Resumen

El progreso de la actividad petrolera enVenezuela y en la mayor parte del mundoconstituye un elemento estratégico eindispensable del proceso de desarrollo nacionaldesde el punto de vista económico ytecnológico. A pesar de esto, las acciones quedía a día se llevan a cabo en la industria,siempre generan riesgos de alteración del medioambiente, tales como derrames terrestres,marítimos y lacustre, de petróleo y productosrefinados, debido al manejo irregular desistemas de bombeo, transporte en tuberías,almacenaje en tanques y disposición inadecuadade desechos (fosas de lixiviados o perforación).En el caso de éste último, es de granimportancia su función, ya que permite facilitarla deposición y acumulación de los efluentes enun área restringida y exclusiva. En contraste,exponer de forma prolongada al medio ambienteelevadas concentraciones de distintas clases decontaminantes (los hidrocarburos más tóxicos yrecalcitrantes son los aromáticos policíclicos),es considerado en el presente como emergenciasambientales debido al riesgo que representa a lasalud humana y los recursos naturales.

Actualmente, los procesos de remediaciónmás utilizados consisten en la utilización demicroorganismos; por esta razón se destinacomo finalidad principal de la investigación laevaluación de la tecnología de BiorremediaciónIn Situ, la cual consiste en la digestión desustancias orgánicas por microorganismosnaturales presentes en el suelo a través de laBioaumentación de la población autóctona. Eldiseño estadístico a utilizar, para comprobar laefectividad de la técnica, es el de Bloques al

azar en arreglo factorial con tres repeticiones.Con la aplicación de esta metodología sepretende acelerar la degradación parcial de losdesechos orgánicos presentes en el suelo.

Introducción

Venezuela es un país en donde se concentrangrandes reservas de hidrocarburos y por ende seasocian procesos de extracción, producción,transporte, utilización y descomposición deproductos fósiles (petróleo). Estas actividadeshan generado derrames en espacios de suelosque alteran profundamente el medio ambiente.Por ésta razón, el objetivo de la investigación esofrecer los resultados obtenidos en la evaluacióndel proceso de Biorremediación in situ a un áreadel suelo afectado en la zona cercana a una fosade perforación ubicado en el sector Caico Secoen el estado Anzoátegui, utilizando la técnica deBioaumentación de la población bacterianaautóctona.

Con la utilización de los medios de cultivosricos y de baja concentración de sales, como enel caso del Luria Broth (LB) y M9respectivamente, se conseguiría llevar a cabo losexperimentos que implican el aislamiento de lasbacterias autóctonas. De esta misma forma, losresultados relacionados con la biorremediaciónde hidrocarburos, serán calculados por mediodel análisis de Hidrocarburos Totales delPetróleo (TPH).

En la figura 1 se ilustra la ubicacióngeográfica del sector Caico Seco.

EVALUACIÓN DEL PROCESO DE BIORREMEDIACIÓNIN SITU EN EL SUELO DE LA MACRO-FOSA CARACOL(MUNICIPIO ARAGUA, ESTADO ANZOÁTEGUI),IMPACTADO POR HIDROCARBUROS, MEDIANTEBIOAUMENTACIÓN DE LA POBLACIÓN BACTERIANAAERÓBICA AUTÓCTONA

Elynee Rojas

Materiales y Métodos

1. Estudio del Suelo . Muestras compuestas desuelo arenoso, planta, hidrocarburo y agua,fueron colectadas de la macro-fosa Caracol.Esta fosa fue escogida por representar un áreade exposición histórica a hidrocarburos queoperó durante muchos años como una de lasprincipales y más grande recolectora dedesechos petrolíferos de la zona.

Para la obtención de las muestras, setomaron aleatoriamente porciones de suelo delos primeros 10 cm de profundidad en cincodiferentes lugares de la fosa (a lo largo de lazona costera, en los linderos y en la parte centralde la misma); la planta fue tomada en un áreacercana a la fosa y tanto el agua como elhidrocarburo, fueron extraídos de la parteacuosa de la misma.

En la figura Nº 2 se muestra el lugar en elcual fueron extraídas las muestras de estudio.

Posteriormente, se transportaron allaboratorio en donde se integraron las muestraspara formar las siguientes composiciones:

Agua*: Agua procedente de la fosaAgua**: Agua atrapada por el hidrocarburo(emulsión inversa o “Mouse”)

La nomenclatura FC, proviene de lasiniciales del nombre del lugar de donde seextrajeron las muestras (Fosa Caracol).

Cada una de las composiciones se procesóde la siguiente forma:

• FC-01. Se eliminaron parcialmente delas raíces el exceso de tierra. Luego setomó por completo las raíces y sedesechó el resto (hojas) paraposteriormente mezclarlas con agua*.Finalmente, se colocó en un fiola.

• FC-02. En una fiola se mezclaron elagua** e hidrocarburo.

• FC-03. Se seleccionaron y mezclaronlos sólidos con características especiales(aspecto húmedo o lodoso, restos de arenamuy integrados al hidrocarburo).Todas las muestras constituidas (FC-01,

FC-02 y FC-03), se colocaron en un agitador a30 °C y 150 rpm durante una semana.

El pH se determinó usando un pHmetro,mientras que los análisis de humedad fueronrealizados siguiendo la técnica de secado ydiferencia de pesada. Una muestrarepresentativa fue enviada a los laboratorios de

Edafofinca (Cagua, estado Aragua), para elanálisis de nitrógeno y fósforo total.

Fig. 1. Ubicación Geográfica del Sector CaicoSeco.

Dsff

Fig. 2. Lugar de Obtención de Muestras

2. Análisis Microbiológico2.1. Medios de Enriquecimiento. Se realizó elenriquecimiento de las muestras FC-01, FC-02 yFC-03, en M9 (compuesto de Na2HPO4,KH2PO4, NaCl, NH4Cl) suplementado con losnutrientes elementales e hidrocarburo comofuente de carbono.

Todo el proceso se realizó bajo un régimende esterilidad apropiado para evitar lacontaminación tanto de los cultivos como de losaditivos utilizados.

En la figura Nº 3 se reseña un ejemplo de laelaboración del medio de enriquecimiento parael caso de la muestra de suelo.

Luego de la primera semana deenriquecimiento se procedió a realizar el mismoprocedimiento pero con un cambio en laconformación de los nutrientes, para este casose le comenzó a añadir 40ml de M9, 40 _l deMgCl2 1M, 8 _l de CaCl2 0,5M, 80 _l de MgSO41M, 800 _l de FeCl3 5mM, se mantuvo la fuentede carbono y se vertió 10 ml, finalmente secolocó 500 _l de inóculo. Este último provinode la muestra procesada con el medio inicial.

Nombre ComponentesFC-01 Rizoesfera + Agua*

FC-02 Hidrocarburo + Agua**

FC-03 Sólidos (Arena)

Caico Seco

Anzoátegui

Semanalmente se realizaban pases deenriquecimiento y se tomaban las observacionesmás resaltantes que presentaban las muestras.Se realizaron 5 pases de las cuales el últimosirvió de inóculo para los siguientes procesosque se llevaron a cabo durante la investigación.

Fig. 3. Pasos a Seguir para la Elaboración delMedio de Enriquecimiento de la Muestra

2. 2. Conteo de colonias en placas de LB-agar. Se realizaron diluciones de 10-2 y 10-3.

En placas de LB-agar fueron sembrados5ml provenientes de cada dilución la cual sellevó a cabo rallando toda la placauniformemente con un asa de platino. Esteproceso se efectuó en la campana de flujolaminar la cual es un equipo que proporcionaesterilidad.

El LB (Luria Broth), es un compuesto ricoen nutrientes que se emplea para realizaraislamiento y cultivo de bacterias.

Finalmente las placas inoculadas fueronguardadas en una estufa a 30ºC y 150 rpm por24 horas.

Pasadas las 24 horas, se observaron lasdiferentes morfologías y se llevó a cabo el pasoconteo.

2.3. Aislamiento de bacterias a partir dediferentes diluciones. Una vez culminado elpaso 2, se procedió a visualizar los diferentesmorfotipos obtenidos, para luego sembrarlos porduplicado en placas de LB-agar y así obteneruna sola cepa en cada placa. La siembra seefectuó por agotamiento con la ayuda de un asade platino. Esta experiencia se realizó en lacampana de flujo laminar y con la utilización deun mechero.

Para culminar, se colocaron las placas enuna estufa a 30ºC y 150rpm durante 24 horas.

2.4. Medios de cultivos líquidos selectivos.Se realizaron medios líquidos la cual conteníaM9 como solución base, enriquecido consuplementos (MgCl2, CaCl2, FeCl3, MgSO4) ymicroelementos. La fuente de carbono aportadoal mismo consistió de diferentes hidrocarburos(Ciclohexano, Naftaleno, DBT y ASF/AMN) adistintas concentraciones (0,1 y 1%).

El inóculo provino de las muestras (FC-01,FC-02 y FC-03) originadas inicialmente, endonde el volumen de éste fue de 200ml el cualfue mezclado con 19 ml de M9, 460ml desuplementos, 100ml de microelementos y decarbono se vertió para una concentración al0,1% la cantidad de 20ml, por otro lado, secolocaron 200ml para una solución al 1%.

La solución formada fue introducida en unaincubadora a una temperatura de 30ºC y 150rpm durante 3 días.

La manipulación de hidrocarburos y desustancias estériles fue realizada en la campanade flujo laminar.

3. Experimento de Biorremediación. Para laelaboración del experimento se tomó comopunto inicial la exploración del terreno paraubicar el lugar que sería más favorable para eldesarrollo de la investigación. Luego de haberrealizado una inspección en la zona, se dispusode un área de poca pendiente y en donde lascaracterísticas del suelo mostraban ciertahomogeneidad en cuanto a contaminación serefiere.

La biorremediación de hidrocarburos seevaluó en sistemas por duplicado utilizandoparcelas que fueron limitados por piezas demadera en donde formaban un área de 1m2 ycon una p rofundidad de 15cmaproximadamente. Cada parcela contienealrededor de 500Kg de suelo impactado de loscuales se le aplicaron los tratamientosmostrados en la tabla Nº1.

En la figura Nº 4 se presenta el áreaseleccionada para la implementación de lasparcelas de estudio. De igual forma, en la figuraNº 5, se puede apreciar cada uno de los casos deBiorremediación que fueron aplicados.

Posterior a la inoculación inicial seobtuvieron muestras de 5kg tomadas enprofundidad y de manera aleatoria por triplicadoa través de una tabla de números aleatorios. Esteproceso ocurrió en la semana siguiente a lainicial, posteriormente en las semanas 4, 7 y 12.

En general, la extracción de hidrocarburosdel suelo se realizó de una muestra de 7gr con

Fig. 4. Área Seleccionada para Implementarla Biorremediación

FiolaVac_a

M9suplementadoy Glicerol al

80%

Hidrocarburocomo Fuentede Carbono

Muestra deSuelo

Muestrade Suelo

50ml de cloroformo. La medición de TPH sellevó a cabo según el método 413.1 de la EPA(Agencia de Protección Ambiental de losEstados Unidos), el cual es un métodogravimétrico que consiste en la extracción consolvente, evaporación del solvente, y ladeterminación del peso.

Tabla Nº1. Tratamientos de BiorremediaciónAplicados en el Suelo Contaminado con

Hidrocarburos

Tratamientos Descripción del tratamientoAtenuación

Natural(Control)

Evaluación de la degradaciónp o r m i c r o o r g a n i s m o sautóctonos del suelo.

BioestimulaciónEvaluación de la degradaciónp o r m i c r o o r g a n i s m o sautóctonos del suelo a travésde la adición de 1,5L denutrientes.

BioaumentaciónEvaluación de la degradaciónpor bacterias autóctonas delsuelo a través de la adición de1,5L de nutrientes y 2,5L debacterias autóctonas en mediomínimo salino (M9).

Fig. 5. Representación de Cada Uno de losCasos de Biorremediación Aplicada

Control

Bioestimulación Bioaumentación

En la figura Nº 6 se puede observar los pasosrealizados para la ejecución de la prueba deTPH.

Resultados y Discusiones

Previo a la realización de las actividadesmicrobiológicas se determinó el pH de lasmuestras FC-01, FC-02, FC-03, la cualindicaron que las muestras inicialmenteprocesadas mantienen un pH neutro,demostrando así que el ambiente en donde seextrajeron las bacterias mantiene un equilibrioen cuanto a acidez y basicidad muy favorablepara su crecimiento.

Por otro lado, los resultados obtenidos denitrógeno y fósforo total a través de los análisisrealizados en el laboratorio Edafofinca, ubicadoen el estado Aragua, indicaron que el nitrógeno

Condensador

1. Secarla

Muestra(Suelo+Crudo)

2. Tamizar laMuestra

3. Pesar la Muestrade Suelo, Perlas deAgitaci_n, Papel deFiltro, Fiola yFrasco de vidrio

4. Mojar laMuestra de Suelocon Solvente5. Filtrar la

Muestra de Suelo6. Se Obtienen2 Derivados, elSolvente conHidrocarburo yel SueloLimpio

7. Secar el Suelo y Papel deFiltro

8. Recuperar el Solvente a trav_s de una Celda de Destilaci_n

Term_metro

Celda deDestilaci_n

Crudo+Solvente

Trampa.Lugar endonde esrecolectadoel solvente

Regulador de TemperaturaMalla de Calentamiento

está muy por debajo de los valores estándares,reflejando así un 15% de la carga total. En elcaso del fósforo, éste conserva un estatus casiintermedio (45%). En esta ocasión losresultados son aceptables o simplemente seajustan a las condiciones ambientales en la quese encuentra el área, por tanto es obvio lacarencia o escasez de muchos nutrientes.

El suelo de estudio se caracteriza por serarenoso y de grano intermedio desde lasuperficie hasta unos 15cm de profundidad, loque es ventajoso para el tratamiento ya quepermite un favorable esparcimiento de losnutrientes como también admite una efectivaaireación. Cuando se alcanza una profundidadsuperior a la antes mencionada, el suelo se tornaun poco más fino y húmedo, éste último pudieraestar asociado con el hecho de que en la zonaexisten riachuelos (río Caracol y Garrapata) queabarcan gran extensión del área de estudio ycomo también por estar fuera de contacto tantocon el aire como con la radiación solar. Delmismo modo, el subsuelo se topa con pequeñostrozos de arcilla que se hallan muy dispersas alo largo de la estructura, caso que coloca endesventaja algunas partes del subsuelo debido aque las arcillas se caracterizan por ser porosasmás no permeables, es decir, que los poros no seencuentran interconectados entre sí por lo cualretiene los fluidos sin permitir la circulación delmismo. Éstas se observan muy escasamente.Conjuntamente con la arena se percibencantidades considerables de hidrocarburos muyerosionados que forman parte de la fracción quese desea degradar.

En sí, un suelo arenoso podría favorecercomo también agravar el proceso debiorremediación, en el caso de éste último, esporque la presencia de granos muy gruesosconforman generalmente una estructura muyporosa la cual permite la percolación más rápidade los fluidos colocados (los nutrientes sevierten en el sistema de forma líquida).

Estudios Microbiológicos1. Los medios de enriquecimientos se llevaron acabo hasta el quinto pase, ya que para eseentonces, las muestras estudiadas (FC-01, FC-02 y FC-03) presentaban una gran turbidez,coloraciones muy diversas y formación debiocapa.

La coloración y la turbidez son respuestasque en muchas ocasiones los microorganismos yen este caso las bacterias tienden a presentarcomo consecuencia de la metabolización(respuesta a la coloración), multiplicación ycrecimiento (respuesta a la turbidez). Por otrolado, la formación de biocapa estuvo dispuesta aunos 4cm aproximadamente de la superficie dellíquido para todas las muestras y se difundió de

igual forma a lo largo de la fiola. Las bacteriasse asientan en estas superficies ya que susreacciones ocurren a nivel de la interfase endonde las células logran producir un materialpolimérico extracelular. En si ésta adherenciaésta influenciada por la movilidad de las célulasy depende de las características del medio decultivo, por lo cual este último coincide con losmedios formados (FC-01, FC-02 y FC-03) endonde la orimulsión contribuye a establecer unambiente tóxico para las bacterias y esto a suvez implica una mayor producción de sustanciaspoliméricas que en medios no tóxicos.

2. A simple vista es imposible detectar lacantidad de bacterias que están presentes en elmedio ambiente, es por ello que en prácticas delaboratorio se implementan técnicas quepermiten contarlas. Esto se fundamenta en quecada bacteria se desarrolla y se reproduce hastaformar una masa visible, es decir, la formaciónde una colonia partiendo de un organismoviable; por tanto el conteo en placa nosproporciona el número de bacterias presentes enla muestra de estudio. Por lo general la muestraoriginal se diluye de manera que el número decolonias desarrolladas en la placa se encuentrenentre 50 y 500 colonias con el fin de disminuirla posibilidad de interferencia en el desarrolloentre las distintas especies bacterianas.

En la tabla Nº 2 se muestran los resultadosluego de 24 horas de inoculación de lasdiferentes diluciones (10-2 y 10-3).

Tabla Nº 2. Resultados del Conteo deColonias en Placas de LB-agar

Experimento UFC @ t = 24 hr Título(UFC/ml)

FC-01 10-21 233 4,6 105

FC-01 10-22 214 4,28 105

FC-01 10-31 42 8,4 104

FC-01 10-32 17 3,4 104

FC-02 10-21 192 3,84 105

FC-02 10-22 211 4,22 105

FC-02 10-31 14 2,8 104

FC-02 10-32 23 4,6 104

FC-03 10-21 410 8,2 105

FC-03 10-22 427 8,54 105

FC-03 10-31 83 1,66 105

FC-03 10-32 69 1,38 105

En todos los casos el título oscila entre 104

y 106 UFC/ml. Estos niveles son aceptables yaque se han reportado algunos resultados (comoen el caso del proyecto realizado por laUniversidad de Antioquia que consistió en elconteo de colonias bacterianas mediante visióncomputarizada, 2001) que indican que la

cantidad de colonias bacterianas presentes enzonas contaminadas con hidrocarburos estánbajo el mismo rango de los valores obtenidos.

En la figura Nº 7 se puede observar lapresencia de colonias perfectamente expuestaspara el conteo.

Figura Nº 7. Formación de Variadas ColoniasBacterianas

3. En la tabla Nº 3 se puede apreciar la cantidadde morfotipos que lograron aislarse en ellaboratorio.

Sumando todos los morfos aislados seobtienen 28 cepas, de las cuales representanparte de las bacterias ambientales que puedenser cultivadas en el laboratorio, siendo estaquizás menos del 1%. Es importante tomar encuenta que el 99% de las bacterias que nocrecieron consiguen un ambiente equilibrado ensu hábitat original, considerando que enocasiones necesiten de la participación de otrosorganismos y conjuntamente con lascondiciones ambientales logren establecer unasinergia favorable. En contraste, en ellaboratorio, resultan diferentes y limitadas lascondiciones referentes a la conformación de losmedios de cultivos, ya que éstos incluyen losnutrientes necesarios para su crecimiento perose ve escaso ante la influencia de otras fuentesde nutrición como también el efecto deloxígeno, temperatura, agua, entre otros.

Por otro lado, no todas las bacteriasevolucionan de igual forma, es decir, algunasson aeróbicas, anaeróbicas, facultativas y otras;es por esta razón que no se puede obviar laprocedencia de las muestras de estudio, estoindica que referirse a las bacterias quecircundan los alrededores de la rizosfera de unaplanta no es igual a las que se encuentran en elagua o a las que se encuentran en contacto conun crudo y mucho menos aquellas bacterias queestán presentes en la superficie del suelo. Es porello que la diversidad bacteriana es sumamentecompleja y por ende es imposible de aislarcompletamente en laboratorio.

Tabla Nº 3. Número de Morfotipos Aislados

en Laboratorio

ExperimentoNúmero deMorfotipos

AisladosFC-01 (10-2 y 10-3)

y FC-017

FC-02 (10-2 y 10-3)y FC-02

5

FC-03 (10-2 y 10-3)y FC-03

16

Total 28

4. En la tabla Nº 4 se presentan los resultadosobtenidos de la observación realizada luego dehaber transcurrido 22 días desde el inicio de estaactividad. Durante éste tiempo se efectuaron 2pases de enriquecimiento en los medios dondeel sustrato fue líquido (Ciclohexano yASF/AMN) ya que su evolución ocurrió unpoco lenta. Para el DBT y el Naftaleno en dondesu presentación en el sistema fue en formacristalizada, su pronta metabolización condujo ala ejecución de 3 pases.

Como puede apreciarse, la mayoría de lasmuestras estudiadas son capaces de degradarhidrocarburos lo cual es obvio, ya que lasbacterias que lograron crecer eficientementebajo estos ambientes de presión indican que sugenética no está restringida a procesarcompuestos de alta toxicidad, esto pudieradeberse a que se encuentran adaptadas y porende desarrollaron defensas para poder soportaréstos sistemas lo que a su vez está relacionadocon el tiempo de exposición del contaminanteen el ambiente. Esto quiere decir que unaexhibición prolongada está asociada con lainocuidad del contaminante en el ecosistemaexistente.

Es preciso enfatizar que en los sistemasexperimentales FC-01, FC-02 y FC-03, seprodujeron poblaciones bacterianas concaracterísticas particulares, y que en conjuntologran establecer un equilibrio favorable para suentorno. Esta idea conlleva a intuir que esprobable que existan bacterias que cumplan confunciones definidas, es decir, que a diferencia deotras capten algún sustrato específico, y elresultado de su metabolización sirva decomplemento para otras.

Si tomamos en cuenta la escala dedegradación de hidrocarburos se puede hacernotar que las bacterias en la mayoría de lasocasiones consiguen captar con mayor facilidadlos compuestos más simples (como en el casode los alcanos), es por esta razón que resulta

interesante las características observadas en losdistintos experimentos realizados y en donde seaprecia a través de la turbidez, cambio decoloración y la formación de biocapa, cómo lapoblación bacteriana autóctona, aún en lascondiciones de laboratorio, pueden procesarestructuras muy estables o en sus efectosramificados como lo son el ciclohexano,naftaleno, dibenzotiofeno (DBT) y la soluciónasfaltenos con alfametilnaftaleno (ASF/AMN).

Tabla Nº 4. Observaciones de los DistintosMedios de Cultivo Selectivos

Experimento Observación del Medio deCultivo (T= 22 días)

Ciclohexano 1%

FC-01, FC-02 y FC-03Color amarillento. Traslucido.Biocapa color naranja muydelgada e inconstante a lo largode la fiola. Turbidez media.

Ciclohexano 0,1%FC-01, FC-02 y FC-03 Poca turbidez

ASF/AMN 1%

FC-01

Color grisáceo. Ruptura deemulsión lo cual implica lapresencia de gotas de asfaltenos.Biocapa uniforme en la extensiónde la fiola, color negro.

FC-02Color gris claro. Alta turbidez.Ruptura de emulsión. Biocapacolor negro.

FC-03Color gris oscuro. Ruptura deemulsión. No presenta biocapa.Turbidez pronunciada.

ASF/AMN 0,1%

FC-01Color gris claro. Traslucido. Bajaturbidez . Biocapa coloranaranjado. Ruptura de emulsión.

FC-02Características parecidas a laspresentadas por FC-01

FC-03Se nota más limpia o menosopaca en cuanto a turbidez serefiere.

Naftaleno

FC-01

Color blanco mate. Alta turbidez.Material sólido color amarillomuy claro disperso en el medioirregularmente. Biocapa blancacon tonos anaranjados.

FC-02 Color marrón claro mate. Altaturbidez. Biocapa blanca.

FC-03 Color blanco mate. Excesivaturbidez. Biocapa blanca.

DBT

FC-01Coloración blanca mate. Turbio.Biocapa gruesa y de colornaranja.

FC-02Presenta características similaresa las de FC-01 pero con ladiferencia de que la biocapa fuemás delgada

FC-03Color naranja mate. Excesivaturbidez. Biocapa color naranja ydelgada.

Los resultados observados en el caso delexperimento del ciclohexano al 1% con respectoal de 0,1%, pudieran estar indicando que la

colocación de este hidrocarburo a menorconcentración se evapora, bien sea durante elproceso de vertido o en la etapa de preservaciónen la estufa, esto a su vez ocasiona una carenciaimportante de la fuente de carbono la cual esesencial para el proceso evolutivo de lasbacterias.

En el caso del ASF/AMN ocurre un efectomuy similar al del ciclohexano, pero a este se lesuma la idea de que por efecto de la ruptura dela emulsión entre el asfalteno y elalfametilnaftaleno, debido a un aumento de laconcentración de la fase continua (en laemulsión ASF/AMN, la fase continua es elAMN y por ende la dispersa el asfalteno)cuando se mezcla el ASF/AMN con el mediobase (M9). Es probable que a las bacterias se ledificulte tomar el hidrocarburo por ser estehidrofóbico (incompatibilidad al agua), es porello que es necesario que éste se encuentre ensolución con el medio para así facilitar eltransporte de nutrientes a través de las células.

En el caso del DBT, se observa unarespuesta del medio que está asociada con laruta de degradación reportada por Kodama.

Experimento de BiorremediaciónEn las parcelas de estudio (bioaumentación,bioestimulación) se observaron pocasvariaciones físicas durante el tiempo detratamiento. En sí los niveles dedescontaminación no fueron muy notorios yaque a pesar de que se realizó inicialmente unahomogenización de cada sistema no fue posiblecuantificar del todo la proporción delcontaminante en éstas.

En la figura Nº 8 se puede apreciar laevolución de las distintas parcelas desde elinicio del procedimiento.

Es importante mencionar que la influenciadel medio ambiente fue punto predominante enla efectividad de los procesos, esto se refiere ala coincidencia del comienzo del trabajoexperimental (inicio del mes de junio y finalesdel mes de julio) con la llegada de la temporadade invierno. Las lluvias por su parte afectangravemente el desarrollo del estudio pordiversas razones, en primer lugar pudieraproducirse un lavado del suelo, esto seconsidera en desventaja ya que una vezcolocados los nutrientes en el medio, es muyposible que se percolen gran parte de éstos aprofundidades que están muy lejos de lasuperficie; por otro lado, en las parcelas 1 y 2,en donde se bioaumentó la población bacterianaautóctona que crece a temperaturas quesobrepasan los 30 ºC, por su parte se veinfluenciada en esta ocasión por la temperatura

promedio en invierno, por lo cual provoca unatensión en el metabolismo de las bacterias.

Los valores de pH para los tiempos que vandesde T0 hasta T3, resultan favorables para elcrecimiento bacteriano autóctono la cual influyepor ende en los procesos de remediación. Porotro lado, para los dos últimos tiempos (T4 yT5), ocurre un aumento que oscila entre 8,1 y8,847, esto pudiera inhibir la actividad de lasbacterias ya que muestran un comportamientoóptimo cuando el ambiente que los rodea está enun rango de pH entre 6 y 8.

La humedad relativa está asociada con lacantidad de agua que contiene un cuerpo conrespecto a la que pudiera contener si estuvierasaturado a la misma temperatura. Con éstarelación hay que tener suma delicadeza a la horade aplicarla, debido a que físicamente medir lahumedad relativa de un cuerpo a través dediferencias de pesadas se tendría que tomar encuenta las variaciones de temperaturas, porqueésta es muy sensible y su cambio ocasionaríavalores erróneos a la hora de tomar losresultados.

Fif. Nº 8. Visualización del Desarrollo de lasDiferentes Técnicas de Biorremediación con

Respecto a los Tiempos Muestrales

BioaumentaciónParcela 1

T0 T1 T2

T3 T4 T5

Parcela 2

T0 T1 T2

T3 T4 T5

BioestimulaciónParcela 3

T0 T1 T2

T3 T4 T5

Parcela 4

T0 T1 T2

T3 T4 T5

Control

Parcela 5T0 T1 T2

T3 T4 T5

Medición de la Biodegradación

En la tabla Nº 5 se presentan los resultadosobtenidos de TPH considerando el análisis

para las parcelas 1 y 2 (bioaumentación)como también 3 y 4 (bioestimulación) un solosistema. Este criterio se tomó con la finalidadde optimizar los resultados arrojados por cadaexperimento.

Tabla Nº 5. Resultados de TPH paraCada Uno de los Experimentos de

Biorremediación

Experimento TPHpromedio

T0

TPHpromedio

T5

TPHdegradad

o (%)Prcela

1-28,2 6,11 25,49

Parcela3-4

8,83 7,21 18,35

Parcela5

11,98 10,55 11,94

Por otra parte, se aprecia que los porcentajesde degradación en los tres casos resultaron seraceptables para cada tipo de tratamiento,obteniéndose valores entre 18 y 25%. Paraalgunos autores (Infante, 2001) (Ercoli, 2001),las consecuencias de una buena aplicación dela biorremediación consiste en alcanzar cifraspor encima del 25% para un tiempo deaproximadamente de 150 días.

Es entonces relevante destacar los 90 díasde tratamiento que a su vez equivalen tresquintas partes de un periodo de150 días, por locual teóricamente según este último criterio setendría entonces que obtener el 15% dedegradación, valor que se encuentra 10unidades por debajo de la cifra obtenida bajola implementación del proceso debiorremediación in situ utilizando la técnicade bioaumentación.

La figura Nº 9 muestra la variación de losniveles de concentración de hidrocarburostotales reportados. Las curvas muestran unadisminución de los hidrocarburos totales en eltiempo para las parcelas analizadas.

El mejor comportamiento en cuanto adegradación se refiere se encontró en lasparcelas en donde se bioaumentó la poblaciónbacteriana autóctona, en donde el grado deconcentración de hidrocarburos totales con eltiempo resultaron inferiores con respecto alcontrol, lo que indica que las condicionesaeróbicas, el aumento de el número debacterias, la adición de nutrientes y el materialcontaminante ya presente pudieron influir enel proceso de degradación. En el proceso debioestimulación todavía se observa un mejorcomportamiento con respecto a la parcela 5,pero sus valores de TPH están muy cercanos.En sí esta similitud evidencia que la adiciónde nutrientes y el número de microbiota no

fueron suficientes en las proporcionesañadidas y existentes respectivamente, ya quepudo haber influenciado las constantes lluviasque ocurrían en ese tiempo y así provocar unexcesivo lavado del suelo conllevando a laperdida de nutrientes y la disminución de lasbacterias. En el caso de la bioaumentación nose puede obviar el efecto de las lluvias, peroes posible que la existencia de una mayorconcentración de bacterias hallan podidoresistir éste fenómeno.

Bioaumentación

Bioestimulación

Control

Conclusiones

1. Bajo condiciones de laboratorio lograroncrecer 28 morfotipos.

2. Se encontró que la población bacterianaaeróbica aislada de los alrededores de lamacro-fosa Caracol, es capaz de degradarhidrocarburos como ciclohexano,alfametil/asfaltenos, dibenzotiofeno ynaftaleno.

3. Las bacterias autóctonas frente alcompuesto azufrado (DBT), mostrócaracterísticas propias de la biodegradación

0 1 2 4 7 120

1

2

3

4

5

6

7

8

9

TIEMPO (SEMANAS)

0 1 2 4 7 12

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

TIMEPO (SEMANAS)

0 1 2 4 7 120

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TIEMPO (SEMANAS)

de éstos siguiendo la ruta metabólicaKodama.

4. La Biorremediación se ve influenciada porla por las variaciones en la humedadrelativa que presentan las parcelasexperimentales durante el tratamiento.

5. La Bioaumentación en un lapso de 90 díasgeneró mayor porcentaje de degradación(25,49%) con respecto a la Bioestimulación(18,35%) y el Control (11,94%).

Recomendaciones

1. Realizar un estudio de la Reacción enCadena de la Polimerasa para lograridentificar las bacterias autóctonas capacesde metabolizar hidrocarburos.

2. Caracterizar a través de la técnica SARA(Saturados, Aromáticos, Resinas yAsfaltenos) el hidrocarburo extraído en lapráctica de TPH, para así conocer lasfracciones degradadas durante eltratamiento.

Bibliografía

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