Mme Danièle Sandret et Pr JC Sabourin

Etat de l’art en anatomopathologie : où en est-on en 2013 de l’automatisation ?

L’anatomie et la cytologie pathologiques

• L'Anatomie Pathologique est une spécialité médicale clinique et biologique.

• C'est la partie de la médecine qui étudie les altérations morphologiques de l'organisme au cours des maladies.

• Médecin Anatomo-cyto-pathologiste ou pathologiste.

L’Anatomie Pathologique• Quels sont les types de prélèvements

traités?

– Pièces opératoires (tous les organes)– Biopsies– Liquides de ponction, d‘épanchements….– Urines, sécrétions– Sang (CTC)

L’Anatomie Pathologique

• Les grandes étapes techniques et médicales- Fixation- Prélèvements- Déshydratation, imprégnation en paraffine- Inclusion en paraffine- Coupes tissulaires et colorations- Interprétation médicale- Compte-rendu d’histo-cytopathologie- Conservation et archivage- Destruction des pièces anatomiques

AVANT ET MAINTENANTL’ACP : une discipline en mutation

L’enregistrement

Avant Aujourd’hui

Réception du prélèvement :Enregistrement dans le SIL du laboratoire de pathologie

INFORMATISATION +++

Fixation des tissus- But : immobiliser les constituants cellulaires et tissulaires

dans un état aussi voisin que possible de l’état vivant- Sinon : autolyse (idem post-mortem), destruction des

tissus par les enzymes qu’ils contiennent, de début très rapide

- Le plus souvent assurée par le médecin préleveur, sauf hôpitaux, pièces opératoires, extempo, et cas particuliers...

- Règles impératives- Aussi précoce que possible- Pas de fixateur parfait- Volume de fixateur plusieurs fois supérieur à celui du prélèvement

- Le plus souvent par immersion, plus rarement par perfusion

- Cas particulier de la cytologie pathologique (air, chauffage, laque, acétone...)

Principal fixateur utilisé- Formol 10% (H-CHO)

- Solution aqueuse ou tamponnée (phosphate pH7), de formol du commerce à 37% dilué au 1/10ème

- Prêt à l’emploi +++- Avantages :

- Bonne pénétration- Peu de rétraction et de durcissement des tissus- Conservation longue possible- Incolore, odoriférant- Faible prix de revient- Peu de masquage antigénique

- Inconvénients- Morphologie moyenne- Toxique, inflammable pur- Peut précipiter (pigments formoliques)

- Modalités d’utilisation- Délai prélèvement fixation < 30 min- Durée de fixation environ 24H (qq heures à + 48H)- Prélèvements en tranches fines

Le tissue Processing

Milieu aqueuxMilieu

liposoluble

Prélèvement en milieu aqueux

Déshydratation tissu par alcools

Milieu soluble dans l’alcoolXylène

paraffine : enrobage, inclusion, coupe

conservation illimitée blocs

Réhydratation coupe par alcools

Coloration aqueuse (ou alcoolique)

Déshydratation des coupes par alcools

Formol 10% (H-CHO)

méthanal ou formaldéhyde ou aldéhyde formique ou formol

La fixation

Avant

• À l’ancienne

Aujourd’hui

Aujourd’hui : Sécurité du personnel ++++

La macroscopie

Avant Aujourd’hui

La macroscopie

Avant Aujourd’hui

LE BLOC DE PARAFFINEL’ACP : une discipline en mutation

Le bloc de paraffine

Avant Aujourd’hui

Les barres de Leuckart

La macroscopie aujourd’hui : lames à usage uniquegants adaptés, gants anti-coupures, blouses…

L’imprégnation en paraffine

Avant Aujourd’hui

L’inclusion en paraffine

Avant Aujourd’hui

L’inclusion en paraffine

Avant Aujourd’hui

L’autoTech

La coupe

Avant Aujourd’hui

La coupe

Avant Aujourd’hui

Reste très manuelle +++

Le rasoir

Avant Aujourd’hui

Usage unique +++Affutage...

La coupe

Avant Aujourd’hui

C’est toujours la même chose...

Coloration

Milieu aqueuxMilieu

liposoluble

Prélèvement en milieu aqueux

Déshydratation tissu par alcools

Milieu soluble dans l’alcoolXylène

Milieu liposoluble

paraffine : enrobage, inclusion, coupe

conservation illimitée blocs

Réhydratation coupe par alcools

Coloration aqueuse (ou alcoolique)

Déshydratation des coupes par alcools

La coloration

Avant Aujourd’hui

La coloration

Avant Aujourd’hui

Le montage des lames

Avant

• À la main avec le milieu de montage

Aujourd’hui

Colorations histologiques

- Déparaffinage indispensable. Aucune coloration ne peut être faite sur coupes contenant de la paraffine

- Nombreux colorants, choisis en fonction de leur capacité à colorer divers composants cellulaires et tissulaires

- Coloration de routine : HES ou HPS, automatisables- Noyau : Hématoxyline (produit d’oxydation de l’hématéine)

- Colorant basique, forte affinité pour acides nucléiques du noyau- Cytoplasme : Eosine

- Colorant acide, d’usage facile- +/- tissu conjonctif : safran

La lecture

Avant Aujourd’hui

Microscope semi automatique

Le compte rendu

Avant Aujourd’hui

La révolution « Immunohistochimie »

Avant Aujourd’hui

Avant Aujourd’hui

Colorations manuelles par paniers de 10 ou 20 lames lames Automate +++

La révolution « Immunohistochimie »

Hier

Les premiers « robots »

La révolution « Immunohistochimie »

Aujourd’hui

La révolution « Immunohistochimie »

Avant Aujourd’hui

Les kits +++

La révolution « Immunohistochimie »

Avant

• Moins de traçabilité

Aujourd’hui

Code à Barres

La révolution « Immunohistochimie »

CK7

CK7

ACE

CK20

L’image en ACP

Avant Aujourd’hui

Images numériques

L’image en ACP

Avant Aujourd’hui

Images numériques

L’image en ACP

Avant Aujourd’hui

Les lames virtuelles

Lames virtuelles

Analyse d’images

Lame virtuelle

ET DEMAIN ?L’ACP en marche vers l’avenir

Evolution des techniques :quel impact pour la pratique clinique quotidienne ?

Le séquençage de nouvelle génération NGS

c

La révolution technologiqueLe séquençage de nouvelle génération

(NGS) :

� séquençage massif, en parallèlede millions de fragments d’ADN.

Préparation d’une banque d’ADN :

11

22La capture permet la « sélection » et l’enrichissement des cibles à séquencer

33� Amplification sur lame

de verre

� Hybridation de chaque fragment d’ADN

� PCR en pont

� Ainsi, chaque fragment va former un cluster de 1000 molécules

� Clivage des brins anti-sens pour séquençage

44

� Séquençage massif, en parallèle, utilisant des terminateurs réversibles couplés à un fluorochrome spécifique de chaque base

Les images utilisées

proviennent

de la société Illumina®.

NEXT GENERATION SEQUENCING

Permet le séquençage de grandes régions dugénome, de plusieurs 100 de gènes (voire de 1000de gènes), de l’exome et même du génomecomplet d’une tumeur dans un seul tempsréactionnel !

Permet un saut d’ échelle

NEXT GENERATION SEQUENCING

Permet le séquençage de grandes régions dugénome, de plusieurs 100 de gènes (voire de 1000de gènes), de l’exome et même du génomecomplet d’une tumeur dans un seul tempsréactionnel !

Permet un saut d’ échelle

NGS : le tissu

Tissu tumoral :

� FFPE +++ : ADN suffisamment préservé

� Accessibilité des archives +++

� Complémentaire de l’histologie

� Autorise une bonne pré-analytique

� Aujourd’hui environ de 1200 €/patient pour un exome

� Mais décroissance rapide +++

NGS : le coût

Sequencers 454 GS FLX HiSeq 2000 SOLiDv4 3730xl

Instrument price Instrument $500 000,$7 000 per run

Instrument $690 000,$6 000/ (30x) human

genome

Instrument $495 000,$15 000/100 Gb

Instrument $95 000,about $4

per 800 bp reaction

CPU 2* Intel Xeon X5675 2* Intel Xeon X5560 8* processor 2.0 GHz Pentium IV 3.0 GHz

Memory 48 GB 48 GB 16 GB 1 GB

Hard disk 1.1 TB 3 TB 10 TB 280 GB

Automation in library preparation Yes Yes Yes No

Other required device REM e system cBot system EZ beads system No

Cost/million bases $10 $0.07 $0.13 $2 400

Jeffrey S. Ross & Maureen Cronin, Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012; doi:10.1155/2012/251364

NGS : durée de l’analyse

Compatible avec une pratique clinique

Avantages du NGS Comparison of Sanger and NGS for the Cancer Cell Genome

Parameter Traditional NGS Advantage

Costper baseper Single clinical « test » ($)per 10-gene multiplex multigene test ($)Equipment

HighLow to moderate, 300-500

High, 3 000-5 000Moderate

LowModerate to high, 800-2 000 (estimated)

Moderate, 800-2 000High

NGSTraditional

NGSTraditional

Expertise required for sequencing and data analysis Moderate High Traditional

Can be performed using FFPE samples Yes Yes _

Challenged by small samples, necrotic tumor, tumor heterogeneity and low percentage of tumor sample DNA Yes Yes _

Generally restricted to 1 gene at 1 time Yes No NGS

Can easily sequence hundreds of cancer-relatedgenes in 1 sample No Yes NGS

Generally restricted to hot-spot analysis Yes No NGS

Can detect deletions No Yes NGS

Can detect translocations No Yes NGS

Can detect gene copy number alterations No Yes NGS

Sensitivity Low High NGS

Accuracy High High _

Regulatory status « Gold standard » Pending Traditional

Turnaround timeSingle geneper multiplex multigene test

ShorterLonger

LongerLonger

Traditional_

Jeffrey S. Ross & Maureen Cronin, Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012; doi:10.1155/2012/251364

FFPE: Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded; NGS: Next-Generation Sequencing

Utilisation du NGS en pathologie :apport au diagnostic

Vers une nouvelle classification des tumeurs

� Le phénotype d’une tumeur est le reflet des altérations

génétiques présentes dans toutes les cellules tumorales

qui la composent !

Séquençage complet de tumeurs :

� Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways.

� The Cancer Genome Atlas Research Network Nature. 2008

Création de consortium de séquençage, ex du Cancer Genome Atlas (TCGA)� Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 2011.

� Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers Nature. 2012.� Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature.2012.

� Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 2012.

21 Signatures of mutational processesin human cancer

doi:10.1038/nature12477

2 à 6 signatures / cancers (foie, utérus et estomac)

Nature. ; 474(7353) : 609-615. doi: 10.1038/nature 10166

La nouvelle histoNGS-pathologie ?

NGS : changement de paradigmepour la pathologie

Universum - C. Flammarion, Holzschnitt, Paris 1888

L’ACP s’automatise• PLUS DE SÉCURITÉ

• PLUS DE TRAÇABILITÉ

• AIDE AU DIAGNOSTIC

• PATHOLOGIE MOLÉCULAIRE

• ACCRÉDITATION...

CONCLUSION

Merci pour votre attention