.A., ribonuclease free ) se obtuvo de Serva. El solueno ( soluene 3 50 ) se adquiriô a Packart Instrument. El PPO y POPOP se adquirieron a Inter­technique .

6.2. Equipe.+) Agitador magnético: Selecta.+) Agitador de tubos: Gri Gel.+) Balanzas: Mettler, modelos P1210 y H54.+) Calculadora: Hewlett-Packard 45.+) Bano: Memmert,+) Centrîfuga: Servall, con un rotor tipo SS-34.+) Equipo de electroforesis:

- Cubeta : Savant Instruments.- Fuente de alimentaciôn: ISCO, modelo 4 90.- Lector de geles: ISCO, modelo 659.- Monitor de absorciôn; ISCO, modelo UA-5- Cortador de geles: Mikle Laboratory

+) Lâmpara germicida ; Sylvania.

39

+) Equipo de filtraciôn por vacio; Millipore.+) Espectrofotômetros: Guilford 2400 y Spectronic 710.+) Estufa; Selecta, modelo 203A.+ ) Contador de centelleo liquide : Intertechnique, modelo

SL32.+) Fotomicroscopio: Zeiss.+) Lupa: Nikon.+) Microscopio: Zeiss.+) pHmetro: Radiometer, modelo PHM62.

6.3, Otros materiales.+) Cubetas para espectrofotometria: TSL.+) Filtres de papel de fibra de vidrio: Whatman, GF/A y

GF/C.+) Material para autorradioagrafias:

- pelicula AR-10 de Kodak- revelador D-19 de Kodak- fijador ultrarâpido de Kodak.

+) Pelicula para fografias: Panatomie X, 17 DIN, de Kodak

R E S U L T A D O S

40

1. ESTUDIOS PRELIMINARES.

1.1. La glândula salivai de Chironomus.Las glândulas salivales de Chironomus constituyen dos es-

tructuras de forma arrinonada, de dimensiones 0,7 5 - 1 mm de longitud y 0,3 - 0,4 mm de anchura, situadas a ambos lados del inicio del tubo digestive larvario. Aunque estân formadas por distintos tipos de células ( véase Kloetzel y Laufer,1969 ), la gran mayoria de su actividad metabôlica radica en las grandes células politenizadas que, en numéro aproximado de 30, se disponen periféricamente formando una monocapa, en tante que su producto de secrecién es vertido y se almacena en el centre de la glândula. Un detalle de un lôbulo de una glându- la salivai puede observarse en la fig. la. Las células apare- cen bien individualizadas, y les cromosomas politénicos se aprecian como fibras oscuras en el interior de les nûcleos.

El .genoma de estas células esté constituido por cuatro gran^ des cromosomas politénicos,( fig.lb ). Como la dotacién de es­tas especies es 2n = 8, es de notar entonces que le que aqui denominamos " cromosoma politénico " es, en realidad, el resul- tado de un apareamiento intime de cada par de homélogos. Por le demâs, le mâs destacable desde un punto de vista citolôgico es la presencia de un gran nucleolo y, dentro de su espectro de puffing, de grandes anillos de Balbiani ( BRs ). El genoma de Ch. pallidivittatus présenta su nucleolo sobre el cromosoma II, y très BRs, numerados sucesivamente como 2,1 y 3 ( Beermann,

Figura 1 .- En detalle de un lôbulo de una glân­dula salivai de Ch. pallidivittatus. La masa fibri- lar oscura dentro de los nücleos corresponde a los cromosmas politénicos.

En b, a mayor aumento, se muestra el genoma de una de las células.

1962 ), sobre el cromosoma IV ( fig. 2a ). Por el contrario, en el caso de Ch. thummi, tanto el nucleolo como sus dos BRs ( de numeraciôn 2 y 1, segûn Santa-Cruz et al., 1978 ), aparecen localizados en el cromosoma IV ( fig. 2b ). ^;v

1.2. Extracciôn y purificaciôn del RNA glandular.Dada la pequeha masa de tejido que supone la glândula sa­

livai de Chironomus, la homogeneizaciôn del material por medios mecânicos séria sumamente dificultosa. De ahi que hayamos re- currido a la utilizaciôn de métodos quimicos o enzimâticos: di­gestion con NaOH para extraer las proteinas, y con un enzima proteolitico para la extracciOn de âcidos nucleicos.

1.2.1. Rend^m^ento comparado de_^la extracciôn_^u;tiy^ando pro- teinasa K y pronasa.

El enzima utilizado casi exclusivamente para extraer el RNA en nuestro sistema biolôgico ha sido la pronasa ( Daneholt, 1970; Pelling, 1970 ). Sin embargo la extracciôn de âcidos nu­cleicos ha sido llevada a cabo en otros materiales utilizando proteinasa K. Con tal motivo, el primer paso ha consistido en estudiar comparativamente el rendimiento de la extracciôn del RNA glandular utilizando uno u otro enzima.

Dos grupos de glândulas procédantes de larvas aproximada- mente iguales del mismo cultivo fueron marcados " in vitro " durante 20 min en medio C.R. conteniendo 750 ^Ci/ml de uridi-

3na-H . Los âcidos nucleicos del primer grupo fueron extraidos

Figura 2 .- En a, cromosoma IV de una cêlula polite- nizada de glândula salivai de Ch. pallidivittatus. Obsérvense los 3 anillos de Balbiani ( BRs 2, 1, 3 ).

En b, el cromosoma IV correspondiente a Ch. thummi, mostrando, ademâs de los 2 anillos de Balbiani { BRs 2 y 1 ), un gran nucleolo ( N ).

/

t

s

44

en 1 ml de medio conteniendo proteinasa K, y los del segundo grupo en 1 ml de medio conteniendo pronasa ( véase Material y Métodos, 4.1.2. ). Tras valorar la radiactividad âcido-insolu- ble, el rémanente no utilizado de los digestos fue sometido a purificaciôn exahustiva ( Material y Métodos, 4.3.1. ), y la radiactividad âcido-insoluble de las soluciones finales valo- rada nuevamente.

Los valores obtenidos se recogen y comparan en la tabla 1. Como puede observarse, la extracciôn del RNA total glandular se muestra mucho mâs efectiva en presencia de pronasa, por lo que este enzima fue definitivamente adoptado como método de extracciôn para los expérimentes posteriores.

1.2.2. Çinéticajde ^^_extracc^ôn con pronasa.Se tratô a continuaciôn de encontrar las condiciones de

tiempo minimo que proporcionan un rendimiento mâximo de extrac­ciôn del RNA glandular. Esto ténia como objeto el evitar que una digestiôn innecesariamente prolongada pudiera dar lugar a una degradaciôn parcial del RNA, cosa de especial interés cuando se tratara de llevar a cabo una caracterizaciôn electro- forética del mismo.

Tras ser marcadas " in vitro " durante 3 0 min en medio de3Cannon conteniendo 2.500 yuCi/ml de uridina-H , las glândulas

fueron fijadas en etanol absolute y transferidas entonces a un tubo de centrifuga conteniendo 2 ml de medio de digestiôn. A tiempos de 5, 10, 20, 40, 60 y 120 min se tomaron alicuotas

45

cuentas/glândula

protein.KpronasaValoraciôn protein.K pronasa

Tras digestiôn 760 22168

Tras purificaciôn 75 437 17

Tabla 1 . - Rendimiento de la extracciôn enzimâtica de RNA.3Tras un breve marcado " in vitro " con uridina-H , los

âcidos nucleicos de glândulas salivales de Ch. pallidi­vittatus fueron extraidos en presencia de proteinasa K o pronasa, siendo posteriormente purificados, y valorândose la radiactividad âcido-insoluble.

46

para valorar la radiactividad âcido-insoluble. Antes de cada toma, el digesto era centrifugado a 48 0 g durante 2 min, para hacer sedimentar todo posible resto glandular no digerido, que era desprendido tras la toma por agitaciôn del tubo.

Los valores obtenidos, expresados como radiactividad por glândula, se resumen en la fig. 3. Como puede observarse, en condiciones de fijaciôn con etanol, un valor mâximo para la ex­tracciôn del RNA en presencia de pronasa se obtiene ya a los 10 min de digestiôn. Por otro lado, a tiempos superiores a 2 0 min parece existir una pequeha caida en la radiactividad in- corporada. No es excluible que esto pueda deberse, al menos en parte, a una degradaciôn parcial del RNA, como se indicô ante- riormente.

1.2.3. Ç a r a et e r a c ô n de_l grado de__pureza _en £ciôos_nuc]l^e^cosPara comprobar si los métodos descritos de purificaciôn

( Material y Métodos, 4.1.3. ) dan como resultado soluciones de un adecuado grado de pureza en âcidos nucleicos, dos grupos de 60 glândulas fueron sometidos a digestiôn en presencia de pronasa. Uno de los digestos ( a ) fue purificado por simple precipitaciôn alcohôlica, en tanto que el segundo ( b ) lo fue mediante la técnica de purificaciôn exahustiva. En ambos casos se prescindiô, al precipitar, de la adiciôn de RNA exôgeno.Los extractos finales fueron redisueltos en 1 ml de tampôn de electroforesis. Como control ( c ) se empleô una soluciôn de RNA comercial puro, 4 0 yag/ml, en el mismo tampôn.

47

cECD

c(bDuTJCDTDUCDTJCDcr

6 -

5-

A-

3 -

T “

10-]--------1— ----- 1---20 40 60

min. en pronasa

-/A120

Figura 3.- Cinética de la extracciôn de RNA en presencia de pronasa. Glândulas de Ch. thummi brevemente marcadas con uridina-H^ y fijadas con etanol absoluto fueron dige- ridas en medio conteniendo pronasa, y la radiactividad âcido-insoluble del digesto valorada en los tiempos indi- cados en ascisas. En ordenadas, los valores de radiactivi­dad son expresados como cuentas por glândula.

48

De cada una de las soluciones se obtuvo un espectro con- tinuo de absorciôn, por lectura a luz U.V. entre longitudes de onda de 230 y 320 nm. Dichos espectros se representan en la fig. 4. Se puede observar, en primer lugar, que los perfiles de las muestras de âcidos nucleicos glandulares ( a,b ) pre- sentan una clara semejanza con el perfil de la soluciôn con­trol ( c ). Ademâs, en todos los casos se alcanza un mâximo de absorciôn a longitud de onda aproximadamente a 260 nm, y las curvas muestran una perfecta configuraciôn sin que existan indicaciones de una sensible contaminaciôn con restos de pro­teinas o fenol. Por todo ello podemos concluir que los proce- dimientos de purificaciôn empleados - incluse la simple pre­cipitaciôn alcohôlica - proporcionan soluciones adecuadamente puras en âcidos nucleicos.

Como prueba adicional, se midieron los valores de absor­ciôn a luz U.V. 260 y 280 nm de varias muestras de varias mues­tras de âcidos nucleicos glandulares sometidos a purificaciôn exahustiva. Como control, dicha absorciôn fue también medida para soluciones de RNA comercial puro de concentraciones 15,25 y 40^g/ml. Los resultados obtenidos, asi como las relacio- nes de absorciôn 260/280 se recogen en la tabla 2. La obtenciôn de relaciones aproximadamente igual a 2, y esencialmente se­me jantes a las obtenidas con RNA comercial, confirma el eleva- do grado de pureza de los extractos purificados de âcidos nu­cleicos glandulares.

Figura 4.- Espectro de absorciôn de âcidos nucleicos. Extractos de âcidos nucleicos de glândulas salivales fueron purificados mediante simple precipitaciôn al­cohôlica ( a ), o por purificaciôn exahustiva ( b ). La absorciôn fue leida de modo continuo a luz U.V., y los perfiles résultantes comparados con el obtenido de una soluciôn de RNA comercial de levadura ( c ) .La linea inferior en cada grâfico corresponde a la absorciôn del tempôn empleado.

49

I . » -

1.00

040 -

OiO0.20

260 280 MOlongiiud dr o n d a (n m )

O 0

0.20

120300

longitud d r onda ( nm )

0 .60 -

OdOJO-

320280 300260

long itud d r onda ( nm )

50

D.O.260

260 nm. 280 nm. 280Glândulas( muestra n°)

1 0,266 0,128 2,07

2 0,315 0,149 2,11

3 0,349 0,170 2,05

RNA comercial

15 ^g/ml 0,124 0,053 2,33

25 ^g/ml 0,231 0,110 2,1

4 0 ytig/ml 0,357 0,157 2,27

Tabla 2.- Estimaciôn del grado de pureza en âcidos nu­cleicos. Acidos nucleicos procédantes de glândulas sali­vales de Ch. pallidivittatus fueron purificados, y medi­da su absorciôn a luz U.V. 260 y 280 nm. Los valores al- canzados son comparados con los obtenidos a partir de un RNA comercial de levadura. La absorciôn fue medida en

cubetas de 0,5 cm de paso de luz.

51

1.3. Incorporaciôn de uridina-H^ en RNA.

1.3.1. Caracter^zac_iôn en^imâtica_de ^a_r^d^a£t_ivyad__inco^r-porada.

Pese a la naturaleza del nucleôsido radiactivo empleado3( uridina-H ), no se puede excluir a priori una incorporaciôn

parcial de radiactividad en macromolêculas distintas de RNA. Una incorporaciôn significativa en DNA, a partir de un marcado de 1 h con el nucleôsido arriba indicado, ha sido medida en nuestro laboratorio, utilizando material vegetal ( Aller et al., 1978 ). Por ello ha sido necesario comprobar hasta qué punto la radiactividad âcido-insoluble valorada, tras un cor- to pulso de las glândulas con uridina-H^, es una medida real de su incorporaciôn en RNA.

Treinta glândulas fueron marcadas durante 2 0 min en medio de Cannon conteniendo 2.500 yaCi/ml de uridina-H^, y el extrac­to purificado de âcidos nucleicos fue redisuelto en 600 yal de un tampôn Tris-CIH 10 mM, pH 7,4. Se tomaron entonces alicuo­tas de 100 jil, que fueron incubadas durante 1 h a 37°C con;

+) 25 yag/ml de DNasa libre de ribonucleasas, en Cl 2 Mg 10 mM.

+) 100 yag/ml de RNasa A de pâncreas bovino.Como control, una alîcuota igual del extracto, sin adiciôn

de enzima, fue sometida a incubaciôn en las mismas condiciones Los digestos résultantes fueron purificados por simple pre­

cipitaciôn alcohôlica, midiéndose la radiactividad âcido-inso-

52

lubie. Los valores obtenidos, reducidos a cuentas por glândula, se recogen en la tabla 3.

Como puede observarse, la radiactividad âcido-insoluble era prâcticamente en su totalidad sensible a la RNasa, lo que nos ha indicado que, al menos tras periodos cortos de marcado, el isôtopo se incorpora prâcticamente de un modo exclusivo en el RNA glandular.

1.3.2. Cin^âtica__de lj^_i^co^rporac^i6n_"_^in vitro ".Dado que muchos de los tratamientos aplicados ( adminis-

traciôn de drogas, marcado radiactivo ) lo han sido bajo con­diciones de incubaciôn " in vitro ", se ha hecho preciso com­probar experimentalmente la regularidad del metabolismo celu- lar en dichas condiciones, dentro de los mârgenes de tiempo de incubaciôn empleados.

a.- Incorporaciôn en medio C.R.Grupos con el mismo nûmero de glândulas, procédantes de ,

larvas aproximadamente iguales del mismo cultivo, fueron mar-3cados en medio C.R. conteniendo 750 jiC±/ml de uridina-H du­

rante 10, 20, 40, 60 y 90 min. En cada caso los âcidos nuclei­cos fueron extraidos y la radiactividad incorporada medida, primero directamente sobre los digestos, y posteriormente so­bre los extractos ya purificados.

Los resultados obtenidos se resumen en la fig. 5, expresa­dos relativamente al valor medido sobre el digesto correspon­diente a 90 min de marcado. Como puede observarse, el creci-

53

Tratamiento cuentas/glând. % del control

Control 6.240

+ DNasa 6.613 106

+ RNasa 36 0,58

Tabla 3.- Caracterizaciôn enzimâtica de la in­corporaciôn de uridina-H? Glândulas salivales de Ch.thummi fueron marcadas brevemente con uridina-H^, y fracciones iguales del extracto de âcidos nucleicos tratadas con DNasa y RNasa, Los valores obtenidos de radiactividad âcido- -insoluble son comparados con el de una frac- ciôn control no tratada.Cada resultado corresponde a la media de un du- plicado.

54

RNA no purificado RNA purificado

1 0 0 -

cËoCD 60-03

UC

A —2 0 -

10 20 60 90m in uto s de marcado

Figura 5.- Incorporaciôn de uridina en medio C.R. Glândulas salivales de Ch. pallidivittatus fue­ron incubadas en medio C.R. conteniendo uridina-H^, durante los tiempos indicados en ascisas. En or­denadas se expresan los valores de radiactividad âcido-insoluble, relativamente al valor obtenido a 9 0 min de incubaciôn.

Cada punto représenta la media de dos experimentos.

55

miento de la radiactividad es prâcticamente lineal con el tiem­po, lo que indica que, dentro del intervalo estudiado, la ac­tividad de transcripciôn " in vitro " de las glândulas en me­dio C.R. se mantiene normalmente. Por otro lado, es de notar el paralelismo de las cinêticas correspondientes a las me- diciones sobre los digestos y sobre las soluciones purifica- das. Esto nos indica, en primer lugar, que la medida directa sobre muestras no purificadas puede adoptarse como una estima- ciôn relativa adecuada de la radiactividad incorporada? y en segundo lugar, que la purificaciôn de la muestra, pese a que se trabaja con volûmenes muy pequehos, no provoca pêrdidas incontroladas de material.

b . - Incorporaciôn en_medio__de Canno^n.Se efectuaron conjuntos de cuatro larvas, y las glândulas

de cada conjunto fueron divididas en dos grupos de hermanas. Cada par de grupos hermanos fue marcado con 650 yiCi/ml de

3uridina-H en medio de Cannon, a tiempos de amplitud consecu­tive: 10 y 20 min; 20 y 60 min? 60 y 120 min; 120 y 180 min; 180 y 300 min. Los âcidos nucleicos fueron extraidos y la ra­diactividad âcido-insoluble de cada extracto valorada.

Los resultados obtenidos se resumen en la fig. 6, expresa­dos relativamente al valor obtenido a 300 min de marcado. Co­mo puede observarse, el incremento de la radiactividad incor­porada es lineal hasta los 18 0 min de incubaciôn, lo que pare­ce indicar que, dentro de este intervalo de tiempo, la activi-

56

100-c

§ 80-0)uc 60-

■Dro;o>umm 20- cr

10 20 120 180 300min. de marcado

Figura 6.- Incorporaciôn de uridina en medio de Cannon. Glândulas salivales de Ch. thummi fueron incubadas en medio de Cannon conteniendo uridina-H^, durante los tiempos indicados en ascisas. En ordenadas se expresan los valores de radiactividad âcido-insoluble, relati­vamente al valor obtenido a 300 min de incubaciôn.

Cada punto représenta la media de dos expe­rimentos.

57

dad de transcripciôn "in vitro " de las glândulas en medio de Cannon se mantiene normalmente.

1.4. Anâlisis electroforético del RNA.

1.4.1. Perfil del RNA reciën sintetizado.Dado que en nuestro experimentos el RNA glandular ha sido

brevemente' marcado con uridina-H^, los perfiles electroforêti- cos obtenidos corresponden a RNA reciên sintetizado. La dis- tribuciôn y caracteristicas de las principales especies de este RNA en glândulas salivales ha sido ya objeto de conside- raciôn anterior ( véase Introduccién, 1.4. ).

Glândulas salivales fueron marcadas durante 20 min en me­dio C.R. conteniendo 750 jiCi/ml de uridina-H^. Los âcidos nu­cleicos fueron extraidos, purificados, y separados por electro­foresis , y los espectros de absorciôn y radiactividad obteni­dos, por los métodos previamente de$critos ( Material y Méto­dos ,4.8.').

La fig. 7 nos muestra conjuntamente los perfiles de absor­ciôn y radiactividad correspondientes a glândulas de Ch. palli­divittatus. En el perfil de absorciôn se destacan los très pi- cos del rRNA de levadura adicionado como marcador: 28S, 18Sy 5S. En cuanto al perfil de radiactividad, coincide esencial­mente con el descrito en otros trabajos para este material bio­lôgico, usando métodos similares de separaciôn ( p.e., Edstrom y Tanguay, 1974 ). En dicho perfil podemos destacar;

58

0 400 -

m03

S 300-3U

- 4

I 200- >Ijm"O 1 0 0 - 03oc

-2

10 20 30 40 50

if)/g"v_03

jQL_03

in<L»"O03■DCD

dd

Numéro de fracciôn

Figura 7 .- Anâlisis electroforético del RNA reciên sin­tetizado en glândulas salivales de Ch. pallidivittatus. Tras un corto marcado con uridina-H^, los âcidos nuclei­cos glandulares fueron extraidos y separados por electro­foresis. En e-------- # : perfil de radiactividad.En ---------- — : perfil de absorciôn a luz U.V. Esteûltimo corresponde fundamentalmente al RNA ribosomal exô­geno adicionado como marcador.

59

+) La presencia de un pico dominante, previo al componen- te ribosomal mayor ( 28 S ) que, por su colocaciôn y dada la brevedad del marcado, corresponde presumiblemente al trans- cripto ribosômico inicial 38S. ESte carâcter de precursor se verâ probado mâs adelante por el hecho de su desapariciôn en el perfil de RNA estable ( fig. 12a ) .

+) Un segundo pico, correspondiente a la posiciôn 5S. Se incluyen aquî las especies de RNA de bajo Pm, en especial el componente ribosomal 5S y molêculas de pre-tRNA y tRNA, que bajo estas condiciones de fracçionamiento no se separan indi- vidualmente.

+) Por ültimo, es de destacar la fracciôn de hnRNA de alto Pm, que emigra a la regiôn inicial del gel, anterior a la po­siciôn de la especie pre-rRNA 38S. Como se indicé anteriormen- te, su importancia es fundamental en este material biolôgico, por incluir los grandes mensajeros 'especificos.

La fig. 8 muestra el perfil de radiactividad correspon­diente a Ch. thummi, que es esencialmente coincidente con el de Ch. pallidivittatus. Es de notar, no obstante, la presen­cia de dos picos subsidiarios, posteriores en colocaciôn al pre-rRNA 38S. Su significado es por el momento desconocido, pues dado la brevedad del marcado con uridina-H^ difîcilmente pueden ser explicados como especies ribosomales estables. Por otro lado su apariciôn serâ habituai en los perfiles de Ch. thummi, especialmente en perîodos largos de incubaciôn " in

60

4-5 S285185300-

200-

u 100-T)

2010 30 40numéro de fracciôn

Figura 8 .- Anâlisis electroforético del RNA reclén sintetizado en glândulas salivales de Ch. thummi. Las condiciones expérimentales son las mismas que en la fig. 8. Para mayor claridad, el perfil de luz U.V. es suprimido, y la localizaciôn de sus pi COS indicada mediante fléchas. Este criterio serâ el seguido en adelante.

61

vitro ", por lo que tampoco pueden ser explicados como un ar- tefacto ocasional. Este problema serâ considerado posterior- mente con mâs detalle.

1.4.2. Cons_iderac_ione£ metodo 1 6g_ica^.Dado que el método expuesto de electroforesis, tal como

ha sido descrito, es el resultado de una modificaciôn perso­nal, ha sido preciso previamente encontrar las condiciones 6p- timas para su aplicacidn a nuestro material biolôgico. En con- creto:

+) Fijar la concentraciôn de agarosa que proporcione la separaciôn mâs adecuada para las distintas fracciones princi­pales de RNA.

+) Lograr un método de lavado del gel que, sin dar lugar a pêrdidas o degradaciôn incontroladas, proporcionen un es- pectro limpio de RNA, eliminando la acumulaciôn de. contami­nantes radiactivos.

a . - Dependencia de] perf^1 _con_la concentraciôn de_agarosa,Alîcuotas iguales de un mismo extracto de RNA glandular

brevemente marcado fueron analizadas en geles de concentraciôn 1, 1,5 y 2% en agarosa. Geles de mener concentraciôn fueron desechados, por ser muy deformables y de difîcil manejo. Las condiciones de anâlisis electroforético fueron las habituales.( Material y Métodos, 4.8.4. ), aunque, para mejorar la sepa­raciôn, la electroforesis B fue ampliada a 60 min en el caso

62

de los geles al 1,5 y 2%. Los perfiles de radiactividad résul­tantes se presentan en la fig. 9.

Con el fin de estudiar la proporciôn relativa que cada una de las principales fracciones de RNA ocupa dentro de lalongitud total del espectro, cada perfil fue dividido en cua-tro regiones, correspondientes a:

+) Regiôn de hnRNA de alto Pm: desde el comienzo del es­pectro hasta el inicio del pico 38 S.

+) Regiôn del rRNA: desde el pico 38S hasta la posiciôn 18S, inclusive.

+) Regiôn de hnRNA de médiane Pm: desde la posiciôn 18S hasta el inicio del pico 4-5S,

+) Regiôn de RNA de pequeho tamaho: pico 4-5S.Las proporciones fueron obtenidas refiriendo el nûmero de

fracciones del gel comprendidas por cada regiôn al total de las incluidas por el correspondiente perfil. Los resultados se expresan en la tabla 4.

Como puede observarse, el aumento de la concentraciôn de agarosa da lugar a un progresivo acortamiento de la regiôn correspondiente al hnRNA de alto Pm, que ocurre a costa del alargamiento de la region ribosomal y, especialmente, de la del hnRNA de médiane Pm. Ahora bien, dada la significaciôn especial que en este material biolôgico tienen las especies de hnRNA de alto Pm ( no asî las de mediano Pm ), tal modi- ficaciôn irîa contra nuestros propôsitos. A esto se une el

Figura 9.- Variaciôn del perfil electroforético con la concentraciôn de agarosa. Tras un breve marcado con uridina-H^, los âcidos nucleicos de glândulas sa­livales de Ch. thummi fueron extraidos y separados en geles de concentraciôn 1% ( a ), 1.5% ( b ), y 2% ( c ) en agarosa, obteniendose los perfiles de ra­diactividad.

63

60044-5S285 «S

i 6004

400H

■ô 200-J

3020 4010numéro de fracciôn

285 185 4-5 56004

40CH

•2 2004

40

numéro de fracciôn

285 « 5: 6004

.2 2004

10 20 30 50numéro de fracciôn

64

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I— IfdoQ )P

65

que los geles de concentraciôn creciente presentan una mayor opacidad a la luz U.V., dificultando seriamente la definici- ciôn de los picos del RNA exôgeno marcador anadido. Por todo ello, la concentraciôn de 1% en agarosa ha sido adoptada como la mâs idônea para nuestro trabajo.

b .- Fijaciôn y lavado del gel.Très alîcuotas iguales de un mismo extracto de RNA glan­

dular brevemente marcado fueron analizadas por electroforesis. Tras la lectura a luz U.V., uno de los geles ( a ) fue inme- diatamente cortado y procesado para el contaje de radiactivi­dad, mientras que los otros dos fueron sometidos previamente a un proceso de purificaciôn. De elles, el primero ( b ) fue fijado ( 2 h en TCA al 5% en frîo ), y lavado durante 2 h en un volumen amplio de agua destilada ( conforme a Edstrom y Tanguay, 1974 ). El segundo ( c ) fue fijado del mismo modo, pero el lavado en agua destilada se prolongô durante toda la noche.

Los perfiles de radiactividad résultantes se representan en la fig 10. El primero ( a ), no sometido a fijaciôn - la­vado, muestra un acûmulo de radiactividad en la zona de alta velocidad de emigraciôn, que distorsiona seriamente la re­giôn del hnRNA de mediano Pm y, especialmente, del RNA de pe­queho tamaho ( 4-5S ). Esta contaminaciôn, presumiblemente debida a radiactividad residual no especîficamente incorpora- da en RNA, desaparece en los perfiles procedentes de geles

Figura 10.- Modificaciôn del perfil electroforético por el lavado del gel. Tras un breve marcado con uri-

3dina-H , los âcidos nucleicos de glândulas salivales de Ch, pallidivittatus fueron extraidos y separados por electroforesis, y los perfiles de radiactividad. obtenidos.

En a, el gel no fue fijado ni lavado.En hj_ fue fijado y lavado durante 2 h.En c, fue fijado^ y lavado durante to­

da la noche.

66

28S18S 4-5S

800-

600-

400-

200-

E 800-

600-

- 400-

1200 -

1000-

800 -

6 0 0

4 0 0

?00

10 .10 60.’ 0 50

Numéro de fracciôn

67

sometidos a lavado ( b,c ), sin que, gracias a la fijaciôn previa con TCA, se produzca una pérdida sensible de RNA. Ni siquiera se observa pérdida o distorsiôn del perfil al pro- longar.mucho el lavado del gel ( c ), modificaciôn introdu- cida para mayor comodidad de experimentaciôn. Por ello, la fijaciôn de los geles en TCA y su lavado durante toda la no­che ha sido el método definitivamente adoptado.

1.4.3. Caracter^zaci^ôn en^imétiça_de 1 _per^i 1 de radiactividad.Alîcuotas de un mismo extracto de RNA glandular breve­

mente marcado fueron sometidas a digestiôn enzimâtica con DNasa y RNasa, tal como ha sido anteriormente descrito ( Resultados, 1.3.1. ), y los digestos résultantes purifica- dos por simple precipitaciôn alcohôlica y analizados por elec­troforesis. Los perfiles de radiactividad résultantes se re­presentan en la fig. 11. Como puede observarse, el tratamien- to con DNasa ( b ) no modif ica fundamentalpiente el perfil ca- racterîstico del RNA recién sintetizado, medido éste a partir del control no tratado ( a ). Por el contrario, el tratamien- to con RNasa { c ) hace desaparecer completamente el perfil. Estos resultados, acordes con los previamente obtenidos por caracterizaciôn enzimâtica del RNA total glandular ( Resulta­dos, 1.3.1. ), confirman que la totalidad del perfil radiac- tivo obtenido bajo nuestras condiciones de marcado y separa­ciôn, corresponde a radiactividad incorporada en RNA.

Figura 11.- Caracterizaciôn enzimâtica del perfil electroforético. Alîcuotas de un extracto de RNA brevemente marcado, procédante de glândulas sali­vales de Ch. thummi, fueron tratadas con DNasa { b ), y RNasa ( c ) . Los perfiles de radiactividad, ob­tenidos por anâlisis electroforético, son compara- dos con el de un control no tratado ( a ).

68

28 5 4j5S1400-

1.000 -

600-

c 200- E

I 1400-

1000-x>cc

600-

200-

200-

4020 3010numéro tie traccion

69

1.4.4. Perfil de RNA estable.Dos grupos de larvas fueron sometidas a marcado " in vi­

vo " del RNA durante 24 h ( vêase Material y Métodos, 4.3.2. ), En uno de los grupos las glândulas fueron extraidas inmediata- mente, en tanto que en el otro el marcado fue seguido de un perîodo de recuperacién de las larvas durante 6 dîas en me­dio sin el isétopo. En ambos casos, los âcidos nucleicos glandulares fueron extraidos y separados por electroforesis, y los perfiles de radiactividad obtenidos. La fig.12a, co­rrespondiente a larvas donde el perîodo de recuperacién fue aplicado , muestra el perfil caracterîstico de RNA estable de glândulas salivales, que es esencialmente coincidente con los presentados en otros trabajos utilizando técnicas similares de separaciôn ( Daneholt y Hosick, 1973; Edstrom y Tanguay, 1974 ). Lo mâs destacable, cuando se compara con el perfil de RNA recién sintetizado, es la desapariciôn del precursor ri­bosomal 38S, apareciendo en cambio las dos formas ribosomales estables 28S y 18S. Por el contrario, cuando el perîodo de recuperacién sin isétopo no fue aplicado ( fig.12b ), junto a las formas ribosomales estables coexiste, como era de esperar, un pequeno pico previo correspondiente presumiblemente al pre-rRNA 38S.

1.5. Valoracién relativa de la actividad de transcripcién.En el présente trabajo, los resultados son habitualmente

expresados como radiactividad por glândula, modo de expresién

Figura 12.- Perfil electroforético del RNA estable. Larvas de Ch. pallidivittatus ( a ) y Ch. thummi ( b )fueron incubadas durante 24 h en presencia de uridi-

3 3na-H y citidina-H . Extractos de los âcidos nucleicosfueron separados por electroforesis, y los perfiles deradiactividad obtenidos. En a , tras el marcado, laslarvas fueron mantenidas durante 6 dîas en medio sinisétopo.

70

285 18510000 -1

60004

2 000 4

4030Numéro de f ra c c i ôn

285 18 5 4-5 5

•DfO£r

6000-J

4000-4

20004

10 20 30

Num éro de fracciôn

71

comunmente utilizado en la literatura, en estimaciones cuan- titativas tomando como material glândulas salivales. De to- dos modos, para eliminar al mâximo posibles diferencias entre glândulas y obviar la incidencia de posibles pêrdidas de ma­terial durante el proceso de experimentaciôn, una consideraciôn mâs exacta de los resultados exigirla expresarlos como radiac­tividad especifica ( es decir, radiactividad referida a con­centraciôn de âcidos nucleicos en la muestra ). Sin embargo, diversas circunstancias dificultan la adopciôn de este parâme- tro en nuestro caso: p.e., trabajar con muy pequenos volûme- nes de muestra, o muy diluida; la adiciôn habituai de RNA exô­geno, que enmascararia la cuantificaciôn espectrofotomêtrica de los âcidos nucleicos galndulares; la conveniencia de redu- cir al mâximo la manipulaciôn de las muestras, para minimizar las posibilidades de degradaciôn, etc.

La utilizaciôn de tratamientos comparados entre glândulas hermanas ( Material y Métodos, 2.2. ) ha sido un método adop­tado en orden a evitar los efectos de variabilidad que resul- tarian de compararse resultados obtenidos con larvas distin­tas. De todos modos, para comprobar hasta qué punto el uso de " radiactividad por glândula " es un parâmetro de exactitud aceptable, se llevô a cabo una serie de experimentos. Conjun­tos de 8, 16 y 26 larvas aproximadamente iguales de un mismo cultivo fueron establecidos, y las glândulas de cada conjunto divididas en dos grupos de hermanas ( a,b ). Tras un breve

72

marcado " in vitro " (20 min en medio de Cannon conteniendo 500 ^Ci/ml de uridina-H^ ), los âcidos nucleicos de cada grupo fueron extraidos y purificados por simple preçipitaciôn alco­hôlica ( sin adiciôn de RNA exôgeno ). En cada caso la radiac­tividad âcido-insoluble fue valorada, y medida la absorciôn a luz U.V. 260 nm . Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 5. De dichos resultados podemos concluir:

a) Entre grupos de glândulas hermanas ( a,b ) los valores de absorciôn ( D.O. total o D.O. por glândula ) y de radiacti­vidad ( radiactividad por glândula o radiactividad por 1 D.O. ) son aproximadamente iguales. Esto nos indica:

+) Que " per se " no parecen existir diferencias de importancia entre glândulas hermanas. Y, ademâs, que las téc­nicas de manipulaciôn empleadas no parecen dar lugar a pérdi- das diferenciales incontroladas de material

+) Que, en consecuencia, la adopciôn del parâmetro " radiactividad por glândula " es de un rigor comparable al de radiactividad especifica, cuando se trata de comparer re­sultados obtenidos de glândulas hermanas.

b) Que entre glândulas procedentes de distintas larvas( confrôntese, p.e., el grupo 8a con el 26a ) tanto los valo­res de absorciôn ( D.O. por glândula ) como de radiactividad pueden diferir considerablemente. Esta limitaciôn ha de ser te- nida en cuenta cuando hayan de compararse resultados obtenidos a partir de larvas diferentes ( p.e., en el caso de trata­mientos aplicados ” in vivo " ).

73

0

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74

2. INCORPORACION DE URIDINA EN AUSENCIA DE SINTESIS DE PROTEINAS.Una vez puestas a punto las técnicas fundamentales, nos

centraremos en el estudio del efecto de la inhibicién de la sintesis de proteinas, por aplicaciôn de cicloheximida y anisomicina, sobre la actividad de transcripcién.

2.1. Efecto ” in vivo " de la cicloheximida sobre la incor-3 3poracién de lisina-H y uridina-H .

Con el fin de obtener una primera informacién acerca del efecto de la CHM sobre la sintesis de proteinas y RNA, lar­vas aproximadamente iguales de un mismo cultivo fueron tra­tadas " in vivo " con 10 ^g/ml de dicha droga. Esta concen­traciôn fue la elegida por haber sido anteriormente utiliza- da en estudios citolôgicos ( Clever, 1967; Diez y Stockert, 197 6 ). A las horas de tratamiento 3, 6 y 24, se sacrificaron varias larvas, y sus glândulas fueron marcadas durante 20

3min en medio C.R. conteniendo 750 yaCi/ml de lisina-H o uri- 3dina-H , valorândose entonces la radiactividad incorporada,

respectivamente, en proteinas o en RNA. Como control, se uti- lizaron larvas no tratadas con la droga.

Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 6, expre­sados como cuentas por glândula, y relativamente al control. Puede observarse claramente que:

+) La incorporaciôn de lisina se ve ya inhibida, en mâs de un 7 0% a 3 h de tratamiento, lo que parece confirmar que

75

Uridina-HLisina-HHoras en

CHM Cuent./g* de Cent. Cuent./g. de Cent.

Control 20.300 608

295.887 790 130

3.045 15 480 79

24 2.198 32211 53

Tabla 6.- Efecto " in vivo " de la CHM sobre la incorpora- cidn de lisina y uridina. Tras varias horas de tratamien­to " in vivo " con 10 yag/m1 de CHM, se midiô la actividad

3 3de incorporaciôn " in vitro " de lisina-H y uridina-H en glândulas salivales de Ch. pallidivittatus. Los valores de radiactividad âcido-insoluble son comparados con los obte­nidos a partir de contrôles no tratados con la droga.

76

que la dosis de CHM adoptada es considerablemente inhibitoria, " in vivo ", de la sintesis de proteinas en glândulas saliva­les .

+) A corto tiempo de tratamiento ( 3 h ), la CHM parece provocar un incremento en la radiactividad incorporada en RNA. A tiempos superiores, la incorporaciôn se muestra ya inhibida.

A la vista de estos resultados, se plantearon nuevos expe­rimentos consistentes en la aplicaciôn " in vitro " de inhi- bidores de la sintesis de proteinas. La técnica " in vitro " hace posibles periodos mâs cortos de tratamiento, con lo que el incremento transitorio de la radiactividad incorporada en RNA podrâ ser mejor caracterizado en sus momentos iniciales. Por otro lado, la aplicaciôn del tratamiento directamente so­bre el tejido glandular nos permitirâ comprobar si tal fenô- meno se debe a una respuesta a nivel celular, y no es mediado por procesos metabôlicos ocurrentes en la totalidad del orga­nisme larvario. Por lo demâs, en dichos experimentos se utili- zarâ paralelamente CHM y ANS, para asegurarnos en lo posible de que las respuestas observadas del mecanismo de transcrip- ciôn son una consecuencia de la inhibiciôn de la sintesis de proteinas, y no debidas fundamentalmente a un efecto secunda- rio de una droga en particular.

77

2.2. Efecto " in vitro " de la cicloheximida y anisomicina so-3bre la incorporaciôn de lisina-H .

En orden a adoptar una concentraciôn de ambos inhibidores capaz de producir " in vitro " una depresiôn efectiva de la sintesis de proteinas, glândulas salivales fueron preincubadas durante 10 y 40 min en medio C.R. conteniendo CHM a concentra­ciôn de 0,2 5, 0,5, 1, 2, 5 y 10 yug/ml, siendo posteriormente marcadas durante 10 min por adiciôn de lisina-H^ hasta una concentraciôn de 750 yjCi/ml, siempre en presencia de la droga. Las proteinas fueron extraidas, y la radiactividad âcido-inso­luble de los extractos valorada. Como control, en cada caso las glândulas hermanas de aquellas fueron sometidas al mismo proceso de preincubaciôn y marcado, pero en ausencia de CHM.

I preincubaciôn |Êzzzzzzzzzzzszzza 10 o 40 min 10 min

Un estudio semejante fue llevado a cabo con ANS, emplean- do en este caso concentraciones de 2, 5, 10 y 20 yig/ml de la droga.

Los resultados obtenidos, expresados relativamente a los valores control, se representan grâficamente en la fig.13.Como puede apreciarse { a ), una dosis muy baja de CHM ( 0,25 ug/ml ) logra ya inhibir considerablemente la incorpo­raciôn de lisina, inhibiciôn que es prâcticamente total a

Figura 13.- Efecto " in vitro " de la CHM y ANS sobre la incorporaciôn de lisina. Glândulas salivales de Ch. thummi fueron princubadas " in vitro " con distintas concentra­ciones de CHM ( a ) o ANS ( b ) durante los tiempos indi- cados en ascisas, y brevemente marcadas con lisina-H^. Los valores obtenidos para la radiactividad incorporada son expresados en ordenadas, relativamente al valor del con­trol no tratado.En a : CHM a concentraciôn :

En b; ANS a concentraciôn

e--- --- e 0,25 fig/ml

o-------- □ 0,5 JiqMl

■— ^ ---- ■ 1 jug/mlA--- ----A 2 fig/ml

A--- --- ▲ 5 fig/ml

O--------O 10 fig/ml

e--- ----e 2 fig/ml

0--------o 5 fig/ml

■--------■ 10 fig/ml

A--------A 20 fig/ml

78

120 -

100

(b 80-■o

60--o

40-■o

4010min. de preincubaciôn

120-

100_ 80- <b "Og 60-XJm•f 40-

■6 20-

4010min. de preincubaciôn

79

a 10 jiq/ml. El sistema parece mostrarse menos sensible a la ANS ( b ), droga de la que se requiere 2 yag/ml para dar lugar a una inhibicidn parcial, y 2 0 yag/ml para obtener una depre- si6n prâcticamente total.

Las figs. 14 y 15, donde los resultados se representan en funcidn de las concentraciones ensayadas, da una mejor idea de la efectividad de ambos inhibidores. La total semejanza de las curvas a 10 y 40 min de pretratamiento, en el caso de la CHM ( fig. 14 a,b ), patentiza la rapidez de su acciôn, incluso a bajas concentraciones, sobre el mecanismo de sîntesis de pro- teinas. Esta acciôn se muestra menos violenta en el caso de la ANS ( fig. 15 a ,b ), pues sôlo a 20 ^g/ml se alcanza la inhibiciôn mâxima a corto tiempo de pretratamiento ( 10 min ).

Sobre la base de estos resultados se adotarâ definitiva- mente, en los experimentos posteriores " in vitro ", las con­centraciones de 10 ^g/ml de CHM y 20 yig/ml de ANS, por ser las dosis minimas que aseguran un mâximo de acciôn depresora de de la sîntesis de prpteinas.

2.3. Efecto " in vitro " de la cicloheximida y anisomicina so-3bre la incorporaciôn de uridina-H .

Para obtener una primera informaciôn acerca de la acciôn " in vitro " de ambas drogas sobre la actividad de transcrip- ciôn, glândulas salivales fueron preincubadas en medio de Cannon conteniendo 10 jig/ml de CHM o 20 jiq/ml de ANS, duran­te 10, 20, 60 y 120 min, siendo despuês marcadas durante

00

100

80-

60-

40-

cou<bX)- 100-

■S 80- >u•5 60-m

c r40-20-

pg /m l de CHM

Figura 14.- Efecto " in vitro " de diversas con­centraciones de CHM sobre la incorporaciôn de li- sina. La tasa de incorporaciôn de lisina-H^ se représenta en ordenadas como tanto por ciento del control, en funciôn de la concentraciôn empleada de CHM.

En a, 10 min de preincubaciôn.En b, 4 0 min de preincubaciôn.

81

100- ►

80-

60-

40-

20-2cou

^ 100

1 80- >

40-

20-

2 5 2010pg/ml de ANS

Figura 15. - Efecto " in vitro " de diversas con~! centraciones de ANS sobre la incorporaciôn de li-

3sina. La tasa de incorporaciôn de lisina-H se représenta en ordenadas como tanto por ciento del control, en funciôn de la concentraciôn empeada de ANS.

En a, 10 min de preincubaciôn.En b, 4 0 min de preincubaciôn.

82

10 min por adiciôn de uridina-H^ hasta una concentraciôn de 650 siempre en presencia de la droga. Como control,en cada caso las glândulas hermanas de aquellas fueron some- tidas a igual proceso de preincubaciôn y marcado, pero en ausencia de la droga. Un experimento adicional fue ademâs rea- lizado sin previa preincubaciôn ( es decir, por adiciôn si- multânea de la droga y el isôtopo; preincubaciôn = 0 ). Tras el marcado, los âcidos nucleicos fueron extraidos, valorândo- se la radiactividad âcido-insoluble.

Los experimentos fueron repetidos por triplicado, para cada tiempo de preincubaciôn.

S" °j preincubaciôn j

0 - 120 min 10 min

Los resultados obtenidos, expresados relativamente a los valores control, se representan grâficamente en la fig.16.Como puede observarse, dentro del perlodo de tiempo estudiado ambas drogas provocan un incremento en la radiactividad incor- porada en RNA. La respuesta inicial parece ser considerable- mente mâs râpida en el caso de la CHM, donde el mâximo se al­canza ya prâcticamente a los 10 min de pretratamiento. A largo tiempo, sin embargo, ambos inhibidores inducen una tasa de incremento semejante.

83

180-

160-

140- CHM

120-

■o 160-

ANS0: 120-

100-

60 12020 400 10min. de preincubaciôn

Figura 16.- Efecto " in vitro " de la CHM y ANS so­bre la incorporaciôn de uridina. Glândulas saliva­les de Ch. thummi fueron preincubadas " in vitro " con CHM ( 10 ) o ANS ( 2 0 yug/ml ) durante lostiempos indicados en ascisas, y brevemente marca­das con uridina-H^. Los valores obtenidos para la radiactividad incorporada son expresados en ordena­das , como tanto por ciento de los contrôles no tratados.

El valor inicial ( 0 ) corresponde a un punto donde ningûn tiempo de preincubaciôn fue aplicado.

Cada punto représenta la media de trèsexperimentos,

84

Estos resultados obtenidos " in vitro " confirman lo an- teriormente observado " in vivo " ( véase tabla 6 ), en lo re- ferente a una activaciôn de la radiactividad incorporada en RNA como respuesta inicial a la inhibiciôn de la sîntesis de proteinas. AquI se ahade una nueva informaciôn, referente a la rapidez de respuesta* del sistema, pues el incremento en la incorporaciôn de uridina comienza a hacerse patente casi inmediatamente a la aplicaciôn de los inhibidores. Por otro lado, el que tal incremento ocurra también por aplicaciôn " in vitro " de las drogas - es decir, actuando directamer\- te sobre el tejido glandular aislado - nos confirma que la respuesta es un fenômeno a nivel estrictamente celular, y no mediado por procesos previos a nivel de todo el organisme larvario.

2,4. Efecto " in vitro " de la cicloheximida sobre la esta- bilidad del RNA reciÔn.sintetizado.

El problema radica en interpreter tal incremento en la radiactividad incorporada, puesto que no puede, si mâs, ser directamente atribuido a una mayor actividad de transcrip- ciôn. En efecto ( véasê esquema 2 ), no se puede excluir a priori que un tratamiento sea capaz de activer la entrada o precesamiento intracelular del precursor administrado ( uri- dina-H^ ) - lo que provocarîa un incremento en la disponi-

3bilidad del precursor inmediato marcado, UTP-H -; o de inhi- bir la tasa de degradaciôn del RNA recién sintetizado - lo

85

Entradadel

precursor

Procesam.Incorporac.

en RNA

precursorinmediato

DegradaciôndelRNA

E S Q U E M A 2

86

que redundarla en una mayor acumulaciôn del mismo. Cada una de estas hipôtesis podria explicar un incremento en la ra­diactividad actualmente incorporada en RNA, sin suponer ne- cesariamente un incremento en la actividad de transcripciôn.

En nuestro caso concreto, es difîcil explicar una acu­mulaciôn importante en la radiactividad incorporada como de- bida a un cese hipotético de la actividad de degradaciôn, dada la brevedad del pulso de marcado ( 10 min ) y la relati- va estabilidad de una buena parte del RNA recién sintetizado ( RNA ribosomal y grandes mensajeros especîficos ). De todos modos, para excluir un efecto en este sentido, un experimento adicional fue llevado a cabo. Glândulas salivales fueron preincubadas durante 10 min en medio de Cannon conteniendo10 jjg/ml de CHM, siendo entonces marcadas por adiciôn de uri-

3dina-H hasta una concentraciôn de 650 yaCi/ml, durante 10,20 o 4 0 min, siempre en presencia de la droga. Como control, en cada caso las glândulas hermanas de aquellas fueron prein­cubadas y marcadas durante tiempos iguales, pero en ausencia de la droga. Un experimento adicional fue realizado, sin el periodo inicial de preincubaciôn ( preincubaciôn = 0 ). En todos los casos, la radiactividad incorporada en RNA fue me- dida, y los resultados obtenidos representados grâficamente en la fig.17, relativamente a los correspondientes valores . control.

87

ü 180-

140-

(0 +10) 40min. de marcado

Figura 17.- Efecto " in vitro " de la CHM sobre la estabilidad del RNA recién sintetizado. Tras una breve princubacidn " in vitro" con CHM, glândulas salivales de Ch. thummi fueron marcadas a diverses tiempos ( ascisas ) con uridina-H^, en presencia de la droga. Los valores obtenidos para la radiactivi­dad incorporada son expresados en ordenadas, rela­tivamente al valor de los contrôles no tratados.

El valor inicial ( 0 + 10 ) correspon­de a un punto donde la princubacidn no fue aplicada.

Cada punto représenta la media de trèsexperimentos.

88

CHM urid.-H^I preincub. k% ; V//////// f / n n / j//,/( i//i n n ij /1\ 10 - 40 min

Los experimentos fueron repetidos por triplicado, para cada tiempo de marcado.

Si la CHM inhibiera la degradaciôn de una parte importan­te del RNA recién sintetizado, entonces tiempos crecientes de marcado producirfan un incremento cada vez mayor de la radiactividad incorporada acumulada en relaciôn al correspon- diente control no tratado. Sin embargo, el incremento obser­vado se estabiliza a los 10 min de marcado, lo que excluye la hipôtesis de una acumulaciôn de radiactividad incorporada por efecto de no degradaciôn, al menos en el intervalo de tiempo estudiado. Esta conclusiôn es plenamente acorde a la alcanzada en levaduras por Foury y Goffeau ( 1973 ), siguien- do una via experimental semejante.

89

3. ESTUDIO SOBRE LA PERMEABILIDAD CELULAR A LA URIDINA.I Podrîa explicarse el incremento observado en la radiac­

tividad incorporada en RNA por una mayor tasa de captaciôn de uridina-H^?.

Resultados obtenidos en diverses sistemas biolôgicos hanmostrado que la actividad de captaciôn de un nucleôsido esfactor limitante de su posterior tasa de incorporaciôn en âci-dos nucleicos. Asimismo se ha constatado que dicha actividadde captaciôn puede ser modificada por aplicaciôn de diversas

*drogas ( p.e., DRB, en fibrobalstos: Sehgal et al., 1975; y en cêlulas HeLa; Tamm et al., 1976; Sehgal et al., 1976 ).La CHM, en concreto, parece deprimir en ciertos materiales la tasa de captaciôn de aminoâcidos ( p.e., en levadura: Gren- son et al., 1968; en Neurospora, Wiley y Matchett, 1968; en Pénicillium: Hunter et al., 1973 ), y activar en cambio la incorporaciôn de uridina ( en fibroblastos: Hershko et al., 1971 ). La importancia de este problema es évidente, por cuan- to cuestiona seriamente las conclusiones acerca de la activi­dad de transcripciôn y sus modificaciones, obtenidas de la simple mediciôn de la radiactividad incorporada. Pese a ello, nunca se habîa abordado experimentalmente este aspecto en nuestro sistema biolôgico. Con tal motivo hemos llevado a ca­bo un estudio en torno a la medida de la captaciôn de uridi­na, y sus modificaciones por aplicaciôn de CHM, ANS y otros tratamientos, en glândulas salivales de Chironomus.( * ) DRB: 5,6-dicloro-l-^-D-ribofuranosilbenzimidazol:

en células de mamîferos es un inhibidor selecti­ve de la sîntesis de hnRNA nuclear.

90

3.1. Medida de la tasa de captaciôn de uridina.Tras un période breve de incubaciôn con un nucleôsido

marcado, el total de radiactividad intracelular esté consti- tuido por radiactividad incorporada en âcidos nucleicos ciôn âcido-insoluble ), y por radiactividad no incorpora­da ( fracciôn âcido-soluble ). Bajo nuestras condiciones de marcado (10 - 20 min con uridina-H^ ), hemos comprobado que el componente âcido-insoluble es insignificante trente a la radiactividad total intracelular ( 1 - 3 % ). Por ello pode- mos asumir que la valoraciôn de la radiactividad âcido-solu­ble intracelular es una medida adecuada de la captaciôn, por la cêlula, del precursor radiactivo durante el periodo de marcado.

Para comprobar la eficacia del raétodo adoptado de estima- ciôn de la radiactividad âcido-soluble, glândulas salivales fueron marcadas durante 10 min en medio de Cannon contenien­do 2.000 yuCi/ml de uridina-H^, tras lo cual fueron lavadas en el mismo medio y fijadas en TCA, tal como ha sido previamen- te descrito ( Material y Mëtodos, 4.4. ). La radiactividad total présente en los medios de lavado y en el TCA fue valo- rada, en este ûltimo caso a tiempos de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 y 20 min de fijaciôn. Finalmente las glândulas fueron di- geridas en medio conteniendo pronasa, midiéndose la radiacti­vidad total y âcido-insoluble en el digesto.

91

urid.-H^ TCA yRadiact. âcido-solub.( i ( 5 )

0-20 mini tot*!10 min o 1 I /I pronasa

1 h. Radiact. acido- insol.

( I )

El experimento fue repetido por triplicado. Los resul­tados obtenidos se resumen en la fig. 18 y en la tabla 7.

La fig.18 expresa grâficamente la media de los valores de radiactividad obtenidos sobre los medios de lavado y de fijaciôn. Dichos valores, previamente reducidos a cuentas por glândula, son expresados relativamente al valor corres- pondiente a 20 min de fijaciôn. Como puede observarse, la radiactividad residual recogida en los medios de lavado de- crece râpidamente. Esto nos confirma que el triple lavado es

3eficaz para eliminar los restos de, uridina-H no captada por la célula, con lo que la radiactividad posteriormente medi­da en el TCA de fijaciôn serâ una medida del componente âci­do-soluble intracelular extraido, y no debida a contaminantes externos. Por otro lado, la extracciôn del componente âcido- -soluble en presencia de TCA es râpida, alcanzândose ya el mâximo a los 4 min de fijaciôn.

La tabla 7 nos da la idea de la eficacia de la extraciôn del componente radiactivo âcido-soluble en presencia de TCA.El rémanente no extraido ( T - I ) - medido por la diferencia

92

o 120-

- 60

l a v adosS/*

m i n . en TCA

Figura 18.- Medida de la radiactividad âcido-soluble.3Tras un breve marcado " in vitro " con uridina-H ,

glândulas salivales de Ch. thummi fueron repetidamen- te lavadas, y finalmente fijadas en TCA. La radiacti­vidad total fue valorada sobre los medios de lavado, y sobre el TCA a tiempos sucesivos ( ascisas ). Los re­

sultados obtenidos se expresan en ordenadas, relativa­mente al valor a 20 min de fijaciôn.

Cada punto représenta la media de très ex­perimentos.

93

experim. T I T - I ST-I

S+T-I ^

1 2.742 2.414 328 110.050 0,30

2 2.470 2.180 290 104.844 0,28

3- 1.766 1.464 302 74.300 0.41

Media ; 0.33

Tabla 7.- Medida de la eficacia de la extracciôn de la

Tabla 7 .- Eficacia de la extracciôn de la radiactividad âcido-soluble en presencia de TCA. Las glândulas marca­das y fijadas con TCA ( véase fig.18 ) fueron digeridas, y los valores de radiactividad total ( T ) y âcido-inso­luble ( I ) medidos sobre el digesto. La radiactividad âcido-soluble residual ( T - I ) es calculada y referi- da como tanto por ciento al total de la misma ( es de­cir, la extraida por el TCA, S, mas la residual: S+T-I ).

Los valores son dados como cuentas por glândula

94

entre la radiactividad total ( T ) y âcido-insoluble ( I ), valorados sobre el digesto de âcidos nucleicos - es compara- do con el valor de la radiactividad extraida tras 20 min de fijaciôn en TCA ( S ). Como puede observarse, dicho rémanen­te no extraido es prâcticamente despreciable ( un 0,33% del total ). Podemos entonces concluir que la fijaciôn con TCA y la valoraciôn de la radiactividad sobre el fijador, es un mê- todo adecuado para estimar el componente âcido-soluble ra­diactivo intracelular y,por ello, la actividad de captaciôn del nucleôsido marcado.

3.2. Medida de la captaciôn e incorporaciôn " in vitro " de uridina, en funciôn de su concentraciôn externa.

Para estudiar la modificaciôn de la tasa de captaciôn e incorporaciôn de uridina en funciôn de la concentraciôn ad- ministrada del nucleôsido, se establecieron parejas de gru- pos de glândulas hermanas, las cuales fueron preincubadas urante 20 min en medio de Cannon y posteriormente marcadas durante 10 min en el mismo medio por adiciôn de uridina-H^.De cada par de grupos hermanos, uno era marcado con 100 ^Ci/ml, siendo usado como control, y el otro lo era a una de las si- guientes concentraciones: 250, 500, 1.000, 1.500, 2.000,2.500, 3.000 y 5.000 ^Ci/ml, En cada caso la radiactividad âcido-soluble fue estimada, tras lo cual los âcidos nucleicos fueron extraidos, valorândose la radiactividad incorporada.

95

Cada punto fue efectuado al menos por duplicado.Los resultados obtenidos , para la radiactividad âcido-

-soluble e incorporada , se recogen en la tabla 8, como cuen­tas por glândula, y en la tabla 9 como indice de incremento relativo al valor correspondiente a 100 jiCi/ml. La media de es­tos indices se représenta grâficamente en la fig.19, para las distintas concentraciones ensayadas.

Como puede observarse, el crecimiento de la radiactividad âcido-soluble e incorporada ocurre conforme a curvas parale- las de saturaciôn. Esta conducta, en el caso de la radiacti­vidad âcido-soluble, es plenamente congruente con la idea ya alcanzada en otros sistemas biolôgicos de que la entrada de uridina se realiza fundamentalmente por mecanismo de trans­porte activo ( p.e., Jacquez, 1962; Plagemann y Roth, 1969; Birch y Turnock, 1976 ). Por otro lado, el que la radiactivi­dad incorporada siga un comportàmiento totalmente paralelo al anterior, apoya la idea ya formulada de que la cuantia del componente soluble - y por ello, la tasa de captaciôn del precursor - es factor limitante de su tasa posterior de in­corporaciôn en RNA (p.e., Nakata y Bader, 1969; Plagemann, 1971; Weber y Rubin, 1971; Stambrook et al., 1973 ).

Por ûltimo, es de notar que el estado de saturaciôn en la entrada del precursor parece superarse al aplicar una concen­traciôn de 5.000 jjLC±/ml, Ello podrîa explicarse considerando

Tabla 8.- Repercusiôn de la concentraciôn de uridi- na-H^ sobre la radiactividad âcido-soluble e incor­porada , Grupos de glândulas salivales de Ch. thummi fueron brevemente marcados con diferentes concen­traciones de uridina-H^, y los grupos de glândulas hermanas, como control, a 100 yaCi/ml. Los valores obtenidos para la radiactividad âcido-soluble ( S ) e incorporada ( I ) son expresados como cuentas por glândula.

96

ConcentracÛ2T1 exper 2° exper. -er3 exper

comparadas ( yuCi/ml ) r..

s\I / S / S i \ |

100 3.133 79 3.133 259 6.687 257250 4.987 257 4.227 548 20.400 541

100 19.367 181 19.213 145500 68.560 245 52.160 549

100 12.100 127 6.267 76 13.207 145

1.000 68.473 664 32.080 336 55.627 448

100 24.140 575 19.073 288

1.500 134.007 2.269 114.267 1.444

100 34.267 272 12.407 757

2.000 144.467 2.005 82.367 2.593

100 35.533 373 20.673 184 17.907 293

2.500 241.487 2.196 86.260 519 72.060 1.497

100 14.467 395 23.333 548

3.000 68.333 1.303 159.200 3.133

100 27.420 164 15.060 160

5.000 223.600 597 189.653 928

97

Uridina-H^ ( jiCi/ml )

1 er1 exper. / g l"

2° exper.' s

3®^/ S

exper.\I

250 1,6 2,9 1,7 2,3 3,0 2,1

500 3,4 1,6 2,8 3,8

1.000 5,6 5,2 5,3 4,4 4,2 4,0

1,500 5,5 3,9 6,5 5,0

2.000 4,3 7,3 6,6 3,4

2.500 6,8 6,3 4,2 3,1 4,0 5,1

3.000 4,7 3,3 6,8 5,7

5.000 8,1 4,2 12,2 5,4

Tabla 9.- Los valores para la radiactividad so­luble ( S ) e incorporada ( I ), recogidos en la tabla 8, son aqui expresados como indice de incremento relativo al correspondiente control a 100 yaCi/ml.

98

un,oomo>

um■g>um%)mOC

765A

32

302520 501 2.5 5 10 15jiCi/ml de uridina-H^ (*10~2)

Figura 19.- Modificaciôn de la radiactividad âcido-so­luble e incorporada con la concentraciôn de uridina-H^ .Los valores de radiactividad âcido soluble ( A------ »A )e incorporada ( e-------e ) , recogidos en la tabla 8,son aqui representados grâficamente como tanto por cien­to del correspondiente control a 100 |iCi/ml, en funciôn de la dosis de uridina-H^ empleada.Cada punto représenta la media de los resultados obteni­dos con cada dosis ensayada.

99

que a altas dosis la penetraciôn del nucleôsido parece reali- zarse predominantemente por difusiôn pasiva, segûn se ha for- mulado a partir de los resultados alcanzados en otros siste­mas biolôgicos ( p.e., en células de tumor ascîtico: Jacquez, 1962; en células de hepatoma Novikoff: Plagemann y Roth, 1969 ) -, Plagemann, 1970 ) .

3.3. Efecto " in vitro " de diverses inhibidores sobre la ta­sa de captaciôn e incorporaciôn de uridina.

El efecto sobre la transcripciôn de una amplia gama de inhibidores de la sîntesis de RNA y proteinas es bien conoci- do, siendo en cambio muy escasos los estudios en torno a su posible acciôn modificadora de la entrada en la célula de di­verses precursores. La importancia del tema es manifiesta, pues, como ya se indicô anteriormente, las conclusiones al- canzadas sobre la medida de la radiactividad incorporada pue- den verse falseadas si los tratamientos han modificado sensi- blemente la tasa de captaciôn de los precursores radiactivos administrados. Con tal motivo, hemos abordado aquî el estu- dio de las modificaciones en la tasa de captaciôn de uridina en presencia de alguno de los inhibidores de la transcripciôn ( o<-amanitina, actinomicina D ) o de la sîntesis de proteinas ( CHM, ANS ) utilizados en glândulas salivales.

La CHM y la ANS son inhibidores especîficos de la sîntesis de proteinas en organismes eucariôticos, y su modo de acciôn ha sido ya previamente descrito ( Introducciôn, 2.1. ).

100

La <?<-amanitina inhibe especîficamente la sîntesis de RNA extranucleolar en organismes eucariôticos, al actuar directa­mente sobre la RNA polimerasa II { Seifart y Sekeris, 1969; Seifart, 1970; Jacob et al., 1970; Kedinger et al., 1970; No- vello et al., 1970; Chan et al., 1973 ). En glândulas saliva­les provoca el colapsamiento e inhibiciôn del marcado autorra- diogrâfico en los anillos de Balbiani ( Beermann, 1971; Wobus et al., 1971 ).

La actinomicina D, a bajas concentraciones, inhibe especî- ficamente la sîntesis de RNA nucleolar en células de mamîferos ( Perry y Kelly, 1970; Moore y Ringertz, 1973 ), uniéndose al DNA e impidiendo la polimerizaciôn del RNA nascente ( Kirk, 1960; Reich y Goldberg, 1964 ). Su efecto se muestra inespe- cîfico, incluso a bajas concentraciones, en glândulas saliva­les ( Pelling, 1964 ) causando un colapsamiento de los puffs ( Beermann, 1964; Ellgaard y Clever, 1971; Dîez, 1973 ).

Por ûltimo, hemos estudiado también la acciôn del dimetil sulfôxido ( DMSO ), que a altas concentraciones ( 10% ) pare­ce afectar a la permeabilidad de la membrana celular ( Franz y van Bruggen, 1967; Delmer y Mills, 1971 ), asî como al me- tabolismo de RNA y proteinas ( Bajej et al., 1970 ) en ciertos sistemas eucariôticos. Recientes observaciones han mostrado que esta droga, a corto tiempo de aplicaciôn " in vivo ", mo- difica diferencialmente la expansiôn de los anillos de Bal­biani, produciendo a largo tiempo un colapsamiento generali-

101

zado de los mismos ( Sass, 1978 ).Para llevar a cabo estos experimentos, glândulas salivales

fueron incubadas durante 1 h en medio de Cannon, conteniendo una de las siguientes drogas:

+ ) 1 jig/ml de c<-amahitina.+ ) 1 jiq/ml de actinomicina D.+) 10 ^g/ml de CHM+ ) 20 yjg/ml de ANS+) 10% de DMSO.Las glândulas fueron entonces marcadas durante 10 min.

3por adiciôn de uridina-H hasta una concentraciôn de 650 ^g/ml, siempre en presencia de la droga correspondiente, tras lo cual se valorô la radiactividad âcido-soluble e incorporada en RNA.

Como control, en cada caso el grupo correspondiente de glândulas hermansa de aquellas fue sometido a los mismos pe- riodos de preincubaciôn y marcado,pero en ausencia de la dro­ga .

Los experimentos se llevaron a cabo, generalmente , por triplicado.

Los resultados se recogen en la tabla 10, como cuentas por glândula y como indice de modificaciôn en las glândulas tratadas relativo al control. Las médias de estos indices de modificaciôn , expresadas como tanto por ciento, se represen­tan grâficamente en la fig. 20.

Como ya se observô anteriormente ( Resultados, 2.3.

102

- er1 exper 2° exper. ^er3 exper\ / \

S I S I S I

CHM C

Tr

Tr/C

20.693

33.620

1,62

708

1.751

2,47

32.253

56.153

1,74

972

1.395

1,43

20.627

48.887

2,37

399

1.277

3,26

ANS C

Tr

Tr/C

22.480

45.343

2,02

815

1.673

2,05

59.360

75.480

1,27

1.685

2.522

1,50

30.780

40.680

1,32

787

1.259

1,60

(X-amanit. C

TrTr/C

54.247

82.2691,51

963

2690,28

90.167

124.6671,38

1.560

5370,34

Actinom. D C

Tr

Tr/C

38.667

40.883

1,06

531

15

0,03

45.667

42.867

0,94

779

24

0,03

31.493

39.467

1,25

588

15

0,03

DMSO C

Tr

Tr/C

10.800

11.626

1,08

171

83

0,49

54.273

47.580

0,88

684

123

0,18

17.653

13.000

0,74

185

127

0,69

80

239

0

103

_ 140

^ 1 0 0----

ITJ(T>:> 60-

a:

20 -

CHM

F

ANS (x-amanit._

actinom. D

a

DM SO

Figura 20.- Modificaci6n de la tasa de captaciôn e incorporaciôn de uridina por aplicaciôn ” in vitro ” de diversas drogas. La media de los valores de la radiactividad âcido-soluble e incorporada, obteni- dos para cada droga ( vêase tabla 10 ), se repre- presenta aquî como tanto por ciento del correspon- diente control no tratado.

Radiactividad âcido-soluble.

Radiactividad incorporada

104

la CHM y ANS activan " in vitro " la incorporaciôn de uri­dina en RNA, pero incrementando también considerablemente su tasa de captacidn por las células.

La «X-amanitina y la actinomicina D inhiben fuertemente, como era de esperar, la radiactividad incorporada en RNA, pe­ro tienden a incrementar, especialmente la (X-amanitina, la tasa de captaciôn de uridina.

Por ultimo, el DMSO, bajo las condiciones estudiadas, de- prime s61o muy levemente la tasa de captaciôn del precursor, pero inhibe considerablemente su incorporaciôn en RNA.

3.4. Efecto del choque têrmico sobre la tasa de captaciôn e incorporaciôn de uridina: relaciôn con el estado de puffing.

La aplicaciôn de modificaciones têrmicas en larvas de Chironomus ha sido un tratamiento empleado en ocasiones co­mo via de anâlisis del mecanismo de puffing y su control ( p.e., Beermann, 1952; Ritossa, 1964; Yamamoto, 1970 a,b ) Previos estudios realizados en nuestro laboratorio habian mostrado un comportamiento aparentemente antagônico entre el tamaho de ciertos puffs y la tasa de transcripciôn, medida esta como incorporaciôn de uridina en el RNA total glandu­lar, durante el periodo de recuperaciôn subsiguiente a un choque têrmico. En concreto, un estado de colapsamiento casi total en el BR2 de Ch. pallivittatus parecia coexistir con una no modificaciôn o incluso ligero incremento en la sin- tesis global de RNA.

105

Para investigar mâs detalladamente esta aparente discre- pancia, se llevô a cabo un estudio autorradiogrâfico. Larvas aproximadamente iguales de un mismo cultivo de Ch. pallidi- vittatus fueron sometidas a una temperatura de 39°C durante 5 min, tras lo cual fueron mantenidas en recuperaciôn en su propio medio de cultivo, a 18°C. A las horas 1 y 8, algunas larvas fueron sacrificadas, y sus glândulas salivales proce- sadas para autorradiografîa, conforme a la técnica previamen- te descrita ( Material y Mêtodos, 3.2. ). Se efectuaron tam­bién preparaciones autorradiogrâficas con glândulas de larvas no sometidas al choque, siendo utilizadas como control.

Para estimar las modificaciones producidas por el trata­miento, los BR2 fueron agrupados en 3 clases segûn tamaho, siguiendo este criterio : ( ejemplificado en fig.21 ).

Clase A: diâmetro del anillo igual o mayor al doble del grosor del cromosoma ( en zona no de puff ).

Clase B: diâmetro del anillo menor del doble del grosor del cromosoma, pero suficientemente apreciable.

Clase C: anillo prâcticamente colapsado.

Del mismo modo, segûn la intensidad de marcado, los ani- llos fueron agrupados en 4 clases:

+++ : marcado muy denso: los granos dan lugar a una man- cha continua.

++ : marcado bastante denso, aunque los granos aparecen individualizados.

Figura 21.- Clases, segûn tamaho, del BR2 en Ch. palli- divittatus.

En a, anillo grande ( clase A ).En b, anillo pequeho ( clase B ).En c, anillo casi colapsado ( clase C ).En d, anillo hipertrofiado ( clase A ).

107

+ ; marcado poco denso.- : marcado no superior al fondo citoplâsmico.

Los valores de cada clase, tanto para tamahos como para intensidad de marcado, se recogen en la tabla 11 expresadoscomo tanto por ciento del total de anillos medidos a cadatiempo.

Como puede observarse, 1 h despuês del choque hay un con­siderable efecto de reducciôn en el tamaho del anillo - mani- festado especialmente por el incremento en las formas colap- sadas ( clase C ) - asî como en la tasa de marcado autorradio- grâfico. Lo mâs destacable es, sin embargo, lo observado a la hora 8 ; frente a una total recuperaciôn en el tamaho del anillo, incluso mostrando formas frecuentemente hipertrofia- das ( ver ejemplo en fig. 21 d ), su intensidad de marcado es aûn muy inferior a los contrôles.Esta disparidad se obser­va mâs claramente en la fig.22, dohde, para mayor simplicidad, la intensidad de marcado ha sido reducida solamente a dos clases.

Un ejemplo fotogrâfico se présenta en la fig.23. Obsérve- se que el tamaho del BR2 es semejante a la hora 8 ( c ) y en el control ( a ), siendo en cambio muy distinta la intensidad de marcado.

Como ya se indicô ( Introducciôn, 1.3. ), se admite co- munmente una relaciôn entre el tamaho de un puff y la activi- dad de transcripciôn del locus o loci implicados en el mismo

100

Horas de recuperac.

Tamaho Marcado/A B \C /.....+++ ++ + ■... \

Control 66 28 4 75 19 3 1

1 - 10 90 - 9 22 69

8 74 24 - 15 20 48 16

Tabla 11.- Modificaciôn del tamaho e intensidad de mar­cado en anillos de Balbiani por efecto del choque têrmi­co . A distintas horas de recuperaciôn tras un choque têrmico ( 39°C, 5 min ), glândulas salivales de Ch. pa- llidivittatus fueron procesadas para autorradiografîa, y los BR2 agrupados en distintas clases segûn tamaho e intensidad de marcado ( vêanse en el texto los criterios de clasificaciôn ). El control corresponde a glândulas de larvas no sometidas a choque. Los valores vienen da­dos como tanto por ciento del total de anillos medidos a la hora indicada.

109

cont roi hora 1 hora 8

Figura 22.- Efecto del choque têrmico sobre « 1 tamaho e intensidad de marcado autorradiogrâfico en los ani­llos de Balbiani 2. Para cada tiempo de recuperaciôn tras un choque têrmico ( 39°C, 5 min ), el tanto por ciento de anillos correspondientes a cada clase de tamaho ( vêase tabla 11 ) es grâficamente expresado por la altura de la columna, y dentro de ésta lo es la intensidad de marcado autorradiogrâfico, confor­me a dos grados:

■ marcado muy intenso.

marcado poco intenso.

Figura 23.- Variaciôn del tamaho e intensidad de marcado autorradiogrâfico en el cromosoma IV de Ch. pallidivittatus, por efecto de un choque têr­mico . En a, control; en b y c, horas 1 y 8 de re- cuparaciôn, respectivamente, tras el choque ( 3 9°C, 5 min ). Nôtese que a hora 8 el BR2 présenta un tamaho semejante, pero un marcado mucho menor, que en el control.

•1

• •

Ill

( Felling, 1964 ). Esta hipôtesis aparecerîa seriamente cues- tionada por nuestros resultados, de admitirse que la intensi­dad de marcado autorradiogrâfico nos da una medida directa de la actividad de transcripciôn. Sin embargo, podrîa formularse una hipôtesis conciliadora, consistante en que el choque tér- mico hubiera niodificado fuertemente la captaciôn de uridina-H^ y, consiguientemente, su tasa de incorporaciôn en RNA.

Para comprobar esta posibilidad, se efectuô un choque têrmico en las condiciones anteriormente descritas. A las horas 1 y 8 de recuperaciôn, se sacrificaron larvas, y sus glândulas fueron marcadas durante 10 min en medio de Cannon onteniendo 2.000 yaCi/ml de uridina-H^, tras lo cual se valo- rô la radiactividad âcido-soluble. Como control, igual proce- so experimental se llevô a cabo con glândulas de larvas no sometidas al choque têrmico.

El experimento fue llevado a cabo por duplicado.De la observaciôn de la tabla 12, donde los resultados

han sido recogidas como cuentas por glândula y relativamente al control, se deduce que la tasa de captaciôn de uridina-H^ se ve considerablemente incrementada a la hora 1, y muy dismi- nuida, en cambio, a la hora 8 de recuperaciôn tras el cho­

que têrmico. Esta disminuciôn a hora tardîa puede explicar, al menos en parte, la considerable bajada del marcado autorra- diogrâfico y, por ello, la discrepancia entre el tamaho del anillo y la actividad de incorporaciôn del isôtopo a nivel local.

112

Experimento cuentas/g % del Control Media

Cont. 1 92.336

11

2 97.096 I1

hora 1 1

2

188.123

149.803

1204 1

1 179 154 1

1

hora 8 1 48.1331

52 11 63

2 70 .407 11

Tabla 12.- Efecto de un choque têrmico sobre la tasa de captaciôn de uridina. A distintas horas de recupe­raciôn tras un choque têrmico ( 3 9 5 min ), la ta­sa de captaciônde uridina fue medida, como radiacti­vidad âcido-soluble, en glândulas salivales de Ch. thummi. Los resultados se expresan como cuentas por glândula, y relativamente al correspondiente control no tratado.

113

3.5. Efecto de la ciclohexiinida y anisomicina sobre la tasa de captaciôn de uridina.

Los primeros resultados mostraban que la CHM y ANS, bajo condiciones de aplicaciôn " in vitro ", parecen inducir una

3Clara activaciôn en la tasa de captaciôn de uridina-H ( Re­sultados, 3.3. ). Dada la importancia de este problema en el contexte del trabajo présente, se llevô a cabo un estudio mâs complete sobre el efecto de ambos inhibidores , bajo distin­tas condiciones de aplicaciôn, sobre la captaciôn de dicho nucleôsido.

Glândulas salivales fueron tratadas " in vitro " en me­dio de Cannon conteniendo 10 yig/ml de CHM o 20 ^g/ml de ANS, durante 20, 60, 120 y 180 min, y marcadas posteriormente du-

3rante 10 min por adiciôn de uridina-H hasta una concentra- ciôn de 2.000 |iCi/ml, en presencia de la droga. Tras ello, se valorô la radiactividad âcido-soluble intracelular. Como con­trol, en cada case las glândulas hermanas de aquellas fueron sometidas a iguales perîodos de pretratamiento y marcado, pero en ausencia de la droga.

Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 13 , pa­ra el caso de la CHM, y en la tabla 14, para la ANS, expresa­dos como cuentas por glândula y como indice de modificaciôn relative al control. Los valores medios de estos indices para cada tiempo de preincubaciôn se representan grâficamente, co­mo tanto por ciento, en la fig 24 a,b.

Tabla 13.- Efecto " in vitro " de la CHM sobre la tasa de captaciôn de uridina. Tras ser preincuba- das a distintos tiempos con 10 yag/ml de CHM, y bre- vemente marcadas con uridina-H^, la radiactividad âcido-soluble fue medida en glândulas salivales de Ch, thummi. Como control se emplearon las glându­las hermanas no tratadas con la droga. C, control; Tr, tratadas. Los resultados se expresan como cuen­tas por glândula, y como indice de modificaciôn re­lative al control ( Tr/C ).

114

Experimento

m/

20

in. de pre

60

incubaciôn

120 180

1 C Tr

Tr/C

146.733139.793

0,95

83.187141.460

1,7

64.513200.033

3,1

107.673128.140

1,19

2 C Tr

Tr/C

77.97399.067

1,27

95.347118.887

1,24

159.627145.580

0,91

129.633215.687

1,66

3 C Tr

Tr/C

97.286151.387

1,55

37.13341.387

1,11

157.033179.373

1,14

4 C Tr

Tr/C

212.905191.908

0,9

49.244162.667

3,3

5 C Tr

Tr/C

92.010121.667

1,32

116.738148.257

1,27

6 C Tr

Tr/C

90.072151.766

1,68

132.709150.709

1,14

Tabla 14.- Efecto " in vitro " de la ANS sobre la tasa de captaciôn de uridina. Tras ser preincubadas a distintos tiempos con 20 yag/ml de ANS, y breve-

3mente marcadas con uridina-H , la radiactividad âcido-soluble fue medida en glândulas salivales de Ch. thummi. Como control se emplearon las glân­dulas hermanas no tratadas con la droga. C, con­trol; Tr_, tratadas. Los resultados se expresan co­mo cuentas por glândula, y como indice de modifica­ciôn relative al control.

115

iuxii • \jl^ ^ jLi.xv

Experimento ^ 20 60 120 180 \

1 C Tr

Tr/C

154.093217.087

1,4

110.007108.080

0,98

80.373161.167

2,0

115.660138.080

1,19

2 C Tr

Tr/C

177.847193.900

1,09

218.882194.637

0.89

65.85371.0801,05

59.78794.3071,57

3 C

TrTr/C

74.287

156.9532,11

158.265

244.4531,54

29.833

80.1602,68

61.522

133.0602,16

4 C Tr

Tr/C

78.807141.588

1,80

66.572136.773

2,05

116

Una segunda serie de expérimentes fue llevada a cabo pa­ra estimar el efecto " in vivo" de ambos inhibidores. Larvas aproximadamente iguales de un mismo cultivo fueron incubadas en presencia de 10 jig/ml de CHM o 50 ^g/ml de ANS. A las horas If 3, 6 y 24 de tratamiento, se sacrificaron varias larvas, siendo marcadas sus glândulas durante 10 min. con 750 jiCi/ml

3de uridina-H en medio C.R. Tras ello se valorô la radiacti­vidad âcido-soluble intracelular. Como control se utilizaron larvas no tratadas con la droga.

Los resultados obtenidos, expresados como cuentas por glândula, se recogen en la tabla 15 para el caso de la CHM, y en la tabla 16 para el caso de la ANS. El valor medio para cada tiempo de tratamiento, expresado relativamente al con­trol, se représenta en la fig.24 c,d.

Como puede observarse, el efecto de la CHM y ANS sobre la actividad de captaciôn de uridina es considerablemente distin- to segûn los inhibidores sean aplicados " in vivo" o " in vi­tro ". Por otro lado, para las mismas condiciones de aplica­ciôn, ambos inhibidores producen un efecto muy similar. Bajo condiciones " in vitro ". la tasa de captaciôn de uridina ré­sulta activada a todos los tiempos de preincubaciôn ensayados, pero especialmente a los mâs tardîos ( 120 y 180 min ). Por el contrario, el tratamiento " in vivo "durante el mismo in- tervalo de tiempo ( hasta 3 h ) no parece producir modifica­ciones de importancia. ( las pequehas variaciones no pueden

117

Experimento Control / 1

horas de

3

tratamientoA6 24

1 51.600 77.300 62.925 64 .561 24. 205

2 84.175 71.725 71.650 52 .447 37 .630

3 80.300 48.675 59.200 62 .750 35 .804

4 60.550 87.850 83.975 41 .874 11 .646

5 69.225 105.625

6 109.625

Media 75.912 71.387 76.750 55 .408 27 .321

Relat. al Control 0,94 1,01 0,73 0,36

Tabla 15.- Efecto " in vivo " de la CHM sobre la tasa de captaciôn de uridina. Tras un tratamiento " in vivo" a dis­tintos tiempos con 10 yag/ml de CHM, y un breve marcado " in vitro " con uridina-H^, la radiactividad âcido-soluble fue medida en glândulas salivales de Ch. thummi. Como con­trol se utilizaron larvas no tratadas con la droga. Los re­sultados se expresan como cuentas por glândula, y relativa­mente al control.

118

Experimento

iiuras ue auanij-tîiiuu

Control / ■ 1 3 6

1 76.810 64.210 72.925 44.990 43.140

2 67.600 74.185 87.650 53.405 27.650

3 82.090 65.585 62.180

Media 75.500 67.993 74.252 49.197 36.073

Relativeal Control 0,90 0,98 0,65 0,48

Tabla 16.-- Efecto " in vivo " de la ANS sobre la tasa decaptaciôn de uridina. Tras un tratamiento " in vivo " a distintos tiempos con 50 jig/ml de ANS, y un breve marca­do " in vitro " con uridina-H^, la radiactividad âcido-so­luble fue medida en glândulas salivales de Ch. thummi. Co­mo control se utilizaron larvas no tratadas con la droga, Los resultados se expresan como cuentas por glândula y relativamente al control.

11'

200-

20 60 120 min. de pre incubac iôn

1 3 6horas de tratam iento

Figura 24.- Modificaciôn de la tasa de captaciôn de uridina por aplicaciôn de CHM y ANS. Para cada tiempo de tratamien­to, la media de los valores de radiactividad âcido-soluble ( vêase tablas 13, 14, 15, 16 ) se représenta aqui grâfica­mente como tanto por ciento del correspondiente control no tratado. En a, CHM " in vitro en b, ANS " in vitro "* en c, CHM " in vivo en d, ANS " in vivo

■ 1El ârea rayada dénota la activaciôn résultante.

120

considerarse significativas, dada la variabilidad inherente al uso de larvas distîntas: vêase resultados 1.5. ). A tiem­pos superiores de tratamiento ( horas 6 y 24 ), la tasa de captaciôn résulta ya claramente deprimida.

Estos resultados reafirman la pregunta, ya antes plantea- da, de si el efecto de activaciôn observado previamente en la radiactividad incorporada en RNA ( vâse Resultados, 2.3., fig.16 ), por aplicaciôn " in vitro " de CHM y ANS, no podrîa ser adecuadamente explicado por el incremento producido en la

3captaciôn de uridina-H . Tal cuestiôn nos plantea la necesi- dad de elaborar y aplicar coeficientes de correcciôn, que permitan estimar la modificaciôn en la tasa de incorporaciôn del nucleôsido en RNA, libre del influjo de las posibles al- teraciones en su tasa de captaciôn. Se hablarâ entonces de " incorporaciôn corregida ", cuando dichos coeficientes . de incorporaciôn hayan sido aplicados.

3.6. Determinaciôn de la radiactividad incorporada " corregida " El problema a la hora de elaborar un coeficiente de correc­

ciôn consiste en saber en quê grado una modificaciôn en la ta­sa de captaciôn del precursor repercute posteriormente en su tasa de incorporaciôn. A este respecte, algunos autores han adoptado sin mâs el principio de una relaciôn lineal ( Tamm et al., 1976; Sehgal et al., 1976 ); es decir, un incremento dado en la radiactividad âcido-soluble determinarâ un incre­mento igual de la radiactividad incorporada.

121

Para obtener alguna indicaciôn sobre este problema, fueron re- considerados los resultados obtenidos en un experimento ante­rior, donde la radiactividad âcido-soluble e incorporada ha­bian sido medidas en funciôn de la dosis administrada de uri-

3dina-H ( véanse Resultados, 3.2. ). En este caso, para cada concentraciôn del isôtopo ( i ), se determinô el cociente en­tre la radiactividad incorporada ( I ) y âcido-soluble ( S ); a saber;

( I / S

lo cual nos mide la " tasa de aprovechamiento ", es decir, la fracciôn de radiactividad captada que ha sido incorporada en RNA, para dicha concentraciôn _i ensayada. Los cocientes asi obtenidos fueron referidos a su correspondiente control a 100 ^Ci/ml, obteniêndose las relaciones;

( I / S )^ .

( I / S )ioolo cual nos mide la tasa de aprovechamiento, relative a la concentraciôn minima, lOOyaCi/ml. El valor medio de estas re­laciones se représenta grâficamente, en funciôn de la dosis ±, en la fig.25.

Si un incremento en la radiactividad âcido-soluble déter­minera siempre un incremento igual en la radiactividad incor­porada ( relaciôn lineal ), entonces se daria siempre que;

122

( 1/S).ÜTsVoo

I.0--

0.4 -

de urid ina-H^("10

Figura 25.- Variaciôn de la tasa de aprovechamiento de la radiactividad âcido-soluble. Para cada concen­traciôn de uridina-H^ administrada ( iy en ascisas ), la fracciôn de radiactividad captada que es incorpo­rada en RNA j( I/S) J es expresada relativamente al valor de dicha fracciôn a 100 yaCi/ml ( I/S) en ordenadas.

En e- -# , curva real obtenida.

En — — , aproximaciôn teôrica

123

( I / S ) ±_ = 1( : / s )ioo

con lo cual el resultado serla una recta paralela al eje de ascisas. Sin embargo, de la observaciôn de la grâfica obteni­da, se deduce que;

+) La relaciôn es siempre inferior a la unidad: Esto in- dica que en ningûn caso el incremento de la concentraciôn administrada del precursor determinarâ una mayor tasa de apro­vechamiento respecto a la concentraciôn mâs baja, sino todo lo contrario.

+) La tasa de aprovechamiento sufre una disminuciôn ini- cial, hasta una concentraciôn de aproximadamente 1.000 ^Ci/ml, para aparentemente estabilizarse a concentraciones superiores. Es decir, que:

( I / Ses constante, para i comprendi-do entre 1.000 y 3.000 yuCi/ml

Con lo cual podremos fundadamente adoptar un criterio de rela­ciôn lineal de incrementos entre la radiactividad âcido-soluble e incorporada cuando trabajemos dentro de ese intervalo de con­centraciones.

Este aparente mantenimiento de la tasa de aprovechamiento del precursor , dentro de dicho intervalo de concentraciones, parece confirmarse por los resultados recientemente obtenidos en nuestro laboratorio, comparando entre si otras concentracio-

124

3nés de uridina-H distintas a las aquî utilizadas.c Supuestas taies premisas, c6mo elaborar el coeficiente

de correcciôn ?.Sea un experimento en el que el efecto de un tratamiento

es comparado con el control no tratado, y los resultados obte- nidos:

+) Control, radiactividad âcido-soluble ;+) Control, radiactividad incorporada :+) Tratado, radiactividad àcido-soluble : S.tr,+) Tratado, radiactividad incorporada :

El coeficiente de correcciôn lineal vendrâ dado entoncespor :

/ Str.Entonces, el prpducto:

fç .

nos darâ el indice de incremento en la radiactividad incorpora- da " corregida , expresado relativamente al control no tratado.

125

4. EFECTO " IN VITRO " DE LA CICLOHEXIMIDA Y ANISOMICINA SO­BRE LA SINTESIS DE RNA.

Por lo expuesto se deduce claramente que el incremento observado en la radiactividad incorporada en RNA, al menos por el tratamiento " in vitro " con CHM y ANS, no puede ser sin mâs atribuido a una mayor actividad de transcripciôn. La pregunta que que ahora se plantea es si el incremento en la tasa de captaciôn de uridina-H^, por efecto de ambas drogas, puede explicar totalmente, o no, su mayor actividad de incor- poraciôn en RNA.

Para responder a esta cuestiôn , en todos los experimentos posteriores se medirâ la radiactividad âcido-soluble, calcu- lando y aplicando coeficientes de correcciôn en orden a poder obtener los valores de la radiactividad incorporada " corre­gida ". Por otro lado, se utilizarâ una concentraciôn elevada de uridina-H^ - 2.000 ^Ci/ml - que, por lo anteriormente vis- to ( Resultados, 3.6.), résulta adecuada para el empleo de coeficientes de correcciôn lineal.

4.1. Modificaciôn de la radiactividad incorporada " corregida "En un experimento anterior, la radiactividad âcido-soluble

habîa sido estimada tras una preincubaciôn de las glândulas " in vitro " a tiempos variables con CHM o ANS, y un breve

3marcado con uridina-H a 2.000 yiCi/ml ( véase Resultados, ;. 3.5. ). El proceso fue ahora completado mediante extracciôn de los âcidos nucleicos, y valoraciôn de la radiactividad in-

corporada.

CHM oANS urid.-H'/ preinc. j20-180 min 10 min

TCA4/

4 — I— mlav.

126

Radiact. âcido-solub ( S )

^ pronasa 1 h

Radiact. âcido-insolub,

( I )

Para el case de la CHM, los valores de radiactividad âci- do soluble e incorporada se recogen conjuntamente en la ta­bla 17 como cuentas por glândula, y en la tabla 18 como indi­ces de modificaciôn relatives al control. En este ültimo caso, el cociente I/S representarâ entonces el indice de incremento de la radiactividad incorporada " corregida ". La media de es­tes resultados, como tante por ciento del control , se repré­senta grâficamente en la fig.26. Como puede observarse, la radiactividad incorporada expérimenta por lo general un incre­mento superior a la radiactividad âcido-soluble. Por tal cau­sa, la tasa de incorporaciôn " corregida " se ve tambiên sig- nificativamente activada, salve a corto tiempo de tratamiento ( fig.26b ).

Para el caso de la ANS, los valores obtenidos se recogen en las tablas 19 y 20, como cuentas por glândula y como indi­ces de modificaciôn relatives al control, respectivamente; y, grâficamente, en la fig.27. También en este caso la radiactivi­dad incorporada " corregida " se ve significativamente incre-

co•HüdXi0ü■H(UU04Q)

WO■P00•Hg

T—1 H' 00 CM O uo Vf) 00 o 00 CM00 O 00 tH Vf) uo 00 ro o CM vo Pr~- ro 00 G) p~ ro o uo uo ro tH UO«—1 ro CM ro CM "T t—1 CM tH CM CM CM

o00 ro O ro ro ro H* p- 00 rt G G

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T—1 ro CM 00m o Vf) in

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H o Tp <T\ CM UO ro tH 00 UO p" ro trtH tH tH t—1 ter tr t—1 CM CM tr

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tH t—1 CM tH tH tH

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H VÛ Vf) en ro votH tH tH t—1

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ro O) G) Vf) 00 00o- o CM co

W • • • • • •VD O) G) tHTf ro p~ GO GO UO

\ tH tH t—1

0 U U U U U u U U U U U U-P Eh tH Eh Eh Eh Eh0Q)e•HPQ)eu t—1 CM ro ter UO VO

XW

127

p 1o •H 1eu g U1 en 00 d d 0d \0 Q) rH 0 eu•H W 0 d 0d u TJ g 0P d «■ 0 P p0 A ro vd 0 peu 0 œ rH X op u 1 en u0 0 d U)ü •H 0 0 d 00 (U •H Q) 1—1 0•H P TJ 0 peu •H nO 00) P 0 1—1Q) 0 H vd d<U TJ rH >1-1 0 0>

JO (D 0 00 rH U d en 01—1 X *0 d PI0 d O d 1—iU1 •H P •1 P d O 0 00 d U eu O d> P , p P Tî*H d o d dü O g u 0 P\d eu 0 1—1 dg (U •H eu PT5 Q) > g Pd •H Q) 0 0-P P ».•H X y— 0 Pi> 0 (0 Eh|•H 0 0 w-P 0 rH »»U W '—' 0 rHd d >1 p O•H P 0 p pT5 Eh ». 1—1 0 pd S X O 0p • K 0 U 0S U 1—1 üd 3 0 01—1 U Q) w g1 o Ul •(U 0) 0 u d'0 rH • 1—1g •H • d 00 = ü •H U> TJVD tn \d g 0 0•H 0 g P vdU p T) 0 TJ 1—1d 4J o d ,0 enU •H tH P d•H > •H 1—1 pU-t 0 > • 0•H 0 0 •H f: 0 euTJ •H U P u 00 U ü 0S d 0 d•H TJ 0 P1 0 0 TJ d 0• VD p d 0 T) 0•H p p 0 d 0t—1 u •H rH P üd > d (0 dd u rH > P di-H •H 0 •H PXi r4 •H VD 1—1 0d eu •H d 0 0H d = TJ w 0

128

/

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tH O tH o tH tH

m in 00 ter GO H 00 ro lO ro LO tH00tH tH tH tH CM tH tH

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i

I

60 120 180min de preincubaciôn en CHM

Figura 26.- Efecto " in vitro " de la CHM sobre la captaciôn e incorporaciôn de uridina. Para cada tiempo de preincubaciôn con la droga, la media de los resultados obtenidos para la radiac­tividad âcido-soluble, incorporada, e incorporada " corregida " ( véanse tablas 17 y 18 ) se représenta grâficamente como tan- to por ciento del correspondiente control no tratado

En a :

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radiactividad âcido-soluble

radiactividad incorporada.

En b : radiactividad incorporada " corregida ". El ârea rayada dénota la activaciôn résultante

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180

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12060 120 180m m de preincubaciôn en ANS

Figura 27.- Efecto " in vitro " de la ANS sobre la captaciôn e incorporaciôn de uridina. Para cada tiempo de preincubaciôn con la droga, la media de los resultados obtenidos para la radiac­tividad âcido-soluble, incorporada e incorporada " corregida "( véanse tablas 19 y 20 ) se representan grâficamente como tan- to por ciento del correspondiente control no tratado.

En a: radiactividad âcido-soluble

radiactividad incorporada.

En b : radiactividad incorporada " corregida"El ârea rayada dénota la activaciôn résultante

133

mentada a medio y largo tiempo de tratamiento con la droga ( fig.27 b ).

Estos resultados parecen indicar que el aumento de la tasa de captaciôn del nucleôsido radiactivo puede explicar en parte, pero no totalmente, el incremento observado en la radiactivi­dad incorporada en RNA por efecto de la CHM y ANS. Resultados semejantes se obtuvieron en otros experimentos empleando dis- tintas concentraciones de uridina-H^, y que no son aquî expues­to s por evitar reiteraciones. Pero dada la inportancia de la conclusiôn alcanzada, se ha elaborado una tabla ( tabla 21 ) mostrando el porcentaje de experimentos en los que se observô un incremento en la radiactividad incorporada " corregida ".

DrogaExperimw

realizadosMuestran

activaciôn % del total

Tabla 21.- Glândulas salivales fueron tratadas " in vitro durante 60 - 180 min con 10 ^g/ml de CHM d 20 yig/ml de ANS, y brevemente marcadas con uridina-H^. La tabla recoge el nümero de experimentos realizados y aquellos en los que una activaciôn de la radiactividad incorpr- rada " corregida " fue observada.

En resumen, la aplicaciôn " in vitro " de CHM y ANS in­duce un incremento en la actividad de incorporaciôn de uridina que no parece ser adecuadamente explicable ni por una modifi-

134

caciôn en la estabilidad del RNA recién sintetizado ( al menos en el caso de la CHM, véase Resultados, 2.4. ) ni, en la mayo- ria de los casos, por una mayor tasa de captaciôn del precur­sor marcado. Ello apoya la idea de que ambas drogas, a dosis fuertemente inhibitorias de la sintesis de proteinas, logran activar el mecanismo de transcripciôn. Esta idea serâ ulterior- mente confirmada por mediciôn directa de la actividad RNA poli- merasa.4.2. Efecto de la cicloheximida y anisomicina sobre las distin­tas especies de RNA.

Determinada la existencia de la respuesta activadora a ni- vel del RNA total, se trata ahora de comprobar si tal respues­ta es general, o bien présenta un carâcter selective para las distintas especies de RNA recién sintetizado que permite di- ferenciar el anâlisis electroforético.

4.2.1. Mediciônjde la_rad^act^v_id^d^âcido-solub]l^e__bajo ciones de fijaciôn con etanol.

Como se indicé previamente ( Material y Métodos, 4.1.1. ), la fijaciôn de las glândulas con etanol es especialmente de- seable cuando se pretende obtener un perfil electroforético del RNA. Ello ha obligado a poner a punto un nuevo método para la mediciôn de la radiactividad âcido-soluble intracelular, pues el normalmente empleado se basaba en la fijaciôn en pre- sencia de TCA.

Dos grupos de glândulas hermanas fueron marcadas durante

135

20 min con medio de Cannon conteniendo 1.000 ^Ci/ml de uridi- na-H^, tras lo cual fueron sometidos a lavados sucesivos con el medio de incubaciôn ( Material y Métodos, 4.4.). üno de los grupos de glândulas fue fijado con TCA, y la radiactividad âcido-soluble valorada por el método habituai, siendo el va­lor obtenido considerado como control. Las glândulas hermanas fueron fijadas por adiciôn de 1 ml de etanol frio, y a tiempos de 5 y 10 min la fraccién de radiactividad celular extraida fue valorada tomando alîcuotas del alcohol de fijaciôn; tras ello las glândulas fueron digeridas en presencia de pronasa, valorândose sobre el digesto la radiactividad total y âcido-in- soluble.

En la tabla 22 se recogen los valores de radiactividad medidos sobre el TCA y etanol, expresados como cuentas por glândula. De estos datos se puede deducir que:

+) En primer lugar, son suficientes 5 min de fijaciôn para alcanzar el mâximo de extracciôn posible con etanol.

+) En todo caso, esta fracciôn extraida es muy baja, cuan­do se compara con los valores obtenidos con TCA.

En consecuencia,para medir la radiactividad âcido-soluble, en condiciones de fijaciôn con etanol, habrâ de sumarse la fracciôn extraida por el fijador ( Et ) con la que permanece en el interior de las células. Esta ûltima serâ estimada por por la diferencia entre la radiactividad total ( T ) y âcido- -insoluble ( I ), medidas sobre el digesto de âcidos nucleicos

136

EtanolEt./TCA

(10 min.)Experimento TCA 5 min. 10 min

1 114.290 13.400 13.615 0,12

2 93.655 11.820 11.770 0,13

3 74.345 11.875 13.250 0,18

Media : 0,14

Tabla 22.- Rendimiento comparado de la extracciôn de ra diactividad âcido-soluble intracelular con TCA y etanol Grupos de glândulas hermanas, brevemente marcadas con3uridina-H , fueron fijadas con TCA o etanol absoluto { Et ), La radiactividad extraida en los medios de fi­jaciôn fue valorada y comparada en ambos casos.

EtanolTCA T-I+EtTCAExperimento T-I+Et.0,8495.752114.290 84.640 2.503

80.42970.448 1.78993.655

74.499 1,001.64174.345 62.890

Media ; 0,90

Tabla 23.- Caracterizaciôn del método de medida de la ra­diactividad âcido-soluble bajo condiciones de fijaciôn con etanol. Las glândulas fijadas con etanol ( ver tabla 23 ) fueron digeridas en presencia de pronasa, y la radiactividad total ( T ) y âcido-insoluble ( I ) del digesto medidas. El valor para la radiactividad âcido-soluble fue calculado y comparado con el obtenido por fijaciôn en TCA. Los valoresdados corresponden a cuentas por glândula.

137

La fôrraula résultante serâ entonces:

S = T - I + Et

En la tabla 23 los valores de radiactividad obtenidos de este modo son comparados con los valores control obtenidos en las glândulas hermanas ( fijadas con TCA ). Los resultados son comparables, por lo que el procedimiento descrito puede ser aceptado como método alternativo para la mediciôn de la radiac­tividad celular âcido-soluble y, por ello, estimar la tasa de captaciôn de uridina por las células.

4.2.2. Anâlisis electroforético.Un estudio preliminar llevado a cabo con Ch. pallidivitta-

tus mostraba que , cuando las glândulas eran brevemente marca­das " in vitro " con uridina-H^ en presencia de CHM o ANS, se producîa un incremento en la radiactividad incorporada, afec- tando aparentemente a todas las familias de RNA recién sinteti­zado distinguibles en el perfil electroforético, sin que nin- gûn efecto selectivo pudiera ser apreciado ( véase fig.28 ).Con el fin de estudiar mâs a fondo este comportamiento, un planteamiento experimental mâs riguroso fue llevado a cabo con larvas de Ch. thummi.

Glândulas salivales fueron preincubadas en medio de Cannon conteniendo 10 yug/ml de CHM durante 60 o 180 min, siendo en­tonces marcadas durante 10 min por adiciôn de uridina-H^ has- ta una concentraciôn de 2.000 yaCi/ml, siempre en presencia de

Figura 28.- Efecto " in vitro *' de la CHM y ANS sobre la actividad de incorporaciôn en distintas especies de RNA. Glândulas salivales de Ch. pallidivittatus fueron marcadas durante 20 min con 750 jjCi/ml de uri- dina-H^ en presencia de 10 jag/ml de CHM ( a ) o de 10 ^g/ml de ANS { b ), y los âcidos nucleicos extrai- dos y separados por electroforesis. Como control, las glândulas hermanas de aquellas fueron marcadas en au- sencia de la droga.

#--------# : control.A ________A : glândulas tratadas.

138

285185 4-55

10004

800

2 600

200

2010 30 40

Numéro de fracciôn

285185 4 -5 510004

8004

■5) 6004

20CH

Numéro de fracciôn

139

la droga. Tras ser fijadas con etanol, las glândulas fueron procesadas para estimar la radiactividad âcido-soluble, tal como fue previamente indicado ( Resultados, 4.3.1. ), El ré­manente no utilizado del extracto de âcidos nucleicos fue puri- ficado por precipitaciôn alcohôlica, y el RNA analizado por por electroforesis. Como control, en cada caso un proceso igual fue llevado a cabo con las glândulas hermanas de aque­llas, en ausencia de la droga.

Con el fin de que los perfiles résultantes correspondie- ran a radiactividad incorporada " corregida ", fueron calcula- dos los coeficientes de correcciôn tal como se indi-cô anteriormente ( Resultados, 3.6. ), y los valores de ra­diactividad de cada fracciôn del perfil correspondiente a glândulas tratadas fueron corregidos conforme a dichos coefi­cientes .

Un proceso experimental idéntico al anterior fue llevado a cabo usando ANS a concentraciôn de 20 jiq/ml, siendo también aplicada a 60 y 180 min de preincubaciôn.

Los perfiles de radiactividad résultantes se representan en la fig.29, para el caso de la CHM, y en la fig. 30 para el caso de la ANS.

Para la interpretaciôn de estos perfiles ha de considerar- se, en primer lugar, la apariciôn de picos subsidiaries situa- dos tras el pre-rRNA 38S, como ya fue anteriormente constatado ( Resultados, 1.4.1. ). Su tamano es especialmente prominente

Figura 29. - Efecto " in vitro *' de la CHM sobre el perfil de RNA recién sintetizado. Glândulas saliva­les de Ch. thummi fueron preincubadas " in vitro" con 10 ^g/ml de CHM durante 60 min ( ^ ) o 180 min

3( b ), y brevemente marcadas con uridina-H . Los âcidos nucleicos fueron separados por electrofore­sis, obteniéndose los perfiles de radiactividad in­corporada " corregida ". Como control, las glându­las hermanas fueron usadas, en ausencia de la droga

^ ----- e : control.: glândulas tratadas.

140

A -5 S285 1858004

cEm 600-mcOiDO^ AOO-

200-

10 6020 30 AO

num éro de fracciôn

2 8 5 185

AOOH

I 300-

rocdjD- 200- ■DUm"Om

100-

2010 30 AO 50numéro de fracciôn

Figura 30.- Efecto *' in vitro " de la ANS sobre el perfil de RNA recién sintetizado. Glândulas saliva­les de Ch. thummi fueron preincubadas " in vitro "con 20 jiq/ml de ANS durante 60 min ( a_ ) o 180 min

3{ b ), y brevemente marcadas con uridina-H Los âcidos nucleicos fueron separados por electrofore­sis, obteniéndose los perfiles de radiactividad in­corporada " corregida ".Como control, las glându­las hermanas fueron usadas, en ausencia de la droga

#------# : control.A------ A : glândulas tratadas.

141

4 -5 5285 1858 0 0 -

E 6 0 0 -

X) 400 -m"O

œ 20 0 -

2010numéro de fracciôn

200

160-

cEm 120- racd>DO■O•g 80-

u2T>focr

40-

2010 30 40numéro de fracciôn

142

tras largos tiempos de incubaciôn " in vitro ", y distorsio- nan seriamente la regidn del perfil correspondiente al hnRNA de pequno tamano. Como ya se indic6 previamente, la naturale- za de estos picos no parece ser explicable como formas riboso- males astables originadas por un normal procesamiento del pre-rRNA, dado el escaso tiempo de marcado ( 10 min ); ni tam- poco como una degradacidn, en sentido estricto, del RNA ex- traido, dada la repetibilidad en la localizaciôn de estos pi­cos y el hecho de que otras regiones del espectro no aparezcan especialmente distorsionadas. Asi, no se aprecia una acumula- ci6n anormal de radiactividad en la regiôn del RNA de peque- no tamano, como es habituai cuando se ha producido degrada- ciôn: tanto a 60 como a 180 min de preincubaciôn " in vitro ", el valor relativo de la fracciôn 4-5S en los espectros control se mantiene aproximadamente en un 20% del total del perfil.Una posible explicaciôn radicarîa en que se trate de RNAs de naturaleza ribosomal, originados por una especial labilidad del transcripto primario nucleolar, debido a las condiciones artificiales de mantenimiento " in vitro " de las glândulas. Esta idea podria tener su apoyo en observaciones citolôgicas, que muestran que entre 1 - 3 h de incubaciôn de las glândulas en medio de Cannon la morfologia de los cromosomas se mantiene normalmente , en tanto las estructuras nucleolares aparecen especialmente dahadas.

Obviando esta dificultad, se observa claramente que el in-

143

cremento , por efecto de ambos inhibidores, en la tasa de ra­diactividad incorporada " corregida " - y, por ello, presumi- blemente , en la actividad de sintesis de RNA - parece afec- tar a todos los componentes del perfil. Con el fin de examiner si, de todos modos, existen diferencias cuantitativamente sig­nificatives entre las diferentes especies de RNA, los perfiles fueron divididos en sus principales regiones ( véase Resulta­dos, 1.4.2.a ), aunque en este caso las dos regiones interme- dias ( pre-rRNA y hnRNA de mediano Pm ) fueron consideradas conjuntamente, debido a la ya indicada presencia de formas pre- sumiblemente de naturaleza ribosomal sobre la regiôn del media­no hnRNA. La radiactividad correspondiente a cada regiôn ( hnRNA de alto Pm, pre-rRNA + hnRNA de mediano Pm, RNA de bajo Pm ) se obtuvo entonces sumando los valores de las frac- ciones que la integran.

Los resultados obtenidos , para el caso de la CHM y ANS, se recogen en la tabla 24, expresados como cuentas totales y como indice de incremento en el perfil tratado respecto a su correspondiente control. Estos indices de incremento, expre sados como tanto por ciento, se representan grâficamente en la fig. 31, Como puede observarse, es la familia de R ïA de pequeno tamano ( 4-5S ) la que résulta siempre mâs incremen- tada, en tanto la regiôn intermedia ( donde prédomina cuanti­tativamente el RNA nucleolar ) es la que en la mayorîa de los casos résulta menos activada por efecto de ambos inhibidores.

Tabla 24.- Modificaciôn de las distintas especies de RNA reciên sintetizado por aplicaciôn " in vitro " de CHM y ANS. Los perfiles electroforéticos representados en las figs. 29 y 30 fueron divididos en très regiones, y la su- ma de radiactividad correspondiente a cada regiôn calcu- lada. C, perfil control; Tr, perfil de glândulas trata- das, Los valores son dados como cuentas totales, y como indice de incremento en el perfil de glândulas tratadas respecte al control ( Tr/C ).

Los valores entre paréntesis, adjuntos a les perfiles control, expresan la fracciôn de radiactividad que la correspondiente regiôn représenta respecte al to­tal del perfil.

144

Pre-rRNA

CHM

60m i n .

180 m i n .

\

hnRNA alto Pm

y hnRNA med. Pm

Peq, RNA ( 4-5 S ) Total

/

c

( 0,17 ) 1.395

( 0,62 ) 5.098

( 0,20 ) 1.664 8.157

Tr 1.939 6.270 2.662 10.871

^Tr/C 1,39 1,23 1,60 1,33

/

C{ 0,18 ) 1.164

( 0,63 ) 4.067

( 0,19 ) 1.196 6.427

Tr 1.420 4.026 1.674 7.120

Tr/C 1,22 0,99 1,40 1,11

/

ANS

\

/ ( 0,24 ) ( 0,56 ) ( 0,19 )C 2.141 4.931 1.720 8.792

60min. Tr 2.855 6.231 2.629 11.745

Tr/C 1,35 1,26 1,53 1,34

/ ( 0,25 ) ( 0,55 ) ( 0,20 •)C 511 1.136 402 2.049

180min. Tr 614 1.494 732 2.840

Tr/C 1,20 1,31 1,82 1,39\

Figura 31.- Activaciôn de las distintas especies de RNA recién sintetizado por aplicaciôn " in vitro " de CHM y ANS. Los Indices de incremento para cada regidn del perfil obtenidos en la tabla 24 son aquî expresados como tanto por ciento del control.

; hnRNA de alto Pm.

: pre-rRNA + hnRNA de medio Pm,

: RNA de bajo Pm ( 4-5S ) .

145

140-

100-

o 60-S 20-

■o

180-TD TO■oi 140^uTO% 100- cr

60-

20-

CHM. 60min.

i

ANS, 60 min.

CHM, 180 min.

ANS, IBOmin

i

I

146

Estos resultados parecen apuntar hacia la existencia de una respuesta distinta de las diversas especies de RNA a la inhibiciôn de la sîntesis de proteinas. De todos modes, un comportamiento cualitativamente diferencial s61o serâ ob- servado bajo condiciones de aplicaciôn " in vivo " del tra- tamiento inhibitorio.

147

5. EFECTO " IN VIVO " PE LA CICLOHEXIMIDA SOBRE LA SINTESIS DE RNA.

Bajo condiciones de aplicaciôn " in vitro ", la CHM y ANS parecian provocar un incremento en la actividad de transcrip- ci6n , afectando, aunque en distinta medida, a todas las es­pecies de RNA distinguibles en el perfil de electroforesis. Por su parte, la incubaciôn " in vivo " durante 3 h con CHM, daba lugar a un claro incremento en la radiactividad incorporada en RNA ( Resultados, 2.1.; tabla 6 ), que no parece ser expli­cable como un incremento en la tasa de captaciôn del precursor, dado que ninguna alteracidn significativa de este paramétré era observada en las horas iniciales de tratamiento con la droga ( Resultados, 3.5.: fig.24c ).

En este capitule se tratarâ de comprobar si, como parece, la inhibiciôn " in vivo " de la sîntesis de proteinas incremen- ta también la actividad de transcripciôn, y si este incremen­to muestra un carâcter selective para las distintas familias de RNA.

5.1. Efecto de la cicloheximida sobre la sîntesis de RNA total y sus diferentes especies.

Un estudio previo llevado a cabo con Ch. pallidivittatus mostrô que la actividad de incorporaciôn en las diferentes es­pecies de RNA recién sintetizado era diferencialmente modifi- cada tras 3 h de tratamiento " in vivo " con CHM. Como puede

148

apreciarse en la fig.32, la radiactividad incorporada aparece incrementada a nivel de todo el perfil, excepciôn hecha del pico de RNA de origen nucleolar ( pre-rRNA 38S ). Estas modi- ficaciones fueron cuantificadas dividiendo los perfiles con­trol y tratado en sus cuatro regiones fundamentales ( hnRNA de alto Pm, hnRNA de mediano Pm, pre-rRNA, y RNA 4-5S ), y calculando el total de radiactividad comprendida por cada re- giôn. Los resultados, como cuentas totales y como Indice de modificaciôn en el perfil tratado respecto al control, se re- cogen en la tabla 25. El incremento mâs acusado corresponde al RI'JA 4-5S, y al hnRNA de alto Pm, siendo el pre-rRNA la ünica especie inhibida respecto al control.

Con el fin de obtener una informaciôn mâs compléta, un nuevo estudio experimental fue llevado a cabo. Larvas apro- ximadamente iguales de un mismo cultivo de Ch. thummi fueron tratadas " in vivo " con 10 yag/ml de CHM, y a las horas 1, 3, 6 y 24 de tratamiento se sacrificaron 8 larvas, siendo marca- das sus glândulas durante 10 min con 2.000 yuCi/ml de uridi- na-H^ en medio de Cannon. Tras ser fijadas con etanol abso- luto, las glândulas fueron procesadas para la valoraciôn de la radiactividad âcido-soluble, siguiendo el método ya descri- to ( Resultados, 4.3.1. ). El rémanente no utilizado del ex­tracto de âcidos nucleicos fue purificado por simple precipi- taciôn alcohôlica, y el RNA analizado por electroforesis. Co­mo control se utilizaron larvas del mismo cultivo no tratadas

149

28S185 4-55_ 1200-

cI 1000-

3 800-

"D,-S 600 - >

o 400-1 3rocr

200 -

10 20 30 40 50Numéro de fraccion

Figura 32.- Efecto " in vivo " de la CHM sobre la ac­tividad de incorporaciôn en distintas especies de RNA. Larvas de Ch, pallidivittatus fueron tratadas " in vi­vo " durante 3 h con 10 jig/ml de CHM, y sus glândulas salivales extraidas y marcadas " in vitro " durante 20 min con 750 yaCi/ml de uridina-H^. Los âcidos nuclei­cos fueron extraidos y separados por electroforesis. Como control se utilizaron larvas no tratadas con la droga. #----- # : control; A------ A : larvas tratadas

150

PerfilhnRNA

alto PmhnRNA

medio Pm pre-rRNApeq. RNA ( 4-5S ) Total

C 2.820 1.165 2.795 1.250 8.030

Tr 3.960 1.390 2.435 2.175 9.960

Tr/C 1,40 1,19 0,87 1,74 1,24

Tabla 25.- Modificaciôn de la radiactividad incorporada en las distintas especies de RNA recién sintetizado, por tratamiento " in vivo " con CHM. Los perfiles represen­tados en la fig.32 fueron divididos en cuatro regiones, y la suma de radiactividad correspondiente a cada regiôn calculada. C, perfil control; perfil de glândulas tra­tadas. Los valores son dados como cuentas totales , y co­mo indice de incremento en el perfil de glândulas trata­das respecto al control (Tr/C ).

151

con la droga.Para que los perfiles résultantes correspondiesen a ra­

diactividad incorporada " corregida ", se calcularon los coe- ficientes de correcciôn S^ys^^( véase Resultados, 3.6. ), y los valores de radiactividad correspondientes a los perfiles de glândulas tratadas fueron corregidos conforme a dicho coe- ficiente. Los espectros as! obtenidos se representan en la fig.33. En cada caso, a efectos de comparaciôn, se adjunta también el perfil control.

Con el fin de estimar la modificaciôn de la sîntesis deRNA, a nivel total y en sus diferentes especies, los perfiles fueron divididos en sus cuatro regiones fundamentales, y la suma de radiactividad para cada regiôn y para el total del perfil, calculada y expresada relativamente al control ( ta­bla 26 ) .

De la observaciôn de los resultados obtenidos parece de- ducirse , en primer lugar, que la CHM, bajo condiciones de aplicaciôn " in vivo ", induce un pequeno incremento inicial en la sîntesis de RNA total glandular ( 15% a la hora 3 ), para dar lugar posteriormente a una clara inhibiciôn a horastardîas de tratamiento ( hora 24 ). Estos resultados confir-man esencialmente los obtenidos previamente con Ch. pallidi­vittatus ( Resultados, 2.1., tabla 6 ), donde se midiô la in-

3corporaciôn no corregida de uridina-H , Es de notar, sin em­bargo, que en dicha ocasiôn el incremento observado a corto

Figura 33.- Efecto " in vivo " de la CHM sobre el per­fil de RNA recién sintetizado. Larvas de Ch. thummi fueron tratadas " in vivo " con 10 jxq/ml de CHM duran­te Ih ( a ) , 3 h ( b ) , 6 h ( ç_ ) y 24h ( d ) , y sus glândulas salivales marcadas " in vitro " brevemente

3con uridina-H . Los âcidos nucleicos fueron separados por electroforesis, obteniéndose los perfiles de ra­diactividad incorporada " corregida ". Como control se usaron larvas no tratadas con la droga.

#----- 0 : control.A_____ A : larvas tratadas.

152

4-5S28S «S

1000-

800-

600-

400-

200-

20 3010Numéro de fraccion

1200-285 185 4 -55

1000-

800-

600-

400-

200-

2010 30

Numéro de fraccion

1200-

28S18S 4-55

1000-

800-

600-

200-

10 20 30

Numéro de fraccion

1200-285 185 4 55

1000-

800-

600-

400-

200-

10 20 30 40

N u m éro de fraccion

153

PerfilhnRNA alto Pm

hn RNA medio Pm pre-rRNA

peq. RNA ( 4-5 S ) Total

Control 1.785 1.713 3.839 1.4 07 8.744

h i 2.212 1.955 2.906 2.147 9.220

hl/C 1,24 1,14 0,76 1,53 1,05

h 3 2.217 1.970 3.610 2.289 10.086

h3/C 1,24 1,15 0,94 1,63 1,15

h 6 1.655 1.656 2.791 2.056 8.186

h6/C 0,93 0,97 0,73 1,46 0,94

h 24 969 1.501 1.571 1.752 5.793

h24/C 0,54 0,88 0,41 1,25 0,66

Tabla 26,- Modificaciôn de las distintas especies de RNA re­cién sintetizado por tratamiento " in vivo " con CHM. Los per­files electroforéticos representados en la fig.3 3 fueron divi­didos en cuatro regiones, y la suma de radiactividad corres­pondiente a cada regiôn calculada. Los valores son dados como cuentas totales, y como indice de modificaciôn en los perfiles de glândulas tratadas respecto al control.

154

tiempo de tratamiento ( un 30% a la hora 3 ) era apreciable- mente mayor que el detectado en el experimento presente. Esta discrepancia puede tener su causa, al menos en parte, en di- ferencias cuantitativas intrinsecas a las especies de Chirono- mus utilizadas. En efecto, la comparaciôn de los datos obteni­dos en los perfiles control de Ch. pallidivittatus ( tabla 25 ) y de Ch. thummi ( tabla 26 ) nos indican que la proporciôn de la especie de hnRNA de alto Pm, respecto al total del perfil, es considerablemente menor en el caso de Ch. thummi que en el de Ch. pallidivittatus, como puede observarse en la tabla 27. Dado que éste es uno de los componentes del perfil mâs incre- mentado por efecto de la CHM, ello podrîa explicar en buena medida que la activaciôn a nivel del RNA total sea menor en Ch. thummi que en Ch. pallidivittatus.

Total perfilhnRNA de alto Pm % del total

Ch. pallidiv. 8.030 2.820 35Ch. thummi 8.744 1.875 20

Tabla 27. La suma de radiactividad correspondiente al total del perfil, y a la familia de hnRNA de alto Pm, son compara- dos en espectros provenientes de Ch. pallidivittatus y Ch. thummi.

Por ûltimo, la evoluciôn frente al tiempo de tratamiento de cada una de las especies de RNA distinguibles en el perfil, cuantificadas en la tabla 26, se représenta grâficamente en la

155

fig.34, como tanto por ciento del control. Estos resultados confirman el carâcter diferencial de la acciôn " in vivo " de la CHM, que ya fue observado en Ch. pallidivittatus ( fig.32 y tabla 2 5 ). El componente de pequeno tamaho (4-5S) es el que expérimenta un mâximo incremento , observable incluso a tiem­po s largos de tratamiento. En menor proporciôn, el hnRNA de alto Pm , y de mediano Pm , resultan también activadosdurante los tiempos iniciales, siendo después progresivamente inhibidos a horas tardias de incubaciôn. Por ûltimo, la sinte- tesis de RNA nucleolar ' résulta en todo momento inhibida por efecto de la droga.5.2. Anâlisis autorradiogrâfico de la incorporaciôn de uridina-H

Con el fin de confirmer citolôgicamente el efecto diferen­cial de la CHM sobre la incorporaciôn de uridina, larvas de un mismo cultivo de Ch. pallidivittatus fueron incubadas " in vivo " durante 3 h en presencia de 10 jig/ml de la droga, y las glândulas extraidas y procesadas para autorradiografla ( Mate­rial y Métodos, 3.2. ). Como control se emplearon larvas no tratadas del mismo cultivo. Tanto los nucleolos como los BRs 2 fueron agrupados en 3 clases, segün intensidad de marcado. El criterio de clasificaciôn fue:

++ : marcado muy superior al fondo citoplâsmico.+ : marcado algo superior al fondo citoplâsmico

: marcado no superior al fondo citoplâsmico.

156

coo~âjTD

"Om-oum%)fü0:

100

1A0-

120

100

hn RNA alto Pm

\y /

hn RNA medio Pm

pre-r RNA

---T— --—---------- ---- /i-------

f r ~ ‘RNA 4-5 5

j 124 1 3

horas en CHM24

Figura 34.- Evoluciôn de las diferentes especies de RNA con el tiempo de tratamiento " in vivo " con CHM. Los indices de modificaciôn para cada regiôn del perfil, ex­presados en la tabla 26, son aqui representados como tanto por ciento, en funciôn del tiempo de tratamiento con CHM. El ârea rayada resalta la activaciôn résultante.

157

Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 28. Como puede observarse, el tratamiento ha activado la incorporaciôn en los BRs ( incremento de un 11% en la clase de marcado alto ), y ha deprimido considerablemente la incorporaciôn sobre los nucleolos ( disminuciôn de un 24 % en la clase de marcado alto).

Un ejemplo fotogrâfico de estas observaciones se muestra en la fig.35. Nôtese en la célula tratada ( b ) la considera­ble reducciôn del marcado sobre el nucleolo, y su notable in­cremento sobre todo el cromosoma IV, en particular sobre el BR2.

Estos datos citolôgicos son plenamente acordes con los re- sulatdos bioquîmicos que mostraban una activaciôn en la sînte­sis de hnRNA, y una inhibiciôn del pre-rRNA, por efecto " in vivo " de la CHM.

Tabla 28.- Respuesta de la intensidad de marcado autorra- diogrâfico a la aplicaciôn " in vivo " de CHM. Tras 3 h. de tratamiento ” in vivo " con CHM, los BR2 y nucleolos procédantes de glândulas salivales de Ch. pallidivitta­tus fueron agrupados en clases, segun intensidad de mar­cado aurradiogrâfico ( véanse en el texto los criterios de clasificaciôn ). El control corresponde a glândulas de larvas no tratadas con la droga.

158

B R 2

Control TratadosMarcado Xn° anillos % total /— .......n° anillos % total ^

++ 60 69 117 80

+ 22 25,3 29 20

- 5 5,7 - -

Total 107 100 146 100

Nucleolo

Control TratadosMarcado Xn° nucleol. % total ^

/---n° nucleol. .......\% total

++ 97 76,5 59 52

+ 23 18 51 45

- 7 5,5 3 3

Total 127 . 100 113 100

Figura 35.- Modificaciôn del marcado autorradiogrâfico por aplicaciôn " in vivo " de CHM. En a, célula de glân- dula control; en b, célula de glândula tratada durante 3 h con CHM. Nôtese la distinta repercusiôn del trata­miento sobre el marcado en el BR2 y en el nucleolo.

160

6. EFECTO DE LA CICLOHEXIMIDA SOBRE LA ACTIVIDAD RNA POLIMERASA.Planteamiento del problema.La inhibiciôn de la sîntesis de proteinas mediante inhibi-

dores especîficos inducîa un incremento de la incorporaciôn de uridina que aparentemente era debido a una mayor actividad de sîntesis de RNA, al no poder ser explicado ( al menos en el caso de la CHM ) por una variaciôn en la estabilidad del RNA recién sintetizado ni, totalmente, por una mayor tasa de capta­ciôn del precursor radiactivo. En el présente apartado preten- demos confirmar, por una vîa experimental distinta, que se trata efectivamente de una mayor actividad de transcripciôn.

Por otro lado, en el mecanismo de transcripciôn se distin- guen dos procesos diferentes, y por tanto susceptibles de ser controlados separadamente: la actividad de uniôn de las mOlê- culas de RI A polimerasa al DNA ( actividad de iniciaciôn ) , y la velocidad de lectura del DNA por dichas polimerasas ( ve- locidad de elongaciôn del RNA nascente, o tasa de polimeriza- ciôn de los nucleôtidos en RNA ), Cabe entonces preguntarse si, de producirse una mayor actividad RNA polimerasa, ésta se debe a un incremento en la actividad de iniciaciôn o de elon­gaciôn.

Un método empleado frecuentemente para abordar estos pro­blèmes en cêlulas eucariôticas consiste en la estimaciôn de la actividad RNA polimerasa en nûcleos aislados, sobre la ba­se de la tasa de incorporaciôn de un precursor radiactivb

161

apropiado ( p.e., UMP-H^ ). Este método permite soslayar pro­blèmes tales como las alteraciones en la captaciôn del pre­cursor ( Pogo et al., 1966 ); por otro lado, los distintos procesos implicados en el mecanismo de transcripciôn pueden ser separadamente examinados, considerando que en nûcleos ais­lados existe sôlo prâcticamente actividad de elongaciôn ( Wid- nell y Tata, 1964; Maul y Hamilton, 1967; Pogo, 1969 ). La aplicaciôn de este método, sin embargo, tropezarîa con cier- tas dificultades en nuestro sistema biolôgico, para este tipo de estudios.

Existe una técnica alternativa, empleada con éxito en diverses sistemas eucariôticos para la localizaciôn y medida " in situ " de la actividad RNA polimerasa endôgena. Esta técnica se fundamenta en que, tras una breve fijaciôn de las cêlulas, tanto la RNA polimerasa nucleolar como nucleoplâsmica son reactivadas por incubaciôn de los ribonucleôsidos trifos- fatados ( ATP, GTP, CTP y UTP-H^), reiniciSndose su polimeri- zaciôn en RNA ( Moore, 1978 ). Este método permite obviar pro- blemas taies como las posibles variaciones en la tasa de cap­taciôn o fosforilaciôn del precursor marcado, o de la estabi­lidad del RNA recién sintetizado, los cuales si podian inter- ferir al trabajar con cêlulas vivas. Por ello, la suma de ra­diactividad incorporada ha de ser una medida directa de la ac­tividad RNA polimerasa dependiente de DNA. Por otro lado, los dos procesos implicados en el mecanismo de transcripciôn pueden ser distinguidos, dado que bajo estas condiciones no existe

162

nueva actividad de iniciaciôn, sino sôlo elongaciôn de aquellas cadenas de RNA nascente iniciadas anteriormente a la fijaciôn de las cêlulas ( Moore, 1978 ). Por ello, si la velocidad de elongaciôn no es alterada, la cantidad de RNA sintetizada ( medida como incorporaciôn de UTP-H^ )estarâ directamente rela- cionada con el numéro de RNA polimerasas actualmente unidas al DNA.

Proceso experimentalDos grupos de glândulas hermanas fueron incubadas " in vi­

tro " durante 3 h en medio de Cannon, uno de ellos en presen­cia de 10 jiq/ml de CHM, y el otro, usado como control, en au- sencia de la droga. Tras ello el medio de incubaciôn fue reti- rado , y las glândulas fueron fijadas en etanol-acetona y pro­cesadas para la estimaciôn de la actividad RNA polimerasa en­dôgena ( Material y Métodos, 4.6. ). Los âcidos nucleicos fueron finalmente extraidos y purificados por simple precipitaciôn alcohôlica, midiéndose la radiactividad âcido-insoluble.

El experimento fue llevado a cabo por triplicado.Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 29.Como puede observarse, el tratamiento previo con CHM ha

dado lugar a un incremento de la actividad de incorporaciôn de UTP-H^. Por las razones anteriormente expuestas podemos con- cluir que:

a.- La CHM, bajo condiciones de aplicaciôn " in vitro ", da lugar a una real activaciôn del mecanismo de transcripciôn,

163

Cuentas/g TrX 100

Experimento Tr

72 88 122

123 158 128

113 144 127

Media 126

Tabla 29.- Repercusidn de la CHM sobre la actividad RNA polimerasa. La actividad de incorporacidn de

3 . •UTP-H en glandulas fijadas, previamente tratadas " in vitro " durante 3 h con CHM, fue medida y com- parada con la incorporaciôn en glândulas no tratadas con la droga. C , control; Tr, glandulas tratadas.

164

sin que esta conclusiôn pueda ahora ser cuestionada por posi- bles efectos colaterales de la droga sobre otros procesos me- tabôlicos relacionados.

b.- El coeficiente de incremento en la incorporaciôn de UTP-H^ en células fijadas es de una magnitud semejante al in­cremento previamente determinado para la actividad de incor­poraciôn " corregida " de uridina en células vivas ( véase Re- sultados, 4.2., fig.26 ). Esta semejanza habla en favor de que otros procesos metabôlicos que no han sido controlados direc-

3tamente - p.e., la actividad dd fosforilaciôn de la uridina-H - no han de verse modificados, al menos en una medida muy acusa- da, por efecto de la droga.

c.- Por ûltimo, el incremento en la incorporaciôn de 3UTP-H no puede ser explicado como una mayor tasa de elongaciôn de

RNA nascente, pues el medio de incubaciôn conteniendo CHM es retirado previamente, y la incubaciôn de las glândulas fijadas con el isôtopo se lleva a cabo siempre en las mismas condicio- nes, en ausencia de la droga. La explicaciôn ha de estribar enfonces en que hay un mayor numéro de cadenas de RNA en for- maciôn en las células pretratadas con el inhibidor, lo que im- plica que la CHM ha activado la tasa de uniôn de las RNA poli- merasas al DNA. En consecuencia, la CHM parece actuar incre- mentando, al menos , la actividad de iniciaciôn.

D I S C U S I O N

165

El fenômeno de la expresiôn génica en organismes eucariô- ticos consituye un problema de gran actualidad, pero sumamente complejo y oscuro. Su investigaciôn estâ siendo llevada a cabo mediante el empleo de diferentes sistemas biolôgicos que favo- recen la aproximaciôn experimental a alguno de los aspectos parciales de dicho fenômeno. En concrete, las células polite- nizadas de Chironomus presentan condiciones excepcionales pa­ra el abordaje del nivel primario de la expresién génica, la transcripcién, por cuanto permiten conjugar una doble via de anâlisis:

+) citolégica: fundamentalmente, por el anâlisis del es- tado de puffing y sus modificaciones.

+) bioquîmica; por anâlisis directe de les productos detranscripcidn.

En este contexte, la présente Tesis ha pretendido iniciar un acercamiento, a nivel molecular, al problema del control de la expresién génica en células politenizadas de Chironomus, en orden a una ulterior correlacién de los dates alcanzados con la informaciôn mâs amplia que ya se posee a nivel morfolé- gico. Este carâcter de iniciaciôn explica la naturaleza meto- dolôgica de una gran parte del trabajo, pues ante todo ha sido precise un amplio estudio infraestructural en orden a poner a punto las técnicas de anâlisis bioquîmico aptas para nuestro material biolôgico.

Por tal causa, los resultados obtenidos pueden ser agrupa-

166

dos, para su discusiôn, en dos grandes apartados:+) aspectos metodolôgicos.+) efecto de la inhibiciôn de la sintesis de proteinas

sobre la actividad de transcripcién.

1.- ASPECTOS METODOLOGICOS.

l;l. Sobre los estudios preliminares.El trabajo metodolégico realizado ha hecho posible, en al-

gunos puntos, una mejor caracterizacién de las técnicas emplea- das para la extraccién y anâlisis del RNA sintetizado en las glândulas salivales. En concrete:

a.- El método décrite de una breve digestién en presencia de pronasa, y los métodos de purificacién del digeste empleados, han demostrado dar como resultado un extracto de elevado grade de pureza en âcidos nucleicos.

b .- La caracterizacién enzimâtica con DNasa y RNasa nos ha permitido comprobar que la radiactividad âcido-insoluble medida sobre un extracto de âcidos nucleicos, tras un breve marcado con uridina-H^, es una estimacién directa de la radiac­tividad incorporada en RNA, sin que se produzca incorporaciôn sensible en otro tipo de macromolêculas, como ha sido observa- do en otros sistemas biolôgicos ( p.e., células vegetales ).

c .- La adopciôn de unas condiciones adecuadas de incuba­ciôn " in vitro " de las glândulas salivales es de especial interés, en orden ha posibilitar la aplicaciôn de tratamien-

167

tos directamente sobre el tejido glandular, sin que los posi- bles efectos sean mediatizados por procesos ocurrentes a ni­vel de la totalidad del organisme larvario. En este sentido, los estudios realizados sobre la cinética de incorporaciôn " in vitro " de uridina-H^ nos ha permitido:

+) Asegurarnos del mantenimiento " in vitro " de la fisio- logîa del sistema de transcripciôn en las glândulas aisladas.

+) En algûn caso, establecer los limites de tiempo en los que dicho sistema de incubaciôn puede, con garantîa, ser apli- cado: p.e., hasta 3 horas en medio de Cannon. En este aspecto, nuestros datos pueden cuestionar seriamente la validez de re­sultados que han sido obtenidos bajo periodos muy largos de incubaciôn " in vitro : p.e., hasta 13 horas con glândulas de Ch. thummi en medio de Cannon ( Serfling et al., 1974 ).

c.- La electroforesis en gel de agarosa, bajo nuestras condiciones de aplicaciôn, ha demostrado ser un metôdo muy adecuado para el anâlisis del RNA en este sistema biolôgico.En efecto, si bien es cierto que una separaciôn mejor entre RNAs muy proximos puede ser obtenida mediante otras técnicas de fraccionamiento mâs usadas ( p.e., geles de poliacrilamida ), los geles de agarosa tienen la ventaja de que permiten conju­gar una separaciôn suficiente entre las principales especies de RNA con la presencia simultânea en el perfil de RNAs de muy distinto peso molecular: p.e., desde el tRNA 4S hasta los grandes mensajeros especificos , de alto coeficiente de sedi-

168

mentaciôn.d .- Por ültimo, hemos constatado la existencia de dife-

rencias metabôlicas muy acusadas entre larvas distintas, in­cluse siendo larvas hermanas del mismo grade de desarrollo.En este aspecto, la adopciôn de un sistema que permite compa­rer resultados sobre glândulas hermanas, cuando las condicio­nes expérimentales lo permiten ( estudios " in vitro " ), ha demostrado ser altamente eficaz en orden a evitar la distor- siôn de los resultados obtenidos por la variabilidad inhéren­te al propio material biolôgico,

1.2. Sobre la actividad de captaciôn de uridina.De todos los aspectos metodolôgicos, el mâs destacable ha

sido, sin duda alguna, la puesta a punto para nuestro sistema biolôgico de un método adecuado que nos permite estimar el contenido de radiactividad soluble intracelular, lo que pro- porciona a su vez una medida relativa de la tasa de entrada en la célula del nucleôsido precursor, y de sus posibles modifica- ciones por diversos tratamientos.

La entrada de uridina, bajo condiciones de incubaciôn " in vitro ", résulta diferencialmente modificada por diversos tra­tamientos ( p.e., activada por CHM, ANS y (X-amanitina; lige- ramente inhibida por DMSO ). Por otro lado nuestros resultados parecen indicar - de acuerdo con lo descrito en otros sistemas biolôgicos - que là entrada del nucleôsido se realiza por un mecanismo de transporte active, siendo ademâs factor limitante

169

de su posterior tasa de incorporaciôn en âcidos nucleicos.En consecuencia, hemos de afirmar que la Simple estima- • ciôn de la radiactividad incorporada no puede sin mâs ser to- mada como una medida directa de la actividad de transcripciôn y sus modificaciones. Esto nos ha llevado a la necesidad de elaborar y aplicar coeficientes de correcciôn , los cuales son capaces de modificar cuantitativa o incluso cualitativamente ( p.e., en el caso del choque térmico ) las conclusiones ini- cialmente formuladas por la sôla consideraciôn de la radiac­tividad incorporada.

Por ello, y de acurdo con Sutton y Kempt ( 197 6 ) hemos de cuestionar seriamente el rigor de muchos resultados, ofre- cidos en la literatura, que han olvidado sistemâticamente la consideraciôn de este parâmetro. En particular, nunca, que sepamos, habla sido experimentalmente abordado al trabajar con células politenizadas^ incluso en los anâlisismâs precisos re- cientemente publicados.

Adicionalmente, el estudio aquî iniciado ha abierto nue- vas puertas de investigaciôn en torno a aspectos nunca abor- dados. En concrete, el concepto de " tasa de aprovechamiento " ( radiactividad incorporada versus radiactividad captada) es un factor de gran utilidad en estudios, actualmente en curso en nuestro laboratorio, acerca de ciertas diferencias intrîn- secas sistemâticamente ocurrentes en el desarrollo larvario.

En relaciôn al nücleo temâtico del présente trabajo, el

170

aspecto fundamental es el tocante a la repercusiôn de la CHM y ANS sobre la actividad de captaciôn de uridina. Son muy pocas y contradictorias las observaciones existantes en la literatura. Asî, la CHM no parece modificar la tasa de cap­taciôn del nucleôsido en Achyla ( Timberlake y Griffin,1974b ), o en plântulas de râbano ( Delseny et al., 1977 );sin embargo logra incrementarla ligeramente en levaduras ( Foury y Goffeau, 1973 ), y considerablemente en cultives de fibroblastos ( Hershko et al., 1971 ). Nuestros mismos resul­tados parecen indicar una clara discrepancia en el efecto de la CHM y ANS sobre la tasa de captaciôn, a corto période detiempo ( hasta 3 h ), segün sean aplicadas " in vivo " ( nomodificaciôn ) o " in vitro " ( activaciôn ). La posibilidadde interpretaciôn de estes datos excede a nuestras posibilida- des actuates.

171

2. RESPUESTA DE LA ACTIVIDAD DE TRANSCRIPCION A LA INHIBICION DE LA SINTESIS DE PROTEINAS.

La disponibilidad de la metodologla adecuada nos ha per­mitido, en segundo lugar, estudiar el efecto que una inhibi­ciôn drâstica de la sintesis de proteinas, por aplicaciôn de inhibidores especificos, produce sobre la sintesis de RNA, a nivel total y en sus diferentes especies. En este aspecto, los resultados obtenidos nos han mostrado que:

+) La actividad de transcripciôn résulta globalmente in- crementada.

+) Dicho incremento posee un carâcter selective.

2.1. Sobre el incremento de la sintesis de RNA.La existencia de un incremento en la tasa de transcrip­

ciôn como respuesta a la inhibiciôn de la sintesis de protei­nas ha sido probada en esta Tesis por via de anâlisis bioqui- mico, y encuentra ademâs una confirmaciôn en ciertas eviden- cias morfolôgicas complementarias.

a.- Parece probarse, en primer lugar:, por via indirecta de razonamiento. En efecto, la aplicaciôn de CHM y Al'JS bajo distintas condiciones de tratamiento inducia un incremento en la radiactividad incorporada en RNA, no explicable ni por una modificaciôn en la estabilidad del RNA recién sintetizado ni, al menos totalmente, por una mayor tasa de captaciôn del pre­cursor marcado. Ello apoya la idea de que el sistema de trans­cripciôn résulta efectivamente activado. Esta conclusiôn es

172

plenamente coïncidente con la formulada por Foury y Goffeau ( 1973 ), siguiendo una via de argumentaciôn semejante, por aplicaciôn de CHM y ANS en levaduras.

b .- La existencia de una respuesta activadora ha sido pro­bada ulteriormente, de modo inequivoco, mediante el empleo de células fijadas. Por esta via experimental, la detecciôn de un incremento en la incorporaciôn de UTP-H^ en células pre­tratadas con CHM es una medida directa de un incremento en la actividad RNA polimerasa dependiente de DNA, sin que en este caso la estimaciôn pueda ser perturbada por otros procesos me­tabôlicos relacionados.

Esta conclusiôn que hemos alcanzado por via bioquimica se ve apoyada por otras observaciones obtenidas en diversos sistemas biolôgicos, mostrando un incremento en la radiactivi­dad incorporada en RNA como respuesta a una inhibiciôn de la sintesis de proteinas. Tal cosa ocurre, p.e., en procariotes: por aplicaciôn de estreptomicina en cepas de E. coli estrepto- micin-dependientes ( Spotts y Stanier, 1961 ), o por adiciôn de cloranfenicol en cultives en fase de crecimiento estaciona- rio ( Fraenkel y Neidhart, 19 61 ) o bajo control de los genes de restricciôn ( Hershko et al., 1971; Ryan y Boreck, 1971 ). Semejantemente, en células eucariôticas la CHM es capaz de pro- ducir un incremento en la radiactividad incorporada ( p.e., Saccharomyces: Siegel y Sisler, 1964; células hepâticas; Verbin et al., 1969; en RNA viral infective de células superiores:

173

Stuart et al., 1974 ); o provocan una parcial recuparaciôn de la actividad de incorporaciôn previamente deprimida por some- timiento de las células a dieta carente de algdn nutriente esencial ( Smulson y Thomas, 1969; Smulson, 1970, en células de mamîferos; Gross y Pogo, 1974, en levaduras). El mismo efecto ha sido observado con otros inhibidores ( p.e., con ANS a baja dosis en hîgado de rata: Rizzo y Webb, 1969; ANS y emetina, en células HeLa: Grollmann, 1967 )y o por la sim­ple aplicaciôn de una dieta déficiente ( Mandel y Quirin-Stric- ker, 1967; Quirin-Stricker y Mandel, 1968 ).

En todo caso es preciso hacer notar que la mayorîa de estas observaciones se limitan a constatar un incremento en la radiactividad incorporada, lo cual, por las razones repeti- damente apuntadas con anterioridad, no puede ser tomado, sin mâs, como una medida directa de la actividad de transcripciôn.

c .- La existencia de una respuesta activadora, probada a nivel bioquîmico, se ha visto ademas confirmada a nivel morfo- lôgico. Observaciones realizadas en nuestro laboratorio han mostrado que la aplicaciôn de CHM y ANS induce là recuperaciôn del tamaho en el BR2 de Ch. thummi, previamente colapsado por tratamiento de las larvas con galactosa ( Santa-Cruz, en prépa­rée) . Si considérâmes que el puff es la manifestaciôn morfo- lôgica de una actividad de transcripciôn particularmente inten­se , la observéeiôn expuesta es un argumente claro en favor de

174

que, al menos a nivel de algunos loci, la inhibiciôn de la sintesis de proteinas puede dar lugar a una reactivaciôn de la tasa de transcripciôn.

Por ûltimo, hemos de notar que la respuesta activadora présenta dos caracteristicas:

+) Se trata de una respuesta a nivel estrictamente celu- lar, como se prueba de su detecciôn bajo condiciones de ex- perimentaciôn " in vitro ". No es, pues, imputable a otros procesos metabôlicos distintos a la acciôn de la droga misma, tal como, p.e., una modificaciôn en el aporte hormonal, que segûn se ha observado en otros sistemas podria dar también lugar a una activaciôn de la sintesis de RNA.

+) El incremento en la actividad de transcripciôn respon- de, al menos en parte, a una mayor actividad de iniciaciôn ( i.e., uniôn de las RNA polimerasas al DNA ), como ha podi- do deducirse del ensayo de la actividad RNA polimerasa en células fijadas. Esta conclusiôn es plenamente acorde con la alcanzada por Gross y Pogo ( 1974 ), en levaduras tratadas con CHM, o por Mandel y Quirin-Stricker ( 1967 ), al inhibir la sintesis de proteinas en células hepâticas mediante una dieta déficiente. En todo caso, si ademâs se produce o no una modificaciôn en la tasa de elongaciôn del RNA nascente, es algo que no puede responderse, dada la naturaleza de nuestros experimentos.

175

2.2. Sobre el carâcter selectivo de la activaciônEl anâlisis electroforético nos ha permitido distinguir

el comportamiento particular de los principales componentes del RNA recién sintetizado en glândulas salivales;

+) hnRNA ( destacando especialmente el de gran peso mole­cular ) .

+) pre-rRNA.+) RNA de bajo peso molecular ( 4-5S ).Los perfiles de radiactividad muestran que para las mis­

mas condiciones expérimentales, las distintas especies de RNA se ven diferencialmente modificadas;

- cuantitativamente; bajo condiciones de inhibiciôn " in vitro " de la sintesis de proteinas.

- cualitativamente ( i.e., mostrando una depresiôn selec- tiva del pre-rRNA ); bajo condiciones de inhibiciôn " in vivo "

Para su discusiôn, las distintas especies distinguibles en el perfil serân agrupadas en dos grandes categories ;

+) RNA de origen nucleoplâsmico ( extranucleolar ).+) RNA de origen nucleolar.

176

2.2,1. RNA nucleoplâsmico.La mayor parte de las observaciones existentes en la li­

teratura indican que el RNA nucleoplâsmico résulta menos o sôlo mâs tardiamente inhibido, por efecto de la CHM, que el RNA nucleolar ( p.e., Willems et al., 1969 ), o incluso no parece significativamente afectado ( Schmid y Sekeris, 1973 ). Es de notar que en algunos casos los datos presentados pare­cen indicar la existencia de una ligera activaciôn temporal de esta fracciôn del RNA ( p.e., Higashi et al., 1968; Mura- matsu et al., 1970 ), pero esta activaciôn no es explicitamen- te comentada por los autores.

Nuestros resultados, por el contrario, muestran muy cla- ramente que la inhibiciôn drâstica de la sintesis de proteinas, tanto " in vivo " como " in vitro ", produce un incremento en la sintesis de RNA extranucleolar, tal que:

+) es mâximo, y mâs duradero, para el RNA de pequeno ta- mano ( 4-5S).

+) es menos acusado y mâs transitorio para el hnRNA,

En el contexte de nuestro trabajo, son de especial inte­rés algunas de las observaciones tocantes al comportamiento del RNA de pequeno tamaho, por cuanto pueden indicar la exis­tencia de un mecanismo especifico de regulaciôn para estas es­pecies. Junto a ciertas indicaciones de que la CHM puede inhi­bir su sintesis ( Viau y Davis,1970, en Neurospora; Ro-Choi

177

et al.,1970, en células de mamîferos ), referencias mâs re- cientes indican que la sintesis de tRNA puede verse conside­rablemente incrementada por aplicaciôn de ciertos inhibidores de la sintesis de proteinas. Entre éstas, son especialmente sugerentes las observaciones de Bolcsfoldi ( 1974 ) y de Wes- terberg et al.( 1976 ), que parecen evidenciar una relaciôn directa entre la tasa de sintesis de tRNA y el tanto por cien- to de ribosomas que estân en forma polisomal. Asi, ambos fe- nômenos - segûn sus resultados - son activados pos aplicaciôn de inhibidores de la sintesis de proteinas que actûan a nivel de la fase de elongaciôn. Sobre la base de estas observacio­nes, dichos autores postulan la posible existencia de un me­canismo de regulaciôn por retrocontrol para la sintesis de

trtRNA, tal que las moléculas de tRNA libres ( es decir, no li- gadas a ribosomas ) actuarian como factores represores de su propia sintesis.

Estos datos son plenamente acordes con nuestros propios re­sultados, por cuanto las drogas aqui empleadas ( CHM y ANS ) son inhibidores de la sintesis de proteinas en la fase de elon­gaciôn. Adicionalmente, la hipôtesis formulada de un mecanis­mo especifico de regulaciôn para el tRNA puede resultar muy sugerente para explicar por qué la fracciôn dë pequeno tama­ho ( 4-5S ) résulta siempre diferencialmente activada respec­te al resto de los componentes del perfil de RNA.

178

2.2.2. nucleol^ar.El comportamiento seguido por el RNA de origen nucleolar

es el de mâs difîcil discusiôn. Y ello:+) Por nuestros propios resultados, que muestran una res­

puesta antagônica del pre-rRNA 3 8S, segûn la inhibiciôn de la sintesis de proteinas ocurra bajo condiciones:

- " in vivo ": se produce depresiôn- " in vitro ": se produce activaciôn.

+) Por la disparidad de los mecanismos propuestos para explicar el comportamiento de esta fracciôn del RNA.

a.- Efecto_"_in yiv^o_"_de ]^a_CHM^Nuestros resultados, mostrando que la aplicaciôn " in vi*

vo " de CHM, a dosis fuertemente inhibitorias de la sintesis de proteinas, deprimen pronta y selectivamente la sintesis del pre-rRNA 38S, son plenamente acordes con las observaciones realizadas en otros sistemas biolôgicos, acerca de la acciôn inhibitoria selectiva o preferencial de dicha droga sobre la actividad RNA polimerasa nucleolar ( p.e., Fiala y Davis, 1965;' Viau y Davis, 197 0, en Neurospora; Timberlake et al., 197 2a, en Achyla; Delseny et al., 1977, en plântulas de râbano; Mu- ramatsu et al., 1970; Fakan, 1971; Schmid y Sekeris, 1973;Grummt et al., 197 6, en diversos tipos celulares de mamiferos ).

1) Para explicar esta inhibiciôn selectiva, la mayoria de los autores postulan que en la transcripciôn de los genes nu- cleolares estâ implicada la acciôn de una o mâs proteinas de

179

vida muy corta, tal que su concentraciôn en la célula dismi- nuiria râpidamente al ser inhibida la sintesis de proteinas por aplicaciôn de CHM ( Summers et al., 1966; Franze-Fernân- dez y Fontanive-Sanguesa, 1973; Cereghini y Franze-FernSndez, 1974; Lampert y Feigelson, 1974 ) o cualquier otro tratamien­to adecuado ( p.e., puromicina: Chesterton et al., 1975; dieta déficiente: Wannemacher et al., 1971 ). Respecte al papel de dichas proteinas lâbiles:

+) Podria tratarse de componentes estructurales de la RNA polimerasa misma ( Yu y Feigelson, 1972 ). Esto no pare­ce probable, dado que:

- Mediciones directes sobre la estabilidad del enzima parecen indicar que su concentraciôn no es afectada tras va­rias horas de tratamiénto con CHM ( Benecke et al., 1973;Schmid y Sekeris, 1973; Cereghini y Franze-Fernândez, 1974 ).

- Nuestros mismos resultados muestran que 1 hora de tra­tamiento con la droga produce una inhibiciôn de la sintesis de pre-rRNA sensiblemente igual a un tratamiento largo ( 6 horas ) Aunque desconocemos la vida media de la RNA polimerasa nucleo­lar en Chironomus, habria entonces que admitir que es desusa- damente corta.

+) La hipôtesis alternative, que es la normalmente admiti- da, postula entonces que dichas proteinas lâbiles son distin­tas a la RNA polimerasa misma, y actuan como moduladores posi- tivos ( factores activadores ) del funcionamiento del enzima.

180

A este respecte, los estudios mâs actuates, realizados median­te técnicas de experimentacién in vitro, parecen indicar que el control de la actividad RNA polimerasa se ejerce a nivel de la " iniciaciôn " ( Chesterton et al., 1975; Grummt y Grummt, 197 6 ), posiblemente regulando la disponibilidad de la croma- tina para su uniôn con el enzima ( Onhisi et al., 1977 ).

2) En todo caso, la hipôtesis formulada se apoya sobre dos principles:

- Que la regulaciôn ocurre primarlamente a nivel de la propia actividad RNA polimerasa.

- Que el efecto de la CHM tiene lugar sôlo a travês de la inhibiciôn de la sintesis de proteinas.

Existen sin embargo resultados que han apoyado la formula- ciôn de teorias alternatives.

+) Se ha observado en ocasiones que la CHM parece inhibir adicionalmente el proceso de maduraciôn del precursor ribosô- mico inicial ( Willems et al., 1969; Craig y Perry, 1970, en células de mamiferos; Viau y Davis, 1970, en Neurospora ), asi como la exportaciôn al citoplasma de las moléculas de rRNA ( Fakan, 1971, en células de mamîferos; Eckert y Franke, 1975, en Tiphimûrium; Lonn y Edstrom, 1977, en Chironomus ). Willems et al.( 1969 ), y Craig y Perry ( 1970 ) han propuesto la hipô­tesis de un posible control postranscripcional, segûn lo cual el fenômeno primariamente controlado séria la maduraciôn 'del pre-rRNA inicial. Cuando esta es inhibida, la acumulaciôn résultante de pre-rRNA en el nucleolo daria lugar, sôlo secun-

181

dariamente,a la inhibiciôn de la transcripciôn de los genes nu- cleolares.

+) Otros resultados parecen apoyar la idea de que la inhi­biciôn especîfica de la transcripciôn de los genes nucleares pudiera ser debida, al menos en parte, a un efecto directo, tôxico, de la CHM sobre la RNA polimerasa nucleolar. Asî, ob­servaciones basadas en el empleo de dicha droga a distintas concentraciones ( Rizzo y Webb, 1969; Farber y Farmer, 1973; Delseny et al., 1977 ), o en la comparaciôn de su efecto con el producido por otros inhibidores { Timberlake y Griffin,1974 a ,b ), parecen indicar que el efecto selectivo observado de la CHM ha de ejercerse por otro mecanismo distinto a la inhibiciôn de la sintesis de proteinas. Los datos mâs direc- tos han sido aportados por anâlisis in vitro de la actividad RNA polimerasa. En efecto, la actividad de la RNA polimerasa I ( nucleolar ), convenientemente aislada y purificada, parece resultar especificamente inhibida al ser ensayada in vitro en presencia de CHM, sin que la droga parezca afectar, en cambio, a la actividad de las RNA polimerasas II y III ( nucleoplâsmi- cas ), segûn los resultados de Horgen y Griffin, 1971, en Blas- tocladiella; Timberlake et al., 1972 a,b, en Achyla e hîgado de rata; y Rudic y Weisman, 1973, en Acentamoeba. Ello ha lleva­do a Timberlake y col. a postular que la CHM tiene un efecto directo, " per se ", sobre la RNA polimerasa nucleolar. El pro­blema, sin embargo, permanece sumamente oscuro, dado que si-

18

guiendo las mismas técnicas expérimentales, otros autores han concluido que ni la actividad RNA polimerasa total ( Sum­mers et al., 1966, en nûcleos de células HeLa; Eckert y Fran­ke, 1975, en Tetrahymena ) ni, en particular, la actividad RNA polimerasa nucleolar ( Yu,y Feigelson, 1972; Higashinaka- gawa y Muramatsu, 1972, en células hepâticas; Gross y Pogo, 1974, en levaduras ), son, " per se ", afectadas por la droga,

Respecto a nuestros propios resultados, parece difîcil ad­mitir que la inhibiciôn especîfica de la sintesis de pre-rRNA, observada por aplicaciôn " in vivo " de CHM, pueda deberse fundamentalmente a un efecto tôxico, directo, de la drogasobre la actividad RNA polimerasa, pues habria que explicar por qué dicha toxicidad no se manifiesta cuando la CHM es apli-cada directamente sobre el sistema celular aislado ( i.e.," in vitro " ). Esto parece mâs bien indicarnos que el efecto ha de ser mediado por la sintesis de proteinas. En todo caso, una investigaciôn mâs a fondo de este fenômeno requeriria comparer el efecto observado con los obtenidos por inhibiciôn " in vivo " de la sintesis de proteinas mediante otros procedi- mientos. Nuestos intentos de utilizer la ANS bajo estas condi­ciones han tropezado, hasta el momento, con ciertas dificulta- des metodolôgicas.

183

b .- Efecto " in vitro " de la CHM y ANS.A la luz de lo expuesto, résulta de difîcil interpretaciôn

el incremento observado en la sintesis de pre-rRNA bajo condi­ciones de inhibiciôn " in vitro " de la sintesis de proteinas. Ello parece implicar la puesta en funcionamiento de distintos mecanismos de regulaciôn, segûn las glândulas se encuentren en su p r o p i o entorno larvario, o bien incubadas en un medio ar­tificial .

Existen no obstante resultados congruentes con nuestros datos , en otros organismos biolôgicos. Asî, la sintesis de RNA ribosomal puede resultar incrementada al inhibir la sinte­sis de proteinas mediante una dieta déficiente ( Stenram, 1958 y 1972; Bailey et al., 1976 ), o por aplicaciôn de CHM y ANS en hîgado de rata no regenerante ( Rizzo y Webb, 1969 ). El fenômeno es observado mâs frecuentemente cuando un inhibidor de la sintesis de proteinas es aplicado en células que se en- cuentran previamente en bajo estado metabôlico. P.e., en pro­cariotes, por adiciôn de cloranfenicol en cultives bacteria-, nos en fase estacionaria ( Fraenkel y Neidhart, 1961 ) o cre- ciendo en medio mÎTiimo ( Kurland y Maloe, 1962 ) ; en células eucariôticas cultivadas en un medio déficiente, por aplicaciôn de CHM y ANS ( Smulson y Thomas, 1969; Smulson, 1970, en célu­las HeLa ), o de bajas dosis de CHM ( Pogo y Zbrezezna, 1978, en células de tumor ascîtico ).

184

Una ulterior especulaciôn sobre este fenômeno, tal como aparece en nuestro sistema biolôgico, serâ ofrecida mâs adelante.

En suma, y como finalizaciôn de este apartado, hemos de hacer dos consideraciones:

+) El comportamiento diferencial de las distintas espe­cies de RNA parece indicar que existen distintos mecanismos de regulaciôn para los diferentes RNAs.

+) La activaciôn neta que fue detectada a nivel del RNA total es el resultado de un balance cuantitativo de lo ocu- rrente para las diferentes especies de RNA.

185

2.3. En torno a un modelo de regulaciôn de la transcripciôn.La idea mâs comunmente admitida es que la regulaciôn de

la sintesis de RNA en organismos eucariôticos se realiza por un mecanismo de control positivo. A partir de un estado de re- presiôn inespecifico del genoma, la expresiôn particular de ciertos genes séria promovida por efectores capaces de pro- ducir una desrepresiôn en regiones especificas del genoma, haciéndolas accesibles a su lectura por las RNA polimerasas.Un modelo ya clâsido dentro de esta lînea es el elaborado por Britten y Davidson ( 1969 ), y Davidson y Britten ( 1971 y 1973 ). Sin embargo, evidencias expérimentales obtenidas mâs recientemente parecen indicar que la realidad es bastante mâs compleja.

La finalidad que se persigue en este a p a r t a d o es intentar una interpretaciôn de nuestros resultados en un contexte teô- rico mâs amplio, buscando su posible conexiôn con modèles recientes tocantes a la regulaciôn de la transcripciôn en organismos eucariôticos.

El fenômeno fundamental a explicar es el desacoplamientoobservado entre las actividades de transcripciôny sintesis de proteinas, por aplicaciôn de inhibidores especificos. Esto nos conecta con el mecanismo de " control estricto ", y su funcionamiento en organismos eucariôticos.

2.3.1. Restricciôn y relajaciôn. Modelo de__Gro£s_y Pogo.Se ha definido el " control estricto " como un proceso ge-

186

néticamente controlado, observado inicialmente en organismos procariôticos, por el cual su metabolismo general se adapta a cambios de nutrientes en el medio de cultive ( Edlin y Bro­da, 1968 ). Asi, una privaciôn de aminoâcidos en el medio de cultive inhibe la sintesis de proteinas coordinadamente con otros procesos metabôlicos, entre elles la sintesis de RNA.Se habla entonces de un estado de " restricciôn ". En estas condiciones, la aplicaciôn de ciertos inhibidores de la sin­tesis de proteinas, como el cloranfenicol, puede producir un desacoplamiento entre dichas actividades - i.e., una reac­tivaciôn de la sintesis de RNA, continuando en cambio la de­presiôn de la sintesis de proteinas -. Se habla entonces de un fenômeno de " relajaciôn ". ( Como revisiôn del problemade control estricto, y los mécanismes de control implicados, puede verse Goldberger et al., 1976 ).

Posteriormente se ha observado que el control estricto, o un sistema de regulaciôn équivalente, parece también existir en organismos eucariôticos. Asi, a lo largo de esta Discusiôn hemos citado resultados que mostraban que una dieta o medio de cultivo déficiente en nutrientes esenciales podia originar una inhibiciôn coordinada en la sintesis de proteinas y RNA ( i.e., équivalente a la " restricciôn " ), y que la adiciôn en taies condiciones de CHM o, eventualmente, ANS, podia dar lugar a una reactivaciôn ( i.e., équivalente a la " relaja­ciôn " ) de la sintesis de RNA ( Smulson y Thomas, 1969; Smul-

187

son, 1970; Hershko et al., 1971, en células de mamîferos;Foury y Goffeau, 1973; Gross y Pogo, 1974, en levaduras ),

En este contexte. Gross y Pogo ( 1974, 1976 a,b ) han concluido, tras un complejo proceso experimental, en la ela- boraciôn de un modelo de regulaciôn de la transcripciôn en organismes eucariôticos que, por su interés para la inter- pretaciôn de nuestros resultados, reproducimos aqui simpli- ficadamente ( véase esquema 3 ). Este modelo se basa en el juego conjunto de dos factores o grupos de factores de ac- ci6n antagdnica sobre la actividàd RNA polimerasa, presumi- blemente controlando la accesibilidad al DNA. A saber;

+) Factores moduladores positives ( A ), polipéptidos de vida corta, que activarîan la uniôn RNA polimerasa - DNA.

+) Factores moduladores negatives ( R ), que reprimirian dicha uniôn, bien sea por si mismos o bien activando la for­ma inactiva de un represor. Su sintesis o actividad estâ con- trolada por les genes de restricciôn.

La privaciôn en la dieta de algûn aminoâcido esencial, u otro tratamiento équivalente, daria lugar, al ser inhibida la sintesis de proteinas, a una râpida disminuciôn de la con- centraciôn en la cêlula de les factores activadores ( A ). Paralelamente, mediado por el funcionamiento de les genes de restricciôn, se induciria la sintesis o activaciôn de los fac­tores represores ( R ). Ambos efectos redundarian en la res- tricciôn de la uniôn RNA polimerasas - DNA, y consiguientemen-

138

Control estricto ( o équivalente )

InhibeFactor ( activador

Estimula

( represor ) .FactorRNApolim Inhibe

\ ( activa )inhibe ) Represor

- inactivoRepresoractivo

DNA

• H• H

H

CHMo tratamiento

équivalente

E S Q U E M A 3

189

te una menor sintesis de RNA .En estas condiciones, la administracidn de CHM u otro

inhibidor o tratamiento équivalente, podria dar lugar a una sintesis o actividad de los factores represores ( R ), lo que se plasmaria en una recuparaciôn parcial de la sintesis de RNA ( i.e., relajaciôn ).

Mâs recientemente, Pogo y Zbrezezna ( 1978 ) han confir- mado la aparente validez de este esquema para el caso particu­lar de la regulaciôn de la actividad RNA polimerasa nucleolar, en cêlulas de tumor ascitico.2.3.2. P^o£iyes_mecan_ismos^ de__controljde l,a_6xpre£i6njgén^ica en células politenizadas.

El modelo expuesto podria ilustrar en buena medida los meca- nismos responsables de la regulaciôn de la transcripciôn en células politenizadas.

a . - Factore^s_impycado£ en__la regu_laciôn^ a.l.- Factores represores.Nuestros datos mostraban que :+) La CHM y ANS, a dosis fuertemente inhibitorias de la

sintesis de proteinas, inducen un râpido incremento en la sin­tesis de RNA. Esto ténia su correlate, a nivel morfolôgico, en la desrepresiôn del BR2 por efecto de las drogas.

+) Dicho incremento era debido, al menos en parte, a una mayor tasa de " iniciaciôn " en el sistema de transcripciôn.

Una explicaciôn de estes hechos podria ser ofrecida por las

190

siguientes hipôtesis:En células politenizadas de Chironomus existe un con­

trol negative de la transcripciôn.Es ejercido por factores moduladores negatives con

especificidad local de acciôn.- Provocan la restricciôn de la uniôn de las RNA polime­

rasas a ciertas regiones del DNA.Algunas secuencias del DNA estarian " naturalmente " re-

primidas ( es decir, genes no expresados bajo condiciones ambientales normales ), en tante otras lo serian sôlo por de- terminados tratamientos ( p.e., un cambio de nutrientes ).La adiciôn de CHM o ANS lograria romper el estado de represiôn, al inhibir la sintesis o actividad de los factores represores.

c. Cuâl podria ser la naturaleza de dichos factores ?+) La hipôtesis mâs inmediata podria radicar en que se

tratase de polipéptidos de muy cotta vida, cuya concentraciôn en la cêlula decaeria râpidamente al ser inhibida la sintesis de proteinas.

+) Otra posibilidad alternativa, que nos acercaria mâs a lo formulado por Gross y Pogo, séria el que las drogas ac- tuaran inhibiendo la actividad de los factores represores, o alguna reacciôn responsable de su activaciôn. Esto no exigi- ria su naturaleza proteica.

En ests aspecto, se ha especulado con un posible papel de control llevado a cabo por nucleôtidos taies como el

191

ppGpp o ppGppp, cuyo papel como moduladores negatives de la transcripciôn en procariotes parece probado ( Hershko et al., 1971; Goldberger et al., 1976 ). Sin embargo, los re­sultados para probar esta posibilidad en células eucariôti- cas han dado, hasta el momento, resultados negatives ( Smul- son, 1970; Mamont et al., 1972; Buckel y Bock, 1973; Alber- ghina et al., 1973; Gross y Pogo, 1976b ).

a.2.- Factores activadores.+) Nuestros resultados han mostrado que la CHM, bajo con­

diciones de aplicaciôn " in vivo ", deprime selectivamente la actividad RNA polimerasa nucleolar. Sin. excluir un posi­ble efecto tôxico adicional de la droga, esta depresiôn es normalmente atribuida a la inhibiciôn de la sintesis de pro­teinas .

+) Desde un punto de vista morfolôgico hay que notar que, segün observaciones realizadas en nuestro laboratorio, la CHM y ANS, ademâs de posibilitar una desrepresiôn especifica de ciertos loci, inducen el colapsamiento de otros puffs, lo que supone la represiôn de la expresiôn gênica en algunos i loci extranucleolares.( Villanueva, 1978 ).

Estes datos podrian indicar la existencia de un control positive de la transcripciôn, no sôlo a nivel de los genes nucleolares, sine de todo el genoraa. Si dicho control es ejer­cido por factores proteicos de gran labilidad, la inhibiciôn de la transcripciôn de ciertos genes por la CHM o la ANS po-

192

drîa explicarse por un descenso en la cêlula de la concentra­ciôn de dichos factores, al ser inhibida la sintesis de pro­teinas.

a .3.- Re^umen.Por todo ello, parece admisible la hipôtesis de que la ac­

tividad de transcripciôn es el resultado de un equilibrio cir- cunstancial de factores moduladores positives y negatives. Di­cho equilibrio - y, por ello, la tasa de transcripciôn - séria especifico para cada gen o grupo particular de genes.

Esto viene apoyado por el hecho de que un mismo tratamien­to - p.e., adiciôn de hormonas, variaciones en los nutrientes del medio, en la concentraciôn salina, alteraciones têrmicas - pueda producir cambios simultâneos opuestos en la expresiôn de distintos puffs en el genoma ( véase, p.e., Ashburner, 1970 )

b . - Niyel^e£ de_regulaci^ôn.Se trata ahora de saber a qué niveles puede ejercerse el

control de la transcripciôn en células politenizadas.Si la medida de la tasa de transcripciôn de un gen viene

dada por el nûmero de copias de RNA del mismo producidas por unidad de tiempo, entonces su regulaciôn cuantitativa puede ocurrir:

+) En un primer nivel, modulando la tasa de lectura de di­cho gen, en cada cromatidio,por las RNA polimerasas. Este mo­do de regulaciôn es comûn para toda célula.

+) En un segundo nivel, variando el nûmero de cromatidios

193

en los que dicho gen estâ siendo actualmente transcrite. Re- cordemos a este efecto { Introducciôn, 1.3. ), que el nûmero de cromômeros que participan activamente en un puff puede va­rier. Este modo de regulaciôn sôlo puede darse en células donde existe una multiplicidad de copias del mismo cromatidio; células poliploides y politenizadas.

2.3.3. Sobre la activaciôn del RNA nucleolar.Como se indicé anteriormente en esta Discusiôn ( 2.2.2.a ),

aunque la activaciôn observada en la sintesis de pre-RNA por aplicaciôn " in vitro " de CHM y ANS en glândulas salivales contradice la idea comunmente admitida sobre la inhibiciôn preferencial del RNA nucleolar, existen resultados mostrando que la actividad RNA polimerasa nucleolar puede resultar in- crementada al aplicar inhibidores de la sintesis de proteinas en células en bajo estado metabôlico por carencia en el medio de cultivo de algûn nutriente esencial ( es decir, en estado de restricciôn ). Se trataria, en estos casos, de un fenômeno de " relajaciôn ".

La consideraciôn del " control estricto " puede sugerir- nos, a nivel muy especulativo, una explicaciôn de nuestros resultados. En efecto, observaciones realizadas en nuestro la­boratorio han mostrado que:

+) La simple extracciôn y mantenimiento " in vitro " de las glândulas salivales parece afectar de modo especial a las estructuras nucleolares, mostrando un alto nûmero de nucleo-

194

los segregados , y " droplets " en su interior.■f) La tasa de captaciôn e incorporaciôn de uridina se

ve muy disminuida por el sôlo hecho de preincubar las glân­dulas " in vitro " durante 1 - 3 horas.

A la luz de estas observaciones podria postularse que la extracciôn y matenimiento " in vitro " de las glândulas, por si sola, tuviera un efecto de algûn modo semejante al de la " restricciôn " genéticamente controlada, en lo refe- rente a un incremento en la actividad de los factores repre­sores que controlan la transcripciôn de los genes nucleola- res. Si en estas condiciones, conforme a la hipôtesis de Gross y Pogo, la CHM (y, en este caso, también la ANS ) inhibieran la sintesis o actividad de dichos factores, ello podria explicar el incremento de la actividad RNA polimerasa nucleolar respecto a los contrôles no tratados con las drogas

195

gQNgLUilQNiiDe los resultados obtenidos a lo largo del trabajo reali-

zado para esta Tesis, podemos destacar las siguientes conclu- siones principales:

+) Se ha elaborado un método que permite estimar satis- factoriamente la tasa de captaciôn de uridina-H^, medida co­mo radiactividad acido-soluble, en células de glândulas sali­vales de Chironomus. Este método, que supone una innovaciôn en este sistema biolôgico, podrâ ser eventualmente aplicable a la estimaciôn de la actividad de captaciôn de otros meta- bolitos.

+) La tasa de captaciôn de uridina se ve diferencialmente modificada por aplicaciôn " in vitro " de distintos inhibido­res.

+) La discrepancia observada entre el tamaho de puffing y la incorporaciôn de uridina-H^ en el anillo de Balbiani 2, por aplicaciôn de un choque têrmico, puede ser satisfactoria­mente explicada como debida a cambios en la tasa de captaciôn del precursor, por efecto del tratamiento.

+) La medida relativa de la actividad de transcripciôn, a partir de la incorporaciôn en RNA de un precursor marcado, requiere el conocimiento de los posibles cambios en la tasa de captaciôn de dicho precursor, que permita eventualmente la aplicaciôn de factores correctores.

196

+) La inhibiciôn de la sintesis de proteinas, por apli­caciôn de cicloheximida y anisomicina, induce un incremento en la sintesis de RNA total glandular.

+) Dicho incremento responde, al menos en parte, a una mayor actividad de " iniciaciôn " en el mécanisme de trans­cripciôn.

+) Existe una respuesta diferente de las distintas espe- cies de RNA reciên sintetizado a la inhibiciôn de la sinte­sis de proteinas, tal que:

- Es mâximamente incrementada la sintesis de RNA de bajo peso molecular ( 4-5S ).

- En menor medida, es también incrementada la sinte­sis de hnRNA.

- La sintesis de RNA nucleolar es la menos afectada, y, bajo ciertas condiciones, selectivamente deprimida.

+) Todos estos datos, junto con otras evidencias morfo- lôgicas aducidas, sugieren la existencia de distintos meca- nismos de regulaciôn de la transcripciôn en células polite­nizadas, dotados de alta especificidad local de acciôn.

B I B L I O G R A F I A

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