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Etude de l'adaptation des organismes Etude de l'adaptation des organismes marins en environnement variablemarins en environnement variable
Arnaud Tanguy, Didier Jollivet
Station Biologique de Roscoff, UMR CNRS 7144, Adaptation et Diversité en Milieu Marin, Equipe Ecologie et Génétique des Populations Marines
Mécanismes physiologiques et génétiques de la réponse Mécanismes physiologiques et génétiques de la réponse aux stress chez l’huître creuse aux stress chez l’huître creuse Crassostrea gigasCrassostrea gigas
Dario Moraga, Marie Thérèse Thébault, Philippe Soudant Christophe Lambert
Laboratoire des Sciences de l’Environnement Marin (LEMAR)Institut Universitaire Européen de la Mer (IUEM) UMR CNRS 6539, Université de Bretagne Occidentale 29280 Plouzané.
Equipe 3 de l’UMR 6539Réponses des organismes et des populations à la variabilité environnementaleThème 2 Réponses aux stress et adaptation
…
MoléculeGène Cellule
OrganismeIndividu
PopulationGroupes fonctionnels
CommunautésPeuplements
Expression de gèneGénotoxicité
Protéines de stress
CroissanceReproduction
PolymorphismeDynamique de
population
Abondance et diversité spécifiques, écologie
Réponse au stress
Différents niveaux d’intégration et d’étude de la réponse des organismes face au stress
Signification ECOLOGIQUE
Signification TOXICOLOGIQUE
Approche génétique intégrée de la réponse au stress
Sélection / Adaptation ?
Paramètres biologiques (Fécondité,
génotoxicité, etc.)
Intégration des réponses:corrélation phénotypes / génotypes
au niveau populationnel
Analyse de l’expression des
gènes
Analyse du polymorphisme des
gènes candidats
Recherche de gènes candidats en réponse au stress environnementaux
Approche génétique intégrée de la réponse au stress
Les sources de stress oxydatif
Caractéristiques des fluides
Température élevée (300-350°C)
Acides (pH 2.5 à pH 4.5)
Métaux (Fe, Zn, Cu…)
Gaz dissous (H2S, H2, CO2, CH4)
Anoxie
Radiations ionisantes
Gradients abrupts
Température
Concentrations en oxygène
Concentrations en composés réduits
(H2S, H2, CO2, CH4)
Milieu hydrothermal
Milieu côtier
Polluants anthropiques
Température
Eutrophisation (MO)
État actuel des connaissances sur le stress oxydatif chez les mollusques marins
Très nombreuses études en écotoxicologie utilisant essentiellement
- les mesures d’activités d’enzymes anti-oxydantes (SOD, catalases, …)
- le dosage des ROS et du GSH comme biomarqueurs de stress
Peu d’études au niveau moléculaire (absence d’organisme modèle, peu d’outils moléculaires relatifs au stress oxydant)
Les modèles biologiques étudiés
Mollusques
Annélides
Bathymodiolus azoricus Mytilus edulis Crassostrea gigas
Alvinella pompejana
Paralvinella grasslei
Paralvinella sulfincola
Approches moléculaires employées:transcriptomie différentielle
Approche spécifiqueBanques SSH
Approches globales:Banque cDNA
ARNm
Control samples
Stressed samples
Substraction of common genes
Up-regulated genes
Down-regulated genes
tissues
ARNm ARNm
• Métaux lourds• Pesticides• Hydrocarbures• Salinité• Température• Hypoxie• Infections bactériennes
Tous convergent vers une production de radicaux libres
Infectionspathologies
xénobiotiqueshypoxie
Stress abiotiques
XR
n
a
y
Identification des différentes voies de régulation et de
détoxication du stress oxydatif
Analyses des profils transcriptomiques: recherche des gènes communs ou spécifiques de
plusieurs stress
Modèle Crassostrea gigas
Approches moléculaires employées:transcriptomie différentielle
Gènes sur-exprimés (24 jours)Cytoskeleton, structure, matrix
Respiratory chain
Nucleic acids regulation
DetoxificationAmino acids metabolism
Energetic metabolism
Protein regulation
Cellular communication, immune system,
receptor
Stress protein
Reproduction
Lipids metabolismDevelopment, differenciation
Ribosomal protein
Unknown functions
ESTs
Cytochromes P4501A1SODHSP70Gluthatione peroxydaseGlutamine synthetaseDelta-9-desaturaseArginine kinaseGlycogen phosphorylaseAnhydrase carbonique
BANQUES SSH sur Crassostrea gigas: effets de l’hypoxie
Gènes inhibés (24 jours)
Gènes inhibés (7-10 jours)
Gènes sur-exprimés (7-10 jours)
Temps d’exposition (jours)
Expre
ssio
n r
ela
tive
Metallothionein 4
Protéine de stressProtection cellulaire
Fonction anti-oxydanteManteau
Delta-9 désaturase
Peroxiredoxine 6
0
1
2
3
0 3 7 10 14 17 21 24
*
*
**
*
0
1
2
3
0 3 7 10 14 17 21 24
0
2
4
6
8
0 3 7 10 14 17 21 24
*
*
*
*
* **
*
*
Métabolisme lipidique: maintien de la structure
membranaire
Enzyme antioxydant
Manteau
Glande digestive
BANQUES SSH sur Crassostrea gigas: effets de l’hypoxie
hypoxienormoxie
* Forte variabilité inter-individuelle de l’expression des gènes
•Expression tissu-specifique
* Expression régulée au cours du temps
Phase IOxydation par les monooxygénases
Récepteurs
Phase IIConjugaison à des
composés endogènesD
om
mag
es
AD
N
Phase IIIElimination active
métabolites hydrosolubles
H
Hydrocarbures (H)
métabolites réactifs
BANQUES SSH sur C. gigas: effets des hydrocarbures
déto
xica
tion
des
hydr
ocar
bure
s
régu
latio
n de
s lip
ides
prot
éine
s de
stre
sscy
tosq
uele
tte
chai
ne re
spira
toire
régu
latio
n de
s ac
ides
nucl
éiqu
esré
gula
tion
des
prot
éine
s
com
mun
icat
ion
cellu
laire
mét
abol
ism
e én
ergé
tique
prot
éine
s rib
osom
ales
EST
induit 7 joursinhibé 7 jours
induit 21 joursinhibé 21 jours0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50258 gènes
potentiellement régulés par les hydrocarbures *
10 gènes codant pour des enzymes impliquées dans
la biotransformation
Cytochromes P4501A1 et 3A4Cytochrome b5
Monoamine oxidase A (MAO A)Monooxygenase à flavine 2 (FMO-2)4 Glutathione S-transferases (GST)Sulfotransferase 1C1
BANQUES SSH sur C. gigas: effets des hydrocarbures
0.2 kb
M 0 3 7 11 15 21 jours
T0 7 15 21
T0 7 15 21
CYP1A1
Phase I
Induction
*
**
jours
jours
GST pi
GST sigma
GST omega
GST mu
T0 7 15 21
Phase II
RT-PCR Multiplex
jours
Induction des GSTs mu et omegaInhibition de la GST sigma
BANQUES SSH sur C. gigas: effets des hydrocarbures
Hémoglobines
0
1
10
100
1000
20° C Branchie 15°C Branchie 20° C Corps 15°C Corps
exp
ress
ion
HemL3Hem B1
Hem IC Hem A2C
Gènes du stress oxydant
0
1
10
100
1000
20°C Branchie 15° C Branchie 20°C Corps 15°C Corps
Temperature - Tissue
exp
ress
ion
PRXSOD GST Sigma
Gène du métabolisme mitochondrial
0
1
10
100
1000
20°C Branchie 15°C Branchie 20°C Corps 15°C Corps
Temperature-Tissue
exp
ress
ion
MDH
AAT
Succinate
Aconitase
Effets de la température sur P. grasslei: induction de stress oxydant
À 15°C Sur expression: Hem IC (Intracellulaire)
A 20°C sur expression: Hem L3 (Linker)Hem B1 (Extracellulaire)
À 15°C: sur expressionBranchie: MDH, AAT, SDHCorps: Aconitase
À 15°C: sur expressionBranchie-manteau: GST sigmaBranchie: PRX, SOD
Réduction de la disponibilité d’O2
HémoglobinesExtracellulaires
B1 et A2CCapture et
transport d’O2
PO2
HémoglobinesIntracellulaires
ICRéservoir d’O2
LinkerL3
Structure HbProtection
contre le ROS
Augmentation de Température
SOD ?Transfert Bidirectionnel ?
20° C
15° C
20° C
Effets de la température sur P. grasslei: induction de stress oxydant
Effets de la température sur P. grasslei: induction de stress oxydant
Augmentation de la Température 20°C
Stress Oxydatif
Altération de la stabilité membranaire
(peroxydation lipidique)
SODGSTPRX
ROSRHS
Enzymes de protection
AconitaseAAT
MDH
Protéines métaboliques
Métabolisme anaérobie?
Alvinella pompejana sequencing project
4,000 contigs9,000 singlets
Annotated; 95%
No annotation5%
160%
2 and more8%
No Pfam-A32%
With definition87%
No definition13%
With EC74%
No EC26%
With GeneOntology
86%
No GeneOntology
14%
6,600 with homolog proteins (51%)
blastX49% with no homologs !!!(long ORFs with biased composition)
Banques cDNA construites en 2005-2007:
ESTs (cDNA libraries):
* 9000 unigenes chez Crassostrea gigas* 3500 unigenes chez Mytilus galloprovincialis* 1800 unigenes chez Ruditapes decussatus* 2500 unigenes chez Bathymodiolus azoricus
* 2000 unigenes chez Paralvinella grasslei* 9000 unigenes on Alvinella pompejana* 300 unigenes on Lepetodrillus elevatus
Puce ADN disponibles ou en construction :
* « gigas » micro-array (1500 spots) dédiée au stress: utilisée pour des analyses comparatives en milieu anthropisé.
* « gigas » micro-array (9000 spots) C. gigas: collaboration avec le Marine Genomics Europe Program and Aquafirst (IFREMER-INRA)
* Autres microarrays: en construction : moules, palourdes, annélides
Marine GenomicEurope Network
Alvinella Consortium
Projets de recherche en coursTranscriptomie comparée
Temps
[Gène X]PCR quantitative
Catalogues de gènes régulés au cours des processus de réponse aux stress (biotiques, abiotiques, anthropiques,…) mais aussi liés aux
différents stades de développement
Développement de micro-array
Intensité du stresset/ou
Etude qualitative et quantitative des régulations
BIOLOGIE FONCTIONNELLE
TRANSCRIPTOMIE:Régulation de
l’expression des gènes PHYSIOLOGIE:* activité d ’enzymes régulées
par le stress
* Couplagesgénotype/phénotype
(polymorphisme d’expression ou de séquence)
* croissance* fitness* détoxication
Etude des convergences des réponses au stress sur une échelle évolutive
Gradient et nature du stress oxydant
Projets de recherche en cours
Projets de recherche en cours
TRANSCRIPTOMIE:Régulation de l’expression des gènes
Identification des différentes voies de régulation et de
détoxication du stress oxydatif
Comparaison inter-espèce(taxons) et/ou inter-stress des profils
transcriptomiques: recherche de signatures de régulation communes
ou spécifiques
Stress DEspèce 4
Stress BEspèce 2Stress A
Espèce 1
Espèce 3
X w
n
a
Stress C
Gène A
Gène D
Gène J
Gène E
Gène K
Gène G
Gène H
Gène F
Gène C
Gène L
Gène I
Gène BEtude des co-régulations
entre gènes
Identification de network de gènes =
Signatures moléculaires de réponse au stress
Projets de recherche en cours
TRANSCRIPTOMIE:Régulation de l’expression des gènes
Relation génotype-expression de gènes.
Ex de Bathymodiolus
PGM bas
6
6,5
7
7,5
8
8,5
100/100 100/95+95/95 105/100 + 105/105+105/95
del
ta C
t H
SP
70
PGM haut
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
100/100 100/90+90/90
110/100+110/90
100/86+110/86
delta
Ct
HS
P70
Relation entre génotypes allozymiques et expression des ARNm
Analyse canonique de redondance: mise en évidence de relation entre
le génotype allozymique, l’expression des ARNm, le niveau de protéines de
stress (?) et le temps (d’exposition et de récupération).
HSP70
Ferritine GF2a, yolk, GF2b / MDH haut et bas ; ferritine GF1 / LAP GPI ;
anhydrase carbonique / MDH haut GPI ; MT / PGM haut
Projets de recherche en cours
* Couplages génotype/phénotype(polymorphisme d’expression ou de séquence)
Projets de recherche en cours
Expression et polymorphisme des
gènes Activité protéique
variant1 Variant 2
Transformation dans E.coli BL21DE3
Culture en milieu liquide en présence de gammes
de stress
DO
Temps
Activation de MT15 ’UTR
1er cas: présence de faibles concentrations en métaux
- 60pb- 90pbMT1
MBF
5 ’UTR
- 170pbMT2
Activation de MT15 ’UTR
2ième cas: présence de fortes concentrations en métaux
- 60pb- 90pbMT1
MBF
5 ’UTR
- 170pbMT2 Activation de MT2
1: TTT GGG GTC AAG2: TTT GGG CCC AAG
Dans quel cadre ?
* OUEST-genopole® (projet fédérateur Mer-Agro-Santé): Génome, adaptation et environnement. Projet 5: Réponse au stress oxydatif chez l’huître Crassostrea gigas en environnement variable : expression et activité d’enzymes antioxydantes
* ANR Genanimal (Cgphysiogen) CNRS IFREMER UniversitésBases moléculaires des fonctions physiologiques chez Crassostrea gigas : interaction hôte/pathogène/environnement
* Programme Européen « Marine Genomics Europe »Etude transcriptomique de la réponse au stress chez les mollusques marins.
* Coopération franco-chilienne et franco-canadienne
Dans quel cadre ?
* PRIR « AMETHYST » (2005-2007) : Adaptation Multigénique et Evolution des Taxons HYdrothermaux aux conditions ‘extrêmes’ de température et d’anoxie : recherche de Signatures moléculaires convergentes au niveau du Transcriptome
* Programme GIS « Alvinella » (2005-2008) Etude de l’adaptation des Alvinellides aux conditions de stress thermique et oxydatif de l’environnement hydrothermal profond
* Programme Européen « Marine Genomics Europe »:Etude transcriptomique de la réponse au stress chez les mollusques marins: comparatif hydrothermal-côtier.