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EVALUACIÓN BIOCIDA DE EXTRACTOS DE LAS SEMILLAS DE LAS PLANTASArgemone mexicana YArgemone platyceras, CONTRA EL
VECTOR TRANSMISOR DEL DENGUE: Aedes aegypti
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA AVANZADA
PRESENTA:
I.Q.I. FABIAN MENDOZA HERNÁNDEZ
DIRECTOR DE TESIS:
DRA. MARÍA DEL ROSARIO RUÍZ GUERRERO
México, D. F., julio de 2013
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE INVESTIGACIÓN E INNOVACIÓN TECNOLÓGICA
RESUMEN
Aedes aegypti (Linneaus) es el principal vector transmisor del dengue en América.
Con el control del vector se busca disminuir la incidencia de la enfermedad ante la
ausencia de una vacuna. La resistencia por parte del mosquito hacia los insecticidas
empleados habitualmente sugiere plantear la búsqueda de nuevas fuentes de moléculas
capaces de combatir al vector.
Se obtuvieron extractos de las semillas de Argemone mexicana y Argemone
platyceras tras la maceración de cada una de ellas con distintos disolventes. Los extractos
y fracciones obtenidas se evaluaron sobre larvas de Aedes aegypti y se determinaron las
dosis letales medias necesarias para ser tóxicas sobre el agente biológico.
Los mejores extractos y fracciones se seleccionaron para analizarse por medio de
pruebas fitoquímicas preliminares y cromatografía de gases‐espectrometría de masas para
identificar compuestospresentes en ellos.
ABSTRACT
Aedes aegypti (Linnaeus) is the main vector of dengue in America. With vector
control seeks to reduce the incidence of the disease in the absence of a vaccine.
Resistance by the mosquito to insecticides commonly used suggeststo posethe search new
sources of molecules capable of fighting vector.
Extracts were obtained from the seeds of Argemone mexicana and Argemone
platyceras after macerating each with different solvents. Extracts and fractions obtained
were evaluated on Aedes aegypti where the median lethal doses were required to be toxic
to the biological agent.
The best extracts and fraction were selected to be analyzed through preliminary
phytochemical tests and gas chromatography‐mass spectrometry to identify compounds
present in them.
i
Agradecimientos
Al Instituto Politécnico Nacional, mi segunda casa.
Al Centro de Investigación e Innovación Tecnológica… grandísimo centro de
investigación.
Al Colegio Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada
durante los cuatro semestres de duración de la maestría.
Al Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) por la beca
concedida durante la maestría.
A la Dra. Rosario, por el tiempo, paciencia y dedicación brindados para poder
realizar este proyecto. Por los apreciables consejos y por el apoyo durante estos 2 años…
gracias.
A la Dra. Irina, Dra. Antonieta, M. en C. Mariana, Dr. Ángel y Dr. David Jaramillo por
las valiosas aportaciones para el mejoramiento de este trabajo.
Al Laboratorio de Control Ambiental: Mariana, Alma, Lulú, Fanny, Teresita,
Rolando, Miguel, Fernando e Iván por el espacio proporcionado para la realización de este
proyecto, porque lo importante de haber estado en el laboratorio no fue compartirlo…es
la amistad que se va haciendo a lo largo del camino.
Al Laboratorio de Resistencia a Insecticidas del Centro Regional de Investigación en
Salud Pública del Instituto Nacional de Salud Pública (CRISP/INSP) de Tapachula, Chiapas:
Dr. Américo, Gabriel, Sr. Roberto, Daniel†yTavi; Dr. Mario Rodríguez y Alfonso Garza (CBG‐
IPN) por todo el apoyo brindado para la realización de las pruebas biológicas. A Alma y
Paco, porque aun cuando se conoce a muchas personas, nunca dejan de aparecer
personas extraordinarias… gracias por todo.
A la Dra. Guadalupe, Sra. Ofelia, Cinthia, Ángel y Juan Manuel… hace falta inventar
nuevos adjetivos que describan todo lo que hay que decir de estas personas a un nivel
superlativo… mil gracias por su apoyo incondicional.
A la delegada Refugio Viveros, enfermera Odilia e Irving (IMSS), a la Lic. Verónica P.
Fernández y al Dr. Héctor Gurrola (ISSSTE) por toda la ayuda, por los consejos que me
permitieron creer que, aunque tal vez no había motivos para grandes celebraciones, las
pequeñas conquistas del día a día eran motivo de alegría.Al Dr. Serrano (IMSS) por
hacerme creer que nada es imposible.
ii
Al Dr. Trejo, Dra. Ma. Esther, Alicia, Polo, Leo, Dr. Joel, Josué (IMP) por su amistad,
por todas las palabras de aliento dedicadas en momentos difíciles.
A Nayeli, Diana Marcela, Mónica, Gaby y Paola, por las asesorías y consejos
valiosos. A Claudia Leticia, Eli, Claudia G., Cindy, Diana Sahilly, Alejandro, Cosme,
Emmanuel y Hugo por su sincera amistad… porque cuando se sufre una caída, siempre hay
alguien que te ayuda a no quedarte mirando hacia el suelo.
A mis compañeros de laboratorio: Juan, conocedor del esfuerzo y tiempo
dedicados para la realización de este trabajo, cómplice de buenos y muy buenos
momentos; Rebeca y Diana, por los momentos y experiencias vividas en los viajes durante
la maestría.
A Luz, Dalia, Elizabeth, Miguel y Mauricio, compañeros y amigos de esta
experiencia inolvidable llamada maestría.
iii
Dedicatoria
A mi familia:
a mi abuelita Trini que ha sido como una madre;
amis tías: Lupe, Mari, Carmen, Cata y Clara;
a mis tíos: Roberto, Paco, Tomás, Agricol y Felipe;
a mis primas: Anahí, Paola, Pamela, Dulce, Claudia, Liz, Karla, Jessie y Yoali;
a mis primos: Marlon, Oswin, Joshimar, Roberto e Irving;
a mis sobrinas: Meli, Jenny y Camila;
a Bladimir, un gran ejemplo de fortaleza y de ganas de seguir adelante…
…ni en mis mejores y más anhelados sueños hubiera tenido una familia como esta.
A la memoria de mi abuelo Pablo y mi tía Raquel.
iv
Y, finalmente, al “amigo de allá arriba”…
Señor…
gracias por darme la fuerza y la convicción necesarias para seguir adelante sin mayores problemas...
gracias por guiarme de manera impecable a través de los obstáculos que se han presentado en mi camino y por mantenerme firme cuando todo parecía estar perdido...
gracias por tu protección, y por las señales a lo largo del camino...
gracias por lo bueno que me has permitido hacer hasta el momento y te pido perdón por todo lo malo...
gracias por la familia que me has dado y gracias por todos los amigos que he hecho, por favor, cuídalos al igual que lo has hecho conmigo...
gracias por todas las personas que quisiste que conociera y por las que seguiré conociendo…
gracias por finalmente permitirme llegar hasta esta instancia, ahora, será momento de trabajar más duro sabiendo que tendré que hacer lo correcto con mi tiempo en esta
tierra.
v
INTRODUCCIÓN
El dengue es la enfermedad tropical de mayor propagación en el mundo y supone
"una amenaza de pandemia", ya que infecta a alrededor de 50 millones de personas en
todos los continentes, de acuerdo con lo citado por la Organización Mundial de la Salud
(OMS) en enero de este año (Reuters, 2013). El mismo informe de la OMS señala que la
enfermedad se ha extendido más debido al movimiento creciente de personas y a los
cambios climáticos, por lo que la enfermedad viral que sólo afectó a un puñado de países
en los años 50’s ahora está presente en más de 125 países, más que la malaria,
históricamente la enfermedad transmitida por mosquitos más destacada.
Aedes aegypti (Linneaus) es el principal vector transmisor del dengue en el
continente americano.Entre 1948 y 1972 el Ae. aegypti, también mosquito vector de la
fiebre amarilla, fue erradicado de 21 países en el continente americano. Para el año de
1997, prácticamente todos los países de América se encontraban reinfestados, incluida la
parte sur de los Estados Unidos, las numerosas epidemias de dengue que han ocurrido
han convertido a la enfermedad progresivamente en un problema de salud (Rodríguez,
2002). En 2008, en regiones de América, Asia Sudoriental y el Pacífico Occidental se
registraron en conjunto más de 1,2 millones de casos, y en 2010, más de 2,3 millones
(según datos oficiales presentados por los países miembros a la OMS). En fechas recientes
el número de casos notificados ha seguido aumentando. En 2010, se notificaron 1,6
millones de casos tan solo en América; 49 000 de ellos fueron de dengue grave.
Hasta ahora, el único método de control de la enfermedad es mediante el control del
vector. La vacunamás avanzada contra el virus, ha demostrado sólo un 30 por ciento de
eficacia en un amplio ensayo clínico desarrollado en Tailandia, bastante menos de lo
esperado, según los resultados publicados en septiembre de 2012 (Reuters, 2013).
Los insecticidas químicos son la piedra angular sobre la que recaen las prácticas de
control de vectores, y es probable que sigan siéndolo, siempre y cuando estén disponibles
productos químicos de bajo costo y eficaces, en la medida de lo posible, únicamente sobre
el insecto blanco. El temefos se encuentra dentro de los insecticidas organofosforados
más utilizados como larvicida en el tratamiento focal de Ae. aegypti. En la mayoría de los
países de América Latina desde los años 90 se han empleado los insecticidas piretroides
para el control de mosquitos adultos en caso de epidemias o en presencia de altos índices
de infestación del vector. El principal problema operacional que afecta el control del
mosquito es la resistencia que Ae.aegypti ha desarrollado a una amplia gama de
insecticidas.
vi
La resistencia no es el único inconveniente en el uso de insecticidas químicos,
además, su uso desmedido se ve reflejado en problemas de salud de la población donde
los brotes de dengue tienen presencia. La misma resistencia provoca que se tengan que
utilizar productos cada vez más potentes para poder combatir al mosquito vector, lo que
perjudica en gran medida a insectos no blanco y al medio ambiente en general.
Los insecticidas con nuevo modo de acción, se suelen buscar regularmente como
un medio para hacer frente a los problemas de resistencia. Sin embargo, la presencia de
múltiples mecanismos de resistencia (es decir, insensibilidad de la acetilcolinesterasa, la
penetración reducida, la insensibilidad del sistema nervioso y la detoxificación de
insecticidas) sugiere que la resistencia puede ocurrir a cualquier clase de insecticida dado
el tiempo suficiente, la presión de selección constante, y una población suficientemente
grande como para que la selección ocurra.
Ante la necesidad de sustituir el uso excesivo de insecticidas químicos, la creciente
demanda por el empleo de productos naturales se ha intensificado en las últimas décadas,
ya que son utilizados ampliamente como compuestos biológicamente activos y se están
considerando una alternativa importante para el manejo sostenible de plagas de insectos
en la agricultura y vectores de enfermedades, ya que son biodegradables y
potencialmente adecuados para su uso en la gestión integrada de programas de control.
Los bioinsecticidas o insecticidas botánicos están ganando cada vez más atención e
interés por provenir de una fuente natural (en su mayoría de plantas) de compuestos con
una amplia gama de efectos sobre los insectos. Además, están jugando un papel vital en la
producción de alimentos orgánicos a nivel mundial.
En lo que respecta a las especies vegetales, las más exitosas suelen sintetizar una
amplia gama de compuestos de defensa moderadamente tóxicos o un pequeño número
de sustancias altamente tóxicas. Estos mecanismos de defensa que las plantas han
desarrollado han sido observados desde épocas remotas por parte de nuestros ancestros.
Diversos trabajos basados en el uso de extractos y aceites esenciales de plantas buscan
aprovechar los fitoquímicos presentes en ellas para poder dar una solución al control de
las poblaciones de Aedes aegypti conociendo sus dosis letales y el tiempo para lograr los
efectos letales sobre las larvas del mosquito, sin embargo, el modo de acción a nivel
molecular de los fitoquímicos no está totalmente esclarecido dado la extensa variedad de
defensas químicas que se encuentran presentes en la naturaleza.
Si bien la historia indica que la aparición de la resistencia es posible, expertos
sugieren que hay menos posibilidades de desarrollo de la resistencia con nuevas
moléculas de origen vegetal con sitios específicos o múltiples. Fitoquímicos aún
vii
inexplorados pueden tener un lugar desconocido de acción, pero ser selectivos para los
insectos y ser seguros para los seres humanos y el medio ambiente. La combinación de
acciones fisiológicas y de comportamiento de los insecticidas botánicos impediría el
desarrollo de la resistencia (Rice, 1993).
Por lo anterior, en este trabajo se obtuvieron los extractos de las semillas de las
plantas de Argemone mexicana y Argemone platyceras por medio de maceración con
cuatro disolventes de distinta polaridad. Los extractos obtenidos, y en algunos casos sus
fracciones, fueron evaluados sobre larvas de Ae. aegypti de probada susceptibilidad y
resistencia a insecticidas. Los extractos/fracciones más tóxicos de acuerdo a su valor de
dosis letal media fueron analizados por espectrometría de masas con lo que fue posible
determinar las estructuras de los compuestos presentes que pueden ser responsables de
la actividad larvicida.
El trabajo está dividido en cinco capítulos, en el primero de ellos se hace mención
de la entomología del dengue, lo que permite conocer más acerca de la enfermedad y de
su vector Ae. aegypti. Además, se hace una revisión de los productos naturales o
metabolitos secundarios, donde se detalla su clasificación, su modo de acción hasta ahora
conocido sobre los insectos, así como aquellos trabajos que se han realizado sobre plantas
para conocer sus efectos tóxicos sobre Ae. aegypti. Finalmente dentro del capítulo se
aborda la problemática de la resistencia a los insecticidas químicos, mencionando los
diversos insecticidas que se utilizan, su clasificación, modo de acción, los mecanismos que
se tienen de resistencia y se describen trabajos de susceptibilidad/resistencia de Ae.
aegypti a los diversos insecticidas empleados en varios países del continente americano.
En el Capítulo II se puntualiza el desarrollo experimental llevado a cabo desde la
maceración de las semillas de las plantas pasando por los bioensayos del material vegetal
sobre las larvas de Ae. aegypti hasta la determinación estructural de los compuestos
presentes en los extractos y fracciones evaluadas con mayores efectos tóxicos.
Los resultados del desarrollo experimental se presentan dentro del Capítulo III y su
posterior discusión se trata en el Capítulo IV. Por último, las conclusiones del trabajo se
presentan en el Capítulo V.
viii
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Dadas las condiciones de reproductividad y adaptabilidad del Aedes aegypti se
hace sumamente difícil el control de sus poblaciones. El uso indiscriminado de insecticidas
químicos ha provocado problemas en la salud y el ambiente, aunado a la resistencia que
el vector ha presentado a estos compuestos.
Emplear bioinsecticidas para poder controlarlo es una alternativa viable y que
cobra un interés cada vez mayor por parte de la actividad investigadora.
ix
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad larvicida de los extractos obtenidos de las semillas de
Argemone mexicana y Argemone platycerasen larvas de cuarto estadio y la identificación
de sus principios activos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
I. Obtener los extractos orgánicos con disolventes de diferente polaridad (hexano,
acetato de etilo, acetona y metanol) y de manera sucesiva de las semillas de ambas
plantas.
II. Obtener las fracciones correspondientes del extracto con mayor rendimiento por
medio de técnicas cromatográficas.
III. Evaluar los extractos y fracciones en bioensayos de susceptibilidad sobre larvas de
tercer estadio tardío – cuarto estadio temprano de Aedes aegypti de resistencia
probada a insecticidas.
IV. Evaluar los extractos crudos y fracciones de la semilla de Argemone mexicana en
bioensayos de susceptibilidad sobre larvas de tercer estadio tardío – cuarto estadio
temprano de Aedes aegypti susceptibles a insecticidas.
V. Determinar las dosis letales medias de los extractos y fracciones de las semillas de
las plantas mediante el análisis Probit.
VI. Determinar, de manera cualitativa a través de un análisis fitoquímico preliminar los
grupos de metabolitos presentes en los mejores extractos/fracciones de las
semillas de ambas plantas.
x
ÍNDICE
Agradecimientos……………………………………………………………………………………………………………………………..i
Dedicatoria…………………………………………………………………………………………………………………………………….iii
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………………………………………………v
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………………………………………………………………………………….viii
OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………………………..……………………..ix
ÍNDICE…………………………………………………………………………………………………………………………………………….x
ÍNDICE DE TABLAS………………………………………………………………………………………………………………………..xiv
ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………………………………………………………………….xv
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBIOGRÁFICA……………………………………………………………………………………………..1
I.1 EL dengue y el vector Aedes aegypti .......................................................................................... 1
I.1.1 Entomología del dengue ..................................................................................................... 1
I.1.1.1 Aedes aegypti, vector transmisor ................................................................................... 2
I.1.1.1.1 Ciclo de vida del vector ............................................................................................ 3
I.1.1.1.2 Aspectos generales de Aedes aegypti ...................................................................... 5
I.1.1.2 Transmisión del virus del dengue ................................................................................... 6
I.1.1.3 Actualidad del dengue………………………………………………………………………………………………. 7
I.1.1.4 Medidas de control del dengue…………………………………………………………………………………..8
I.1.1.4.1 Manejo de la enfermedad. Elaboración de una vacuna…………………………………….....8
I.1.1.4.2 Métodos de control del vector……………………………………………………………………………..9
I.1.1.4.2.1 Campañas de educación preventiva……………………………………………………………….9
I.1.1.4.2.2 Uso de enemigos naturales de Aedes aegypti………………………………………………10
I.1.1.4.2.3 Control químico……………………………………………………………………………………………11
I.1.1.4.2.4 Control biológico………………………………………………………………………………………….11
I.1.1.4.2.4.1 Bioinsecticidas……………………………………………………………………………………….11
xi
I.2 Productos naturales……..…………………………………………………………………………………………………….13
I.2.1 Metabolitos secundarios…….…………………………………………………………………………………….….13
I.2.1.1 Modo de acción de los metabolitos secundarios de plantas contra insectos…………….14
I.2.2 Extracción de productos naturales………………………………………………………………………………..16
I.2.2.1 Métodos de extracción……………..……………………………………………………………………………..17
I.2.2.1.1 Maceración………………………………………………………………………………………………………….17
I.2.2.1.1 Percolación o lixiviación.………………………………………………………………………………………17
I.2.2.1.3 Destilación al vapor..……………………………………………………………………………………………17
I.2.3 Control de Aedes aegypti con productos naturales………………………………………………………18
I.2.4 Resistencia a insecticidas naturales………………………………………………………………………………23
I.2.4 Argemone mexicana y Argemone platyceras………….………………….…………………………………23
I.3 Resistencia a insecticidas químicos…………………………………………………………………………………….24
I.3.1 Insecticidas químicos……………………………………………………………………………………………………24
I.3.1.1 Clasificación de los insecticidas…………………………………………………………………………………25
I.3.2 Resistencia a insecticidas…………………………………………………………………………………………….26
I.3.2.1 Indicativo de la resistencia………………………………………………………………………………………..27
I.3.2.2 Tipos de resistencia…………………………………………………………………………………………………..27
I.3.2.2.1 Resistencia cruzada……………………………………………………………………………………………27
I.3.2.2.1.1 Resistencia cruzada positiva…………………………………………………………………………27
I.3.2.2.1.2 Resistencia cruzada negativa……………………………………………………………………….28
I.3.2.2.2 Resistencia múltiple………………………………………………………………………………………….28
I.3.2.3 Mecanismos de resistencia a insecticidas…………………………………………………………………28
I.3.2.4 Resistencia de Aedes aegypti a insecticidas………………………………………………………………29
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS………………..……………………………………………………………….…….32
xii
II.1 Materiales……………………………………………………………………………………….……………………………….32
II.1.1 Material vegetal………………………………………………………………………………….……………………..32
II.1.2 Material biológico……………………………………………………………………………….……………………..32
II.1.3 Insecticida comercial………………………………………………………………………….………………………..33
II.2 Metodología…..…………………….……………………………………………………….…………………..……………..34
II.2.1 Obtención de extractos orgánicos..………………………………………………………………………………36
II.2.2 Fraccionamiento de los extractos orgánicos..……………………………………………………………….37
II.2.2.1 Fraccionamiento y separación del extracto crudo de hexano…………………………………..38
II.2.3 Técnicas cromatográficas empleadas……………………............................…………………………..39
II.2.3.1 Cromatografía en placa fina.…..…….………………………………………………………………………….39
II.2.3.2 Cromatografía en columna……………………………………………………………………………………….39
II.2.3.1 Cromatografía en placa preparativa…………………………………………………………………………40
II.2.4 Fraccionamiento biodirigido o pruebas biológicas…………..…………………………………………..41
II.2.4.1 Bioensayo I Determinación de extractos/fracciones más eficaces………………………….42
II.2.4.2 Bioensayos II.Dosis letal media para larvas resistentes a insecticidas……….……………44
II.2.4.3 Bioensayo III. Dosis letal media para larvas susceptibles a insecticidas…………………..47
II.2.4.4 Análisis estadístico…………………………………………………………………………………………………47
II.2.5 Determinación estructural de componentes……………………………………………………………….48
II.2.5.1 Análisis fitoquímico preliminar……………………………..……………………………………………….48
II.2.5.2 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas….……………………………49
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………..50
III.1 Introducción……………………………………………………………………………………………………………………50
III.2 Obtención de extractos orgánicos…………………………………………………………………………………..51
III.3 Fraccionamiento biodirigido o pruebas biológicas…………………………………………………………..51
xiii
III.3.1 Bioensayo I. Determinación de extractos orgánicos y fracciones eficientes sobre larvas
de Ae. aegypti resistentes…………………………………………………………………………………………………………….51
III.3.1.1 Efecto de controles positivo y negativo y testigos sobre larvas de Ae. aegypti……….54
III.3.2 Bioensayo II. Determinación de dosis letal media (DL50) para larvas de Ae. aegypti
resistentes……………………………………………………………………………………………………………………………………56
III.3.3 Bioensayo III. Determinación de dosis letal media (DL50) para larvas de Ae. aegypti
susceptibles………………………………………………………………………………………………………………………………….57
III.3.3.1 Efecto de controles positivo y negativo y testigos sobre larvas de Ae. aegypti
susceptibles………………………………………………………………………………………………………………………………….59
III.3.4 Comparación de valores de DL50 de extractos/fracciones de la semilla de A. mexicana
sobre larvas de Ae. aegypti resistentes y susceptibles………………………………………………………………….60
III.4 Determinación estructural de compuestos……………………………………………………………………….61
III.4.1 Análisis fitoquímico preliminar…………………………………………………………………………………….61
III.4.2 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas……………………………………..64
CAPÍTULO IV.CONCLUSIONES……………………………………………………………………………………………………….74
BIBLIOGRAFÍA………..…………………………………………………………………………………………………………………….76
ANEXO A. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS……….…………………………………………………………………….85
ANEXO B. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS…………………………………………………………………………….105
ANEXO C. DETERMINACIÓN DE LOS EXTRACTOS ORGÁNICOS Y FRACCIONES MÁS EFICACES……..117
ANEXO D. DETERMINACIÓN DE DOSIS LETAL MEDIA (DL50). ANÁLISIS PROBIT….………………………..124
ANEXO E. REACTIVOS PARA PRUEBAS FITOQUÍMICAS………………………………………………………………..129
xiv
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I.1 Clasificación taxonómica de Aedes aegypti……………….……………………………………………………..3
Tabla I.2 Fuentes de bioinsecticidas, mecanismo de acción, efectos y organismos sobre los que
actúan…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 12
Tabla I.3 Modo de acción de los metabolitos secundarios sobre insectos.………………………………….. 15
Tabla I.4 Plantas evaluadas contra Aedes aegypti…..…………………………………………………………………….20
Tabla I.5 Tipos de insecticidas, modo de acción y mecanismo de resistencia………..……………………. 26
Tabla II.1 Tratamientos evaluados en el Bioensayo I……………………………………………………………………43
Tabla II.2 Tratamientos evaluados en el Bioensayo II…………………………………………………………….……..45
Tabla II.3 Tratamientos evaluados en el Bioensayo III………………………………………………………….……….47
Tabla II.4 Reacciones de identificación característica de metabolitos secundarios presentes en los
extractos y fracciones…………………………………………………………………………………………………………………. 49
Tabla III.1 Rendimiento obtenido (%) de los extractos orgánicos de las semillas de las plantas
evaluadas…………………………………………………………………………………………………………………………………… 51
Tabla III.2 Eficiencia de extractos orgánicos y fracciones de las semillas de A. mexicana y A.
platyceras sobre larvas de Ae. aegypti resistentes……………………………………………………………………… 52
Tabla III.3 Valores de dosis letal media (DL50) a 24 y 48 h para extractos orgánicos y fracciones de
las semillas de A. mexicana y A. platyceras sobre larvas de Ae. aegypti resistentes………………….. 56
Tabla III.4 Valores de dosis letal media (DL50) a 24 y 48 h para extractos orgánicos y fracciones de la
semilla de Argemone mexicana en larvas de Aedes aegypti susceptibles a insecticidas…………….. 58
Tabla III.5 Relación de DL50 a 48 h para larvas resistentes y larvas susceptibles…………………………… 61
Tabla III.6 Análisis fitoquímico preliminar de los extractos y fracciones de las semillas de A.
mexicana y A. platyceras…………………………………………………………………………………………………………….. 62
xv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura I.1 Distribución geográfica del dengue.………………………………………………………………………………..2
Figura I.2 Mosquito hembra Aedes aegypti……………………………………………………………………………..……..2
Figura I.3 Ciclo de vida de Ae. aegypti…………………………………………………………………………………………….3
Figura I.4 Transmisión de virus del dengue…………………………………………………………………………………….6
Figura I.5 DDT……………………………………………………………………………………………………………………………… 26
Figura II.1 Larvas de cuarto estadio de Aedes aegypti…………………………………………………………………..33
Figura II.2 Temefos……………………………………………………………………………………………………………………… 34
Figura II.3 Esquema de la metodología desarrollada para la identificación de los compuestos
bioactivos presentes en la semilla de Argemone mexicana y Argemone platyceras contra Aedes
aegypti..………………………………………………………………………………………………………………………………………..3
5
Figura II.4 Extracción de componentes de la semilla de las plantas…………………………………………….. 37
Figura II.5 Purificación del extracto orgánico de hexano con metanol……………………………………….. 38
Figura II.6 Cromatografía en columna…………………………………………………………………………………………. 39
Figura II.7 Cromatografía en placa preparativa…………………………………………………………………………… 40
Figura II.8 Bioensayos de toxicidad sobre larvas de Aedes aegypti…………………………………………….. 46
Figura III.1 Porcentaje de larvas muertas para controles y testigos…………………………………………….. 55
Figura III.2 Porcentaje de larvas muertas para controles y testigos…………………………………………….. 60
Figura III.3 Placas finas de las pruebas fitoquímicas preliminares para Argemone mexicana………. 63
Figura III.4 Espectro de masas del 8‐metil, decanoato de metilo………………………………………………… 64
Figura III.5 Espectro de masas de 4‐metil, 3‐penten‐2‐ona…………………………………………………………. 65
Figura III.6 Espectro de masas de 4‐hidroxi‐4‐metil‐2‐pentanona……………………………………………….. 66
Figura III.7 Espectro de masas del ácido pentanoico…………………………………………………………………… 67
Figura III.8 Espectro de masas del anhídrido acético fórmico……………………………………………………….68
Figura III.9 Espectro de masas del pentadecanoato de etilo…………………………………………………………69
xvi
Figura III.10 Espectro de masas del ácido hexadecanoico……………………………………………………………70
Figura III.11 Espectro de masas del 9‐octadecenoato de etilo……………………………………………………..71
Figura III.12 Espectro de masas del 9,12‐octadecadienoato de etilo……………………………………………72
Figura III.13 Espectro de masas de bis (2‐etilhexil) adipato………………………………………………………….73
1
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
I.1 El dengue y el vector Aedes aegypti
I.1.1 Entomología del dengue
Sin duda alguna, uno de los problemas en salud pública que es considerado como
prioridad, en los diversos países donde tiene presencia, es el dengue. La Organización
Mundial de la Salud refería en 2012 que se estiman en promedio 50 millones de casos de
la enfermedad del dengue; sin embargo, de acuerdo a estudios independientes, el número
real de casos promedio oscila los 100 millones (Nebehay, 2013).
El dengue es una enfermedad viral aguda, que es transmitida a los seres humanos
por mosquitos del género Aedes, siendo Aedes aegypti el principal vector (Gubler, 1998),
así como de otras enfermedades virales (Dégallier, et al., 1998). Los virus del dengue
abarcan cuatro serotipos relacionados que causan enfermedad muy similar en los
humanos, denominados DENV‐1, DENV‐2, DENV‐3 y DENV‐4 (Virus del dengue
correspondiente a los serotipos 1, 2, 3 y 4). Pertenecen al género Flavivirus, familia
Flaviviridae, que de igual manera es denominado “arbovirus” o virus que se transmite por
artrópodos, debido a que se transmiten entre huéspedes vertebrados por mosquitos
(Beasley, 2008). Los virus son genéticamente distintos entre sí, con lo que una infección
por uno de los cuatro serotipos puede inmunizar sólo para dicho serotipo
específicamente. En teoría, significa que una persona puede estar infectada por cada uno
de los cuatro serotipos, aunque las infecciones son muy raras, una tercera y cuarta
infección no se han reportado (OMS, 2012).
Existen tres manifestaciones clínicas de la enfermedad que son la fiebre del
dengue (FD), seguida de la fiebre hemorrágica del dengue (FHD) y la complicación de ésta
última, el síndrome de shock por dengue (SSD). La FD afecta principalmente a lactantes,
niños pequeños y adultos mayores, se caracteriza por fiebre, mialgia o artralgia, erupción
cutánea, linfadenopatía y leucopenia, pero rara vez es causa de muerte. En cambio, la FHD
es un caso grave caracterizado por fiebre alta, agrandamiento del hígado, insuficiencia
circulatoria que conduce, en casos severos, a un síndrome de shock por pérdida de
proteínas (SSD, potencialmente mortal) (Halstead, 2008).
El dengue se presenta en las regiones con clima tropical y subtropical de todo el
mundo, principalmente en zonas urbanas y semiurbanas. La Figura I.1 exhibe las áreas que
se encuentran en riesgo de contraer la enfermedad (OMS, 2012).
2
Figura I.1. Distribución geográfica del dengue (modificado de OMS, 2012).
I.1.1.1 Aedes aegypti, vector transmisor
Originario de África (Gubler, 2008), el Aedes aegypti (Fig. I.2) probablemente
invadió otros continentes a través de barcos mercantes y de transporte que reabastecían
en los puertos africanos durante los siglos XV y XVII (Christophers, 1960; Resiter, 1998).
Estos barcos contaban con reservorios de agua dulce a bordo que podían contener
colonias de Aedes. Es probable que poblaciones del mosquito se introdujeran en el resto
del mundo en varias ocasiones a través de este medio (Tabachnick, 1991). Actualmente se
puede encontrar al mosquito en áreas urbanas y semiurbanas alrededor del mundo
(Carbajo, et al., 2006; Fuller, et al., 2010).
Figura 1.2. Mosquito hembra Aedes aegypti.
Áreas en riesgo de contraer el dengue
3
Aedes aegypti responde a la clasificación taxonómica que se presenta en la Tabla I.1.
Tabla I.1. Clasificación taxonómica de Aedes aegypti.
Reino Animalia Phylum Arthropoda Clase Insecta Orden Díptera Familia Culicidae
Subfamilia Culicinae Género Aedes
Subgénero Stegomyia Especie aegypti (Linnaeus, 1792)
I.1.1.1.1 Ciclo de vida del vector
Expertos coinciden en que quizá el aspecto más importante a tener en cuenta para
un adecuado enfoque de cualquier estrategia de control, tanto del dengue como de Aedes
aegypti, es el conocimiento del ciclo vital del vector del DENV, sumado a las
consideraciones de índole social que potencian la presencia de los criaderos de la especie
en el entorno humano (Thirión, 2003).
Los mosquitos Aedes son holometábolos, es decir, presentan una metamorfosis
completa, con lo que se pueden distinguir dos etapas bien diferenciadas en el ciclo de vida
del mosquito: la fase aérea que comprende su etapa como mosquito y, la fase acuática
con tres etapas evolutivas de su ciclo (huevo, larva y pupa), tal como puede observarse en
la Figura I.3. En regiones tropicales el ciclo se completa entre 7 y 13 días.
4
Figura I.3. Ciclo de vida de Ae. aegypti.
Una vez que ha sido fecundada y ha ingerido sangre de un humano, la ovipostura
de la hembra se lleva a cabo preferentemente por las tardes (de 10 a 100 huevos por vez),
pone sus huevecillos uno a uno y estos quedan adheridos a las paredes de los recipientes
al ras del agua. Los huevos miden menos de 1 mm de largo. En el momento de la postura,
el embrión inicia su formación, para lograr su desarrollo necesita de dos a tres días con
humedad. Las primeras 48 horas de esta etapa juegan un papel crucial, donde la
temperatura y humedad son esenciales para su supervivencia; una vez que se ha
desarrollado completamente la larva dentro del huevo es capaz de resistir sequía y bajas
temperaturas, sobrevive por períodos de varios meses hasta poco más de un año. Bajo
estas condiciones, la larva permanece en estado de diapausa hasta tener contacto con el
agua de nuevo al disminuir el suministro de oxígeno atmosférico, se activa y emerge del
cascarón (Thirión, 2003). Su vida acuática se inicia con el primero de cuatro estadios, cada
uno de mayor talla que el anterior. El paso de un estadio larval a otro se lleva a cabo por
muda en la que abandona su exoesqueleto, manteniéndose protegida por una nueva
cubierta del cuerpo que se formó previamente, esto permite el aumento de su talla. Las
larvas pasan la mayor parte del tiempo alimentándose, tienen sedas bucales en forma de
abanico que emplean para atrapar las partículas y microorganismos que encuentran en el
agua, por lo que se les considera omnívoras (Colvard, 1978).
Normalmente el desarrollo larval dura de cinco a siete días y concluye cuando la
larva del cuarto estadio se desarrolla y alcanza la forma de pupa, la cual es móvil y sólo
respira, no se alimenta, por lo general este estadio dura 48 horas o un poco más. Bajo
condiciones desfavorables, el tiempo del cuarto estadio larval puede prolongarse dando
Mosquito adulto
Fase aérea
Fases que se desarrollan bajo el aguaHuevo
Pupa
Larva1° 2°
3° 4°
5
lugar a pupas y adultos de tamaño más pequeño. El adulto, al emerger de la pupa, es un
mosquito oscuro, presentando rayas blancas y negras tanto en el dorso como en las patas.
Los machos se diferencian de las hembras por tener un menor tamaño y por sus antenas
más plumosas. Hembra y macho liban néctar u otros carbohidratos de cualquier fuente
accesible, únicamente la hembra se alimenta de sangre para obtener así el hierro y
proteínas que le son necesarios para la maduración de los ovocitos, y aumentar la
viabilidad de los huevos.
La cópula ocurre a pocas horas de la emergencia del adulto (24‐48 horas). La
hembra oviposita durante toda su vida entre 300 y 750 huevos, influyendo la temperatura
y las ingestas de sangre. Es suficiente una sola fertilización para fecundar todos los
huevos.
En condiciones ideales viven 131‐225 días, pero en estado natural no llegan a un
mes (Thirión, 2003).
I.1.1.1.2 Aspectos generales de Aedes aegypti
Aedes aegypti es una especie tropical y subtropical cuya dispersión se limita a
latitudes comprendidas entre los 35° Norte y los 35° Sur, correspondientes a una isoterma
de 10° durante el verano (véase Figura I.1); y aunque ha sido localizado hasta los 45°
(Bisset, 2002), su presencia en esta latitud se debe a invasiones durante la estación cálida,
no soportando el invierno. La altura también es un factor limitante de su dispersión,
encontrándose sólo por debajo de los 1800 msnm, aunque en Colombia ha sido reportado
en los programas de vigilancia entomológica hasta los 2200 msnm, debido probablemente
al incremento de la temperatura media y a la desordenada urbanización de casi todas las
ciudades, más allá del Ecuador rara vez se encuentra por arriba de los 1000 msnm
(Nelson, 1986).
Se considera una especie predominantemente doméstica, ya que prolifera en
recipientes artificiales o naturales encontrados en las viviendas o en sus alrededores,
únicamente las hembras son hematófagas, se alimentan de sangre de los humanos o de
animales domésticos que detectan por estímulos visuales, movimientos, tamaño, olor,
humedad, temperatura, concentración de CO2, entre otros. Esta sangre les es necesaria
para desencadenar la maduración de sus óvulos. Por lo anterior, rara vez se encuentran a
más de 100 metros de la vivienda humana (Martínez, 1987). En contadas ocasiones se ha
encontrado hasta varios kilómetros de la vivienda más cercana.
6
I.1.1.2 Transmisión del virus del dengue
Como se muestra en la Figura I.4, los seres humanos infectados son los principales
portadores y multiplicadores del virus, sirviendo como fuente del virus para los mosquitos
no infectados. El virus circula en la sangre de los seres humanos infectados durante 2 a 7
días, coincidiendo aproximadamente con el periodo febril; los mosquitos Aedes pueden
adquirir el virus cuando se alimentan de la sangre de una persona durante este período
(Fig. I.4.a). Posteriormente al quedar infectado, el mosquito transmite el virus a una
persona sana a través de la picadura y alimentación de su sangre (Fig. I.4.b). La cadena se
repite cuando un nuevo mosquito hembra se alimenta de la sangre de la persona
contagiada con el DENV (Fig. I.4.c).
Figura I.4. Transmisión del virus del dengue.
De acuerdo con Thirión (2003), en estudios de laboratorio se había observado la
capacidad de transmisión transovárica y transestadial del virus del dengue en las especies
Ae. aegypti y Ae. albopictus, y se demostró que esto ocurre de forma natural, sin
embargo, no se conoce la magnitud de dicho fenómeno, aunque se cree que es muy rara
su ocurrencia. Anteriormente se pensaba que todos los mosquitos nacían sanos, la
hembra adquiría el virus al ingerir sangre humana contaminada de un individuo en su fase
virémica de la infección. Hay autores que hasta consideran la posibilidad de que el
mosquito pueda transmitir el dengue mecánicamente si cambia en forma inmediata de
huésped al interrumpir la absorción de sangre infectada. La hembra se convierte en
transmisora permanente del dengue después de haber transcurrido el periodo extrínseco
de incubación, tiempo durante el cual el virus se multiplica en el tubo digestivo y pasa a
las glándulas salivales, la temperatura afecta la replicación viral y la duración de este ciclo.
Mosquito
sano
Persona
infectada Persona
infectada Persona
infectada
Mosquito
infectado
a b c
7
I.1.1.3 Actualidad del dengue
En el continente americano se llevaron a cabo grandes y coordinados esfuerzos
para la erradicación de la fiebre amarilla por parte de la Organización Panamericana de la
Salud entre los años de 1950 y 1960, con lo que se produjo un descenso notable en las
poblaciones de Aedes aegypti (vector transmisor del DENV y la fiebre amarilla) en el
continente (Scheliessman & Calheiro, 1974). Sin embargo, ante una reducción en los
esfuerzos por mantener los programas de control en la década de 1970 se produjo una
reinfestación de Ae. aegypti en la mayoría de las regiones del norte y del sur de América,
seguidos por epidemias posteriores de dengue y la aparición de dengue hemorrágico en
algunas zonas (Gubler, 1989).
Aunque Ae. aegypti tenía presencia en la región del Mediterráneo antes de la
Segunda Guerra Mundial (Kumm, 1931), también desapareció del sur de Europa y el norte
de África después de este período. La razón de este hecho no está del todo esclarecida,
aunque existe la probabilidad de que sea atribuible a los esfuerzos por erradicar la malaria
y el uso generalizado y desmedido del DDT (Reiter, 2001).
El DENV se aisló por vez primera en el continente americano en 1942 (Schneider &
Droll, 2001; Isturiz, et al., 2000), aunque se sabe de los grandes brotes que provocó en el
Caribe desde la primera mitad del siglo XVII, así como epidemias continentales o
verdaderas pandemias a lo largo de los siglos XIX y XX. Cuba reportó la primera gran
epidemia de dengue hemorrágico en el año de 1981, presentándose 24 mil casos por DH,
10 mil casos por síndrome de shock por dengue y se tuvieron 158 muertes que fueron
reportadas en un lapso de tres meses (Schneider & Droll, 2001; Isturiz, et al., 2000;
Gubler, 1988). En 1986 y 1987 se registraron brotes masivos de fiebre de dengue en Brasil
(Figuereido, et al., 1990; Zagne & Alves, 1994). Investigaciones serológicas posteriores
realizadas en el mismo Brasil estimaban 4 millones de casos de FD, la cifra clínicamente
estimada es de 1 millón de casos (Zagne & Alves, 1994). Para el año de 1988 un brote de
FD tuvo lugar a 1700 msnm en el estado de Guerrero, México (Herrera‐Basto, et al., 1992).
En 1990 casi un cuarto de los 300 mil habitantes de la comunidad de Iquitos en Perú
contrajo la FD y para ese mismo año se registraron 3,108 casos de DH con 78 muertes en
Venezuela (Anonymus, 1991). Cifras del año 2001 para la región indican la ocurrencia de
482,799 casos de infección, de ellos 9,893 fueron por DH/SSD, presentándose 161
muertes. En diversos países latinoamericanos han registrado la circulación simultánea de
los cuatro serotipos del virus.
Antes de 1970, solo nueve países habían sufrido epidemias de dengue grave. Sin
embargo, ahora la enfermedad es endémica en más de 125, más que la malaria,
históricamente la enfermedad transmitida por mosquitos más destacada. Los países más
8
afectados son los que se encuentran en las regiones de África, América, el Mediterráneo
Oriental, Asia Sudoriental y el Pacífico Occidental. Siendo estas últimas dos regiones las
más afectadas (OMS, 2012).
En 2008, en regiones de América, Asia Sudoriental y Pacífico Occidental se
registraron en conjunto más de 1,2 millones de casos, y en 2010, más de 2,2 millones
(según datos oficiales presentados por los países miembros a la OMS). En fechas recientes
el número de casos notificados ha seguido aumentando. En 2010, se notificaron 1,6
millones de casos tan solo en el continente americano; 49,000 de ellos fueron de dengue
grave (DH/SSD). Los últimos datos revelan que se están presentando de 5,000 a 6,000
muertes anuales de acuerdo con el departamento de control de enfermedades tropicales
desatendidas de la OMS.
Además de que el número de casos aumenta a medida que la enfermedad se
propaga a nuevas zonas, se están produciendo brotes epidémicos de carácter explosivo
(OMS, 2012).
A finales del 2012, Europa sufrió su primer brote sostenido desde la década de los
20, con 2,000 personas infectadas en la isla atlántica de Madeira (Nebehay, 2013).
En los recientes comunicados emitidos por la Organización Mundial de la Salud se
establece que "en el 2012, el dengue se clasificó como la enfermedad vírica de mayor
propagación, con una posible epidemia en el mundo, registrando un aumento de 30 veces
en su incidencia durante los últimos 50 años" (Nebehay, 2013).
I.1.1.4 Medidas de control del dengue
Ante el aumento en los casos de dengue y la expansión hacia nuevos territorios por
parte del mosquito Aedes aegypti las medidas de control que se han seguido desde años
atrás parecen no ser suficientes ante el riesgo de una posible epidemia hoy en día. La
mayoría de las soluciones propuestas para esta problemática se enfocan en dos aspectos:
el manejo de la enfermedad y el control del vector transmisor.
I.1.1.4.1 Manejo de la enfermedad. Elaboración de una vacuna
El manejo de la enfermedad busca su éxito en la elaboración de una vacuna.
Mundialmente las inversiones en investigaciones para el desarrollo de una posible vacuna
para evitar el dengue son cuantiosas. La búsqueda de estas vacunas no es reciente ni
9
mucho menos fácil, desde finales de la Segunda Guerra Mundial científicos investigaban
en este tema, pero desconocían ciertos factores relacionados con la forma en que el
patógeno se desarrolla (Zuñiga & Peraza, 2009). Uno de los problemas que se debe
solucionar es que, a diferencia de muchas enfermedades, donde una vez que se padecía la
primera vez, se logra inmunidad, en el caso del dengue, la segunda vez, se da con mayor
fuerza y peligrosidad, como es el caso del dengue hemorrágico (OMS, 2004). Con lo que
una vacuna contra esta enfermedad tendría que ser tetravalente para poder combatir los
cuatros serotipos del virus existentes.
La vacuna más avanzada contra el dengue cuenta con una eficacia de tan sólo el 30
por ciento, según demostraron ensayos realizados en el año 2012 (Nebehay, 2013).
I.1.1.4.2 Métodos de control del vector
La principal estrategia de los programas de prevención y control del dengue se
basa en el control del vector transmisor mediante la eliminación de los criaderos de Aedes
aegypti que contienen las larvas, debido a que es el método más eficaz para disminuir las
poblaciones del mosquito ante los brotes de la enfermedad.
Dentro de los métodos de control del vector se encuentran las campañas de
educación preventiva emprendidas principalmente por personal del sector salud, el
empleo de enemigos naturales de Ae. aegypti, el control químico basado en el uso de
insecticidas químicos y el control biológico apoyándose en los denominados
bioinsecticidas.
I.1.1.4.2.1 Campañas de educación preventiva
Frente al agravamiento de la situación epidemiológica internacional del dengue,
previsto para las próximas décadas, los países y las organizaciones internacionales
implementan diferentes iniciativas, adaptadas a la situación local concreta, con el objetivo
de prevenir y controlar las epidemias de la enfermedad (Roses & Guzmán, 2007). Dichas
iniciativas buscan ser efectivas en base a campañas que buscan concientizar a la población
sobre los riesgos de contraer la enfermedad.
La OMS en el año de 1995 propuso una estrategia para frenar la transmisión del
dengue (Marten, 1986), basada en la centralización y la coordinación de los esfuerzos
nacionales, la estrategia se vio reforzada para el año 2002 con la aprobación de una
resolución sobre la prevención y control del dengue y del dengue hemorrágico, aprobada
10
en la 55ª Asamblea Mundial de Salud (Marten, 1986). Los elementos de los cuales consta
esta estrategia puede resumirse como:
a) La participación de la comunidad contando con el respaldo intersectorial para
lograr el control selectivo e integrado del vector.
b) Con los diagnósticos de laboratorio y la vigilancia entomológica alcanzar la
vigilancia activa de la enfermedad.
c) La preparación de las condiciones para el enfrentamiento de las situaciones de
emergencia.
d) El desarrollo de capacidades y el adiestramiento de los recursos humanos.
e) La investigación sobre métodos efectivos y eficaces de control del vector (Roses &
Guzmán, 2007).
Otra de las entidades que juega un papel fundamental en estas estrategias es la
Organización Panamericana de la Salud que para enfrentar esta grave situación ha
desarrollado la Estrategia de Gestión Integrada para la Prevención y el Control del Dengue
en el continente americano en el 2007 (San Martín & Brathwaite, 2007). Con la
generalización de la estrategia se espera que permita controlar la transmisión y reducir la
incidencia de la enfermedad mediante un enfoque integrado e intersectorial.
I.1.1.4.2.2 Uso de enemigos naturales de Aedes aegypti
Estrategias que no son de uso frecuente contemplan la utilización de enemigos
naturales en contra de Ae. aegypti. Los procedimientos consisten en introducir en el seno
de las poblaciones del mosquito, factores naturales de regulación como predadores,
parásitos o microorganismos patógenos. Las investigaciones en esta área no son nuevas,
pero exigen un buen conocimiento de la ecología del insecto por controlar y del
ecosistema circundante (Zuñiga & Peraza, 2009).
En países de América y Asia (Mazine, et al., 1991) se han utilizado pequeños peces,
tortugas, microsporidios (Marten, 1986) y copépodos como Mesocyclops longisetus
(Sweeney & Becnel, 1991; Marten, 1986), obteniéndose resultados satisfactorios.
En los estudios realizados por Schaper y colaboradores (1998) se demuestra que
puede emplearse satisfactoriamente al copépodo Mesocyclops thermocyclopoides como
control biológico de Aedes aegypti.
11
I.1.1.4.2.3 Control químico
El método de control más común y tradicional de Aedes aegypti es mediante el
empleo de insecticidas químicos. Esta práctica resulta controversial debido a que los
insecticidas no atacan solamente al insecto blanco, sino que se ven afectados otros seres
vivos.
Los costos del uso de insecticidas para combatir al Ae. aegypti van más allá de los
que representan por sí solos los asociados a su producción (incluidos costos por
investigación), ya que se ve directamente afectada la economía de los países debido a la
prevalencia del dengue en las regiones tropicales y subtropicales de todo el mundo,
mismas que en su mayoría representan atracciones turísticas importantes y que son
perturbadas por los efectos residuales de los químicos.
En la sección I.3 se presenta un análisis de los insecticidas químicos que se
emplean para el control de vectores como el Aedes aegypti, así como el problema de la
resistencia por parte de los insectos a estos compuestos que tan preocupado tiene a la
comunidad investigadora y a los gobiernos en general.
I.1.1.4.2.4 Control biológico
El desarrollo de herramientas biológicas alternas frente a los insecticidas químicos
para controlar las poblaciones de Ae. aegypti, es toda un área de investigación en el
mundo, donde existe una demanda creciente de compuestos cada vez más seguros
(Zuñiga & Peraza, 2009).
La principal vía de control biológico del vector del dengue se centra en el empleo
de insecticidas de origen natural o bioinsecticidas. Con este método no se busca erradicar
por completo al mosquito vector, sino reducir al máximo sus poblaciones ante los brotes
de la enfermedad y de esta manera evitar su propagación.
I.1.1.4.2.4.1 Bioinsecticidas
Los bioinsecticidas (término que incluye organismos microbianos, nematodos,
metabolitos secundarios de plantas y microorganismos, feromonas de insectos, genes y
parásitos), han recibido mucha atención por ser amigables con el medio ambiente y ser
potencialmente usados como agentes de control para una amplia variedad de insectos,
como los piretroides, anteriormente obtenidos de las flores de piretro Chrysanthemum
12
cinerariaefolium (Asteraceae). En la Tabla I.2 se presenta la fuente de algunos
bioinsecticidas conocidos, su origen, el efecto que producen y el mecanismo por el cual
operan sobre los organismos que actúan.
Tabla I.2. Fuentes de bioinsecticidas, mecanismo de acción, efectos y organismos sobre los que actúan.
Origen del bioinsecticida
Agente insecticida
Mecanismo de acción
Efecto Organismo blanco
Bacterias Cristal proteico en las esporas bacterianas
Se depositan en el intestino del
insecto alterando su permeabilidad
Parálisis del intestino y muerte del insecto
Mosquitos (paludismo)
Virus Viriones Por replicación
viral
Estallamiento corporal del insecto
Lepidópteros
Hongos Esporas del
hongo
Penetran en la piel del insecto y la degradan.
Producen toxinas y finalmente lo matan por
invasión total
Muerte del insecto por invasión
Insectos, ácaros
Nemátodos Bacteria parásita del nematodo
Mutualismo obligatorio entre la bacteria y el nematodo. El huésped muere por septicemia
Muerte Insectos: larvas, pupas, adultos
Feromonas sexuales
Feromonas
Se aumenta la concentración de feromonas en el
campo de cultivo,
impidiendo que los machos localicen a la hembra
Poca reproducción de los insectos
Insectos machos
Insecticidas botánicos
Sustancias químicas de
diversas plantas
Alteraciones fisiológicas
Afectan diversas funciones de los insectos. Ej., bloquean
hormonas e impiden la
metamorfosis
Insectos
Fuente: (Cantú, et al., 2012)
13
Una de las ventajas en el uso de los bioinsecticidas, a diferencia de los insecticidas
químicos, es que al degradarse no generan residuos tóxicos.
El potencial de los productos naturales para ser empleados en el control de Aedes
aegypti será tema de revisión en la sección I.2, siendo este tipo de control nuestra
contribución con este trabajo.
I.2 Productos naturales
En nuestro país la herbolaria ha sido y sigue siendo un recurso para buscar la cura a
las enfermedades más comunes. México ha sido geográficamente privilegiado, ya que
posee una de las floras más ricas en el mundo. Y su herbolaria se ha enriquecido por la
observación y paciencia de los pueblos que durante siglos han buscado en ella la curación
a muchas enfermedades.
En 1552 se elaboró en el colegio de la Santa Cruz en Tlatelolco de la ciudad de
México un manuscrito que lleva por título Libellus de medicinalibus indorum herbis (librito
de las yerbas medicinales de los indios), cuatro siglos después sería conocido como Códice
Badiano. Este libro está integrado con una descripción del uso medicinal de más de 150
plantas originarias de nuestro país que eran empleadas en la medicina prehispánica. La
obra es considerada el primer libro de herbolaria medicinal azteca y una de las más
importantes fuentes bibliográficas históricas en materia de medicina en México.
La co‐evolución de las plantas con los insectos a lo largo de los años ha provisto de
una alternativa al uso de defensas químicas naturales para el manejo de insectos. Dado
que, un insecticida a base de plantas es menos probable que cause daños ecológicos
(principalmente por el reducido tiempo de persistencia en el ambiente), un gran número
de plantas han sido aprovechadas por sus propiedades insecticidas contra diversas plagas
de insectos (Ryan & Byme, 1988).
I.2.1 Metabolitos secundarios
Compuestos aleloquímicos (Whittaker & Feeny, 1971) es un término propuesto
para referirse a las sustancias no nutricionales producidas por individuos de una especie y
que afecta al comportamiento, el desarrollo o la biología de individuos de otras especies.
En las plantas suele emplearse el término metabolitos secundarios para este tipo de
compuestos, ya que no están implicados directamente en los procesos metabólicos
primarios o de crecimiento y desarrollo de la planta, tienen una función ecológica
14
importante como defensas químicas contra microorganismos, insectos, otros herbívoros e
incluso contra otras plantas (Balandrin & Klocke, 1985; Feeny, 1992; Berenbaum &
Rosenthal, 1992). La importancia de los metabolitos secundarios en las interacciones
planta‐insecto es bien conocida, pueden actuar de forma constitutiva o inducible como
atrayentes, repelentes, estimulantes o inhibidores de la alimentación o de la ovoposición,
como sustancias tóxicas y como reguladores del desarrollo (Jacobson, 1989; Ascher,
1993).
Entre las sustancias vegetales más prometedoras para el control de plagas, los
extractos y fracciones constituidas por mezclas ofrecen buenas perspectivas, ya que su
efecto combinado es más estable que el efecto de los compuestos simples (Jeremy, 1990).
En función de la ruta metabólica que los sintetiza, los metabolitos secundarios de
plantas se pueden dividir en cinco grandes grupos (Nakataki, et al., 2000):
a) Terpenoides: son conocidos alrededor de 25 mil, todos ellos poseen un precursor
de cinco carbonos que es el isopreno. Este grupo presenta una mayor diversidad
estructural, e incluye aceites esenciales, resinas, fitoesteroides, piretrinas de
origen natural y saponinas.
b) Alcaloides: se han descrito cerca de 12 mil. Todos poseen al menos un átomo de
nitrógeno en su estructura. Son sintetizados a partir de aminoácidos
principalmente.
c) Fenoles: son conocidos alrededor de 800 compuestos fenólicos y todos ellos
provienen de la ruta del ácido siquímico. Algunos de los más conocidos son las
quinonas, cumarinas, ligninas y taninos.
d) Policetometilenos: se conocen cerca de 600 compuestos de este tipo, que
provienen de la ruta biosintética del acetato, vía malonil‐coenzima A.
e) Metabolitos de biogénesis mixta: provienen del acoplamiento de dos o más partes
estructurales biosintetizadas por las rutas metabólicas indicadas anteriormente.
Algunos de los más conocidos con acción insecticida son los flavonoides, y algunos
alcaloides como la ergotamina (Nakanishi, et al., 1974).
1.2.1.1 Modo de acción de los metabolitos secundarios de plantas contra insectos
Las plantas han desarrollado una variedad de mecanismos de defensa para reducir
el ataque de insectos, mientras que estos últimos han desarrollado estrategias para
superar estas defensas de las plantas. La mezcla de metabolitos secundarios puede ser
disuasiva para ciertos o algunos insectos.
15
La Tabla siguiente presenta el modo de acción de los metabolitos secundarios
sobre los insectos.
Tabla I.3 Modo de acción de metabolitos secundarios sobre insectos Metabolito secundario Modo de acción Referencias
Alcaloides Interferencia con la replicación del ADN. Interferencia con el transporte en membranas. Inhibición de enzimas. Agonista de la acetilcolina.
(Wink, 2003) (Wink, et al., 1998) (Fellows, et al., 1986) (Sultana, et al., 2002)
Flavonoides Inhibición de la NADH deshidrogenasa en el transporte respiratorio de e‐
(Miyoshi, 1998)
Terpenoides Repelentes y disuasorios. Interfieren en la producción de hormona de la muda y de la hormona juvenil. Inhibidores de la síntesis de la quitina. Inhibidores de enzimas digestivas.
(Ave, et al., 1987) (Mordue, et al., 1993) (Blackwell, 1996) (Koul, et al., 1996)
Glicósidos cianogénicos Repelentes y disuasorios. (Erickson & Feeny, 1974)
Cumarinas Reaccionan de forma irreversible con el ADN.
(Berenbaum , 1991)
Taninos y Ligninas Reductores de la digestibilidad. (Rhoades, 1979)
Quinonas Reductor de la digestibilidad. (Felton, et al., 1992)
Piretrinas Actúan sobre los canales de sodio de las neuronas interfiriendo con la transmisión del impulso nervioso.
(Bloomquist, 1996)
Saponinas Repelentes y disuasorios. Alteran la estructura de membranas.
(Soulé, et al., 2000) (Pelah, et al., 2002)
Las funciones y la claridad sobre la especifidad de los metabolitos secundarios
responsables de la actividad insecticida aún están incompletas. La opinión hoy en día del
16
modo de acción no es del todo comprendida, lo más probable es que el mecanismo se
comporte como una red, es decir, que se esté presentando una interacción dinámica y
flexible entre los componentes.
Los metabolitos secundarios pueden servir como compuestos modelo para el
desarrollo de derivados de síntesis química con actividad mejorada y teniendo un respeto
por el medio ambiente (Chitwood, 2002; Park, et al., 2005).
I.2.2 Extracción de productos naturales
Los extractos de plantas medicinales utilizados por el hombre desde la antigüedad
se han obtenido mediante la separación de porciones biológicamente activas presentes en
los tejidos de las plantas, con el uso de un disolvente y un proceso de extracción
adecuado.
Uno de los aspectos más importantes en la obtención de extractos orgánicos es
garantizar altos rendimientos del material vegetal y elevado contenido de principios
activos, lo que depende entre otros aspectos de:
La elección adecuada del material vegetal.
Factores precosecha: disponibilidad de la especie, factibilidad del cultivo, lugar y
época de cultivo e identificación botánica.
Factores postcosecha: selección, secado, molinado y almacenaje.
Del manejo postcosecha dependerá en gran medida, que el material orgánico
mantenga y conserve las características físicas, químicas, organolépticas y farmacológicas.
Rivero y colaboradores (2002) evaluaron la influencia de la preparación de la
materia prima vegetal en el rendimiento del proceso de extracción, concluyendo que el
molinado del material después del secado permitió obtener un tamaño de partículas más
pequeño y homogéneo, lo que favoreció la unión de las células con el disolvente al existir
mayor superficie de contacto entre éste y el material vegetal.
La elección del método de extracción puede tener un efecto sobre los
constituyentes de las plantas. Otro factor importante es el tipo de disolvente a utilizar,
desde disolventes no polares (que van a extraer moléculas no polares de la semilla) hasta
disolventes polares (extraen moléculas polares).
17
I.2.2.1 Métodos de extracción
La extracción sólido‐líquido es una operación que está prácticamente en todos los
procesos tecnológicos relacionados con la industria química y médico‐farmacéutica;
dentro de ésta, los métodos de extracción por maceración y la percolación o lixiviación
son los más utilizados.
I.2.2.1.1 Maceración
El material crudo previamente triturado se pone en contacto con cantidad
suficiente de disolvente, en un recipiente cerrado a temperatura ambiente durante 2‐14
días hasta el agotamiento del compuesto activo. Puede utilizarse agitación. Posterior a
este tiempo la mezcla se filtra, el material insoluble es lavado con el mismo disolvente y
los filtrados se concentran para concentrar el extracto habitualmente empleando un
equipo a presión reducida y presión controlada, lo que evita manejar temperaturas
cercanas al punto de ebullición de los compuestos activos y con ello evitar que se
degraden.
El propósito de la maceración es, tanto como sea posible, extraer los componentes
potencialmente activos. Esto se logra mediante el uso de disolventes de diferente
polaridad (Abdel‐Shaalan, et al., 2005).
I.2.2.1.2 Percolación o lixiviación
El material crudo previamente triturado se pone en contacto con cantidad
suficiente de disolvente de forma tal que el disolvente cubra la capa de sólido en el
tanque percolador. El disolvente se renueva de modo continuo manteniéndose un
gradiente de concentración, el disolvente puro desplaza al que contiene la sustancia
extraída sin ser necesario aplicar presión. el material residual es prensado y el fluido
obtenido es combinado con el percolado para concentrar e extracto.
I.2.2.1.3 Destilación al vapor
Es el más frecuente. Se coloca el material vegetal sobre una rejilla por la que se
hace pasar vapor de agua a 110°C. Así, las plantas liberan una esencia en forma de vapor
que pasa por un serpentín de refrigeración y se transforma en estado líquido; la esencia
del vapor (aceite esencial) suele ser más ligera que el agua, flotando y separándose
18
fácilmente. También suele emplearse el sistema de hidrofusión, que consiste en aplicar
presión con un aspirador durante la destilación del vapor, con esto se consigue aligerar el
proceso.
I.2.3 Control de Aedes aegypti con productos naturales
Como se ha mencionado, una de los vectores más resistentes a insecticidas
químicos es el mosquito Aedes aegypti, por lo que las investigaciones para el control de
las poblaciones del vector se centran en el empleo de productos naturales. Este tipo de
compuestos en base a sus metabolitos secundarios están siendo cada vez más estudiados,
los resultados obtenidos hasta el momento alientan a continuar con ésta búsqueda de
nuevos compuestos para el control de Ae. aegypti. Algunos ejemplos se dan a
continuación.
En un estudio realizado (Garcez, et al., 2009) con un total de 32 extractos de 30
diferentes plantas nativas de la región centro – oeste de Brasil contra larvas de Aedes
aegypti, obtuvieron que de entre los extractos evaluados el obtenido de la corteza del
tronco de Ocotea velloziana era el más activo. Se logró aislar el alcaloide aporfinoide
dicentrine. Este reporte representa la primera evidencia de actividad larvicida contra Ae.
aegypti de este alcaloide.
Rodrigues y colaboradores (2005) realizaron un estudio de actividad larvicida
contra Aedes aegypti empleando extractos hexánicos de Cybistax antisyphilitica. El
fraccionamiento del extracto orgánico llevó a la identificación de la quinona identificada
como 2‐hidroxi‐3‐(3‐metil‐2‐butenilo)‐1,4‐naftoquinona. El compuesto fue altamente
potente contra las larvas de Ae. aegypti (CL50 de 26.3 μg/ml).
Young‐Cheol Yang y colaboradores (2004) evaluaron la toxicidad los extractos de
metanol de 28 especies de plantas medicinales contra larvas de Aedes aegypti. A una
concentración de 100 ppm, se presentó una mortalidad mayor al 90% con los extractos de
Cinnamomum cassia, Illicium verum, Piper nigrum, Zanthoxylum piperitum y Kaempferia
galanga.
Rajasekaran y Duraikannan (2012) en sus estudios de actividad larvicida de
extractos de plantas contra Aedes aegypti encontraron que los extractos de Lantana
camara, Tridax procumbens y Datura stramonium mostraron 100% de mortalidad después
de 48 h de exposición a las larvas. Tridax procumbens presentó la menor CL50 (219 μg/ml),
seguida por Lantana camara y Datura stramonium (251 y 288 μg/ml) respectivamente.
19
En el estudio realizado por parte de Chakraborty y colaboradores (2010)
observaron el efecto del ácido láctico y del ácido ortofosfórico sobre larvas de Aedes
aegypti. Los resultados indican que los ácidos pueden utilizarse en combinación (1:1) para
reducir las poblaciones de Ae. aegypti.
Extractos de Dalbergia oliveri fueron evaluados como agentes larvicidas contra
Aedes aegypti (Pluempanupat, et al., 2013). Los más altos efectos larvicidas fueron
obtenidos con los extractos de diclorometano y hexano (CL50 de 289.1 y 325.3 ppm,
respectivamente) a 24 horas de post‐tratamiento. Tres compuestos fueron identificados
como larvicidas activos de Ae. aegypti: medicarpin, formononetina y violanona.
Los estudios con extractos de Andrographis echioides y Cadaba trifoliata sobre
larvas de Aedes aegypti (Rajkumar, et al., 2012) muestran que el efecto larvicida sinérgico
es más eficaz (CL50 es 68,3 mg / L) que los efectos por separado de las plantas (CL50 de
108.3 mg/L y 123.4 mg/L para A. echioides y C. trofoliata, respectivamente).
Kumar y colaboradores (2011) probaron el potencial larvicida de aceite esencial
extraido de las hojas de la planta de Menta piperita contra Aedes aegypti. Los bioensayos
mostraron una CL50 y CL90 de 111.9 y 295.18 ppm, respectivamente, después de 24 horas
de exposición. Los resultados sugieren que el aceite esencial de menta demuestra ser
eficaz larvicida contra el vector del dengue.
El ácido oleico y el ácido linoléico aislados de Dirca palustris (Ramsewak, et al.,
2001) y Citrullus colocynthis, respectivamente, han sido reportados por su actividad
larvicida contra Aedes aegypti. Los bioensayos realizados contra larvas de Aedes aegypti
mostraron una CL50 de 100 ppm para ambos compuestos.
El grupo de los flavonoides también ha sido evaluado contra larvas de Aedes
aegypti. El compuesto 2’‐6‐dihidroxi‐4’‐metoxichalcona obtenido de Polygonium
senegalensis (Polygonaceae) fue tóxico para larvas de segundo instar de Aedes aegypti
con CL50 de 16.15 μg/ml después de 48 h de exposición (Midiwo, et al., 2005).
Naringenina es una conocida flavonona que exhibió toxicidad contra larvas de
tercer estadio tardío de Aedes aegypti con LC50 de 3.7 μg/ml y CL90 de 15.1 μg/ml (Ho et
al., 2003).
En la tabla siguiente se presenta una revisión de las plantas que han sido
estudiadas por su actividad larvicida contra Aedes aegypti, en algunos casos, se presentan
algunos compuestos que se han identificado de la planta en cuestión.
20
Tabla I.4. Plantas evaluadas contra Aedes eegypti.
Planta Insecto Dosis Mortalidad/dosis letal/tiempo letal
Actividad probada
Componentes principales
Referencia
A. grandifolia
Aedes aegypti
CL50 2.6 mg/L Larvicida (Ciccia, et al.,
2000)
A. calamus Aedes aegypti
CL50 3.6 mg/L Larvicida (Ranaweera,
1996)
A. calamus Aedes aegypti
CL50 52 mg/L Larvicida (Sharma, et al.,
1994)
A. glauca Aedes aegypti
CL 52‐74 mg/L Larvicida (Sharma, et al.,
1994)
A. glutinosa Aedes aegypti
CL 200‐400 mg/L Larvicida (Rey, et al.,
2001)
A. glutinosa Aedes aegypti
CL50 382 mg/L Larvicida (David, et al.,
2000)
A. indica Aedes aegypti
CL50 4800 mg/L Larvicida (Monzon, et al.,
1994)
A. indica Aedes aegypti
CL50 100 mg/L Larvicida (Sinniah, et al.,
1994)
A. sisalana Aedes aegypti
CL50 322 mg/L Larvicida (Pizarro, et al.,
1999)
A. squamosa Aedes aegypti
CL50 2400 mg/L Larvicida (Monzon, et al.,
1994)
C. dentata Aedes aegypti
CL50, CL90
140.2 mg/L, 341.6 mg/L a 24 h
Larvicida
Sabineno, borneol, β‐bisabolol, δ‐
cadinol
(Rajkumar & Jebanesan, 2010)
C. glaucophylla
Aedes aegypti
CL50 0.69 mg/L Larvicida (Shaalan, et al.,
2003)
C. inophyllum
Aedes aegypti
CL50 16 mg/L Larvicida (Pushpalatha & Muthukrishnan,
1999)
C. inophyllum
Aedes aegypti
CL50 7.1 mg/L Larvicida (Pushpalatha & Muthukrishnan,
1999)
C. japonica Aedes aegypti
CL50, CL90
28.4 a 56.7 mg/ml, 111.8 a 153.9 mg/ml a 24
h
Larvicida
16‐kaureno, elemol,
sabineno, γ‐eudesmol
(Cheng, et al., 2009)
C. nardus Aedes aegypti
CL50 6.3 mg/L Larvicida (Ranaweera,
1996)
C. obtusifolia Aedes aegypti
CL50 40 mg/L Larvicida (Jang, et al.,
2002)
21
Tabla I.4. Plantas evaluadas contra Aedes aegypti (continuación).
Planta Insecto Dosis Mortalidad/dosis letal/tiempo letal
Actividad probada
Componentes principales
Referencia
C. sativum Aedes aegypti
CL50 1000 mg/L Larvicida (Jalees, et al., 1993)
C. scalpelliformis Aedes aegypti
CL50 53.7 mg/L Larvicida (Thangam & Kathiresan,
1991)
C. tora Aedes aegypti
CL50 20 mg/L Larvicida (Jang Y. , et al., 2002)
C. variegatum Aedes aegypti
CL50 37.6 mg/L Larvicida (Monzon, et al., 1994)
D. carota Aedes aegypti
CL50 36 mg/L Larvicida (Sharma, et al., 1994)
D. morbifera Aedes aegypti
CL50, CL90
62.32 ppm, 131.21 ppm
Larvicida β‐zingibireno, β‐selineno, γ‐cubebeno
(Chung, et al., 2009)
D. dichotoma Aedes aegypti
CL50 61.7 mg/L Larvicida (Thangam & Kathiresan,
1991)
D. palustris Aedes aegypti
CL50 10 mg/L Larvicida (Ramsewak,et al., 2001)
E. camaldulensis Aedes aegypti
CL50, CL90
31.0 mg/ml, 71.8 mg/ml
Larvicida
α‐pineno, p‐cimeno, α‐
felandreno, 1,8‐cineol, limoneno
(Cheng, et al., 2009)
E. urophylla Aedes aegypti
CL50, CL90
95.5 mg/ml, 166.3 mg/ml
Larvicida
1,8‐cineol, α‐acetato de terpenilo, α‐pineno, cis‐ocimeno, α‐terpineol
(Cheng, et al., 2009)
L. domesticum Aedes aegypti
CL50 5000 mg/L Larvicida (Monzon, et al., 1994)
M. volkensii Aedes aegypti
CL50 50 mg/L Larvicida (Mwangi & Mukiama, 1998)
22
Tabla I.4. Plantas evaluadas contra Aedes aegypti (continuación).
Planta Insecto Dosis Mortalidad/dosis letal/tiempo letal
Actividad probada
Componentes principales
Referencia
P. gaudichaudianum
Aedes aegypti
CL50, CL90
121.0 mg/ml, 169.0 mg/ml a
24 h Larvicida
viridiflorol, aromadendreno, β‐selineno, selin‐11‐en‐4alfa‐ol
(de Morais, et al., 2007)
P. hostmanianum Aedes aegypti
CL50, CL90
54 mg/ml, 72 mg/ml a 24 h
Larvicida
miristicina, dilapiol,
germacreno
(de Morais, et al., 2007)
P. humaytanum Aedes aegypti
CL50, CL90
156 mg/ml, 227 mg/ml a 24 h
Larvicida β‐selineno, espatulenol
(de Morais, et al., 2007)
P. nigrum Aedes aegypti
CL50 0.92 mg/L Larvicida (Park, et al.,
2002)
P. marginado Aedes aegypti
CL10, CL50
14.8 a 19.2 ppm, 19.9 a 23.8 ppm
Larvicida
alcohol de pachulí, (E)‐cariofileno, α‐
copaeno
(Autran, et al., 2009)
R. nasutus Aedes aegypti
CL50 22 mg/L Larvicida
(Pushpalatha &
Muthukrishnan, 1999)
S. lappa Aedes aegypti
CL 52‐74 mg/L Larvicida (Sharma, et al., 1994)
T. minuta Aedes aegypti
CL50 16 mg/L Larvicida (Perich, et al., 1994)
T. patula Aedes aegypti
CL50, CL90
13.57 ppm, 37.91 ppm a 24 h
Larvicida
alcohol de pachuli, β‐pineno, α‐pineno, α‐cadinol, t cadinol‐
(Dharmagadda, et al., 2005)
V. wallichii Aedes aegypti
CL 52‐74 mg/L Larvicida (Sharma, et al., 1994)
V. tetrasperma Aedes aegypti
CL50 100 mg/L Larvicida (Jang, et al.,
2002)
23
I.2.4 Resistencia a insecticidas naturales
Una interrogante que es constante y a la vez una preocupación en cuanto al uso de
insecticidas de origen vegetal es sobre la resistencia que los insectos pudieran generar a
ellos.
Los insecticidas de origen vegetal son generalmente extractos que están
constituidos por grupos de ingredientes activos que tienen diversa naturaleza química y
por ende distinto modo de acción (Völlinger, 1987). Así que, desde el punto de vista de la
resistencia, la baja estabilidad de estos insecticidas vegetales se convierte en un factor
positivo debido a que es mínima la probabilidad de que dos extractos sean iguales, en
razón a que la presión ejercida por el insecticida sobre el mosquito no es siempre la
misma. Esto se debe a que, aunque en el extracto se encuentren los mismos principios
bioactivos, no siempre se encontrará en las mismas proporciones.
Como lo indica Bowers (1976), de manera general, la resistencia por parte de los
insectos tarda más tiempo en desarrollarse cuando se usa una mezcla de ingredientes
activos naturales, que cuando se utiliza cualquiera de sus componentes por separado, lo
que puede explicarse porque es más difícil detoxificar un complejo de sustancias que un
solo compuesto.
I.2.5 Argemone mexicana y Argemone platyceras
En este trabajo se emplearon extractos de las semillas de las plantas Argemone
mexicana y Argemone platyceras, a continuación se describen características de estas
plantas.
Argemone mexicana L. (Papaveraceae) con sinónimos populares: cardo,
cardosanto, cardolechero, cardosanto, cardo reina, carmensanto, chacalota, chicalota,
chicalote blanco, chocolata, espina blanca, fachina; Estado de México: ostrené, ost‐bi‐
yishi‐villi (mazahua); Guerrero; chicale, tlapa; Michoacán: xate (purhépecha); Morelos:
ayohuixtle, chigalotl (náhuatl); Nayarit: chicalote sha, zamuitiza (cora), jo‐he (tepehuán del
Sur); Oaxaca: San Pedro agats; Quintana Roo: h‐man, ixk'anlo (maya); Yucatán: ix'k'ann
lool, jam, x‐carbesanto; San Luís Potosí: tsolich (tenek).
Es una maleza que crece anualmente. Tiene las hojas de color verde azuloso con
líneas azul‐brillante y se ven desgarradas, con el borde dentado, terminando cada diente
en una espina. Las flores son amarillentas, grandes y parecen como si fueran de papel.
Tiene los frutos como unas cápsulas alargadas y espinosas, por la parte superior se abren y
al madurar, se escapan las semillas, las cuales son muy pequeñas, negras y rugosas.
24
La planta es nativa del sur de los Estados Unidos, México, América Central,
Colombia, Guyana, Venezuela, Brasil, Ecuador, Perú, Uruguay y Argentina.
La planta se caracteriza por la presencia de alcaloides iso‐quinolínicos detectados
en todos sus órganos. La protopina y la berberina se encuentran en mayor cantidad en las
ramas, y la sanguinarina en la raíz y en las semillas. Alcaloides menores incluyen la
cheilantiofolina, cheileritrina, coptisima, críptopina, esculerina y estilopina. En las flores se
detectaron los flavonoides 3‐metoxi‐quercetín, isoramnetín y el mono y diglucósido. En la
semilla, el argemexitín, eriodictiol y luteolín; un aceite fijo en el que se encuentran los
ácidos grasos argemónico y mexicánico, y mexicanol. La raíz contiene beta‐sitosterol.
Báez (2010) evaluó extractos de 7 plantas contra larvas de cuarto instar de Aedes
aegypti, entre esas plantas se encontraba Argemone mexicana. Extractos de la planta
fueron tóxicos para las larvas obteniéndose valores de CL50 menores a 100 mg/L. Además
a través de pruebas colorimétricas se encontró la presencia de alcaloides, lo que indica
que estos compuestos pueden ser los responsables de la actividad en contra de las larvas.
El Chicalote o Argemone platyceras, es una especie de arbusto del género
Argemone (Papaveraceae).
Es una planta que alcanza un tamaño de 30 cm a 1 m de altura. Puede ser anual o
durar más de 2 años, tiene látex de color amarillo. Las hojas son de color verde blancuzco,
con hendiduras y terminan en una espina fina. Las flores son desde blancas hasta
ligeramente amarillo pálido y vistosas.
En general, tanto A. mexicana como A. platyceras presentan los mismo
compuestos, únicamente difieren en la proporción de estos.
1.3 Resistencia a insecticidas químicos
1.3.1 Insecticidas químicos
Un insecticida o plaguicida es un producto fitosanitario utilizado para controlar
insectos generalmente por la inhibición de enzimas. El origen etimológico de la palabra
insecticida deriva del latín y significa literalmente “matar insectos”.
El concepto de plaguicida definido por El Código Internacional de Conducta Sobre
la Distribución y Uso de Plaguicidas de la FAO es el siguiente: es la sustancia o mezcla de
ellas, destinada a prevenir, destruir o controlar plagas, incluyendo los vectores de
enfermedad humana o animal; las especies no deseadas de plantas o animales que
25
ocasionan un daño duradero u otras que interfieren con la producción, procesamiento,
almacenamiento, transporte y comercialización de alimentos; los artículos agrícolas de
consumo, la madera y sus productos, el forraje para animales o los productos que pueden
administrárseles para el control de insectos, arácnidos u otras plagas corporales (FAO,
1970).
Durante el siglo XX, se dio el desarrollo exponencial de la industria de la síntesis
química cuando se comienzan a producir y diseñar productos insecticidas de síntesis o
sintéticos. Hacia finales de este siglo y comienzos del siglo XXI, a causa de la toxicidad
inespecífica de los insecticidas sintéticos comienza el desarrollo de productos menos
tóxicos y más específicos.
Para 2001 se estimaba que existían 900 productos insecticidas y 600 ingredientes
insecticidas activos en el mercado. Millones de toneladas de pesticidas son aplicadas
anualmente; sin embargo, se estima que menos del 5% de estos productos alcanzan el
organismo blanco, que el resto es depositado en el suelo así como en la atmósfera y el
agua (Baddi, et al., 2007).
1.3.1.1 Clasificación de los insecticidas
La clasificación de los insecticidas generalmente se concede desde un punto de
vista químico, debido a que esto permite agruparlos con un criterio uniforme y establecer
correlaciones entre su estructura y toxicidad, actividad, mecanismos de degradación, etc.
Acorde a esto, los insecticidas se han clasificado en diversas familias, que van desde los
compuestos organoclorados y organofosforados, hasta los compuestos inorgánicos. Los
grupos que presentan un mayor uso en salud pública son los organoclorados,
organofosforados, carbamatos y piretroides, y desde hace unos pocos años, como lo
establece López (1997), se tiene el interés creciente en alternativas como reguladores de
crecimiento e insecticidas microbianos.
Por su parte, el modo de acción se puede definir como la respuesta bioquímica y
fisiológica de los organismos que está asociada con la acción de los insecticidas (Ponce, et
al., 2004).
La Tabla I.5 presenta la clasificación de los insecticidas, su mecanismo de acción así
como su mecanismo de resistencia.
26
Tabla I.5. Tipos de insecticidas, modo de acción y mecanismo de resistencia
Insecticida Modo de acción Mecanismo de resistencia
Organofosforados
Carbamatos
Inhibición directa del neurotransmisor, Acetilcolinesterasa
Aumentada detoxificación y/o acetilcolinesterasa insensible
Cidlodienos,… ɣ‐HCH
Excesiva liberación de acetilcolinesterasa
Insensitivo GABA receptor de proteína
Piretroides, DDT y análogos
Interrupción de la transmisión axonal por acción del canal de sodio
Insensitivo canal de sodio y/o aumentada detoxificación
Fosfina, cianidas, rotenonas
Inhibición de respiración por acción en componentes
mitocondriales de la cadena respiratoria
Cambios en proteínas respiratorias, detoxificación metabólica, proteínas
reducidas (fosfina)
1.3.2 Resistencia a insecticidas
Cuando en 1939 se descubrió el DDT (Figura I.5) nadie tuvo objeción alguna sobre
su uso al ver los beneficios inmediatos que presentaba (las plagas agrícolas fueron
controladas y enfermedades transmitidas por insectos se encontraban en decremento),
inclusive, se le otorgó a su descubridor, el suizo Paul Müller, el Premio Nobel. No fue sino
algunos años más tarde cuando se encendieron las luces de alarma debido a que algunas
plagas gradualmente comenzaron a presentar signos de resistencia al DDT, muy
probablemente por el uso masivo de este químico y a la naturaleza propia de los insectos.
Figura I.5. DDT
La resistencia es definida como la habilidad para tolerar dosis de tóxicos, las cuales
resultarían letales para la mayoría de los individuos de una población normal de la misma
especie, de acuerdo con la OMS, y se genera por presión de selección del insecticida sobre
genes que se encontraban a bajas frecuencias.
La FAO (1970) establece a la resistencia como una respuesta disminuida de la
población de una especie de animales o plantas a un plaguicida o agente de control como
resultado de su aplicación.
ClCl
Cl
Cl Cl
27
Paroonagian (1994) explican que el desarrollo de la resistencia en una población
dada se debe a que los genes de resistencia se encuentran normalmente en las
poblaciones a una frecuencias muy bajas, una vez empiecen a hacer presiones químicas
con insecticidas, los individuos susceptibles comienzan a desaparecer y predominan los
individuos que portan los genes de resistencia, provocando con ello un aumento de los
individuos resistentes dentro de la población.
1.3.2.1 Indicativo de la resistencia
Cuando los ensayos biológicos con dosis diagnóstica indican algún grado de
resistencia en la población evaluada, se hace necesario establecer la concentración letal
50 del insecticida en la población de campo comparado con la cepa susceptible de
referencia, con el fin de determinar el factor de resistencia, el cual indica cuántas veces
más de concentración de insecticida se requiere para matar el 50% de las larvas de la
población de campo respecto a la requerida para matar al 50% de las larvas de la
población susceptible, siendo este un indicador más real del estado de la resistencia
(Bisset, et al., 2005).
El tiempo de selección que se requiere para el desarrollo de resistencia es variable.
Este puede tomar de 15 a 20 generaciones o más, dependiendo de la naturaleza química
del insecticida y del grado de presión de selección que se aplica. Desde un punto de vista
evolutivo, se trata de un tiempo relativamente corto.
1.3.2.2 Tipos de resistencia
1.3.2.2.1 Resistencia cruzada
1.3.2.2.1.1 Resistencia cruzada positiva
Es el tipo de resistencia que se considera como un fenómeno por el cual una
población de artrópodos, sometida a presión de selección con un plaguicida, adquiere
resistencia a él y a otros insecticidas relacionados toxicológicamente que no han sido
aplicados, pero que son afectados, al menos, por un mecanismo de resistencia común
(Georghiou, 1965).
28
1.3.2.2.1.2 Resistencia cruzada negativa
Esta resistencia se presenta cuando una población que ha adquirido resistencia a
un insecticida, regresa a una susceptibilidad cercana a la original, como consecuencia de la
aplicación de otro insecticida que es toxicológicamente diferente (Lagunes, 1991).
1.3.2.2.2 Resistencia múltiple
Este tipo de resistencia se presenta cuando una población que ha adquirido
resistencia a varios insecticidas, tanto a insecticidas a los que se haya expuesto como a los
que no haya sido expuesta. En este caso, la población posee varios mecanismos de
resistencia de forma simultánea (Georghiou, 1965).
1.3.2.3 Mecanismos de resistencia a insecticidas
La resistencia puede en muchos casos, ser atribuida a un simple gen/proteína, pero
hay ejemplos donde dos o más mecanismos de resistencia operan simultáneamente.
Miller (1988) las clasifica en cuatro categorías:
‐ Resistencia por comportamiento
El insecto no entra en contacto con el depósito del insecticida, debido a la
modificación del comportamiento del insecto, lo cual permite evadir los efectos letales
de los insecticidas.
‐ Resistencia a la penetración
Donde la composición del exoesqueleto llega a ser modificada inhibiendo la
penetración del insecticida. También se le conoce como mecanismo físico y contempla
muchos casos de penetración reducida que causan resistencia en los insectos. La
velocidad de penetración depende de las características moleculares del insecticida y
de las propiedades del tegumento del insecto, las cuales varían considerablemente
entre los estadios de vida y de una especie a otra. Una penetración demorada provee
un mayor tiempo para la detoxificación de una dosis tomada.
‐ Resistencia en el sitio químico de acción
El sitio químico de acción para el insecticida se modifica reduciendo la sensibilidad
a la forma activa del insecticida. Sitio insensible o sitio blanco alterado: la resistencia
29
también es atribuida a un mecanismo en el cual los sitios blanco alteran y esto hace
que disminuyan la sensibilidad al ataque tóxico. Un ejemplo de esto es el de la enzima
AChE y la reducida sensibilidad en el sitio de acción.
‐ Resistencia metabólica
La vía metabólica del insecto llega a ser modificada detoxificándose el insecticida o
negando el metabolismo del compuesto aplicado en su forma tóxica. La forma más
importante de resistencia metabólica incluye la multifunción oxidas, las glutatión s‐
transferasas y las esterasas.
I.3.2.4 Resistencia de Aedes aegypti a insecticidas
Dentro del gran número de especies de mosquitos resistentes a la acción de los
insecticidas químicos se encuentran el Aedes aegypti, Anopheles albimanus y Lutzomyia
peuensis que desempeñan un papel importante en la transmisión de enfermedades
virales, parasitarias y bacterianas, respectivamente.
En el año de (1990), Rawlins y Ragoonansingh detectaron resistencia al
organofosforado temefos en algunas poblaciones caribeñas, así como a los también
organofosforados malation, fention y clorpirifos, aunque se encontró susceptibilidad a
fenitrotión por parte de Aedes aegypti.
De 34 cepas de Ae. aegypti evaluadas por parte de Rawlins y Hing Wan (1995) de
17 países caribeños encontraron que la mayoría mostraron resistencia a fention y temefos
y moderados niveles de resistencia a malation, fenitrotion y clorpirifos.
En la India se demostró que tanto Aedes aegypti como Aedes albopictus mostraron
completa susceptibilidad a los organofosforados más utilizados por el Programa de
Control de enfermedades transmitidas por vectores como fueron el temefos, fentin,
malation y fenitrotion (Sharma, et al., 2004).
En un estudio llevado a cabo en Cuba (Rodríguez, 2008) se evaluó la susceptibilidad
y/o resistencia a insecticidas organofosforados: temefos, malation, fention, pirimifos
metil, fenitrotion y clorpirifos en larvas de Aedes aegypti colectadas de Cuba (cepas:
Santiago de Cuba y Ciudad Habana) y de otros países de Latinoamérica (cepas: Jamaica,
Panamá, Costa Rica, Nicaragua, Perú y Venezuela). La cepa de Nicaragua mostró ser
moderadamente resistente a temefos, caso contrario con todas las demás cepas que
resultaron ser altamente resistentes al insecticida. Todas las cepas resultaron ser
susceptibles a malation. Por su parte la cepa de Ciudad Habana demostró alta resistencia
30
a fention seguida de las cepas Santiago de Cuba y Perú, el resto resultaron ser susceptibles
al compuesto. Para fenitrotion únicamente la cepa de Ciudad Habana mostró resistencia.
Las cepas de Ciudad Habana, Panamá, Costa Rica y Venezuela resultaron ser altamente
resistentes al pirimifos metil, la cepa de Nicaragua mostró susceptibilidad, mientras que el
resto mostró valores de resistencia moderados. Para clorpirifos se detectó alta resistencia
en las cepas de Santiago de Cuba, Jamaica y Costa Rica, moderada resistencia en la cepa
Venezuela, y para las cepas de Ciudad Habana, Panamá, Nicaragua y Perú se observó
susceptibilidad al organofosforado.
El mismo estudio reporta que para los bioensayos de susceptibilidad/resistencia en
mosquitos adultos Aedes aegypti, todas las cepas resultaron ser resistentes al
organoclorado DDT. Para el piretroide lambdacialotrina resultaron ser susceptibles las
cepas de Santiago de Cuba, Panamá, Nicaragua y Venezuela, en verificación las cepas de
Jamaica y Costa Rica, y las cepas de Ciudad Habana y Perú mostraron resistencia. Al
piretoride ciflutrina resultaron susceptibles las cepas de Santiago de Cuba, Costa Rica y
Venezuela, resistentes resultaron ser las cepas de Ciudad Habana y Perú, y en verificación
las cepas de Jamaica, Panamá y Nicaragua. En cuanto al organofosforado clorpirifos
resultaron ser susceptibles las cepas de Santiago de Cuba, Nicaragua y Venezuela, en
tanto que fueron resistentes las cepas de Ciudad Habana, Jamaica y Perú, en verificación
las cepas de Panamá y Costa Rica.
Durante el proceso de selección con temefos se incrementó la resistencia a
piretroides (resistencia cruzada a piretroides). La presión de selección con malation en la
cepa Santiago de Cuba no generó resistencia cruzada a organofosforados. El proceso de
selección con malation en la cepa de Santiago de Cuba generó resistencia cruzada a
piretroides, muy marcada a deltametrina. La selección con deltametrina incrementó la
resistencia a otros insecticidas piretroides.
Chávez y colaboradores (2005) llevaron a cabo un estudio para determinar los
niveles de susceptibilidad a temefos por parte de Aedes aegypti en Perú. Para todas las
cepas que evaluaron de ese país encontraron susceptibilidad al temefos.
El estudio realizado en Cuba por parte de Rodríguez y colaboradores (2004)se
determinaron los niveles de susceptibilidad/resistencia de Aedes aegypti a insecticidas
organofosforados, piretroides y un carbamato. Los resultados de los bioensayos en larvas
mostraron completa susceptibilidad a los insecticidas organofosforados malation,
clorpirifos, pirimifos metil y al carbamato proxour, sin embargo se observó alta resistencia
a temefos y fention, no observándose resistencia a fenitrotion en una de las cepas
evaluadas (Mañana Habana Nueva) pero sí en la otra (Nalón).
31
En Colombia se llevó a cabo un estudio por parte de Santacoloma y colaboradores
(2010) para evaluar el estado de susceptibilidad a insecticidas piretroides deltametrina y
lambdacialotrina y al organoclorado DDT y para identificar los mecanismos bioquímicos
asociados con resistencia en 13 poblaciones naturales de Aedes aegypti recolectadas en
localidades de ese país donde el dengue es un grave problema de salud pública. Todas las
poblaciones del mosquito evaluadas evidenciaron resistencia al organoclorado DDT. En
cuanto a los piretroides, se encontró resistencia generalizada a lambdacialotrina pero no a
deltametrina. Además se descartó la resistencia cruzada de tipo fisiológico entre el DDT y
lambdacialotrina en las poblaciones de Ae. aegyti evaluadas.
32
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS
En el presente capítulo se describen los materiales y métodos de la etapa
experimental que se llevó a cabo para lograr la identificación de algunos de los
metabolitos secundarios presentes en las semillas de Argemone mexicana y Argemone
platyceras que presumiblemente son capaces de combatir a la larva del mosquito Ae.
aegypti.
A continuación se detallan en primera instancia los materiales que se emplearon
en esta sección del trabajo y enseguida la metodología. Cabe aclarar que los métodos y
procedimientos empleados fueron los mismos para las semillas de ambas plantas.
II.1 Materiales
II.1.1 Material vegetal
En este trabajo se emplearon las semillas de las plantas Argemone mexicana y
Argemone platyceras. Las semillas maduras, se obtuvieron a partir de las flores respectivas
de las plantas que fueron colectadas en el estado de Tlaxcala (coordenadas 19°19’46.07’’
N, 98°22’46.07’’ O) y que sólo se encuentran maduras por un periodo corto del año. Las
plantas fueron identificadas en el Herbario Nacional de México (MEXU) del Instituto de
Biología de la U.N.A.M por R. Torres.
Báez (2010) evaluó extractos de la raíz, tallo, hoja, flor y semilla de Argemone
mexicana contra larvas de Aedes aegypti. Los mejores resultados en contra de la larva del
vector del dengue se obtuvieron de los extractos de la semilla de A. mexicana. Estos
resultados motivaron la realización de este trabajo.
II.1.2 Material biológico
Los bioensayos que se efectuaron para valorar la eficiencia de los bioinsecticidas
obtenidos a partir de las semillas de las plantas antes mencionadas, se realizaron
empleando dos tipos de larvas: las primeras, son larvas que han desarrollado resistencia a
los insecticidas a través de varias generaciones y, las segundas, corresponden a larvas que
continúan siendo susceptibles a insecticidas químicos. A continuación se describe estas
larvas:
33
a) Larvas Resistentes: cuarta generación de cepa de laboratorio resistente a
insecticidas del tipo piretroides.
b) Larvas susceptibles: cepa susceptible a insecticidas químicos.
Las larvas (Figura II.1) fueron proporcionadas por el Insectario de Resistencia a
Insecticidas del Centro Regional de Investigación en Salud Pública del Instituto Nacional de
Salud Pública (CRISP/INSP) con sede en Tapachula, Chiapas.
Los bioensayos se realizaron en el Laboratorio de Resistencia a Insecticidas del
CRISP/INSP con apoyo de personal del mismo.
Figura II.1. Larvas de cuarto estadio de Aedes aegypti.
II.1.3 Insecticida comercial
Para los bioensayos se manejó como control positivo el tratamiento con el
insecticida comercial Temefos (90%). Temefos o fosforotionato de o, o, o, o’‐tetrametil‐o,
o’‐tio‐di‐p‐fenileno (Figura II.2), éste químico se encuentra dentro del grupo de
insecticidas organofosforados. El insecticida fue proporcionado por el Laboratorio de
Resistencia a Insecticidas del CRISP/INSP.
34
Figura II.2. Estructura química del Temefos.
II.2 Metodología
La metodología desarrollada en este trabajo se divide en cuatro etapas básicas que
son:
I) Extracción de los componentes de las semillas de las plantas A. mexicana y A.
platyceras, ambas semillas se trabajaron por separado.
II) Fraccionamiento de los extractos orgánicos.
III) Ensayos biodirigidos de los extractos orgánicos y fracciones contra larvas de
Aedes aegypti.
IV) Determinación estructural, por técnica de espectrometría de masas, de
fracciones y/o compuestos puros, de la semilla de las plantas.
La Figura II.3 presenta un esquema con la metodología desarrollada. Los detalles
de cada una de las etapas se detallan a continuación.
S
OP
OCH3
S
OP O
CH3S
O CH3O CH3
35
Figura II.3. Esquema de la metodología desarrollada para la identificación de los
compuestos bioactivos presentes en la semilla de Argemone mexicana y Argemone
platyceras contra Aedes aegypti.
Semilla
Maceración (2)
Hexano AcOEt Acetona MeOH
Concentrado (Rotavapor)
Extracto orgánico de hexano
Extracto orgánico de AcOEt
Extracto orgánico de acetona
Extracto orgánico de MeOH
Purificación con MeOH
Fase metanólica
Cromatografía en columna
Fracciones
Bioensayos
Bioensayos
Concentrado
Grasas
CCF
CCF
CCF
Bioensayos Identificación
(Análisis fitoquímico,
EM)
Placa preparativa
Placa preparativa
Destilación de disolventes
Identificación (Análisis
fitoquímico, EM)
Identificación (Análisis
fitoquímico, EM)
CCF
CCF
36
II.2.1 Obtención de extractos orgánicos
La extracción de los componentes de la semilla de la planta en este trabajo se llevó
a cabo por medio de maceración con distintos disolventes. La principal ventaja de usar la
maceración es que se evita que los compuestos presentes en la semilla se alteren, ya que
los compuestos de productos naturales son considerados termolábiles (se degradan
fácilmente por acción del calor).
En este trabajo se utilizó un disolvente no polar: el hexano, hasta el metanol que es
altamente polar, pasando por disolventes de polaridad intermedia: acetato de etilo y
acetona, todos de manera consecutiva sobre el mismo material vegetal.
Los disolventes mencionados (marca Meyer, grado técnico) pasaron por un
proceso de destilación previa para garantizar su pureza y así ser empleados en la
maceración de la semilla.
El procedimiento que se siguió para obtener los extractos se describe a
continuación:
Se trituraron con ayuda de un mortero 250 g de semilla de Argemone mexicana y
180 g de Argemone platyceras. Cada una de las semillas se trabajó por separado, ya
trituradas se depositaron en un recipiente de vidrio y se cubrieron totalmente con 2 litros
del disolvente de interés, hexano, acetato de etilo, acetona y metanol. La maceración con
cada uno de los disolventes se realizó por un periodo de 72 h, a temperatura ambiente y a
la sombra, agitándose esporádicamente. La Figura II.4 muestra la maceración con hexano.
El extracto obtenido, en cada caso, se filtró y se centrifugó para separar los
residuos de la semilla para posteriormente concentrarlo en un rotavapor (Hahnshin
Scientific Co., modelo HS‐2000NS) a presión y temperatura controladas (presión de 480
mmHg; temperatura para hexano: 59°C, acetato de etilo: 68°C, acetona: 47°C y metanol:
55°C), finalmente se eliminó el disolvente residual por aireación continua (Domínguez,
1985). La semilla, una vez seca a la sombra, se volvía a situar dentro del recipiente de
vidrio y se cubría nuevamente con el siguiente disolvente de interés. La maceración con
cada uno de los disolventes se realizó por duplicado y el segundo producto se unía al
sustraído inicialmente. Una vez obtenidos los extractos se conservaron en refrigeración
hasta su uso para ser fraccionados y en los diferentes bioensayos.
37
a) Maceración de la semilla
b) Extracto crudo de hexano
Figura II.4. Extracción de componentes de la semilla de las plantas
II.2.2 Fraccionamiento de los extractos orgánicos
Los extractos orgánicos contienen una mezcla compleja de ingredientes activos
también conocidos como metabolitos secundarios. El extracto orgánico puede ser
fraccionado sucesivamente para obtener compuestos puros, en el caso ideal, obtener de
manera pura el o los componentes que causen el efecto letal en el material biológico de
interés (Abdel‐Shaalan, et al., 2005).
Los extractos crudos orgánicos en este trabajo se fraccionaron y purificaron
empleando técnicas cromatográficas (cromatografía en capa fina, cromatografía en
columna y cromatografía en placa preparativa) para aislar algunos de los compuestos
bioactivos presentes.
A cada uno de los extractos orgánicos obtenidos se les aplicó un análisis por
cromatografía en capa fina (CCF) para determinar la presencia de compuestos orgánicos
en general, de igual manera se empleó con el fin de determinar las condiciones
experimentales óptimas para cromatografía en columna y obtener las fracciones
cromatográficas de los extractos orgánicos.
38
II.2.2.1 Fraccionamiento y separación del extracto orgánico de hexano
El extracto crudo de hexano fue el elegido para ser purificado, previa prueba de
mortalidad de larvas por este extracto (Báez, 2010). El proceso consistió, primeramente
en “lavar” con metanol al extracto hexánico, la mezcla obtenida se agitó vigorosamente y
se separó con ayuda de un embudo de separación (Figura II.5). La adición de metanol al
extracto permitió separar los metabolitos presentes en el extracto crudo en función de su
capacidad hidrofóbica, de tal manera que los ácidos grasos de cadena muy larga
permanecían en la fase orgánica mientras moléculas más pequeñas de mayor polaridad
eran separadas en la fase alcohólica. El proceso se repitió cinco veces. La fase metanólica
obtenida fue concentrada en el rotavapor y al igual que la fase hexánica (moléculas de
baja polaridad) se les realizó análisis por CCF que permitió corroborar la eficiencia del
“lavado”. Las pruebas biológicas se realizaron principalmente con la fracción metanólica
que se obtuvo y sus subsecuentes fracciones obtenidas por cromatografía en columna que
se describe a continuación.
Figura II.5. Purificación del extracto orgánico de hexano con metanol
39
II.2.3 Técnicas cromatográficas empleadas
II.2.3.1 Cromatografía en placa fina
Para la CCF se utilizaron cromatofolios de aluminio Macherey – Nagel con gel de
sílice 60 F254 espesor de 0.2 mm, empleando como fase móvil diferentes mezclas de
disolventes. La lectura elemental de las placas se hizo utilizando una lámpara de luz UV y
como agente cromogénico revelador el reactivo de sulfato sérico amoniacal – ácido
sulfúrico que se emplea para detectar compuestos orgánicos de manera general. La
solución revelador fue preparada de la siguiente manera:
350 g de hielo se mezclaron con 12 g de sulfato sérico amoniacal (Merck, 98% de
pureza) y se le adicionaron 22.5 ml de ácido sulfúrico (Meyer, 98% de pureza). Se calentó
en baño María hasta ser disuelto completamente el compuesto y finalmente ser filtrado.
Las placas fueron rociadas con la solución y se calentaron a aproximadamente 100°C. La
producción de manchas oscuras es indicativa de la presencia de compuestos orgánicos de
manera general.
II.2.3.2 Cromatografía en columna
Se empleó gel de sílice con tamaño de malla de 230 ‐ 400 para soportar la muestra
y gel de sílice tamaño de malla 200 – 300 (ambas Netland Internacional Corporation)
como fase estacionaria en una columna de 70 cm de altura por 4.5 cm de diámetro (Figura
II.6).
Las fracciones obtenidas fueron almacenadas en viales. El avance de la extracción,
así como el control del contenido de las fracciones obtenidas en la CC se siguió por CCF
para finalmente mantenerlas en refrigeración.
40
Figura II.6. Cromatografía en columna
II.2.3.3 Cromatografía en placa preparativa
En las purificaciones sucesivas fueron empleadas placas preparativas de gel de
sílice de 20 x 20 cm de 2.5 mm de espesor sobre un soporte de vidrio (Figura II.7). En la
superficie del adsorbente (gel de sílice) se aplicó de manera homogénea la muestra con
ayuda de un capilar. Como eluyentes se empleó la mezcla de disolventes (capaz de
resolver la mezcla de metabolitos presentes en el extracto y/o fracción.
Una vez resueltos los principios activos de la muestra se procedió a sustraerlos, por
medio de lavados con el disolvente adecuado. Los productos puros se mantuvieron en
refrigeración hasta su análisis para identificación por cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas (GS‐MS).
41
Figura II.7. Cromatografía en placa preparativa.
II.2.4 Fraccionamiento biodirigido o pruebas biológicas
Para poder conocer la eficiencia de los extractos y fracciones obtenidos de las
semillas de Argemone mexicana y Argemone platyceras se realizaron bioensayos de
toxicidad sobre larvas de Aedes aegypti. Los bioensayos son una herramienta muy
utilizada para poder evaluar en forma efectiva y eficiente los efectos tóxicos de material
vegetal o insecticidas químicos en organismos vivos.
Debido al gran número de extractos y fracciones con las que se contaba para ser
evaluadas en las pruebas biológicas, se realizaron bioensayos preliminares para identificar
los extractos y fracciones de mayor actividad, a estas pruebas las llamamos Bioensayo I.
Una vez identificados los extractos de mayor interés se planearon otra serie de pruebas
para conocer, con precisión, las dosis letales medias para larvas resistentes a insecticidas,
a estas pruebas les dimos el nombre de Bioensayos II. Finalmente, otro grupo de pruebas,
nombrados como Bioensayos III, corresponde a una serie de experimentos realizados con
cepas susceptibles a insecticidas, esto con el fin de comparar, al menos en la planta
Argemone mexicana, la diferencia al tratamiento con cepas de diferente sensibilidad hacía
los insecticidas. Los tres experimentos serán descritos en los párrafos siguientes.
42
II.2.4.1 Bioensayo I. Determinación de extractos/fracciones más eficaces
Para este bioensayo se emplearon tratamientos por triplicado, empleando cada
uno de los extractos y fracciones a una concentración de 500 ppm, cada réplica se llevó a
cabo con 25 larvas de Ae. aegypti en tercer estadio tardío – cuarto estadio temprano,
resistentes a insecticidas del tipo piretroides.
Se utilizó un control positivo con Temefos a una concentración de 0.125 ppm, dosis
diagnóstico del CRISP/INSP para este insecticida. También se empleó un control negativo
compuesto por 1 ml de dimetilsulfóxido y 99 ml de agua. Se evaluaron testigos,
preparados añadiendo 1 ml de cada disolvente empleado en la maceración: hexano,
acetato de etilo, acetona y metanol, a 99 ml de agua.
Los conteos de larvas muertas se llevaron a cabo cada 6 horas durante un periodo
de 48 h.
Los tratamientos que se evaluaron fueron los que se muestran en la siguiente
tabla:
43
Tabla II.1. Tratamientos evaluados en el Bioensayo I
Grupo Tratamiento Concentración Larvas/
Tratamiento
Argemone mexicana
Extracto crudo de AcOEt
500 ppm 75
Extracto crudo de acetona
500 ppm 75
Extracto crudo de MeOH
500 ppm 75
Fracción metanólica
500 ppm 75
Fracción I‐II 500 ppm 75 Fracción I‐III 500 ppm 75 Fracción III 500 ppm 75
Argemone platyceras
Extracto crudo de hexano
500 ppm 75
Extracto crudo de AcOEt
500 ppm 75
Extracto crudo de acetona
500 ppm 75
Extracto crudo de MeOH
500 ppm 75
Fracción metanólica
500 ppm 75
Fracción I‐IV 500 ppm 75 Fracción 0‐III 500 ppm 75
Controles
Positivo (Temefos)
0.125 ppm* 75
Negativo (agua+DMSO)
1% 75
Testigos
Hexano 1% 75 AcOEt 1% 75 Acetona 1% 75 MeOH 1% 75
*Dosis diagnóstico del CRISP/INSP
Los extractos y fracciones que presentaron la mortalidad más alta en un periodo de
tiempo más corto de tiempo fueron seleccionados para realizar un segundo bioensayo
mucho más fino, que nos ayuda a determinar dosis letales medias (DL50) a 24 y 48 h.
44
II.2.4.2 Bioensayo II. Dosis letal media para larvas resistentes a insecticidas
Los bioensayos (Figura II.8) se realizaron siguiendo la metodología de la
Organización Mundial de la Salud (WHO, 1981), a una temperatura de 23°C y una
humedad relativa de 43%. Se emplearon larvas en tercer estadio tardío – cuarto estadio
temprano de Aedes aegypti, como recipientes para las pruebas, se usaron vasos
desechables de plástico. Cada uno de los vasos se acondicionó con 99 ml de agua y 1 ml de
solución stock, que se describe en el párrafo siguiente, para finalmente añadir 25 larvas.
Paralelo a la evaluación de los extractos/fracciones se evaluaron controles positivo
(Temefos, a 0.012 ppm, de acuerdo a lo que marca la OMS) y negativo (99 ml de agua + 1
ml de DMSO), además de testigos con los disolventes empleados en las etapas de la
maceración de la semilla: hexano, acetato de etilo, acetona y metanol.
Para cada concentración de tratamiento de extracto/fracción definida de acuerdo
a la OMS (500, 250, 200, 100, 50 y 10 ppm) se realizaron cuatro réplicas en las mismas
condiciones. El tiempo de observación, para cada seguimiento de mortalidad, se realizó a
las 24 y 48 h. las larvas se consideraron muertas cuando al tocarlas con una pipeta Pasteur
éstas eran incapaces de reaccionar. En total para cada tratamiento de extracto/fracción se
probaron 600 larvas, sólo para este bioensayo se evaluaron 8 tratamientos de ese tipo.
Las soluciones stock se prepararon con la cantidad necesaria de cada uno de los
extractos/fracciones disueltos en DMSO de tal manera que al añadir 1 ml de esta solución
en cada uno de los vasos se obtuviera al final la concentración deseada a evaluar. El DMSO
(Research Organics, 99% de pureza) es un disolvente aprótico, polar, útil en la disolución
de los extractos y que sirve como acarreador de venenos o drogas ya que ayuda a que
éstos penetren fácilmente la epidermis, adicionalmente es inocuo a las larvas.
Las larvas se alimentaron, durante los bioensayos, con alimento para ratones
(marca, nombre) durante los bioensayos que se llevaron a cabo a una temperatura de
23°C y a una humedad de 42%.
Los tratamientos que se evaluaron fueron los siguientes para este bioensayo:
45
Tabla II.2. Tratamientos evaluados en el Bioensayo II
Grupo Tratamiento Concentración Larvas/
Tratamiento
Argemone mexicana
Extracto crudo de AcoEt
10, 50, 100, 200, 250, 500 ppm
600
Fracción metanólica 10, 50, 100, 200, 250, 500 ppm
600
Fracción I‐II 10, 50, 100, 200, 250, 500 ppm
600
Fracción I‐III 10, 50, 100, 200, 250, 500 ppm
600
Argemone platyceras
Extracto crudo de AcOEt
10, 50, 100, 200, 250, 500 ppm
600
Fracción metanólica 10, 50, 100, 200, 250, 500 ppm
600
Fracción I‐IV 10, 50, 100, 200, 250, 500 ppm
600
Fracción 0–III 10, 50, 100, 200, 250, 500 ppm
600
Controles Positivo (Temefos) 0.012 ppm* 100
Negativo (agua+DMSO)
1% 100
Testigos Hexano 1% 100
Acetato de etilo 1% 100 Metanol 1% 100
*Dosis diagnóstico OMS
46
a) Preparación de soluciones stock
b) Población de larvas a evaluar
c) Materiales
d) Preparación de tratamientos
e) Alimentación de larvas
f) Conteo de larvas muertas
Figura II.8. Bioensayos de toxicidad sobre larvas de Aedes aegypti.
47
II.2.4.3 Bioensayo III. Dosis letal media para larvas susceptibles a insecticidas
El tercer bioensayo se realizó empleando extractos crudos y fracciones de la
semilla de Argemone mexicana.
Para este bioensayo se empleó la cepa susceptible a insecticidas. Se realizaron
cuatro réplicas por tratamiento (25 larvas por réplica), siguiendo el mismo procedimiento
descrito en Bioensayo II.
Los tratamientos evaluados fueron los siguientes:
Tabla II.3. Tratamientos evaluados en el Bioensayo III
Grupo Tratamiento Concentración Larvas/
Tratamiento
Argemone mexicana
Extracto crudo de AcOEt
10, 50, 100, 200, 250, 500 ppm
600
Fracción metanólica 10, 50, 100, 200, 250, 500 ppm
600
Fracción I‐II 10, 50, 100, 200, 250, 500 ppm
600
Fracción I‐III 10, 50, 100, 200, 250, 500 ppm
600
Controles Positivo (Temefos) 0.012 ppm* 100 Negativo (agua +
DMSO) 1% 100
Testigos Acetato de etilo 1% 100
Metanol 1% 100 *Dosis diagnóstico OMS
II.2.4.4 Análisis estadístico
Se realizó un análisis estadístico con los resultados de los bioensayos procesados
con el programa SPSS v. 20 para la validación de las pruebas (mediante una comparación
de medias, análisis de varianza, prueba HSD de Tukey (Anexo C)) y determinar la dosis letal
media (DL50) mediante un regresión Probit (Anexo D).
48
II.2.5 Determinación estructural de componentes
II.2.5.1 Análisis fitoquímico preliminar
Este tipo de análisis se emplea para una identificación preliminar de grupos
químicos de manera muy general. Una de las limitaciones que presenta este tipo de
pruebas es el de contar con un buen número de reactivos químicos, para caracterizar de
manera eficaz el grupo funcional que puede estar presente en alguno de los metabolitos
secundarios.
En este trabajo el objetivo de estas pruebas fue la de determinar los metabolitos
secundarios presentes en la especie vegetal de interés. La técnica se basa en reacciones
específicas que pueden ir desde el cambio de coloración, hasta características físicas que
puedan apreciarse en el extracto una vez en contacto con el reactivo apropiado.
En este trabajo se efectuó un análisis fitoquímico preliminar para detectar, de
manera cualitativa, los grupos químicos de metabolitos secundarios presentes tanto en los
extractos como en las fracciones obtenidas, específicamente: alcaloides, flavonoides,
cumarinas, saponinas, fenoles, esteroides fenólicos, aminas aromáticas, aminoácidos y
derivados antrácenicos libres, para ello se siguió la metodología marcada por Domínguez
(1979) y Harborne (1998). En el Anexo E se hace la descripción detallada de la preparación
de cada uno de estos reactivos. En la Tabla II.4 se presentan las soluciones y los reactivos
empleados para la detección de metabolitos secundarios presentes en los extractos y
fracciones, de igual manera se indica la coloración característica que denota la presencia
de los compuestos.
La metodología seguida en esta etapa fue aplicar muestras de los extractos y
fracciones sobre los cromatofolios y como fase móvil se usaron las mezclas de disolventes
utilizadas en la sección II.2.3.3 de este trabajo. Cada una de las placas fue rociada con las
soluciones para determinar la presencia de diferentes grupos de metabolitos secundarios.
49
Tabla II.4. Reacciones de identificación característica de metabolitos secundarios presentes en los extractos y fracciones
Solución Reactivo Grupo químico o
metabolito secundario
Coloración de la reacción
A Agente de Dragendorff – modificación de Munier
Alcaloides Manchas amarillas –
naranjas
B Cloruro férrico – Ferrocianuro de
potasio Fenoles y esteroides
fenólicos Manchas oscuras
(tornarse azul claro)
C Citrobórico Flavonoides Coloración naranja
D Vainillina – ácido sulfúrico Saponinas Azul o azul violeta,
puede dar coloración amarilla
E Reactivo de Borntrager
Derivados antracénicos libres, antroquinonas,
antronas y antranoles
Rojo, amarillo y/o fluorescencia amarilla
en UV 365 nm
F Hidróxido de potasio Cumarinas volátiles Fluorescencia azul
(Domínguez, 1979; Harborne, 1998)
II.2.5.2 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GS‐MS)
Para la determinación estructural de los compuestos presentes en los mejores
extractos/fracciones contra larvas de Ae. aegypti se empleó un cromatógrafo de gases
(Perkin Elmer Auto System XL, Columna HP, 30 m de longitud y 0.32 mm de diámetro)
acoplado a un espectrómetro de masas.
El análisis de los componentes de los extractos y fracciones se realizó por medio de
una comparación con la quimioteca NIST.
50
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
III.1 Introducción
Es importante subrayar que los resultados que se presentan en este capítulo
corresponden a pruebas que se realizaron sobre larvas con dos tipos de resistencia. Los
detalles experimentales de los resultados que aquí se resumen se encuentran descritos en
el capítulo de Metodología (Cap. II).
Se denominaron “Larvas resistentes” a aquellas que en pruebas biológicas de
susceptibilidad‐resistencia presentaron una mortalidad por debajo del 80%. La resistencia
de esta cepa se obtuvo al aplicar insecticidas del tipo piretroides. Cabe aclarar que este
criterio es en apego a lo que dicta la OMS (1992). En el mismo sentido, se denominó
“Larvas susceptibles” a aquellas que en bioensayos de susceptibilidad‐resistencia
presentan una mortalidad entre 98 y 100% debida al insecticida. De la misma forma, el
criterio esta tomado en cuenta de acuerdo a lo establecido por la OMS (1992).
Los dos grupos de larvas fueron estudiados en cuanto a su susceptibilidad con
fitoquímicos de las semillas de dos especies de planta del mismo género: Argemone
mexicana y Argemone Platyceras, de tal manera que para facilitar la lectura de este
capítulo, los resultados se agruparon inicialmente por tipo de larva y enseguida por tipo
de planta.
Dentro del fraccionamiento biodirigido o pruebas biológicas o se catalogó
Bioensayo I al grupo de pruebas que sirvió para seleccionar el conjunto de fitoquímicos
con mayor actividad larvicida (sobre larvas resistentes). En esta prueba se incluyeron
tanto extractos orgánicos como fracciones de ambas especies de las plantas.
Se estableció Bioensayo II el grupo de pruebas biológicas que sirvió para
determinar las DL50 del conjunto de fitoquímicos con mayor actividad larvicida, sobre
larvas resistentes.
Bioensayo III es denominado el grupo de pruebas biológicas que sirvió para
determinar las DL50 del conjunto de fitoquímicos con mayor actividad larvicida, sobre
larvas susceptibles.
51
III.2 Obtención de extractos orgánicos
Derivado de la maceración de las semillas de A. mexicana y A. platyceras se
obtuvieron de cada una de ellas los extractos orgánicos de hexano, acetato de etilo,
acetona y metanol. El rendimiento de cada uno de los extractos obtenidos se muestra en
la Tabla III.1 y se determinó en base al peso seco del material vegetal y el peso del
extracto recuperado.
Tabla III.1 Rendimiento obtenido (%) de los extractos orgánicos de las semillas de las plantas evaluadas
Extractos orgánicos
Planta Hexano Acetato de etilo Acetona Metanol
Argemone mexicana
15.24 5.76 4.12 14.56
Argemone platyceras
16.65 4.98 4.81 15.34
El disolvente con el que se obtuvo la mayor cantidad de extracto a partir de las
semillas se obtuvo de la maceración con hexano (mayor rendimiento) esto permitió una
mejor purificación de sus compuestos químicos (metabolitos secundarios) respecto a los
otros extractos.
El mayor rendimiento obtenido tras la extracción con hexano puede explicarse por
la composición mayoritaria de la semilla a base de ácidos grasos, siendo estos apolares,
cuanto más larga es su cadena hidrocarbonada y menos dobles enlaces contenga, menor
es su solubilidad en agua.
III.3 Fraccionamiento biodirigido o pruebas biológicas
III.3.1 Bioensayo I. Determinación de extractos orgánicos y fracciones eficientes sobre
larvas de Ae. aegypti resistentes
Se evaluó la efectividad de extractos orgánicos y fracciones obtenidas de las
semillas de A. mexicana y A. platyceras sobre larvas de tercer estadio tardío‐cuarto
temprano de Ae. aegypti resistentes. Los resultados de los tratamientos que exhibieron un
mayor porcentaje de larvas muertas a menor tiempo fueron catalogados como más
eficaces, es decir, la efectividad del extracto/fracción evaluados se ve reflejada al combatir
52
el mayor número de larvas en un menor tiempo. A partir de estos resultados se procedió
con el Bioensayo II, que se discute más adelante.
En la Tabla III.2 se detallan los resultados obtenidos del Bioensayo I, la tabla se
divide en dos grupos de acuerdo a la especie de planta estudiada, seguida de una
subdivisión por tipo de tratamiento (extracto/fracción). Las fracciones provienen del
extracto crudo de hexano de cada una de las semillas.
Tabla III.2. Eficiencia de extractos orgánicos y fracciones de las semillas de A. mexicana y A. platyceras sobre larvas de Ae. aegypti resistentes
Grupo Semilla (Planta) Tratamiento Larvas
expuestas%Larvas muertas
Media (h)
1
Argemone mexicana
Extracto de AcOEtA 75 100 15.92 Extracto de acetonaB 75 69.33 34.64 Extracto de MeOHC 75 0 ‐‐‐‐‐
Fracción metanólicaA 75 86.67 23.36 Fracción I‐IIB 75 80 27.68
Fracción I‐IIIC 75 75.32 31.82 Fracción IIID 75 100 6
Extracto de hexanoB 75 100 18.80 Extracto de AcOEtB 75 100 16.48 Extracto de acetonaA 75 4 46.48
2 Argemone platyceras
Extracto de MeOHA 75 5.33 46.56
Fracción metanólicaA 75 100 14.80 Fracción I‐IVB 75 100 8.24 Fracción 0‐IIIB 75 100 7.84
Tratamientos de subgrupos con letras distintas son significativamente diferentes (Tukey, α =0.05)
Como se muestra en la Tabla III.2, de los extractos obtenidos de la semilla de
Argemone mexicana, el extracto más eficiente contra las larvas de Aedes aegypti resultó
ser el extracto de AcOEt ya que en un tiempo promedio de 15.92 h, tuvo un efecto tóxico
sobre el total de la población de larvas expuestas. El extracto orgánico de acetona se
posicionó como el segundo extracto más eficiente ya que fue nocivo para el 69.33% de las
larvas en un tiempo promedio de 34.64 h. Por su parte, el extracto orgánico de MeOH fue
inofensivo contra las larvas del vector del dengue ya que no fue capaz de combatirlas
durante las 48 h de exposición a este extracto. De acuerdo a estos resultados se observa
que a medida que la polaridad del disolvente con que se extrajo el extracto aumenta, la
efectividad sobre las larvas disminuye, es decir, existe una relación inversa entre
efectividad del extracto y polaridad del disolvente extractor, con lo que los mejores
compuestos activos presentan una polaridad de mediana a baja.
53
Dentro de las fracciones provenientes del extracto de hexano de la semilla de A.
mexicana, la Fracción III obtuvo la mayor eficacia contra las larvas al combatir al 100% de
la población expuesta en un tiempo promedio de 6 h, le sigue la Fracción metanólica ya
que resultó ser tóxica para el 86.67% de las larvas en un tiempo promedio de 23.36 h. A
continuación se ubica la Fracción I‐II, debido a que en un tiempo promedio de 27.68 h fue
tóxica para el 80% de las larvas expuestas. Como la fracción con menor efectividad se
ubicó la Fracción I‐III ya que el 75.32% de larvas para el cual resultó ser tóxica lo realizó en
un tiempo promedio de 31.82 h. Si bien el resultado de las Fracciones I‐II y I‐III sugiere que
existe un efecto sinérgico entre sus componentes (es mayor la efectividad de la Fracción
metanólica de donde provienen), también hay presencia de compuestos más puros en la
Fracción III que son capaces de combatir eficazmente a las larvas.
En lo que respecta a los extractos de la semilla de A. platyceras, se observa en la
Tabla III.2 que tanto el extracto de hexano como el de acetato de etilo son tóxicos para el
total de larvas expuestas a cada uno de ellos. El extracto orgánico de AcOEt resultó ser el
más tóxico al combatir a las larvas en un tiempo promedio de 16.48 h. Por su parte, el
extracto orgánico de hexano combate al total de larvas 2.32 h después (18.80 h en
promedio) del tiempo en el que lo logra el crudo de AcOEt. Al igual que en los extractos de
A. mexicana, los compuestos extraídos con menor polaridad son los más tóxicos para las
larvas de Ae. aegytpi.
La eficiencia de las fracciones provenientes del extracto de hexano de la semilla de
Argemone platyceras queda de manifiesto al ser tóxicas para el total de la población de
larvas expuesta a cada una de ellas. La Fracción 0‐III resultó ser más tóxica para las larvas
al combatirlas en un tiempo promedio de 7.84 h. Por su parte, la Fracción I‐IV presentó su
efecto tóxico sobre el total de la población a 8.24 h (en promedio) de exposición.
Finalmente de entre las fracciones se situó la Fracción metanólica por su efecto tóxico en
un tiempo promedio de 14.8 h. Contrario a lo ocurrido en las fracciones del extracto de
hexano de A. mexicana, en las fracciones del extracto de hexano de A. platyceras el efecto
tóxico sobre las larvas lo presentan los compuestos puros por separado que de manera
conjunta, es decir, no hay un efecto sinérgico por parte de los compuestos presentes en el
extracto orgánico de hexano.
Cabe destacar que los análisis estadísticos en este bioensayo se realizaron
independientemente por grupo (cuatro análisis), con la finalidad de mantener
independientes los resultados para cada planta y origen del extracto.
Las diferencias significativas en los resultados para los tratamientos respecto al
tiempo de efectividad sobre las larvas se determinó en base al análisis de varianza
(cuando p menor al valor de significancia de 0.05) y a la prueba de Diferencia Honesta
54
Significativa (DHS) de Tukey, así, la elección del extracto/fracción para ser evaluado en el
siguiente bioensayo recayó en el que ostentó el menor tiempo de efectividad sobre las
larvas de Ae. aegypti, una vez que se determinó si existía diferencia o no respecto a los
demás tratamientos.
De acuerdo a lo anterior, los extractos crudos de la semilla de A. mexicana son
significativamente diferentes, estadísticamente hablando (valor de p), por lo cual el
extracto de AcOEt se seleccionó para ser evaluado en el Bioensayo II.
Las fracciones provenientes del extracto hexánico de la semilla de A. mexicana
presentaron diferencias significativas en sus resultados. Es de notarse el eficiente tiempo
en el que la Fracción III es capaz de combatir a las larvas, desafortunadamente por causas
debidas a la cantidad que existía de la fracción no se pudo evaluar en el siguiente
bioensayo. Se optó por emplear las restantes fracciones para determinar su DL50 y poder
determinar si existía un efecto sinérgico por parte de los compuestos de cada fracción o, si
en su caso el efecto era antagónico.
Respecto a los resultados de los extractos orgánicos de la semilla de A. platyceras,
desde el punto de vista estadístico, presentaron el mismo escaso efecto tóxico sobre las
larvas el extracto de acetona y el extracto de metanol (no son significativamente
diferentes). Igualmente el extracto de hexano y el extracto de AcOEt tuvieron el mismo
efecto tóxico, aunque el segundo se seleccionó para evaluarse en el Bioensayo II al
presentar un menor tiempo promedio en la mortalidad de las larvas.
Los resultados de las fracciones de la semilla de A. platyceras indican que no hay
diferencia entre emplear la Fracción I‐IV o la Fracción 0‐III para determinar su DL50, es
decir, su efecto es similar sobre las larvas (no son significativamente diferentes). Estas dos
fracciones se evaluaron junto con la Fracción metanólica en las siguientes pruebas
biológicas para observar los efectos entre ellas (sinérgico o antagónico).
III.3.1.1 Efecto de controles positivo y negativo y testigos sobre larvas de Ae. aegypti
resistentes
En la Figura III.1 se presentan los porcentajes de larvas muertas de Ae. aegypti a 48
h de exposición a los controles y testigos empleados durante el Bioensayo I y el Bioensayo
II. El control positivo con Temefos evaluado a la dosis de 0.125 ppm (dosis diagnóstico
CRISP/INSP) resultó ser letal para las larvas. Caso contrario a lo sucedido al evaluar este
químico a la dosis diagnóstico de la OMS, en donde no se presentaron efectos tóxicos
sobre las larvas. Este resultado exhibe la resistencia cruzada que se presenta con el
55
insecticida organofosforado Temefos, ya que inicialmente la cepa es resistente a
insecticidas del tipo piretroides. Diversos autores han señalado la resistencia de Aedes
aegypti a distintos insecticidas en el continente americano, el hecho requiere de mejoras
en los programas de vigilancia del vector así como de emplear nuevas moléculas capaces
de combatir al mosquito.
Por su parte, en el control negativo no se presentó mortalidad de las larvas de Ae.
aegypti.
Con excepción del hexano que fue altamente tóxico para las larvas expuestas
(100% de mortalidad), los testigos con los demás disolventes empleados en la maceración
de las semillas de las plantas son inofensivos para las larvas del mosquito vector del
dengue.
Los resultados del control negativo y de los testigos con AcOEt, acetona y MeOH
indican que los efectos tóxicos como resultado de los bioensayos I y II sobre las larvas de
Aedes aegypti son producidos únicamente por el o los compuestos activos contenidos en
los extractos/fracciones evaluados de las semillas de ambas plantas.
Figura III.1. Porcentaje de larvas muertas para controles y testigos. Temefos*: dosis diagnóstico del
CRISP/INSP; Temefos**: dosis diagnóstico de la OMS.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Agua +DMSO
Temefos* Temefos** Hexano AcOEt Acetona MeOH
% Larvas muertas
Controles/Testigos
56
Los resultados de los extractos obtenidos para ambas plantas y de los testigos evaluados
inclusive, del control negativo con agua y dimetilsulfóxido, indican que, para el caso de estas
semillas de ambas plantas, los compuestos activos sobre Ae. aegypti presentan una polaridad de
baja a mediana.
III.3.2 Bioensayo II. Determinación de dosis letal media (DL50) para larvas de Aedes aegypti
resistentes
Se evaluó la toxicidad de extractos orgánicos y fracciones de las semillas de
Argemone mexicana y Argemone platyceras sobre larvas de Aedes aegypti resistente a
insecticidas piretroides. Los datos fueron procesados mediante el análisis Probit para
obtener las dosis letales medias a las 24 y 48 h post‐exposición. Los resultados se
presentan en la Tabla III.3.
Tabla III.3. Valores de dosis letal media (DL50) a 24 y 48 h para extractos orgánicos y fracciones de las semillas de A. mexicana y A. platyceras sobre larvas de Ae. aegypti resistentes
Grupo Semilla (Planta)
Tratamiento DL50 a 24 h
(LC) DL50 a 48 h
(LC)
1 Argemone mexicana
Extracto de AcOEt 159.7
(135.6 – 183.5) 149.9
(127.9 – 172.7)
Fracción metanólica 287.5
(242.9 – 322.3) 286.2
(269.5 – 302.7)
Fracción I‐II 203.9
(190.5 – 216.1) 164.6
(146.7 – 180.8)
Fracción I‐III 238.1
(224.4 ‐253.2) 217.7
(204.9 – 230.2)
2 Argemone platyceras
Extracto de AcOEt 192.9
(70.1 – 282.2) 173.8
(75.1 – 249.4)
Fracción metanólica 144.1
(94.1 – 195.5) 89.8
(69.1 – 110.8)
Fracción 0‐III 241.1
(215.7 – 266.1) 237.1
(209.8 – 260.2)
Fracción I‐IV 194.7
(176.4 – 210.9) 127.9
(108.9 ‐144.3) Valores de DL50 en ppm; Límites de confianza al 95% entre paréntesis; *No se determinó
Como se exhibe en la tabla, de los tratamientos de la semilla de A. mexicana, el
extracto de AcOEt resultó ser el más eficaz por actuar más rápido en contra de las larvas
de Ae. aegypti ya que presentó una dosis letal media a 48 h de 149.9 ppm.
57
Por su parte, las fracciones provenientes del extracto de hexano requieren de una
concentración mayor respecto al extracto de AcOEt para combatir a la mitad de la
población de larvas. La primera purificación del extracto de hexano dio como resultado la
denominada Fracción metanólica que presentó una DL50 a 24 h de 287.5 ppm. La sucesiva
purificación de esta fracción resultó en nuevas fracciones de las cuales la Fracción I‐II y la
Fracción I‐III mostraron DL50 de 203.9 y 238.1 ppm, respectivamente sobre las larvas del
mosquito vector del dengue a 24 h.
De acuerdo con los resultados de las fracciones, a medida que se purificaron los
compuestos presentes en el extracto crudo el efecto tóxico sobre las larvas es mayor, es
decir, la actividad del extracto de hexano no muestra dependencia de efectos sinérgicos
de sus componentes.
Para la semilla de A. platyceras, el mejor resultado de DL50 lo obtuvo la Fracción
metanólica (obtenida a partir del extracto crudo de hexano) al requerir una menor
concentración para poder ser tóxica para el 50% de la población de larvas resistentes tras
48 h de exposición.
El extracto curdo de AcOEt y la Fracción I‐IV necesitan de una concentración similar
para ser activas sobre la mitad de larvas a 24 h post‐exposición, la diferencia entre estos
tratamientos es de tan solo 1.7 ppm. Por último, para los tratamientos de A. platyceras se
ubica la Fracción 0‐III ya que su valor de DL50 a 24 h es de 241.1 ppm.
Los valores de las DL50 de los extractos y fracciones de las semillas de Argemone
mexicana y Argemone platyceras sobre larvas de Aedes aegypti resistentes a insecticidas
piretroides indican diferencias entre la actividad de los compuestos presentes en cada
planta. Abdel‐Salam y colaboradores (2005) establecen que la bioactividad de fitoquímicos
contra larvas de mosquitos puede variar significativamente dependiendo de plantas de la
misma familia, la especie de la planta, parte de la planta, edad de la parte de la planta, el
disolvente utilizado en la extracción y especies de mosquitos.
III.3.3 Bioensayo III. Determinación de la dosis letal media (DL50) para larvas de Ae. aegypti
susceptibles
La toxicidad de extractos crudos y fracciones de la semilla de Argemone mexicana
fue evaluada sobre larvas de Aedes aegypti susceptibles a insecticidas.
La mejor dosis letal media la presentó la Fracción metanólica con un valor a las 24
h de 80.6 ppm, y a las 48 h de 69.2 ppm, siendo este último el mejor valor de DL50 en este
58
trabajo, tal y como puede observarse en la Tabla III.4. En la misma tabla se aprecia una
notoria dependencia de efectos sinérgicos de los componentes de la Fracción metanólica
sobre las larvas de Ae. aegypti susceptibles a insecticidas, ya que las posteriores fracciones
obtenidas por su purificación requieren de una mayor concentración para combatir al
mismo 50% de la población.
Finalmente, dentro de este bioensayo, se ubicó el extracto crudo de acetato de
etilo ya que necesita de una concentración de 285.6 ppm para poder ser letal para el 50%
de la población de larvas a 24 h.
Tabla III.4. Valores de dosis letal media (DL50) a 24 y 48 h para extractos orgánicos y fracciones de la semilla de Argemone mexicana en larvas de Aedes
aegypti susceptibles a insecticidas
Extracto crudo/fracción
DL50 a 24 h (LC) DL50 a 48 h (LC)
AcOEt 285.6 (236.4 – 353.9) 101.1 (90.7 – 111.2) Fracción
metanólica 80.6 (42.6 ‐96.5) 69.2 (52.1 ‐ 81.9)
Fracción I‐II 238.1 (209.3 – 263.3) 163.8 (139.5 – 182.7) Fracción I‐III 187.4 (148.5 – 216.5) 135.8 (120.4 – 150.1)
Valores de DL50 en ppm; Límites de confianza al 95% entre paréntesis
El extracto orgánico de AcOEt ve mejorada su eficiencia sobre las larvas a las 48 h
respecto a la DL50 sobre larvas resistentes a insecticidas. Báez (2010) indica que este
mismo extracto de la semilla de Argemone mexicana no presentó una actividad eficiente
sobre larvas de Ae. aegypti de campo.
El mismo trabajo de Báez establece que los extractos acetónico y metanólico de la
semilla de Argemone mexicana mostraron una actividad de buena a moderada, con dosis
letales de 61.18 y 104.61 ppm a las 48 h post‐exposición, contrastando con los resultados
de este trabajo donde no fueron eficaces estos extractos contra las larvas de Aedes
aegypti. Las diferencias respecto a nuestro trabajo pudieran ser atribuidas al origen de las
cepas usadas, como ya ha quedado demostrado en capítulos previos.
La Fracción metanólica proveniente del extracto crudo de hexano presentó la DL50
más baja (69.223 ppm a 48 h), teniendo un resultado similar al reportado por el mismo
Báez para esta fracción del crudo hexánico a 48 h (67.40 ppm). Las fracciones resultantes
de la posterior purificación de la Fracción metanólica se observa que la combinación de
compuestos presentes en las fracciones tiene un efecto larvicida mayor respecto al efecto
59
de los compuestos presentes en las fracciones individualmente, es decir, los resultados de
las fracciones evidencian que el efecto sinérgico de la Fracción metanólica puede
considerarse como un arsenal más potente para el control larvario de Ae. aegypti que el
uso de sus posteriores fracciones por separado.
Este resultado en particular de las fracciones se ve beneficiado ante el posible
control de Aedes aegypti durante los brotes de dengue debido a que como lo indican
Schmutterer (1988) y Mulla y Su (1999), la ausencia de resistencia a estos productos entre
los mosquitos podría ser debido a que son mezclas de varios compuestos relacionados con
diferentes modos de acción (extracto crudo) y por lo tanto el desarrollo de resistencia a
estos productos es algo difícil, que si se emplean compuestos más puros.
Sakthivadivel y Thilagavathy reportan para la fracción de acetona del extracto de éter de
petróleo de semillas de Argemone mexicana una DL50 a 24 h de 13.58 ppm y de 17.43 ppm
para larvas de Aedes aegypti evaluadas en campo y en el laboratorio, respectivamente.
III.3.3.1 Efecto de controles positivo y negativo y testigos sobre larvas de Ae. aegypti
susceptibles
Los resultados de los controles y testigos empleados en este tercer bioensayo se
muestran en el gráfico de la Figura III.2 donde se exhibe el porcentaje de larvas muertas.
De los disolventes empleados en la maceración únicamente el hexano resultó tener un
efecto tóxico sobre las larvas. La nula mortandad de larvas que se presentó en el control
negativo y en los testigos con acetato de etilo, acetona y metanol indica que los resultados
en la determinación de la DL50 en este bioensayo se debe exclusivamente a la
susceptibilidad de las larvas a los compuestos presentes en el extracto crudo de AcOEt y
en las fracciones del extracto crudo de hexano.
Para el control positivo la mortalidad de larvas fue al 100% para una dosis
diagnóstico de la OMS de 0.012 ppm del organofosforado Temefos.
60
Figura III.2. Porcentaje de larvas muertas para controles y testigos.
III.3.4 Comparación de valores de DL50 de extractos/fracciones de la semilla de A.
mexicana sobre larvas de Ae. aegypti resistentes y susceptibles
Al realizar una comparación entre los valores de DL50 a 48 h para larvas
susceptibles y larvas resistentes con los extractos/fracciones de la semilla de Argemone
mexicana es posible determinar el número de proporción adicional que se tendría que
utilizar de extracto/fracción para compensar la resistencia a piretroides por parte de las
larvas de Aedes aegypti. Así, se necesitarían, respecto a las larvas susceptibles, 4.14 veces
más Fracción metanólica para combatir a las larvas resistentes como se puede apreciar en
la Tabla III.5. Para el caso de la Fracción I‐II es prácticamente equivalente la concentración
necesaria que es letal para el 50% de la población de larvas resistentes y larvas
susceptibles a piretroides.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Agua+DMSO Temefos Hexano AcOEt Acetona Metanol
% Larvas muertas
Controles/Testigos
61
Tabla III.5. Relación de DL50 a 48 h para larvas resistentes y larvas susceptibles
Extracto/fracción Tipo de larvas
DL50 a 48 h (ppm)
Relación (DL50 larv. res./DL50
larv. sus.)
AcOEt Resistentes 149.9 1.4 Susceptibles 101.1
Fracción metanólica
Resistentes 286.2 4.1 Susceptibles 69.2
Fracción I‐II Resistentes 164.6 1.01 Susceptibles 163.8
Fracción I‐III Resistentes 217.7 1.6 Susceptibles 135.8
Un resultado de Relación cercano a 1, como en el caso de la Fracción I‐II, se puede
interpretar además como que la resistencia por parte de los compuestos activos presentes
en el fitoquímico no es probable (al menos de manera inmediata), ya que los valores de la
concentración que se requieren del fitoquímico para ser activos contra la mitad de la
población de larvas son similares para ambos tipos de larvas. Inclusive, basados en que se
presenta resistencia cruzada por parte de las larvas (a piretroides y organofosforados), se
puede deducir que el mecanismo de acción de los compuestos presentes en el fitoquímico
difiere al de ambos grupos de insecticidas probados. Amonkar y Reeves (1970) evaluaron
un extracto de metanol y una fracción de aceite de Allium sativum contra cepas de Ae.
nigromaculis que fueron altamente susceptibles y altamente resistentes a los insecticidas
organofosforados. Los resultados no exhiben resistencia cruzada (entre los
extractos/fracciones y los organofosforados) ya que los valores de dosis letales para los
fitoquímicos son idénticos entre las cepas.
La resistencia cruzada es siempre una preocupación cuando se desarrollan nuevos
insecticidas ya que su modo de acción puede ser similar a los insecticidas bien
establecidos.
III.4 Determinación estructural de compuestos
III.4.1 Análisis fitoquímico preliminar
De manera cualitativa, se lograron identificar grupos de metabolitos secundarios
presentes en los extractos y fracciones de las semillas de Argemone mexicana y Argemone
platyceras, tal como puede apreciarse en la Tabla III.6.
62
La prueba del Agente de Dragendorff – Modificación Munier para determinación
de alcaloides resultó positiva para los extractos/fracciones más activos contra las larvas de
Aedes aegypti, al igual que la prueba con el Reactivo de Hidróxido de potasio para
determinación de cumarinas.
Flavonoides, saponinas y fenoles y esteroides fenólicos determinados mediante el
Reactivo Citrobórico, el Reactivo de Vainillina – Ácido sulfúrico y el Reactivo de Cloruro
férrico – Ferrocianuro de potasio, respectivamente, se encuentran en diferente
proporción para cada una de las semillas.
Tabla III.6. Análisis fitoquímico preliminar de los extractos y fracciones de las semillas de A. mexicana y A. platyceras
Especie Extracto/ fracción
Alcaloides Flavonoides Cumarinas Saponinas Fenoles, esteroides fenólicos
Derivados antracénicos
libres, antroquinonas
Ex. crudo de AcOEt
+ + + ‐ + +
Argemone mexicana
Fracción metanólica
+ + + + + +
Fracción I‐II + + + + + + Fracción I‐III + + + + + +
Ex. crudo de
AcOEt + + + + + NR
Argemone platyceras
Fracción metanólica
+ + + + + NR
Fracción IV + ‐ + ‐ ‐ NR
+ presencia; ‐ no detectado; NR no se realizó la prueba
63
En la siguiente figura se muestran imágenes de las placas finas una vez que fueron
rociadas con los reactivos para las pruebas fitoquímicas preliminares, corresponden a las
pruebas realizadas sobre los extractos/fracciones de A. mexicana.
a) Alcaloides
b) Saponinas
c) Derivados antracénicos
libres
d) Cumarinas
e) Fenoles, esteroides fenólicos
Figura III.3. Placas finas de las pruebas fitoquímicas preliminares para Argemone mexicana.
64
III.4.2 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
III.4.2.1 Compuestos identificados en la semilla de Argemone mexicana
La purificación del extracto orgánico de hexano de la semilla de Argemone
mexicana condujo a diversas fracciones, de las cuales, la Fracción I‐II y la Fracción I‐III
fueron evaluadas en contra de la larva del mosquito vector del dengue. De esta última
Fracción I‐III se lograron identificar el compuesto 8‐meti, decanoato de metilo: EM‐IE m/z
(% a. r.): 200 M+, 87 [C4H7O2]+, 74 [C3H6O2]+ (100). A continuación se presenta el espectro correspondiente a este éster el cuál presentó un tiempo de retención de 21.219 minutos.
De 870 comparaciones que realizó el programa con la base de datos NIST, 841
coincidieron con el 8‐metil, decanoato de metilo.
Revisiones: 870 de 841 P.M.: 200 Formula: C12H24O2 Librería: NIST
Espectro del compuesto:
Comparación 1:
Figura III.4. Espectro de masas del 8‐metil, decanoato de metilo.
65
Otro compuesto identificado de esta fracción es el 4‐metil, 3‐penten‐2‐ona: EM‐IE
m/z (% a.r.): 98 M+, 83 [C5H7O]+, 55 [C4H7]+. El espectro se muestra a continuación, el
compuesto presentó un tiempo de retención de 2.662 minutos. De 868 revisiones que el
programa realizó con la biblioteca NIST, 852 veces coincidió con la estructura del 4‐metil,
3‐penten‐2‐ona.
Revisiones: 868 de 852
P.M.: 98 Formula: C6H10O Librería: NIST
Espectro del compuesto:
Comparación 1:
Figura III.5. Espectro de masas de 4‐metil, 3‐penten‐2‐ona.
66
Así mismo se identificó el compuesto 4‐hidroxi‐4‐metil‐2‐pentanona: EM‐IE m/z (%
a.r.): 116 M+, 101 [C5H9O2]+, 59 [C3H7O]+, 43 [C2H3O]+ (100). El tiempo de retención para
esta cetona fue de 5.858 minutos. De 979 revisiones relizadas con la biblioteca NIST, el
100% de ellas coincidieron con la estructura del compuesto 4‐hidroxi‐4‐metil‐2‐
pentanona. A continuación se presenta su espectro de masas.
Revisiones: 979 de 979 P.M.: 116 Formula: C6H12O2 Librería: NBS
Espectro del compuesto:
Comparación 1:
Figura III.6. Espectro de masa de 4‐hidroxi‐4‐metil‐2‐pentanona.
67
De igual manera en la Fracción I‐III se encontró presencia del ácido pentanoico:
EM‐IE m/z (% a. r.): 102 M+, 87 [C4H7O2]+, 73 [C3H5O2]+, 60 [C2H4O2]+ (100). El tiempo de
retención para este ácido fue de 15.3 minutos. A continuación se presenta su espectro
correspondiente. De las 927 revisiones que el programa hizo con la biblioteca Nist, el
100% de estas coincidieron con la estructura del ácido pentanoico.
Revisiones: 927 de 927
P.M.: 102 Formula: C5H10O2 Librería: NIST
Espectro del compuesto:
Comparación 1:
Figura III.7. Espectro de masas del ácido pentanoico.
68
El último compuesto identificado de la Fracción I‐III del extracto de hexano de la
semilla de A. mexicana fue el anhídrido acético fórmico: EM‐IE m/z (% a.r.): 88 M+, 60
[C2H4O2]+ (100), 43 [C2H3O]+ (100), 28 [CO]+. El compuesto presentó un tiempo de
retención de 7.569 minutos. El 100% de revisiones con la biblioteca NIST coincidieron con
la estructura del anhídrido. El espectro de masas del compuesto se muestra enseguida.
Revisiones: 783 de 783
P.M.: 88 Formula: C3H4O3 Librería: NIST
Espectro del compuesto:
Comparación 1:
Figura III.8. Espectro de masas del anhídrido acético fórmico.
Del ácido pentanoico identificado no se tienen reportes de su efecto tóxico sobre
Ae. aegypti o cualquier otro insecto. Lo mismo ocurre con el éster 8‐metil, decanoato de
metilo, el cual deriva del ácido decanoico. Sin embargo, se tienen reportes de efectos
tóxicos sobre larvas de Ae. aegypti por parte de ácidos orgánicos presentes en plantas
(Rahuman, et al., 2000; Rahuman, et al., 2008; Ramsewak, et al., 2001). Además, el efecto
de dos ácidos orgánicos, ácido láctico y ácido ortofosfórico, sobre larvas de tercer instar
de Aedes aegypti se observó en el trabajo de Chakraborty y colaboradores (2010) con la
finalidad de observar las tasas de mortalidad después de 8, 16 y 24 h post‐exposición. Los
69
resultados indican que los ácidos se pueden utilizar perfectamente en combinación 1:1
para reducir las poblaciones de Aedes aegypti.
Por su parte, de la semilla de A. platyceras se identificó del extracto de acetato de
etilo al éster pentadecanoato de etilo: : EM‐IE m/z (% a. r.): 270 M+, 101 [C5H9O2]+, 88 [C4H8O2]+ (100), 43 [C2H5O]+. El tiempo de retención para el éster fue de 14.524 minutos.
En una comparación con la biblioteca NIST, de 988 revisiones, 981 coincidieron con la
estructura del pentadecanoato de etilo. El espectro del éster es el siguiente.
Revisiones: 988 de 981
P.M.: 270 Formula: C17H34O2 Librería: NIST
Espectro del compuesto:
Comparación 1:
Figura III.9. Espectro de masas del pentadecanoato de etilo.
70
De igual manera se identificó al ácido hexadecanóico: EM‐IE m/z (% a. r.): 256 M+,
213 [C13H25O2]+, 129 [C7H12O2]+, 73 [C3H5O2]+ (100). El ácido presentó un tiempo de
retención de 16.422 minutos. De las 975 revisiones que se hicieron con la biblioteca NIST,
957 coincidieron con el ácido hexadecanóico. A continuación se muestra el espectro de
masas del ácido.
Revisiones: 975 de 957
P.M.: 256 Formula: C16H32O2 Librería: NIST
Espectro del compuesto:
Comparación 1:
Figura III.10. Espectro de masas del ácido hexadecanóico.
El fraccionamiento guiado del extracto de acetona de las hojas secas de Feronia
limonia por parte de Rahuman y colaboradores (2000) proporcionó un larvicida potente
identificado como ácido n‐hexadecanoico eficaz contra larvas de cuarto instar de Culex
quiquefasciatus, Anopheles stephensi y Aedes aegypti con DL50 de 129.24, 79.58 y 57.23
ppm, respectivamente.
71
Así mismo se identificó al éster 9‐octadecenoato de etilo: EM‐IE m/z (% a. r.): 310
M+. El tiempo de retención para este compuesto fue de 16.868 minutos. De las 973
revisiones hechas con la base de datos NIST, 951 coincidieron con la estructura del 9‐
octadecanoato de etilo. El espectro de masas correspondiente es el siguiente.
Revisiones: 973 de 951
P.M.: 310 Formula: C20H38O2 Librería: NIST
Espectro del compuesto:
Comparación 1:
Figura III.11. Espectro de masas del 9‐octadecenoato de etilo.
72
Se identificó también del extracto orgánico de acetato de etilo al 9,12‐
octadecadienoato de etilo: EM‐IE m/z (% a. r.): 308 M+. Este compuesto presentó un
tiempo de retención 17.601. 953 comparaciones de las 977 realizadas con la biblioteca
NIST coincidieron en la estructura del 9,12‐octadecadienoato, a continuación se presenta
su espectro de masas.
Revisiones: 977 de 953
P.M.: 308 Formula: C20H36O2 Librería: NBS
Espectro del compuesto:
Comparación 1:
Figura III.12. Espectro de masas del 9,12‐octadecadienoato de etilo.
Si bien del éster 9,12‐octadecadienoato de etilo (proveniente del ácido linoleico)
no hay reportes de su toxicidad sobre larvas de Aedes aegypti, el ácido linoleico fue
aislado de Citrullus colocynthis (Linn.) por parte de Rahuman y colaboradores (2008)
reportando una CL50 y CL90 de 18.2 y 96.33 ppm, respectivamente, sobre larvas de cuarto
instar de Ae. aegypti. Ramsewak y colaboradores (2001) reportan para este mismo ácido
una CL50 de 100 ppm sobre larvas de cuarto estadio de Ae. aegypti. Los trabajos de los
autores también reportan actividad del ácido oleico, con CL50 de 8.8 y 100 ppm.
73
Se identificó al compuesto denominado bis (2‐etilhexil) adipato: EM‐IE m/z (% a.
r.): 370 M+. 970 comparaciones de 985 revisiones en la biblioteca NIST, coinciden con la
estructura del compuesto del cual se presenta su espectro de masas a continuación.
Revisiones: 985 de 970
P.M.: 370 Formula: C22H42O4 Librería: NBS
Espectro del compuesto:
Comparación 1:
Figura III.13. Espectro de masas de bis (2‐etilhexil) adipato.
74
CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES
Ante la problemática que ha representado el dengue su combate se ha centrado,
principalmente, en el empleo de insecticidas químicos para disminuir las poblaciones del
mosquito vector Aedes aegypti. La búsqueda de nuevas alternativas en el combate de Ae.
aegypti que muestren un gran potencial en su control y además permitan solucionar los
problemas de resistencia a los insecticidas químicos deja abierta la opción al uso de
productos naturales.
En este trabajo la semilla de dos plantas del mismo género, Argemone mexicana y
Argemone platyceras, fue evaluada sobre larvas de Ae. aegypti, de probada resistencia a
insecticidas, a través de sus extractos y sucesivas fracciones, exhibiendo alguna actividad
contra la larva del vector.
Para ambas plantas, los extractos obtenidos con disolventes de polaridad baja a
media presentaron mayores efectos larvicidas, es decir, existe una relación inversa entre
polaridad y efectividad sobre las larvas de Aedes aegypti.
Un total de 7 extractos crudos y de 7 fracciones (provenientes de los extractos
crudos de hexano) de las dos semillas de las plantas se probaron sobre larvas de Ae.
aegypti resistentes. En general, los mejores resultados se observaron con la semilla de A.
platyceras a 48 horas de exposición de los extractos/fracciones sobre las larvas, siendo
una fracción la única que presentó una dosis letal media menor a 100 ppm.
Sin embargo, cuando se evaluaron los extractos y fracciones de la semilla de A.
mexicana sobre larvas susceptibles a insecticidas de Ae. aegypti, la concentración
requerida de estos es menor para combatir las larvas al mayor tiempo de exposición,
además, se evidencia un posible mecanismo de acción distinto por parte de los
compuestos de una fracción respecto a insecticidas organofosforados y piretroides, es
decir, no se exhibe resistencia cruzada entre fitoquímicos y par de grupos de insecticidas.
Se identificó de una fracción del extracto crudo de hexano de la semilla de A.
mexicana las cetonas 4‐metil, 3‐penten‐2‐ona y 4‐hidroxi‐4‐metil‐2‐pentanona; al ácido
pentanoico, al anhídrido acético fórmico y al éster 8‐meti, decanoato de metilo. Por su
parte, del extracto crudo de acetato de etilo de la semilla de A. platyceras se identificó al
ácido hexadecanoico; a los ésteres pentadecanoato de etilo, 9‐octadecenoato de etilo y
9,12‐octadecadienoato de etilo; finalmente se identificó al compuesto denominado bis (2‐
etilhexil) adipato. Si bien, estos compuestos identificados no se probaron por sí solos
75
sobre las larvas, una posterior evaluación de estos en su forma pura, o en su caso de
manera combinada, podría exhibir una mayor susceptibilidad de las larvas hacia ellos.
Los estudios que se tienen de fitoquímicos sobre organismos están, en su mayoría,
basados en plantas medicinales, el hecho no es producto si no del conocimiento histórico
experimental que se tienen de ellas. Nuevas fuentes de fitoquímicos inexploradas hasta
ahora permitirán descubrir nuevas moléculas que se sumen al conocimiento obtenido en
beneficio de un control adecuado de insectos considerados plagas.
No se pueden descartar los beneficios que otorgan los productos naturales para el
control de Ae. aegypti, sin embargo, su empleo deberá de ir de la mano con la
participación de la población en programas sostenidos de vigilancia y prevención del
dengue para augurar el éxito tan deseado en el combate de la enfermedad.
76
BIBLIOGRAFÍA
Abdel‐Shaalan, E., Canyon, D., Younes, M., Abdel‐Wahab, H., & Mansour, A. (2005). A
review of botanical phytochemicals with mosquitocidal potential. Environmental
International, 31, 1149‐1166.
Anonymus. (1991). Imported dengue‐United States. Morb Mortal Wkly Rep.
Ascher, S. K. (1993). Non conventional insecticidal effects of pesticides available from the
Neem tree, Azadirachta indica. Arch. Insect. Physiol, XXII, 433‐449.
Autran, E., Neves, I., da Silva, C., Santos, G. d., & Navarro, D. (2009). Chemical
composition, oviposition deterrent and larvicidal activities against Aedes aegypti of
essential oils from Piper marginatum Jacq. (Piperaceae). Bioresurce Technology,
57, 2284‐2288.
Ave, D. A., Gergoy, P., & Tingey, W. (1987). Aphid repellent sesquiterpenes in glandular
trichomes of Solanum berthaultii and S. tuberosum. Entomol. Exp. Appl., 131‐138.
Baddi, M. L., Cerna, E., & Abreu, J. (2007). Ecología e historia del dengue en las Américas.
International Journal of Good Conscience, 2, 248‐273.
Báez, I. (2010). Evaluación de plantas medicinales con potencial en el control biológico del
vector transmisor de dengue Aedes aegypti. Tlaxcala.
Balandrin, M., & Klocke, J. A. (1985). Natural plant chemicals: Sources of industrial and
medicinal materials. Science, CCXXVIII, 1154‐1160.
Beasley, D. W. (2008). Dengue (Primera ed., Vol. 5). (S. B. Halstead, Ed.) London: Imperial
College Press.
Berenbaum, M. B., & Rosenthal, G. A. (1992). Plant Secundary Metabolites: Vol. 1. The
Chemical Participants. New York: Academic Press.
Berenbaum, M. R. (1991). Coumarins. En Herbivores: Their interactions with Secondary
Plant Metabolites. 221‐249. San Diego: Academic Press.
Bisset, J. (2002). Uso correcto de insecticidas: control de la resistencia. Revista Cubana de
Medicina Tropical, 55(3), 202‐219.
77
Bisset, J., Blanco, S., Braga, I., Coto, H. M., Moncayo, A., Nathan, M., y otros. (2005).
Protocolo para determinar la susceptibilidad o resistencia a insecticidas de
mosquitos de la especie Aedes aegypti. Red Latinoamericana de Control de
Vectores.
Bloomquist, J. R. (1996). Ion channels as targets for insecticides. Annu. Rev. Entomol., 163‐
90.
Bowers, W., Ohta, T., Cleere, J., & Marsehla, P. (1976). Discovery of insect anti‐juvenile
hormones in plants. Science, 193, 542‐547.
Chakraborty, S. S. (2010). Mosquito larvicidal effect of orthophosporic acid and lactic acid
individually or their combined form on Aedes aegypti. Asian Pacific Journal of
Tropical Medicine, 3, 954‐956.
Chávez, J., Córdova, O., & Vargas, F. (2005). Niveles de susceptibilidad de temefos en el
vector transmisor del dengue en Trujillo, Perú. An. Fac. Medicina, 53‐56.
Cheng, S., Chua, M., Chang, E., Huang, C., Chen, W., & Chang, S. (2009). Variations in
insecticidal activity and chemical composition of leaf essential oils from
Cryptomeria japonica at different ages. Bioresource Technology, 100, 465‐470.
Chitwood, D. J. (2002). Estrategias basadas en fitoquímicos para el control de nemátodos.
Rev. An. Fitopatología, 40, 241‐249.
Christophers, S. R. (1960). Aedes aegypti (L). The Yellow Fever Mosquito. Its Life History,
Bionomics and Structure. Cambridge: University Press.
Chung, I., Seo, S., Kang, E., Park, S., Park, W., & Moon, H. (2009). Chemical composition
and larvicidal effects of essential oil of Dendropanax morbifera against Aedes
aegypti L. Biochemical Sistematics and Ecology, 37, 470‐473.
Ciccia, G., Coussio, J., & E., M. (2000). Insecticidal activity against Aedes aegypti larvae of
some medicinal South American Plants. Journal Ethnopharmacology, 72, 185‐189.
Colvard, J. (1978). El comportamiento alimentario de los mosquitos. Investigación y
ciencia. Scientific American, 86‐93.
David, J., Rey, D., Pautou, M., & Meyran, J. (2000). Differential toxicity of leaf litter to
dipteran larvae of mosquitoe developmental sites. J. Invertebr. Pathol., 75, 9‐18.
78
de Morais, S., Facundo, V., Bertini, L., Cavalcanti, E., Junior, J., Ferreira, S., y otros. (2007).
Chemical composition and larvicidal activity of essential oils from Piper species.
Biochemical Systematics and Ecology, 35, 670‐675.
Dharmagadda, V., Naik, S., Mittal, P., & Vasudevan, P. (2005). Larvicidal activity of Tagetes
patula essential oil against three mosquito species. Bioresurce Technology, 96,
1235‐1240.
Domínguez, X. A. (1985). Métodos de investigación fitoquímica (Tercera ed.). México:
Limusa.
Erickson, J. M., & Feeny, P. (1974). Sinigrin: A chemical barrier to the black Swallowtail
butterfly, Papilio polyxenes. Ecology, 103‐111.
FAO. (1970). Recommended methods for the detection and measurement of the resistance
of agricultural pests to pesticides. FAO Plant Protection Bull.
Feeny, P. (1992). The evolutionary of chemical ecology: Contributions from the study of
herbivorous insects. En G. A. Rosental, & M. R. Berenbaum (Edits.), Herbivores.
Their interaction with Secondary Plant Metabolites. 1‐35. New York: Academic
Press.
Fellows, L. E., Evans, S. V., Nash, R. J., & Bell, E. A. (1986). Polyhydroxy plant alkaloids as
glycosidase inhibitors and their possible ecological role. En Natural Resitance of
plants to Pests (págs. 72‐78). Washington: American Chem. Soc.
Felton, G. W., Donato, K. K., Broadway, R. M., & Duffey, S. S. (1992). Impact of oxidized
plant phenolics on the nutritional quality of dietar protein to a noctuid herbivore,
Spodoptera exigua. J. Insect. Physiol, 277‐285.
Garcez, W., Garcez, F., da Silva, L., & Hamerski, L. (2009). Larvicidal activity against Aedes
aegytpi of some plants native to the West‐Central region of Brazil. Bioresource
Technology, 100, 6647‐6650.
Georghiou, G. (1965). Genetic studies on Insecticide Resistance. Adv. Pest. Control Res., 6,
171‐176.
Gubler, D. J. (1989). Aedes aegypti and Aedes aegypti‐borne disease control in the 1990s:
top down or bottom up. Am. J. Trop. Med. Hyg., XL, 571‐578.
Gubler, D. J. (1998). Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clin Microbiol Rev, 11(3), 480‐
496.
79
Gubler, D. J. (2008). Dengue/Dengue Haemorrhagic Fever: History and Current Status, in
New Treatment Strategies for Dengue and Other Flaviviral Diseases: Novartis
Foundation Symposium 277. (G. Bock, & J. Goode, Edits.) Chichester, United
Kingdom: John Wiley & Sons, Ltd.
Halstead, S. B. (2008). Dengue: Overview and History. En Dengue (Tropical Medicine:
Science and Practice) (Primera ed., Vol. 5, págs. 1‐28). London: Imperial College
Press.
Health, R. (16 de Enero de 2013). MedlinePlus. Recuperado el 28 de Enero de 2013, de El
dengue es la enfermedad tropical más expandida en el mundo: OMS:
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/news/fullstory_133170.html
Jacobson, M. (1989). Botanical pesticides: past, present and future. En J. T. Arnason, & P.
Moran (Edits.), Insecticides of Plant Origin (págs. 1‐10). Washington, D. C.:
American Chemical Society.
Jalees, S., Sharma, S., Rahman, S., & Verghese, T. (1993). Evaluatin of insecticidal
properties of an indigenous plant, Cannabis sativa Linn., against mosquito larvae
under laboratory conditions. J. Entomol. Res., 2, 117‐120.
Jang, Y., Baek, B. Y., Kim, M., & Lee, H. (2002). Larvicidal activity of leguminous seeds and
Culex pipiens pallens. Journal American Mosq. Control Assoc., 18, 210‐213.
Koul, O., Shankar, J. S., & Kapil, R. S. (1996). The effect of neem allelochemicals on
nutritional physiology of larval Spodoptera litura. Entomol. Exp. Appl., 43‐50.
Kumar, S., Wahab, N., & Warikoo, R. (2011). Bioefficacy of Mentha piperita essential oil
against dengue fever mosquito Aedes aegypti L. Asian Pacific Journal Tropical
Biomedical, 2, 85‐88.
Kumm, H. W. (1931). The geographical distribution of the yellow fever vectors. Am. J.
Hyg., XII, 1‐10.
Lagunes, T. (1991). Notas del curso de Toxicología y Manejo de Insecticidas. Chilpancingo,
México: Centro de Entomología y Acarología.
López, J. (1997). Actividad de Trichilia havanensis J. sobre larvas de Spodoptera littoralis.
Bol. San. Veg. Plagas, 23, 3‐10.
Marten, G. G. (1986). Mosquito control by plankton management: The potential of
indigestible green algae. J Trop Med Hyg, LXXXIX, 213‐222.
80
Mazine, C. A., Macoris, M. L., Andrighetti, M. T., & Nelson, M. J. (1996). Disposable
containers as larval habitats for Aedes aegypti in a city with regular refise
collection: a study in Marília, Säo Paulo State, Brazil. Acta Tropical, 1‐13.
Miller, T. (1988). Mechanisms of resistance to pyrethroid insecticides. Parasitology Today,
4, 13‐15.
Miyoshi, M. (1998). Structure‐activity relationships of some Complex I inhibitor.
Biochimica et Biophysica Acta, 244‐326.
Monzon, R., Alvior, J., Luczon, L., Morales, A., & Mutuc, F. (1994). Larvicidal potential of
five Philippine plants against Aedes aegypti (Linnaeus) and Culex quinquefasciatus
(Say). Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 25, 755‐759.
Mordue, A. J., & Blackwell, A. (1993). Azadirachtin: an update. Journal of Insect Physiology,
903‐924.
Mwangi, R., & Mukiama, T. (1998). Evaluation of Melia Volkensii extract fractions as
mosquito larvicides. Journal American Mosq. Control Assoc., 4, 442‐447.
Nakanishi, K., Goto, T., Ito, S., Natosi, S., & Nozoe, S. (1974). Natural Products Chemestry.
Tokyo: Academic Press, Inc.
Nelson, M. J. (1986). Aedes aegypti: Biología y Ecología. Washington, D. C.: Organización
Panamericana de la Salud.
OMS. (2004). Comité Consultivo Mundial sobre Seguridad de las Vacunas. X Reunión.
OMS. (Diciembre de 2012). Centro de prensa. Dengue y dengue hemorrpagico.
Recuperado el 28 de Enero de 2013, de Nota descriptiva No. 117:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs117/es/
Park, A., Justiniano, M., & Fredericksen, T. (2005). Natural regeneration and
environmental relationships of tree species in logging gaps in Bolivian tropical
forest. Forest Ecology and Management, 147‐157.
Park, I., Lee, S., Shin, J., Park, J., & Ahn, Y. (2002). Larvicidal activity of isobutylamides
edentified in Piper nigrum fruits against three mosquito species. Journal Agric.
Food Chemistry, 50, 1866‐1870.
Paroonagian, D. (1994). Managing insect resistance. Memorias XXI Congreso Sociedad
Colombiana de Entomología, (págs. 20‐62). Medellín, Colombia.
81
Pelah, D., Abramovich, Z., Markus, A., & Wiesman, Z. (2002). The use of comercial saponin
from Quillaja saponaric bark as a natural larvicidal agent against Aedes aegypti and
Culex pipiens. Journal of Ethnopharmacology, 407‐409.
Perich, M., Wells, C., Bertshc, W., & Tredaway, K. (1994). Toxicity of extracts from three
Tagetes against adult and larvae of yellow fever mosquito and Anopheles stephensi
(Diptera: Culicidae). Journal Med. Entomology, 31, 833‐837.
Pizarro, A., Oliveira, J., Parente, J., Melo, M., dos Santos, C., & Lima, P. (1999). Utilization
of the waste of sisal industry in the control of mosquito larvae. Rev. Soc. Bras.
Med. Trop., 32, 23‐29.
Pluempanupat, S., Kumrungsee, N. P., & Bullangpoti, V. K. (2013). Laboratory evaluation of
Dalbergia oliveri (Fabaceae: Fabales) extracts and isolated isoflavonoids on Aedes
aegypti (Dipetra: Culicidae) mosquitoes. Industrial Crops and Products, 44, 653‐
658.
Pushpalatha, E., & Muthukrishnan, J. (1999). Efficacy of two plant extracts for the control
of mosquitoes. J. Appl. Entomol., 123, 369‐373.
Rahuman, A., Gopalakrishnan, G., Ghouse, G., Arumugam, S. & Himalayan B. (2000). Effect of
Feronia Limonia on mosquito larvae. Fitoterapia. 71, 553‐555.
Rahuman, A., Venkatesan, P., & Gopalakrishnan, G. (2008). Mosquitolarvicidal activity of oleic and
linoleic acids isolated from Citrullus colocynthis (Linn.) Schrad. Parasitol Res. , 103, 1383‐
1390.
Rajasekaran, A., & Duraikannan, G. (2012). Larvicidal activity of plant extracts on Aedes
aegypti. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 5, 1578‐1582.
Rajkumar, S., & Jebanesan, A. (2010). Chemical composition and larvicidal activity of leaf
essential oil from Clausena dentata (wild) M. Roam. (Rustaceae) against the
chikungunya vector, Aedes aegypti Linn. (Diptera: Culicidae). J. of Asian‐Pacific
Entomology, 13, 107‐109.
Rajkumar, S., Arulsamy, J., & Nagarajan, R. (2012). Synergistic effect of Andrographis
echioides and Cadaba trifoliata leaf extracts against larvae of dengue mosquito
Aedes aegypti L. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 5, 1588‐1591.
Ramsewak, R., Muraleedharan, G., Murugesan, S. W., & Zasada, J. (2001). Insecticidal fatty
acids and triglycerides from Dirca palustris. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 49, 5852‐5856.
82
Ranaweera, S. (1996). Mosquito‐larvicidal activity of some Sri Lankan Plants. J. Natn. Sci.
Coun. Sri Lanka, 24, 63‐70.
Rawlins, S., & Hing, O. (1995). Resistance insome Caribbean populations of Aedes aegypti
to several insecticides. Journal Am. Mosq. Control Assoc., 11, 59‐65.
Rawlins, S., & Ragoonansingh, R. (1990). Comparative organophosphorous insecticide
susceptibility in Caribbean populations of Aedes aegypti and Toxorynchites
moctezuma. Journal Am. Mosq. Control Assoc., 6, 315‐317.
Reiter, P. (2001). Climate change and mosquito‐born disease. Environ. Health Prespect.,
CIX, 141‐161.
Resiter, P. (1998). Aedes albopictus and the world trade in used tires, 1988‐1995: the
shape of things to come? Journal American Mosquito Control Association, 14, 83‐
94.
Rey, D., David, J., Besnard, G., Jullien, J., Lagneau, C., & Meyran, J. (2001). Comparative
sensitivity of larval mosquito to vegetable polyphenols versus conventional
insecticides. Entomol. Exp. Appl., 98, 361‐367.
Rhoades, D. F. (1979). Evolution of plant Chemical Defense against herbivores. En
Herbivores: Their interaction with Secondary Plant Metabolites. Academic Press.
Rivero, R., Rodríguez, E., & Menéndez, R. (2002). Obtención y caracterización preliminar
de un extracto de Aloe vera L. con actividad antibacterial. Rev. Cubana PLant.
Med., 7, 32‐38.
Rodrigues, A., de Paula, J. R., & Espíndola, L. (2005). Larvicidal activity of Cybistax
antisyphilitica against Aedes aegypti larvae. Fitoterapia, 76, 755‐757.
Rodríguez, M., Bisset, J., Fernández, D., & Pérez, O. (2004). Resistencia a insecticidas en
larvas y adultos de Aedes aegypti: prevalencia de la esterasa A4 asociada con la
resistencia a temefos. Rev. Cubana Med. Trop., 56, 54‐60.
Roses, M., & Guzmán, M. (2007). Dengue y dengue hemorrágico en las Américas. Rev
Panam Salud, XXI(4), 187‐191.
Ryan, M., & Byme, O. (1988). Plant‐insect coevolution and inhibition of acetylcholine‐
esterase. Journal of Chemical Ecology, XIV, 1965‐1975.
83
San Martín, J., & Brathwaite, O. (2007). La estrategia de gestión integrada para la
prevención y control del dengue en la región de las Américas. Rev Panam Salud
Publica, XXI(1), 143‐150.
Santacoloma, L., & Chaves, B. (2010). Susceptibilidad de Aedes aegypti a DDT,
deltametrina y lambdacialotrina en Colombia. Rev. Panam. Salud Pública, 27, 66‐
73.
Scheliessman, D. J., & Calheiro, L. B. (1974). Review of status yellow fever and Aedes
aegypti eradication programs in Americas. Mosquito News(34), 1‐9.
Shaalan, E., Canyon, D., Faried, M., Abdel‐Wahab, H., & Mansour, A. (2003). Efficacy of a
highly active phytochemical (Callitris glaucophylla) against mosquito vectors of
dengue and Japanese encephalitis. The Annual Queensland Health and Medical
Scientific Meeting, "Making It Better: Encouraging health research and innovation".
Sharma, R., Deshpande, S., Tungikar, V., & Joseph, M. (1994). Toxicity of natural essential
oils to mosquitoes, Aedes aegypti and Culex fatigans. Geobios, 21, 162‐165.
Sharma, S., Saxena, V., & Lai, S. (2004). Study on susceptibility status in aquatic and adult
stages of Aedes aegypti and Ae. albopictus against insecticides at interantional
airports of South India. J.Commun. Dis., 36, 177‐181.
Sinniah, B., Sinniah, D., & Ibrahim, J. (1994). Effect of neem oil and mosquito larvae. Mosq.
Borne Dis. Bull., 11, 90‐93.
Soulé, S., Guéntner, C., Vazquez, A., Argandona, A., Moyna, P., & Ferreira, F. (2000). An
aphid repellent glycoside from Solanum Iaxum. Phytochemistry, 217‐222.
Sultana, I., Hosokawa, C., Nishimura, K., Ikeda, I., & Ozoe, I. (2002). Benzylidene
anabaseines act as high‐affinity agonists for insect niconitic acetylcholine
receptors. Insect. Biochem. Mol. Biol., 637‐643.
Sweeney, A. W., & Becnel, J. J. (1991). Potential of microsporidia for teh biological control
of mosquitoes. Parasitol Today, VII, 217‐220.
Tabachnick, W. J. (1991). Evolutionary genetics and arthropod‐born disease. The yellow
fever mosquito. American Entomologist, 37, 14‐24.
Thangam, T., & Kathiresan, K. (1991). Mosquito larvicidal effect of seaweed extracts. Bot.
Mar., 34, 433‐435.
84
Thirión, J. (2003). El mosquito Aedes aegypti y el dengue en México. México: Bayer
Environmental Science.
Völlinger, M. (1987). The possible development of resistance against neem seed kernel
extract and deltamethrin in Plutella xylostella. En M. Völlinger, Natural Pesticides
fromte Neem Tree (Azadirachta indica A. Juss) and other Tropical Plants,
Proceedings of Third International Neem Conference (págs. 543‐554). Eschborn,
Germany: German Agency for Technical Cooperation (GTZ).
Whittaker, R. H., & Feeny, P. P. (1971). Allelochemics: Chemical Interactions between
Species. Science, CLXXI, 757‐770.
WHO. (1981). Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito
larvae to insecticides. Geneva: WHO.
Wink, M. (2003). Evolution of secondary metabolites from an ecological and molecular
phylogenetic perspective. Phytochemistry, 3‐19.
Wink, M., Scmeller, T., & Latz Brüning, B. (1998). Modes of action of allelochemical
alkaloids: Interaction with neuroreceptors, DNA and other molecular targets. J.
Chem. Ecol., 1881‐1937.
Young‐Cheol, Y., Park, I., Eun‐Hee, K., Lee, H., & Ahn, Y. (2004). Larvicidal activity of
medicinal plant extracts against Aedes aegypti, Ochlerotatus togoi and Culex
pipiens pallens (Diptera: Culicidae). Journal of Asia‐Pacific Entomology, 7, 227‐232.
Zagne, S. M., & Alves, V. G. (1994). Dengue hemorrhagic fever in the state of Rio de
Janeiro, Brazil: a study of 56 confirmed cases. Trans R Soc Trop Med Hyg, LXXXVIII,
677‐679.
Zuñiga, C., & Peraza, J. H. (2009). Abordando la problemática del dengue desde una
prespectiva ambiental. Tecnología en marcha, XXII, 81‐89.
85
ANEXO A.I. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone mexicana.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Ext. orgánico de AcOet Temperatura: 23°C Humedad: __43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: 25
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: Alimento para ratones_____
Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio del 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 10 15 16 9 21 4 25 0
500 2 5 20 13 12 18 7 21 4
500 3 7 18 12 13 14 11 20 5
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 23 2 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 22 3 24 1 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐
86
ANEXO A.II. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone mexicana.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Ext. orgánico de acetona Temperatura: _23°C__ Humedad: __43%_____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ___Alimento para ratones_____ Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio del 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 6 19 11 14 12 13
500 2 0 25 2 23 3 20 6 19
500 3 0 25 0 25 1 24 3 22
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 13 12 14 11 18 7 25 0
500 2 10 15 12 13 14 11 25 0
500 3 9 16 13 12 20 5 25 0
87
ANEXO A.III. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone mexicana.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Ext. orgánico de MeOH Temperatura: ___23°C___ Humedad: ___43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ____Alimento para ratones____ Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio del 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 0 25 0 25 0 25
500 3 0 25 0 25 0 25 0 25
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 0 25 0 25 0 25
500 3 0 25 0 25 0 25 0 25
88
ANEXO A.IV. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone mexicana.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Fracción metanólica Temperatura: ___23°C___ Humedad: ___43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ____Alimento para ratones___ Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio de 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 3 22 14 11 22 3 25 0
500 2 1 24 1 24 8 17 10 15
500 3 4 21 8 17 13 12 16 9
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 14 11 22 3 23 2 25 0
500 3 16 9 16 9 17 8 25 0
89
ANEXO A.V. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone mexicana.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: __Fracción I‐II__ Temperatura: ___23°C___ Humedad: ___43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ___Alimento para ratones___ Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio de 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 1 24 7 18 10 15 18 7
500 2 1 24 1 24 5 20 12 13
500 3 1 24 4 21 9 16 15 10
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 19 6 21 4 24 1 25 0
500 2 22 3 22 3 22 3 22 3
500 3 19 6 19 6 20 5 20 5
90
ANEXO A.VI. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone mexicana.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: __Fracción I‐III__ Temperatura: ___23°C___ Humedad: ____43%___ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ___Alimento para ratones____ Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio de 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 1 24 5 20 7 18 15 10
500 2 1 24 1 24 3 22 10 15
500 3 1 24 2 23 8 17 12 13
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 17 8 19 6 22 3 23 2
500 2 20 5 21 4 22 3 25 0
500 3 16 9 18 7 19 6 19 6
91
ANEXO A.VII. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone mexicana.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: __Fracción III____ Temperatura: ___23°C___ Humedad: ____43%___ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ___Alimento para ratones____ Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio de 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
92
ANEXO A.VIII. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Controles.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Positivo (temefos) Temperatura: ___23°C___ Humedad: ___43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ___Alimento para ratones____ Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio de 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
93
ANEXO A.IX. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Controles.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Negativo
(agua+DMSO) Temperatura: ___23°C___ Humedad: ____43%___
Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto temprano
Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ____Alimento para ratones____ Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio de 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 0 25 0 25 0 25
500 3 0 25 0 25 0 25 0 25
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 0 25 0 25 0 25
500 3 0 25 0 25 0 25 0 25
94
ANEXO A.X. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Testigos.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: __AcOEt__ Temperatura: ___23°C___ Humedad: ____43%___ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ____Alimento para ratones____ Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio de 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 0 25 0 25 0 25
500 3 0 25 0 25 0 25 0 25
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 0 25 0 25 0 25
500 3 0 25 0 25 0 25 0 25
95
ANEXO A.XI. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Testigos.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: __Acetona__ Temperatura: ____23°C__ Humedad: ___43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: __Alimento para ratones______ Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio de 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 0 25 0 25 0 25
500 3 0 25 0 25 0 25 0 25
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 0 25 0 25 0 25
500 3 0 25 0 25 0 25 0 25
96
ANEXO A.XII. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Testigos.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: __MeOH__ Temperatura: ____23°C__ Humedad: ____43%___ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ____Alimento para ratones____ Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio de 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 0 25 0 25 0 25
500 3 0 25 0 25 0 25 0 25
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 0 25 0 25 0 25
500 3 0 25 0 25 0 25 0 25
97
ANEXO A.XIII. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Testigos.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: __Hexano__ Temperatura: __23°C____ Humedad: ____43%___ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ____Alimento para ratones____ Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio de 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
98
ANEXO A.XIV. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone platyceras.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Ext. orgánico de hexano Temperatura: 23°C Humedad: __43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: 25
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: Alimento para ratones_____
Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio del 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 4 21 9 16 18 7 24 1
500 2 2 23 4 21 14 10 23 2
500 3 0 25 1 24 18 7 25 0
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 24 1 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
99
ANEXO A.XV. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone platyceras.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Ext. orgánico de AcOEt Temperatura: 23°C Humedad: __43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: 25
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: Alimento para ratones_____
Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio del 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 6 19 14 11 22 3 24 1
500 2 1 24 9 16 15 10 16 9
500 3 4 21 20 5 24 1 25 0
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 20 5 21 4 23 2 25 0
500 3 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
100
ANEXO A.XVI. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone platyceras.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Ext. orgánico de
acetona Temperatura: 23°C Humedad: __43%____
Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto temprano
Larvas/vaso: 25
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: Alimento para ratones_____
Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio del 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 1 24 1 24 1 24
500 3 0 25 0 25 0 25 1 24
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 1 24 1 24 1 24 1 24
500 3 1 24 2 23 2 23 2 23
101
ANEXO A.XVII. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone platyceras.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Ext. orgánico de
MeOH Temperatura: 23°C Humedad: __43%____
Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto temprano
Larvas/vaso: 25
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: Alimento para ratones_____
Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio del 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 0 25 0 25 0 25
500 3 0 25 1 24 15 10 18 7
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 0 25 0 25 0 25 0 25
500 2 0 25 0 25 0 25 0 25
500 3 23 2 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
102
ANEXO A.XVIII. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone platyceras.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Fracción metanólica Temperatura: 23°C Humedad: __43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: 25
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: Alimento para ratones_____
Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio del 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 4 21 11 14 18 7 25 0
500 2 9 16 19 6 22 3 25 0
500 3 4 21 6 19 22 3 25 0
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
103
ANEXO A.XIX. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone platyceras.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Fracción I‐IV Temperatura: 23°C Humedad: __43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: 25
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: Alimento para ratones_____
Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio del 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 22 3 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 16 9 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 10 15 24 1 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
104
ANEXO A.XX. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Evaluación de la eficacia de extractos y fracciones contra larvas de mosquitos en el laboratorio. Bioensayo I. Argemone platyceras.
No. experimento : _1_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 5/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Fracción 0 – III Temperatura: 23°C Humedad: __43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: 25
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: Alimento para ratones_____
Fecha de preparación de la solución stock: 05 de junio del 2012
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
6 h 12 h 18 h 24 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 17 8 24 1 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 24 1 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 13 12 24 1 25 0 ‐‐‐ ‐‐‐
No. de larvas muertas post‐exposición (h)
30 h 36 h 42 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 2 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
500 3 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐
105
ANEXO B.I. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Determinación de la dosis letal media (DL50) de extractos y fracciones contra larvas de mosquito en el laboratorio. Bioensayos II. Argemone mexicana
No. experimento : _2_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 8/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Ext. orgánico de AcoEt Temperatura: __23°C____ Humedad: ___43%_____
Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto temprano
Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: __Alimento para ratones______ Fecha de preparación de la solución stock: ______________8 de junio de 2012________________
24 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
250 1 13 12 19 6
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
200 1 8 17 14 11
2 7 18 15 10
3 9 16 13 12
4 5 20 11 14
100 1 3 22 3 22
2 0 25 0 25
3 3 22 7 18
4 2 23 2 23
50 1 0 25 0 25
2 0 25 0 25
3 0 25 0 25
4 1 24 2 23
10 1 2 23 2 23
2 1 24 1 24
3 0 25 1 24
4 0 25 0 25
106
ANEXO B.II. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Determinación de la dosis letal media (DL50) de extractos y fracciones contra larvas de mosquito en el laboratorio. Bioensayos II. Argemone mexicana.
No. experimento : _2_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 8/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Fracción metanólica Temperatura: ___23°C___ Humedad: _____43%___
Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto temprano
Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ______Alimento para ratones___ Fecha de preparación de la solución stock: ____________8 de junio de 2012_______ _______
24 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
250 1 6 19 11 14
2 0 25 1 24
3 0 25 3 22
4 0 25 3 22
200 1 3 22 4 21
2 1 24 2 23
3 0 25 1 24
4 1 24 2 23
100 1 1 24 1 24
2 0 25 0 25
3 1 24 2 23
4 1 24 2 23
50 1 0 25 0 25
2 1 24 1 24
3 1 24 1 24
4 0 25 0 25
10 1 0 25 0 25
2 1 24 1 24
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
107
ANEXO B.III. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Determinación de la dosis letal media (DL50) de extractos y fracciones contra larvas de mosquito en el laboratorio. Bioensayos II. Argemone mexicana.
No. experimento : _2_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 8/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: ___Fracción I‐II_____ Temperatura: ____23°C__ Humedad: ___43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: _______Alimento para ratones__ Fecha de preparación de la solución stock: ____________8 de junio de 2012___________________
24 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
250 1 25 0 25 0
2 20 5 24 1
3 25 0 25 0
4 12 13 20 5
200 1 13 12 14 11
2 13 12 21 4
3 8 17 20 5
4 8 17 12 13
100 1 0 25 0 25
2 1 24 1 24
3 0 25 0 25
4 1 24 5 20
50 1 1 24 1 24
2 0 25 0 25
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
10 1 0 25 0 25
2 0 25 0 25
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
108
ANEXO B.IV. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Determinación de la dosis letal media (DL50) de extractos y fracciones contra larvas de mosquito en el laboratorio. Bioensayos II. Argemone mexicana.
No. experimento : _2_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 8/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: ___Fracción I‐III____ Temperatura: ___23°C___ Humedad: ___43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: __Alimento para ratones__ Fecha de preparación de la solución stock: ____________________8/Jun/2012___________
24 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
250 1 13 12 15 10
2 13 12 17 8
3 11 14 15 10
4 14 11 18 7
200 1 6 19 8 17
2 8 17 9 16
3 14 11 18 7
4 5 20 7 18
100 1 0 25 0 25
2 1 24 1 24
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
50 1 0 25 1 24
2 0 25 0 25
3 1 24 1 24
4 0 25 0 25
10 1 0 25 0 25
2 0 25 0 25
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
109
ANEXO B.V. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Determinación de la dosis letal media (DL50) de extractos y fracciones contra larvas de mosquito en el laboratorio. Bioensayos II. Argemone platyceras.
No. experimento : _2_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 9/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Ext. orgánico de AcOEt Temperatura: ___23°C__ Humedad: ____43%____ Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto
temprano Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: ____Alimento para ratones____
Fecha de preparación de la solución stock: _____________9 de junio de 2012________________
24 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
250 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
200 1 10 15 13 12
2 8 17 10 15
3 6 19 9 16
4 11 14 14 11
100 1 4 21 7 18
2 1 24 1 24
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
50 1 0 25 0 25
2 0 25 0 25
3 3 22 3 22
4 10 15 13 12
10 1 0 25 0 25
2 7 18 8 17
3 1 24 1 24
4 2 23 2 23
110
ANEXO B.VI. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Determinación de la dosis letal media (DL50) de extractos y fracciones contra larvas de mosquito en el laboratorio. Bioensayos II. Argemone platyceras.
No. experimento : _2_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 9/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: _Fracción metanólica_ Temperatura: ___23°C____ Humedad: ____43%____
Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto temprano
Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: __Alimento para ratones_______
Fecha de preparación de la solución stock: ____________________9 de junio de 2012__________
24 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
250 1 15 0 19 6
2 9 0 18 7
3 13 0 19 6
4 15 0 17 8
200 1 13 12 15 10
2 7 18 14 11
3 11 14 16 9
4 10 15 12 13
100 1 6 19 12 13
2 0 25 0 25
3 11 14 13 12
4 9 16 11 14
50 1 7 18 8 17
2 3 22 7 18
3 3 22 3 22
4 4 21 7 18
10 1 0 25 0 25
2 1 24 1 24
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
111
ANEXO B.VII. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Determinación de la dosis letal media (DL50) de extractos y fracciones contra larvas de mosquito en el laboratorio. Bioensayos II. Argemone platyceras.
No. experimento : _2_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 9/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: ____Fracción I‐IV__ Temperatura: ___23°C___ Humedad: ____43%____
Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto temprano
Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: __Alimento para ratones_______
Fecha de preparación de la solución stock: ______________9 de junio de 2012________________
24 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
250 1 19 6 25 0
2 17 8 25 0
3 19 6 25 0
4 16 9 25 0
200 1 12 13 19 6
2 15 10 21 4
3 14 11 24 1
4 11 14 18 7
100 1 6 19 10 15
2 3 22 5 20
3 3 22 12 13
4 1 24 5 20
50 1 1 24 2 23
2 3 22 3 22
3 1 24 1 24
4 0 25 0 25
10 1 5 20 5 20
2 0 25 0 25
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
112
ANEXO B.VIII. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Determinación de la dosis letal media (DL50) de extractos y fracciones contra larvas de mosquito en el laboratorio. Bioensayos II. Argemone platyceras.
No. experimento : _2_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 9/Jun/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: ___Fracción 0‐III__ Temperatura: ____23°C__ Humedad: _____43%___
Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto temprano
Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: Resistentes a insecticidas del tipo piretroides
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: _____Alimento para ratones_____
Fecha de preparación de la solución stock: _______________9 de junio de 2012_______________
24 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 25 0
2 24 1 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
250 1 18 7 19 6
2 12 13 15 10
3 11 14 15 10
4 19 6 21 4
200 1 4 21 8 17
2 3 22 7 18
3 9 16 9 16
4 10 15 12 13
100 1 3 22 5 20
2 0 25 7 18
3 4 21 1 24
4 1 24 4 21
50 1 1 24 1 24
2 0 25 0 25
3 0 25 4 21
4 1 24 2 23
10 1 0 25 0 25
2 0 25 0 25
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
113
ANEXO B.IX. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Determinación de la dosis letal media (DL50) de extractos y fracciones contra larvas de mosquito en el laboratorio. Bioensayos III. Argemone mexicana.
No. experimento : _3_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 11/Dic/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: Ext. orgánico de AcoEt Temperatura: ___23°C____ Humedad: ____43%____
Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto temprano
Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: ____Susceptibles a insecticidas________
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: __Alimento para ratones________
Fecha de preparación de la solución stock: ___________11 de diciembre de 2012_______________
24 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
250 1 17 8 23 2
2 5 20 23 2
3 3 22 21 4
4 10 15 23 2
200 1 3 22 24 1
2 5 20 24 1
3 8 17 23 2
4 8 17 24 1
100 1 10 15 12 13
2 8 7 12 13
3 12 13 17 8
4 1 24 7 18
50 1 3 22 2 23
2 2 23 4 21
3 2 23 2 23
4 2 23 5 20
10 1 2 23 2 2
2 0 25 0 0
3 0 25 0 0
4 0 25 0 0
114
ANEXO B.X. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Determinación de la dosis letal media (DL50) de extractos y fracciones contra larvas de mosquito en el laboratorio. Bioensayos III. Argemone mexicana.
No. experimento : _3_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 11/Dic/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: _Fracción metanólica_ Temperatura: ___23°C____ Humedad: ____43%____
Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto temprano
Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: ________Susceptibles a insecticidas______
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: __Alimento para ratones________
Fecha de preparación de la solución stock: _______________11 de diciembre de 2012__________
24 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
250 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
200 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
100 1 20 5 23 2
2 19 6 20 5
3 21 4 23 2
4 22 3 23 2
50 1 16 9 16 9
2 9 16 12 13
3 16 9 17 8
4 12 13 15 10
10 1 15 10 21 4
2 7 18 8 17
3 13 12 14 11
4 6 19 8 17
115
ANEXO B.XI. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Determinación de la dosis letal media (DL50) de extractos y fracciones contra larvas de mosquito en el laboratorio. Bioensayos III. Argemone mexicana.
No. experimento : _3_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 11/Dic/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: ___Fracción I‐II___ Temperatura: ___23°C___ Humedad: _____43%___
Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto temprano
Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: ___Susceptibles a insecticidas_____
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: _____Alimento para ratones_____
Fecha de preparación de la solución stock: ___________11 de diciembre de 2012______________
24 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 21 4 25 0
2 23 2 25 0
3 25 0 25 0
4 23 2 25 0
250 1 18 7 20 5
2 13 12 20 5
3 12 13 23 2
4 11 14 22 3
200 1 11 14 19 6
2 9 16 16 9
3 10 15 15 10
4 7 18 18 7
100 1 2 23 3 22
2 1 24 2 23
3 2 23 4 21
4 0 25 3 22
50 1 0 25 0 25
2 0 25 0 25
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
10 1 0 25 0 25
2 0 25 0 25
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
116
ANEXO B.XII. FORMATO DE REGISTRO DE DATOS
Determinación de la dosis letal media (DL50) de extractos y fracciones contra larvas de mosquito en el laboratorio. Bioensayos III. Argemone mexicana.
No. experimento : _3_ Lugar: Lab. de resistencia a insecticidas CRINSP/INSP Fecha: 11/Dic/2012
Investigador: _________Fabian Mendoza Hernández____________ Tratamiento: ___Fracción I‐III__ Temperatura: ___23°C____ Humedad: ____43%____
Especie: __Aedes aegypti__ Larvas instar: Tercero tardío‐cuarto temprano
Larvas/vaso: _25_
Tipo de larvas: ________Susceptibles a insecticidas________
Agua: _Destilada__ Volumen de agua: 99 ml Comida: __Alimento para ratones________
Fecha de preparación de la solución stock: ____________11 de diciembre de 2012_______________
24 h 48 h
Concentración (ppm)
Réplica Muertas Vivas Muertas Vivas
500 1 25 0 25 0
2 25 0 25 0
3 25 0 25 0
4 25 0 25 0
250 1 17 8 20 5
2 18 7 23 2
3 18 7 24 1
4 14 11 25 0
200 1 13 12 23 2
2 11 14 23 2
3 14 11 20 5
4 11 14 21 4
100 1 4 21 4 21
2 7 18 8 17
3 4 21 7 18
4 2 23 3 22
50 1 0 25 0 25
2 0 25 0 25
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
10 1 0 25 0 25
2 0 25 0 25
3 0 25 0 25
4 0 25 0 25
117
ANEXO C. DETERMINACIÓN DE LOS EXTRACTOS ORGÁNICOS Y FRACCIONES MÁS EFICACES
A continuación se detalla el análisis estadístico realizado en el programa SPSS v. 20
para determinar los extractos orgánicos y fracciones más eficaces contra las larvas de Ae.
aegypti resistentes a insecticidas. Este análisis además sirvió para delimitar el número de
tratamientos a evaluar en el Bioensayo II.
Debido a que en este primer bioensayo el objetivo era determinar el tratamiento que
fuera capaz de combatir al mayor porcentaje de larvas en el menor tiempo posible,
nuestra variable de interés fue el tiempo (variable dependiente).
El análisis estadístico que a continuación se describe es el mismo para extractos
orgánicos y fracciones de las semillas de A. mexicana y A. platyceras.
C.1. Comparación de medias. Análisis de varianza (ANOVA).
Este análisis nos ayuda a comprobar si existen diferencias entre las medias de dos o
más grupos.
Cuando en el análisis de varianza se halla una diferencia significativa entre las medias
de varios grupos quiere decir que hay diferencia entre al menos dos de las medias, pero
no se indica entre qué medias hay diferencias.
En el ANOVA es posible plantear una hipótesis (prueba de hipótesis) en donde lo que
se desea corroborar o rechazar es si las medias de los grupos en estudio son
significativamente iguales o al menos, existe un par de ellas que no lo son, la hipótesis
nula a contrastar es la siguiente:
Ho: µ1 = µ2 = ……. = µn vs Ha: µi ≠ µj al menos para un par (i, j) i ≠ j
Donde:
Ho = hipótesis nula, que señala la igualdad de los dos grupos. Es decir, la no
existencia de diferencia estadística significativa.
Ha = hipótesis alternativa, que señala la existencia de una diferencia
estadísticamente significativa al comparar los grupos.
µ1, µ2, …, µn = medias de los grupos 1, 2 hasta n.
118
µi, µj = media del grupo i, j.
La teoría estadística establece que si el valor observado es menor que el valor
crítico, entonces se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa.
Para el caso de los extractos orgánicos de la semilla de Argemone platyceras para
el Bioensayo I, deseamos saber el tiempo en que estos extractos presentan su efecto
tóxico contra las larvas de Aedes aegypti, con el ANOVA conoceremos si los extractos
tienen o no diferente efecto tóxico sobre las larvas, es decir, si estadísticamente hablando
los extractos difieren entre sí en sus efectos tóxicos respecto al tiempo. Por lo tanto, la
hipótesis nula es la igualdad de medias (mismo tiempo promedio de acción de los
extractos) y la hipótesis alternativa la existencia de al menos un extracto con diferente
tiempo promedio de acción sobre las larvas.
Los datos se introdujeron en 3 columnas (variables) dentro del programa SPSS de la
siguiente manera:
Figura C.1. Ventana de datos de SPSS v. 20.
119
Dónde:
Tratamiento = 1 = extracto orgánico de hexano,
2 = extracto orgánico de acetato de etilo,
3 = extracto orgánico de acetona,
4 = extracto orgánico de metanol.
Repeticiones = número de réplicas por tratamiento (1, 2 y 3).
Hora = hora de conteo de larvas muertas (6, 12, 18, 24, 30, 36 o 48).
El primer cálculo que se hace es el cálculo de las medias de los tiempos de los
cuatro extractos orgánicos en que son tóxicos para las larvas. Por lo que de la barra de
herramientas del programa se selecciona la opción Analizar, seguida de Comparar medias
y finalmente Medias. De la ventana que se despliega se selecciona en Lista de
dependientes la variable Hora y en Lista de independientes la variable Tratamiento. En
Opciones se selecciona Media y por último Aceptar.
De la ventana de Resultados se despliega una tabla como la siguiente:
Tabla C.1. Resumen de datos procesados
Casos
Incluidos Excluidos Totales
N Porcentaje N Porcentaje N Porcentaje
Hora*Tratamiento 300 100% 0 0% 300 100%
La Tabla C.1 permite corroborar que todos los datos han sido incluidos (100% de
porcentaje de datos Incluidos) en el cálculo de las medias de los tiempos de los extractos.
La segunda tabla que se presenta en la ventana de Resultados muestra las medias
calculadas. A continuación se presentan estos resultados:
120
Tabla C.2. Medias calculadas para los cuatro extractos orgánicos de la semilla de A. platyceras
Tratamiento Media N
Extracto orgánico de hexano 18.80 75 Extracto orgánico de AcOEt 16.48 75 Extracto orgánico de acetona 46.88 75 Extracto orgánico de MeOH 46.56 75
Variable dependiente: Hora
La Tabla C.2 indica el tiempo en promedio en que cada extracto orgánico es efectivo
contra las larvas de Ae. aegypti, así, el extracto orgánico de hexano es efectivo contra las
75 larvas expuestas en un tiempo promedio de 18.80 horas.
Conociendo los valores de las medias de los extractos, lo siguiente es realizar el
ANOVA para saber si hay diferencias en los resultados obtenidos.
De la barra de herramientas se selecciona la opción Analizar, Comparar medias y
ANOVA de un factor, se selecciona y transfiere la variable Hora al apartado
Dependientes, después se selecciona y se transfiere la variable Tratamiento al apartado
Factor, finalmente Aceptar.
En la ventana de Resultados se despliega una tabla como la Tabla C.3 correspondiente
al ANOVA, lo primero es observar el valor F que es el cociente de los valores de la media
cuadrática, se tiene que F(3, 296) = 447.248 y que p <= 0.000, esta probabilidad es menor
al nivel de significancia, es decir, 0.000 <= 0.05, se llega a la conclusión de que hay
diferencia significativa entre las medias de los tratamientos y, por lo tanto, se rechaza la
hipótesis nula de igualdad de medias entre los 4 tratamientos, es decir, los cuatro
extractos orgánicos tienen un efecto diferente sobre las larvas de Aedes aegypti respecto
al tiempo de exposición.
Tabla C.3. Análisis de Varianza (ANOVA) Hora
Suma de cuadrados
Gl Media
cuadrática F Sig.
Inter‐grupos 63629.160 3 21209.720 447.248 .000 Intra‐grupos 14037.120 296 47.423
Total 77666.280 299
121
C.2. Comparaciones múltiples post hoc
El estadístico F del análisis de varianza únicamente permite contrastar la hipótesis
general de que las n medias comparadas son o no iguales. Al rechazar esa hipótesis, como
en este caso, se sabe que las medias poblacionales comparadas no son iguales, pero no se
conoce dónde en concreto se encuentran tales diferencias.
Para saber qué media difiere de qué otra se utiliza un tipo particular de contrastes
denominados comparaciones múltiples post hoc o comparaciones a posteriori, en este
caso se emplearon para ello dos de las pruebas más utilizadas (Tukey y Games‐Howell).
El programa SPSS v. 20 permite realizar este tipo de análisis por lo que la manera
en que se puede realizar un contraste Post Hoc, es: del cuadro de diálogo de ANOVA,
seleccionar Post Hoc y en Asumiendo varianzas iguales seleccionar la prueba de Tukey, y
del apartado No asumiendo varianzas iguales seleccionar la prueba de Games‐Howell,
después presionar Continuar y finalmente Aceptar. Al realizar las dos pruebas se puede
corroborar si efectivamente existe diferencia en los tiempos de acción de los extractos
orgánicos.
La ventana de resultados extiende la Tabla siguiente:
122
Tabla C.4 Múltiples Comparaciones
Variable Dependiente: Hora
(I) Tratamiento (J) Tratamiento Mean Difference
(I-J)
Std. Error Sig. 95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
Tukey HSD 1 2 2.320 1.125 .168 -.59 5.23
3 -28.080* 1.125 .000 -30.99 -25.17
4 -27.760* 1.125 .000 -30.67 -24.85
2 1 -2.320 1.125 .168 -5.23 .59
3 -30.400* 1.125 .000 -33.31 -27.49
4 -30.080* 1.125 .000 -32.99 -27.17
3 1 28.080* 1.125 .000 25.17 30.99
2 30.400* 1.125 .000 27.49 33.31
4 .320 1.125 .992 -2.59 3.23
4 1 27.760* 1.125 .000 24.85 30.67
2 30.080* 1.125 .000 27.17 32.99
3 -.320 1.125 .992 -3.23 2.59
Games-Howell 1 2 2.320 1.281 .273 -1.02 5.66
3 -28.080* .911 .000 -30.45 -25.71
4 -27.760* .988 .000 -30.33 -25.19
2 1 -2.320 1.281 .273 -5.66 1.02
3 -30.400* 1.247 .000 -33.65 -27.15
4 -30.080* 1.303 .000 -33.47 -26.69
3 1 28.080* .911 .000 25.71 30.45
2 30.400* 1.247 .000 27.15 33.65
4 .320 .943 .986 -2.13 2.77
4 1 27.760* .988 .000 25.19 30.33
2 30.080* 1.303 .000 26.69 33.47
3 -.320 .943 .986 -2.77 2.13
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
En esta tabla de Comparaciones múltiples se visualizan todas las combinaciones
posibles de las medias de los tiempos en que los extractos son eficaces contra las larvas de
123
Aedes aegypti, también se observan las diferencias de las medias de cada dos grupos y el
nivel de significación. La tabla marca con un asterisco las parejas que son distintas.
Se puede comprobar por ambas pruebas utilizadas que, estadísticamente
hablando, tienen el mismo efecto el extracto de hexano y el de acetato de etilo. Lo mismo
ocurre con los extractos de acetona y metanol ya que de acuerdo al análisis estadístico
presentan un efecto tóxico similar sobre las larvas.
Finalmente de la ventana de resultados se obtiene la Tabla C.5 de Subconjuntos
homogéneos en donde se presenta una clasificación de los grupos que se basa en la
similaridad de grado de las medias entre el grupo de extractos orgánicos analizados, es
decir, se corroboran los pares de extractos estadísticamente similares entre sí.
Tabla C.5 Subconjuntos homogéneos
Subconjuntos para alfa = 0.05
Tukey HSD Tratamiento N 1 2
2 75 16.48
1 75 18.80
4 75 46.56
3 75 46.88
Sig. 0.168 0.992
124
ANEXO D. DETERMINACIÓN DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL50). ANÁLISIS PROBIT
En términos generales, un bioensayo puede ser definido como cualquier prueba
que involucra organismos vivos, a su vez se puede señalar como cualquier método por
medio del cual alguna propiedad de una sustancia o material, es medida en términos de la
respuesta biológica que produce. Los datos obtenidos de un bioensayo no pueden ser
analizados con la metodología estadística tradicional que se usa en los ensayos de campo
sino que se debe utilizar lo que se llama estadística cuantal, la cual se caracteriza por la
respuesta a un estímulo de n unidades experimentales, donde r unidades responden y n ‐
r no lo hacen. El principal objetivo de este tipo de análisis es evaluar el nivel de estímulo
que es necesario para obtener una respuesta en un grupo de individuos de la población. El
nivel de estímulo que causa una respuesta en el 50% de los individuos de una población
bajo estudio es un importante parámetro de caracterización denotado como DL50 por
dosis letal media (o DE50 por dosis efectiva media, CL50 por concentración letal media, CE50
por concentración efectiva media y Ltm por límite de tolerancia media). El periodo de
tiempo durante el cual se expone el estímulo debe ser especificado, por ejemplo, 24 horas
DL50, esto con el fin comparar y estimar la potencia relativa del estímulo.
La determinación de la DL50, se utiliza para encontrar umbrales de toxicidad para
determinadas sustancias; en el desarrollo de insecticidas se utiliza para determinar los
límites de resistencia de insectos, por ejemplo, ante ciertos biocidas.
La determinación de la DL50 requiere de la estadística cuantal, para lo cual es
necesario transformar los valores de respuesta obtenidos en unidades Anglit, Logit o
Probit y las dosis suministradas en unidades logarítmicas conocidas como dosis
metamétricas.
Para la determinación de la DL50 de los extractos orgánicos y fracciones de las
semillas de A. mexicana y A. platyceras se empleó el método Probit con el programa
estadístico SPSS v. 20. La regresión Probit consiste en un tipo particular de regresión lineal
que se construye con el objetivo de conocer la relación que existe entre una variable
independiente (la concentración del extracto/fracción) y una variable dependiente (la
respuesta = mortalidad) para una especie y una exposición determinada (24, 48 o 96 h).
Para ello la respuesta acumulada de los organismos (mortalidad) se transforma a unidades
Probit (eje Y) y la concentración del tóxico se transforma logarítmicamente (eje X). El
resultado es una recta en la cual se pueden interpolar el 50% de respuesta y conocer qué
concentración del tóxico causa esa respuesta.
125
Para calcular la DL50 es necesario realizar una regresión concentración – respuesta.
Si se representa la mortalidad acumulada en % (en el eje Y) y la concentración en el eje X
(log transformado) de los datos lo que se obtiene es una respuesta de tipo sigmoidal.
El objetivo principal de la transformación Probit es hacer lineal la relación entre
dosis – respuesta. La transformación Probit procede de la Normal Equivalent Deviation
(NED), que es la proporción de la mortalidad expresada en unidades de desviación
estándar de la media de una curva normal.
A continuación se presenta, a manera de ejemplo, la determinación de la DL50 a 24
horas para la Fracción metanólica (proveniente del extracto orgánico de hexano) de la
semilla de A. mexicana sobre larvas de Ae. aegypti susceptibles a insecticidas. La
secuencia en la determinación de la DL50 es la misma tanto para extractos orgánicos como
fracciones de ambas plantas. SPSS v.20 proporciona las dosis necesarias del material
evaluado para ser efectivo sobre un porcentaje de población que va desde el 1% hasta el
99%.
En primera instancia se introducen los datos dentro de la ventana de datos de SPSS
de la siguiente manera:
Figura D.1. Ventana de datos de SPSS v.20.
126
Donde:
Concentración = concentraciones empleadas para cada réplica de cada extracto y
fracción (500, 250, 200, 100, 50 y 10 ppm).
Larvas = número de larvas empleadas en cada réplica (25).
Muertas = número de larvas muertas al tiempo de post‐exposición (24 o 48 h).
El siguiente paso es realizar el cálculo de la DL50 por lo que de la barra de
herramientas se selecciona la opción Analizar, posteriormente Regresión y Probit. Del
cuadro de diálogo que se despliega se selecciona y transfiere la variable Concentración al
apartado Covariables, en Frecuencia de respuesta se transfiere la variable Muertas y en
Total observado a la variable Larvas. A continuación, del botón Opciones se determina el
valor de Nivel de significación para el uso del factor de heterogeneidad, en este caso fue
de 0.05, en Tasa de respuesta natural se selección la opción Calcular a partir de los datos
que se introdujeron en el programa y finalmente se selecciona Continuar.
En el apartado de Covariables en Transformar se elige Log de base 10 (para
homogeneizar los valores de la concentración a valores probit). Y por último se escoge el
tipo de modelo de regresión que se desea utilizar para determinar la DL50, en este caso se
eligió el modelo Probit.
De las tablas que despliega la ventana de resultados se encuentra la del Contraste
de Chi‐cuadrado (Tabla D.1), donde se presenta la prueba de bondad de ajuste:
El contraste de la bondad de ajuste de Pearson (18.367) mediante la hipótesis:
Ho: el modelo está bien ajustado (P > 0.05).
Ha: el ajuste del modelo no es bueno (P < 0.05).
Como P = 0.626 > 0.05, permite concluir que no hay razones para dudar del
modelo, es decir, se presenta un buen ajuste del modelo Probit.
127
Tabla D.1. Contraste de Chi cuadrado
Probit Contraste de la bondad de ajuste de Pearson
Chi‐ cuadrado glb Sig.
18.367 21 0.626a a. Como el nivel de significación es mayor que 0.05, no se utiliza un factor de heterogeneidad en el
cálculo de los límites de confianza.
b. Los estadísticos basados en casos individuales difieren de los estadísticos basados en casos
agregados.
Igualmente se presenta la Tabla D.2 dentro de la ventana de resultados con el
porcentaje de larvas que se desea combatir así como la dosis estimada necesaria para
combatir dicho porcentaje de la población de larvas. La tabla también presenta los límites
de confianza al 95% de probabilidad para los valores de cada una de las dosis estimadas.
El valor de la DL50 corresponde a una dosis de 80.635 ppm, es decir, para alcanzar un 50% de mortalidad en los insectos es necesaria una dosis de 80.635 ppm de la Fracción metanólica de la semilla de A. mexicana.
Debido a que le modelo de regresión siempre tiene asociado un grado de
incertidumbre, el valor de DL50 tiene asociado unos límites de confianza, que normalmente se expresan al 95%, es decir, hay un 95% de probabilidades que los valores encontrados de dosis letales se encuentren dentro de ese intervalo.
128
Probabilidad Límites de confianza al 95% para Concentración Límites de confianza al 95% para log(Concentración)a
Estimación Límite inferior Límite superior Estimación Límite inferior Límite superior
PROBIT .010 34.388 4.508 55.462 1.536 .654 1.744
.020 37.999 5.880 59.046 1.580 .769 1.771
.030 40.485 6.958 61.446 1.607 .842 1.788
.040 42.461 7.897 63.320 1.628 .897 1.802
.050 44.140 8.754 64.889 1.645 .942 1.812
.060 45.621 9.555 66.259 1.659 .980 1.821
.070 46.960 10.317 67.486 1.672 1.014 1.829
.080 48.192 11.051 68.605 1.683 1.043 1.836
.090 49.341 11.763 69.642 1.693 1.071 1.843
.100 50.423 12.459 70.611 1.703 1.095 1.849
.150 55.160 15.801 74.793 1.742 1.199 1.874
.200 59.241 19.077 78.326 1.773 1.281 1.894
.250 62.981 22.416 81.522 1.799 1.351 1.911
.300 66.541 25.898 84.539 1.823 1.413 1.927
.350 70.019 29.592 87.474 1.845 1.471 1.942
.400 73.488 33.565 90.401 1.866 1.526 1.956
.450 77.007 37.893 93.387 1.887 1.579 1.970
.500 80.635 42.660 96.501 1.907 1.630 1.985
.550 84.434 47.975 99.829 1.927 1.681 1.999
.600 88.477 53.969 103.491 1.947 1.732 2.015
.650 92.859 60.807 107.673 1.968 1.784 2.032
.700 97.713 68.685 112.702 1.990 1.837 2.052
.750 103.236 77.795 119.215 2.014 1.891 2.076
.800 109.755 88.204 128.587 2.040 1.945 2.109
.850 117.874 99.629 143.939 2.071 1.998 2.158
.900 128.948 111.734 172.411 2.110 2.048 2.237
.910 131.775 114.309 180.980 2.120 2.058 2.258
.920 134.917 116.993 191.066 2.130 2.068 2.281
.930 138.458 119.836 203.115 2.141 2.079 2.308
.940 142.523 122.906 217.801 2.154 2.090 2.338
.950 147.304 126.311 236.211 2.168 2.101 2.373
.960 153.128 130.225 260.249 2.185 2.115 2.415
.970 160.603 134.972 293.685 2.206 2.130 2.468
.980 171.108 141.260 345.585 2.233 2.150 2.539
129
ANEXO E. REACTIVOS PARA PRUEBAS FITOQUÍMICAS
Soluciones empleadas en la determinación de grupos de metabolitos secundarios de
manera preliminar.
Solución A
Solución 1: se disolvieron 1.7 g de subnitrato de bismuto y 20 g de ácido tartárico
en 80 ml de agua. Solución 2: se disolvieron 16 g de yoduro de potasio en 40 ml de agua.
Se mezclaron partes iguales de ambas soluciones y se rociaron las placas con esta nueva
solución.
Solución B
Solución 1: Cloruro férrico (Sigma Aldrich, 97% pureza) 0.1 M. Solución 2:
Ferrocianuro de potasio (Sigma Aldrich) 0.1 M. Se preparó una mezcla 1:1 de la solución 1
con la solución 2. Las placas se calentaron a 110°C después de ser rociadas con la solución.
Solución C
Se preparó una solución de 5 g de ácido bórico (Sigma Aldrich) y 5 g de ácido cítrico
(Sigma Aldrich) en 100 ml de etanol. Las placas fueron rociadas con la solución, se
calentaron a 100°C durante 5 minutos y se observaron a la luz UV.
Solución D
Solución 1: Ácido sulfúrico (J. T. Baker, 98.3% de pureza) al 5% en etanol (J. T.
Baker, 99.7% pureza). Solución 2: Vainillina (Sigma Aldrich, 99% pureza) al 1% en etanol.
Se rociaron las placas con la solución 1, a continuación con la solución 2 y se calentaron a
110°C de 5 a 10 minutos.
Solución E
Se preparó una solución de hidróxido de sodio (Sigma Aldrich, >98% de pureza) al
5% en agua. Las placas fueron rociadas con la solución y se calentaron.
Solución F
Se preparó una solución de hidróxido de potasio (Sigma Aldrich, 90% de pureza) al
5% en etanol. Las placas se rociaron con la solución.
