Etude des interactions entre le chitosane et diverses souches bactériennes en milieux

aqueux.

Laurence Giraud

Encadrant : Yves Andres

Maître assistant, HDR

DEA « Chimie et Microbiologie de l ’Eau »

PLAN DE LA PRESENTATION

• Introduction Généralités sur la chitine et le chitosane Généralités sur les bactéries Cinétiques de mortalité

• Matériels et Méthodes Caractérisation des matériaux Etude de la survie des bactéries dans divers milieux Approche mécanistique

• Résultats et Discussion Spectres IR-TF et Titrages acido-basiques Courbes de survie des bactéries dans divers milieux Approche mecanistique

• Conclusion et Perspectives

INTRODUCTION

• Dispersion des micro-organismes résistants par les installations traitant l ’eau (Gerba et al., 2003) Aeromonas Hydrophila (E.P.A.)

103-104 UFC/mL dans eaux de surface 102-103 UFC/mL dans les réseaux de distribution

• Toxicité des produits de désinfection actuels (Chlore, dioxyde de chlore, ozone) Exemple : le dioxyde de chlore est capable de se combiner à la matière organique du milieu et de former des composés aromatiques chlorés nocifs

• Afin de pallier à ces problèmes techniques de mises en œuvre, utilisation du chitosane pour le traitement des eaux.

L ’E.P.A. a déjà approuvé l ’usage du chitosane dans l ’eau (jusqu ’à 10 mg/L)

• But de l ’étude : Etudier les interactions et les effets entre le polymère et les souches bactériennes : deux Gram-négatives, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa, et deux Gram-positives, Staphylococcus saprophyticus et Enterococcus faecalis

INTRODUCTION

Structures moléculaires de la chitine (a) et du chitosane (b).Généralités sur la chitine et le chitosane

CH2OH

O

NH2

HO

CH2OH

O HO

CH2OH

HO

NH2

O

O

NH2

O

OO

(a)

O

OO

NH

O

OHO

CH2OH

HOO

CH2OH

HO

O

CH2OH

OC

CH3

NH

CH3

C O

NH

CH3

C O

(b)

INTRODUCTION

Propriétés et caractérisation• Analyses physiques du chitosane

polymère très peu poreux

• Analyse infra-rouge

• Comportement acido-basique du chitosane

Généralités sur la chitine et le chitosane

Bande amide 1 ou déformation N-H des

amines

Bande amide 2 ou déformation des amines

protonées

Bande amide 3 ou étirement C-N des amines

Chitosane 1633 1590 1300Chitine 1655-1626 1561 1320

Nombres d’onde caractéristiques (cm-1) des principales vibrations amines et amides des polymères.

DA = (Harish Prashanth et al., 2002) ; DA = (Khor, 2001)1655

3450

A 1*100 *

A 1,33

1655

3450

A*115

A

% NH2 = (Broussignac, 1968 ; cité par Saucedo, 1993) 2 1V V *M*161

m

INTRODUCTION

Lipopolysaccharide

Pedptidoglycane

Acide lipoteichoïqueAcide teichoïque

Espacepériplasmique

Membranecelluaire

Protéines trans-membranaires

Lipides

Protéines

Membraneexterne

Porines

Gram négative Gram positive

Comparaison des enveloppes des bactéries Gram-positives et Gram-négatives (Maier et al., 2000).

Généralités sur les bactériesLa paroi bactérienne

Cinétiques de mortalité

INTRODUCTION

ln = -Kt

N = nombre de micro-organismes présents au temps t,N0 = nombre de micro-organimes présents au temps 0,K = constante caractéristique du type de désinfectant,

des micro-organismes et de l’aspect de la qualité de l’eau du système (min-1),

t = temps (min).

0N

N

Le modèle de Chik-Watson (Montgomery, 1985)

MATERIELS ET METHODES

Etude mécanistique

Etude de la survie des micro-organismes dans divers milieux

• Dans l ’eau déminéralisée

• Dans une suspension de chitosane déacétylé à 80 %

• Influence du degré de déacétylation du chitosane

• Influence de la concentration en chitosane déacétylé à 80 %

• Intégrité des couches pariétales

• Libération de protons

• Libération d ’ions potassium

• Force ionique

Caractérisation du matériel utilisé• Analyse infra-rouge

Caractérisation des matériaux par spectroscopie IR-TF (pastillage de l ’échantillon)

• Titrages acido-basiques des polymères

Dissolution des polymères dans de l ’acide chlorhydrique 0.1M et dosage par la soude

MATERIELS ET METHODESEtude de la survie des micro-organismes dans divers milieux

Protocole de numération des colonies

ensemencement réacteurs (2 duplicats par milieux) : eau déminéralisée, suspension de chitine, suspension de chitosane déacétylé à 60 % et suspension de chitosane déacétylé à 80 %

dilution en cascade

préculture

numération des colonies présentesdans le culot récolté

~72 h, 20°C 24h,T° optimale

culture

conservation des bactéries à 4°C durant la nuit

100 µLL

récupération culot par centrifugation

suspension culot dans 800 mL d'ED

numération des colonies au temps t

défini

RESULTATS ET DISCUSSIONS

Caractérisation des matériaux par spectroscopie IR-TF et titrimétrie des polymèresAnalyses des spectres infra-rouge

Détermination du degré d’acétylation (+/- 5 %) à partir de l’analyse des spectres infra-rouge (les résultas représentent les valeurs moyennes des duplicats).

% d'acétylation % de déacétylation % d'acétylation % de déacétylationChitine (Aldrich) 43 57 65 35

Chitosane (France Chitine) 21 79 38 62Chitosane (cette étude) 29 71 44 56

(Harish Prashanth et al. 2002) (Khor 2001)

0,8

1,3

1,8

2,3

2,8

3,3

3,8

1302603904120515061807210824092710301133123613

cm-1

Abs

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

Chitosane

Chitinee

Abs

Spectres infra-rouge de la chitine et du chitosane (déacétylé à 80 %).

RESULTATS ET DISCUSSIONS

Caractérisation des matériaux par spectroscopie IR-TF et titrimétrie des polymèresAnalyses des titrages acido-basiques

Comparaison des taux de déacétylation des polymères selon la méthode d ’analyse

Spectro IR (Khor, 2001)pKa n (NH2)(mmole) / g polymère

Chitosane 80 62 64,6 6,3 +/- 0,1 4Chitosane 60 56 12,5 5,92 +/- 0,1 0,8

Chitine 35 7 7,31 +/- 0,1 0,4

% déacétylation

Titrimètrie

Comparaison des taux de fonctions aminées (%) du chitosane et de la chitine selon la méthode d’analyse utilisée.

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

0 7 15 17 19 23 26 29 37 45

volume de NaO H 0.2M versé (mL)

pH

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

dp

H/d

V

Titrage acido-basique du chitosane (France Chitine).

RESULTATS ET DISCUSSIONS

Etude de la survie des MO dans divers milieux

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

0 100 200 300 400 500temps (min)

UF

C/m

L

Exemple de courbe de survie obtenue pour les quatre souches de bactéries :

E. coli (), P. aeruginosa (), E. faecalis (), et S. saprophyticus (),

dans l’eau déminéralisée en présence de chitosane (80 %).

Constantes de mortalité (minute–1) des bactéries dans quatre milieux : eau déminéralisée, suspension contenant du chitosane déacétylé à 80 % et déacétylé à 60 % et suspension contenant de la chitine.

Chitosane (80%) Chitosane (60%) ChitineE. coli -6,00E-04 -905,00E-04 -227,00E-04 6,00E-04

P. aeruginosa -12,00E-04 -132,00E-04 9,00E-04E. faecalis. -25,00E-04 -367,00E-04 1,00E-04

S. saprophyticus (ds NaCl) -16,00E-04 -281,00E-04 -50,00E-04 3,00E-04

Eau DéminéraliséeEau déminéralisée additionnée de polymères

RESULATS ET DISCUSSIONS

Influence de la concentration en chitosaneEtude de la survie des MO dans divers milieux

-0,06

-0,05

-0,04

-0,03

-0,02

-0,01

0,00

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

chitosane (mg/mL)

K (

min

-1)

Courbe représentant les constantes de mortalité de E. coli selon la concentration en chitosane déacétylé à 80 %.

RESULTATS ET DISCUSSIONS

Approche mécanistiqueIntégrité des couches pariétales

Libération des ions potassium

CODi CODf

Eau déminéralisée 0,83 2,39Chitosane 80% 1,51 2,96

Chitine 12,84 13,18

Concentrations en Carbone Organique Dissout dans trois milieux différents avec E. coli (mg.L-1).

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1chitosane (mg/mL)

po

tass

ium

(m

g/L

)

-0,07

-0,06

-0,05

-0,04

-0,03

-0,02

-0,01

0,00

0,00 0,10 0,20 0,30

potassium (mg/L)

K (

min

-1)

Courbes représentant les constantes de mortalité de Escherichia coli selon la quantité de K+ rejetés (a) et la quantité en ions potassium libérés dans le milieu pour différentes concentrations en polymère (b).

RESULTATS ET DISCUSIONS

Influence de la présence d ’ions dans le milieuApproche mécanistique

Calcium 62,27 Bicarbonates 219Magnésium 14,3 Sulfates 29,8

Sodium 10,52 Chlorures 37,4Potassium 1,02

Anions Cations

Composition ionique de l’eau de source Sainte-Aude (mg.L-1).

Chitosane (80%) Chitosane (60%) ChitineE. coli -6,00E-04 -17,00E-04 -29,00E-04 -8,00E-04

Eau de SourceEau de source additionnée de polymères

Constantes de mortalité (minute–1) des bactéries dans quatre milieux : eau de source, suspension contenant du chitosane déacétylé à 80 % et déacétylé à 60 % et suspension contenant de la chitine.

L ’eau de source permet de voir un effet possible de la présence d ’ions dans le milieu sur la mortalité de E. coli

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

• Effet antibactérien du chitosane

• Action différente sur les quatre souches de bactéries, mais pas de comparaison notable entre mortalité des Gram-négatives et mortalité des Gram-positives

• Rôle majeur des fonctions NH2 du chitosane dans la diminution de la population bactérienne• Interaction probable entre les fonctions amines libres du chitosane et des groupements fonctionnels des bactéries

• Les cellules ne se lysent apparemment pas

• Possibilité de réutiliser le polymère après réalisation d ’une première cinétique de mortalité

• D ’autres études nécessaires à la caractérisation de la mortalité des cellules

• Utilisation du polymère dans le traitement des eaux