EVALUACIÓN DE UN PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN Y DE …biblio3.url.edu.gt/Tesis/2012/06/14/Ayala-Jose.pdf · en el medio murashige skoog (1962), para generaciÓn in vitro de callo a

UNIVERSIDAD RAFAEL LANDÍVAR FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y AGRÍCOLAS

LICENCIATURA EN CIENCIAS AGRICOLAS CON ÉNFASIS EN GERENCIA AGRÍCOLA

EVALUACIÓN DE UN PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN Y DE CUATRO REGULADORES DE CRECIMIENTO

EN EL MEDIO MURASHIGE SKOOG (1962), PARA GENERACIÓN IN VITRO DE CALLO A PARTIR

DE HOJA DE GERBERA (Gerbera jamesonii)

TESIS

JOSÉ ALEJANDRO AYALA CORDÓN Carné: 13011-02

Guatemala, marzo de 2012 Campus Central

UNIVERSIDAD RAFAEL LANDÍVAR FACULTAD DECIENCIAS AMBIENTALES Y AGRÍCOLAS

LICENCIATURA EN CIENCIAS AGRICOLAS CON ÉNFASIS EN GERENCIA AGRÍCOLA

EVALUACIÓN DE UN PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN Y DE CUATRO REGULADORES DE CRECIMIENTO EN EL MEDIO MURASHIGE SKOOG (1962), PARAGENERACIÓN IN VITRO DE CALLO A PARTIR DE

HOJA DE GERBERA (Gerbera jamesonii)

TESIS

Presentada al Honorable Consejo de laFacultad de Ciencias Ambientales y

Agrícolas

Por:

JOSÉ ALEJANDRO AYALA CORDÓN Carné: 13011-02

PREVIO A CONFERÍRSELE, EN EL GRADO ACADÉMICO DE LICENCIADO EL TÍTULO DE

INGENIERO AGRÓNOMO CON ENFASIS EN GERENCIA AGRÍCOLA

Guatemala, marzo de 2012Campus Central

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD RAFAEL LANDÍVAR

RECTOR: P. Rolando Enrique Alvarado López, S.J. VICERRECTORA ACADEMICA: Dra. Marta Lucrecia Méndez González de

Penedo VICERRECTOR DE INVESTIGACION Y PROYECCION: P. Carlos Rafael Cabarrús Pellecer, S.J. VICERRECTOR DE INTEGRACION UNIVERSITARIA: P. Eduardo Valdés Barría, S.J. VICERRECTOR ADMINISTRATIVO: Lic. Ariel Rivera Irías SECRETARIA GENERAL: Licda. Fabiola Padilla Beltranena AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y AGRÍCOLAS DECANO: Dr. Marco Antonio Arévalo Guerra VICEDECANO: Ing. Miguel Eduardo García Turnil, MSc SECRETARIA: Inga. María Regina Castañeda Fuentes DIRECTOR DE CARRERA: Licda. Anna Cristina Bailey Hernández, MA

NOMBRE DEL ASESOR DE TESIS

Ing. Julio Roberto Garcia Moran, MA

TRIBUNAL QUE PRACTICÓ LA DEFENSA PRIVADA

Licda. Anna Cristina Bailey Hernández, MA Ing. Harry Florencia de Mata Mendizábal

Ing. Hector Alfredo Sagastume Mena

AGRADECIMIENTOS

A:

Dios, mi Padre Celestial por darme la sabiduría y la oportunidad de realizarme

para tener una mejor vida.

Mi familia Ayala Cordón, por su apoyo incondicional.

Mis padres Mario Rubén Ayala Vásquez y Blanca Iris Cordón de Ayala, por

enseñarme a valorar el estudio.

La Universidad Rafael Landivar Campus Central, lugar donde me impartieron

los conocimientos de mi Carrera Profesional.

Ing. Edgar Escobar y Luis Cerrate por su apoyo incondicional en la realización

del estudio.

Ing. Julio Roberto Garcia Morán, MA por su apoyo y asesoría en el proyecto

de tesis.

Mis compañeros por proporcionarme su ayuda y todos los momentos

compartidos.

DEDICATORIA

A:

Dios: Mi Padre Celestial por darme la vida, y quien me deja seguir

progresando tanto en lo temporal como en lo espiritual.

Mis Padres: Mario Rubén Ayala Vásquez y Blanca Iris Cordón de Ayala, por

enseñarme a vencer los obstáculos que encontramos en la vida

y a valorar el estudio y el sagrado trabajo.

Hermanos: Mario Ruben Ayala Cordón, Luis Alexi Ayala Cordón, Francisco

Jorge Ricardo Ayala Cordón, Luis Arturo Ayala Cordón e Iris

Ashley Alejandra Ayala Cordón, por sus consejos, apoyo

incondicional y comprensión durante el transcurso de mi carrera.

Mis amigos: Por su apoyo, consejos y gratos recuerdos que compartí con

todos.

INDICE GENERAL

RESUMEN i SUMMARY ii

I. INTRODUCCION 1

II. MARCO TEORICO 3

2.1. Descripción del cultivo de gerbera 3

2.2. Origen de cultivo de gerbera 4

2.3. Clasificación taxonómica 4

2.4. Importancia del cultivo 4

2.5. Formas de reproducción 6

2.5.1. Propagación por semilla 6

2.5.2. Propagación vegetativa 7

2.5.3. Cultivo de tejidos 7

2.6. Fases del cultivo de tejidos 9

2.6.1. Preparación de la planta madre 9

2.6.2. Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia 10

2.6.3. Cultivo in vitro de callo 10

2.6.4. Multiplicación de los brotes 11

2.7. Explantes 11

2.8. Medios de cultivo 12

2.9 Reguladores de Crecimiento 13

2.9.1. Auxinas 13

2.9.2. Citocininas 15

2.10. Mercados 14

2.11. Trabajos realizados sobre micropropagación de Gerbera 15

III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 18

3.1. Problema y justificación 18

IV. OBJETIVOS 19

4.1. Objetivo general 19

4.2. Objetivos específicos 19

V. HIPOTESIS 20

VI. METODOLOGIA 21

6.1. Localización del trabajo 21

6.2. Material experimental 21

6.3. Factores estudiados 21

6.3.1. Protocolo de desinfección 21

6.3.2. Evaluación de medios 21

6.4. Descripción de los tratamientos 21


6.4.2. Evaluación de suplementos al medio de cultivo 22

6.5. Diseño experimental 22

6.6. Modelo estadístico 22

6.7. Unidad experimental 23

6.8. Croquis de campo 23

6.9. Manejo del experimento 24

6.9.1. Preparación de las plantas 24

6.9.2. Preparación de soluciones madre 24

6.9.3. Elaboración del medio de cultivo 24

6.9.4. Esterilización de equipo 25

6.9.5. Siembra 25

6.9.6. Desinfección de explantes 25

6.9.7. Almacenamiento de frascos con medio 28

6.10. Variables de respuesta 28


6.10.2. Evaluación de medios 29

6.11. Análisis de la información 29

6.11.1. Análisis estadístico 29

VII. RESULTADOS Y DISCUSION 30

7.1. Protocolo de desinfección 30

7.1.1. Contaminación de los medios 30

7.1.2 Sobrevivencia de explantes 31

7.2. Evaluación de reguladores de crecimiento 32

7.2.1 Contaminación 33 7.2.2 Sobrevivencia 33

7.2.3 Formación de callo 34

VIII. CONCLUSIONES 36

IX. RECOMENDACIONES 37

X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 38

XI. ANEXOS 41

INDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Tratamientos para desinfección de explantes de

G. jamesonii con hipoclorito de sodio al 1%. 22

Cuadro 2. Tratamientos para la formación de callo

en explante de G. jamesonii. 22

Cuadro 3. Resultados obtenidos en las variables contaminación y

sobrevivencia de explantes en las pruebas realizadas para establecer

el protocolo de desinfección. 30

Cuadro 4. Resultados obtenidos de la evaluación de los complementos

al medio MS para la formación de callo en hoja de Gerbera. 32

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Diagrama de la unidad experimental. 23

Figura 2. Croquis de evaluación de protocolo de desinfección 23

Figura 3. Croquis evaluación de medios 24

Figura 4. Tratamiento de medio MS completo 33

Figura 5. Formación de callo en medio MS suplementado con ANA 33

Figura 6. Tratamiento de medio MS suplementado con sulfato de adenina 33

Figura 7. Porcentaje de contaminación obtenido en los tiempos de inmersión

de explantes de Gerbera (Gerbera jamesonni) en hipoclorito de sodio al 1%. 46

Figura 8. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de gerbera

(Gerbera jamesonii) evaluados en los tiempos de inmersión en hipoclorito

De sodio al 1%. 46

Figura 9. Porcentaje de contaminación de los explantes de gerbera

(Gerbera jamesonii) evaluado en medio de cultivo MS con diferentes

Concentraciones de hormonas. 47

Figura 10. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de gerbera

(Gerbera jamesonii) evaluados en medio de cultico MS con diferentes


Figura 11. Porcentaje de formación de callo de los explantes de gerbera



EVALUACIÓN DE UN PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN Y DE CUATRO REGULADORES DE CRECIMIENTO EN EL MEDIO MURASHIGE SKOOG (1962),

PARA GENERACIÓN IN VITRO DE CALLO A PARTIR DE HOJA DE GERBERA (Gerbera jamesonii)

RESUMEN

El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Biotecnología de la Universidad Rafael Landívar, Guatemala. Tuvo como objetivo evaluar diferentes tiempos de inmersión de explantes de gerbera en hipoclorito de sodio al 1% y cuatro diferentes reguladores de crecimiento para el desarrollo de callo in vitro. Para cada estudio se utilizó diseño completamente al azar con cuatro tratamientos con 15 repeticiones en el protocolo de desinfección y tres tratamientos con 30 repeticiones en la evaluación de los reguladores de crecimiento. El mejor tratamiento para establecer el protocolo de desinfección fue la inmersión al hipoclorito de sodio al 1% durante 20 minutos brindando 45% de contaminación y donde la variable sobrevivencia brindó un mayor porcentaje (96%). En la evaluación de reguladores de crecimiento se obtuvo que el mejor tratamiento fue el medio MS + 2.5 mg/L ANA y el Medio MS + 40 mg/L de sulfato de adenina + 0.5 mg/L de AIA + 1 mg/L de BA con un porcentaje de 68.30% en la generación de callo. No se observaron diferencias significativas en la sobrevivencia de los explantes. Se recomienda sumergir en hipoclorito de sodio al 1% durante 20 minutos espaciados en tres intervalos (5, 10 y 5 minutos), después de cada intervalo se debe lavar tres veces con agua destilada como parte del proceso de desinfección; además, utilizar el regulador de crecimiento ANA en una concentración de 2.5 mg/L en el medio MS.

i

EVALUATION OF A DESINFECTION PROTOCOL AND FOUR GROWTH

REGULATORS IN THE MEDIUM Murashige Skoog (1962) FOR in vitro

GENERATION OF CALLUS, FROM GERBERA LEAF (Gerbera jamesonii)

SUMMARY

The present work was carried out in the Laboratory of Biotechnology of Universidad

Rafael Landivar, Guatemala and the objective was to evaluate different times of

immersion of explants of Gerbera in sodium hypochlorite 1% and four differents

growth regulators for the development of callus in vitro. For each study a complete

randomized desing was used with 4 treatments and 15 replicates in the desinfection

protocol and 3 treatments with 30 replicates in the evaluation of growth regulators.

The best treatment to determine the desinfection protocol was the immersion in

sodium hypochlorite 1% for 20 minutes, providing 45% of contamination and where

the variable survival gave a higher percentage (96%). In the evaluation of growth

regulators was obtained that the best treatment was MS médium + 2.5 mg/L of NAA

and MS médium + 40 mg/L of adenine sulfate + 0.5 mg/L of IAA + 1 mg/L of BA with

a percentage of 68.30% in the generation of callus. There were no significant

differences in the survival of the explants. It was recommended immerse in sodium

hypochlorite 1% during 20 minutes in three spaced intervals (5, 10 and 5 minutes),

after each interval should be washed three times with distilled water as part of the

desinfection process; also use the growth regulator NAA at concentration of 2.5 mg/L

in the MS medium.

ii

1

I. INTRODUCCION

El cultivo de tejidos es una técnica que fue desarrollada a partir de la

investigación de distintos laboratorios botánicos y fisiólogos vegetales desde

1950, en esta época se introdujo el término clon y fue aplicado a las plantas

propagadas vegetativamente, las cuales en su mayoría mantienen las mismas

características genotípicas y fenotípicas ya que a veces ocurren mutaciones y

cambios epigenéticos derivadas del cultivo in vitro que se evidencian con

cambios fenotípicos. La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen

a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo

vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de

microbiología por las cuales los microorganismos se ponen a crecer en

medios estériles para reproducirlos e identificarlos. Por medio de esta técnica

las plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número,

teniendo un crecimiento individual controlado, a través del cultivo de pequeños

trozos de tejido vegetal sobre un medio específico con nutrientes en un

recipiente estéril (Morgan, 2009).

Guatemala es muy conocida como tierra de flores debido a la diversidad de

ornamentales producidas dentro del país y que al mismo tiempo son

exportadas a Europa, Estados Unidos y Centro América, estas son producidas

en distintos departamentos del país, principalmente en el departamento de

Guatemala; alrededor de medio millón de plantas son exportadas. Este sector

es muy competitivo con otros países que producen la misma calidad de flores

como los son Colombia, Holanda y Ecuador (Morgan, 2009).

La gerbera (Gerbera jamesonii) es un cultivo exótico, en Guatemala se cuenta

con 40 variedades, las cuales han ganado espacio en el mercado de las

flores de corte y ornamentales, por la altura del tallo, el diámetro de flor, y por

su larga duración en floreros. La gerbera es un cultivo que se vuelve

complicado para exportar ya que los métodos de producción convencional no

permiten la producción de éstas en grandes cantidades (Morgan, 2009).

2

Con el presente trabajo se pretende desarrollar un protocolo de desinfección

para explantes en cultivo in vitro de G. jamesonii, así como también evaluar

cuatro suplementos hormonales para mejorar la producción de callos de

gerbera (Morgan, 2009).

3

II. MARCO TEORICO

2.1. Descripción del cultivo de gerbera

La gerbera (Gerbera jamesonii) pertenece a la familia Asteraceae. Es una

planta herbácea, en roseta, cuyo cultivo puede durar varios años, aunque

comercialmente solo se mantiene por dos o tres años el sistema radicular es

pivotante de origen, pero a medida que se desarrolla, se convierte en

fasciculado y está compuesto por gruesas raíces (Cultivo de Gerbera, 2004).

Las hojas tienen forma de roseta, son alargadas de unos 40 cm y ligeramente

hendidas en los bordes; del pecíolo de algunas de ellas evolucionan los brotes

florales, que van a desarrollar unos vástagos o pedúnculos con una

inflorescencia terminal en capítulo. El pedúnculo puede ser de distintos

grosores, y su longitud depende del cultivar y de las condiciones

medioambientales existentes (Cultivo de Gerbera, 2004).

El tallo forma una “corona” superficialmente enterrada, ramificada con rizomas

breves, de crecimiento definido, simpodial. La yema apical del tallo

subterráneo origina una inflorescencia y el rizoma continúa creciendo en

forma dicotómica por la acción de yemas laterales. En las yemas apicales se

forman tallos aéreos, muy compactos, con hojas en rosetas cuyo ápice

termina en una inflorescencia. Las yemas de otras hojas del tallo también dan

inflorescencias. Luego continúa la brotación de yemas laterales, de los nudos

del rizoma, dando brotes similares al de la yema apical (Salomón, 1978).

La raíz presenta un sistema fasciculado compuesto por numerosas raíces

gruesas de las que parten finas raicillas. De los rizomas nacen numerosas

raíces adventicias. Estas son fasciculadas (dispuestas en haz o manojo)

(Cultivo de Gerbera, 2004).

El capitulo floral está formado, desde el exterior hacia el interior, por varias

filas concéntricas de flores femeninas liguladas, normalmente una fila de flores

hermafroditas no funcionales, y colocándose en el centro, las flores

4

masculinas. Las flores liguladas son de forma y espesor variables y amplia

gama de colores (Cultivo de Gerbera, 2004).

2.2. Origen del cultivo de gerbera

La gerbera es originaria de Transvaal (Africa del Sur); también se conoce

como margarita del Transvaal. La gerbera lleva el nombre de Trangott Gerber,

un médico alemán que coleccionó muchas plantas, sobre todo en la península

danesa de Jutlandia (abcAgro, 2002).

Las variedades de cultivo comercial proceden de hibridaciones con especies

del sur de Africa (Gerbera jamesonii y G. viridifolia), donde el clima es tropical

de montaña. El nombre científico viene dado por un coleccionador de plantas

llamado Jameson, quien descubrió la gerbera en Transvaal (abcAgro, 2002).

2.3. Clasificación Taxonómica de Gerbera (Font, 1973)

REINO: Plantae

SUBREINO: Embryobionta

DIVISION: Anthophyta (angiospermas)

CLASE: Monocotiledonea

ORDEN: Liliopsida

FAMILIA: Asteraceae

GENERO: Gerbera

ESPECIE G. jamesonni

2.4. Importancia del Cultivo

En el cultivo de gerbera para la comercialización de flor cortada, la

importancia de la gerbera radica en que representa una flor ideal para

bouquets por la existencia de variedades de diferentes colores. También hay

que mencionar la importancia del cultivo industrial de la gerbera en maceta en

los últimos años (abcAgro, 2002).

5

A nivel mundial, los colores de las flores de gerbera más demandadas son:

rosa (incluye tonos fucsia, 40%), rojo (20%), amarillo (10%), blanco (10%),

naranja (10%) y otros. En función del tipo de inflorescencia, un 20 a 40 % de

los consumidores prefiere flores dobles, 20-40% prefiere las semidobles y del

30-60% las sencillas. Respecto al color de la parte central de la inflorescencia,

la demanda es del 20-30% para las flores de corazón negro y del 70-80% para

las de corazón verde (abcAgro, 2002).

Para comercializar las flores se emplean paneles especiales de cartón o

cálices de material plástico que impiden el roce de las lígulas entre ellas y con

las cajas que los contienen. El empaquetado de la flor es delicado y se

recomienda que se realice en la misma explotación para aquellas variedades

sensibles al roce.

El envasado se realiza en cajas de cartón de 12 cm de altura con capacidad

para 40 a 60 flores colocadas en dos paneles de cartón, con 20 a 30 flores

cada uno. También se comercializa en ramos de 10 flores, protegidos con

cálices de plástico (Cabrera, 2002).

Las cajas deben ser almacenadas boca abajo para evitar que los tallos se

tuerzan. La temperatura óptima de almacenamiento es de 2 a 8 ºC (Cabrera,

2002).

En el transporte de gerberas está el embalaje tipo "raqueta"; se trata de una

construcción de cartón con agujeros, por los cuales se meten los tallos,

teniendo su similitud con la de una raqueta. En una raqueta entran siete

gerberas; de esta manera las flores no se dañan. Este tipo de embalaje solo

se emplea en gerberas de primera categoría, las cuales se transportan en

este embalaje en agua. De este modo la calidad no se ve alterada.

En cuanto a los parámetros de calidad que sirven para la clasificación de la

flor, existen diversos criterios, aunque los más empleados son:

6

a) La longitud de la vara, medida desde la base del pedúnculo hasta la parte

superior del capítulo (abcAgro, 2002).

b) El diámetro del capítulo, que se refiere al número de centímetros

correspondientes al diámetro de la circunferencia que forman los extremos

exteriores de las lígulas de la inflorescencia (abcAgro, 2002).

c) Las especificaciones, que se refieren a las flores y a los tallos que deben

estar exentos de daños producidos por plagas y enfermedades que alteren su

aspecto y color, manchas o quemaduras producidas por productos

fitosanitarios, residuos visibles de tratamientos y magulladuras, defectos de

vegetación (lígulas torcidas), etc (abcAgro, 2002).

d) La tolerancia de calidad, que expresa el porcentaje de varas que pueden

presentar ligeros defectos, a condición de que la homogeneidad de la

presentación no se vea afectada (abcAgro, 2002).

e) La presentación de las flores en los envases descritos anteriormente, que

define las categorías extra, primera y segunda en función de la conservación

de los capítulos (abcAgro, 2002).

2.5. Formas de reproducción

2.5.1. Propagación por semilla

Este método de propagación se realiza para la mejora de esta planta, pero

también se emplea para la obtención de cultivares de gerbera para maceta.

Mediante este método se obtiene una disminución del vigor en la

autofecundación de esta especie por lo que hay que recurrir a

retrocruzamientos entre individuos bastantes alejados genotípicamente para

conseguir una gran cantidad de semilla y descendientes vigorosos (Cabrera,

2002).

7

Las condiciones climáticas son más favorables para el desarrollo del cultivo

ya que las condiciones son más controladas y se cuenta con una temperatura

ligeramente elevadas, de 22-24ºC y una humedad relativa entre el 40 y 50%.

Desde la polinización hasta la maduración de la semilla transcurren de 4 a 8

semanas, obteniéndose de 40 a 100 semillas por capítulo. El poder

germinativo se reduce al 50% después de tres meses a partir de la

polinización y al 5% después de seis meses (Cabrera, 2002).

2.5.2. Propagación vegetativa

Es el método más sencillo, pero comercialmente no se emplea por su baja

tasa de propagación. Para ello se arranca la planta adulta de más de un año,

podándose las raíces a una longitud de 10-12 cm, y seleccionando varias

hojas adultas cuyos limbos se recortan dejando un tercio de ellas.

Posteriormente se divide el rizoma en pequeñas porciones que contendrán

raíces y parte aérea. Estas porciones se desinfectan con un caldo fungicida

antes de su plantación y se colocan a continuación bajo mist-system a 25ºC o

bajo pequeños túneles de polietileno y se toman para el esquejado los brotes

que se desarrollen cuando tienen 2 a 3 hojas, los cuales se colocan en mesas

de multiplicación a 25ºC y humedad relativa del 80%. Se obtienen entre 4 y 10

plantas por cada planta madre. El enraizamiento se efectúa a los 15-20 días

(abcAgro, 2002).

2.5.3. Cultivo de Tejidos

Con la micropropagación se obtiene de una sola planta un gran número de

plántulas anualmente, comparándolo con el bajo número de plántulas que

permite obtener el método de propagación vegetativa mencionado

anteriormente. Se cultivan primero en tubos de ensayo y luego en frascos o

cajas de polypropyleno, fragmentos de capítulos muy jóvenes o meristemos.

Se obtienen plantas a los 3 ó 4 meses (Arévalo, 1995).

La expresión cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un

frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas

8

tiene dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes,

etc), y el control de los factores que afectan el crecimiento. El avance

alcanzado por las ciencias biológicas ha permitido en los últimos años el

estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular, y en

condiciones de laboratorio es posible actualmente reproducir todos los

factores que puedan incidir en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Este

principio general se aplica también al cultivo in vitro de plantas. Haberlandt, un

científico alemán, postuló a principios del siglo pasado que las plantas eran

capaces de reproducir su crecimiento a partir de células aisladas, originando

la hipótesis de la totipotencia celular en plantas. Sin embargo, este

investigador no pudo demostrar en forma práctica su hipótesis, debido a que

la mayoría de los componentes complejos que integran los medios de cultivo

actuales todavía no habían sido descubiertos. Sería recién en la década de

los ´50 cuando se determina la importancia del balance hormonal en las

plantas, con el descubrimiento de las hormonas vegetales más usadas en la

actualidad (Hurtado y Merino, 1988).

Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el

ambiente de la planta en la naturaleza es técnicamente muy complejo. Por

esa razón se realiza una simplificación de la realidad escogiendo aquellos

factores que se puedan mantener controlados. Cuando no se realiza el

estudio con todo el ser vivo sino con solamente una parte del mismo, se utiliza

el término explante para indicar la parte del órgano o tejido vegetal que se

cultiva in vitro (Arévalo, 1995).

A la dificultad de reproducir las condiciones naturales en condiciones de

laboratorio, se debe añadir en este caso la dificultad de suministrar al explante

todo aquello que antes obtenía del sistema completo. En resumen, el cultivo in

vitro de plantas es una técnica que exige un control específico del ambiente,

tanto físico como químico, en el que se sitúa al explante (Arévalo, 1995).

La micropropagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones más

generalizadas del cultivo in vitro, a través de la micro propagación, a partir de

un fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia

9

uniforme, con plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. El

explante más usado para los procesos de propagación in vitro son las yemas

vegetativas de las plantas. Los frascos que contienen las plantas se ubican en

estanterías con luz artificial dentro de la cámara de crecimiento, donde se fija

la temperatura en valores que oscilan entre los 25 y 28°C, además de

controlar la cantidad de horas de luz. Por su parte, el medio de cultivo se

compone de una mezcla de sales minerales, vitaminas reguladores de

crecimiento, azúcar, agua y agar. La composición del medio depende de la

especie vegetal y de la etapa del proceso de micropropagación (Arévalo,

1995).

Con finalidad descriptiva se puede clasificar los principales factores no

biológicos que afectaran al desarrollo del cultivo in vitro, así:

• Ambiente químico

• Composición del medio de cultivo

• pH

• Ambiente físico

• Temperatura

• Luz y fotoperiodo

• Humedad (Arévalo, 1995).

2.6. Fases del cultivo de tejidos

Según Rosell (1990), el proceso de cultivo de tejidos incluye seis fases que

son:

2.6.1. Preparación de la planta madre

Para establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener

explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para

obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre un

período de tiempo, que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en

un invernadero, en el que se va a intentar cultivar la planta en condiciones

10

sanitarias óptimas y con un control de la nutrición de la radiación recibida

(Rosell, 1990).

2.6.2. Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia

Una vez escogida la planta madre, se extraen los fragmentos a partir de los

cuales se obtendrá los explantes. Antes de extraer los explantes se hace una

desinfección de los fragmentos de la planta madre para eliminar los

contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe

mantener en condiciones de asepsia. Ya en condiciones de asepsia se

extraen los explantes del material vegetal y se colocan en cultivo dentro de

un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo, para poder controlar la

sanidad y la viabilidad de los explantes (Rosell, 1990).

2.6.3. Cultivo in vitro de callo

Se parte de un trozo de hoja o de tallo; bien de una planta madre de maceta o

de una planta que viene de cultivo in vitro. El medio puede ser sólido o liquido.

Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, o también

por embriones, que al unirse forman una estructura similar al embrión las

células vegetales que se desarrollan en condiciones asépticas sobre medios

de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando como

respuesta una desdifereciación celular acompañada por un crecimiento

tumoral que da lugar a células indiferenciadas denominadas callo (Rosell,

1990).

Un callo consiste en una masa amorfa surgida de la proliferación de células

del parénquima frecuentemente como resultado de una herida en el corte de

un tallo o raíz. Los callos no tienen patrones predecibles de organización,

están presentes en centros localizados de actividad meristemática. Una de las

características importantes de este, desde un punto de vista funcional, es su

irregular crecimiento, teniendo el potencial para desarrollar raíces normales,

brotes y embriones que formarán plántulas (Billard, 1995).

11

2.6.4. Multiplicación de los brotes

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron de la fase I

originen brotes con varios entrenudos. Periódicamente estos nuevos brotes

se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en

tubos de cultivo. Esto se realiza en las camas de flujo laminar (Rosell, 1990).

2.7. Explantes

La utilización de explantes es la técnica primordial en la micropropagación ya

que a raíz de éstos se producen las réplicas en masa. Dentro de los

explantes que se utilizan para la micro propagación están: yemas axilares,

ápices meristemáticos, microesquejes, meristemos, partes de hojas, de raíz y

por semilla (Arévalo, 1995).

Según Roca y Mroginski (1991), en los años 60, el desarrollo de

procedimientos para multiplicar y mantener plantas en cultivos asépticos,

recibió un impulso dramático; ello se debió al descubrimiento de la capacidad

que tienen las puntas de los brotes y los meristemos de la orquídea

Cymbidium sp.

Desde entonces se han usado los cultivos de puntas de brotes y de

meristemos de muchas otras plantas para obtener, mantener y multiplicar los

materiales genéticos; de un explante, que en algunos casos se puede

regenerar una planta y en otros casos se puede estimular la formación de

brotes múltiples (Styer y Chin, 1983).

Según Roca y Mroginski (1991), se puede definir como un explante una

porción separada de un vegetal, esta porción puede ser muy pequeña (5 – 10

mm), abarcando una porción de tejido u órgano. Cualquier explante que

contenga células nucleadas vivas, se puede emplear potencialmente para la

obtención directa de plantas o para la obtención indirecta de grupos celulares

amorfos. Puede ser tejido vivo de hoja, raíz, tallo, flores e inclusive semillas o

granos de polen.

12

El tipo de explante se seleccionará por razones prácticas como: disponibilidad,

facilidad de manipulación, homogeneidad, baja contaminación con

microorganismos y rápida respuesta al cultivo in vitro; es probable que en

estos casos se opte por explantes provenientes de plantas jóvenes que

crecen en el campo. Algunos estudios demuestran que los tejidos más

jóvenes se desdiferencian más rápido y producen mejores resultados en

menor tiempo, que tejidos más viejos (Roca y Mroginski, 1991).

En relación con la especie vegetal utilizada, es importante tener en cuenta la

variabilidad asociada con el genotipo de las plantas. Es muy frecuente que en

condiciones idénticas de medio de cultivo y ambiente, las respuestas in vitro

de un determinado explante de una especie dependan del cultivar empleado.

Las respuestas de los explantes cultivados in vitro pueden variar

notablemente, con el estado de desarrollo y edad ontogénica de los mismos.

Se debe tener en cuenta la incidencia de otros factores que a menudo pueden

afectar las respuestas de los explantes cultivados; como son; la época del año

en que se realizan los cultivos, las condiciones de crecimiento de las plantas

donantes y los pre tratamientos que se realizan a los explantes (Kuan y

Ospina, 1990).

A partir de cualquiera de estos tratamientos, se pueden obtener una planta

completa debido a la totipotencia de las células vegetales. Es decir a la

capacidad de des diferenciarse y retornar a un estado embriogénico que le

permite formar un individuo nuevo. En el caso de los ápices y yemas, estos no

se des diferencian, solo se les estimula para que se desarrollen y formen una

planta completa (Kuan y Ospina, 1990).

2.8. Medios de Cultivo

Una vez definido el objetivo perseguido con el cultivo in vitro de un

determinado explante, es necesario elegir un medio apropiado de cultivo, en el

cual hay que considerar no sólo sus componentes sino también su

preparación, pH, tipo de agua e inocuidad. Actualmente existen innumerables

13

formulaciones, cada una de las cuales contienen entre 15 y 32 compuestos

químicos que suministran: carbono, nutrientes, minerales, vitaminas,

sustancias reguladoras del crecimiento, compuestos orgánicos naturales y

agentes gelificantes. Todos ellos en las dosis adecuadas proveen al explante

de todos los requerimientos para crecer y desarrollarse adecuadamente

(Aguirre, 2003).

Los medios están constituidos en su mayor parte por agua, por tanto es

recomendable utilizar agua destilada para su intercambio catiónico ya que el

agua natural puede incluir microorganismos que dañen el desarrollo del

cultivo de tejidos. Para el desarrollo de la planta se necesitan componentes

químicos o inorgánicos dentro de los que se pueden mencionar se

encuentran: nitrógeno, fosforo, potasio, calcio, magnesio, hierro y micro

elementos teniendo cada uno de ellos una función específica (Usui, 1996).

Por otro lado también un medio contiene componentes orgánicos como

vitaminas, mioinositol y aminoácidos. En conjunto con componentes naturales

que dentro de ellos se encuentran caseína hidrolizada, agua de coco y

extracto de malta. Por último un medio contiene fitohormonas que pueden ser

utilizadas como reguladores de crecimiento tomando en cuenta su proporción

y cantidad (Usui, 1996).

2.9. Reguladores de crecimiento

2.9.1. Auxinas Auxina es un término genérico que se aplica al grupo de compuestos

caracterizados por su capacidad para inducir la extensión de las células de los

brotes. Por los efectos fisiológicos que provocan en las células vegetales, el

más importante es la elongación. Por lo general estos compuestos son ácidos

de núcleo cíclico insaturado o derivados de esos ácidos (Weaver, 1976).

Son consideradas como substancias de crecimiento y estimulan el

alargamiento celular, estimulan la mitosis en los meristemos secundarios.

14

Normalmente se encuentran en las plantas las auxinas naturales: ácido

indolacético (AIA). Otras son auxinas sintéticas: ácido indolbutírico (AIB)

(Perea y Navarro, 1988).

Algunos compuestos utilizados como herbicidas, se emplean para la iniciación de callos (Perea y Navarro, 1988):

2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético).

2,4,5-T (ácido triclorofenoxiacético).

Embriogénesis: dicamba (ácido 3,6 dicloro anísico).

2.9.2. Citoquininas Las citoquininas estimulan la división celular. Se encuentran en casi todos los

tejidos, son particularmente abundantes en los granos, frutas y raíces. Las

citoquininas naturales como la zeatina son extraídas de las semillas del maíz.

Las citoquininas sintéticas tienen propiedades análogas, las más utilizadas

son: la kinetina y la bencilaminopurina (BAP o BA) (Perea y Navarro, 1988).

2.10. Mercados

Los cultivares aceptables de flor cortada tienen un alto tallo, grueso,

terminando en una inflorescencia perfectamente circular con posición al

exterior más que hacia arriba. Los colores de los flosculos de radio y disco

serán claros y limpios. Localmente no es exigente que sean de centro negro

ya que perecen gazanias. Las flores dobles deben tener pétalos firmes y el

estadio de recolección debe ser determinable. Para el mercado se requieren

flores de tamaño medio y no tan grandes. Las plantas deben recolectarse de

modo continuo, preferiblemente con pocas hojas, y cultivadas bajo protección,

continuaran floreciendo en invierno; es un merito adicional la resistencia a las

enfermedades y a la marchitez. Los floristas locales necesitan ser

convencidos de que las gerberas son flores nuevas, útiles y de larga duración.

Además su comercialización con un conservador floral aumentara la

satisfacción del consumidor.

15

2.11. Trabajos realizados sobre micropropagación de Gerbera

Actualmente se tienen conocimientos de estudios de cultivo in vitro de

Gerbera jamesonni, que datan desde Hussein (2007), Kumar y Kumar (2007),

Radice y Marconi (1998) en Argentina, Severin et al (2000) en Cuba y

Machado et al (2002) en India.

Se han utilizado diversos explantes de: hoja, capítulos florales, capítulos

desarrollados, pedúnculos florales, flores liguladas y ápices de gerbera; con la

finalidad de establecer una metodología para la micropropagación. Al mismo

tiempo se evaluó también sales del medio MS suplementadas con diversos

reguladores de crecimiento para la clonación in vitro y distintos tratamientos

de desinfección de G. Jamesonni.

Un estudio realizado por Radice y Marconi (1998), en donde se evaluó

también sales del medio MS suplementadas con diversos reguladores de

crecimiento para la clonación in vitro de G. jamesonii a partir de capítulos

florales, se obtuvo que del 70% al 100% de los brotes crecidos, enraizaron en

el medio MS con 0.5 mg/L de IBA (ácido Indol butírico).

Con el objetivo de optimizar la metodología para aumentar la tasa de

multiplicación de Gerbera spp, Severin et al (2000) evaluaron diversos

explantes para determinar cuál es el más adecuado en la Micropropagación.

De los explantes evaluados se utilizaron: capítulos desarrollados, pedúnculos

florales, flores liguladas, primordios de capítulos (5 mm) y ápices de rizomas.

El medio utilizado fue siempre el MS con diferentes reguladores de

crecimiento y de todos los explantes evaluados únicamente los ápices de

rizomas y los primordios de capítulos prosperaron.

Con el objetivo de establecer una metodología de propagación comercial in

vitro de G. jamesonii, Machado et al (2002) estudiaron los medios de cultivo y

manejo de los explantes en las diferentes fases de micropropagación. Dentro

de los resultados más relevantes obtuvieron que desinfectar los explantes con

hipoclorito de sodio al 0.5% durante 10 minutos se logra una alta desinfección,

16

así como también utilizar la combinación de 6-bencilaminopurina (6-BAP) 1.0

mg/L y ácido giberélico (AG) 0.1 mg/L al medio se obtiene mayor numero de

brotes del explante y en la fase de enraizamiento lograron determinar que la

adición de ácido indolacético (AIA) lograba influenciar positivamente en el

numero de raíces.

Según (Hussein, 2007), se desarrolló callo a partir de explantes de hojas

jóvenes de Gerbera jamesonii, utilizando el medio Murashige and Skoog (MS)

suplementado con diferentes concentraciones y combinaciones de

reguladores de crecimiento vegetal, el medio en el que se obtuvieron mejores

resultados fue el medio MS suplementado con 2 mg/l de benzilaminopurina y

2 mg/l ácido naftalenacético, en el cual se generó callo dentro de los 21 y 30

días después de la siembra.

De los explantes evaluados, el de Kumar y Kumar (2007) fue el que mejor

resultado dio a partir de formación de callo en explante de hoja. Se determinó

que el mayor porcentaje de callo formado se produjo en el medio con 1.5 y 2.0

mg/L de 2,4-D. De los medios probados, el medio MS suplementado con 1.0

mg/L de BA (benzil adenina) fue el que mayor numero de brotes por callo dió.

De estos estudios se puede determinar que la Micropropagación utilizando

explantes de hoja es la más eficiente debido a la complejidad que lleva el

protocolo de desinfección de otros explantes como lo son los primordios

florales y explantes de rizomas.

En estudios de propagación in vitro de guayabo, la contaminación en la fase

de iniciación es una limitante, especialmente cuando la fuente de material

vegetal proviene de arboles adultos establecidos en el campo. Al prospecto,

se han conducido investigaciones utilizando varios agentes de desinfección

tales como, cloruro de mercurio, hipoclorito de calcio, hipoclorito de sodio y

etanol, en diferentes concentraciones y tiempos, y se ha cuantificado su efecto

atreves del porcentaje de cultivos libres de contaminación y brotación de las

yemas. La mayoría de los resultados coinciden en que el emplear material

adulto, el agente es más efectivo para reducir la contaminación sin afectar la

17

brotación, es el cloruro de mercurio 0,05% por dos o tres minutos, combinando

con la utilización de etanol 70% por un minuto; mientras que cuando se usa

material juvenil, el empleo de etanol 70% o 80% por cinco minutos, seguido

por hipoclorito de sodio de 5 a 10 minutos, controla la contaminación

adecuadamente (Maracay, 1994).

18

III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

3.1. Problema y Justificación

La floricultura es una rama de la horticultura que crece 15% anualmente en

Guatemala. Una de las problemáticas que existe con la gerbera es la poca

disposición de espacio y tecnología que cuentan los sistemas de producción

en Guatemala lo que hace ineficiente el proceso, además la planta ornamental

de gerbera presenta considerables dificultades para su propagación por

métodos convencionales, ya que las condiciones climáticas favorecen al

desarrollo de enfermedades que disminuyen el rendimiento de la planta, por

lo que se hace muy necesaria la evaluación de técnicas que puedan usarse

como alternativas para su propagación eficiente (AGEXPRONT, et al., 2000).

La biotecnología, como el caso del cultivo de tejidos, ofrece ventajas en la

propagación de plantas. Como ejemplo la propagación de muchos individuos

en relativamente poco tiempo y espacio. Sin embargo, es necesario generar

información que permita implementar estas técnicas para luego comparar sus

ventajas y de ser posible adoptarlas para generar desarrollo en el país. En

Guatemala aún no se ha intensificado el uso de la técnica de cultivo de tejidos

vegetales para la producción masiva de gerbera. Hay estudios realizados en

el Departamento de Biotecnología de la Universidad de Horticultura y

Forestería Solan en India que indican que a través del medio Murashige y

Skoog (MS) se puede obtener callo. Sin embargo la desinfección de los

explantes se realiza con cloruro de mercurio, un reactivo muy peligroso y

oneroso.

Esta investigación pretende contribuir en parte al desarrollo de una

metodología de desinfección con el uso de hipoclorito de sodio al 1% y

reguladores de crecimiento al medio MS para la formación de callo y así

proponer un protocolo de desinfección que no sea costoso y de reactivos que

son recurrentes de uso en los laboratorios. Busca evaluar los reguladores de

crecimiento al medio MS para la formación de callo como parte de proceso de

propagación de plantas de gerbera utilizando segmentos de hoja.

19

IV. OBJETIVOS

4.1. Objetivo General

Establecer un protocolo de desinfección de tejido foliar y desarrollar callo in

vitro de Gerbera jamesonii.

4.2. Objetivos Específicos

Establecer el tiempo de inmersión de explantes en hipoclorito de sodio al 1%

que menor contaminación presente en el medio de cultivo.

Determinar el regulador de crecimiento que mejor favorezca el desarrollo de

callo en los explantes de hojas de G. jamesonii.

Establecer el medio de cultivo en donde sobrevivan mayor número de

explantes de hojas de G. jamesonii.

20

V. HIPOTESIS

Al menos un tiempo de inmersión en hipoclorito de sodio al 1%, tendrá efecto

sobre las bacterias y hongos contaminantes de los medios MS.

Al menos un suplemento al medio MS tendrá mayor producción de callos

embriogénicos en los explantes de hoja de G. jamesonii

21

VI. METODOLOGIA

6.1. Localización del trabajo

La investigación se llevó a cabo en las instalaciones del laboratorio de

Biotecnología ubicado en el campus central de la Universidad Rafael

Landívar, zona 16 Guatemala.

6.2. Material experimental

El material que se utilizó como explante fueron hojas de Gerbera jamesonii,

jabón de extran, hipoclorito de sodio al 1%, el medio Murashige y Skoog (MS)

y los reguladores de crecimiento al medio: ácido naftalenacético (ANA), sulfato

de adenina, ácido indolacético (AIA) y benziladenina (BA).

6.3. Factores estudiados

6.3.1. Protocolo de desinfección

El factor que se estudió para la elaboración del protocolo de desinfección fue

el tiempo (en minutos) de inmersión en hipoclorito de sodio al 1%.

6.3.2. Evaluación de medios

El factor que se estudió para esta fase fue el regulador de crecimiento al

medio MS para la formación de callo en explantes de hoja de Gerbera

jamesonii

6.4. Descripción de los tratamientos


Los tratamientos que se utilizaron para establecer el protocolo de desinfección

de explantes de G. jamesonii en cultivo in vitro se detallan en el cuadro 1.

22

Cuadro 1. Tratamientos para desinfección de explantes de G. jamesonii con

hipoclorito de sodio al 1%

TRATAMIENTO DESCRIPCION

T1 5 minutos de inmersión en hipoclorito de sodio al 1%




6.4.2. Evaluación de suplementos al medio de cultivo

Los tratamientos que se utilizaron para esta fase están descritos en el cuadro

2.

Cuadro 2. Tratamientos para la formación de callo en explantes de G.

jamesonii.

TRATAMIENTO DESCRIPCION

T1 Medio Murashige y Skoog (MS)

T2

Medio MS + 2.5 mg/L de ácido

naftalenacético (ANA)

T3

Medio MS + 40 mg/L de sulfato de adenina

+ 0.5 mg/L de ácido indolacético (AIA )+ 1

mg/L de benzil adenina (BA)

6.5. Diseño experimental

Para cada estudio, por las condiciones controladas de laboratorio, se utilizó el

diseño completamente al azar. En establecimiento del protocolo de

desinfección fue de 4 tratamientos y 15 repeticiones. En la evaluación de

medios fue de 3 tratamientos con 30 repeticiones.

6.6. Modelo estadístico

Se detalla a continuación el modelo estadístico para el diseño completamente

al azar que se utilizó en todas las pruebas:

23

Yi = µ + ζi + εi

Donde:

Yi = Es la variable de respuesta

µ = Es la media general de las variables de respuesta

ζi = Efecto del i-ésimo tratamiento

εi = Error experimental

6.7. Unidad experimental

La unidad experimental para este estudio fue cada frasco conteniendo 3

explantes de hoja de G. jamesonii (figura 1).

Explantes

vista superior vista lateral

Figura 1. Diagrama de la unidad experimental caja petri.

6.8. Croquis de campo

El croquis de campo para el protocolo de desinfección ejemplificado en la

figura 2 y la evaluación de medios en la figura 3.

T3R

1

T1

R1

T3R

2

T4R

1

T1R

2

T2R

1

T3R

3

T2R

2

T4R

2

T2R

3

T1R

3

T4R

3

T1R

4

T3R

4

T2R

4

T1R

5

T1

R6

T3R

5

T2R

5

T3R

6

T4R

4

T2R

6

T3R

7

T3R

8

T2R

7

T2R

8

T1R

7

T1R

8

T3R

9

T2R

9

T3R

10

T4

R5

T3R

11

T2R

10

T2R

11

T2R

12

T2R

13

T1R

9

T3R

12

T3R

13

T3R

14

T2R

14

T1R

10

T3R

15

T4R

6

T2R

15

T4

R7

T1R

11

T4R

8

T4R

9

T4R

10

T1R

12

T4R

11

T1R

13

T4R

12

T1R

14

T1R

15

T4R

13

T4R

14

T4R

15

Figura. 2 Croquis de evaluación de protocolo de desinfección.

T = Tratamiento

R = Repetición

24

T

2

T

1

T

2

T

2

T

1

T

3

T

3

T

1

T

1

T

2

T

1

T

2

T

3

T

2

T

1

T

2

T

1

T

3

T

1

T

1

T

3

T

3

T

3

T

1

T

3

T

1

T

2

T

1

T

2

T

1

T

1

T

3

T

3

T

2

T

2

T

1

T

1

T

2

T

3

T

2

T

2

T

1

T

2

T

3

T

1

T

3

T

3

T

1

T

2

T

3

T

2

T

3

T

1

T

3

T

3

T

2

T

2

T

3

T

3

T

1

T

3

T

2

T

3

T

3

T

2

T

3

T

3

T

2

T

3

T

2

T

3

T

2

T

3

T

3

T

3

T

1

T

1

T

3

T

3

T

3

T

2

T

3

T

3

T

1

T

3

T

3

T

3

T

1

T

3

T

3

T

1

T

1

T

3

T

3

T

2

T

3

T

3

T

3

T

1

T

1

T

1

T

3

T

3

T

2

T

3

T

2

T

1

T

3

T

3

T

2

T

3

T

3

T

3

T

2

T

3

T

3

T

3

T

3

T

3

T

2

Figura 3. Croquis evaluación de medios

T = Tratamiento

6.9. Manejo del experimento

6.9.1. Preparación de las plantas

Antes de iniciar el experimento fue necesario aislar las plantas que fueron

utilizadas durante el estudio, lo cual permitió que a estas se les hicieran

aplicaciones de fertilizante, fungicidas y bactericidas, previo a la extracción de

tejido foliar.

6.9.2. Preparación de soluciones madre

Antes de la preparación del medio MS fue necesario preparar las soluciones

madre las cuales están formadas por macronutrientes (10x), micronutrientes

(200x), vitaminas (100x) y hierro (100X).

6.9.3. Elaboración del medio de cultivo

Se elaboraron los medios de cultivo MS completo, para cada experimento. Al

momento de establecer el protocolo de desinfección se procedió a elaborar los

medios MS nuevamente, con la diferencia que se agregaron reguladores de

crecimiento (tratamientos) 2.5 mg/L de ANA y otro suplementado con 40 mg/L

de sulfato de adenina + 1 mg/L de BA + 0.5 mg/L de AIA, el medio se

dispensó en frascos tipo gerber con tapadera de plástico, a los cuales se les

vertió 25 ml de medio para luego autoclavar (20 minutos a 121°C y 1

Atmósfera de presión). A todos los tratamientos se les ajustó el pH a 5.7

(Anexos 2).

25

6.9.4. Esterilización de equipo

Fue necesario que todos los instrumentos que se utilizaron fueran

esterilizados con una autoclave. Los instrumentos y la cristalería se

envolvieron en papel periódico y se colocaron dentro de la autoclave. Se

esterilizó por 20 minutos a 121°C y 1 atmósfera de presión.

6.9.5. Siembra

Se realizó la desinfección de los explantes conforme al protocolo existente de

preparación de los explantes y conforme a los cuatro tratamientos (evaluación

de tiempos 5,10,15 y 20 minutos en hipoclorito de sodio al 1%). Se colocaron

tres explantes dentro de cada frasco, identificando con marcador indeleble los

explantes que fueron desinfectados en los diferentes tiempos con hipoclorito

de sodio al 1%. De la misma manera, cuando se evaluaron los medios se

colocaron tres explantes por frasco identificando el tipo de medio y la

repetición. Posteriormente fueron colocados dentro del cuarto de crecimiento.

6.9.6. Desinfección de explantes

Protocolo de desinfección de los explantes de G. jamesonii para el tratamiento

1, (tiempo de inmersión 5 minutos).

En el invernadero:

Sumergir el material (explante de hoja) en un mL de Extran

En el Laboratorio

Lavar el material con Extran por 5 minutos a mano

Sumergir el material en agua estéril y agitar tres veces

Sumergir el material en cloro comercial

Lavar el material con agua estéril 3 veces (3 minutos c/u)

En el laboratorio (dentro de las campanas):

Sumergir el material en cloro al 1% durante 5 minutos


Sumergir el material en alcohol al 70% durante 2 minutos

26


Dejar reposando en antioxidante mientras se siembra.


2, (tiempo de inmersión 10 minutos).

En el invernadero:

Sumergir el material (explante de hoja) durante 5 minutos en una solución de

agua estéril + 1 ml de Extran

En el Laboratorio

Lavar el material con Extran por 5 minutos a mano




Sumergir el material en cloro comercial nuevamente









Dejar reposando en antioxidante mientras se siembra.


3, (tiempo de inmersión 15 minutos)

En el invernadero:



27

En el Laboratorio

Sumergir el material en agua estéril y agitar

Sumergir el material durante 5 minutos en una solución de agua estéril + 1 ml

de Extran + 0.5 mL de cloro comercial nuevamente













Dejar reposando en agua estéril mientras se siembra.



En el invernadero:



En el Laboratorio


Sumergir el material durante 5 minutos en una solución de agua estéril + 1 mL

de Extran + 0.5 mL de cloro comercial nuevamente

Sumergir el material en agua estéril y agitar tras veces




28












6.9.7. Almacenamiento de frascos con medio

Los frascos que contenían el medio previamente esterilizado fueron colocados

en un cuarto con condiciones controladas donde la temperatura fue entre 25 –

28 °C para evitar la evaporación de medio y muerte de los explantes, con un

fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad y una intensidad lumínica de

2,000 lux para su desarrollo.

6.10. Variables de respuesta


Para efecto de establecer el protocolo de desinfección se tomaron lecturas a

los 3 y 8 días después de siembra tomando en cuenta el 100% de los frascos

en cada variable; las variables estudiadas fueron las siguientes:

Contaminación: De cada frasco con el explante se consideró que el medio

estuvo contaminado cuando hubo presencia de bacterias u hongos.

Sobrevivencia: De cada frasco se anotó si el explante estaba vivo o no, sin

importar si el frasco con el medio estaba contaminado.

29

6.10.2. Evaluación de medios

Para la evaluación de medios se tomaron lecturas a los 3, 8, 15, 30 días de la

manera siguiente:

Formación de callo: De cada frasco se determinó si los explantes formaron

callo o no.

Contaminación: De cada frasco con los explantes se considero que el medio

estaba contaminado cuando hubo presencia de bacterias u hongos.

Sobrevivencia: De cada frasco se anotó si el explante estaba vivo o no.

6.11. Análisis de la información

6.11.1. Análisis estadístico

Para cada variable en estudio se realizó una prueba de ajuste Shapiro Wilks

para determinar la normalidad de los datos. Se utilizó la transformación

para los datos que no se ajustan a la distribución normal.

Posteriormente se realizó un análisis de varianza para determinar significancia

entre tratamientos y al haber, se realizó una prueba de medias de Duncan al

5% de significancia con ayuda del software estadístico INFOSTAT. Se

graficaron y se realizaron tablas resumen de los resultados obtenidos para

analizar de una mejor manera lo obtenido.

30

VII. RESULTADOS Y DISCUSION

7.1. Protocolo de desinfección

Se realizó un análisis de los distintos tiempos evaluados de hipoclorito de

sodio al 1% obteniendo los siguientes resultados en las variables. A pesar de

que hubo diferencias observables entre los diferentes tratamientos. En el

cuadro 3 se presentan los datos obtenidos para las variables en estudio.

Cuadro 3. Porcentaje de contaminación y sobrevivencia de explantes en las

pruebas realizadas para establecer el protocolo de desinfección

Tratamiento Contaminación

% Sobrevivencia

%

20 minutos 45 a 97 a

15 minutos 45 a 95 a

10 minutos 80 b 83 a

5 minutos 80 b 87 a

Probabilidad 0.04 15.42

C.V. * 10.48 5.12 *el C.V. que se presenta en la tabla es el del ANDEVA con los datos transformados

7.1.1. Contaminación de los medios

El análisis realizado se puede observar en el cuadro 3 donde se determina

que los tratamientos tienen diferencia significativa, siendo la inmersión de 15 y

20 minutos en hipoclorito de sodio los que menos contaminación obtuvieron

alcanzando un 45%, por lo cual son estadísticamente iguales. Los tiempos de

5 y 10 minutos presentan mayores índices de contaminación (80%). Para

efectos de este estudio se contempló la sobrevivencia aunque el medio

estuviera contaminado, de esta manera se simplifica el análisis del diseño

experimental planteado, sin embargo es importante reconocer que en la

aplicación de este protocolo en la práctica se debe descartar los frascos

contaminados como punto critico de control de asepsia.

Según López et al, (2004), el hipoclorito de sodio provoca la oxidación de las

proteínas de la pared celular de las bacterias, de la membrana citoplasmática

y del citoplasma. En sentido general se puede decir que las paredes celulares

31

de las esporas bacterianas son igualmente atacadas ya que este compuesto

también tiene actividad esporicida, por lo cual no deben ser aplicadas durante

períodos excesivamente largos. Se observó que al someter altos tiempos en

el hipoclorito de sodio, algunos explantes mueren, lo que justifica la

evaluación de la sobrevivencia de estos.

Pierik (1990), indica que una de las cuatro fuentes de infección mas

importante en el establecimiento de cultivo de tejidos, es el operario, si se ha

realizado una buena esterilización química del material vegetal, puede existir

la tendencia que al momento de que el operario manipule los explantes sea

fuente de contaminación directa al realizar la siembra respectiva del segmento

foliar.

Con los resultados obtenidos de dicha siembra, la contaminación está

presente en todos los procesos involucrados en un cultivo de tejidos, que

puede abarcar desde la esterilización de los instrumentos hasta la fumigación

de las plantas en el invernadero o que también al momento de la siembra de

los explantes puede influir un factor microbiológico que pueda contaminar

dicho explante.

7.1.2. Sobrevivencia de explantes

Según el cuadro 3 donde se presenta el resumen de resultados y análisis del

efecto de la inmersión del hipoclorito de sodio al 1%, en donde se puede

determinar que los tratamientos son estadísticamente iguales entre si

(P=0.1542) (anexo 3).

En estudios realizados por Radice y Marconi (1998), donde se hicieron

pruebas para reproducir in vitro Gerbera jamesonii a partir de capítulos

florales, se utilizó para desinfectar los explantes una solución de hipoclorito

de sodio al 20 % durante 20 minutos y bicloruro de mercurio al 0.1 % (solución

acuosa) durante 10 minutos. Con esta metodología alcanzaron una

contaminación mínima de 10% y una máxima de 75% en algunos

tratamientos. Comparando los resultados del estudio se puede decir que es

32

posible obtener un rango de contaminación similar (cuadro 3) obviando el uso

del bicloruro de mercurio que puede ser muy costoso y muy tóxico para el

operario en explantes de hoja de G. jamesonii.

Con estos resultados y luego de realizar la preparación de la muestra se

propone un protocolo de desinfección de los explantes de G. jamesonii según

la metodología del tratamiento 4, el cual se utilizó en la evaluación de

reguladores de crecimiento al medio de cultivo Murashigue y Skoog (MS).

7.2. Evaluación de reguladores de crecimiento

Se evaluaron tres tratamientos para la formación de callo en explantes de G.

jamesonii. Los tratamientos utilizados fueron, medio MS (T1), medio MS + 2.5

mg/L de ácido naftalenacético (T2), medio MS + 40 mg/L de sulfato de

adenina + 0.5 mg/L de ácido indolacético + 1 ml/L de benziladenina (T3).

En el tratamiento 1 no hubo ningún efecto sobre la formación de callo ya que

este no contenía ningún regulador de crecimiento que indujera el desarrollo

del mismo. El tratamiento 2 y el 3 fueron los que más efecto tuvieron sobre los

explantes de hoja siendo estadísticamente iguales con un 68% de formación

de callo.

Cuadro 4. Resultados obtenidos de la evaluación de los complementos al

medio MS para la formación de callo en hoja de Gerbera.

Tratamiento Formación

Callo %

Contaminación %

Sobrevivencia %

T1 MS (testigo) 0 a 4 a 88 a

T2 MS+2.5mg/L ANA 68 b 7 a 93 a

T3 MS+40mg/L SA+0.5mg/L AIA+1 mg/L BA

68 b 14 a 94 a

Probabilidad 0.01 6.99 6.76

C.V.* 9.19 7.60 2.52

*el C.V. que se presenta en la tabla es el del ANDEVA con los datos

transformados

33

Figura 4. Tratamiento de Figura 5. Formación de callo en Medio MS completo medio MS suplementado con ANA

Figura 6. Tratamiento de medio MS suplementado con sulfato de adenina

7.2.1 Contaminación por frasco

Para esta variable, se obtuvieron los resultados que se observan en el cuadro

4. Donde no se determina diferencia significativa entre los tres tratamientos

(P=0.0699, α=5%). El protocolo utilizado para esta evaluación fue el mismo

generado anteriormente basado en los resultados obtenidos (20 minutos en

hipoclorito de sodio), por lo que se puede decir que la desinfección se llevó

correctamente debido a la igualdad estadística que resultó. De esta manera se

valida el protocolo anterior y se puede decir que no hay influencia de la

contaminación sobre las otras variables.

7.2.2 Sobrevivencia por frasco

Para esta variable se obtuvieron los resultados que se presentan en el cuadro

4, donde se observa que en el tratamiento 1 obtuvo un 88% de sobrevivencia,

el tratamiento 2 un 93% y el tratamiento 3 obtuvo 94%, sin embargo los tres

tratamientos son estadísticamente iguales.

34

7.2.3. Formación de callo frasco

Para esta variable, se obtuvieron los resultados que se observan en el cuadro

4, donde se presentó diferencia significativa entre los tratamientos (P<0.0001,

α=5%). Siendo el tratamiento 2 (MS + 2.5 mg/L de ANA) y el tratamiento 3

(MS + 40 mg/L de SA + 0.5 mg/L de AIA + 1 mg/L de BA) estadísticamente

iguales, alcanzando 68.30% de formación de callo. En el testigo (MS) no se

observó callo en los explantes.

Lo cual comprueba estudios realizados por Hussein (2007), donde observó

que estos reguladores de crecimiento a nivel celular formaban una

estimulación en la formación de callo. No se observó formación de callo en

las primeras dos lecturas (8DDS y 15 DDS), se observó formación de callo a

partir de 21-30 días por las condiciones controladas.

Para esta variable los tratamientos 2 y 3 presentan mayor índice para la

formación de callo 68.30% en comparación con el tratamiento 1 en donde no

se obtuvo. Esto demuestra que las células vegetales que se desarrollan en

condiciones asépticas sobre medios de cultivo adicionados con reguladores

vegetales, pueden dividirse dando como respuesta una desdiferenciación

celular acompañada por un crecimiento tumoral que da lugar a células

indiferenciadas denominadas callo (Rosell, 1990).

Pierik (1990) explica que la capacidad regenerativa de los órganos o tejidos

de una planta disminuye a medida que van estos madurando, siendo los

tejidos jóvenes los más apropiados para el cultivo de tejidos. En la evaluación

se utilizaron únicamente tejidos jóvenes evitando este error sistemático del

estado fisiológico del explante. Se puede decir que la formación de callo

estuvo influenciada por la adición de los reguladores de crecimiento en los

medios, y también debido a que el testigo (MS) sin ninguna adición de

hormonas no presentó formación de callo.

De esta manera se confirma evaluaciones realizadas por Geier (1990), donde

explica que en ausencia de reguladores de crecimiento, muy pocos explantes

foliares forman callo. Las auxinas generalmente inducen la división celular o

35

formación de callo, expansión de tejidos y formación de raíces adventicias.

Además, según Murashigue y Skoog (1962), las citocininas son unas

sustancias muy activas al igual que la auxina, las cuales presentan muchas

formas de actuar como a la elongación de las células para las auxinas y la

división celular y la producción de callos como lo promueven las citocininas,

sobre los segmentos foliares de hoja. Las dos se complementan,

obteniéndose que la auxina favorece a la duplicación del ADN y la citocinina

hace posible la separación de los cromosomas, un papel muy claro en la

organogénesis indirecta, en la que brinda estimulación considerable sobre los

explantes de hoja para la formación de callo.

36

VIII. CONCLUSIONES

Se desarrolló un protocolo de desinfección basado en tiempos de inmersión

en hipoclorito de sodio al 1%, siendo los tiempos de 15 y 20 minutos los que

menor contaminación tuvieron alcanzando un 45% (P=0.0004, α=5%).

En la evaluación de medios el tratamiento MS + 2.5 mg/L de ácido

naftalenacético y el tratamiento MS + 40 mg/L de sultfato de adenina + 0.5

mg/L de ácido indolacético + 1 mg/L de benziladenina son estadísticamente

iguales, alcanzando 68% de formación de callo. En el testigo (MS) no se

observó formación de callo en los explantes.

No se observaron diferencias en la sobrevivencia de los explantes en ningún

factor evaluado.

37

IX. RECOMENDACIONES

Se recomienda sumergir en hipoclorito de sodio al 1% durante 20 minutos

espaciados en 5,10 y 5 minutos, después de cada tiempo lavar tres veces con

agua destilada estéril como parte del proceso de desinfección previo a la

siembra de explantes de Gerbera jamesonii.

Se recomienda adicionar al medio MS, 2.5 mg/L de ANA (ácido

naftalenacetico) para generar callo in vitro de G. jamesonii.

Se recomienda evaluar factores asociados a la sobrevivencia de explantes de

G. jamesonii en cultivo in vitro como tamaño del explante, temperatura,

oxidación del medio, entre otros. Esto con el fin de evitar la pérdida de

explantes que pueden ser potenciales en producción de plantas.

Se recomienda continuar estudios con los reguladores de crecimiento al

medio MS, evaluando diferentes concentraciones y diferentes tipos de

reguladores (auxinas o citoquininas) para mejorar el porcentaje de formación

de callo en explantes de hoja de G. jamesonii, tomando en cuenta las

características morfológicas de los callos (tamaño, tipo de callo, color, etc.).

Al momento de realizar evaluaciones con propagación de G. jamesonii in vitro

se sugiere que se realice con la mayor cantidad de réplicas posibles además

de contemplar subréplicas para disminuir la variabilidad de los datos.

38

X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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W.M. Morgan., (2009). Cultivo de tejido vegetal. International Plant Laboratories. UK.

41

XI. Anexos 1



En el invernadero:


Agua estéril + 1 ml de Extran

En el Laboratorio


Sumergir el material durante 5 minutos en una solución de Agua estéril + 1 ml

de Extran + 0.5 ml de cloro comercial nuevamente

Sumergir el material en agua estéril y agitar tras veces












Sumergir el material en alcohol al 70% durante (2 minutos)



42

Anexo 2

Preparación del medio MS para el tratamiento 1 (tiempo de inmersión 5

minutos), 2 (tiempo de inmersión 10 minutos), 3 (tiempo de inmersión 15

minutos) y 4 (tiempo de inmersión 20 minutos).

Macronutrientes 50 mL

Micronutrientes 5 mL

Hierro 5 mL

Na2EDTA 5 mL

Inositol 0.05 g

Tiamina 0.05 g

Piridoxina 2.5 mL

Sacarosa 15 g

Agar 4 g

pH 5.7

Preparación del medio MS + ANA para el tratamiento 1 (tiempo de inmersión 5

minutos), 2 (tiempo de inmersión 10 minutos), 3 (tiempo de inmersión 15

minutos) y 4 (tiempo de inmersión 20 minutos).


Micronutrientes 5 mL

Hierro 5 mL

Na2EDTA 5 mL

Inositol 0.05 g

Tiamina 0.05 g

Piridoxina 0.05 g

ANA 2.5 mL

Sacarosa 15 g

Agar 4 g

pH 5.7

Preparación del medio MS + sulfato de adenina para el tratamiento 1 (tiempo

de inmersión 5 minutos), 2 (tiempo de inmersión 10 minutos), 3 (tiempo de

inmersión 15 minutos) y 4 (tiempo de inmersión 20 minutos).


Micronutrientes 2.5 mL

Hierro 2.5 mL

Na2EDTA 2.5 mL

Inositol 0.05 g

Tiamina 2.5 g

Piridoxina 2.5 g

BA 1 mL

AIA 0.5 mL

Sulfato de adenina 40 mL

Sacarosa 15 g

Agar 4 g

PH 5.7

43

Anexo 3

Análisis de varianza para el protocolo de desinfección para los índices

presentados de contaminación, sobrevivencia de explantes y análisis de

varianza para evaluación de suplementos hormonales.

44

Gráficas con los datos transformados.

Análisis de varianza para las variables presentados de prueba de

suplementos hormonales al medio MS para formación de callo en hoja de

gerbera.

45

46

Figura 7. Porcentaje de contaminación obtenido en los tiempos de inmersión

de explantes de Gerbera (gerbera jamesonii) en hipoclorito de sodio al 1%.

Figura 8. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de gerbera (Gerbera

jamesonii) evaluados en los tiempos de inmersión en hipoclorito de sodio al

1%.

47

Figura 9. Porcentaje de contaminación de los explantes de gerbera (gerbera

jamesonii) evaluado en medio de cultivo MS con diferentes concentraciones

de hormonas.

Figura 10. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de gerbera (Gerbera

jamesonii) evaluados en medio de cultivo MS con diferentes concentraciones

de hormonas.

48

Figura 11. Porcentaje de formación de callo de los explantes de gerbera


concentraciones de hormonas.

49

Anexo 4

SOLUCIONES STOCK PARA MEDIO MS

(Murashing y Skoog, 1962)

Solución MACRONUTRIENTES (10X) gramos/litro

1 LITRO 500 mL

NH4NO3 16.5 8.25 KNO3 19 9.5 CaCl2.2H2O 4.4 2.2 MgSO4.7H2O 3.7 1.85 KH2PO4 1.7 0.85

Autoclavar y guardar a temperatura ambiente

Solución MICROCRONUTRIENTES (200 X) gramos/litro

1 LITRO 500 mL

H3BO3 1.24 0.62 MnSO4, 4H2O 4.46 2.23 ZnSO4.7H2O 0.72 0.86 Kl 0.166 0.083 NaMoO4.2H2O 0.05 0.025 CuSO4.5H2O 0.005 0.0025 CoCl2.6H2O 0.005 0.0025

Autoclavar y guardar en la refrigeradora

Solución de HIERRO (100 X) gramos/litro

1 LITRO 500 mL 250 mL

Na2EDTA 3.73 1.86 0.93 FeSO4.7H2O 2.78 1.4 0.7

EL EDTA debe estar completamente disuelto con NaOH 3M antes de agregar

el hierro. Se agrega el EDTA en un poco de agua y se pone a disolver, se va

agregando NaOH 3M hasta que disuelva completamente (son tres gotas más

o menos) sin llegar a un pH de 8.0. Luego se añade el sulfato de hierro y se

mide nuevamente el pH que debe estar en 2.5.

El frasco debe forrarse con papel aluminio para evitar la fotodegradación,

luego se puede autoclavar y guardar en la refrigeradora.

50

Solución de VITAMINAS (100X) gramos/litro

1 LITRO 500 mL

Myo-Inositol 10 5 Glicina 0.2 0.1 Acido nicotínico 0.05 0.025 Piridoxina HCl 0.05 0.025 Tiamina HCl 0.01 0.005

No se autoclavan, se guardan pequeñas cantidades en envases y se

congelan. Preparar la mínima cantidad posible, se contaminan muy

rápido.

PREPARACION DE MEDIO – MS COMPLETO

1 LITRO 500 mL

MACRONUTRIENTES 100mL 50 mL MICRONUTRIENTES 5 mL 2.5 mL HIERRO 10 mL 5 mL VITAMINAS 10 mL 5 mL SACAROSA 30 g 15 g

pH 5.7 – 6.0

Aforar a un litro

Agar 7 gramos

Hervir para disolver el agar, servir y autoclavar en SLOW (líquidos) por

20 minutos.

51

Anexo 5

Datos de campo

Evaluación de tiempos de inmersión en hipoclorito de sodio 1%

Tratamiento Repetición Contaminación Sobrevivencia

5 min 1 1 1

5 min 2 1 0.5

5 min 3 1 0.5

5 min 4 1 1

5 min 5 1 0.5

5 min 6 0.5 1

5 min 7 0.5 1

5 min 8 1 1

5 min 9 0.5 1

5 min 10 0.5 1

5 min 11 1 0.5

5 min 12 1 1

5 min 13 0.5 1

5 min 14 1 1

5 min 15 0.5 1

10 min 1 1 0.5

10 min 2 1 1

10 min 3 1 1

10 min 4 1 0.5

10 min 5 0.5 1

10 min 6 0.5 0.5

10 min 7 1 1

10 min 8 1 0.5

10 min 9 1 1

10 min 10 0.5 1

10 min 11 0.5 1

10 min 12 0.5 0.5

10 min 13 0.5 1

10 min 14 1 1

10 min 15 1 1

15 min 1 0.75 1

15 min 2 0.5 1

15 min 3 0.5 1

15 min 4 0.75 0.75

15 min 5 0.75 1

15 min 6 0.25 1

15 min 7 0.75 0.75

52

15 min 8 0 1

15 min 9 0.5 0.75

15 min 10 0.5 1

15 min 11 0 1

15 min 12 0.25 1

15 min 13 0.75 1

15 min 14 0.25 1

15 min 15 0.25 1

20 min 1 0 1

20 min 2 1 1

20 min 3 0 1

20 min 4 0 1

20 min 5 1 1

20 min 6 0.5 1

20 min 7 1 0.5

20 min 8 1 1

20 min 9 1 1

20 min 10 0 1

20 min 11 0.5 1

20 min 12 0 1

20 min 13 0 1

20 min 14 0 1

20 min 15 0 1

Evaluación de suplementos hormonales al medio MS

Tratamiento Rep Formación

Callo 8DDS

Formación Callo

15DDS

Formación Callo

30DDS Contaminación Sobrevivencia

MS (testigo) 1 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 2 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 3 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 4 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 5 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 6 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 7 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 8 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 9 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 10 0.000 0.000 0.000 0.167 0.667

MS (testigo) 11 0.000 0.000 0.000 0.000 1.000

MS (testigo) 12 0.000 0.000 0.000 0.000 1.000

MS (testigo) 13 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 14 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 15 0.000 0.000 0.000 0.167 0.833

MS (testigo) 16 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

53

MS (testigo) 17 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 18 0.000 0.000 0.000 0.000 1.000

MS (testigo) 19 0.000 0.000 0.000 0.000 1.000

MS (testigo) 20 0.000 0.000 0.000 0.000 1.000

MS (testigo) 21 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 22 0.000 0.000 0.000 0.000 1.000

MS (testigo) 23 0.000 0.000 0.000 0.000 1.000

MS (testigo) 24 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 25 0.000 0.000 0.000 0.000 1.000

MS (testigo) 26 0.000 0.000 0.000 0.000 1.000

MS (testigo) 27 0.000 0.000 0.000 0.333 1.000

MS (testigo) 28 0.000 0.000 0.000 0.500 0.833

MS (testigo) 29 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS (testigo) 30 0.000 0.000 0.000 0.000 0.833

MS+2.5mg ANA 1 0.000 0.000 0.500 0.167 1.000

MS+2.5mg ANA 2 0.000 0.000 1.000 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 3 0.000 0.000 0.500 0.167 1.000

MS+2.5mg ANA 4 0.000 0.000 0.500 0.000 0.833

MS+2.5mg ANA 5 0.000 0.000 0.000 0.500 0.667

MS+2.5mg ANA 6 0.000 0.000 1.000 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 7 0.000 0.000 1.000 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 8 0.000 0.000 0.500 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 9 0.000 0.000 0.500 0.167 0.833

MS+2.5mg ANA 10 0.000 0.000 0.500 0.000 0.833

MS+2.5mg ANA 11 0.000 0.000 1.000 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 12 0.000 0.000 0.500 0.000 0.833

MS+2.5mg ANA 13 0.000 0.000 0.500 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 14 0.000 0.000 0.000 0.167 0.833

MS+2.5mg ANA 15 0.000 0.000 1.000 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 16 0.000 0.000 0.500 0.500 0.833

MS+2.5mg ANA 17 0.000 0.000 1.000 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 18 0.000 0.000 0.000 0.500 0.667

MS+2.5mg ANA 19 0.000 0.000 1.000 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 20 0.000 0.000 1.000 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 21 0.000 0.000 1.000 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 22 0.000 0.000 1.000 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 23 0.000 0.000 0.500 0.000 0.833

MS+2.5mg ANA 24 0.000 0.000 1.000 0.000 1.000

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MS+2.5mg ANA 27 0.000 0.000 1.000 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 28 0.000 0.000 1.000 0.000 0.833

MS+2.5mg ANA 29 0.000 0.000 0.500 0.000 1.000

MS+2.5mg ANA 30 0.000 0.000 0.500 0.000 0.833

MS+40mg SA+0.5mg AIA+1 ml BA 1 0.000 0.000 0.500 0.000 1.000

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DDS = días después de siembra

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EVALUACIÓN DE UN PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN Y DE …biblio3.url.edu.gt/Tesis/2012/06/14/Ayala-Jose.pdf · en el medio murashige skoog (1962), para generaciÓn in vitro de callo a