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Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores
inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de
Porphyromonas gingivalis en macrófagos humanos
Yormaris Castillo Romero
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional (IBUN) Bogotá. D.C, Colombia; noviembre de 2017
Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores
inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de
Porphyromonas gingivalis en macrófagos humanos
Yormaris Castillo Romero
Trabajo de investigación para optar al título de: Magister en ciencias-Microbiología.
Directora: Diana Marcela Castillo Perdomo
BcL, MSc, cPhD. Facultad de Odontología, Universidad El Bosque
Co-director: Jaime Eduardo Castellanos Parra
OD, MSc, PhD Facultad de Odontología, Universidad Nacional de Colombia
Línea de Investigación:
Biología Molecular de agentes infecciosos
Grupo de Investigación:
Instituto UIBO (Unidad de Investigación Básica Oral) Universidad El Bosque
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional (IBUN)
Bogotá. D.C, Colombia; noviembre de 2017
Dedicatoria
Dedico este trabajo a Dios, por darme la
oportunidad de levantarme cada día, la
perseverancia para cumplir con mis sueños y
la luz para iluminar mí camino de vida.
A mi familia, especialmente mi madre Yolis M
Romero, mi hermano Diego, mi papá Ernesto
y a mi novio Javier porque ustedes son mi gran
apoyo y la razón para dar lo mejor de mí como
persona, como profesional, estudiante y
amiga.
A mi amiga Alexandra Cáceres.
“Aquel que tiene un porqué para vivir, se puede enfrentar a todos los cómos” Friedrich Nietzsche
Agradecimientos
A mis directores Diana Marcela Castillo Perdomo, Jaime Eduardo Castellanos, Gloria Inés
Lafaurie. Por todo su apoyo, enseñanza, guía y dedicación en este proceso, por darme la
oportunidad de aprender un poquito de todo su conocimiento y experiencia, por permitirme
crecer como persona y profesional.
A la Universidad El Bosque, especialmente al instituto UIBO porque es mi casa, es mi
presente y ha sido mi escuela, a todos mis compañeros de UIBO, porque se han convertido
en mi familia y de quienes aprendo cada día. Especialmente agradezco a Nathaly
Delgadillo, Yineth Neuta y Andrés Cardona, por su colaboración, apoyo y ayuda en este
proceso.
Al Instituto de Virología, por abrirme las puertas de su laboratorio y a sus integrantes por
siempre tener la mejor disposición para ayudarme en todo este proceso, especialmente
agradezco a la doctora Myriam Velandia, Arturo Balbas y Giovanny Delgado.
Agradezco al posgrado de Microbiología, por su apoyo en el desarrollo de este trabajo. A
mis profesores, especialmente a la profesora Martha Raquel Fontanilla y Daniel Uribe
Vélez, por toda su enseñanza y dedicación. A socorro Prieto, por su carisma, su dedicación
y amor a lo que hace. Por ser nuestra guía en el posgrado, por su valioso e impecable
trabajo.
Agradezco a la Fundación para la promoción de la investigación y la tecnología, entidad
que apoyó económicamente para el desarrollo de este trabajo. Contrato No 3955
Al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación (Colciencias).
Contrato No 6422017 Código. 13874455642
Resumen y Abstract IX
Resumen
Porphyromonas gingivalis es un patógeno periodontal, que secreta vesículas de
membrana externa (OMV) como vehículo de factores de virulencia e incluso se ha
reportado que estas pueden ser más virulentas que la propia bacteria y podrían modular
la respuesta inmune. Objetivo: Determinar las variaciones en la expresión de mediadores
inflamatorios en macrófagos humanos estimulados con vesículas de membrana externa
de P. gingivalis. Métodos: Monocitos U937 fueron diferenciados a macrófagos y
estimulados a diferentes tiempos con OMV, lisado bacteriano y bacteria viva. En
experimentos independientes cada estímulo fue pre-tratado con los inhibidores KYT-1,
KYT-36 y Polimixina-B para bloquear la acción de las gingipaínas R y K y además del LPS
respectivamente. Se determinaron los niveles solubles de citocinas y quimiocinas y
también del ARNm. Se usó ANOVA factorial para el análisis estadístico. Resultados: Las
vesículas estimularon la producción de citocinas proinflamatorias y quimiocinas. Sin
embargo, cuando se bloquean las gingipaínas R y K presentes en OMV, los niveles de IL-
1β, IL-6, MCP-1, RANTES, MIP-1α e IL-8 aumentaron significativamente comparado con
células sin estímulo y las estimuladas sin el bloqueo (p<0,05). De manera contraria, se
encontró una disminución en los niveles de TNF-α después de bloquear las proteasas o
LPS. Conclusión: Las vesículas de membrana externa de P. gingivalis más que las
bacterias vivas inducen cambios en la secreción de mediadores inflamatorios en
macrófagos humanos por eventos de proteólisis dependientes de gingipaínas lo cual
podría estar involucrado en el establecimiento de un estado crónico característico de la
enfermedad periodontal.
Palabras clave: Vesículas de membrana externa, P. gingivalis, citocinas, macrófago,
gingipaínas.
X Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
Abstract
Porphyromonas gingivalis is a periodontal pathogen, which secretes outer membrane
vesicles (OMV) as a vehicle for virulence factors and it has even been reported that these
can be more virulent than the bacterium itself and could modulate the immune response.
Objective: To determine the variations in the expression of inflammatory mediators in
human macrophages stimulated with outer membrane vesicles of P. gingivalis. Methods:
U937 monocytes were differentiated into macrophages and stimulated at different times
with OMV, bacterial lysate and live bacteria. In independent experiments each stimulus
was pre-treated with inhibitors KYT-1, KYT-36 and Polymyxin-B to block the action of the
R and K gingipains and in addition to the LPS respectively. The soluble levels of cytokines
and chemokines and also of the mRNA were determined. Factorial ANOVA was used for
the statistical analysis. Results: The vesicles stimulated the production of proinflammatory
cytokines and chemokines. However, when the R and K gingipains present in OMV are
blocked, the levels of IL-1β, IL-6, MCP-1, RANTES, MIP-1α and IL-8 increased significantly
compared with cells without stimulus and those stimulated without the blockade (p <0.05).
Conversely, a decrease in TNF-α levels was found after blocking proteases or LPS.
Conclusion: The outer membrane vesicles of P. gingivalis, more than live bacteria, induce
changes in the secretion of inflammatory mediators in human macrophages due to
gingipains-dependent proteolysis events, which could be involved in the establishment of
a chronic state characteristic of periodontal disease.
Key words: External membrane vesicles, P. gingivalis, cytokines, macrophage,
gingipains.
Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen ……………………………………………………………………………………… IX
Lista de figuras………………………………………………………………………………. XIII
Lista de tablas………………………………………………………………………………... XVI
Lista de Símbolos y abreviaturas………………………………………………………… XVII
1 Marco teórico ............................................................................................................ 5 1.1 Periodontitis ....................................................................................................... 5 1.2 Etiología de la periodontitis ................................................................................ 6 1.3 Porphyromonas gingivalis .................................................................................. 7
1.3.1 Factores de virulencia de P. gingivalis ............................................................. 8 1.3.1.1 Fimbrias ............................................................................................... 8 1.3.1.2 Hemaglutininas .................................................................................... 8 1.3.1.3 Lipopolisacárido (LPS) ......................................................................... 9 1.3.1.4 Gingipaínas .......................................................................................... 9
1.3.1.4.1 Funciones de las gingipaínas .............................................................. 11 1.3.2 Vesículas de membrana externa (OMV) ........................................................ 12 1.3.3 Vesículas de membrana externa de P. gingivalis ........................................... 12
1.3.3.1 Composición de las OMV de P. gingivalis .......................................... 14 1.3.3.2 Función de las OMV de P. gingivalis .................................................. 16 1.3.3.3 Cambios de respuesta inmune por OMV de P. gingivalis ................... 17
2 Metodología ............................................................................................................ 19 2.1 Cultivo bacteriano de P. gingivalis ATCC 33277 y P. gingivalis W83 y obtención de pre-inóculos ........................................................................................................... 19
2.1.1 Inóculos de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 ................................................ 20 2.1.2 Viabilidad bacteriana de inóculos de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 .......... 20 2.1.3 Límite de detección de actividad de la proteasa (Rgp) en los pre-inóculos e inóculos de P. gingivalis ........................................................................................... 20
2.2 Obtención y purificación de OMV P. gingivalis ................................................. 21 2.2.1 Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) para OMV de P. gingivalis ... 22 2.2.2 Límite de detección de actividad proteasa de las OMV de P. gingivalis ......... 22
2.3 Cultivo celular de monocitos U937 ATCC® CRL1593.2™ ................................ 22 2.3.1 Diferenciación de monocito U937 a macrófago .............................................. 23
2.4 Evaluación de la viabilidad de macrófagos-U937 estimulados con P. gingivalis 23 2.5 Modelo de infección de macrófagos - U937 con OMV de P. gingivalis ............. 24
2.5.1 Evaluación de los niveles solubles de citocinas por citometría de flujo .......... 24
XII Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en macrófagos
humanos
2.6 Evaluación de la expresión de citocinas proinflamatorias por macrófagos-U937 estimulados con OMV de P. gingivalis W83 y 33277 ................................................... 25 2.7 Evaluación del efecto de la inhibición de gingipaínas y LPS de OMV en los niveles y expresión de citocinas en proinflamatorias ................................................... 26 2.8 Plan de análisis ................................................................................................. 27
3 Resultados ............................................................................................................. 29 3.1 Recuentos bacterianos del pre-inóculo e inóculos P. gingivalis ATCC 33277 y W83 29 3.2 Actividad de la Arg-gingipaína Rgp en los Pre-inóculos e inóculos de P. gingivalis ..................................................................................................................... 31 3.3 Vesículas de membrana externa de P. gingivalis W83 y ATCC 33277 .............. 32
3.3.1 Microscopia Electrónica de Transmisión de vesículas de membrana externa de P. gingivalis ......................................................................................................... 33 3.3.2 Actividad Arg-gingipaína de vesículas de P. gingivalis .................................. 33
3.4 Diferenciación celular de Monocitos U937 a Macrófagos-U937 ........................ 34 3.5 Viabilidad celular de macrófagos U937 estimulados ......................................... 35 3.6 Niveles solubles de citocinas proinflamatorias producidas por macrófagos-U937 estimulados ................................................................................................................. 35 3.7 Evaluación de la inhibición de Rgp y Kgp en OMV de P. gingivalis ................... 40 3.8 Niveles de ARNm de citocinas proinflamatorias y quimiocinas producidas por macrófagos-U937 estimulados .................................................................................... 50 3.9 Efecto de la inhibición de Rgp, Kgp y LPS sobre la expresión de ARNm de citocinas proinflamatorias y quimiocinas producidas por macrófagos-U937 estimulados 52
4 Discusión ................................................................................................................ 57
5 Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 63 5.1 Conclusiones .................................................................................................... 63 5.2 Recomendaciones ............................................................................................ 63 5.3 Perspectivas ..................................................................................................... 64
Contenido XIII
Lista de figuras
Pág.
Figura 1. Productos de Transcripción y traducción de genes rgpA, rgpB y kgP de las
gingipaínas. Tomado de: Imamura. J Periodontol; 2003 (36). ......................................... 10
Figura 2. Modelo de biogénesis de vesículas de membrana externa de P. gingivalis. Tres
modelos son presentados: (A) una fuerza física inducida por acumulación de proteínas de
la envoltura sobre-expresada. (B) interrupción del vínculo existente entre la membrana
externa y la capa de peptidoglicano (C) aumento de la curvatura local de la membrana
externa bacteriana potenciado por señales extracelulares como PQS: Xie H. Future
Microbiol, 2015 (47). ....................................................................................................... 14
Figura 3.SDS-PAGE de Pool OMV de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 (30 µg/pozo).
Carril MP: (Protein Ladder 260 kDa); carril 1: Sonicado Pg 33277; carril 2: Sonicado Pg
33277 1/100; carril 3: OMV Pg 33277; carril 4: Sobrenadante de ultracentrifugación de Pg
33277; carril 5: Sonicado PgW83; carril 6: Sonicado PgW83 1/100; carril 7: OMV W83;
carril 8: Sobrenadante de ultracentrifugación de Pg W83; carril 9: Caldo BHI
ultracentrifugado. ............................................................................................................ 32
Figura 4.Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) de vesículas purificadas de P.
gingivalis (A) y Bacteria con vesículas de membrana externa (B).................................. 33
Figura 5. Micrografía de un cultivo de monocito U937 (A) y Monocito U937 diferenciado a
macrófago con 200ng/mL de PMA (B). ........................................................................... 34
Figura 6. Niveles de citocinas pro-inflamatorias en macrófagos estimulados con Lisado,
Bacteria y OMV de P. gingivalis W83 y 33277 por 30 minutos (barra negra punteada), 2
horas (barra blanca punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con
líneas transversas) comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A) Niveles de
IL-1β; B) Niveles de TNF-α; C) Niveles de IL-6 ............................................................... 38
Figura 7.Niveles de quimiocinas en macrófagos estimulados con Lisado, Bacteria y OMV
de P. gingivalis W83 y 33277 por 30 minutos (barra negra punteada), 2 horas (barra blanca
punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con líneas transversas)
comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A) Niveles de IL-8; B) Niveles de
RANTES; C) Niveles de MCP-1; D) Niveles de MIP-1 α. ................................................ 39
XI
V
Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en macrófagos
humanos
Figura 8.Niveles de IL-1β en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado,
Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-1β sin bloqueo y con inhibidor para Arg-
gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-1 β sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas
(KYT-36). C: niveles de IL-1 β sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS
(PMXB). .......................................................................................................................... 42
Figura 9. Niveles de TNF-α en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con
Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de TNF-α sin bloqueo y con inhibidor
para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de TNF-α sin bloqueo y con inhibidor para Lys-
gingipaínas (KYT-36). C: niveles de TNF-α sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor
para LPS (PMXB). .......................................................................................................... 43
Figura 10.Niveles de IL-6 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado,
Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-6 sin bloqueo y con inhibidor para Arg-
gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-6 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas
(KYT-36). C: niveles de IL-6 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
....................................................................................................................................... 44
Figura 11.Niveles de IL-8 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado,
Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Arg-
gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas
(KYT-36). C: niveles de IL-8 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
....................................................................................................................................... 47
Figura 12.Niveles de MCP-1 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con
Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para
Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-
gingipaínas (KYT-36). C: niveles de IL-8 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para
LPS (PMXB). .................................................................................................................. 48
Figura 13. Niveles de RANTES en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con
Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de RANTES sin bloqueo y con inhibidor
para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de RANTES sin bloqueo y con inhibidor para Lys-
gingipaínas (KYT-36). C: niveles de RANTES sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor
para LPS (PMXB). .......................................................................................................... 49
Figura 14. Expresión relativa de ARNm en macrófagos estimulados con Lisado, Bacteria
y OMV de P. gingivalis W83 y 33277 durante 30 minutos (barra negra punteada), 2 horas
(barra blanca punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con líneas
transversas) comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A). IL-1β; B). MCP-
1; C) IL8. ......................................................................................................................... 51
Contenido XV
Figura 15.Expresión relativa de ARNm de IL-1β en macrófagos estimulados durante 30
min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de IL-1β
sin bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de IL-1β sin
bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de IL-1β sin
bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB). ................................................ 54
Figura 16. Expresión relativa de ARNm de IL-8 en macrófagos estimulados durante 30 min
y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de IL-8 sin
bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de IL-8 sin
bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de IL-8 sin
bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB). ................................................ 55
Figura 17. Expresión relativa de ARNm de MCP-1 en macrófagos estimulados durante 30
min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de MCP-
1 sin bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de MCP-
1 sin bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de MCP-
1 sin bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB). ........................................ 56
Contenido XVI
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1. Proteínas identificadas en las OMV de P. gingivalis de las cepas ATCC 33277 y W83. (Las proteínas resaltadas en negrilla fueron las más abundantes). Modificado de: Mantri et al., Microbiology Open 2015 (48). ..................................................................... 15 Tabla 2. Secuencias de primer y concentración utilizadas para detección de citocinas .. 26 Tabla 3.Promedios de recuentos de P. gingivalis ATCC: 33277 y P. gingivalis W83 expresados en Log 10. .................................................................................................... 29 Tabla 4. Promedios de recuentos del inóculo de P. gingivalis ATCC: 33277 y P. gingivalis W83 expresados en Log 10. ........................................................................................... 30 Tabla 5. Actividad Arg-gingipaína de pre-inóculo e inóculo de P. gingivalis .................... 31 Tabla 6.Límite de detección de actividad Arg-gingipaína de OMV de P. gingivalis ......... 34 Tabla 7. Viabilidad de macrófagos U937 estimulados con lisado, bacteria o vesículas de P. gingivalis ..................................................................................................................... 35
Contenido XVII
Lista de Símbolos y abreviaturas
Abreviaturas
Abreviatura Término
AAP Academia Americana de Periodoncia
ATCC American Type Culture Collection
BANA Benzoilarginina-2-naptilamida
CAAM NCBZ- GLY-GLY-ARG- clorohidrato de 7-amido-4-metil coumarina
CV Coeficiente de Variación
DE Desviación estándar
ECV Enfermedad cardiovascular
ENSAB Encuesta Nacional de salud Bucal
HA Hemaglutininas
HGE Células epiteliales gingivales Humana
HUVEC Células endoteliales de vena umbilical humana
ICAM-1 Molécula de adhesión intercelular 1
IL-1β Interleucina 1 beta
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
iNOS Óxido nítrico sintasa inducible
LDL Lipoproteínas de baja densidad
LPS Lipopolisacárido
MAPK Proteína quinasa activada por mitógenos
MCP-1 Proteína quimioatrayente de monocitos 1
MIP-1α (CCL3) Proteína Inflamatoria de macrófago
MOI Multiplicidad de Infección
NFκB Factor nuclear-kappaB
NLR Receptores similares a NOD
ON Óxido nítrico
DO Densidad óptica
OM Membrana externa
OMV Vesículas de membrana externa "Outer Membrane Vesicles"
PAMP Patrones Moleculares Asociados a Patógenos
PI3K Fosfatidilinositol 3-quinasa
qPCR Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real
RANTES (CCL5) Quimiocina (C-C motif) ligand 5 también conocida como RANTES
RIPK1 Receptor que interactúa con la proteína quinasa-1
X
VII
I
Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en macrófagos
humanos
Símbolos con letras latinas
RLR Receptores similares a RIG-I
TAK1 Factor de crecimiento transformante beta activado por cinasa 1
TEM Microscopia Electrónica de Transmisión
TLR Receptores Toll-like
TNFα Factor de Necrosis Tumoral alfa
UF Unidades de Fluorescencia
UFC Unidad Formadora de Colonias
VCAM-1 Molécula de adhesión celular vascular 1
Símbolo Término
µL Microlitro mL Mililitro µg Microgramos
Longitud de onda pg Picogramos
Introducción
La periodontitis es una enfermedad infecciosa, multifactorial, inflamatoria y crónica que
compromete la integridad de los tejidos de soporte del diente, que incluyen la encía, el
ligamento periodontal y el hueso alveolar, representa un reto inflamatorio sistémico, debido
a las grandes superficies epiteliales inflamadas en las bolsas periodontales. Esta
inflamación y vasodilatación ocasionan daño al tejido lo que permite que bacterias y sus
productos puedan llegar a otras partes del cuerpo (1-3). La actividad de la enfermedad
periodontal está determinada por una compleja interacción entre el sistema inmune y
patógenos periodontales, las alteraciones en la microbiota subgingival se han asociado
con el desarrollo y progresión de la periodontitis (4).
Esta enfermedad tiene gran impacto en la pérdida dental de la población adulta en
Colombia y en general en todas las poblaciones a nivel mundial (5). Además, se considera
una enfermedad de gran importancia no solo porque causa perdida de los dientes sino
también porque se ha relacionado con enfermedades sistémicas como: resultados
adversos en el embarazo (3, 6, 7) artritis reumatoide (7), enfermedad cardiovascular como
aterosclerosis y síndrome coronario agudo (8).
El componente microbiano juega un rol muy importante en esta enfermedad y un grupo de
bacterias anaerobias orales conocidas como periodontopatógenas pertenecientes al
complejo rojo conformado por Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia y
Treponema denticola que han sido asociada a la progresión de periodontitis, en función de
sus factores de virulencia y su interacción con el sistema inmune del hospedero (2,3,9).
P. gingivalis se considera como una de las bacterias con mayor importancia en el
desarrollo de la periodontitis debido a que grandes cargas de esta bacteria se relacionan
con mayor severidad de la enfermedad periodontal (10). Esta bacteria tiene diferentes
factores de virulencia que determinan su patogenicidad, dentro de los que se encuentran:
fimbrias, hemaglutininas, lipopolisacárido (LPS), gingipaínas, proteínas de membrana,
antígenos capsulares, ceramidas y vesículas de membrana externa (11). Las vesículas de
2 Introducción
membrana externa, son importantes factores de virulencia secretadas al medio externo
que sirven como sistema generalizado de secreción y transporte para otros factores de
virulencia como LPS, fimbrias y enzimas entre las que se encuentran las gingipaínas. Estas
vesículas han sido investigadas por su importante papel en la respuesta inmune del
hospedador y la destrucción del tejido periodontal durante la infección por P. gingivalis. Se
ha reportado que inducen la producción de citocinas proinflamatorias, asociadas con
osteoclastogénesis y por tanto resorción de hueso alveolar y destrucción del tejido
periodontal (12).
Las OMV pueden ser internalizadas en las células hospedadoras, donde ocurre su lisis y
la liberación de antígenos, que pueden ser procesados por las células presentadoras de
antígeno, lo que conduce a la inducción de la inmunidad adaptativa incluyendo la
producción de anticuerpos específicos contra este patógeno (12, 13, 14).
Aunque P. gingivalis y sus factores de virulencia están involucrados en la patogénesis de
la periodontitis, la naturaleza y magnitud de la respuesta del periodonto, se modula no sólo
por las bacterias presentes, sino también por la respuesta inmune del hospedador y las
interacciones hospedador–patógeno (15). Su persistencia crónica en el periodonto
depende de su habilidad para evadir la inmunidad del hospedador sin inhibir por completo
la respuesta inmune inflamatoria (16). Los macrófagos están implicados activamente en
todas las fases de la inflamación y su papel como efector y células reguladoras ahora se
reconoce ampliamente (17). Son un tipo de células fagocíticas que junto con otras células
modulan con eficacia la respuesta inmune innata y adaptativa ayudando a promover la
resolución inflamatoria y cicatrización de los tejidos (17).
En la periodontitis estas células secretan citocinas quimiotácticas como RANTES, MCP-1,
MIP-1α, MIP-3α, MIP-1β, IL-8, cuya función es la activación y migración de leucocitos; y
citocinas proinflamatorias como la IL-1β, TNF-α, IL-6, que activan procesos de
osteoclastogénesis y la degradación del tejido periodontal. Factores de virulencia como las
OMV secretadas por P. gingivalis en las bolsas periodontales, a nivel local pueden
exacerbar la enfermedad, lo cual podría estar influenciado por la capacidad de estas
vesículas de modular en las células la expresión de estas citocinas (18).
A nivel sistémico, la facilidad que tienen las vesículas para difundirse en tejidos profundos
y torrente sanguíneo favorecen su interacción con diferentes tipos de células como
plaquetas y células endoteliales que promueven la agregación plaquetaria y la
Introducción 3
coagulación, así como la interacción con moléculas de adhesión vascular favoreciendo la
disfunción endotelial típica de la ateroesclerosis, adicionalmente se ha confirmado que
bajas concentraciones de OMV inducen la conversión de macrófagos en células
espumosas favoreciendo el desarrollo del ateroma (2, 18, 19).
En este sentido las OMV de P. gingivalis cobran mayor importancia al ser uno de los
principales factores de virulencia que desencadenan respuesta inmune local y sistémica
favoreciendo adicionalmente la condición crónica de la periodontitis (20). Sin embargo, la
inducción de los cambios en la respuesta inmune relacionados con la interacción de las
OMV de P. gingivalis con la célula hospedadora han sido poco estudiados. Aún menos
evidente es el mecanismo por el cual estas vesículas pueden inducir una respuesta celular
de macrófagos humanos caracterizada por la producción de citocinas proinflamatorias
asociadas con el desencadenamiento de enfermedades locales y sistémicas, lo que podría
generar mayor patogenicidad de estas vesículas en comparación con la bacteria completa.
Por otra parte, no es claro cuál es la contribución de los factores de virulencia que se
encuentran en mayor proporción en las vesículas como las gingipaínas y el lipopolisacárido
en la inducción de la respuesta inmune importante en el desarrollo, evolución y
mantenimiento de la condición inflamatoria crónica a nivel periodontal. Por esta razón
hemos planteado en este trabajo la siguiente pregunta de investigación ¿Cuáles son las
variaciones en la expresión de mediadores inflamatorios en macrófagos humanos
estimulados con vesículas de membrana externa de dos cepas de Porphyromonas
gingivalis? En consecuencia, se planteó el siguiente objetivo general: Determinar las
variaciones en la expresión de mediadores inflamatorios en macrófagos humanos
estimulados con vesículas de membrana externa de P. gingivalis.
En este estudio se demostró que las vesículas inducen cambios en la expresión de ARNm
y los niveles de citocinas y quimiocinas en sobrenadantes de cultivo de macrófagos-U937
por eventos de proteólisis dependiente de gingipaínas y esta inducción es diferencial entre
dos cepas de P. gingivalis.
1 Marco teórico
1.1 Periodontitis
La Academia Americana de Periodoncia (AAP) en su consenso de 1999, definen la
periodontitis como una enfermedad infecciosa, multifactorial y crónica, que resulta en la
inflamación de los tejidos de soporte de los dientes y pérdida progresiva del nivel de
inserción clínico, caracterizada por la formación de bolsas periodontales y/o recesión
gingival (21). Esta enfermedad fue clasificada en 1999 como periodontitis crónica,
periodontitis agresiva y periodontitis asociada a condiciones sistémicas en función de
parámetros clínicos periodontales. Actualmente existe una nueva clasificación que
mantiene la clasificación de 1999 pero incluye la bolsa periodontal como parámetro clínico
adicional (22, 23).
La periodontitis crónica es una patología de gran prevalencia en la población mundial (2).
En Colombia, datos del ENSAB III en 1999, indican que la enfermedad periodontal afecta
en forma generalizada al 12% de la población antes de los 35 años y ésta aumenta
significativamente a los 60 años en un 42%. Según su severidad, el 14% de la población
cercana a los 35 años presenta una destrucción periodontal de moderada a severa y a los
60 años, esta aumenta al 40% (22). La prevalencia de enfermedad periodontal en
Colombia aumentó a un 61.8% de acuerdo al último estudio nacional de salud bucal
(ENSAB IV); de esta cifra el 43.46% de los casos corresponden a periodontitis moderada
y el 10.62% a periodontitis severa. De esta forma, la presencia de periodontitis a los 18
años muestra una prevalencia de 21.90%, con un 10.6% de periodontitis leve y 10.97% de
moderada y para la edad de 35 a 44 años, el 48.29% de las personas presentan
periodontitis moderada y el 7.84% evidencia periodontitis avanzada. A partir de los 45 años
la periodontitis aumenta por encima del 82.88% y a las edades de 65 a 79 años el 25.99%
presentaba periodontitis severa (24). Estos datos tienen un gran impacto en la salud de los
colombianos, no solo a nivel oral por perdida de piezas dentales, sino por todas las
6 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
condiciones sistémicas con las que se encuentra asociada al aumentar el riesgo de los
pacientes para sufrir aterosclerosis, resultados adversos del embarazo, artritis reumatoide,
neumonía por aspiración y cáncer de cabeza y cuello (2).
1.2 Etiología de la periodontitis
Una tríada de bacterias anaerobias orales que comprende P. gingivalis, T. denticola y T.
forsythia tradicionalmente han sido consideradas como agentes causantes de periodontitis,
en función de sus propiedades de virulencia y fuerte asociación con los sitios afectados
(2,9).
El hábitat predominante de bacterias asociadas con periodontitis es el surco gingival,
donde encuentran microambientes distintos asociados al biofilm dental, el fluido crevicular
gingival y el epitelio de revestimiento del surco. El entorno subgingival es rico en
mediadores inmunes e inflamatorios, y ofrece desafíos y oportunidades para las bacterias.
La salud periodontal requiere un estado inmuno-inflamatorio controlado que permite
mantener la homeostasis hospedador-microorganismo en el periodonto. Sin embargo,
durante la periodontitis, se desregula la respuesta inmune del hospedador y por lo tanto es
ineficaz para restringir la patogenicidad bacteriana. Este desequilibrio genera una
respuesta inflamatoria que favorece la cronicidad de la infección (2).
La disbiosis de la microbiota periodontal se caracteriza por un desequilibrio en la
abundancia relativa o la influencia de las especies microbianas que tienen funciones
distintas en el biofilm y que actúan en sinergia para dar lugar a un proceso infeccioso que
puede causar enfermedad en la cavidad oral o tejidos extra-orales de individuos
susceptibles (2).
La etiología infecciosa de esta entidad fue reconocida desde la década de los 60 (25);
posteriormente confirmada por innumerables estudios epidemiológicos alrededor del
mundo, en los cuales se reconoció que una serie de microorganismos Gram negativos
anaerobios y microaerofílicos aumentan significativamente en la placa subgingival de
pacientes con periodontitis indicando que esta entidad representa una infección con un
patrón polimicrobiano, que aunque variable en los individuos, muestra cierta especificidad
caracterizada por el aislamiento de un grupo de microorganismos que han sido
considerados periodontopágenos, entre los cuales se han identificado P. gingivalis , T.
Capítulo 1 7
forsythia, T. denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Eikenella corrodens,
Campylobacter rectus, Parvimonas micra, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens y
Dialister pneumosintes, entre otras. Siendo P. gingivalis el microorganismo aislado con
mayor frecuencia en periodontitis tanto crónica como agresiva alrededor del mundo, con
un patrón similar para la población colombiana (25 - 28).
1.3 Porphyromonas gingivalis
P. gingivalis es un cocobacilo Gram negativo, anaerobio estricto, inmóvil, no esporulado
tiene un diámetro entre 0,5 ~ 3,5 µm. Es un colonizador tardío de la placa dental, utiliza las
bacterias residentes en la cavidad oral para la colonización inicial y hace parte del complejo
rojo al que pertenecen los microorganismos periodontopatógenos (9). Esta bacteria tiene
una naturaleza hemolítica y exhibe un pigmento negro característico en medios de cultivos
que contienen los derivados metabólicos del hierro, extraído de la hemoglobina u otras
proteínas que contienen el grupo hemo. Es una especie caracterizada por ser asacarolítica
y su fuente de carbono y energía es proporcionada por la fermentación de aminoácidos
(11). Tiene diferentes factores de virulencia que determinan su alta patogenicidad, dentro
de los que se encuentran: fimbrias, hemaglutininas, LPS, vesículas de membrana,
gingipaínas, proteínas de membrana, antígenos capsulares y ceramidas (11).
P. gingivalis es uno de los principales patógenos implicados en la progresión de la
enfermedad periodontal, basado en la observación de que el aumento en el recuento de
esta bacteria se asocia con un aumento en severidad de la enfermedad periodontal.
Resultados de estudios experimentales de infección oral con P. gingivalis en primates,
apoyan firmemente esta hipótesis, y demuestran que la inoculación subgingival de la
bacteria en monos libres de enfermedad periodontal resulta en el desarrollo de
periodontitis. En este modelo es significativo, que los niveles de la bacteria en el surco
subgingival están estrechamente correlacionados con una marcada pérdida del hueso
alveolar (29).
8 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
1.3.1 Factores de virulencia de P. gingivalis
1.3.1.1 Fimbrias
P. gingivalis posee fimbrias, las cuales están involucradas en la mayoría de las
propiedades de adherencia y de interacción con moléculas salivares, células epiteliales
orales y otras bacterias, así como en la inducción de la secreción de citoquinas de las
células infectadas (30). Esta bacteria tiene dos tipos de proteínas fimbriales, FimA
denominadas fimbrias mayores y Mfa1 fimbrias menores, expresadas en la superficie de
la bacteria y compuesta por polímeros de proteínas FimA y Mfa1, respectivamente (31).
Las fimbrias están constituidas en su mayoría por la proteína fimbrilina que actúa como
puente entre P. gingivalis y la superficie a colonizar e infectar (fibroblastos, células
epiteliales y células endoteliales). Estas juegan un papel muy importante en la adhesión a
células y facilita la formación del biofilm en el surco gingival. Las fimbrias mayores son de
gran importancia en la invasión, pero no son suficientes para que este proceso se lleve a
cabo (30). Las fimbrias menores están implicadas en la activación del sistema inmune, que
se encuentra estrechamente relacionado con la resorción ósea y la pérdida del ligamento
periodontal, adicionalmente se encuentran involucradas con la formación de biofilm oral
(31).
El gen fimA existe como una única copia en el cromosoma de esta bacteria y codifica para
una fimbrilina polimórfica FimA. Análisis por PCR, han permitido identificar seis genotipos
denominados I, Ib, II, III, IV y V (25). Estudios epidemiológicos han demostrado que las
cepas que poseen FimA tipo II y tipo IV son frecuentes en los pacientes con periodontitis,
mientras que la cepa de tipo I es detectada en individuos sanos. (32). Las fimbrias Mfa1
están compuestas principalmente de polímeros de la proteína Mfa1, codificados por el gen
mfa1. La proteína Mfa2 (codificada por mfa2) se localiza en la membrana externa y
desempeña un papel en el anclaje y la regulación de longitud de Mfa1 (32).
1.3.1.2 Hemaglutininas
P. gingivalis puede utilizar hemaglutininas (HA) para adherirse a los eritrocitos y/o a otras
células y adquirir nutrientes. Múltiples HA han sido identificadas en P. gingivalis, HagB se
ha demostrado estar involucrada en la adherencia de P. gingivalis a las células endoteliales
de arteria coronaria humana. HagA y HagD son 73,8% idénticas y comparten homología
Capítulo 1 9
con el dominio hemaglutinina de las gingipaínas. Otra hemaglutinina, HagE, comparte una
región de 523 aminoácidos con un 93% de homología con HagA (33).
1.3.1.3 Lipopolisacárido (LPS)
El LPS hace parte de la envoltura externa de todas las bacterias Gram negativas. Está
constituido por una región polisacárida y una región lipídica unidas covalentemente. La
región polisacárida está constituida por dos porciones, una cadena lateral (antígeno O) y
una región central (core). El antígeno O usualmente define la especificidad inmunoquímica
de la bacteria. El polisacárido central típicamente consiste de un número de hexosas y dos
azucares únicos, heptosa y 2-keto-3-deoxioctonato (KDO) (11). El lípido A es el
responsable de diversas actividades biológicas y está compuesto de un disacárido D-
glucosamina unido por enlaces beta 1-6 y ácidos grasos. El LPS funciona como una
endotoxina potente y juega un papel muy importante en la activación de la respuesta
inflamatoria, favoreciendo la producción de citocinas por parte de neutrófilos y macrófagos,
que se asocian con activación de osteoclastogénesis y por tanto inicio y progresión de la
periodontitis (11).
P. gingivalis libera OMV que penetran en los tejidos periodontales y median una respuesta
inmuno-inflamatoria en los tejidos periodontales. La naturaleza exacta y la consecuencia
de la respuesta del hospedador al LPS de esta bacteria han sido objeto de debate, debido
a los resultados contradictorios existentes. Recientemente, se reveló que P. gingivalis es
capaz de generar LPS con estructuras heterogéneas de lípido A través de una modulación
dependiente de hemina. Este microorganismo contiene LPS con lípido A tetra-acilado
(LPS1435/1.449) o penta-acilados (LPS1690) que genera efectos opuestos sobre la respuesta
inmune innata, por lo tanto, juega un papel clave en los cambios de la respuesta inmuno-
inflamatoria del hospedador (34, 35).
1.3.1.4 Gingipaínas
Las gingipaínas constituyen un grupo de endopeptidasas cisteína C25, responsables de
más del 85% de la actividad proteolítica y el 100% de la actividad llamada “actividad tipo
tripsina”. Estas enzimas son producto de tres genes (Figura 1): rgpA, rgpB y kgp,
reconocidas como gingipaína R y gingipaína K de acuerdo con su especificidad de
hidrólisis en residuos peptídicos donde encuentran Arginina o Lisina, Arg-Xaa o Lys-Xaa
respectivamente (36).
10 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
Figura 1. Productos de Transcripción y traducción de genes rgpA, rgpB y kgP de las gingipaínas.
Tomado de: Imamura. J Periodontol; 2003 (36).
Estos tres genes se encuentran presentes en todas las cepas de P. gingivalis y son
considerados constitutivos, dan origen a 3 proteínas, la primera RgpA presenta un dominio
catalítico y un dominio hemaglutinina adhesina, RgpB que únicamente tiene un dominio
catalítico y por ultimo Kgp que al igual que RgpA presenta dominio catalítico y dominio
hemaglutinina adhesina. Los dominios hemaglutinina adhesina de RgpA y Kgp presentan
una homología entre sí, que varía entre el 97 a 98% en la mayoría de las regiones y solo
46% de homología con la región HA1 (36, 37).
Los dominios catalíticos de RgpA y RgpB son homólogos (89%), lo que podría indicar que
estas dos proteínas cumplen funciones muy similares y que la ausencia de alguna de las
dos en cepas mutantes no generaría ningún cambio en el metabolismo de la misma ni en
su capacidad patogénica, sin embargo, diferentes estudios confirman que cepas mutantes
para el gen rgpA presentan restricción en su crecimiento y menor virulencia (36-38). La
capacidad proteolítica de las gingipaínas sobre diferentes sustratos como: benzoilarginina-
2-naptilamida (BANA), NCBZ- GLY-GLY-ARG- clorohidrato de 7-amido-4-metil coumarina
(CAAM) ha hecho que se les conozca como enzimas similares a tripsina y se ha empleado
esta característica para la confirmación de P. gingivalis en el laboratorio (38, 39).
Capítulo 1 11
1.3.1.4.1 Funciones de las gingipaínas
Las gingipaínas tienen como una de sus principales funciones la degradación de proteínas,
ya que el metabolismo de esta bacteria es dependiente de la hidrólisis de proteínas.
Además, están implicadas en el secuestro de hemoglobina, hemaglutinación,
neutralización y variaciones del sistema inmune por degradación proteolítica de citocinas
anti-inflamatorias y activación de citocinas proinflamatorias como IL-1, IL-6 IL-8 y TNF-α
activadoras de osteoclastogénesis, lo cual favorece a la destrucción del tejido periodontal.
También participan en la formación de biofilm oral, estas parecen ser fundamentales en la
comunicación entre las bacterias y la adhesión gracias a su dominio hemaglutinina-
adhesina y se ha demostrado que la expresión de estas proteasas aumenta cuando P.
gingivalis está en coagregación con otras bacterias como T. forsythia, T. denticola, F.
nucleatum y P. intermedia (39). Estas están involucradas en la adhesión de P. gingivalis a
las células endoteliales antes de la invasión. Existen estudios que plantean la posibilidad
de usar estas gingipaínas como blanco terapéutico para la bloquear la acción proteasa y
por consiguiente impedir la invasión de este microorganismo tanto en el tejido periodontal
como en placas ateromatosas (40, 41).
Así mismo, la formación de células espumosas por adición de colesterol LDL
(Lipoproteínas de baja densidad) puede ser estimulada por P. gingivalis, ya que este
microorganismo tiene la capacidad de alterar la movilidad de esta molécula, facilitando de
esta manera su agregación en los macrófagos. Cuando se evalúan cepas mutantes para
proteasas Kgp y Rgp está agregación se ve inhibida, lo cual lleva a pensar que estas
proteasas son modificadoras de la movilidad del LDL, debido a que las gingipaínas tienen
la capacidad de degradar la apo B-100, uno de los mayores componentes de las partículas
de LDL. La proteólisis de esta proteína altera la carga de las partículas afectando la
movilidad del LDL, favoreciendo su agregación en los macrófagos y posteriormente la
formación de placas ateromatosas (42). Además, las gingipaínas se han caracterizado por
estimular la respuesta inmune innata, degradar componentes del complemento, péptidos
antibacterianos, citocinas y quimiocinas evitando así la resolución de la infección y
favoreciendo la cronicidad (43).
12 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
1.3.2 Vesículas de membrana externa (OMV)
Las OMV, son nano estructuras membranosas asimétricas, que han sido descritas en
Archaeas, bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas (44). Las bacterias Gram
negativas producen naturalmente OMV. Estas se componen de una sola membrana que
deriva de la membrana externa y contienen tanto proteínas de membrana externa como
LPS, y otros lípidos, mientras que el lumen de la vesícula contiene principalmente proteínas
del periplasma que en su mayoría son importantes factores de virulencia involucrados en
la adherencia bacteriana, defensa contra los factores del hospedador o enzimas entre otros
(45).
1.3.3 Vesículas de membrana externa de P. gingivalis
Las vesículas de este microorganismo son consistentes con vesículas de otras bacterias
Gram negativas, tienen un diámetro entre 50 y 250 nm (figura 2) y se producen a manera
de ampollas en la superficie de la membrana externa de la bacteria (46, 47). Estudios han
demostrado que las vesículas sirven como un vehículo para el transporte de toxinas,
enzimas proteolíticas, y adhesinas; esto se confirmó experimentalmente concluyendo que
pueden degradar diferentes sustratos como el colágeno, Azocoll, y N-alfa-benzoil-
DLarginine p-nitroanilida, y promueven la adhesión bacteriana entre dos especies
bacterianas no coagregantes como Capnocytophaga ochracea y Eubacterium saburreum
(47).
Actualmente son consideradas un sistema de secreción generalizado, altamente regulado
que puede proporcionar una matriz de efectores moleculares, incluidos los implicados en
las interacciones célula-célula, adquisición de nutrientes, desregulación y modulación
inmune del hospedador y formación del biofilm oral. Además, por su tamaño nanométrico
las OMV tienen la capacidad de diseminarse lejos de la célula permitiendo que las
bacterias sésiles asociadas a la biopelícula extiendan su espacio de influencia. Por lo tanto,
los OMV son importantísimos contribuyentes a la supervivencia y virulencia bacteriana y,
por lo tanto, de la patogenicidad (16).
La biogénesis de las vesículas de P. gingivalis puede ser explicada desde distintos
modelos (Figura 3). Un primer modelo apoya la idea de que la membrana externa
bacteriana es empujada hacia afuera a través de una fuerza física inducida por la
Capítulo 1 13
acumulación de proteínas de la envoltura sobre-expresadas (47). La segunda teoría
describe una interrupción en el vínculo existente entre la membrana externa y la capa de
peptidoglicano, lo que lleva a una liberación descontrolada de OMV. Esta suposición se
basó en la observación de que las deficiencias en varias proteínas implicadas en la
interconexión de la membrana externa y peptidoglicano tienen un impacto dramático en la
vesiculación; un ejemplo es la lipoproteína OPRI de 6,95 kDa descrita en P. aeruginosa y
también encontrada en P. gingivalis. OPRI es una proteína de membrana externa
abundante y parece interactuar de forma covalente con la capa de peptidoglicano. La
deleción del gen Opri mejora significativamente la vesiculación en P. aeruginosa, que
presumiblemente resulta en la pérdida de la inmovilización de la membrana externa con el
peptidoglicano (47).
Finalmente, la tercera teoría describe que la vesiculación puede resultar en un aumento de
la curvatura local de la membrana externa bacteriana. Este modelo se apoya en estudios
recientes que describen una molécula de señalización 2-heptil-3-hidroxi- 4-quinolona
(PQS) descrita por primera vez en P. aeruginosa. PQS parece ser necesaria y suficiente
para la formación de OMV a través de la interacción directa con la membrana bacteriana y
la expansión de la membrana externa, lo que aumenta la curvatura de la membrana y
conduce a la formación de vesículas (47).
Mantri et al.,2015 describieron que la vesiculación en P. gingivalis es dependiente de
fimbrias, al comparar vesículas secretadas por cepas con un alelo fimbrial tipo I (ATCC
33277), tipo III (ATCC 49417) y tipo IV (W83). Mediante microscopía electrónica de
transmisión, encontraron más OMV en las superficies de la cepa ATCC 33277 y ATCC
49417, que en la cepa W83, que se ha descrito como poco productora de fimbrias.
Curiosamente, cuando se introdujo un gen que codifica para fimbrias tipo IV en la cepa
ATCC 33277, la vesiculación fue similar entre la cepa parental y la cepa receptora, lo que
sugiere que el subtipo fimbrial está implicado en la biogénesis de vesículas (2048).
La evidencia actual indica que la biogénesis de OMV es un proceso estrictamente
controlado y regulado, que implica un gasto energético de la célula, por lo que no son
producidas al azar y son estrategias de evasión, adquisición de nutrientes y patogenicidad
importantes en la bacteria, aunque es probable que las vías específicas varíen entre filo,
géneros e incluso especies, aún hacen falta por dilucidar estas diferencias (16).
14 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
Actualmente se cree que un aumento de la curvatura local de la membrana externa (~ 14
veces) indica que la biogénesis de OMV requiere un gasto de energía para una curvatura
significativa de la membrana. En P. gingivalis se ha propuesto que esto se puede lograr
regulando positivamente la producción de ciertos lípidos de las caras internas o externas
de la membrana, lo que provoca la curvatura localizada hacia afuera de la membrana
externa. Esto da como resultado la selección de LPS aniónicos (A-LPS) y proteínas
extracelulares de la familia CTD asociadas en la superficie. La desacilación de A-LPS
puede permitir adicionalmente una mayor curvatura que conduzca a la formación de OMV
(44).
Figura 2. Modelo de biogénesis de vesículas de membrana externa de P. gingivalis. Tres modelos son presentados: (A) una fuerza física inducida por acumulación de proteínas de la envoltura sobre-expresada. (B) interrupción del vínculo existente entre la membrana externa y la capa de peptidoglicano (C) aumento de la curvatura local de la membrana externa bacteriana potenciado por señales extracelulares como PQS: Xie H. Future Microbiol, 2015 (47).
1.3.3.1 Composición de las OMV de P. gingivalis
Estudios recientes utilizando herramientas proteómicas han demostrado que las vesículas
de P. gingivalis pueden actuar como intermediarios que llevan una amplia variedad de
factores de virulencia proporcionadas por sus células parentales. En las vesículas se
encuentran los factores de virulencia presentes en la membrana externa de esta bacteria
incluyendo LPS, FimA, Mfa1, HagA, Kgp, RgpA, y RgpB. Algunos de estos factores de
virulencia fueron encontrados en mayor proporción en vesículas comparado con los niveles
encontrados en células intactas y se ha reportado una mayor cantidad (3-5 veces) de
gingipaínas en las vesículas comparadas con la cantidad observada en los extractos de la
superficie de esta bacteria (20). En la tabla 1, se describen las proteínas presentes en las
Capítulo 1 15
vesículas de P. gingivalis ATCC 33277 y W83, donde se destacan las gingipaínas como
las más abundantes (20).
Tabla 1. Proteínas identificadas en las OMV de P. gingivalis de las cepas ATCC 33277 y W83. (Las proteínas resaltadas en negrilla fueron las más abundantes). Modificado de: Mantri et al.,
Microbiology Open 2015 (20).
Rank P. gingivalis ATCC 33277 P. gingivalis W83
1 Lys-gingipaína, kgp Arg-gingipaína, RgpA
2 Arg-gingipaína, RgpA Receptor antígeno A, RagA
3 Sistema de secreción Por ( PorV) Sistema de secreción Por (PorV)
4 Arg-gingipaína, RgpA Arg-gingipaína, RgpB
5 Receptor antígeno A, RagA Receptor antígeno B, RagB
6 Peptidilarginina deiminasa Peptidilarginina deiminasa
7 Proteína Hemaglutinina, HagA Proteína Hemaglutinina, HagA
8 Proteína de subunidad fimbrial tipo-1
Fim A
Antígeno Inmunoreactivo de 61
kDa
9 Receptor antígeno B, RagB Proteína no caracterizada (PG_1823,
PGN_1744)
10 Antígeno Inmunoreactivo 61 kDa Carboxipeptidasa putativa de Zinc
11 Proteína no caracterizada (PGN_1744) Proteína no caracterizada
12 Fimbrilina, Mfa1 Proteína no caracterizada (PG_1626,
PGN_0477)
13 Lipoproteína putativa Lipoproteína putativa
14 Carboxipeptidasa putativa de Zinc Proteína de unión a hemina 35 kDa
15 Antígeno inmunoreactivo 23 kDa Proteasa extracelular putativa
16 Proteína no caracterizada (PGN_0477) Antígeno inmunoreactivo 47 kDa
17 Antígeno inmunoreactivo 47 kDa Proteína no caracterizada
18 Proteína de unión a hemina 35 kDa Proteína no caracterizada
19 Proteína putativa no caracterizada Proteína de unión a hemina FetB
20 Proteasa extracelular putativa Proteína de membrana externa 41
16 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
1.3.3.2 Función de las OMV de P. gingivalis
Se ha sugerido que el aumento de la antigenicidad encontrado en las vesículas podría ser
a causa de una mayor concentración de factores de virulencia en las vesículas que en la
superficie de P. gingivalis. Las OMV liberadas al espacio extracelular, son capaces de
penetrar una mucosa intacta y entrar a los tejidos subyacentes del hospedador liberando
todos los componentes antigénicos que trae consigo favoreciendo la progresión de la
infección (14).
Los OMV de P. gingivalis que se enriquecen selectivamente en proteínas de la familia CTD
como las gingipaínas, favorecen la coagregación bacteriana promoviendo el desarrollo de
biopelículas. También se cree que las OMV de P. gingivalis contribuyen a la interacción y
colonización del hospedador, a la evasión de los mecanismos de defensa inmunitaria y a
la destrucción de los tejidos periodontales. Las OMV pueden ser cruciales para la captura
de micronutrientes y macronutrientes, especialmente el hemo y probablemente otros
compuestos asimilables para su propio beneficio y el de la comunidad de biofilm en general
(44). Recientemente se demostró el mecanismo de endocitosis de las OMV de P. gingivalis
en células epiteliales gingivales y se observó que este proceso es dependiente de fimbrias,
además de actina y Rac1, y que una vez internalizadas, estas son enviadas al endosoma
temprano, donde son capaces de degradar proteínas de la célula como el receptor
intracelular de transferrina, importante para el trasporte y metabolismo del hierro, lo que
induce alteraciones de la función celular como síntesis de DNA y la mayoría de actividades
dependientes de ATP (13, 20). Después de la internalización, las OMV son distribuidas en
compartimientos lisosomales, donde son degradadas por la maquinaria celular y varios
antígenos pueden ser reconocidos y procesados por las células presentadoras de
antígenos, lo que conduce a la inducción de la inmunidad adaptativa incluyendo la
producción de anticuerpos (13).
Furuta et al., 2009 evaluaron la actividad proteolítica de las OMV frente a sustratos para
gingipaínas R y gingipaínas K confirmando que en estas vesículas hay gran actividad
mediada por estas enzimas (48). Sin embargo, el papel de OMV de P. gingivalis en la
inmunopatología y la inmunogenicidad durante el desarrollo de las enfermedades
periodontales en humanos no se ha descrito y el mecanismo por el cual estas vesículas
Capítulo 1 17
son capaces de inducir cambios en la función de células de la respuesta inmune innata no
es claro.
1.3.3.3 Cambios de respuesta inmune por OMV de P. gingivalis
Si bien la inflamación es un componente importante de la defensa del hospedador, la
inflamación persistente y desregulada proporciona un entorno nutricionalmente favorable
para las bacterias en la bolsa periodontal responsables en gran medida de la destrucción
ósea y tisular que caracteriza a la periodontitis (49).
Diferentes estudios han investigado el papel potencial de los OMV en la respuesta inmune
del hospedador y la destrucción del tejido durante la infección por P. gingivalis (12,14, 50).
En primer lugar estudios en sueros de pacientes con periodontitis se reportó que tenían
una reactividad fuerte contra OMV; por otra parte, cuando se adicionan OMV a una
monocapa de una línea de células epiteliales escamosas orales, las OMV provocan
desprendimiento de células, lo cual fue corroborado al pre-incubar las OMV con antisuero
anti-gingipaína el cual bloqueo la acción de las vesículas, indicando adicionalmente que
las gingipaínas derivadas de OMV tienen un efecto proteasa fuerte en la actividad de la
vesícula y sugiriendo que pueden contribuir a la destrucción del tejido periodontal al servir
como un vehículo para los antígenos y proteasas activas. (12).
Además, las OMV de P. gingivalis han sido evaluadas en células epiteliales gingivales
humana (HGE), para determinar su efecto sobre la expresión de ARNm de COX-2, IL-6,
IL-8, MMP-1 y MMP-3 (51); en línea celular de carcinoma de células epiteliales escamosas
(HSC-2), para evaluar el efecto citotóxico y de desprendimiento de células en cultivo
cuando están expuestas a las vesículas (12); en células endoteliales de vena umbilical
humana (HUVEC), utilizadas para evaluar su habilidad para promover la inflamación y su
efecto sobre la biosíntesis de moléculas de adhesión (E-selectina, ICAM-1 y glicoproteínas
como MHC-II) (52); en línea celular de macrófago de ratón (RAW264), para evaluar su
capacidad de inducir la producción rápidamente ON por las células (53).
Duncan et al., (2004) confirmaron en la línea celular mielomonocítica humana (U937) que
las vesículas contribuyen a la pérdida del receptor CD14 para LPS y que las gingipaínas
son las responsables de esta degradación. Este fenómeno, fue confirmado con vesículas
de cepas mutantes P. gingivalis deficiente de gingipaínas (54).
18 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
Las OMV de P. gingivalis también pueden persistir dentro de los lisosomas de las células
hospedadoras y son potentes activadores de los receptores Toll-like (TLR) (55). Un estudio
reciente reportó que la capacidad de P. gingivalis para alterar la respuesta inmune local
se debía a la hipo-respuesta que inducen las OMV en los monocitos, favoreciendo que
estos no respondan a la infección por P. gingivalis viva (56).
Se sabe que los monocitos y los macrófagos son las principales células de la respuesta
inmune del hospedador a la infección bacteriana a través de la fagocitosis, la presentación
del antígeno y la producción de citoquinas. Las biopsias de tejido gingival de pacientes con
periodontitis han mostrado un número elevado de macrófagos y concentraciones más altas
de óxido nítrico sintasa y citocinas proinflamatorias, que sirven para promover la
inflamación y reclutar células inmunitarias adicionales al sitio de la infección (49). Se sabe
que las OMV bacterianas se unen a las células de mamíferos y se internalizan
rápidamente, por lo que entregarían Patrones Moleculares Asociados a Patógenos
(PAMPs) tanto a la superficie celular como a los receptores citosólicos, modulando en las
células que se internaliza la funcionalidad y respuesta de las misma a la infección por P.
gingivalis (49).
Se ha establecido que P. gingivalis tiene un mecanismo para clasificar selectivamente
proteínas en OMV, lo que resulta en el empaquetado preferencial algunos factores de
virulencia en OMV y la exclusión de muchas proteínas de membrana externa de la carga
de proteína. La existencia de un proceso para empaquetar factores de virulencia
específicos en OMV puede alterar significativamente la comprensión actual de las
interacciones hospedador-patógeno (57).
2 Metodología
Para cumplir el objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos:
1. Obtener y purificar las vesículas de membrana externa de P. gingivalis W83 y P.
gingivalis ATCC 33277.
2. Evaluar los niveles y expresión de citocinas proinflamatorias en macrófagos
cultivados y estimulados con vesículas de membrana externa de P. gingivalis.
3. Evaluar el efecto de la inhibición de gingipaínas y lipopolisacárido de vesículas
extracelulares de P. gingivalis en la expresión de citocinas en proinflamatorias en
macrófagos.
La metodología a continuación descrita permitió cumplir los objetivos propuestos.
2.1 Cultivo bacteriano de P. gingivalis ATCC 33277 y P. gingivalis W83 y obtención de pre-inóculos
Cepas de P. gingivalis ATCC 33277 y P. gingivalis W83 fueron descongeladas del cepario
del Laboratorio de Microbiología Oral del Instituto UIBO, conservadas en caldo BHI (Brain
Heart Infusion) con 10% de glicerol a -80°C y cultivadas en agar Brucella suplementado
con (0.3% de Bacto agar, 0.2% de extracto de levadura, 5% de sangre de cordero, 0.2%
de sangre hemolizada, 0.0005% de hemina y 0.00005% menadiona) y fueron incubadas a
37°C durante 4 días en condiciones anaeróbicas (Anaerogen, Oxoid, Hampshire, UK).
Pasado el tiempo de incubación se verificó pureza de los cultivos y posteriormente se
ajustaron pre-inóculos bacterianos de P. gingivalis ATCC 33277 y P. gingivalis W83 en
caldo BHI y se cuantificaron por espectrofotometría a una longitud de onda () de 620 nm
y estandarizados a una densidad óptica (DO) de 0.970 – 0.972 para P. gingivalis W83 y
DO: 1.000-1.008 para P. gingivalis ATCC: 33277 con el fin de obtener recuentos lo más
similares posibles entre las dos bacterias (>1 x 108 bacterias/mL) y de esta manera
asegurar las mismas condiciones para las dos cepas a evaluar. 100 µL de cada suspensión
20 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
previamente ajustada (pre-inóculo), fueron utilizados para hacer diluciones seriadas en
base 10 hasta la dilución -8. Se realizó el recuento del número de bacterias por mL de P.
gingivalis ATCC 33277 y W83, adicionalmente se calculó la concentración de proteínas del
pre-inóculo con ácido Bicinconínico (Pierce® BCA Solid, Thermo Scientific) usando una
curva de calibración con concentraciones conocidas de albumina sérica bovina como
patrón. 1mL del cultivo bacteriano restante fue conservado a -20°C para posteriores
pruebas. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.
2.1.1 Inóculos de P. gingivalis ATCC 33277 y W83
En experimentos independientes se estandarizaron los inóculos bacterianos, para los
cuales se partió del pre-inóculo ajustado previamente y 100 µL de cada suspensión
bacteriana fueron sembrados en 4 mL de caldo BHI suplementado con 5% de hemina y
5% menadiona e incubados en condiciones anaeróbicas, en agitación a 90 rpm durante 48
horas. A las 48 horas de incubación se tomó una alícuota de 100 µL de cada inóculo
bacteriano y se realizaron diluciones seriadas en base 10 para realizar el cálculo del
número de bacterias a las 48 horas de incubación (Inóculo final) y se obtuvieron alícuotas
para determinar límite de detección de actividad Arg-gingipaína.
2.1.2 Viabilidad bacteriana de inóculos de P. gingivalis ATCC 33277 y W83
Para confirmar adicionalmente el dato de los recuentos bacterianos a las 48 horas de
incubación y correlacionar con los recuentos obtenidos por plaqueo, se determinó la
viabilidad bacteriana del inóculo final con el kit comercial LIVE/DEAD™ BacLight™
Bacterial Viability Kit (Thermo Fisher), como lo hemos reportado previamente en Castillo
et al., 2015 (58).
2.1.3 Límite de detección de actividad de la proteasa (Rgp) en los pre-inóculos e inóculos de P. gingivalis
De los pre-inóculos y los inóculos bacterianos con recuentos en UFC/mL previamente
estandarizados, se realizaron diluciones seriadas 1:2 hasta la dilución 1:4096. Se obtuvo
el límite de detección de la actividad Arg-gingipaína de cultivos de P. gingivalis (Pre-inóculo
e Inóculo de 48 horas) usando el sustrato fluorogénico Z-Gly-Gly-Arg 7-amido-4-
Capítulo 2 21
metilcoumarin hydrochloride (CAAM; Sigma) como lo describe previamente Nakagawa et
al., 2006 con modificaciones (59). El inóculo fue preparado a una concentración de 16nM
en 50mM de Buffer Tris HCl pH 8.0 y DMSO (Dimetilsulfóxido), en una relación de 10µL
de reactivo CAAM con 50 µL de muestra. Todos estos ensayos fueron realizados por
triplicado, en placas de 96 pozos oscuras de fondo claro e incubadas a 37°C durante 30
minutos, pasado el tiempo de incubación la reacción fue detenida con 40 µL de una
solución de parada que contiene 100 mM de buffer acetato de sodio pH: 5.0 y 10 mM de
ácido acético 4M. Las placas fueron leídas en un fotofluorómetro Infinite® 200 PRO Tecan,
una excitación: 380 nm y de emisión: 460 nm. Se obtuvieron las unidades de
fluorescencia, que fueron transformadas en unidades de actividad Rgp.
𝑨𝒄𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅 𝑹𝒈𝒑 =𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
µ𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
2.2 Obtención y purificación de OMV P. gingivalis
La preparación y purificación de las vesículas fue realizada como lo describe previamente
Furuta et al., 2009b con modificaciones (48). 100 µL de pre-inóculos previamente ajustados
para cada una de las bacterias fueron sembrados en 4 mL de caldo BHI suplementado con
hemina y menadiona e incubados en agitación a 90 rpm durante 48 horas. Transcurrido
este tiempo a cada cultivo se le adicionaron 40 µL del coctel inhibidor de proteasas 100X
(Protease Inhibitor Cocktail for use with mammalian cell and tissue extracts-Sigma) y se
procedió a realizar dos ciclos de centrifugación a 1.600 gravedades durante 1 hora a 4°C
cada ciclo. El sobrenadante obtenido libre de bacterias fue filtrado a través de filtros de
membrana en esteres de celulosa con un tamaño de poro de 0,22 µm (Millipore), para
remover bacterias residuales.
El sobrenadante filtrado, fue utilizado para la obtención de vesículas por ultra
centrifugación a 100.000 g durante 1 hora en una Ultracentrífuga (OptimaTM MAX-TL-
Ultracentrífuga (Beckman Coulter)) a 4°C. El pellet final de la ultra centrifugación fue
resuspendido en 50 µL de Tris-HCl 20 mM pH: 8.0 con 10% de glicerol y conservadas a -
20°C hasta su uso.
La concentración de proteínas totales de las OMV fue cuantificada con ácido Bicinconínico
(Pierce® BCA Solid, Thermo Scientific) usando una curva de calibración con
concentraciones conocidas de albumina sérica bovina como patrón. El perfil proteico de
22 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
las OMV fue evaluado mediante SDS–PAGE (Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel
electrophoresis) al 14% usando un extracto sonicado de células completas de P. gingivalis
W83 y 33277 como control positivo (59), PBS + 10% de glicerol como control negativo y
se incluyó un segundo control negativo con caldo BHI. Los geles fueron separados en un
equipo Mini Protean electrophoresis (Bio-Rad, Vienna, Austria) y las proteínas se tiñeron
con coloración de plata. Los perfiles electroforéticos fueron comparados con los reportados
previamente por Veith et al., 2014 y Mantri et al., 2015 (45,20).
2.2.1 Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) para OMV de P. gingivalis
Para evaluar la integridad de las vesículas después de su obtención por ultracentrifugación,
se realizó TEM, usando el Microscopio Electrónico Digital de Transmisión Marca: FEI;
Modelo: TECNAI 20 Twin - 200Kv. Se obtuvieron imágenes de OMV purificadas de las dos
bacterias usando un pool representativo de 4 lotes de vesículas obtenidos en diferentes
momentos y conservados durante un mes a -20°C.
2.2.2 Límite de detección de actividad proteasa de las OMV de P. gingivalis
El límite de detección de actividad Rgp de las vesículas de P. gingivalis ATCC: 33277 y P.
gingivalis W83 fue determinada de la misma manera como fue realizada con bacteria
completa usando el sustrato fluorogénico Z-Gly-Gly-Arg 7-amido-4-metilcoumarin
hydrochloride (CAAM; Sigma) como lo describe previamente Nakagawa et al., 2006 (59).
2.3 Cultivo celular de monocitos U937 ATCC® CRL1593.2™
Una línea celular de monocito U937 ATCC® CRL1593.2™ donada por el Instituto de
Virología de la Universidad El Bosque, fue cultivada como lo describe Sekot et al., 2011
con modificaciones (60). Las células fueron mantenidas en medio RPMI-1640 (1X) con L-
Glutamina (GIBCO) suplementado con 10% de suero fetal bovino (GIBCO) y 1% de una
mezcla de antibiótico-antimicótico (100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de Estreptomicina
y 0, 25 µg/mL de Anfotericina B Thermo Fisher Scientific) a 37°C en una atmosfera con 5%
Capítulo 2 23
de CO2 y humedad relativa del 90%. Los cultivos fueron mantenidos por adición de medio
fresco cada 3 días con el fin de mantener una densidad celular entre 1 X 105 y 2 X 106
células /mL, siguiendo las recomendaciones de la ATCC, todos los experimentos se
realizaron al tercer pase.
2.3.1 Diferenciación de monocito U937 a macrófago
Para inducir la diferenciación de monocitos U937 a macrófagos adherentes, se sembraron
150.000 células por pozo en placas de 24 pozos a un volumen final de 500 µL y una
concentración de 200ng/mL de PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate (Sigma)) como
agente diferenciador, la concentración fue definida después de un proceso de
estandarización (datos no mostrados). Las células fueron incubadas por 72 horas a 37°C
en una atmosfera con 5% de CO2 y humedad relativa del 90%. Después de la incubación,
se realizó un recambio de medio, adicionando a las células medio libre de PMA e
incubando nuevamente durante 24 horas.
Después de 24 horas de incubación de las células con medio libre de PMA, se retiró el
medio y se agregó medio fresco, se verificó la adherencia de las células a la placa y el
cambio de tamaño y morfología celular para confirmar la diferenciación celular.
2.4 Evaluación de la viabilidad de macrófagos-U937 estimulados con P. gingivalis
Se determinó la viabilidad de las células infectadas con diferentes multiplicidades de
infección (MOI) de P. gingivalis W83 y 33277 así como con diferentes concentraciones de
lisado celular y OMV con el fin de definir la concentración de bacterias, lisado y vesículas
a la que se obtendría un efecto importante sin daño de la célula. Para ello se realizó el
protocolo de viabilidad celular con el método resazurina, como lo describe Riss et al., 2011,
con modificaciones. Las células viables con metabolismo activo pueden reducir la
resazurina en el producto de resorufina, que es de color rosado y fluorescente (61). Para
este fin macrófagos-U937 fueron estimulados con P. gingivalis W83 y 33277 a una MOI:
10, 50, 100 y 200 y lisado celular o vesículas a 20 μg/mL durante 30 minutos, 1 hora, 2
horas, 3 horas, 6 horas, 12 horas y 24 horas. Posterior al tiempo de estímulo, este fue
retirado y las células fueron lavadas con PBS apirogénico, se usaron como control
macrófagos -U937 sin tratamiento. Resazurina a una concentración de 4,4 μM fue
24 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
adicionada en cada pozo. Se realizó observación del cambio de color de morado a rosado
a partir de la hora de contacto de las células con el reactivo, las placas fueron leídas en un
fotofluorómetro Infinite® 200 PRO Tecan, una excitación: 535 nm y de emisión: 630
nm. Se obtuvieron las unidades de fluorescencia, con las que se calculó el porcentaje de
viabilidad de las células estimuladas comparadas con las células sin estímulo. Todos los
experimentos fueron realizados por triplicado.
2.5 Modelo de infección de macrófagos - U937 con OMV de P. gingivalis
La estimulación de macrófagos con OMV se realizó como lo describe Friedrich et al., 2015
con modificaciones (62). Los macrófagos adherentes sembrados en placas de 24 pozos a
una densidad de 150.000 células por pozo en un volumen de 500 μL RPMI-1640 fueron
estimulados con OMV y lisados celulares de P. gingivalis W83 y 33277 a una concentración
de 20 μg/mL y con bacteria completa a MOI: 100, durante 30 min, 2 horas, 6 horas y 24
horas. Posterior a cada tiempo de estímulo, el estímulo fue retirado y las células lavadas 2
veces con PBS 1X para adicionarles medio fresco. 24 horas después, fueron colectados
los sobrenadantes para evaluación de niveles solubles de citocinas mediante citometría de
flujo, las células fueron desprendidas y conservadas en Trizol® (Invitrogen) a -80oC para
extracción de RNA y determinación de la expresión genes de citocinas y quimiocinas, se
realizaron tres replicas biológicas para todos los experimentos y se incluyeron células sin
estímulo como control.
2.5.1 Evaluación de los niveles solubles de citocinas por citometría de flujo
Sobrenadantes de cultivo después de cada uno de los tiempos de estímulo, fueron
utilizados para determinar los niveles solubles de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, RANTES, MCP-
1 y MIP-1α por citometría de flujo usando el panel de citocinas proinflamatorias (Human
inflammation panel Cat. No. 740118 LEGENDplex (Multi-Analyte Flow Assay Kit)
BioLegend) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Este es un inmunoensayo
basado en perlas, que utiliza los mismos principios básicos de los inmunoensayos tipo
sándwich, mediante el cual se captura un analito soluble entre dos anticuerpos. Cada
conjunto de perlas está conjugado con un anticuerpo específico en la superficie y sirve
Capítulo 2 25
como base de captura para ese analito en particular. Los anticuerpos de detección
biotinilados y cada anticuerpo de detección se unen a su analito específico unido a las
perlas de captura, formando así sándwiches de captura de perlas, analitos y anticuerpos
de detección. Posteriormente, se agrega estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE), que se unirá
a los anticuerpos de detección biotinilados, proporcionando una señal fluorescente con
intensidades en proporción a la cantidad de analito unido (Información disponible en página
web https://www.biolegend.com/legendplex). Para cada población de perlas, la intensidad
de fluorescencia de la señal de PE fue cuantificada utilizando un citómetro de flujo (BD
Accuri™ C6). La concentración particular de cada analito se determinó en base a una curva
estándar conocida usando el software de análisis de datos LEGENDplex ™.
2.6 Evaluación de la expresión de citocinas proinflamatorias por macrófagos-U937 estimulados con OMV de P. gingivalis W83 y 33277
La monocapa celular fue utilizada para extracción de RNA usando Trizol® (Invitrogen), se
realizó tratamiento con DNase (Promega); retro-transcripción y síntesis de cDNA usando
M-MLV Reverse Transcriptase (Promega) y posteriormente qPCR usando el kit Precision
Melt Supermix for High Resolution Melt (HRM) Analysis (BIORAD). Se determinó la
expresión relativa de ARNm en los diferentes tiempos de estímulo para TNF-α, IL-1β, IL-
6, IL-8, RANTES, MCP-1 y MIP-1α, usando β-actina como housekeeping. En la tabla 2, se
muestran las secuencias de primer utilizadas para la determinación de expresión de las
citocinas, los primers para MIP-1α y β-actina fueron diseñados en este estudio usando el
software Beacon Designer 8, PREMIER Biosoft International. Las muestras fueron
amplificadas en un termociclador BioRad CFX96, las concentraciones y secuencias de los
primers se muestran en la tabla 2. El protocolo de amplificación consistió en un ciclo inicial
de 95°C por 3 minutos, posteriormente 40 ciclos de 95°C 30 segundos y 62°C 1 minuto. La
expresión génica fue calculada usando la fórmula descrita por Schefe et al, 2006 (63).
26 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
Tabla 2. Secuencias de primer y concentración utilizadas para detección de citocinas
2.7 Evaluación del efecto de la inhibición de gingipaínas y LPS de OMV en los niveles y expresión de citocinas en proinflamatorias
Ensayos independientes fueron realizados con macrófagos co-cultivados con vesículas,
lisados celulares o bacteria viva de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 pre-tratados durante
5 minutos a 37°C con inhibidores específicos como lo describe Kadowaki et al., 2004 con
modificaciones (67). Los estímulos fueron bloqueados con 3 tipos de sustancias
inhibidoras, grupo I: inhibidor específico de gingipaínas Rgp [KYT-36: Carbobenzoxy Glu
(NHN (CH3) Ph)-Lys-CO-NHCH2Ph], grupo II: inhibidor específico de gingipaínas Kgp
[KYT-1: Carbobenzoxy-Lys-Arg-CO-Lys-N-(CH3)2) (Peptanova)] usados a una
concentración final de 10-4 M; y un tercer grupo inhibidor de LPS (InvivoGen) a una
concentración final de 100 μg/mL.
De esta manera se determinó el efecto que tienen estos factores de virulencia encontrados
en vesículas con la actividad biológica de las OMV en macrófagos, determinando niveles
solubles de citocinas por citometría de flujo y expresión relativa de genes para cada una
de las citocinas evaluadas a los 30 minutos y 6 horas de estímulo de macrófagos. Se
realizaron experimentos por triplicado de cada ensayo y cada grupo evaluado fue
comparado con los ensayos previos sin inhibidores, con células sin estímulo o estimuladas
Gen Tamaño
(Pb)
Concentració
n final Primer Secuencia de primers Referencia
IL-6 86 0,60 µM F: 5´-GGCACTGGCAGAAAACAACC-3´ R: 5´-GGCAAGTCTCCTCATTGAATCC-3´
Scheres et al., 2010 (64)
IL-8 119 0,45 µM F: 5´-GCGCCAACACAGAAATTATTGTAA-3´ R: 5´- TTATGAATTCTCAGCCCTCTTCAA-3´
Tong et al., 2001 (65)
IL-1 β 101 0,60 µM F: 5´-CTTTGAAGCTGATGGCCCTAAA-3´ R: 5´- AGTGGTGGTCGGAGATTCGT-3´
Scheres et al., 2010 (64)
TNF-α 84 0,30 µM F: 5´-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3´ R: 5´- ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3´
Stordeur et al., 2002 (66)
MCP-1 103 0,30 µM F: 5´-CAGCCAGATGCAATCAATGC-3´ R: 5´- TGCTGCTGGTGATTCTTCTATAGCT-3´
Scheres et al., 2010 (64)
MIP-1 α 88 0,45 µM F: 5´-TCAGACTTCAGAAGGACACGG-3´ R: 5´- GAGCAGGTGACGGAATGTGG-3´
Este estudio
RANTES 105 0,30 µM F: 5´-CATCTGCCTCCCCATATTCCT-3´ R: 5´- TGCCACTGGTGTAGAAATACTCCTT-3´
Scheres et al., 2010 (64)
β –actina 90 0,45 µM F: 5´-GGATGCAGAAGGAGATCACTG-3´ F: 5´- CGATCCACACGGAGTACTTG-3´
Este estudio
Capítulo 2 27
con el vehículo Dimetilsulfóxido (DMSO) al 1%, utilizada para la solubilización de los
inhibidores KYT-1 y KYT-36.
2.8 Plan de análisis
Se utilizó ANOVA factorial, con el fin de evaluar el efecto individual de cada uno de los
grupos de tratamiento (variables independientes) ajustado al tiempo y a la interacción
tiempo tratamiento sobre los niveles y expresión de citocinas proinflamatorias (variable
dependiente).
Para los ensayos de qPCR, se empleó el cálculo de expresión relativa génica (GED-Gene
Expression’s CT Diference) (64).
Se utilizó el paquete estadístico STATA versión 12 para Windows, todos los análisis se
realizaron con un nivel de significancia del 5%.
3 Resultados
3.1 Recuentos bacterianos del pre-inóculo e inóculos P. gingivalis ATCC 33277 y W83
En la tabla 3 se muestran los resultados de los promedios en logaritmo base 10 de los
recuentos del pre-inóculo de P. gingivalis en ensayos por triplicado para P. gingivalis ATCC
33277 y para P. gingivalis W83, donde se logró estandarizar a densidades ópticas
diferentes para cada bacteria, recuentos similares y reproducibles entre experimentos. De
esta manera fueron normalizados los resultados de todos los ensayos debido a que las
dos bacterias exhiben patrones de crecimiento diferentes.
Tabla 3.Promedios de recuentos de P. gingivalis ATCC: 33277 y P. gingivalis W83 expresados en
Log 10.
En el inóculo bacteriano, también se estandarizó el recuento de UFC/mL después de 48
horas de incubación a 37°C en agitación a 90 rpm en condiciones anaeróbicas. Con el fin
de tener un dato normalizado de la obtención de OMV a partir de dos cepas de P. gingivalis
que parten de un cultivo (pre-inóculo) con concentraciones bacterianas idénticas. En la
tabla 4, se muestran los resultados de los promedios en logaritmo base 10 los recuentos
del inóculo de 48 horas de P. gingivalis en ensayos por triplicado evaluados a una longitud
de onda () de 620 nm.
Bacteria DO 620 nm
Promedio de
UFC en Log 10 ±
(DE)
Promedio UFC
/mL CV
P. gingivalis ATCC: 33277 1.000-1.008 7,49 ± (0.04) 31000000,0 0,591
P. gingivalis W83 0.970-0.972 7,54 ± (0.02) 35000000,0 0,218
30 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
Tabla 4. Promedios de recuentos del inóculo de P. gingivalis ATCC: 33277 y P. gingivalis W83 expresados en Log 10.
Se puede observar que a partir de un pre-inóculo que estaba a una concentración de
31.000.000,0 UFC/mL para P. gingivalis ATCC 33277 y de 35.000.000,0 UFC/ mL para P.
gingivalis W83, se tomaron 100 μL de estas bacterias para ajustar el inóculo final y a las
48 horas de incubación se obtuvo un recuento bacteriano mayor en la cepa de P. gingivalis
W83 (89.666.667 UFC/mL) que P. gingivalis 33277 (26.666.667 UFC/mL) aun cuando las
dos bacterias son de la misma especie y además iniciaron el cultivo a partir de un pre-
inóculo con iguales concentraciones para las dos, lo cual también indica que las dos
bacterias tienen una tasa de crecimiento distinto que puede influir al final cuando se
analizan efectos de las bacterias en modelos in vitro.
Los resultados de los recuentos de los inóculos bacterianos, fueron corroborados con
experimentos de viabilidad bacteriana, las imágenes obtenidas de células vivas
(Fluorescencia verde) y muertas (fluorescencia roja), fueron procesadas en el software
ImageJ (NIH). Se determinó el porcentaje de viabilidad para P. gingivalis W83 (95%) y P.
gingivalis ATCC 33277 (92%) a las 48 horas de incubación.
Estos resultados son congruentes con los recuentos bacterianos obtenidos por plaqueo de
los mismos inóculos, donde se determinó que el crecimiento bacteriano de P. gingivalis
W83 fue mayor comparado con P. gingivalis 33277 y los resultados de los recuentos no
son producto de la muerte de bacterias durante el manejo microbiológico, la tasa de muerte
en estos inóculos fue muy baja, y los porcentajes de muerte son los normales de cualquier
manejo de cultivos bacterianos.
Bacteria DO 620 nm Promedio de UFC en Log 10 ± (DE)
Promedio UFC /mL
CV
P. gingivalis ATCC 33277
1,430 ± 0,004
7,421 ± 0,08
26666667 1,098
P. gingivalis W83 1,626 ± 0,004 8,000 ± 0,00 89666667 0,035
Capítulo 3 31
3.2 Actividad de la Arg-gingipaína Rgp en los Pre-inóculos e inóculos de P. gingivalis
Fue determinado el límite de detección de actividad Arg-gingipaína con el sustrato
fluorogénico en la última dilución a la que se comprobó actividad enzimática diferente con
respecto a la dilución anterior (p<0,05). Los resultados son presentados en actividad Rgp
específica por cantidad de proteína y en UFC/mL. La tabla 5, muestra los resultados del
límite de detección de actividad enzimática en pre-inóculos e inóculos bacterianos de P.
gingivalis W83 y 33277, como método de seguimiento de la actividad Arg-gingipaína en
cultivos de P. gingivalis que fue también utilizado para la detección de actividad enzimática
en OMV.
Se logró establecer una actividad específica Rgp de 67,49 y 18,80 Unidades de
Fluorescencia (UF) por cada 50µg de proteína en el pre-inóculo de P. gingivalis 33277 y
W83 respectivamente. Esta actividad fue mayor en los inóculos a las 48 horas de
incubación con valores de 62.138,34 y 3.881,12 UF/50µg de proteína para P. gingivalis
33277 y W83 respectivamente, dato que es congruente con los recuentos bacterianos a
las 48 horas. P. gingivalis 33277 es la bacteria en donde se detecta mayor actividad Rgp
y este dato se mantiene entre el pre-inóculo y el inóculo.
Tabla 5. Actividad Arg-gingipaína de pre-inóculo e inóculo de P. gingivalis
Bacteria Bacteria Dilución
(µg/50µL) UFC/mL
Promedio de
UF ± DE
Actividad
RgP
UF/50µg
CV
Pre-
inóculo
P. gingivalis 33277 1/128 [3,01] 227344 203,00 ± 25,0 67,49 13,00
P. gingivalis W83 1/128 [2,50] 234115 50,00 ± 2,0 18,80 4,00
Inóculo
48h
P. gingivalis 33277 1/1024 [0,234] 26042 291 ± 16,17 1265,21 6,00
P. gingivalis W83 1/256 [0,973] 175130 75,0 ± 6,36 77,08 8,40
32 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
3.3 Vesículas de membrana externa de P. gingivalis W83 y ATCC 33277
Después de la ultracentrifugación a 100.000g durante 1 hora, las vesículas fueron
resuspendidas en 50 µL de Tris HCl 20 mM pH: 8.0 con 10% de glicerol. 3 µg / µL de Pool
OMV fueron sembradas por pozo en un gel (SDS-PAGE) al 14%. En la figura 3 se puede
observar el perfil de bandeo de un pool de OMV de P. gingivalis ATCC 33277 (Carril 3) y
de P. gingivalis W83 (Carril 7) representativo de 4 lotes de OMV obtenidas en diferente
tiempo y conservadas a -20°C hasta su uso. Con este resultado se demuestra que el
proceso de obtención de OMV fue estandarizado y las proteínas derivadas de las vesículas
se encuentran integras y con un perfil de bandeo comparable con el reportado por otros
autores (19, 8).
Figura 3.SDS-PAGE de Pool OMV de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 (30 µg/pozo). Carril MP: (Protein Ladder 260 kDa); carril 1: Sonicado Pg 33277; carril 2: Sonicado Pg 33277 1/100; carril 3: OMV Pg 33277; carril 4: Sobrenadante de ultracentrifugación de Pg 33277; carril 5: Sonicado PgW83; carril 6: Sonicado PgW83 1/100; carril 7: OMV W83; carril 8: Sobrenadante de ultracentrifugación de Pg W83; carril 9: Caldo BHI ultracentrifugado.
Capítulo 3 33
3.3.1 Microscopia Electrónica de Transmisión de vesículas de membrana externa de P. gingivalis
Con el fin de determinar la integridad de las vesículas, como condición necesaria para el
uso de estas estructuras como estímulo en un modelo celular con macrófago-U937, un
pool de OMV representativo de cuatro lotes de OMV colectadas en tiempos diferentes, fue
analizando mediante microscopia electrónica de transmisión. En la figura 4A se pueden
observar vesículas purificadas de P. gingivalis como estructuras esféricas irregulares de
tamaño variable, congruente con lo reportado en la literatura, que describe el tamaño de
las OMV entre 50 y 250 nm. Así mismo se puede observar en la figura 4B una bacteria de
P. gingivalis con sus OMV libres en el medio circundante y adheridas a la membrana
externa de la bacteria. Con este resultado se confirma que el proceso de obtención de las
vesículas fue estandarizado y que las OMV se mantienen integras con el método de
conservación utilizado.
Figura 4. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) de vesículas purificadas de P. gingivalis (A) y Bacteria con vesículas de membrana externa (B).
3.3.2 Actividad Arg-gingipaína de vesículas de P. gingivalis
Se determinó el límite de detección de actividad Rgp con el sustrato fluorogénico CAAM.
En la tabla 6 se muestran los resultados de la actividad Arg-gingipaína de las OMV. En las
OMV de P. gingivalis W83 hubo actividad Rgp detectable hasta las dilución 1/32 con un
promedio de UF de73 y actividad específica de 23,36. Estos resultados confirman que en
las OMV hay actividad
34 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
Arg-gingipaína y esta es detectable hasta en concentraciones bajas de proteínas de
vesículas desde 0,02 µg/µL (3,13 µg/50µL).
Tabla 6. Límite de detección de actividad Arg-gingipaína de OMV de P. gingivalis
3.4 Diferenciación celular de Monocitos U937 a Macrófagos-U937
Ensayos de diferenciación celular fueron estandarizados con diferentes concentraciones
de PMA, con el fin de determinar cuál es la mejor concentración a la que se tiene una tasa
de diferenciación celular sin afectar la viabilidad de las células. Después de 72 horas de
incubación, se pudo determinar que a 200ng/mL es la mejor concentración de PMA, donde
se logró la diferenciación total de las células. Concentraciones de PMA de 100ng/mL
resultaron ser insuficientes para lograr una buena diferenciación celular y estabilidad en la
adhesión a las cajas de cultivo, debido a que después de 24 horas de incubación con
medio libre de PMA, las células se desprendieron; por otra parte, concentraciones de 400
y 800ng/mL de PMA resultaron muy agresivas para las células. En la figura 5 se muestran
fotografías tomadas a cajas de cultivo de una línea celular monocitica ATCC U937 sin PMA
y con PMA (200ng/mL) después de 72 horas de incubación a 37°C en una atmosfera con
5% de CO2 y humedad relativa del 90%.
Figura 5. Micrografía de un cultivo de monocito U937 (A) y Monocito U937 diferenciado a macrófago
con 200ng/mL de PMA (B).
OMV Dilución
(µg/50µL)
Promedio de
UF ± DE CV
Actividad RgP
UF/50µg
P. gingivalis ATCC 33277 1/8 (12,50) 365 ± 0,2 11,00 29,20
P. gingivalis W83 1/32 (3,13) 73 ± 0,1 15,00 23,36
Capítulo 3 35
3.5 Viabilidad celular de macrófagos U937 estimulados
Se determinó la viabilidad celular de macrófagos-U937 mediante el método de resazurina
y se definió como concentración final a utilizar 20 µg/mL tanto para lisado celular como
para OMV, la bacteria viva de P. gingivalis W83 y 33277 quedó definida a una MOI: 100
equivalente en concentración de proteínas a 4 mg/mL, lo que corresponde a 200 veces
mayor concentración de proteínas con respecto al lisado y vesículas. Los resultados se
muestran en la tabla 7 como porcentaje de viabilidad celular determinado con respecto a
células sin estímulo, el cual fue mayor al 90% en la mayoría de los tiempos con un rango
entre 93%-100% de viabilidad. Todos los datos corresponden al promedio de experimentos
por triplicado.
Tabla 7. Viabilidad de macrófagos U937 estimulados con lisado, bacteria o vesículas de P. gingivalis
3.6 Niveles solubles de citocinas proinflamatorias producidas por macrófagos-U937 estimulados
Se realizó una cinética de producción de citocinas y quimiocinas por macrófagos-U937
estimulados con lisado, bacteria y OMV de P. gingivalis W83 y ATCC 33277 a los 30
minutos, 2 horas, 6 horas y 24 horas, determinado los niveles de las citocinas
proinflamatorias IL-1β, TNFα, IL-6 (figura 6) y quimiocinas IL-8, RANTES, MCP-1 y MIP-
1α (figura 7) respectivamente, los resultados corresponden a de 3 réplicas biológicas. En
la figura 6A se presentan los resultados obtenidos de la cinética para IL-1 β, donde se
Tiempo de
estímulo
% de viabilidad P. gingivalis W83 % de viabilidad P. gingivalis
33277
Lisado
[20µ/mL]
Vesícula
[20µ/mL]
Bacteria
MOI 100
Lisado
[20µ/mL]
Vesícula
[20µ/mL]
Bacteria
MOI 100
30 min 95% 94% 96% 97% 98% 96%
1 Hora 96% 98% 96% 96% 92% 95%
2 Horas 97% 99% 100% 94% 83% 98%
3 Horas 83% 86% 95% 99% 84% 93%
6 Horas 93% 96% 95% 93% 98% 100%
12 Horas 100% 100% 94% 100% 100% 90%
24 Horas 100% 100% 94% 100% 100% 96%
36 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
puede observar que las OMV de P. gingivalis W83 y 33277 inducen aumento en los niveles
solubles de esta citocina a los 30 minutos (161 pg/mL; 232 pg/mL), a las 2 horas (234
pg/mL; 232 pg/mL), a las 6 horas (292 pg/mL; 291 pg/mL) y 24 horas (278 pg/mL; 363
pg/mL) respectivamente comparados con las células sin estímulo (85 pg/mL). El pico
máximo de estímulo es a las 6 horas para OMV de P. gingivalis W83 y 24 horas para OMV
de P. gingivalis 33277. Las vesículas y los lisados inducen niveles de esta citocina
proinflamatoria de manera similar, mientras que la bacteria viva estimula la producción de
IL-1 β significativamente más que las células sin estímulo, pero menor que las vesículas o
el lisado. El estímulo de 30 minutos induce una respuesta del macrófago similar a la que
ocurre a las 2 horas y cuando se estimulan las células por 6 horas la respuesta del
macrófago es similar al estímulo a las 24 horas (Figura 6A).
Los niveles solubles de TNF-α producidos por macrófagos estimulados con OMV a los 30
minutos fueron mayores (682 pg/mL; 436 pg/mL), a las 2 horas (700 pg/mL; 660 pg/mL), a
las 6 horas (242 pg/mL; 188 pg/mL) y 24 horas (61 pg/mL; 72 pg/mL) respectivamente
comparados con las células sin estímulo (85 pg/mL). Los niveles solubles de TNF-α son
inducidos por las vesículas a los 30 minutos y 6 horas son similares y disminuyen a partir
de las 6 horas teniendo su menor pico de producción a las 24 horas. Las OMV y los lisados
inducen niveles de esta citocina proinflamatoria de manera similar, mientras que la bacteria
viva estimula la producción de esta citocina significativamente más que las células sin
estímulo, pero menor que las vesículas o el lisado (Figura 6B).
En este mismo sentido, las OMV de P. gingivalis W83 y 33277 inducen aumento en los
niveles solubles de IL-6 a los 30 minutos (992 pg/mL; 982 pg/mL), a las 2 horas (1954
pg/mL; 676 pg/mL), a las 6 horas (681 pg/mL; 745 pg/mL) y 24 horas (248 pg/mL; 249
pg/mL) respectivamente comparados con las células sin estímulo (48 pg/mL). Las
vesículas y los lisados inducen niveles de esta citocina de manera similar, mientras que la
bacteria viva estimula su producción significativamente más que las células sin estímulo,
pero menor que las vesículas o el lisado (Figura 6C).
Cuando se evaluaron los niveles de las quimiocinas IL-8, RANTES, MCP-1 y MIP-1α en
macrófagos estimulados, se pudo observar que las vesículas de P. gingivalis W83 y 33277
reprimen los niveles solubles de IL-8 a los 30 minutos (607 pg/mL; 594 pg/mL), a las 2
Capítulo 3 37
horas (564 pg/mL; 612 pg/mL), a las 6 horas (636 pg/mL; 743 pg/mL), a las 24 horas estos
niveles aumentaron para P. gingivalis W83 (1437 pg/mL) mientras que fueron bajos para
P. gingivalis 33277 (659 pg/mL) respectivamente comparados con las células sin estímulo
(845 pg/mL). El estímulo con las OMV redujo de manera similar los niveles de IL-8 a los
lisados celulares y este comportamiento es diferente cuando los macrófagos son
estimulados con bacteria viva, adicionalmente la respuesta de los macrófagos a la
estimulación con las dos bacterias es diferencial (Figura 7A).
En cuanto a la producción de RANTES tras el estímulo con las dos cepas W83 y 33277, el
pico máximo de estimulación fue a las dos horas para ambas bacterias (1865 pg/mL; 1364
pg/mL). A las 6 horas (568 pg/mL; 669 pg/mL) estos niveles disminuyen significativamente
con respecto a las células sin estímulo (658 pg/mL) y a los estímulos de 30 minutos y 2
horas. Las OMV de P. gingivalis reducen de manera similar los niveles de RANTES a los
lisados celulares y este comportamiento es diferente cuando los macrófagos son
estimulados con bacteria viva. La bacteria viva reprime por completo la producción de esta
quimiocina por los macrófagos (Figura 7B).
La producción de MCP-1 se ve reprimida por las OMV de P. gingivalis W83 y 33277 a los
30 minutos (701 pg/mL; 564 pg/mL), a las 2 horas hay un aumento de esta quimiocina
cuando los macrófagos son estimulados con OMV de P. gingivalis W83 (1766 pg/mL) pero
se mantienen disminuidos con OMV de P. gingivalis 33277 a las 2 horas (704 pg/mL), 6
horas (721 pg/mL) y 24 horas (732 pg/mL) con respecto a las células sin estímulo (985
pg/mL). Las OMV de P. gingivalis inducen un comportamiento similar en macrófagos
estimulados con lisados celulares y este comportamiento es diferente cuando el estímulo
es con bacteria viva. La bacteria viva reprime significativamente más los niveles de MCP-
1 que las células sin estímulo y los lisados y vesículas (Figura 7C). En cuanto a MIP-1α las
OMV reprimen su producción a los 30 minutos (1306 pg/mL; 1336 pg/mL), a las 2 horas
hay un aumento de esta quimiocina cuando los macrófagos son estimulados con OMV de
P. gingivalis W83 (3843 pg/mL) comparado con las células sin estímulo (1540 pg/mL); los
niveles de esta quimiocina se mantienen reprimidos cuando los macrófagos son
estimulados con OMV de P. gingivalis 33277 a las 2 horas (1343/mL), 6 horas (1438 pg/mL)
y 24 horas (1448 pg/mL) con respecto a las células sin estímulo (1540 pg/mL) (Figura 7D).
Figura 6. Niveles de citocinas pro-inflamatorias en macrófagos estimulados con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis W83 y 33277 por 30 minutos (barra negra punteada), 2 horas (barra blanca punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con líneas transversas) comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A) Niveles de IL-1β; B) Niveles de TNF-α; C) Niveles de IL-6
*p<0,05 ANOVA Factorial.
Capítulo 3 39
Figura 7.Niveles de quimiocinas en macrófagos estimulados con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis W83 y 33277 por 30 minutos (barra negra punteada), 2 horas (barra blanca punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con líneas transversas) comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A) Niveles de IL-8; B) Niveles de RANTES; C) Niveles de MCP-1; D) Niveles de MIP-1 α.
*p<0,05 ANOVA Factorial.
3.7 Evaluación de la inhibición de Rgp y Kgp en OMV de P. gingivalis
Se determinó el efecto de la Inhibición de Arg-gingipaínas, Lys-gingipaínas y LPS de
Lisado, bacteria y vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 sobre la estimulación de
macrófagos-U937 y los niveles de citocinas proinflamatorias (IL-1 β, TNFα, IL-6) y
quimiocinas (IL-8, RANTES, MCP-1, MIP-1α) por citometría de flujo.
En la figura 8, 9 y 10 se presentan los resultados obtenidos para las citocinas pro-
inflamatorias IL-1 β, IL-6 y TNFα y en las figuras No 11, 12, 13 y 14 las quimiocinas IL-8,
RANTES, MCP-1 y MIP-1α respectivamente en macrófagos estimulados durante 30 min y
6 horas con lisado, OMV y bacteria viva de P. gingivalis sin bloqueo y con bloqueo con los
Inhibidores KYT-1, KYT-36 y PMXB comparados con macrófagos sin estímulo. Los tiempos
evaluados para inhibición fueron determinados, basados en la cinética de citocinas
mostrada anteriormente, siendo 30 min y 6 horas los tiempos donde se obtuvieron los datos
más representativos.
En la figura 8 se observa que, las vesículas sin bloqueo inducen niveles de IL-1β de manera
similar al inducido por los lisados celulares y mayor al inducido por bacteria viva sin
bloqueo. Cuando se bloquearon las Arg-gingipaínas de vesículas se observó un aumento
drástico en los niveles de esta citocina con respecto a las células sin estímulo y a los
estímulos sin inhibición siendo consistente el dato con respecto al resultado encontrado en
los estímulos sin bloqueo a 30 minutos (241pg/mL; 237pg/mL) y 6 horas (711pg/mL;
543pg/mL) respectivamente, para OMV de P. gingivalis W83 y 33277. Las OMV de P.
gingivalis W83 indujeron mayores niveles de esta citocina cuando se compara con las OMV
de P. gingivalis 33277. Estos resultados son similares cuando se bloquean las Lys-
gingipaínas de vesículas. Cuando se bloqueó el LPS derivado de OMV se aumentan los
niveles de IL-1β significativamente con respecto a las células sin estímulo y al estímulo sin
bloqueo, pero menor que los niveles inducidos cuando se bloquean las gingipaínas (Figura
8).
En cuanto a la producción de TNF-α, contario a los resultados observados con IL-1β
(Figura 8), cuando se bloquearon las Arg-gingipaínas de vesículas se observó una
disminución significativa en los niveles de TNF-α con respecto a las células sin estímulo y
los estímulos sin inhibición. Sin embargo, en los lisados celulares y bacterias, el bloqueo
Capítulo 3 41
de esta gingipaína no afecto los niveles de TNF-α como ocurrió con las vesículas. Las
OMV sin bloqueo de P. gingivalis W83 fueron las que indujeron mayores niveles de TNF-
α cuando se compara con las OMV de P. gingivalis 33277. Cuando se bloquean las Lys-
gingipaínas de vesículas aumentan significativamente los niveles de TNF-α comparado
con el bloqueo de Arg-gingipaínas. Sin embargo, estos niveles disminuyen con respecto al
estímulo sin bloqueo. Cuando se bloqueó el LPS se disminuyen los niveles de TNF-α
respectivamente con respecto a las células sin estímulo en los primeros 30 minutos y esta
disminución fue mayor que cuando se bloquearon las gingipaínas (Figura 9).
En la figura 10, se muestran los resultados de los niveles solubles de IL-6 en macrófagos
estimulados con lisado, bacteria y OMV de P. gingivalis pre-tratados con KYT-1, KYT-36 o
PMXB, aquí se puede observar que las OMV de P. gingivalis W83 con boqueo de Arg-
gingipaínas indujeron mayores niveles de IL-6. Estos resultados son similares cuando se
bloquean las Lys-gingipaínas de vesículas a los 30 minutos (2268 pg/mL; 356 pg/mL) y a
las 6 horas (2756 pg/mL; 1407 pg/mL) respectivamente para OMV de P. gingivalis W83 y
33277. Cuando se bloqueó el LPS se disminuyó significativamente el nivel de IL-6 en los
primeros 30 minutos (184 pg/mL; 268 pg/mL) con respecto al estímulo sin bloqueo y el
bloqueo de gingipaínas.
Figura 8.Niveles de IL-1β en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-1β sin bloqueo y con inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-1 β sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C: niveles de IL-1 β sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
*p<0,05 ANOVA Factorial
Capítulo 3 43
Figura 9. Niveles de TNF-α en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de TNF-α sin bloqueo y con inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de TNF-α sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C: niveles de TNF-α sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
*p<0,05 ANOVA Factorial
44 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
Figura 10.Niveles de IL-6 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-6
sin bloqueo y con inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-6 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C: niveles de IL-6 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
*p<0,05 ANOVA Factorial
En cuanto a la inducción de quimiocinas tras el bloqueo de las gingipaínas y el LPS, se
pudo apreciar que las vesículas de membrana externa de P. gingivalis W83 y 33277 que,
cuando se bloquearon las Arg-gingipaínas de vesículas se observó un aumento en los
niveles de esta quimiocina con respecto a las células sin estímulo y los estímulos sin
inhibición a los 30 minutos (1283 pg/mL; 1257 pg/mL). Sin embargo, se disminuyó a las 6
horas (517 pg/mL; 1000 pg/mL) respectivamente para OMV de P. gingivalis W83 y 33277.
Las OMV de P. gingivalis W83 con boqueo de Arg-gingipaínas indujeron mayores niveles
de IL-8 en los primeros 30 minutos comparado con las células sin estímulo y los estímulos
sin bloqueo. Cuando se bloquean las Lys-gingipaínas de vesículas a los 30 minutos
aumenta IL-8 (1584 pg/mL; 3690 pg/mL) y a las 6 horas disminuye (559 pg/mL; 786 pg/mL)
respectivamente para OMV de P. gingivalis W83 y 33277. Las OMV de P. gingivalis 33277
con boqueo de Lys-gingipaínas indujeron mayores niveles de IL-8 en los primeros 30
minutos comparado con las células sin estímulo y los estímulos sin bloqueo. Cuando se
bloqueó el LPS derivado de OMV los resultados son comprables con lo encontrado cuando
se bloquea Arg-gingipaínas y Lys-gingipaínas (Figura 11).
Por otra parte, los niveles de MCP-1, cuando se bloquean las Arg-gingipaínas de vesículas
se aumentan a los 30 minutos para P. gingivalis W83 (1249 pg/mL) mientras que después
del estímulo con vesículas de P. gingivalis 33277 en los primeros 30 minutos esta
quimiocinas estuvo con niveles inferiores a células sin estímulo e indujeron un aumento
significativo en los niveles de MCP-1 a las 6 horas (2756 pg/mL). Cuando se bloquean las
Lys-gingipaínas de vesículas se aumentan los niveles de MCP-1 (1472 pg/mL; 1620
pg/mL) a los 30 minutos significativamente con respecto a las células sin estímulo, al
estímulo sin bloqueo y al bloqueo de Arg-gingipaínas, estos niveles disminuyen a las 6
horas (847 pg/mL; 898 pg/mL). El bloqueo del LPS derivado de vesículas resulta en el
aumento en los niveles de MCP-1 significativamente a los 30 minutos (2385 pg/mL; 1385
pg/mL) y a las 6 horas (1100 pg/mL; 1219 pg/mL) respectivamente. Las vesículas de P.
gingivalis W83 a los 30 minutos inducen niveles mayores de MCP-1 (2385 pg/mL) que la
bacteria viva (1804 pg/mL) y que el lisado (1418 pg/mL). Cuando se bloquean las OMV de
P. gingivalis 33277, también se aumentan los niveles de esta quimiocinas comparado con
la bacteria viva y los lisados. Sin embargo, la bacteria viva reduce los niveles de MCP-1 2
,45 veces con respecto a los niveles producidos por las células sin estimulo (Figura 12).
46 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
Para la quimiocina RANTES, el bloqueo de las Arg-gingipaínas de vesículas induce un
aumento en los niveles de esta quimiocina con respecto a las células sin estímulo y los
estímulos sin inhibición a los 30 minutos (2271 pg/mL; 2374 pg/mL). Sin embargo, esta
quimiocina se disminuyó a las 6 horas (1721 pg/mL; 1680 pg/mL) comparada con el
bloqueo a 30 minutos respectivamente para OMV de P. gingivalis W83 y 33277. Cuando
se bloquean las Lys-gingipaínas de vesículas de P. gingivalis W83 a los 30 minutos
aumenta RANTES (1584 pg/mL) significativamente con respecto a las células sin estímulo
y a los estímulos sin inhibición a los 30 minutos. El evento contrario ocurre con P. gingivalis
33277 en el cual se inhibió por completo la producción de esta quimiocina. A las 6 horas
aumenta RANTES (1695 pg/mL; 1525 pg/mL) respectivamente para OMV de P. gingivalis
W83 y 33277, estos resultados son similares entre lisado y vesícula, sin embargo, difieren
de la respuesta del macrófago a la bacteria viva, en la cual en la mayoría de los casos se
inhibió esta quimiocina. Cuando se bloqueó el LPS derivado de OMV a los 30 minutos
hubo una disminución significativa de los niveles de RANTES (0 pg/mL; 67 pg/mL), este
resultado fue consistente a las 6 horas para bacteria viva, mientras que los lisados (1963
pg/mL; 1805) y vesículas (1543 pg/mL; 1606 pg/mL) aumentaron significativamente esta
quimiocina con respecto a las células sin estímulo y los estímulos a los 30 minutos.
Por último, la concentración de MIP-1α se aumentó al bloquear las Arg-gingipaínas de
vesículas a los 30 minutos (1774 pg/mL; 1738) un valor que es significativamente mayor
comparado con las células sin estímulo (1540 pg/mL). A las 6 horas los niveles de esta
quimiocinas se restablecieron a valores similares al producido por las células sin estímulo
(Datos no mostrados)
Figura 11.Niveles de IL-8 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C: niveles de IL-8 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
*p<0,05 ANOVA Factorial
48 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
Figura 12.Niveles de MCP-1 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C: niveles de IL-8 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
*p<0,05 ANOVA Factorial
Capítulo 3 49
Figura 13. Niveles de RANTES en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de RANTES sin bloqueo y con inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de RANTES sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C: niveles de RANTES sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
*p<0,05 ANOVA Factorial.
3.8 Niveles de ARNm de citocinas proinflamatorias y quimiocinas producidas por macrófagos-U937 estimulados
Se determinó la cinética de expresión de ARNm de las citocinas proinflamatorias (IL-1 β,
TNFα, IL-6) y quimiocinas (IL-8, RANTES, MCP-1, MIP-1α) en macrófagos-U937
estimulados con lisado, bacteria y vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 a los 30 minutos,
2 horas, 6 horas y 24 horas.
Las vesículas de membrana externa de P. gingivalis W83 inducen un aumento en la
expresión de ARNm de IL-1β a los 30 minutos, 2 horas, 6 horas y 24 horas, siendo el pico
más alto de expresión a las 2 horas de estímulo con vesículas y esta inducción fue mayor
cuando los macrófagos fueron estimulados con OMV que con lisados celulares. Las OMV
de P. gingivalis 33277 indujeron un leve aumento en los niveles de ARNm a los 30 minutos
de estímulo comparado con las células sin estímulo, pero los niveles de ARNm en los
macrófagos estimulados con vesículas de P. gingivalis 33277 disminuyeron a las 2 horas
y 6 horas de estímulo mayor que las células sin estímulo (Figura 14A).
Además, las OMV de P. gingivalis W83 y 33277 reprimen significativamente la expresión
de ARNm de MCP-1 a los 30 minutos, 2 horas, 6 horas y 24 horas de estímulo comparado
con las células sin estímulo. La bacteria viva de P. gingivalis W83 por el contrario aumentan
significativamente de los niveles de ARNm a las 2 horas post-estimulo, mientras que P.
gingivalis 33277 tiene este efecto a los 30 minutos de estímulo; en los tiempos posteriores
los niveles de ARNm para MCP-1 son inferiores a las células sin estímulo (Figura 14B). La
expresión de IL8 post-estimulo con OMV de P. gingivalis W83 y 33277 se ve reprimida a
los 30 minutos de estímulo. A las 2 horas hay un aumento en la expresión de esta
quimiocina comparado con las células sin estímulo; la expresión de IL8 se mantiene
reprimida con OMV de P. gingivalis 33277 a las 2 horas, 6 horas y 24 horas con respecto
a las células sin estímulo. Las OMV de P. gingivalis inhiben la expresión de IL-8 en
macrófago manera similar a los lisados celulares y este comportamiento es diferente
cuando los macrófagos son estimulados con bacteria viva, la bacteria viva a las dos horas
induce un aumento en la expresión de ARNm de IL-8 mayor que las células sin estímulo,
lisados y vesículas, siendo P. gingivalis 33277 la bacteria que induce aumento en
expresión de IL-8 en todos los tiempos evaluados (Figura 14C).
La expresión de ARNm para las citocinas proinflamatorias IL-6 y TNFα, así como para las
quimiocinas RANTES y MIP-1α no fue detectado en macrófagos estimulados con lisado,
bacteria o vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 a los 30 minutos, 2 horas, 6 horas y 24
horas. Excepto P. gingivalis W83 que indujo un aumento significativo de ARNm a los 30
minutos de estímulo con bacteria viva.
Figura 14. Expresión relativa de ARNm en macrófagos estimulados con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis W83 y 33277 durante 30 minutos (barra negra punteada), 2 horas (barra blanca punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con líneas transversas) comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A). IL-1β; B). MCP-1; C) IL8.
*p<0,05 ANOVA Factorial.
3.9 Efecto de la inhibición de Rgp, Kgp y LPS sobre la expresión de ARNm de citocinas proinflamatorias y quimiocinas producidas por macrófagos-U937 estimulados
Se determinó el efecto de la Inhibición de Arg-gingipaínas, Lys-gingipaínas y LPS de lisado,
bacteria y vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 sobre la expresión de ARNm de citocinas
proinflamatorias (IL-1 β, TNFα, IL-6) y quimiocinas (IL-8, RANTES, MCP-1, MIP-1α) en
macrófagos–U937 estimulados por 30 minutos y 6 horas.
Con relación a la citocina IL-1 β, cuando se bloquean las Arg-gingipaínas se aumentan
significativamente la expresión de esta citocina en macrófagos estimulados con OMV de
las dos cepas durante los primeros 30 minutos. Las OMV de P. gingivalis 33277 inducen
los mayores niveles de ARNm para IL-1β comparado con las células sin estímulo, los
estímulos sin bloqueo y las vesículas de P. gingivalis W83. Contrariamente a las 6 horas,
la expresión de IL-1β está completamente reprimida.
En los macrófagos estimulados con OMV pre-tratadas con inhibidor de Lys-gingipaínas a
los 30 minutos y 6 horas, se reprime la expresión de ARNm para IL-1β tanto en OMV de
P. gingivalis W83 y 33277. Este efecto es similar entre lisados y OMV y difiere del efecto
inducido por la bacteria viva. El tratamiento con PMXB reprime la expresión de IL-1β en
los macrófagos estimulados durante los primeros 30 minutos. Sin embargo, a las 6 horas
estas OMV inducen un aumento en la expresión de IL-1β mayor a las células sin estímulo
y a los estímulos pre tratados por 30 minutos.
La expresión relativa de ARNm para IL-8 aumenta cuando los macrófagos son estimulados
con OMV de P. gingivalis W83 pre-tratadas con KYT-1 durante los primeros 30 minutos y
este efecto, es mayor al inducido por bacteria viva y lisado. Para P. gingivalis 33277 en los
primeros 30 minutos también se induce un aumento en la expresión de IL-8 en los
macrófagos, sin embargo, es inferior al inducido por lisado o bacteria viva e inferior al efecto
de las vesículas de P. gingivalis W83. A las 6 horas de estímulo con lisado, bacteria o
vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 la expresión de esta citocina está completamente
reprimido. Cuando se bloquean las Lys-gingipaínas se ve un efecto contrario, macrófagos
estimulados con OMV pre tratadas con KYT-36 (inhibidor de Lys-gingipaínas) en los
primeros 30 minutos se reprime la expresión de IL-8 tanto en OMV de P. gingivalis W83 y
Capítulo 3 53
33277. A las 6 horas se aumentan los niveles de expresión de cuando los macrófagos son
estimulados con OMV de P. gingivalis W83 mientras que se mantiene reprimido cuando
son estimulados con OMV de P. gingivalis 33277. El estímulo de macrófagos con lisado,
bacteria o vesículas pre tratados con PMXB se induce una represión en la expresión similar
a cuando se bloquean las Lys-gingipaínas (figura 16).
Por otra parte, la expresión de MCP-1, cuando se bloquean las Arg-gingipaínas aumenta
significativamente en macrófagos estimulados con OMV de P. gingivalis W83 y 33277
durante los primeros 30 minutos. Las OMV de P. gingivalis 33277 inducen mayor expresión
de esta quimiocina comparado con las células sin estímulo, los estímulos sin bloqueo y las
vesículas de P. gingivalis W83 con bloqueo de Arg-gingipaína. A las 6 horas de estímulo
de los macrófagos con lisado, bacteria o vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 pre
tratados KYT-1 la expresión de MCP-1 está completamente reprimida. Los macrófagos
estimulados con OMV pre tratadas con KYT-36 o PMXB a los 30 minutos y 6 horas,
reprimen la expresión de MCP-1 tanto en OMV de P. gingivalis W83 y 33277 (figura 17).
La expresión de ARNm para las citocinas proinflamatorias IL-6 y TNF-α, así como para las
quimiocinas RANTES y MIP-1α no fue detectado en las células sin estímulo ni en los
macrófagos estimulados con lisado, bacteria o vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 pre
tratados con KYT-1, KYT-36 y PMXB a los 30 minutos ni a las 6 horas. Este efecto se
mantiene cuando se bloquean Arg-gingipaínas, Lys-gingipaínas o LPS (datos no
mostrados).
Figura 15.Expresión relativa de ARNm de IL-1β en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de IL-1β sin bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de IL-1β sin bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de IL-1β sin bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
*p<0,05 ANOVA Factorial
Capítulo 3 55
Figura 16. Expresión relativa de ARNm de IL-8 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de IL-8 sin bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de IL-8 sin bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de IL-8 sin bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
*p<0,05 ANOVA Factorial
56 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
Figura 17. Expresión relativa de ARNm de MCP-1 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de MCP-1 sin bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de MCP-1 sin bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de MCP-1 sin bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
*p<0,05 ANOVA Factorial.
4 Discusión
La persistencia crónica de P. gingivalis en el periodonto está determinada por su habilidad
para evadir la inmunidad del hospedador sin inhibir por completo la respuesta inmune
inflamatoria general, necesaria para la adquisición de nutrientes esenciales para la
supervivencia y multiplicación bacteriana. En este estudio se demostró que las OMV de P.
gingivalis tienen la capacidad de modular la respuesta inmune inflamatoria y quimiotáctica
de macrófagos humanos por eventos dependientes de proteólisis mediada por gingipaínas.
También se demostró que existe una inducción diferencial de la respuesta inmune del
macrófago cuando es estimulado con vesículas comparado con bacteria viva y esta
respuesta adicionalmente varía cuando los macrófagos son estimulados con dos cepas
distintitas de P. gingivalis.
Diferentes estudios han reportado las características diferenciales entre P. gingivalis W83
y 33277, lo cual que hace razonable los resultados encontrados en este trabajo. Las cepas
de P. gingivalis se dividen en cepas virulentas (P. gingivalis W83) y menos virulentas (P.
gingivalis 33277) (68), en función de sus tipos de fimbrias (20, 69), antígeno capsular (69-
71), capacidad invasiva (71,72), proteolítica y colagenolítica (72), capacidad de evadir
fagocitosis (71, 72), su hidrofobicidad (72), entre otras. En este estudio se pudo confirmar
que las dos cepas evaluadas presentan un comportamiento diferente en su tasa de
multiplicación por lo que es fundamental asegurar que en los experimentos in vitro con
cepas diferentes esto no afecte los resultados como se logró para este estudio. Estas
bacterias estructuralmente, fisiológicamente y metabólicamente son diferentes. La cepa de
P. gingivalis ATCC 33277 ha sido ampliamente utilizada para la identificación de las
características fisiopatológicas del microorganismo (68), así como para estudios de
invasión, cambios de la respuesta inmune, entre otros. Sin embargo, es importante tener
en cuenta que los resultados obtenidos en modelos de infección in vivo e in vitro frente a
cepas de P. gingivalis varían en función de la naturaleza de la cepa evaluada.
58 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
Además, en este trabajo se pudo determinar que P. gingivalis 33277 tiene mayor actividad
Arg-gingipaína cuando se compara con P. gingivalis W83, aunque en el pre-inóculo se
estabilizó en número de bacterias y la actividad Arg-gingipaína para las dos bacterias, sin
embargo, este evento no ocurre a las 48 horas de crecimiento, cuando el recuento
bacteriano de P. gingivalis 33277 es inferior a P. gingivalis W83. A pesar de este protocolo
de control de las bacterias, la actividad proteasa fue mayor, requiriendo tan solo 0,0046
µg/µL de proteína total para ser detectada con CAAM; mientras que para detectar actividad
Arg-gingipaína en P. gingivalis W83 se requiere tener 0,02 µg/µL, 4,23 veces más proteína
que la requerida para P. gingivalis 33277. Estos resultados son sustentados con lo
reportado por otros autores (20, 37), quienes confirman que existe un perfil diferencial de
proteínas entre P. gingivalis W83 y 33277 siendo más abundantes las Arg-gingipaínas en
OMV de P. gingivalis 33277 que en W83 (20). Aunque se conoce que, para ambas cepas,
estas son las proteínas que se encuentran en mayor abundancia en las vesículas (45,
12,73).
Sorprendentemente, cuando se determinó el límite de detección de actividad Arg-
gingipaína en las vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 la actividad Arg-gingipaína fue
mayor para las OMV de P. gingivalis W83. Este resultado pudo estar influenciado por la
tasa de crecimiento más rápida de esta cepa comparada con P. gingivalis 33277. Debido
a que la expresión de las gingipaínas se autorregula, con una mayor concentración de
gingipaínas estas mismas se auto degradan. Se ha reportado también la capacidad que
estas tienen para degradar los inhibidores de proteasas in vivo e in vitro, probablemente
este sea un punto crítico en la medición de estas proteasas (36, 37, 74).
Los macrófagos desempeñan un papel importante en la regulación de la respuesta
inflamatoria del hospedador, en parte a través de su capacidad para secretar mediadores,
(particularmente citocinas), en respuesta a microorganismos y productos microbianos,
ellos constituyen una importante fuente células recuperadas de los tejidos gingivales,
particularmente los tejidos inflamados, de pacientes con periodontitis. Estos macrófagos
desempeñan un papel esencial en el desarrollo y la progresión de periodontitis (75). Por
ello son considerados un modelo celular importante para diferentes estudios in vitro que
evalúan la patogenicidad de P. gingivalis y sus componentes celulares como las OMV.
Capítulo 4 59
Se realizó una evaluación de producción de citocinas y quimiocinas en macrófagos-U937,
en experimentos independientes a los 30 minutos, 2 horas, 6 horas y 24 horas, la cual
permitió establecer los tiempos de estímulo utilizados para los experimentos de inhibición
de gingipaínas y LPS. A los 30 minutos y dos horas de estímulo no hubo diferencias
estadísticamente significativas para la mayoría de citocinas y quimiocinas así mismo
ocurrió con 6 horas y 24 horas. Por esta razón se establecieron los tiempos de 30 minutos
y 6 horas para evaluar el efecto de la inhibición de Arg-gingipaínas, Lys-gingipaínas y LPS
derivado de vesículas, lisados y bacteria sobre la estimulación de macrófagos. Sin
embargo, la expresión de ARNm de citocinas y quimiocinas no fue comparable con los
niveles solubles de las proteínas. Estos datos han sido también reportados en otros
estudios en donde se ha demostrado que la actividad proteolítica de P. gingivalis atenúa
la expresión de ARNm y producción de citocinas y quimiocinas de las células del
hospedador (76).
Las OMV de P. gingivalis estimularon significativamente la secreción de IL-1β, IL-6, TNF-
α y RANTES e indujeron niveles de estas citocinas proinflamatorias y quimiocinas de
manera similar a los lisados, mientras los macrófagos censaron diferencialmente a la
bacteria viva. Estos resultados son comparables con lo reportado por otros autores (77,
56) quienes confirman que las OMV de P. gingivalis inducen aumentos en los niveles de
TNF-α e IL- β de manera dosis dependiente (56). Se ha reportado que las infecciones
agudas implican un reto de las células inmunes frente a bacterias vivas, mientras que las
infecciones crónicas implican una combinación de bacterias vivas y sus subproductos, es
por ello razonable que células de la respuesta inmune como macrófagos sean estimulados
diferencialmente por la bacteria viva o sus componentes como OMV y lisados. Esto ha sido
sustentado por otros autores (56, 76,77), quienes describen que las células son
estimuladas con bacteria viva pueden ser representativas de una respuesta aguda de la
enfermedad; mientras que el estímulo de las células con productos estructurales y
secretados de la bacteria podrían representar una respuesta crónica, lo cual puede estar
asociado con vías inmunitarias centrales, desencadenadas independientemente de los
estímulos específicos e indispensables para montar una respuesta inmune apropiada (77).
Estudios como el realizado por Zhou et al, 2005 sustentan que, el LPS y las fimbrias
mayores (FimA) de P. gingivalis inducen un perfil similar de expresión de citocinas en
macrófagos peritoneales de ratón, pero que este perfil difiere significativamente en
respuesta a P. gingivalis viva. En ese trabajo los macrófagos fueron estimulados para
60 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
producir IL-6, factor estimulante de colonias de granulocitos y linfotactina por P. gingivalis
viva, pero este efecto no fue observado cuando las células fueron estimuladas con LPS o
fimbrias. Por otra parte, RANTES, interferón gamma, IL -17, VCAM-1 y el factor de
crecimiento endotelial vascular fueron inducidos por LPS o FimA, pero no por P. gingivalis
viva (75). De la misma manera, en este estudio se logró establecer que las vesículas y el
lisado estimulan significativamente la producción de la quimiocina RANTES mientras que
la bacteria viva es incapaz de inducirla. Esto puede ser argumentado desde lo propuesto
por Zhou et al., quienes indican que la respuesta diferencial P. gingivalis viva y a sus
componentes celulares sugieren que la bacteria y sus componentes desempeñan
diferentes roles frente a la respuesta aguda y crónica desencadenada por P. gingivalis
(75). Es comprensible además pensar que no es conveniente para la bacteria atraer
proteínas quimiotácticas que conducirán al reclutamiento de células inmunes y a la
eliminación de la bacteria.
Los niveles de IL-8, MCP-1 y MIP-1α fueron no inducidos por las OMV de P. gingivalis. Se
ha reportado que las gingipaínas de la bacteria, pueden convertir inicialmente IL-8 (77
residuos de aminoácidos) en una especie más potente truncada en el extremo amino,
seguida de la degradación lenta y destrucción de la actividad biológica de la quimiocina.
Por el contrario, las mismas enzimas cuando se asocian con vesículas, degradan al
instante esta quimiocina. Esta división de la actividad potenciadora e inactivadora entre las
gingipaínas solubles y ligadas a la membrana puede causar la compartimentalización de
las reacciones pro y anti-inflamatorias a posiciones distales y proximales de la placa
bacteriana, respectivamente, que puede explicar por qué, a pesar de la acumulación
masiva de neutrófilos en los sitios de periodontitis, no hay eliminación de la infección (78).
Adicionalmente, las OMV de P. gingivalis reprimieron los niveles de MCP-1 y MIP-1α, a los
lisados celulares y este comportamiento es diferente cuando los macrófagos son
estimulados con bacteria viva. La bacteria viva reprime significativamente más los niveles
de MCP-1 que las células sin estímulo y los lisados y vesículas. Choi et al, (2014)
demostraron que la producción MCP-1 era sustancialmente suprimida por altas dosis de
P. gingivalis y este efecto se demostró también a nivel de ARNm. Cuando estimularon
macrófagos-THP-1 con una cepa de P. gingivalis mutante para gingipaínas, se aumentó
significativamente la expresión de ARNm de MCP-1 (76).
Capítulo 4 61
Con el fin de determinar la función principal de las gingipaínas y el LPS, considerados
abundantes en las vesículas, se evaluó el efecto de la Inhibición de Arg-gingipaínas, Lys-
gingipaínas (usando los péptidos sintéticos KYT-1 y KYT-36 respectivamente) y LPS de
Lisado, bacteria y vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 sobre la estimulación de
macrófagos-U937 y los niveles de citocinas proinflamatorias (IL-1 β, TNFα, IL-6) y
quimiocinas (IL-8, RANTES, MCP-1, MIP-1α). El bloqueo de gingipaínas más que el
bloqueo de LPS condujo a un aumento significativo de los niveles de todas las citocinas
proinflamatorias y quimiocinas evaluadas y estos datos son comparables con la expresión
de ARNm para IL-1β, IL-8, MCP-1. Lo anterior explica el papel de las gingipaínas derivadas
de OMV sobre los cambios en la respuesta inmune de macrófagos humanos y estos
resultados aportan a la evidencia que, P. gingivalis utiliza las gingipaínas que son el
principal componente de las vesículas y mecanismo a distancia para modular la respuesta
inmune, incluso se ha propuesto que las vesículas inducen tolerancia en las células de la
respuesta inmune a la infección con P. gingivalis viva, favoreciendo de esta forma el
mantenimiento y supervivencia de la bacteria y por consiguiente la cronicidad de la
periodontitis (56).
Estos datos son consistentes con lo reportado por Barth et al., 2016 quienes estimularon
células HUVEC con P. gingivalis. La estimulación con cepas de P. gingivalis 381 o 33277
dio como resultado la detección de IL-8, IL-6 y MCP-1 a niveles de proteína similares al
control sin estímulo o niveles reducidos. El pre-tratamiento de cepas bacterianas con el
inhibidor de Rgp (KYT-1) aumentó significativamente la concentración de IL-8 y MCP-1,
mientras que la inhibición de Kgp con KYT-36 indujo un aumento en las concentraciones
de todas las citocinas probadas, lo que implica que P. gingivalis utiliza tanto Rgp como Kgp
para degradar estas citocinas (79).
La degradación selectiva de citocinas, complemento, moléculas de adhesión celular,
correceptores o vías de señalización, han sido descritas como mecanismos que conducen
a la desregulación de la respuesta inmune por P. gingivalis. Estos estudios destacan un
papel significativo de las gingipaínas en la alteración de la inmunidad innata y sugieren que
la desregulación de la señalización de las células del hospedador puede ser un factor
crítico en muchas de estas estrategias de evasión (79). Las gingipaínas degradan
directamente citocinas, pero también se ha descrito que pueden degradar receptores y co-
receptores celulares, así como también proteínas intracelulares importantes en vías de
señalización necesarias para la activación y/o secreción de mediadores inflamatorios. El
62 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en
macrófagos humanos
factor nuclear-kappaB (NFκB) y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) son
componentes críticos de la inmunidad innata que orquestan respuestas inmunes
apropiadas para controlar y erradicar patógenos (79), su activación da como resultado la
inducción de mediadores proinflamatorios, como el TNFα, una potente molécula bioactiva
comúnmente secretada por células inflamatorias. P. gingivalis altera la respuesta de las
células hospedadoras a través de la degradación proteolítica de quinasas intracelulares
esenciales para la inmunidad innata. Principalmente se ha reportado de degradación
selectiva del receptor que interactúa con la proteína quinasa-1 (RIPK1), factor de
crecimiento transformante beta activado por cinasa 1 (TAK1) y AKT necesarias para la
señalización paracrina de TNFα (79). Lo que hace razonable los niveles de TNFα
detectados en este estudio. Así mismo, se ha descrito que P. gingivalis causa atenuación
de la vía de señalización de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) / Akt, y este efecto está
fuertemente asociado con la actividad de las gingipaínas. Los efectos proteolíticos de las
gingipaínas desempeñan un papel esencial en la disfunción de PI3K y los cambios en la
vía de señalización Akt durante la infección por P. gingivalis (80).
Las vesículas han cobrado importancia en la patogenia de P. gingivalis y su persistencia
en enfermedad periodontal no solo por la capacidad que tienen de transportar factores de
virulencia propios de la célula parental, si no, porque son usadas por P. gingivalis como
una estrategia adicional de evasión de la respuesta inmune, adquisición de nutrientes y
mecanismo de virulencia a distancia. Estas vesículas se han propuesto como centinelas,
que entran en contacto con las células de la respuesta inmune mucho antes que la bacteria
y con un contacto más cercano favoreciendo hipo-respuesta de las células a la infección
bacteriana (56). Esta disminución de la respuesta de las citocinas puede llevar a una
reducción de la capacidad para eliminar la infección y la transición a la inflamación crónica
que se observa en la periodontitis (81). Lo anterior se ha atribuido a las gingipaínas de esta
bacteria, por lo cual es razonable pensar que las OMV, por tener principalmente estas
proteasas ancladas a la superficie y como contenido luminal mayoritario, las convierte en
una de las estrategias más sofisticadas de P. gingivalis para la evasión de la respuesta
inmune mediada por eventos proteolíticos dependientes de gingipaínas.
5 Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones
1. P. gingivalis W83 y 33277 tienen una tasa de crecimiento, metabolismo y recuentos
bacterianos distintos, por ello las concentraciones deben ser ajustadas para que el
recuento sea comparable, lo cual es muy importante cuando se desea comparar
los efectos inducidos por diferentes cepas en modelos in vivo e in vitro.
2. Las vesículas de P. gingivalis W83 indujeron mayor respuesta de los macrófagos,
lo que se correlaciona con la virulencia de esta bacteria comparada con P. gingivalis
33277.
3. El bloqueo de las gingipaínas, más que el bloqueo del LPS derivado de OMV
favoreció la sobreexpresión de citocinas y quimiocinas.
4. Las OMV de P. gingivalis tienen la capacidad inducir cambios en la respuesta
inmune inflamatoria y quimiotáctica de macrófagos humanos por eventos
dependientes de gingipaínas, de manera significativamente mayor que la bacteria
viva lo cual podría favorecer el estado crónico característico de la enfermedad
periodontal.
5.2 Recomendaciones
En este estudio se determinaron los niveles de citocinas solubles y ARNm en
macrófagos-U937. Sin embargo, la evaluación de la proteína y ARN se realizó a las
24 horas después de retirado el estímulo en todos los tiempos evaluados. Lo
anterior permitió determinar la persistencia de la respuesta del macrófago a cada
estímulo, pero no se conoce la respuesta inmediata. Por lo anterior para estudios
posteriores sería muy importante evaluar los niveles de la proteína y de ARNm
inmediatamente transcurrido el tiempo de estímulo para poder comparar la
respuesta inmediata del macrófago y la persistencia en la respuesta.
64 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios
inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis
en macrófagos humanos
Con el fin de determinar el efecto del DMSO como vehículo usado para disolver los
inhibidores KYT-1 y KYT-36, controles internos fueron usados estimulando
macrófagos solo con el vehículo y se pudo observar que, a la concentración usada,
el DMSO no causó ningún efecto en la célula y el comportamiento de los
macrófagos fue similar al encontrado cuando solamente fueron tratados con medio
de cultivo. Sin embargo, en este estudio no se incluyó un control de estimulación
de las células solo con los inhibidores KYT-1, KYT-36 o PMXB, lo cual sería muy
importante para corroborar que el efecto observado es directamente a causa de
bloqueo de los factores de virulencia y no de los inhibidores.
Se hace necesario confirmar los eventos de proteólisis de citocinas mediadas por
gingipaínas derivadas de vesículas en un modelo experimental que evalué la
estimulación de macrófagos y la presencia de citocinas intracelulares como
mecanismos de evidencia de activación de la célula y degradación de las proteínas
secretadas al medio extracelular.
Evaluar citocinas reguladoras que permitan determinar el efecto modulador de la
respuesta inmune inducida por vesículas de membrana externa de P. gingivalis en
macrófagos humanos.
Evaluar un modelo celular con macrófagos aislados de pacientes con periodontitis
y comparar los resultados con los encontrados en este trabajo para comprobar si
la respuesta es similar.
5.3 Perspectivas
Este estudio permitirá abrir perspectivas de trabajos enfocados a fortalecer el
entendimiento la patogenia de las OMV de P. gingivalis no solo en la enfermedad
periodontal sino también en enfermedades sistémicas relacionadas con la periodontitis,
como artritis reumatoide, enfermedad cardiovascular o resultados adversos en el
embarazo. Dentro de la línea de microbiología oral, sería muy importante evaluar la función
de las vesículas en la formación de un modelo de biofilm oral multiespecies in vitro y poder
comparar el efecto de estas vesículas con las de otras bacterias normales y patógenas de
interés oral.
Bibliografía 65
En un futuro para emprender investigaciones similares a las de este trabajo, es muy
importante determinar sí, los receptores intracelulares como los Receptores similares a
NOD (NLR) y Receptores similares a RIG-I (RLR) son activados por las vesículas una vez
estas son internalizadas en la célula hospedadora y que vías de señalización celular se
ven activadas o reprimidas por la invasión de vesículas.
Bibliografía
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