Evaluación del estado de amplificación de oncogenes, como … · 2015-03-19 · Evaluación del estado de amplificación de oncogenes, como marcadores moleculares en DNA libre en

Evaluación del estado de amplificación de oncogenes, como marcadores moleculares en DNA libre en plasma de pacientes con

cáncer pulmonar

Yara Cruz Lozano 186718

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias

Posgrado interfacultades Microbiología

Bogotá, Colombia

2014

Evaluación del estado de amplificación de oncogenes, como marcadores moleculares en DNA libre en plasma de pacientes con

cáncer pulmonar

Yara Cruz Lozano

186718

Tesis o trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias - Microbiología

Director:

Ph.D., Fabio Ancízar Aristizábal Gutiérrez

Codirectora:

Ph.D., Sandra Janneth Perdomo Lara

Línea de Investigación:

Identificación de marcadores moleculares cáncer

Grupo de Investigación:

Farmacogenética del cáncer

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias

Posgrado interfacultades Microbiología

Bogotá, Colombia

2014

A Dios

A mis padres

Agradecimientos A la Universidad Nacional de Colombia, al posgrado de Ciencias – Microbiología que me

ayudo a mi crecimiento profesional y personal

Al Doctor Fabio Ancízar Aristizábal, mi director de tesis que me brindó la oportunidad de

entrar en el mundo de la investigación y siempre me brindó su apoyo; a la Doctora

Sandra J. Perdomo Lara mi codirectora, quien con sus conocimientos, experiencia y

paciencia me ha enseñado tanto y ha sido un gran apoyo, a ambos mil gracias por su

generosidad.

A la unidad de Virología de la Universidad el Bosque, especialmente a la Doctora Myriam

Velandia que permitieron el uso del termociclador Biorad en el cual se realizaron los

experimentos.

Doctora Gloria Lafaurie Directora de la Unidad de Investigación Básica Oral

Universidad el Bosque, que me permitió realizar algunos experimentos en el Laboratorio

del grupo UIBO

También me gustaría agradecer a la profesora Martha Fontanilla, coordinadora de la

Maestría que con sus consejos y apoyo me ha ayudado a formarme como persona e

investigadora.

A mis compañeros del grupo de Farmacogenética del cáncer y del grupo de Bioprocesos

y Bioprospección, por acompañarme en el proceso de formación.

A mis compañeros y amigas de la maestría con quienes he compartido tanto tiempo

principalmente a Viviana, Melissa y Deisy que siempre estuvieron a mi lado,

apoyándome.

VIII Título de la tesis o trabajo de investigación

A mi familia y amigos que durante este tiempo me entendieron y dieron ánimo para

continuar y terminar esta etapa.

Y a todas las personas que de una forma u otra me ayudaron en el momento en que

necesite y que no nombre aquí.

Resumen y Abstract IX

Resumen En el cáncer se presentan distintos cambios en el genoma, la amplificación de

oncogenes se ha descrito como una de las más frecuentes. Conocer la biología

molecular del cáncer e identificar cambios moleculares comunes en la heterogeneidad

del cáncer de pulmón tiene implicaciones importantes en el diagnóstico temprano,

progresión de la enfermedad, tratamiento a seguir y la posible respuesta a este; por esta

razón se hace importante la búsqueda e identificación de nuevos oncogenes que se

relacionen con cáncer pulmonar que sirvan como herramientas moleculares predictivas.

En este estudio se analizó el estado de amplificación de los oncogenes JUN, MDM2,

CCNE1, ALK, MITF y MDM4 reportados en la base de datos “Cancer Genome Project”

como genes amplificados en distintos procesos tumorales; se comparó el número de

copias génicas encontradas en tejido y en DNA libre en plasma de pacientes sanos y

pacientes con cáncer de pulmón con el fin de evaluar el posible uso de estos como

biomarcadores en cáncer pulmonar y la utilidad del DNA libre de plasma como

herramienta diagnostica para evidenciar las características moleculares del tumor.

De los genes evaluados ALK en plasma se encontró como el gen amplificado un mayor

número de veces, 46% y en tejido se encontró amplificado en un 28%, resultados que

mostraron diferencias significativas con los resultados obtenidos en pacientes sanos.

Con respecto a la sensibilidad de los oncogenes se encontraron valores por debajo de

48,57 indicando que no son capaces de discriminar el 100% de pacientes que sufren de

cáncer de pulmón, pero estos genes pueden servir como ayuda diagnostica junto a otras

pruebas.

Palabras clave: Amplificación, cáncer de pulmón, oncogenes, pruebas diagnósticas.

X Título de la tesis o trabajo de investigación

Abstract Cancer show differences changes in the genoma and the amplification has been

described as one of the most frequent. Knowing the molecular biology of cancer and the

molecular changes in the heterogeneity of lung cancer has important implications for the

early diagnosis, progression, treatment and the response to treatment. For this reason is

important the searching and identification of new oncogenes that are related with lung

cancer and can be used as predictive molecular tools.

In this study we analyzed the amplification of oncogenes JUN, MDM2, CCNE1, ALK,

MITF and MDM4 reported in the database “cancer Genome Project” as genes amplified

in different tumoral process; We compared the number of gene copy in tissue and DNA

free in plasma of healthy patients and lung cancer patients, in order to assess the

possible use of these biomarkers of lung cancer and the use of free plasma DNA as a

diagnostic tool to demonstrate the molecular characteristics of the tumor.

From the genes evaluated ALK was found in plasma as a greater number of times, 46%

and amplified in tissue was found 28%, results show statistically significant differences in

the copy number between healthy patients and patients with cancer. With respect to the

sensitivity of the oncogenes show values below of 48.57, indicating these genes are not

able to discriminate 100% of patients with lung cancer, but these genes can be used as

support for diagnosis, with other diagnostic methods.

Keywords: Amplification, lung cancer, oncogene, diagnostic test.

Contenido XI

Contenido

PÁG.

RESUMEN ........................................................................................................................................... IX

ABSTRACT ............................................................................................................................................ X

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................. XIII

LISTA DE TABLAS ............................................................................................................................... XIV

ABREVIATURAS (ESPAÑOL-“INGLÉS”). ................................................................................................ XV

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 1

OBJETIVO GENERAL .............................................................................................................................. 3

1. CANCER DE PULMON ................................................................................................................ 5

1.1 ESTADÍSTICA ......................................................................................................................................... 5

1.2 TIPOS HISTOLÓGICOS.............................................................................................................................. 6

1.3 DIAGNÓSTICO ....................................................................................................................................... 8

1.4 FACTORES DE RIESGO ............................................................................................................................. 9

1.5 GENÉTICA DEL CÁNCER DE PULMÓN ........................................................................................................ 10

1. 5.1. Amplificación en cáncer ............................................................................................................... 11

1.6 GENES AMPLIFICADOS EN CÁNCER EVALUADOS EN ESTE ESTUDIO: .................................................................. 12

1.6.1 Control ciclo celular (alteraciones vía de apoptosis) ..................................................................... 12

1.6.2. Factores de transcripción .............................................................................................................. 14

1.6.3 Receptor tirosina quinasa .............................................................................................................. 15

2. METODOLOGÍA .......................................................................................................................17

2.1 DESCRIPCIÓN DE LA POBLACIÓN.............................................................................................................. 17

2.1.1. Criterios de inclusión ..................................................................................................................... 17

2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA LA EXTRACCIÓN DE DNA............................................................... 18

2.2.1. Plasma sanguíneo ......................................................................................................................... 18

2.2.2. Tejido pulmonar ............................................................................................................................ 18

2.2.3. Líneas celulares ............................................................................................................................. 18

2.3 EXTRACCIÓN DE DNA .......................................................................................................................... 19

2.4 EVALUACIÓN DE LA DOSIS GÉNICA ........................................................................................................... 20

2.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS............................................................................................... 21

3. RESULTADOS...........................................................................................................................22

XII Evaluación del estado de amplificación de oncogenes, como marcadores moleculares en DNA libre en plasma de pacientes con cáncer pulmonar.

3.1 CURVAS DE EFICIENCIA PARA CADA GEN EN PCR EN TIEMPO REAL. ................................................................ 22

3.1.1 Curvas de eficiencia PCR múltiple en tiempo real. ......................................................................... 22

3.2 CURVAS DE EFICIENCIA PARA CADA GEN COMPARADAS CON EL GEN HOUSEKEEPING EN PCR MÚLTIPLE EN TIEMPO

REAL. 23

3.1.3. Líneas celulares ............................................................................................................................. 24

3.3 CARACTERÍSTICAS DE LA POBLACIÓN ........................................................................................................ 25

3.4 AMPLIFICACIÓN EN PLASMA SANGUÍNEO ................................................................................................. 27

3.5 AMPLIFICACIÓN EN TEJIDO DE PACIENTES CON CÁNCER DE PULMÓN ............................................................... 30

3.6 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LOS MARCADORES EVALUADOS EN PLASMA Y TEJIDO ...................................... 33

3.5.1 Poder predictivo de los marcadores ............................................................................................... 34

3.7 MUESTRAS PAREADAS .......................................................................................................................... 37

3.6.1 Correlación de Spearman ............................................................................................................... 37

4. DISCUSIÓN DE RESULTADOS .................................................................................................... 38

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................................................... 45

5.1 CONCLUSIONES ................................................................................................................................... 45

5.2 RECOMENDACIONES ............................................................................................................................ 46

A. ANEXO: GRÁFICOS Y TABLAS CON LOS VALORES DE CT OBTENIDOS EN CADA GEN

EN LA ESTANDARIZACIÓN DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN ................................................................. 47

B. ANEXO: VALIDACIÓN DE ΔΔCT PARA CADA GEN ........................................................................ 56

C. ANEXO. RESULTADOS DE AMPLIFICACIÓN EN PLASMA DE PACIENTES SANOS ............................ 62

D. ANEXO. RESULTADOS DE AMPLIFICACIÓN EN TEJIDO DE PACIENTES SANOS .............................. 63

E. ANEXO. RESULTADOS DE AMPLIFICACIÓN EN PLASMA DE PACIENTES CON CÁNCER ................... 64

F. RESULTADOS DE AMPLIFICACIÓN EN TEJIDO DE PACIENTES CON CÁNCER ................................. 65

BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................................... 66

XIII

Lista de figuras

PÁG.

Figura 1. Porcentaje de amplificación génica en plasma sanguíneo de

voluntarios sanos con respecto a pacientes con cáncer de pulmón. .......................................... 28

Figura 2. Diagrama de Cajas y bigotes de plasma sanguíneo de voluntarios

sanos (PS) y de pacientes con cancer (PC). Se observan los valores máximo,

mínimo, mediana y distribución de los cuartiles, obtenidos para cada gen y los

valores de P obtenidos con la prueba U de Mann-Whitney (P>0.05) .......................................... 29

Figura 3. Porcentaje de amplificación génica en tejido pulmonar de voluntarios

sanos y pacientes con cáncer de pulmón. .................................................................................. 30

Figura 4. Diagrama de cajas y bigotes de tejido de voluntarios sanos (PS) y

tejido de pacientes con cancer (PC), se observan los valores máximo, mínimo,

mediana y distribución de los cuartiles, obtenidos para gen. Valores de P

obtenidos con la prueba U de Mann- Whitney (P>0.05) ............................................................ 32

Figura 5. Curvas ROC obtenidas para plasma sanguíneo. Se observan las curvas

ROC y sus respectivos valores AUC, obtenidos en plasma de pacientes con

cáncer respecto a plasma de voluntarios sanos. ........................................................................ 35

Figura 6. Curvas ROC obtenidas para tejido de pulmón. Se observan las curvas

ROC y sus respectivos valores AUC, obtenidos en tejido de pacientes con

cáncer respecto a tejido de pacientes sanos. ............................................................................. 36

XIV Evaluación del estado de amplificación de oncogenes, como marcadores moleculares en DNA libre en plasma de pacientes con cáncer pulmonar.

Lista de tablas PÁG.

Tabla 1. Líneas celulares utilizadas ......................................................................................... 19

Tabla 2. Secuencia de los cebadores y sondas utilizados ......................................................... 20

Tabla 3.. Valores de las eficiencias de los genes blancos en las reacciones múltiplex de

PCR entiempo real utilizando sondas Taqman. ....................................................................... 23

Tabla 4. Valores de las pendientes obtenidas en la gráfica logarítmica para

determinar las eficiencias similares entre los genes blanco y el gen normalizador o

housekeeping. ........................................................................................................................ 24

Tabla 5. Valores de la dosis génica de los oncogenes evaluados en diferentes líneas

celulares de cáncer. ................................................................................................................ 25

Tabla 6. Características clínico patológicas de pacientes con cáncer estudiados ..................... 25

Tabla 7. Características clinicopatológicas de los voluntarios sanos que donaron las

muestras de plasma utilizadas en el estudio ........................................................................... 26

Tabla 8. características de controles de tejido pulmonar de pacientes sin cáncer de

pulmón. .................................................................................................................................. 27

Tabla 9. Número de copias encontrado para cada oncogen. Se observan los valores

de dosis génicas clasificados en tres categorías: no amplificado, bajo nivel de

amplificación (entre 2 y 10 copias) y alto nivel de amplificación (más de 10 copias),

encontrados en tejido de pacientes sanos y pacientes con carcer y y plasma de

pacientes sanos y pacientes con cáncer de pulmón. En el rango se anotó el numero

de 2-ΔΔCT más bajo y mas alto encontrado en la muestra. ...................................................... 31

Tabla 10. Evaluación del plasma para predecir el estado de amplificación de los 6

genes evaluados. VPP= valor predictivo positivo. VPN = valor predictivo negativo. Se

describe entre paréntesis los límites inferior y superior correspondientes a un

intervalo de confianza del 95%. .............................................................................................. 34

Tabla 11. Evaluación del tejido para predecir el estado de amplificación de los 6

genes evaluados. VPP= valor predictivo positivo. VPN = valor predictivo negativo. Se

describe entre paréntesis los límites inferior y superior correspondientes a un

intervalo de confianza del 95%. .............................................................................................. 34

Tabla 12. Número de copias génicas de los diferentes genes encontrado en las

muestras pareadas. (rho)= coeficiente de correlación de Spearman y p= nivel de

significancia. Las muestras amplificadas se muestran resaltadas. ............................................ 37

XV

Abreviaturas (español-“inglés”).

ACTB: β-Actina, gen housekeeping.

ADC: Adenocarcinoma

ALK: Quinasa de linfoma anaplásico “Anaplastic lymphoma kinase”

CCNE1: Ciclina E1

JUN: Gen homólogo del virus del sarcoma aviar codifica la proteína c-jun

LCNEC: carcinoma neuroendocrino de célula grande

MDM2: “Murine doble minute 2”

MDM4: “Murine doble minute 4”. También conocido como MDMX

MITF: Factor de transcripción asociado a macroftalmia

CP: Cáncer de pulmón

NSCLC: Cáncer de pulmón de célula no pequeña. “Non-small Cell Lung Cancer”

PC: Plasma paciente con cáncer

PS: Plasma pacientes sano

SCLC: Cáncer de pulmón de célula pequeña. “Small Cell Lung Cancer”

TC: Tejido paciente con cáncer

TS: Tejido paciente sano

1

Introducción El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial; el cáncer pulmonar

tiene uno de los mayores índices de mortalidad con 1,59 millones de defunciones

anuales (OMS). Según estadísticas de GLOBOCAN en el 2012, se presentaron

1.824.701 casos (13%) con una mortalidad del 19.4% (1.589.800 muertes) en ambos

sexos, siendo el porcentaje de mortalidad más alto entre los diferentes tipos de cáncer

evaluados (GLOBOCAN). Los factores de riesgo asociados a esta patología son el

consumo directo de tabaco o la exposición al humo indirectamente por medio de

contaminación ambiental (Samet 2009), exposición a radiaciones ionizantes, factores

individuales como dieta, estilo de vida, exposición a sustancias carcinogénicas, como el

asbesto, radón, arsénico, berilio, cromo, níquel, entre otros y susceptibilidad genética.

Una de las características comunes en la mayoría de los tumores sólidos es el aumento

en el número de copias de diversos genes entre ellos se destacan los oncogenes

(Myllykangas y col 2007). La caracterización de éstos oncogenes como marcadores que

permitan la identificación de personas con mayor susceptibilidad de desarrollar esta

enfermedad, es un método potencial que podría servir para el diagnóstico temprano de

esta patología y por tanto tener la oportunidad de dar tratamientos más oportunos,

disminuyendo las tasas de mortalidad por esta enfermedad.

A pesar de los avances en el diagnóstico y detección de cáncer de pulmón, se sigue

diagnosticando en fases avanzadas y tiene un pobre pronóstico (Herbst y col 2008), la

eficiencia de los tratamientos actuales para el cáncer de pulmón dependen del momento

en que se ha realizado el diagnóstico y su pronóstico mejora si se detecta en estadios

tempranos; por esta razón la búsqueda e identificación de biomarcadores de tipo

diagnóstico en muestras de fácil obtención es una opción viable en el desarrollo de

métodos de detección temprana.

2 Evaluación del estado de amplificación de oncogenes, como marcadores moleculares en DNA libre en plasma de pacientes con cáncer pulmonar.

En investigaciones relacionadas con cáncer, la técnica de PCR en tiempo real es usada

ampliamente por su menor costo en comparación con otros métodos como la hibridación

in situ fluorescente (FISH) y puede ser usada como un método alternativo para realizar la

cuantificación de la dosis génica de diferentes oncogenes; si es empleada con una

muestra de fácil obtención y poco invasiva como el DNA libre en plasma, es posible

detectar con rapidez marcadores moleculares de interés. La detección de biomarcadores

por este método tiene el potencial de facilitar el diagnóstico y poder realizar un

tratamiento oportuno de esta enfermedad.

Anteriormente en el grupo de Farmacogenética del Cáncer del Departamento de

Farmacia de la facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia, se han

realizado otros estudios similares evaluando amplificación de oncogenes que se

encuentran reportados en la base de datos Cancer Genome Project (Sanger) MYCL1,

MYCN, MYC, EGFR, ERBB, AKT2, PI3KCA y REL en pacientes diagnosticados con

cáncer pulmonar, concluyendo que los genes MYCN y MYCL1 se encuentran

amplificados en cáncer de pulmón y que MYC y AKT2 son eficientes para diferenciar

muestras neoplásicas de sanas (Perdomo, 2012). En este trabajo se analizaron muestras

de plasma y tejido pulmonar de pacientes con cáncer de pulmón y controles sanos, con

el fin de identificar si los genes candidatos de esta investigación presentan porcentajes

de amplificación para ser biomarcadores en cáncer de pulmón y demostrar que los

resultados de plasma y tejido se correlacionan, por lo tanto, el plasma podría ser utilizado

con estos genes como muestra opcional para el tamizaje preventivo de cáncer de

pulmón. El grado de amplificación de los genes se evaluaron por PCR múltiple en tiempo

real, una técnica que con poca cantidad de muestra permite evaluar los valores de

amplificación.

El estudio busca establecer nuevos genes potenciales que sirvan como biomarcadores

en cáncer de pulmón y que puedan ser detectados en plasma sanguíneo en una muestra

mínimamente invasiva de fácil obtención y optimizar el manejo de lesiones

preneoplásicas.

3

OBJETIVO GENERAL Evaluar en muestras de biopsia y DNA libre de plasma de pacientes con cáncer de

pulmón el estado de amplificación de varios oncogenes y explorar su utilidad en el

diagnóstico molecular de la enfermedad.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

1. Implementar las metodologías de medición de dosis génicas por q-PCR para los

oncogenes ALK, CCNE1, MDM2, MITF, MDM4 y JUN.

2. Evaluar la dosis génica de los oncogenes ALK, CCNE1, MDM2, MITF, MDM4,

JUN, en muestras pareadas de biopsia y DNA libre proveniente de plasma, de

tejido pulmonar normal y tumoral, de pacientes colombianos con cáncer de

pulmón.

3. Evaluar la especificidad y la sensibilidad de los marcadores evaluados.

5

1. CANCER DE PULMÓN

1.1 Estadística

El cáncer de pulmón (CP) es una de las patologías tumorales más comunes y con las

tasas más altas de mortalidad a nivel mundial, produciendo 1.59 millones de muertes que

corresponden al 19.4% del total de muertes por cáncer. Según estadísticas de Globocan,

en el 2012 se presentaron 1.8 millones de casos nuevos (12,9%) principalmente en

países en vía de desarrollo. En Colombia en el año 2008, el CP presento una incidencia

del 6.7% y un porcentaje de mortalidad del 11.7% siendo el segundo después del cáncer

gástrico (GLOBOCAN 2012).

De acuerdo a información suministrada por el Instituto Nacional de Salud de Colombia,

entre los años 2000-2006 las regiones que presentaron los mayores índices de

mortalidad por CP se concentraron en Antioquia, el nororiente de la Cordillera occidental,

los valles aluviales del río San Juan, algunas zonas de la Región Pacífica, la Sierra

Nevada de Santa Marta y algunas zonas de los departamentos de Meta y Arauca; este

patrón está asociado al consumo de cigarrillo. En la encuesta realizada en 1994 se

observó una prevalencia más alta de consumo de tabaco en los departamentos de

Quindío, Caldas y Antioquia. Otros factores asociados al desarrollo de CP en estas

regiones son el alto nivel de arsénico de fuentes de agua subterránea en las zonas

montañosas, y la exposición a cromo, asbesto hidrocarburos policíclicos relacionados

con la actividad minera (Piñeros y col 2010).

El carcinoma de células escamosas fue en 1998 el subtipo histológico con la mayor

incidencia a nivel mundial, sin embargo, el adenocarcinoma actualmente presenta la

mayor incidencia. Con respecto al género, antes de la década de los 80 el cáncer

predominaba en hombres, luego esta tendencia fue disminuyendo, y por el contrario la

frecuencia de casos en mujeres fue aumentando por el incremento en el consumo de

cigarrillo (Lortet-Tieulenta y col 2014).


1.2 Tipos histológicos

El diagnóstico de cáncer de pulmón se realiza por histología y citología, en relación con

esto, la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Asociación Internacional para el

Estudio del Cáncer de Pulmón (IASLC) realizó la clasificación histológica distinguiendo

dos grupos importantes; carcinomas de células pequeñas no microcítico (SCLC) y

carcinoma de células no pequeñas (NSCLC) en este último grupo se encuentran,

adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas y carcinoma de célula grande,

estos a su vez se subclasifican con tipos más específicos. Esta clasificación se realizó en

base a las características histológicas similares, diseminación de la metástasis y

tratamiento similar (Travis 2002). Debido a los enfoques terapéuticos actuales, además

de clasificar los tumores por su morfología, se han empezado a clasificar según

parámetros inmunohisquímicos y características genéticas, La distinción entre

adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas ha incrementado debido a las

mutaciones, reordenamientos, amplificaciones que presentan y las diferencias en sus

tratamientos (Travis y col 2013). A continuación se describen los 4 tipos histológicos

principales.

El adenocarcinoma (ADC) presenta el mayor porcentaje de incidencia en los últimos años

(Lortet-Tieulenta y col 2014), la mayoría se diagnostica en la periferia del pulmón; en la

biopsia o citología se ve una clara morfología glandular como acinar, papilar lepídica o

solida con patrones de mucina. En tumores que no muestran estas características

morfológicas, se evalúa por inmunohistoquímica el marcador específico para

adenocarcinoma TTF1 y P63 o P40 para carcinomas de células escamosas; si el tumor

es positivo para TTF1 y negativo para células escamosas, se clasifica como carcinoma

de células no pequeñas (NSCLC) a favor de adenocarcinoma, si el tejido es negativo

para ambos marcadores se clasifica como (NSCLC) otro no especificado (Travis y col

2013). Además, otro marcador que se recomienda para adenocarcinoma es NapsinA

(Turner y col 2012).

Por otra parte, se ha observado que amplificaciones o mutaciones en el gen EGFR y

reordenamientos de ALK se encuentran casi exclusivamente en adenocarcinomas, y los

7

inhibidores de los receptores tirosina quinasa son la primera elección en el tratamiento

(Bell y col 2005; Maemondo y col 2010; Gandi y col 2012). En no fumadores se han

reportado mutaciones en los genes EGFR y ROS1, además de reordenamientos de ALK,

y en fumadores mutaciones en los genes KRAS, TP53, BRAF, JAK2, y JAK3 y en los

genes del sistema de reparación de apareamientos erróneos (MMR) (Govidan y col

2012).

El carcinoma de células escamosas, es el segundo subtipo más frecuente de cáncer de

pulmón y se encuentra asociado al hábito de fumar (Lortet-Tieulenta y col 2014), se ubica

principalmente en la parte central del pulmón y pocas veces en la periferia;

morfológicamente se observan puentes intracelulares con formación de perlas

escamosas y queratinización de células individuales. En resecciones se encuentran las

variantes papilares, células claras, células pequeñas, basales. Cuando la morfología no

es clara, se realiza evaluación inmunohistoquímica de los marcadores p63 o p40, si son

positivos para estos y negativos para TTF1 se considera carcinoma pulmonar de células

no pequeñas a favor de carcinoma de células escamosas (Travis y col 2013). Las

alteraciones genéticas no se han identificado completamente y los blancos de tratamiento

no se han establecido; las mutaciones y amplificaciones que se presentan con mayor

frecuencia son P13KCA, DDR2, FGFR1 y EGFRvIII, pero debe continuar el estudio de

estas. (Okudela y col 2007; Hammerman y col 2011, Okamoto y col 2003; Heist, y col

2012). Además se han encontrado alteraciones en las vías CDKN2A/RB1,

NFE2L2/KEAP1/CUL3, PI3K/AKT y SOX2/TP63/NOTCH1 evidenciando la desregulación

en el ciclo celular en respuesta a estrés oxidativo, señales apoptóticas y diferenciación de

células escamosas (The Cancer Genome Atlas Research Network. 2012.).

El carcinoma de células grandes consiste en células grandes poligonales organizadas en

hojas, nidos, con núcleos vesiculares y nucléolos prominentes, situadas generalmente en

la periferia del parénquima celular, el diagnóstico no se puede realizar de biopsias o

muestras pequeñas sino de resección de pulmón. Puede presentarse algunas variantes

incluyendo carcinoma neuroendocrino de célula grande (LCNEC), carcinoma endocrino

de célula grande combinado, carcinoma basaloide, carcinoma similar a linfoepitelioma,

carcinoma de células claras, carcinoma de célula grande con fenotipo rabdoide.


El carcinoma de células pequeñas se presenta en un 20 % de casos, son células de

tamaño pequeño, redondas o fusiformes, escaso citoplasma, cromatina nuclear granular

fina, nucléolo discreto o ausencia de este; la necrosis crece rápidamente, la tasa de

mitosis es alta. Se presenta como una masa central y se puede extender a nódulos

linfáticos y hacer metástasis. Generalmente no se necesita realizar inmunohistoquímica,

pero en casos complicados se puede utilizar anticuerpos pancitoqueratina, como

AE1/AE3 con el fin de confirmar que es carcinoma, o marcadores neuroendocrinos como

CD56; el anticuerpo TTF-1 se encuentra positivo en un 70 - 80%. Es un tipo histológico

de fumadores pesados y de los tumores pulmonares tiene el crecimiento más agresivo

(Travis 2011). No se han descrito blancos específicos para terapia, algunos estudios han

reportado inactivación de TP53 y RB1, mutaciones en los genes CREBBP, EP300 y MLL

(modificadores de histonas), PTEN, SLIT2, EPHA7 y mutaciones en FGFR1 (Peifer y col

2012).

1.3 Diagnóstico

El diagnóstico de CP se realiza en estados tardíos de la enfermedad cuando se ha

identificado algún factor de riesgo previamente indicado o se han presentado síntomas,

en ese momento generalmente el tumor ya se ha establecido, se ha presentado invasión

y metástasis. Los primeros procedimientos son búsqueda de masas sospechosas y luego

la confirmación por métodos que pueden ser invasivos, como los siguientes (Rivera y col

2003, Guía clínica, OncoSur 2007).

Radiografía del torax: Se observan los tumores o líquido anormal, luego de esto se

debe realizar confirmación. La sensibilidad de la radiografía de tórax está estimada en

menos del 50% y la especificidad alrededor del 89% (Bastidas y col 2008).

Tomografía computarizada: Se captan imágenes de tumores, líquidos anormales,

ganglios linfáticos inflamados, no es invasiva y debe confirmarse por otras técnicas.

PET (tomografía por emisión de positrones): La tomografía por emisión de positrones

con 2-[18F]-fluoro-2-desoxi-D-glucosa (FDG-PET, de las siglas en inglés) detecta áreas

con un aumento de la captación de glucosa (secundario a un incremento de la actividad

9

metabólica), permitiendo la detección de la enfermedad en órganos o tejidos con

apariencia normal (como los ganglios linfáticos).

Broncoscopía: Es la técnica de elección, proporciona información útil para el

tratamiento, su sensibilidad diagnóstica es superior en los tumores centrales, en los

tumores endoscópicamente visibles, la sensibilidad diagnostica supera el 90%, en el

resto la rentabilidad es menor y puede ser necesario realizar otras técnicas diagnósticas.

Citología de esputo: Es un método de diagnóstico sencillo y no invasivo pero de

sensibilidad muy variable. Reservado únicamente para los pacientes que rechazan o son

incapaces de tolerar otros procedimientos más agresivos (Bastidas y col 2008).

Punción aspiración con aguja fina (PAAF): En tumores periféricos tienen una

sensibilidad del 90%, en esta técnica se inserta la aguja para extraer la muestra del tejido

o líquido, la complicación más frecuente es el neumotórax.

Toracocentesis y/o Biopsia pleural Se utiliza cuando exista derrame pleural y el tumor

no se pueda diagnosticar mediante las técnicas anteriores. Se extrae líquido anormal o

tejido por medio de un catéter o de una aguja, introducidos percutáneamente en la

cavidad torácica hasta el espacio pleural.

Biopsia quirúrgica (Mediante mediastinoscopia, mediastinotomía, toracoscopia o

toracotomía) Cuando excepcionalmente no se alcance el diagnóstico por ninguno de los

métodos anteriores.

1.4 Factores de riesgo

El principal factor de riesgo para CP es el tabaco, el riesgo aumenta con la cantidad de

cigarrillos fumados por día, dosis acumulada, número de años de consumo, edad de

inicio del hábito de fumar (Caicoya y Mirón 2003). Algunos de los compuestos

carcinogénicos que se han identificado en el cigarrillo, son hidrocarburos aromáticos,

hidrocarburos heterocíclicos, N-nitrosaminas, aminas aromáticas, aminas heterocíclicas,

aldehídos, compuestos fenólicos, hidrocarburos volátiles (isopreno, 1.3-bitadieno,

benceno etc.), acetamida, acrilamida y metales (arsénico, berilio, níquel, cromo, cadmio,

cobalto (Hoffmann and Hoffmann 2001); estos compuestos interactúan directamente con


el DNA de las células produciendo mutaciones en las bases nitrogenadas; según el

tiempo y cantidad de exposición conlleva a lesiones neoplásicas.

Otros de los principales factores de riesgo implicados en su aparición es el contacto con

otros carcinogénicos principalmente exposiciones ocupacionales; se ha demostrado que

existe relación en la incidencia de cáncer y trabajadores de fundiciones de plomo;

también personas que beben agua contaminada con arsénico, (Englysta y col 2001;

Chen y col 2004) y asbesto (Loomis y col 2009), personas que trabajan en minas y tienen

contacto con radón el cual causa cambios en la bases del DNA y rompimiento de las

hebras cromosomales (Turner y col 2011), hidrocarburos aromáticos policíclicos entre

otros contaminantes del ambiente (Arden y col 2002, Samet 2009); la mayoría de

personas en el mundo cocinan con carbón, madera, combustibles o aceites que

producen emisiones cargadas de partículas (hidrocarburos aromáticos policíclicos,

monóxido de carbono, formaldehido, dióxido de nitrógeno) en espacios cerrados las

cuales se asocian con el riesgo de cáncer de las vías respiratorias (Kim y col 2011;

Downwarda y col 2014 ).

Además de las sustancias que favorecen la aparición de esta enfermedad se encuentran

genes relacionados con susceptibilidad al cáncer (Gorlova et al 2007). Otro factor es el

bajo consumo de frutas y verduras que proporcionan antioxidantes y factores de

protección ante sustancias carcinogénicas. (Soerjomataram y col 2010; Dosil-Díaz y col

2008).

1.5 Genética del cáncer de pulmón

El cáncer es un proceso en el cual se encuentran varias mutaciones en el genoma,

generando proliferación celular sin control, las mutaciones varían según la población, la

diversidad genética, las sustancias carcinogénicas a los que se encuentran expuestos, el

tiempo y cantidad de las exposiciones, infecciones por virus y hongos, entre otros

factores. Estas mutaciones pueden ser puntuales afectando una sola base, otras incluyen

cambios en un segmento de un cromosoma, aumento en el número de copias de un gen

y amplificación del segmento, también se puede producir lo contrario deleción en las

copias del gen, reordenamientos, metilación y translocaciones. (Stratton y col 2009;

Pleasance y col 2010; Chin y Gray 2008). Las células tumorales presentan

11

características similares, desregulación de las señales promotoras de crecimiento,

aumento de las señales de proliferación, evasión de los supresores de crecimiento,

potencial de replicación ilimitado generando la inmortalización, aumento de la capacidad

angiogénica, activación de la invasión y metástasis, evasión de la muerte celular,

reprogramación del metabolismo energético con el fin de mejorar la proliferación

neoplásica y evasión de la destrucción inmunológica (Hanahan y Weinberg 2011).

1. 5.1. Amplificación en cáncer

La amplificación de genes es el aumento en el número de copias génicas de una región

de un brazo de un cromosoma, este incremento de segmentos es de 0,5 a 10

megabases, y se diferencia de aneuploidias y translocaciones porque estas afectan

grandes regiones cromosómicas. (Lengauery col 1998). La amplificación génica no es

detectada en células normales, indicando que existen mecanismos normales en las

células para prevenir la amplificación (Wright y col 1990). Los sitios frágiles del DNA son

regiones se pueden definir como puntos específicos de los cromosomas con mayor

susceptibilidad a rupturas y reordenamientos cromosómicos en las células somáticas. Se

relaciona con inestabilidad genética en la célula asociada con estados avanzados de

malignidad del tumor, aunque también aparezca en tumores benignos. La amplificación

génica es prevalente en algunos tumores sólidos y se encuentra asociado con la

sobreexpresión de genes principalmente oncogenes (Myllykangas y col 2007).

Representa una de las principales vías moleculares en las cuales el potencial oncogénico

de los protooncogenes es activado durante la tumorigénesis (Schwab 1998). Alteraciones

de número de copias de células somáticas se han encontrado en varios tipos de cáncer

(Beroukhim, R y col 2010) y cambios en la expresión y en el número copias de algunos

genes se han observado en diferentes tipos de cáncer de pulmón (Dehan et al 2007;

Bergh 1990; Dutt et al 2011, Choi et al 2007). Citogeneticamente las regiones de

amplificación génica se pueden presentar como:

• Cromosomas dobles minutos: DNA extracromosomal circular que contiene 1 a 2

millones de pares de bases las cuales se replican autónomamente, no tienen

centrómero los cual hace que su segregación sea aleatoria en las células hijas.

• Regiones homogéneas de tinción: Son segmentos intracromosomales formados

por regiones genómicas largas.


• Inserciones discretas distribuidas a lo largo del genoma. (Albertson, 2006).

1.6 Genes amplificados en cáncer evaluados en este estudio:

El instituto Sanger en el proyecto del genoma del cáncer “Cancer Genome Project” en su

base de datos reporta que los siguientes presentan aumento en el número de copias

“amplificación” en cáncer: AKT2, ALK, CCNE1, EGFR, ERBB2, JUN, LMO1, MDM2,

MDM4, MITF, MYC, MYCL1, MYCN, NKX2-1, REL, SOX2, de los cuales en trabajos

anteriores realizados por el grupo de trabajo Farmacogenética del Cáncer de la

Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia, se evaluó la

amplificación en CP de los oncogenes MYC, MYCN, MYCL1, EGFR, ERBB2, AKT2

(Álvarez y col 2012) y MYCL1, MYCN, MYC, EGFR, ERBB2, AKT2, REL, PI3KCA

(Perdomo 2012). En este trabajo se evaluó la amplificación de los genes ALK, CCNE1,

MDM2, MITF, MDM4, JUN en muestras clínicas de pacientes con cáncer de pulmón.

1.6.1 Control ciclo celular (alteraciones vía de apoptosis)

CCNE1: Ciclina E1. Localizado en 19q12. Codifica para una proteína altamente

conservada de la familia ciclina, se encuentra presente durante el ciclo celular, regulan

las CDC quinasas. Esta ciclina forma un complejo con una subunidad regulatoria de

CDK2, y su actividad es requerida para la transición de G1/S en el ciclo celular. Esta

proteína se acumula en el límite de la fase G1/S y es degradada durante el progreso de

la célula hacia la fase S1. La sobreexpresión de este gen ha sido observada en varios

tumores, resultando en inestabilidad del cromosoma y contribuyendo en la tumorigénesis.

Esta proteína se ha encontrado asociada con la fosforilación de proteínas NPAT

(proteína nuclear asignada al locus ATM) que participa en el ciclo celular regulando la

expresión de genes histona y juega un papel crítico promoviendo la progresión del ciclo

celular en ausencia de pRB.

Amplificación de este gen se ha relacionado con resistencia a tratamiento con

trastuzumab, platino, taxol en carcinoma de ovario y cáncer de seno respectivamente con

un pobre pronóstico. (The Cancer Genome Atlas Research Network. 2011, Nakayama y

col 2010, Scaltritia y col 2011). Se ha reportado amplificación de CCNE1 y

13

sobreexpresión de ciclina E en cáncer orofaríngeo (Freier y col 2010) y en

adenocarcinoma pulmonar (Ding y col 2008, Weir y col 2007, Peifer y col 2012) asociado

con mutaciones de TP53 y con el hábito de fumar. (Blons y col 2008).

MDM2: (murine doble minute 2). Localizado en 12q14. La proteína MDM2 tiene 491

aminoácidos, la porción N-terminal interactúa con p53 y E2F, las zonas de aminoácidos

223-274 y 305-322, corresponden a un dominio acídico, y en el C-terminal tiene un

dominio dedos de zinc, el cual permite la homodimerización y la heterodimerización con

MDM4 y tiene la actividad ubiquitina ligasa. El blanco de este gen es el factor de

transcripción de la proteína antitumoral p53. La proteína codificada es una fosfoproteína

nuclear que se une al sitio trans-activador N-terminal e inhibe la transcripción génica de

la proteína tumoral p53; existe una retroalimentación negativa donde la proteína MDM2

se transcribe debido a la transactivación que p53 realiza (Moll y Petrenko 2003). La

sobreexpresión de este gen puede resultar en una inactivación excesiva de la proteína

p53, disminuyendo la función antitumoral de esta. MDM2 tiene una actividad ubiquitina

ligasa E3, cuyo blanco es la proteína p53 generando degradación proteosomal, esto

ocurre en el núcleo formando un complejo con las proteínas p300/CREB, con posterior

translocación al citoplasma. Esta proteína también influye en el ciclo celular, apoptosis, y

la tumorigénesis a través de interacciones con otras proteínas, incluyendo

retinoblastoma, factores de transcripción E2F, la proteína ribosomal L5 (Lehman y col

2008, Qiu y col 2008).

La amplificación de MDM2 se ha encontrado en tumores de tejidos blandos, como

osteosarcoma y carcinomas esofágicos (Momand y col 1998). En pacientes con CP de

células no pequeñas muestra un comportamiento tumoral agresivo y con mayor

capacidad de invasión de tejidos lo que se refleja en un peor pronóstico, comparado con

pacientes que no tienen amplificado el gen (Dworakowskaa y col 2004). Altos niveles de

la proteína MDM2 se han reportado en sarcomas, gliomas, tumores hematológicos (Li y

Lozano 2012).

MDM4: (Murine doble minute 4) homólogo de MDM2, también conocido como MDMX.

Localizado en 1q32. Este gen codifica una proteína nuclear que contiene un dominio de

unión a p53 en N-terminal y un dominio de dedos de zinc en el C-terminal presenta

similaridad estructural a la proteína MDM2 en la unión con la proteína p53. Ambas


proteínas se unen a la proteína supresora de tumores p53 e inhiben su actividad, y se ha

demostrado sobreexpresión en una variedad de canceres humanos. Sin embargo a

diferencia de MDM2, esta proteína no degrada p53; la inhibe al unirse a su dominio de

activación transcripcional. Esta proteína también interactúa con la proteína MDM2 vía del

dominio de anillo de zinc, e inhibe la degradación tardía. Esta proteína puede revertir la

degradación de p53 realizada por MDM2, mientras mantiene la supresión de las

funciones de transactivación y apoptosis.

Se ha reportado amplificados varios tumores como; glioma, carcinoma escamoso de

cabeza y cuello, retinoblastoma y cáncer de seno. (Riemenschneider y col, 2003; Nikia y

co, 2006; Yu y col 2014; Valentin-Vega, 2007).

1.6.2. Factores de transcripción

MITF: Factor de transcripción asociado a macroftalmia. Localizado en 3p14.2-p14.1.

Este gen codifica un factor de transcripción que contiene en sus características

estructurales un dominio hélice-bucle-hélice básico de cremallera de leucina. Se une al

DNA a la secuencia promotora CACGTG (caja E) y a la secuencia no palíndroma

CACATG en forma de homodímeros o heterodímeros con los factores de transcripción

TFE3 y TFEC. Regula la diferenciación y el desarrollo de los melanocitos del tejido

pigmentario de la retina, copa óptica derivada de la retina, mastocitos y osteoclastos.

(Levy y col 2006).

MITF controla genes involucrados en supervivencia celular, proliferación e invasividad,

(Carreira y col 2006). Se encuentra amplificado en el 15 al 20% de los melanomas

metástasicos y se asocia con una baja sobrevida (Ugurel y col 2007, Garraway 2005).

JUN: Localizado en 1p32-p31. Este gen es el gen homólogo del virus del sarcoma aviar

17. Este codifica una proteína la cual es altamente similar a la proteína viral, e interactúa

directamente con la secuencia específica de DNA blanco para regular la expresión. Este

gen no tiene intrones, está localizado en 1p32-p31.

La proteína celular c-Jun forma homodímeros o heterodímeros con Fos, ATF, Maf,

formando el complejo AP-1, este factor se ha identificado como el principal regulador de

melanoma, influenciando progresión tumoral, proliferación, migración, invasión

15

angiogénesis, además regula controladores del ciclo celular, ciclina D1, ciclina E (Jin y

col 2012). En carcinoma de células escamosas se observó que c-Jun regula el

crecimiento (Zhang y col 2006); en el desarrollo de cáncer de hígado, previene la

apoptosis de p53. (Eferl y col 2003). La sobreexpresión de la proteína y amplificación del

gen bloquea la diferenciación de los adipocitos de melanoma en etapas tempranas y se

asocia con un fenotipo más agresivo (Mariani y col 2007). En cáncer de pulmón la

expresión alterada de c-jun se relaciona con células independientes de anclaje. (Maeno y

col, 2006).

1.6.3 Receptor tirosina quinasa

ALK: (Anaplastic lymphoma kinase). Localizado en 2p23. Este gen codifica un receptor

tirosina quinasa, el cual pertenece a la superfamilia del receptor de la insulina. Esta

proteína comprende un dominio extracelular N terminal en el cual se encuentra el

dominio de reconocimiento del ligando, un tramo hidrofóbico que corresponde a una

región transmembrana de paso único, y un dominio catalítico intracelular tirosina quinasa.

Juega un rol importante en el desarrollo del cerebro y ejerce su efecto en neuronas

específicas en el sistema nervioso.

En tumores primarios avanzados o tumores metastásicos de neuroblastoma se han

identificado mutaciones en el dominio tirosina quinasa y amplificación del gen, que se

correlaciona con aumento de la expresión, fosforilación, actividad quinasa de ALK y

resultados no favorables, concluyendo que la proteína ALK contribuye a la oncogénesis

en neuroblastoma (Carén y col 2008). En carcinoma hepatocelular, se encuentra con

ganancia en número de copias génicas y esto se asocia a un pronóstico desfavorable

(Jia y col 2014). En cáncer de pulmón se encuentran pacientes con translocación de

EML4 (echinoderm microtubule-associated protein-like 4) y ALK resulta de la inversión

inv(2)(p21;p23), el reemplazo del dominio extracelular y transmembranal de ALK por la

región de EML4 resulta en una proteína fusionada con actividad tirosin-quinasa

fuertemente incrementada, se encuentra en adenocarcinomas, personas jóvenes, no

fumadoras y sin mutaciones de EGFR – KRAS. (Zhang y col 2010, Shaw y col 2009),

ALK también se fusiona con KIF5B. (Wong y col 2011). La prognosis de los casos que

presentan fusiones de ALK con EML4 es mejor con respecto a la los que no presentan la

mutación (ALK negativos) debido a la posibilidad de ser tratados con inhibidores de


tirosina quinasa (Kwak y col 2010). La amplificación de este gen se ha encontrado en

cáncer de pulmón de células no pequeñas. (Salido y col 2011).

17

2. Metodología

2.1 Descripción de la población

Se utilizaron 35 muestras de plasma sanguíneo de pacientes diagnosticados con cáncer

primario pulmonar (CP) atendidos en el Hospital Santa Clara, Fundación Santa Fe de

Bogotá y Hospital Militar entre los años 2004 al 2009. Las muestras de los 35 pacientes

con CP se compararon con 20 muestras de plasma sanguíneo de voluntarios sanos, no

fumadores. Estas muestras pertenecen al banco de muestras del grupo de

Farmacogenética del cáncer de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá,

recolectadas dentro del proyecto ¨Alteraciones genéticas y epigenéticas como

marcadores moleculares para cáncer pulmonar¨.

De las 35 muestras de plasma de pacientes con CP se cuenta con 14 muestra pareadas

que también tienen muestra de tejido embebido en parafina. También se analizaron 18

muestras de tejido de pacientes con cáncer de pulmón con el fin de realizar la

comparación de la dosis génica. Como control se incluyeron 15 muestras de tejido

pulmonar de pacientes sanos obtenidos por necropsias pulmonares proporcionadas por

el departamento de Patología del Hospital Santa Clara.

2.1.1. Criterios de inclusión

Los criterios que se tuvieron en cuenta para incluir o excluir pacientes fueron los

siguientes:

Pacientes con diagnostico confirmado de cáncer primario pulmonar con los siguientes

tipos histológicos: adenocarcinoma, carcinoma escamoso, carcinoma anaplásico de

célula grande, carcinoma anaplásico de célula pequeña.

Pacientes que firmaron el consentimiento informado.


La obtención de la muestra de sangre y tejido embebido en parafina se obtuvo antes de

la cirugía, sin haber recibido tratamientos de quimio o radioterapia.

2.2 Procesamiento de las muestras para la extracción de DNA

2.2.1. Plasma sanguíneo

El comité de ética realizó la aprobación de las muestras y consentimiento informado

firmado por los pacientes. Luego se realizó la obtención de muestras de sangre

periférica, en tubos con EDTA, se centrifugo a 1800 rpm por 10 minutos, se recogió el

plasma, se realizó una segunda centrifugación a 3000 rpm por 10 minutos, con el fin de

eliminar la contaminación de la muestra con DNA linfocitario. El plasma obtenido se

almacenó a -70ºC para la posterior extracción de DNA. (Perdomo 2012)

2.2.2. Tejido pulmonar

Después de obtener el tejido pulmonar embebido en parafina, los casos fueron revisados

por parte del patólogo para confirmar el diagnóstico histopatológico. A cada bloque de

parafina se le realizaron 3 cortes histológicos seriados; el primero de 3µm de espesor

que se utilizó para delimitar las áreas tanto de tejido pulmonar neoplásico como tejido

normal, y tres cortes de 10 µm para separar las células por micro-disección. (Perdomo

2012).

2.2.3. Líneas celulares

Las líneas celulares tumorales (Tabla 1) fueron cultivadas hasta una confluencia del 80%

según indicaciones ATCC en frascos de cultivo celular de 75 cm2, en una atmósfera con

5% de CO2 y a 37°C. La monocapa se lavó con PBS y se agregó tripsina por 15 minutos,

19

la suspensión se centrifugó a 1500 rpm por 5 minutos, obteniendo el pellet para luego

realizar la extracción de DNA.

Línea Celular Origen Tipo Histológico Fuente A549 Pulmón carcinomatoso Adenocarcinoma ATCC NCI-H520 Pulmón Carcinoma Escamocelular ATCC NCI-H727 Pulmón-Bronquio Carcinoide ATCC NCI-H292 Pulmón Carcinoma Mucoepidermoide ATCC

NCI-H82 Pulmón Carcinoma, cáncer de pulmón de células pequeñas ATCC

HT-29 Colon Adenocarcinoma colorectal ATCC PC3 Próstata Adenocarcinoma grado IV ATCC HEP G2 Hígado Carcinoma hepatocelular ATCC HeLa Cérvix Adenocarcinoma ATCC MDA-MB-231 Glándula mamaria, seno Adenocarcinoma ATCC MCF7 Glándula mamaria, seno Adenocarcinoma ATCC Tabla 1. Líneas celulares utilizadas

2.3 Extracción de DNA

La extracción del DNA se realizó por el método de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico

(25:24:1) y precipitación con etanol (Köchl y col; 2005). Se agregó 200µl de buffer (50mM

tris HCL pH 8.0, 2mM Acetato de Calcio) y 10 µl de proteinasa K (20µg/µl) a 56oC y se

incubó durante 16 horas el plasma sanguíneo (200 µl) y tejido microdisectado; el pellet

de las líneas celulares se incubó solo 1 hora y se inactivó la enzima al incubar las

muestras a 95°C por 5 minutos.

La precipitación de proteínas se realizó adicionando 200 µL de fenol:cloroformo:alcohol

isoamílico (25:24:1), luego se agitó por vórtex y se centrifugó a 10.000 rpm por 10

minutos. La fase acuosa se recuperó y se adicionó un volumen igual de cloroformo,

repitiendo la centrifugación y la recuperación de la fase acuosa; se adicionó 0,1

volúmenes de Acetato de Sodio 3M (pH 5,2) y dos volúmenes de etanol absoluto frío, se

mezcló por inversión y se dejó precipitando toda la noche a -20ºC, a continuación se

centrifugo a 10000 rpm por 10 minutos y se procedió a eliminar el sobrenadante, el pellet

de DNA se lavó adicionando etanol al 70% frio, se centrifugó nuevamente, se descartó el

sobrenadante y se dejó secar a temperatura ambiente, luego se resuspendió en 50 µL de


agua estéril. La calidad del DNA se evaluó con PCR convencional, amplificando una

secuencia Alu de 247 pb con los cebadores y condiciones reportadas en literatura

(Umetani et al 2006) y electroforesis en gel de agarosa al 2%. El DNA obtenido se

cuantificó espectrofotométricamente usando NanoDrop® (ND-1000 Spectrophotometer) y

se almacenó a -20ºC hasta su uso (Perdomo, 2012).

2.4 Evaluación de la dosis génica

El diseño de los cebadores y de las sondas se realizó con el programa Beacon designer

8.02, a continuación se reportan las secuencias usadas (Tabla 2).

GEN Secuencia de la sonda (5'-3') Cebador derecho (5'-3') Cebador izquierdo (5'-3')

ACTB TEX 615 TCTCTTCTCTGACCTGAGTCTCCTT BHQ-2

CTCACTGGTTCTCTCTTC CCACAACACTGTCTTAGA

MDM2 HEX CGCTCGTACGCACTAATCCG BHQ-1 CTGTGTGTCGGAAAGATG GGGGATCATTCCACTCTC

JUN FAM AACGACCTTCTATGACGATGCC BHQ-1 GACGGACTGTTCTATGAC GGGTTACTGTAGCCATAAG

MDM4 HEX AGCCTCCACACTGCCACTAAC BHQ-1 CTAGGCTTGTACAATGGA GCACTACATACATCTAACTATAC

ALK HEX CGGCTCCTTCCACCTGATCT BHQ-1 TCCAGGTCTGTTTCATTTAG CTCTGAACAGTCCTTGGTA

CCNE1 FAM ATACATTCAGCCAGGACACAATAGTCA BHQ-1

CATCGGTCTCTTTTCTCTC GCACTTCATGTAAGTCATTTAG

MITF Cy5 CTTAGTTCATCTTGTTGCTGTGCCATC BHQ-2 GACACAAGTTCTTCCTTCA TGACCTGTTCACACAAAG

Tabla 2. Secuencia de los cebadores y sondas utilizados

El número de copias génicas se evaluó en cada muestra por PCR múltiple en tiempo real

previamente estandarizada, utilizando las sondas Taqman® y tomando el gen β-Actina

(ACTB) como gen normalizador, según descrito por Livak y Schmittgen 2001.

La evaluación del cambio en el número de copias génicas se realizó con el método de

cuantificación relativa utilizando como gen normalizador β-Actina (ACTB), y aplicando la

fórmula 2-∆∆CT, donde ∆∆CT (∆∆CT gen problema - ∆∆CT ACTB) pacientes con cáncer -

(∆∆CT gen problema- ∆∆CT β-Actina) pacientes sin cáncer. Valores de 2-∆∆CT >2 se

consideraron amplificación génica (Hirsch y col 2009; Huanga y col 2007). Las

reacciones de qPCR se realizaron en un volumen final de 10 µL, el cual contenía 5µl de

21

Master mix LightCycler® 480 Probes Master (Roche), una concentración de 0.05µM de

cebador para el gen MDM4 y 0.2µM de los cebadores de JUN; MDM2, ALK, CCNE1 y

MITF (tabla 2) y una concentración de 0.2µM de sondas Taqman® completando el

volumen final con agua grado biología molecular. La amplificación se realizó en el equipo

CFX96 de Biorad con el siguiente protocolo: Denaturalización 10 minutos a 95°C, luego

50 ciclos amplificación a 95°C por 15 segundos y 59°C por 45 segundos y por último un

enfriamiento a 40°C por 30 segundos; se corroboró el tamaño del producto en geles de

agarosa al 2%.

Para evaluar la eficiencia de reacción con las diferentes concentraciones de cebadores y

sonda se realizaron curvas de eficiencia con diferentes concentraciones de DNA

genómico, obteniendo eficiencias entre 90% y 110%.

2.5 Análisis estadístico de los resultados

Se compararon los resultados de plasma y tejido de personas sanas y personas con

cáncer de pulmón y se realizaron diagramas de cajas y bigotes, la diferencia en el

número de copias génicas se evaluó con el test de Man Whitney’s con el programa

MedCalc.

La correlación entre muestras pareadas se realizó con la prueba de Spearman,

obteniendo el valor de p y el nivel de significancia rho.

22

3. Resultados

3.1 Curvas de eficiencia para cada gen en PCR en tiempo

real.

La cuantificación del número de copias génicas se realizó con la técnica de PCR múltiple

en tiempo real, con el método 2 -∆∆CT.

3.1.1 Curvas de eficiencia PCR múltiple en tiempo real.

Se calculó para cada gen la eficiencia dentro de la reacción de PCR, con diluciones de

DNA genómico de concentraciones conocidas por triplicado y graficando de forma

logarítmica los promedios de los CT resultantes contra los valores de concentración de

DNA, obteniéndose una pendiente (y) que debe ser cercana a -3,32, para tener una

eficiencia del 100% y se aplicó la siguiente fórmula

En la Tabla 3 se reportan las eficiencias para cada gen de las 3 reacciones. En el anexo

A se reportan los valores de CT y ∆CT obtenidos para cada gen por reacción y se

muestran las curvas de eficiencia donde con el valor de la pendiente y de la eficiencia.

La eficiencia de las reacciones se encontró dentro del parámetro recomendado (90-

110%), todos los genes detectaron las concentraciones desde 0.003 hasta 300 ng/µL de

DNA genómico, excepto MDM4 el cual sólo detecto hasta 0.03 ng/µL.

E = (10–1/ Pendiente) -1 × 100

23

GEN EFICIENCIA

REACCIÓN 1

ACTB 104.1%

JUN 106%

MDM2 96.3%

REACCIÓN 2

ACTB 105.7%

CCNE1 104.1%

ALK 106.5%

MIFT 106.8%

REACCIÓN 3 ACTB 102.4%

MDM4 91.6%

Tabla 3. Valores de las eficiencias de los genes blancos en las reacciones múltiplex de PCR entiempo real utilizando sondas Taqman®.

3.2 Curvas de eficiencia para cada gen comparadas con el gen housekeeping en PCR múltiple en tiempo real.

Para determinar que las eficiencias tanto del gen housekeeping y de los genes blancos

fueran similares, se utilizó el método reportado por Livak y Schimittgen en 2001. Este

método consiste en evaluar el cambio del CT del gen blanco – el cambio del CT del gen

housekeeping (∆CT del gen blanco - ∆CT del ACTB) realizando diluciones seriadas de

DNA de concentración conocida, con el fin de verificar las eficiencias. Los datos

obtenidos de ∆CT se grafican contra los valores de DNA en escala logarítmica, creando

una regresión lineal semilogarítmica. Los valores resultantes de la pendiente son los

criterios para evaluar en el experimento, si la pendiente es <0,1 se considera que las

eficiencias de los genes blanco con respecto al gen normalizador son similares.

Para esto, se efectuaron las reacciones multiplex, con los cebadores, sondas, master mix

y el DNA genómico en diluciones seriadas con concentraciones conocidas (300, 30, 3,

0,3, 0,03 y 0,003 ng/µl), esto se realizó por triplicado con cada una de las reacciones

multiplex. La primera reacción evaluó los genes ACTB, JUN y MDM2, la reacción 2 los

genes ACTB, CCNE1, ALK y MITF y la tercera los genes ACTB y MDM4. Las eficiencias


se obtuvieron graficando los CT obtenidos para cada gen. El valor de las diferencias de

los genes blancos con respecto al gen housekeeping se graficaron (anexo B) obteniendo

pendientes con valores <0.1 (Tabla 4)

GEN Valor de la pendiente (y)

REACCIÓN 1 JUN 0,0257

MDM2 -0,057

REACCIÓN 2

CCNE1 -0,033

ALK 0,0261

MIFT -0,018

REACCIÓN 3 MDM4 -0,089

Tabla 4. Valores de las pendientes obtenidas en la gráfica logarítmica para determinar las eficiencias similares entre los genes blanco y el gen normalizador o housekeeping.

3.1.3. Líneas celulares

El número de copias génicas de los oncogenes se evaluó en 11 líneas celulares

tumorales, A549, H727, H292, H520, H82 HEPG2, PC3, HeLa, MDA-MB-231, MCF7 y

HT29 se utilizó DNA genómico como muestra control (Tabla 5). Los cálculos se

realizaron con el método de ΔΔCT. El número de copias génicas de los genes no se

encontró aumentado en la mayoría de líneas celulares de origen tumoral, sólo se

encontró en la línea H727 carcinoide de pulmón, que MDM4 presento 4,4 copias génicas,

resultados que concuerdan con los encontrados por Hu y col en 2010. En la línea celular

HT29 se encontró MDM4 con 4,8 copias génicas y la línea MCF7 se encontró ligero

aumento en el número de copias génicas 2,4. Estas amplificaciones de estos oncogenes

se encontraron en dosis génicas bajas.

25

Líneas celulares

/ Oncogén JUN MDM2 CCNE1 ALK MITF MDM4

Número de

copias

génicas en

líneas

celulares de

cáncer

evaluadas

A549 0,2 1,2 1,4 0,5 0,9 0,5

H727 0,7 4,4 0,5 0,1 0,3 0,4

H292 0,3 0,8 1,0 0,8 0,3 0,9

H520 0,3 1,3 1,0 1,1 0,7 0,7

H82 0,4 1,1 0,5 1,8 0,2 0,3

HEP G2 1,5 1,2 0,8 0,4 0,7 1,3

PC3 0,1 1,2 1,0 0,4 0,8 0,2

HeLa 0,2 1,2 0,6 0,4 0,8 1,9

MDA-MB-231 0,2 1,2 0,9 0,3 1,2 1,6

MCF7 0,3 1,0 0,9 2,4 0,6 1,1

HT 29 0,1 0,4 0,5 0,7 0,3 4,8

Tabla 5. Valores de la dosis génica de los oncogenes evaluados en diferentes líneas celulares de cáncer.

3.3 Características de la población

VARIABLE PLASMA TEJIDO

GENERO

Masculino 22 (62,9%) 17 (53,1%)

Femenino 13 (37,1%) 15 (46,9%)

EDAD Promedio (rango) 54 (25-76) 53 (25-85)

HISTOLOGIA DEL TUMOR Adenocarcinoma 18 22

Escamocelular 9 2

Carcinoide 5 2

Anáplasico de célula pequeña 2 3

Anáplasico de célula grande 0 2

Otros 1 1

CARACTERISTICAS DEL TUMOR Bien diferenciado 5 8

Moderadamente diferenciado 1 0

Pobremente diferenciado 3 1

Sin clasificación 26 23

Tabla 6. Características clínico patológicas de pacientes con cáncer estudiados.


En la (Tabla 6) se describen las características clínico patológicas de los pacientes

incluidos en el estudio, se incluyeron 39 muestras de hombres y 28 muestras de mujeres,

el promedio de edad entre hombres y mujeres fue de 54 y 53 años respectivamente

(rango 25-85), en los datos histológicos del tumor se encontraron adenocarcinoma 40

(60%), escamocelular 11 (16.5%) carcinoide 7 (10%) anáplasico de célula pequeña 5

(7.5%), anáplasico de células grandes 2 (3%) otros 2 (3%).

En la (Tabla 7) se resumen las características de los voluntarios sanos, quienes donaron

una muestra de sangre para obtener DNA de plasma sanguíneo, y que cumplieron con

los criterios de inclusión en el estudio por medio de una encuesta se confirmó que no

tuvieran neoplasias y que no fueran fumadores. Las muestras que presentaron

amplificación en pacientes sanos, tenían una dosis génica baja (<10), excepto dos que

presentaron dosis génicas altas (>10) (Anexo C). De los pacientes sanos que

presentaron amplificación de los oncogenes JUN, CCNE1, MITF y MDM2, cuatro

padecían enfermedades inflamatorias (artritis y artrosis).

CARACTERISTICAS DE LOS PLASMA CONTROL VARIABLE

GÉNERO (%) Masculino 15 (71,4%) Femenino 6 (28,6%)

EDAD 55 (25, 67)

HÁBITO DE FUMAR (%) Fumadores 0 Exfumadores 14 (66,7%)

no fumadores 7 (33,3%)

ANTECEDENTES FAMILIARES Sin cáncer 15 (71,4%)

con cáncer 6 (28,6%) Tabla 7. Características clinicopatológicas de los voluntarios sanos que donaron las muestras de plasma utilizadas en el estudio.

En la Tabla 8 se describen las características de los controles de tejido sano pulmonar de

muestras embebidas en parafina, estas muestras fueron proporcionas por el

departamento de patología del Hospital Santa Clara, de autopsias realizadas entre los

años 1999 al 2009. Se seleccionaron los casos que cumplieran los criterios de inclusión

27

en el estudio, donde la causa de la muerte no fuera por patologías tumorales y se

confirmó la normalidad del tejido revisando los casos por patología. La amplificación

encontrada de los genes evaluados tenía dosis génicas bajas, los datos para cada

paciente se reportan en el anexo D. Dentro de estas muestras, se encontraban tres

pacientes que contaban con tejido pulmonar sano y tejido pulmonar alterado, a estos dos

tipos de muestra se les evaluó la dosis génica; los resultados mostraron que un paciente

no tenía amplificación en ninguno de los dos tejidos evaluados, el segundo paciente no

mostraba amplificación en la muestra de tejido normal pero la muestra de tejido alterado

si se presentaba amplificación del gen JUN y el tercer paciente el tejido sano tampoco

presento alteración del número de copias génicas pero si se presentó amplificación del

gen MDM2, observándose que en tejidos alterados se presenta cambios en la dosis

génica.

VARIABLE

GÉNERO (%)a

Masculino 5 (41,7%) Femenino 7 (58,3%)

EDAD 34 (0.5, 78) CAUSA DE MUERTE

Edema cerebral 2

Cirrosis 1 Muerte súbita 1

Insuficiencia cardiaca congestiva 2

Encefalitis 1

Hemorragia cerebral 1 Hipertensión pulmonar 1

Masa cerebral 1 Meningitis 1

Neumonía 1 Tabla 8. Características de controles de tejido pulmonar de pacientes sin cáncer de pulmón.

3.4 Amplificación en Plasma sanguíneo

Empleando la técnica de qPCR múltiple y el método de cuantificación relativa ∆∆CT, se

observó la siguiente frecuencia de amplificación para los genes evaluados. En plasma


sanguíneo de voluntarios sanos ALK (10%), CCNE1 (10%), MITF (10%), MDM4 (10%),

MDM2 (10%) y JUN (5%); y en plasma de pacientes con cáncer de pulmón ALK (43%),

CCNE1 (29%), MITF (29%), MDM4 (20%.), MDM2 (20%) y JUN (11%) (Figura 1).

Figura 1. Porcentaje de amplificación génica en plasma sanguíneo de voluntarios sanos con respecto a pacientes con cáncer de pulmón.

Posteriormente se comparó el número de copias génicas encontradas en plasma de

pacientes con cáncer y voluntarios sanos con la prueba estadística de U - Mann-Whitney

considerando los valores p<0.05 significativos. En la figura 2, se muestra los genes que

presentaron diferencias significativas los cuales comprendieron ALK (p=0.045) y MITF

(p=0,0033). No presentaron diferencias significativas en plasma sanguíneo los genes

MDM2, CCNE1 y MDM4, los cuáles en tejido neoplásico pulmonar si presentaron

diferencias significativas.

Con respecto al rango de amplificación en plasma, los genes JUN y MDM2 exhibieron

dosis génicas bajas de 2,48 y 3,54 respectivamente en pacientes sanos; y de 3 y 11 en

pacientes con cáncer. Sin embargo los demás genes presentaron rangos de

amplificación que se encontraron por encima de 87 en pacientes con cáncer, y 2

muestras de pacientes sanos mostraron amplificación de MITF 16 copias, y de MDM4

con 29 copias génicas (Anexo E).

0%

10%

20%

30%

40%

50%

ALK CCNE1 MITF MDM2 MDM4 JUN

10% 10% 10% 10% 10%5%

46%

29% 29%

20% 20%

11%

Po

rce

nta

je d

e a

mp

lific

ació

n

Genes

AMPLIFICACIÓN EN PLASMA

Plasma sano

Plasma cancer

29

DO

SIS

GÉ

NIC

A J

UN

0,001

0,01

0,1

1

10

PS PC

P = 0,1984

DO

SIS

GÉ

NIC

A M

DM

2

0,0001

0,001

0,01

0,1

1

10

PS PC

P = 1,0000

DO

SIS

GÉ

NIC

A C

CN

E1

0

0,0001

0,001

0,01

0,1

1

10

100

1000

PS PC

P = 0,5756

DO

SIS

GÉ

NIC

A A

LK

0,1

1

10

100

PS PC

P = 0,0451

DO

SIS

GÉ

NIC

A M

ITF

0

0

0,000.1

0,001

0,01

0,1

1

10

100

PS PC

P = 0,0033

DO

SIS

GE

NIC

A M

DM

4

00000000

0,00010,001

0,010,1

110

1001000

PS PC

P = 0,7133

Figura 2. Diagrama de Cajas y bigotes de plasma sanguíneo de voluntarios sanos (PS) y de pacientes con cáncer (PC). Se observan los valores máximo, mínimo, mediana y distribución de los cuartiles, obtenidos para cada gen y los valores de P obtenidos con la prueba U de Mann-Whitney (P>0.05)


3.5 Amplificación en tejido de pacientes con cáncer de pulmón

Figura 3. Porcentaje de amplificación génica en tejido pulmonar de voluntarios sanos y pacientes con cáncer de pulmón.

En la Figura 3 se observa la frecuencia de amplificación para los genes evaluados; a este

respecto en tejido pulmonar de voluntarios sanos se presentó un porcentaje de

amplificación para MDM2 (13%), MITF (13%), MDM4 (13%), JUN (7%), CCNE1 (0%),

ALK (0%) y en pacientes con cáncer de pulmón MDM2 (38%), ALK (28%), CCNE1

(16%,) MITF (16%) JUN (13%) y MDM4 (0%.).

Al realizar la comparación de los dos grupos de muestras se encontraron diferencias

estadísticamente significativas en los genes MDM2 (p=0.04), CCNE1 (p=0.04), ALK (p=

0.04) y MDM4 (p = 0.005) (Figura 4).

A nivel de rangos y dosis génicas se encontró que en muestras de pacientes sanos los

genes ALK y CCNE1 no presentaron amplificación, sólo en una muestra amplifico el gen

JUN y para los genes MDM2, MITF, MDM4 amplificaron 2 muestras pero con dosis

génicas bajas (<10), los datos para cada paciente se encuentran en el Anexo D. En

pacientes con cáncer JUN y MITF presentaron dosis génicas bajas (<10) y los genes

CCNE1, ALK y MDM2 dosis génicas altas. El gen MDM4 en las muestras de tejido

analizadas no mostro amplificación. Los datos obtenidos de cada paciente en tejido

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

MDM2 ALK CCNE1 MITF JUN MDM4

13%

0% 0%

13%

7%

13%

38%

28%

16% 16%13%

0%

Po

rce

nta

je d

e a

mp

lific

ació

n

Genes

AMPLIFICACIÓN EN TEJIDO

Tejido sano

Tejido cancer

31

tumoral se encuentran en el Anexo F. Los datos de dosis génica para los genes

evaluados en plasma y tejido se encuentran resumidos en la Tabla 9.

Muestra Genes No

amplificados ≤2

Amplificados dosis génica baja

≥2 < 10

Dosis génica alta ≥ 10

Total muestras con amplificación

Rango de amplificación

Tejido cáncer

JUN 28 (87,5%) 4 (12,5%) 0 (0%) 4 (12,5%) 2 a 6

MDM2 19 (59,4%) 12 (37,5%) 0 (0%) 12 (37,5%) 2 a 87

CCNE1 27 (84,4%) 3 (9,4%) 2 (6,3%) 5 (15,6%) 3 a 17

ALK 23 (71,9%) 7 (21,9%) 2 (6,3%) 9 (28,1%) 2 a 14

MITF 27 (84,4) 5 (15,6%) 0 (0%) 5 (15,6%) 2 a 7

MDM4 32 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) --

Tejido Sano

JUN 14 (93,3%) 1 (6,6%) 0 (0%) 1 (6,6%) 2

MDM2 13 (86,6%) 2 (13,3%) 0 (0%) 2 (13,3%) 4 a 6

CCNE1 15 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) --

ALK 15 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) --

MITF 13 (86,6%) 2 (13,3%) 0 (0%) 2 (13,3%) 3 a 7

MDM4 13 (86,6%) 2 (13,3%) 0 (0%) 2 (13,3%) 3

Plasma Cáncer

JUN 31 (88,6%) 4 (11,4%) 0 (0%) 4 (11,4%) 2 a 6

MDM2 26 (80%) 6 (17,1%) 1 (2,9%) 7 (20%) 2 a 11

CCNE1 25 (71,4%) 8 (22,9%) 2 (5,7%) 10 ( 28,6%) 2 a 221

ALK 19 (54,3%) 12 (34,3%) 4 (11,4%) 16 (45,7%) 2 a 95

MITF 25 (71,4%) 6 (17,1%) 4 (11,4%) 10 (28,6%) 2 a 87

MDM4 28 (71,4%) 4 (11,4%) 3 (8,6%) 7 (20%) 3 a 149

Plasma Sano

JUN 19 (95%) 1 (5%) 0 (0%) 1 (5%) 2

MDM2 18 (90%) 2 (10%) 0 (0%) 2 (10%) 2 a 3

CCNE1 18 (90%) 2 (10%) 0 (0%) 2 (10%) 3 a 5

ALK 18 (90%) 2 (10%) 0 (0%) 2 (10%) 2 a 3

MITF 18 (90%) 1 (5%) 1 (5%) 2 (10%) 3 a 16

MDM4 18 (90%) 1 (5%) 1 (5%) 2 (10%) 2 a 29

Tabla 9. Número de copias encontrado para cada oncogen. Se observan los valores de dosis génicas clasificados en tres categorías: no amplificado (<2 copias), bajo nivel de amplificación (entre 2 y 10 copias) y alto nivel de amplificación (más de 10 copias), encontrados en tejido de pacientes sanos y pacientes con cáncer y plasma de pacientes sanos y pacientes con cáncer de pulmón. En el rango se anotó el numero de 2-∆∆CT más bajo y mas alto encontrado en la muestra.


DO

SIS

GÉ

NIC

A J

UN

0,01

0,1

1

10

TS TC

P = 0,2445

DO

SIS

GE

NIC

A M

DM

2

0

0,000.1

0,001

0,01

0,1

1

10

100

TS TC

P = 0,0497

DO

SIS

GE

NIC

A C

CN

E1

0

0,0001

0,001

0,01

0,1

1

10

100

TS TC

P = 0,0471

DO

SIS

GE

NIC

A A

LK

0,000.1

0,001

0,01

0,1

1

10

100

TS TC

P = 0,0446

DO

SIS

GE

NIC

A M

ITF

0,0001

0,001

0,01

0,1

1

10

TS TC

P = 1,0000

DO

SIS

GE

NIC

A M

DM

4

0,001

0,01

0,1

1

10

TS TC

P = 0,0005

Figura 4. Diagrama de cajas y bigotes de tejido de voluntarios sanos (TS) y tejido de pacientes con cáncer (TC), se observan los valores máximo, mínimo, mediana y distribución de los cuartiles, obtenidos para gen. Valores de P obtenidos con la prueba U de Mann- Whitney (P>0.05)

33

3.6 Sensibilidad y especificidad de los marcadores

evaluados en plasma y tejido

La sensibilidad y la especificidad para cada gen se calculó a partir de los valores de

amplifiicación génica de las muestras de los pacientes con cancer (enfermos), y los

sanos, en muestras de tejido tumoral y plasma. El punto de corte establecido en el

estudio es >2. (Tabla 10 y Tabla 11)

• Sensibilidad : Indica la tasa de verdaderos positivos, VP/(VP+FN).

• Especificidad: Tasa de verdaderos negativos, VN/(FP+VN).

• Valor predictivo de positivos: Porcentaje de enfermos cuando la prueba es

positiva, está relacionado con la especificidad, dado que ambos dependen del

porcentaje de falsos positivos. VPP/(VP/VP+FN).

• Valor predictivo negativo: Indica los pacientes que estarán sanos cuando la

prueba es negativa. Depende en gran medida de la sensibilidad.

VPN/(VN/FN+VN).

Realizando el analisis con las anteriores formulas se encontró en plasma y tejido

pulmonar embebido en parafina niveles bajos de sensibilidad <50%, indicando que estos

marcadores en cáncer de pulmón parecen no ser informativos del proceso neoplásico, la

sensibilidad más alta en plasma se encontro en ALK con un 48,57% seguida por MITF y

CCNE1 con un 28,57%, en cambio la especificidad de estos marcadores es alta por

encima de 75% indicando que estos marcadores no se encuentran comunmente y en alto

porcentaje en pacientes sin cancer de pulmón, esto se relaciona con los valores

predictivos positivos que tambien son altos.

En tejido el valor de sensibilidad más alto es de MDM2 con un 37.50%, seguido por ALK

28,12% y los porcentajes de especificidad se comportan de manera similar que en

plasma con niveles altos.


GEN SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD VPP VPN

ALK 48.57 % (31.39 - 66.00) 85.00 % (62.08 - 96.62) 85.00 % (62.08 - 96.62) 48.57 % (31.39 - 66.00)

MITF 28.57 % (14.66 - 46.31) 90.00 % (68.26 - 98.47) 83.33 % (51.58 - 97.42) 41.86 % (27.02 - 57.87)

CCNE1 28.57 % (14.66 - 46.31) 90.00 % (68.26 - 98.47) 83.33 % (51.58 - 97.42) 41.86 % (27.02 - 57.87)

MDM2 20.00 % (8.48 - 36.95) 95.00 % (75.05 - 99.17) 87.50 % (47.38 - 97.93) 40.43 % (26.38 - 55.73)

JUN 14.29 % (4.86 - 30.27) 95.00 % (75.05 - 99.17) 83.33 % (36.10 - 97.24) 38.78 % (25.20 - 53.76)

MDM4 17% (6.61 - 33.66) 90.00 % ( 68.26 - 98.47) 75.00 % (35.05- 96.07) 38.30 % (24.51 - 53.62)

Tabla 10. Evaluación del plasma para predecir el estado de amplificación de los 6 genes evaluados. VPP= valor predictivo positivo. VPN = valor predictivo negativo. Se describe entre paréntesis los límites inferior y superior correspondientes a un intervalo de confianza del 95%.

GEN SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD VPP VPN

ALK 28.12 % (13.77 - 46.75) 100.00 % ( 78.03 - 100.00) 100.00 % (66.21 - 100.00) 39.47 % (24.05 - 56.61)

MITF 15.62 % (5.33 - 32.80) 86.67 % ( 59.51 - 97.95) 71.43 % (29.27 - 95.48) 32.50 % (18.59 - 49.13)

CCNE1 15.62 % (85.33 - 32.80) 100.00 % ( 78.03 - 100.00) 100.00 % (47.95 - 100.00) 35.71 % (21.56 - 51.97)

MDM2 37.50 % (21.12 - 56.30) 86.67 % (59.51 - 97.95) 85.71 % ( 57.16 - 97.80) 39.39 % (22.92 - 57.86)

JUN 15.15 % (5.17 - 31.91) 93.33 % (67.98 - 98.89) 83.33 % (36.10 - 97.24) 33.33 % (19.58 - 49.55)

MDM4 0.00 % 86.67 % (59.51 - 97.95) 0.00 % (0.00 - 80.71) 28.89 % (16.38 -44.32)

Tabla 11. Evaluación del tejido para predecir el estado de amplificación de los 6 genes evaluados. VPP= valor predictivo positivo. VPN = valor predictivo negativo. Se describe entre paréntesis los límites inferior y superior correspondientes a un intervalo de confianza del 95%.

3.5.1 Poder predictivo de los marcadores

La capacidad discriminativa de una prueba se basa en la capacidad de la misma en

diferenciar personas sanas de pacientes con la enfermedad; el parametro que se utiliza

para evaluar es la AUC (area under the curve) de la curva ROC. Los valores que

comprende son entre 0 y 1 (0% y 100%). Valores de AUC iguales o por debajo de un

valor de 0,5. se considera no discriminativo y sin diferencias.

Se evaluaron los resultados de cada marcador en plasma y suero por medio de curvas

ROC. Los valores de AUC más altos obtenidos en plasma sanguineo fueron MITF y ALK

con 0.744 y 0.663 respectivamente. En tejido los mayores valores de AUC obtenidos

fueron MDM2, ALK y CCNE con 0,683, 0,667 y 0.665 respectivamente, en plasma MITF

se comporta diferente con un AUC de 0,507 disminuyendo su capacidad discriminativa

35

notablemente. En la figura 5 se muestran los valores AUC de cada uno de los genes,

comparando plasma sanguineo de voluntarios sanos y de pacientes con cancer. La figura

6 muestra los valores AUC de cada uno de los genes en tejido de pacientes con cancer y

pacientes sanos.

Figura 5. Curvas ROC obtenidas para plasma sanguíneo. Se observan las curvas ROC y sus respectivos valores AUC, obtenidos en plasma de pacientes con cáncer respecto a plasma de voluntarios sanos.


Figura 6. Curvas ROC obtenidas para tejido de pulmón. Se observan las curvas ROC y sus respectivos valores AUC, obtenidos en tejido de pacientes con cáncer respecto a tejido de pacientes sanos.

37

3.7 Muestras pareadas

3.6.1 Correlación de Spearman

Para evaluar la correlación de los resultados de amplificación en muestras de plasma

sanguíneo y tejido tumoral del mismo paciente con cáncer (pareadas) se utilizó la

correlación de Spearman en la cual se toman valores de -1 al 1, indicando correlación

negativa y positiva respectivamente. 0 indica que no hay correlación entre los valores. El

análisis se hizo categorizando los datos en dos grupos. 1= no amplificado y 2=

amplificado (Tabla 12).

Los índice de correlación (rho) para MITF = 0,778, ALK (rho) = 0,567 y MDM2 (rho) =

0,645 presentan diferencias significativas, estos genes muestras una correlación positiva

mostrando la capacidad del plasma para detectar los estados de amplificación que se

encuentran en el tejido tumoral del mismo paciente. Los genes JUN, MDM2, CCNE1 no

presentaron diferencias significativas y en tejido no se presentó amplificación de MDM4

por esta razón no se puede calcular el rho.

Tabla 12. Número de copias génicas de los diferentes genes encontrado en las muestras pareadas. (rho)= coeficiente de correlación de Spearman y p= nivel de significancia. Las muestras amplificadas se muestran resaltadas.

38

4. Discusión de resultados

En este trabajo, se realizó la validación de la técnica PCR múltiple en tiempo real para

evaluar el aumento en la dosis génica de los genes ALK, MDM2, MITF, CCNE1, MDM4 y

JUN en plasma sanguíneo (muestra poco invasiva) y tejido tumoral embebido en parafina

de pacientes con cáncer de pulmón. En la metodología se describieron las

concentraciones de cebadores y sondas utilizadas para conseguir la manera más

eficiente de detectar la amplificación de los oncogenes en las muestras evaluadas, a

este respecto se observó que las eficiencias de las reacciones se encontraron entre el 90

y 100%, el gen MDM4 de la reacción 3, presentó la eficiencia más baja del 91,6% y no

reportó lectura en la concentración de 0.003 ng/µL una copia génica por lo cual solo

fueron detectables 5 puntos en la curva. Los demás genes incluyendo el ACTB

(housekeeping) fueron capaces de detectar concentraciones desde 1 copia génica hasta

100.000 copias génicas que fueron evaluadas al realizar las curvas de calibración. El

resultado de la resta de los ∆CT de los genes blancos y del ∆CT del housekeeping fue

pequeño debido a que los ∆CT eran muy parecidos, de esta forma al graficarlos la

pendiente (y) fue <0.1, demostrando que son comparables. El método de qPCR múltiple

simplifica y reduce el trabajo en el laboratorio ya que todos los pasos post-PCR son

suprimidos, por lo tanto los productos de PCR no son manipulados, lo cual reduce

considerablemente el riesgo de contaminación cruzada. Además la cantidad de muestra

necesaria es mínima ya que puede detectar desde una copia génica.

En este estudio se evaluó la amplificación de varios genes que se encuentran

relacionados con cáncer (control de ciclo celular, factores de transcripción) y que se

encuentran descritos en la base de datos “Cancer genome project”, en muestras de

plasma y tejido de pacientes con cáncer de pulmón. Se observó un aumento en el

número de copias de los oncogenes en plasma y en tejido de pacientes con cáncer de

pulmón de los genes analizados, excepto MDM4 en tejido.

39

ALK es un receptor tirosina quinasa que desempeña un papel importante en la división

proliferación y supervivencia celular ya que puede activar las vías de señalización

PI3K/AKT, RAS/RAF/MAPK y JAK/STAT. En los resultados en plasma se encontró como

el gen amplificado un mayor número de veces, 46% y en tejido se encontró amplificado

en un 28%, resultados que mostraron diferencias significativas con los resultados

obtenidos en pacientes sanos. Los tipos histológicos donde se encontró la mayoría de

resultados positivos eran de adenocarcinoma y carcinoma escamocelular, resultados

similares a los reportados por Perner y col en 2008 y Salido y col en 2011 donde se halló

una alta prevalecía de aumento de número de copias génicas 3 a 6 copias por célula

(11%), y amplificación >6 con (63%) de los casos en muestras de cáncer de célula no

pequeña de pulmón (NSCLS) porcentajes más alto con respecto a los de este estudio

debido posiblemente a que tienen un número de muestras más alto. Estudios realizados

para evaluar la expresión de la proteína cuando se encuentra amplificado el gen han

mostrado que no hay sobreexpresión de ALK y no se conocen las implicaciones clínicas

(Grande y col 2011). También se puede encontrar la amplificación del gen en pacientes

ALK positivos (pacientes que presentan fusión de ALK con EML4) pero la media de

ganancia de copias génicas es más alta en el grupo ALK negativos que el grupo de ALK

positivos (Camidge y col 2013). Los casos donde se demuestra la amplificación del gen

podría indicar un índice de supervivencia libre de progresión (PFS) más pobre en

comparación con los pacientes que no presentan amplificación, como sucede en casos

de pacientes con hepatocarcinoma celular y carcinoma colorectal (Jia y col 2014, Bavi y

col 2013). La amplificación del gen sin reordenamientos se ha encontrado en cáncer de

esófago (Schoppmann y col 2013). En casos de tumores cerebrales metastásicos de

cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLS) se encuentra amplificación de este

gen en mayor porcentaje en el tumor metastásico que en el tumor primario, sugiriendo

una ventaja de selección en procesos metastásicos (Preusser y col 2013).

De los genes que participan en el control del ciclo celular, MDM2 se encontró amplificado

más veces en tejido, este gen se encuentra relacionado con cáncer ya que codifica una

proteína que tiene como función ubiquitinizar la proteína p53 guiándola a la degradación

en el proteosoma (Haupt y col 1997), además también se une a la proteína

retinoblastoma Rb bloqueando las funciones inhibidoras de esta sobre la progresión del

ciclo celular (Xiao y col 2005). El aumento en la expresión de la proteína se ha


encontrado en más de 40 diferentes tipos de malignidades incluyendo tumores sólidos,

sarcomas y leucemias, además tiene un papel importante en el desarrollo y la progresión

del tumor, este aumento en la expresión se puede deber a amplificación génica, aumento

en la trascripción o traducción (Rayburn y col 2005). En liposarcomas dediferenciados se

encontró amplificación de este gen y se utiliza como una herramienta diagnostica pero

sin valores de prognosis (Jour y col 2014). En carcinoma de colón la amplificación de

este gen se relaciona con la expresión de la proteína MDM2 (Hav y col 2011). En nuestro

trabajo se encontró amplificado en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de

células no pequeñas, en un porcentaje de 38% en tejido y 20 % en plasma, resultados

que concuerdan con los reportados previamente donde se indicó un porcentaje de

amplificación del 21%,(Dworakowska y col en 2004). Los datos obtenidos en tejido tenían

diferencias significativas con pacientes sanos, pero en plasma no debido a que los

valores de la dosis génica en plasma eran más bajos comparados a los valores de tejido.

CCNE1 es un gen que codifica una proteína que participa en control del ciclo celular por

lo tanto también es importante en cáncer, en los resultados obtenidos en plasma

sanguíneo CCNE1 presentó un porcentaje del 29% y en tejido un 16% de amplificación,

Las comparaciones de los resultados obtenidos de tejido de pacientes sanos y pacientes

con cáncer mostraron diferencias significativas, sugiriendo que CCNE1 se relaciona con

pacientes con cáncer. Este gen se ha encontrado amplificado en adenocarcinoma de

cáncer de pulmón conjuntamente con deleción de la proteína RB1 (Weir y col 2007, Ding

y col 2008), también se ha encontrado en carcinoma escamocelular de pulmón, cáncer

de seno, cáncer gástrico y cáncer seroso de ovario; la sobreexpresión de este gen

promueve la entrada a la fase S no programada, produce inestabilidad genómica y

progresión del tumor relacionándose con un pobre resultado clínico (Etemadmoghadam y

col 2013).

El rango de la amplificación génica en plasma de pacientes con cáncer es más alto

comparado con el rango obtenido en tejido, esto puede ser debido a que los pacientes

con cáncer pulmonar se diagnostican en estados tardíos de la enfermedad y

generalmente el 50% de los pacientes han presentado metástasis a otros órganos en los

cuales también puede presentarse amplificación génica de los oncogenes y por esta

razón los valores en plasma pueden verse aumentados.

41

MDM4 o MDMX también interactúa con P53 uniéndose a esta proteína evitando la

activación de la misma; en tejido con cáncer no se presentó amplificación; en tejido sano

se presentaron 2 casos de amplificación pero con dosis génica baja (3 copias). En

plasma se presentó un porcentaje del 20% de amplificación en pacientes con cáncer

pulmonar indicando que no es específico para este tipo de cáncer y su amplificación se

puede presentar en otros procesos. No ha sido reportado como amplificado en cáncer de

pulmón, pero se ha encontrado en cáncer de seno y en gliomas (Riemenschneider y col

2009; Yu y col 2014)

Jun en tejido se encontró amplificado en un paciente sano (7%) y en cuatro pacientes

con cáncer (13%); en plasma se halló el mismo número de pacientes, sanos 1 muestra

(5%) y cáncer 4 muestras (13%), todos presentaban copias génicas bajas (<10) y al

comparar los grupos no mostró diferencias significativas, indicando que no es un buen

marcador para cáncer de pulmón por su baja incidencia y baja dosis génica. No se han

reportado artículos donde este gen se encuentre amplificado en pulmón, pero la

sobreexpresión de la proteína se relaciona con un rol en la patogénesis de cáncer

pulmonar al contribuir a la adquisición de independencia de anclaje, favoreciendo la

proliferación y metástasis (Maeno y col 2006). En sarcomas se demostró la amplificación

del gen con sobreexpresión de la proteína lo que generaba bloqueo de la diferenciación

de los adipocitos (Mariani y col 2011). En Pseudomixoma peritoneal se encontró

coamplificado con MLC1, pero su significado clínico no está claro (Sio y col 2014).

MITF en tejido de pacientes con cáncer se encontró amplificado en 5 muestras (15,6%) y

en tejido sano 2 muestras (13,3%) con dosis génicas bajas, en plasma con cáncer se

encontraron 10 muestras (28,6%) y en sanos 2 (10%), en plasma mostró diferencias

significativas al comparar los grupos de sanos con cáncer, pero en tejido no eran

significativamente diferentes, por esta razón no se puede considerar como un marcador

para cáncer pulmonar. MITF es un factor de transcripción que regula la expresión de

genes con roles esenciales en la diferenciación celular de los melanocitos, se encuentra

amplificado en melanomas y se relaciona con la disminución en la sobrevivencia de

pacientes con melanomas metastásicos (Ugurel y col 2007).

La amplificación de estos genes ALK, MDM2 y CCNE1 presentaron diferencias

significativas entre pacientes sanos y pacientes con cáncer de pulmón, los porcentajes


de amplificación no son altos en todos los tipos histológicos de cáncer de pulmón

sugiriendo que no son marcadores de diagnóstico pero pueden contribuir como una

ayuda diagnostica al ser estudiados en conjunto con otros genes previamente

recomendados como marcadores moleculares de cáncer de pulmón (Perdomo 2012).

También se puede observar que el perfil genético de los distintos tipos histológicos de

cáncer de pulmón es muy amplio y presenta una gran diversidad en el número de copias

génicas que tienen en el DNA, sin embargo es posible que algunos tipos histológicos de

cáncer de pulmón puedan no presentar amplificación de estos genes y necesiten buscar

otros biomarcadores específicos.

Con respecto a la evaluación de los oncogenes como biomarcadores, los resultados de la

curva ROC, se obtuvieron valores <= 0.5 que se interpretan como de contribución nula o

al azar y en los cuales se encontraban los genes JUN y MDM4 en plasma; MDM4 en

tejido obtuvo un valor muy bajo ya que no hubo un aumento en el número de copias en

pacientes con cáncer de pulmón. Valores de 0.5 a 0.6 se consideran resultados fallidos,

en esta categoría encontramos en plasma MDM2, CCNE1 y en tejido JUN, MITF y

valores de 0.6 a 0.7 se consideran resultados pobres, es el caso de ALK en plasma y en

tejido MDM2, CCNE1 y ALK. El único con un resultado aceptable de 0.7 a 0.8 fue MITF

en plasma con un AUC de 0.744. Estos resultados nos indican que estos oncogenes no

son específicos de todos los tipos histológicos de cáncer de pulmón y no nos dan un

criterio de exclusión para poder realizar un diagnóstico exclusivamente con ellos, aunque

pueden servir como apoyo al diagnóstico de cáncer.

También relacionado a los resultados de amplificación en pacientes con cáncer y

pacientes sanos evaluamos la sensibilidad y especificidad de los marcadores. La

sensibilidad de los biomarcadores es muy baja en plasma; la más alta es del gen ALK

con un 48.57% de sensibilidad y en tejido el gen MDM2 con una sensibilidad de 37.50%,

esto se asocia a los resultados de la curva ROC en los cuales se muestran valores muy

bajos de AUC. Con respecto a la especificidad de los biomarcadores vemos que se

encuentran valores altos, reconociendo a los pacientes sanos como tales debido a que

no se presentaron considerables casos de amplificación en pacientes sanos, tanto en

tejido como en plasma, estos resultados nos indican que estos genes no pueden

distinguir pacientes sanos de pacientes con cáncer pero la amplificación de estos si

43

puede indicar que se están presentando o comenzando procesos tumorales. Los genes

para pruebas diagnósticas deben ser altamente sensibles y para realizar un tamizaje de

la enfermedad estos genes no son los ideales, pero un aumento en el número de copias

génicas puede servir para sospechar la presencia de la enfermedad por presentarse

amplificados principalmente en pacientes con cáncer.

En la evaluación de las muestras pareadas de plasma y tejido del mismo paciente

diagnosticado previamente con cáncer de pulmón se evaluó la correspondencia de los

resultados de amplificación en plasma y tejido tumoral; se encontró que MITF presento

un índice rho: 0,778, MDM2 rho: 0,645 y ALK rho: 0,567, estas correlaciones son

positivas y muestran que el plasma es una muestra en la que se encuentran número de

copias similares que en el tejido afectado por cáncer, debido a que en el plasma se

encuentra DNA de distintas partes del organismo. Para los genes JUN y CCNE1 no se

encontró un índice rho positivo debido a las pocas muestras pareadas que se analizaron

y las pocas muestras que presentaron amplificación y una dosis génica baja; MDM4 en

tejido no presento amplificación por lo tanto esta prueba no aplica para este gen. El DNA

libre de plasma se ha considerado como una biopsia liquida en la cual se pueden analizar

las células y el cambio que presentan durante el desarrollo y progresión de la

enfermedad, sirviendo como una guía y ayuda en el diagnóstico y monitoreo del cáncer

(Schwarzenbach y col 2011). Estudios han demostrado amplificación del oncogén ATK2

en DNA libre de plasma en pacientes con cáncer de pulmón comparable a los resultados

obtenidos en tejido (Álvarez y col 2012). Resultados que indican que los datos obtenidos

en plasma sirven como una referencia para conocer las características moleculares del

tumor.

La tasa de sobrevivencia y pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón puede

aumentar con una detección temprana, además pruebas no invasivas para diagnostico

pueden optimizar el manejo de algunos tumores cancerígenos, principalmente lesiones

preneoplásicas; el objetivo de los programas de tamizaje de cáncer es detectar los

tumores en un estado suficientemente temprano para que el tratamiento pueda ser

exitoso. El plasma es una muestra de fácil obtención y poco invasiva, por esta razón es

más fácil realizar exámenes periódicos con el fin de identificar cambios en el número de

copias que circulan, junto a un análisis de riesgos genéticos y ambientales; el estado de


amplificación de oncogenes en el DNA libre en plasma es una prueba complementaria

importante para el diagnóstico y control en cáncer, diferentes estudios han demostrado

que en pacientes con cáncer se observa un aumento en la concentración de DNA libre de

células en plasma por procesos de apoptosis, necrosis y secreción (Sozzi y col 2003).

Evaluar un panel de genes con qPCR en plasma es una aproximación poderosa para la

detección de cáncer de pulmón. En el futuro se requiere realizar la evaluación de los

genes en un número mayor de muestras junto a otro panel de genes para definir el

impacto de esta tecnología, en detección, prognosis y monitoreo de la enfermedad.

45

5. Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

• La estandarización de la técnica de qPCR multiplex permitió detectar varios genes

a la vez y realizar una cuantificación de la dosis génica con una cantidad mínima

de muestra, y se obtuvieron resultados reproducibles y confiables.

• El oncogen ALK se encontró amplificado en muestras de pacientes con cáncer,

tanto en plasma como en tejido, mostrando diferencias significativas con los

resultados encontrados en pacientes sin cáncer, indicando que este gen puede

servir como un apoyo en el diagnóstico y pronóstico de cáncer de pulmón,

principalmente en cáncer de células no pequeñas.

• El gen MDM2 presento amplificación en muestras de tejido de pacientes con

cáncer mostrando diferencias significativas con los resultados de pacientes sin

cáncer, esta amplificación se encontró principalmente en cáncer de pulmón de

célula no pequeña (NSCLC) sugiriendo que puede servir como ayuda diagnostica

y pronostica en estas clases de tipos histológicos.

• La sensibilidad de los oncogenes evaluados no fue alta concluyéndose que estos

genes no son capaces de reconocer a los enfermos de cáncer, pero mostraron

una especificidad alta sugiriendo que la presencia de amplificación de estos

oncogenes pueden servir para identificar a los pacientes con cáncer debido a su

baja tasa de amplificación en personas sanas.

• En las muestras de plasma sanguíneo y tejido (pareadas) de pacientes con CP se

encontró correlación positiva en 3 genes evaluados MDM2, ALK y MITF,


demostrando que los niveles de amplificación de estos genes son detectables

tanto en plasma como en tejido, por lo tanto el plasma es una muestra que se

puede utilizar para realizar tamizaje en búsqueda de biomarcadores de cáncer.

• A pesar que histológicamente los tejidos sean iguales, los marcadores genéticos

pueden variar de una persona a otra, esto confirma que cada paciente tiene una

firma molecular diferente y estos cambios pueden servir para la prevención y

control de la enfermedad.

5.2 Recomendaciones

• Se recomienda utilizar un número de muestra más amplia de las diferentes clases

histológicas de cáncer de pulmón con el fin de tener un resultado más

contundente desde el punto de vista estadístico en relación a las combinaciones

que pueden tener valor diagnóstico.

• Se recomienda realizar estudios de seguimiento en una corte con posible riesgo

de sufrir CP con miras a explorar posibles valores como sistema de diagnóstico

temprano para la combinación de marcadores.

47

A. Anexo: Gráficos y Tablas con los valores de CT obtenidos en cada gen en la estandarización de las curvas de calibración

Curvas de eficiencia para la reacción 1 ACTB, JUN y MDM2 en PCR tiempo real

multiplex.

En las gráficas se observan los CT versus el logaritmo de la concentración de DNA

genómico

Figura A1. Curva estándar ACTB marcado con Rojo Texas para la reacción 1, se

observan el valor de la eficiencia y la pendiente


Figura A2. Curva estándar JUN marcado con FAM, se observan el valor de la eficiencia

y la pendiente

Figura A3. Curva estándar MDM2 marcado con HEX, se observan el valor de la

eficiencia y la pendiente

49

Concentración de DNA en

ng/µl

CT Triplicado

ACTB

CT

Promedio ACTB

CT Triplicado

JUN

CT Promedio

JUN

CT Triplicado

JUN

CT Promedio

JUN

0,003

34,28

34,69

34,5

34,57

34,5

34,57 35,47 35,11 35,11 34,32 34,12 34,12

0,03 31,74

32,25 32,51

32,54 32,51

32,54 32,94 32,91 32,91

32,08 32,21 32,21

0,3

27,61

27,77

30,02

29,85

30,02

29,85 28,87 29,53 29,53 27,61 30 30

3

23,51

23,92

25,76

25,61

25,76

25,61 24,13 25,63 25,63 24,14 25,44 25,44

30 21,16

21,23 22,29

22,24 22,29

22,24 21,37 22,23 22,23

21,34 22,2 22,2

300

19,24

19,21

19,24

19,2

19,24

19,2 19,94 19,24 19,24 18,47 19,12 19,12

Tabla A1: Datos de los CT y del promedio para los genes de la reacción 1


Curvas de eficiencia reacción 2 para ACTB, CCNE1, ALK Y MITF en PCR tiempo real multiplex

En las gráficas se observan los CT versus el logaritmo de la concentración de DNA genómico

Gráfica A4. Curva estándar ACTB marcado con Rojo Texas para la reacción 2, se

observan el valor de la eficiencia y la pendiente.

51

Gráfica A5. Curva estándar CCNE1 marcado con FAM, se observan el valor de la eficiencia y la pendiente.

Gráfica A6. Curva estándar ALK marcado con HEX, se observan el valor de la eficiencia

y la pendiente.


Gráfica A7. Curva estándar MITF marcado con Cy5, se observan el valor de la eficiencia

y la pendiente.

53

oncen- tración de DNA en ng/µl

CT Triplicado

ACTB

CT

Promedio ACTB

CT Triplicado

CCNE1

CT

Promedio CCNE1

CT Triplicado

ALK

CT Promedio

ALK

CT Triplicado

MITF

CT Promedio

MITF

0,003

35,55

35,97

35,31

34,62

36,05

35,937

35,02

35,03 36,97 33,26 35,36 35,22

35,4 35,3 36,4 34,86

0,03

33,44

33,55

32,31

32,3

33,75

33,683

32,05

32,28 33,7 32,67 33,71 32,23

33,5 31,91 33,59 32,55

0,3 30,4

30,56 28,46

28,4 30,46

30,58 29,19

29,13 30,67 29,13 31,11 29,49

30,6 27,6 30,17 28,72

3

25,3

25,74

24,42

24,61

26,27

26,917

25,28

25,56 26,77 25,35 27,03 26,05

25,16 24,07 27,45 25,35

30

23,73

23,64

22,05

21,81

23,63

23,92

22,34

22,32 23,58 22,11 23,63 22,62

23,6 21,26 24,5 22

300 21,42

20,76 19,27

19,03 21,13

20,827 19,28

19,3 20,43 18,81 20,66 19,33

20,43 19 20,69 19,3



Curvas de eficiencia para la reacción 3 ACTB y MDM4 en PCR tiempo real multiplex

Gráfica A8. Curva estándar ACTB marcado con Rojo Texas para la reacción 3, se

observan el valor de la eficiencia la pendiente.

Gráfica A9. Curva estándar MDM4 marcado HEX, se observan el valor de la eficiencia y

la pendiente.

55

Concentración de DNA en

ng/µl

CT Triplicado

ACTB

CT Promedio ACTB

CT Triplicado

MDM4

CT Promedio MDM4

0,003

36,02

36,34

36,91

36,1

0,03

33,71

33,34

34,05

34,44 33,11 35,04

33,2 34,24

0,3

30,19

30,42

31,37

31,30 30,89 31,96

30,19 30,58

3

26,2

26,78

28,1

27,89 27,23 28,04

26,9 27,53

30

22,3

22,78

24,45

24,11 22,89 24,03

23,15 23,85

300

19,8

20,48

20,55

20,33 21 20,33

20,65 20,12



B. Anexo: Validación de ∆∆CT para cada gen

Validación de ∆∆CT para JUN Los valores de CT promedio de ACTB y JUN se usaron para hallar el y realizar la validación del método para JUN.

Concentración de DNA [ng/µl]

Valor de CT

promedio JUN Valor de CT

promedio ACTB ∆CT

(CT JUN – CT ACTB) 0,003 34,5766 34,6900 -0,1133 0,03 32,5433 32,2533 0,2900 0,3 29,8500 27,7733 2,0766 3 25,6100 23,9266 1,6833

30 22,2400 21,2900 0,9500 300 19,2000 19,2166 -0,0166

Tabla B1 Obtención de valores ∆CT del gen JUN respecto a ACTB

Figura B1 Validación de ∆∆CT para JUN. Se muestra la relación Concentración DNA contra ∆CT, y se observa una pendiente menor a < 0,1.

y = 0,0257ln(x) + 0,813R² = 0,0146

-3-2,5

-2-1,5

-1-0,5

00,5

11,5

22,5

0,001 0,01 0,1 1 10 100

ΔC

T

Concentración de DNA (ng/µL)

ΔΔCT ACTB - ΔΔCT JUN

57

Validación de ∆∆CT para MDM2


Valor de CT promedio

MDM2


ACTB

∆CT (CT MDM2 – CT ACTB)

0,003 37,7500 34,6900 3,0600 0,03 31,2800 32,2533 -0,9733 0,3 31,2800 27,7733 3,5067 3 27,8733 23,9267 3,9467 30 24,0933 21,2900 2,8033

300 20,3167 19,2167 1,1000 Tabla B2 Obtención de valores ∆CT del gen MDM2 respecto a ACTB

Figura B2 Validación de ∆∆CT para MDM2. Se muestra la relación Concentración DNA contra ∆CT, y se observa una pendiente menor a < 0,1.

y = -0,057ln(x) + 2,6165R² = 0,0277

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

0,01 0,1 1 10 100 1000

ΔC

T


ΔΔCT ACTB - ΔΔCT MDM2


Validación de ∆∆CT para CCNE1


Valor de CT

promedio CCNE1 Valor de CT

promedio ∆CT

(CT CCNE1 – CT ACTB)

0,003 34,6233 35,9733 -1,3500 0,03 32,2967 33,5467 -1,2500 0,3 28,3967 30,5567 -2,1600 3 24,6133 25,7433 -1,1300

30 21,8067 23,6367 -1,8300 300 19,0267 20,7600 -1,7333

Tabla B3 Obtención de valores ∆CT del gen CCNE1 respecto a ACTB

Figura B3 Validación de ∆∆CT para CCNE1 Se muestra la relación Concentración DNA contra ∆CT, y se observa una pendiente menor a < 0,1.

y = -0,033ln(x) - 1,5773R² = 0,1253

-4-3,5

-3-2,5

-2-1,5

-1-0,5

00,5

11,5

2

0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000

ΔC

T


ΔΔCT ACTB - ΔΔCT CCNE1

59

Validación de ∆∆CT para ALK


Valor de CT promedio ALK


∆C (CT ALK – CT ACTB)

0,003 35,9367 35,9733 -0,0367 0,03 33,6833 33,5467 0,1367 0,3 30,5800 30,5567 0,0233 3 26,9167 25,7433 1,1733

30 23,9200 23,6367 0,2833 300 20,8267 20,7600 0,0667

Tabla B4 Obtención de valores ∆CT del gen ALK respecto a ACTB

Figura B4 Validación de ∆∆CT para ALK. Se muestra la relación Concentración DNA contra ∆CT, y se observa una pendiente menor a < 0,1.

y = 0,0261ln(x) + 0,2758R² = 0,0615

-4-3,5

-3-2,5

-2-1,5

-1-0,5

00,5

11,5

22,5

3

0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000

ΔC

T


ΔΔCT ACTB - ΔΔCT ALK


Validación de ∆∆CT para MITF


Valor de CT promedio MITF


∆CT (CT MITF – CT ACTB)

0,003 35,0333 35,9733 -0,9400

0,03 32,2767 33,5467 -1,2700

0,3 29,1333 30,5567 -1,4233

3 25,5600 25,7433 -0,1833

30 22,3200 23,6367 -1,3167

300 19,3033 20,7600 -1,4567

Tabla B5 Obtención de valores ∆CT del gen MITF respecto a ACTB

Figura B5 Validación de ∆∆CT para MITF. Se muestra la relación Concentración DNA contra ∆CT, y se observa una pendiente menor a < 0,1.

y = -0,018ln(x) - 1,0993R² = 0,0268

-3-2,5

-2-1,5

-1-0,5

00,5

11,5

22,5

0,001 0,1 10 1000

ΔC

T


ΔΔCT ACTB - ΔΔCT MITF

61

Validación de ∆∆CT para MDM4


Valor de CT

promedio MDM4 Valor de CT

promedio ∆CT

(CT MDM4 – CT ACTB)

0,03 34,4433 33,3400 1,1033

0,3 31,3033 30,4233 0,8800

3 27,8900 26,7767 1,1133

30 24,1100 22,7800 1,3300

300 20,3333 20,4833 -0,1500 Tabla B6 Obtención de valores ∆CT del gen MDM4 respecto a ACTB

Figura B6 Validación de ∆∆CT para MDM4. Se muestra la relación Concentración DNA contra ∆CT, y se observa una pendiente menor a < 0,1.

y = -0,089ln(x) + 0,9535R² = 0,31

-2,5-2

-1,5-1

-0,50

0,51

1,52

2,53

3,54

0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000

ΔC

T


ΔΔCT ACTB - ΔΔCT MDM4


C. Anexo. Resultados de amplificación en plasma de pacientes sanos

JUN MDM2 CCNE1 ALK MITF MDM4 1 1,94 2,68 1,56 0,95 0,76 0,84 2 2,48 0,25 0,99 1,04 0,19 0,48 3 0,45 0,78 3,25 1,14 16,00 0,05 4 0,10 0,37 0,00 0,31 0,00 0,01 6 1,49 3,54 0,00 1,01 0,00 0,21 7 0,80 0,26 0,20 1,67 0,39 0,01 8 0,69 0,00 5,39 2,49 0,70 0,00 9 0,30 0,19 1,43 0,55 0,82 0,57

10 0,73 0,45 1,81 0,44 0,44 29,50 11 1,53 1,71 0,48 0,48 0,90 0,92 12 0,60 0,08 0,13 0,53 1,62 0,94 13 0,44 0,00 1,92 0,97 3,16 0,00 14 0,07 0,26 0,01 3,27 0,12 0,48 15 1,45 0,55 1,72 0,62 1,32 0,94 16 0,62 0,43 0,00 1,04 0,63 0,36 17 0,09 0,04 0,92 1,08 0,10 1,02 18 0,29 0,08 1,18 1,62 0,11 1,49 19 1,21 1,68 0,53 1,90 0,82 1,17 20 1,59 1,51 1,29 0,34 0,19 0,66 21 0,58 1,71 0,50 0,50 0,10 2,30

Tabla C1. Se muestra el valor de doble delta CT obtenido para cada muestra de plasma proveniente de voluntarios sanos, se presentan resaltados los valores mayores a 2, consideradas como muestras amplificadas.

63

D. Anexo. Resultados de amplificación en tejido de pacientes sanos

JUN MDM2 CCNE1 ALK MITF MDM4 1 0,78 0,92 0,24 0,42 1,11 1,21

2 0,44 1,22 0,69 1,29 1,99 3,13 3 1,25 6,45 1,59 1,31 0,14 1,13 4 0,68 0,30 0,00 0,00 0,00 0,73 5 0,24 0,52 0,21 1,35 7,94 1,66 6 1,13 0,04 1,45 1,24 3,53 0,00 7 0,64 0,79 0,73 0,91 1,46 0,16 8 2,20 1,73 0,00 0,00 0,38 1,59 9 0,21 0,02 0,01 0,00 0,00 0,69

10 0,59 0,60 1,10 0,42 0,90 3,00 11 0,86 0,11 0,00 0,08 0,09 0,18 12 0,83 0,55 1,05 0,62 0,89 1,60 13 1,43 1,26 0,04 0,74 1,43 0,25 14 1,09 4,53 0,63 1,29 1,11 0,58 15 0,97 0,67 0,46 0,84 0,88 0,76

Tabla D1. Se muestra el valor de doble delta CT obtenido para cada muestra de tejido proveniente de voluntarios sanos, se presentan resaltados los valores mayores a 2, consideradas como muestras amplificadas.


E. Anexo. Resultados de amplificación en plasma de pacientes con cáncer

Tabla E1. Se muestra el valor de doble delta CT obtenido para cada muestra de plasma pacientes con cáncer de pulmón, se presentan resaltados los valores mayores a 2, consideradas como muestras amplificadas.

65

F. Resultados de amplificación en tejido de pacientes con cáncer

JUN MDM2 CCNE1 ALK MITF MDM4 1 0,99 8,08 0,54 0,77 0,58 0,98 2 0,16 0,03 1,40 1,84 0,59 1,85 3 0,81 1,38 17,27 2,45 2,61 0,32 4 1,78 6,77 1,00 2,53 0,82 0,16 5 0,08 1,00 0,23 0,90 0,24 0,00 6 1,71 2,76 0,50 0,83 0,55 0,03 7 1,40 2,37 0,17 0,60 0,18 0,04 8 1,35 6,41 0,31 0,41 1,29 0,06 9 1,41 8,82 0,84 1,10 0,90 0,37

10 0,74 5,41 0,64 10,30 0,55 0,70 11 0,91 0,91 3,77 3,82 1,46 0,54 12 1,86 4,35 0,97 1,19 0,53 0,08 13 0,14 0,33 3,48 3,18 1,83 0,12 14 1,17 1,38 1,81 0,99 0,87 0,06 15 1,53 0,23 0,41 0,75 0,49 0,03 16 4,54 0,01 0,68 0,92 0,33 0,75 17 0,12 0,89 10,78 14,22 2,89 0,04 18 1,48 1,89 0,77 1,10 1,17 0,01 19 1,63 1,95 1,31 1,28 1,51 0,39 20 0,29 0,62 0,95 2,16 2,63 0,01 21 0,16 0,22 0,64 0,34 0,71 0,06 22 0,42 0,60 0,34 0,48 0,30 0,03 23 0,69 4,72 0,66 3,00 1,13 1,18 24 0,03 0,83 0,08 0,21 0,63 0,05 25 1,90 0,37 3,97 7,89 6,96 0,11 26 0,68 1,24 0,28 0,59 1,13 0,19 27 6,71 5,12 0,29 0,57 0,95 0,03 28 1,22 1,93 0,63 0,76 0,05 0,59 29 0,32 0,59 0,47 0,65 0,38 0,09 30 2,67 3,71 1,91 1,59 7,78 0,05 31 1,48 1,96 0,38 0,92 0,30 0,18 32 3,36 7,75 1,64 0,81 0,54 0,05

Tabla F1. Se muestra el valor de doble delta CT obtenido para cada muestra de tejido proveniente , pacientes con cáncer de pulmón se presentan resaltados los valores mayores a 2, consideradas como muestras amplificadas.

66

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