Étapes …Étapes …

Exposition

Toxico-cinétique

Toxico-dynamique

Cycle Cycle cellulaire/cellulaire/

GénotoxicitGénotoxicitéé

Atteintes à Atteintes à la la

membranemembrane

Stress oxydantStress oxydant

EpigénétiquEpigénétiquee

MétabolisatiMétabolisationon

Santé Santé mitochondrialmitochondrial

ee

Apoptose / Apoptose / NécroseNécrose

CytosqueletCytosquelettestes

ProliférationProlifération

Mécanismes de cytotoxicitéMécanismes de cytotoxicité

Signalisation Signalisation CellulaireCellulaire

Étude de la GénotoxicitéÉtude de la Génotoxicité

Developed by Bruce Ames and his colleagues in the 1970s.

Tests the mutagenicity of different compounds Is used by FDA to test many chemical rapidly and

inexpensively Uses special bacteria that are very sensitive to many

mutagenic agents

Test de Mutagenèse : Test Ames (1)Test de Mutagenèse : Test Ames (1)

Characteristics of mutants strains of S.typhimurium used for Ames Test

cannot synthesize histidine.

are very susceptible to additional mutations because they lack the normal repair mechanisms found in bacteria.

more permeable than wild-type bacteria to external chemicals, including potential mutagens.

Different mutant strains of S.typhimurium with different mutations in their DNA

TA 1535 has a base substitution that produces a missense mutation in the gene coding for the first enzyme of histidine synthesis. The mutant enzyme has a proline where a leucine is in the wild-type enzyme.

TA 100 is very similar to 1535, but is also supposed to detect a different range of mutagens.

TA 1537 has a frameshift mutation (deletion of one nucleotide) in a different gene than is mutated in 1535.

TA 1538 has a different frameshift mutation (insertion of one nucleotide) in the same gene that is mutated in TA 1537.

TA 98 is similar to 1538 but is supposed to detect more mutagens than 1538 does. TA 102 is significantly different from the others. It has an ochre mutation which

means that it has a nonsense mutation. This mutation occurs in the same gene as is mutated in the strain TA 1535.

Test de Mutagenèse : Test Ames (2)Test de Mutagenèse : Test Ames (2)

Mise en évidence de la fragmentation de Mise en évidence de la fragmentation de l’ADN sur gel d’agarosel’ADN sur gel d’agarose

• Fragments chromosomiques ou isolement de chromosomes entiers

• Migration anormale pendant la mitose

• Pas d’incorporation dans les noyaux des cellules filles

• Condensation + Membrane Micronoyaux

Visualisation par coloration spécifique et appréciation de leur taux comparé au taux de base

Substance génotoxique ADN

Induction de micro-noyauxInduction de micro-noyaux

Induction de micro-noyauxInduction de micro-noyaux

Induction de micro-noyauxInduction de micro-noyaux

Induction de micro-noyauxInduction de micro-noyaux

0

40

80

120

160

200

Solvant 5 µM 10 µM 20 µM Col

CB

NM

NZen+Vit E Zen

Vit E prévient la production de micronoyaux

Prévention partielle quelle que soit la concentration en Zen

Fusions centriques Cassures

Test d’Aberrations ChromosomiquesTest d’Aberrations Chromosomiques

Anneaux Lacunes (Gap)

0

5

10

15

20

25

30

35

control 10µM 20µM 40µM

% d

es a

berr

ations c

hro

mosom

iques

Zen

Zen + Vit E

Induction d’aberrations chromosomiquesInduction d’aberrations chromosomiques

Mutation Research, 365, 139-149. (2005)Mutation Research, 365, 139-149. (2005)

Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) :

Technique d’électrophorèse qui permet la

détection de cassures de l’ADN (différents types

de dommages) sur des cellules individualisées

Test de Comète Test de Comète (SCGE)(SCGE)Test de Comète Test de Comète (SCGE)(SCGE)

Préparartion des lames : Inclusion des cellules dans de l’agarose sur lames de microscope

Lyse: Triton X-100, 2.5 M NaCl

Nucleide; ADN compact

Déroulement de l’ADN : pH alcalin

Electrophorèse: pH> 13

Neutralisation

Coloration de l’ADN

Microscopie à Fluorescence

Analyse (100 comètes)

% ADN dans la queue est liée à la fréquence des cassures

Cellule individualisée

La Comète

Nucleoid; ADN relaché

Les boucles d’ADN cassé migrent vers l’anode formant la queue de la comète

Noyau non endommagé Noyau légèrement endommagé

Noyau endommagé Noyau fortement endommagé

Longueur

Analayse d’image par ordinateur

% ADN dans la queue(% ADN migrant)

Moment(ADN migrant x Longueur)

Classe 0

Classe 4Classe 3

Classe 1 Classe 2

W. Hassen & H. Bacha / 2ème Colloque Euro-Méditerranéen 13-16

Nov. 2006

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Control 5 µM 25 µM 50 µM 75 µM 100 µM

ZEN concentrations (µM)

Buffer

FPG

EndoIII

DN

A d

am

ag

e (

Arb

itra

ry u

nit

s s

core

)