Eventos antigos de especiação híbrida no grupo bifoliado do gênero Cattleya … · 2014. 1. 8. · DNA regions with evidence for reticulate evolution] The bifoliate Cattleya (Orchidaceae)

TARCISO MAIA SANTOS

Eventos antigos de especiação híbrida no grupo bifoliado

do gênero Cattleya Lindl. (Orchidaceae) inferidos a

partir de uma filogenia baseada em 16 regiões de DNA

nuclear e plastidial

Feira de Santana – Bahia

2011

Universidade Estadual de Feira De Santana

Departamento de Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação Em Botânica

Eventos antigos de especiação híbrida no grupo bifoliado

do gênero Cattleya Lindl. (Orchidaceae) inferidos a

partir de uma filogenia baseada em 16 regiões de DNA

nuclear e plastidial

TARCISO MAIA SANTOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Botânica da Universidade Estadual de

Feira de Santana como parte dos requisitos para a

obtenção do título de Mestre em Botânica.

ORIENTADOR: PROF. DR. CÁSSIO VAN DEN BERG (UEFS)

Feira de Santana – Bahia

2011

DEFESA DE DISSERTAÇÃO

CANDIDATO: Tarciso Maia Santos

TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: “Eventos antigos de especiação híbrida

no grupo bifoliado do gênero Cattleya Lindl. (Orchidaceae) inferidos a

partir de uma filogenia baseada em 16 regiões de DNA nuclear e

plastidial”.

BANCA EXAMINADORA

Feira de Santana – BA

2011

A minha família, meu amor, minha vida.

AGRADECIMENTOS

O presente estudo, o qual cita o meu nome como autor, é na realidade fruto do

trabalho e cooperação de várias instituições e pessoas que contribuíram durante todas as

etapas que fizeram com que eu chegasse até aqui. Espero não ser injusto e peço que para

aqueles que por algum motivo eu esquecer, que me perdoi e entenda que os méritos de sua

colaboração transcendem algumas palavras de agradecimento presente nesse papel. Então,

queria agradecer a CAPES pela bolsa de mestrado concedida. Ao CNPq pelo

financiamento do projeto, Sistemática, Filogenia e Variabilidade de Laeliinae

(Orchidaceae): estudos integrados PII, coordenado pelo professor Dr. Cássio van den Berg

(orientador); à Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) por todas as

oportunidades e possibilidades oferecidas desde a minha graduação até o presente

mestrado.

Ao Programa de Pós-Graduação em Botânica da UEFS (PPGBot/UEFS) pelo apoio

financeiro e logístico. Ao corpo de professores e funcionários que permitiram a promoção

e desenvolvimento dos meus estudos. Em especial queria agradecer a Adriana Estrela e

Gardênia por toda solicitude.

Ao Laboratório de Sistemática Molecular de Plantas (LAMOL), local onde passei

mais de “dois terços” de minha vida acadêmica e realizei boa parte dos trabalhos, Ao

Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana (HUEFS) por apresentar estrutura e

condições adequadas para o desenvolvimento dos meus trabalhos. Aos amigos e

funcionários do HUEFS. A todos os curadores que confiaram e emprestaram materiais para

o estudo dos espécimes.

Aos amigos e colecionadores do Espírito Santo, Alex Zaslawski, Sávio Caliman e

Edson Sperandio pela colaboração com amostras de folhas para o estudo do DNA de

algumas espécies. Ao Jomar Gomes Jardim que contribuiu com coletas de algumas

amostras do Rio Grande do Norte. Ao Marcos Paulo Morfim que contribuiu com coletas de

algumas amostras do Rio Grande do Sul.

Ao parque Nacional da Chapada Diamantina, representado aqui na pessoa de Cezar

Neubert Gonçalves, por ter nos recebido e dado o apoio necessário.

Ao meu orientador Cássio van den Berg, ao qual tenho uma parceria científica que

a mais de cinco anos, pela colaboração, orientação e apoio no desenvolvimento desse

estudo.

Aos meus grandes amigos Lamoianos, Ricardo (Doutorzão) (que sempre quebrou

um galho, seja nos reagentes seja na informática, resumindo o cara é fera), ao recém

chegado Dissinho. As meninas que com suas belezas iluminam e embeleza o laboratório,

Adelina Vitória, Aline, Ana Luisa do Fabrício (Anéthe), Ana Luisa do Ricardo, Barbara,

Cláudia (Claudéte), Elisa (Abre o olho), Élvia (Bem), Laura, Maria Cristina (Criss

Roberts), Maria José (Alga Maria), Marla (Marloca), Patrycia Reijane, Priscila, Silvia

(Advogada) e Tutti (quase sogra). A rapaziada do LAMOL, Alison (Farofa), Anderson

(Mano Chico), Evandro, Fabrício da Anéthe, Floriano (Suassuna), Herlon, Marcos, Tiago

Arruda e Tiago Pontes.

Aos amigos que passaram pelo LAMOL, Ciça, Déa, Luiz Menini, Milene, Paty

Natividade, Sabrina (Sá), Silvana Ferreira e Silvana Helena.

Quero agradecer de forma especial a Paty Luz (Tia) e Paulo Ricardo (tô cansado)

pela amizade e apoio no desenvolvimento dessa dissertação.

Aos amigos e colegas da pós-graduação, Jully, Catharina, Joseane, Jumara, Ricardo

Landim, Ricardo Perdiz, Fábio, Paula, Cássia, Pétala, Grênivel, Michelle, Sâmia, Carla e

Eloina.

Aos amigos e agregados do Residencial, Alécio (Brother Léco), Pedro (Lettle

Peter), Diógenes (Papá), George, Jonaicon, Leilton, Angélica, Mariana, Maria, Eider e

Lizandra que sempre colaboraram e torceram para esse fim.

Em especial a Deus e a minha família (meu pai Pascoal, minha mãe Maria e meus

irmãos Tandson e Taylon) pelo apoio ao meu trabalho e compreensão em relação a minha

ausência durante todo esse tempo.

Por fim, obrigado a todos e todas, vocês foram fundamentais para esse trabalho.

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

INTRODUÇÃO....................................................................................................................1

METODOLOGIA................................................................................................................9

RESULTADOS...................................................................................................................15

DISCUSSÃO.......................................................................................................................20

CONCLUSÃO....................................................................................................................31

REFERÊNCIAS.................................................................................................................33

ANEXOS............................................................................................................................ 58

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Primers e programas utilizados para a amplificação das regiões utilizadas neste

estudo....................................................................................................................................46

Tabela 2. Características das matrizes e das árvores mais parcimoniosas encontradas nas

análises de Máxima Parcimônia individuais e combinadas e dos modelos evolutivos

selecionados para inferência Bayesiana...............................................................................48

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Árvores de consenso estrito resultantes das análises de Máxima Parcimônia

individuais. A, agt1. B, accD. C, atpF-atpH. D, ITS. Os números acima dos ramos

indicam os valores de suporte de bootstrap (%)..................................................................49


individuais. E, ndhJ. F, matK. G, psbA-trnH. I, psbK-psbI. Os números acima dos ramos



individuais. I, rpl32-trnL. J, trnD-trnT. K, rpoB. L, rpoC1. Os números acima dos ramos



individuais. M, trnL-trnF. N, trnS-trnG. O, ycf1. Os números acima dos ramos indicam os

valores de suporte de bootstrap (%).....................................................................................52

Figura 5. Árvore de consenso de maioria das 18.000 árvores resultantes da análise

Bayesiana, com modelo de evolução particionado da matriz Plastídeo (dados das 14

regiões de plastídeo). Os números acima dos ramos indicam: a esquerda os valores de

bootstrap (%) oriundo das análises de máxima parcimônia e a direita os valores de

probabilidade posterior (em escala de 0 - 1) gerados na inferência bayesiana. Os ٭

representam valores de bootstrap inferior a 50%. As letras representam os clados

formados, A (Walkeriana), B (Intermedia), C (Falcata) e E (subclado Bicolor).................53


Bayesiana, com modelo de evolução particionado da matriz Combinada I (dados das 13

regiões de plastídeo, ITS e agt1). Os números acima dos ramos indicam: a esquerda os

valores de bootstrap (%) oriundo das análises de máxima parcimônia e a direita os valores

de probabilidade posterior (em escala de 0 - 1) gerados na inferência bayesiana. Os ٭


formados, A (Walkeriana), B (Intermedia), C (Falcata), D (subclado Elongata) e E

(subclado Bicolor). ..............................................................................................................54


Bayesiana, com modelo de evolução particionado da matriz Combinada II (dados das 14

regiões de plastídeo, agt1 e ITS) excluindo terminais que geravam incongruência. Os

números acima dos ramos indicam: à esquerda os valores de suporte de bootstrap (%) e a

direita os valores de probabilidade posterior da inferência bayesiana (em escala de 0 - 1).

Os ٭ representam valores de bootstrap inferior a 50%. As letras representam os clados

formados, A (Walkeriana), B (Intermedia), E (subclado Bicolor........................................55

Figura 8. Super-rede (supernetwork) das árvores de consenso da análise de máxima

parcimônia com valores de bootstrap igual ou superior a 50% a partir dos dados

combinados de plastídeo, de ITS e de agt1. O número mínimo de árvores foi igual a 2.....56

Figura 9. Rede de consenso não-enraizado (30% de limite para construção da rede)

sumarizando as incongruências existentes entre as topologias dos três conjuntos de dados

(14 regiões de plastídeo, ITS e agt1) usando árvores de consenso de maioria com > 50% de

bootstrap. Na figura apenas a topologia é apresentada, pois os ramos não são escalonados

com comprimento de ramo. As linhas em negrito representam as possíveis reticulações. A

imagens referem-se as espécies ou represententes de clados envolvidos em possíveis

processos de evolução reticulada.........................................................................................57

RESUMO

As Cattleyas bifoliadas (Orchidaceae) compõem um grupo de 21 espécies que

morfologicamente se distingue das outras espécies do gênero por apresentar duas ou

raramente três folhas sobre o pseudobulbo. A maioria das espécies ocorre exclusivamente

no Brasil, apenas três (C. violacea, C. nobilior e C. loddigesii) ocorrem também em outros

países. Estudos prévios envolvendo espécies do grupo bifoliado geraram árvores

filogenéticas com pouca resolução e sugeriram que a evolução de algumas espécies dentro

do grupo pode estar associada a processos de reticulação. Nesse contexto, o presente

estudo teve como objetivos, produzir uma hipótese filogenética para as relações entre as

espécies do grupo bifoliado, bem como avaliar os possíveis processos de evolução

reticulada no grupo. Para tanto, foram utilizadas 16 regiões, sendo 14 do genoma plastidial

(accD, atpF-atpH, matK, ndhJ, psbK-psbI, psbA-trnH, ycf1, rpoB, rpoC1, rpl32-trnL, trnl-

trnF (íntron, exon e espaçador intergênico), trnD-trnT e trnS-trnG) e duas do genoma

nuclear (agt1 e ITS). As análises foram realizadas através do método da máxima

parcimônia e da inferência bayesiana através de análises individuais e combinadas. Em

níveis gerais, os dados apresentaram baixa variação nucleotídica, mas alguns clados foram

reconhecidos. Foram verificadas incongruências entre os dados plastidiais e nucleares. Os

conflitos no sinal filogenético foram tratados como indícios de evolução reticulada. As

incongruências foram filtradas e um consenso de rede (consensus network) foi construído.

O consenso de rede sugeriu que a origem de C. aclandiae, C. dormaniana, C.

porphyroglossa, C. schilleriana e C. tigrina envolveram processos de reticulação entre

linhagens ancestrais de algumas espécies do grupo bifoliado.

Palavras-chave: Cattleya, bifoliadas, evolução reticulada, consenso de redes.

ABSTRACT

[Phylogenetics of the bifoliate lineage of Cattleya Lindl. (Orchidaceae) based in 16

DNA regions with evidence for reticulate evolution] The bifoliate Cattleya (Orchidaceae)

comprise a group of 21 species morphologically distinct from other species in the genus by

presenting two or rarely three leaves per pseudobulb. Most species occur exclusively in

Brazil, and only three (C. violacea, C. nobilior and C. loddigesii) occur in neighboring

countries. Previous studies involving species in the bifoliate group generated phylogenetic

trees with poor resolution and suggested that the evolution of some species within the

group can be associated with processes of reticulation. In this context, this study aimed to

produce a phylogenetic analysis for relationships among species of the bifoliate group, and

assess the possible processes of reticulate evolution. For this, we produced sequence data

from 16 DNA regions, being 14 from the plastidial genome (accD, atpF-atpH, matK, ndhJ,

psbK-psbI, psbA-trnH, ycf1, rpoB, rpoC1, rpl32-trnL, trnL-trnF (intron, exon and

intergenic spacer), trnD-trnT e trnS-trnG) and two from the nuclear genome (agt1 and

ITS). Analyses were performed using methods of maximum parsimony and Bayesian

inference in individual and combined datasets. The trees obtained indicated that most DNA

regions showed low variation, but some clades could be recognized. We found

incongruence between the plastid and nuclear data. The conflicts in phylogenetic signal

were treated as evidence of reticulate evolution. The incongruences were filtered and a

consensus network was built. The consensus network suggested that the origin of C.

aclandiae, C. dormaniana, C. porphyroglossa, C. schilleriana and C. tigrina could

incorporate processes of reticulation between ancestral lineages of some species within the

bifoliate group.

Keywords: Cattleya, bifoliate, reticulate evolution, consensus network.

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. A família Orchidaceae Juss. e o gênero Cattleya Lindl.

Inserida na ordem Asparagales Link (APG III, 2009), a família Orchidaceae com

cerca de 24.500 espécies, é considerada a maior família de plantas (Dressler, 1993, 2005).

Sua distribuição é cosmopolita, com exceção da região Antártica, entretanto são mais

abundante e diversificada em florestas tropicais. No Brasil, as orquídeas estão distribuídas

em praticamente todo o território, sendo registradas 2.419 espécies, das quais 1.620 são

endêmicas (Barros et al., 2010).

No sistema de classificação mais recente para família Orchidaceae (Pridgeon et al.,

1999, 2001, 2003, 2005), baseado principalmente em dados moleculares, são reconhecidas

cinco subfamílias: Apostasioideae Rchb.f., Cypripedioideae Kostel., Orchidoideae Eaton,

Vanilloideae Szlach. e Epidendroideae Lindl.. Esta última é considerada a maior

subfamília de Orchidaceae, sendo subdividida em 16 tribos e 650 gêneros (Pridgeon et al.,

2005, 2007). Suas espécies ocorrem principalmente nos trópicos e subtrópicos, mas

também podem ser encontradas em clima temperado até o Circulo Ártico (Pridgeon et al.,

2005).

A subtribo Laeliinae Benth., depois de Pleurothallidinae Lindl. ex G.Don e

Oncidiinae Benth., ocupa o terceiro lugar em tamanho dentro da subfamília

Epidendroideae. A subtribo é formada por cerca de 50 gêneros e 1.500 espécies, com

distribuição estritamente neotropical (Dressler, 1993). Alguns de seus gêneros como

Cattleya Lindl. e Rhyncholaelia Schltr. apresentam grande valor horticultural, outros como

Encyclia Hook., Epidendrum L. e Prosthechea Knowles & Westc. são elementos comuns

da florística dos neotrópicos. A grande diversidade morfológica presente na subtribo

provavelmente deve estar relacionada a especialização em particular dos polinizadores bem

como adaptações aos diferentes hábitats (van der Pijl & Dodson, 1966).

O estabelecimento do gênero Cattleya, se deu por John Lindley em 1821, na

literatura citada na obra "Collectanea Botanica", ao descrever a espécie brasileira Cattleya

labiata Lindl. importada por acaso do Brasil pelo colecionador William Cattley em 1818

(Braem, 1984). Entretanto, algumas espécies já tinham sido descritas, com outros nomes,

em trabalhos anteriores, como na "Flora Fluminensis" de Vellozo em 1790 (publicada em

2

1829) e na obra "Nova Genera et Species Plantarum" publicada em 1815 (van den Berg,

1996).

O gênero se caracteriza morfologicamente por flores de tamanho grande e labelo

não fundido à coluna (ver Anexos III e IV), características que o separam de Epidendrum,

e coluna não protrusa dorsalmente, o que o separa de Encyclia (Withner, 1988). Laelia

Lindl. foi durante muito tempo considerado o gênero mais próximo a Cattleya, dentro da

subtribo Laeliinae, sendo que alguns autores como Braem (1984), defendiam que a

principal diferença de Laelia e Cattleya seria a presença de oito polínias no primeiro e

quatro no último. Embora Cattleya e Laelia fossem considerados grupos próximos, estudos

de filogenia molecular com dados de sequências de DNA (van den Berg et al., 2000, 2009)

mostraram que Brassavola R.Br. seria o gênero mais próximo de Cattleya. Além disso, os

dados de sequência de DNA não evidenciaram uma proximidade entre as espécies

brasileiras de Laelia com as espécies que ocorre no México, nem com a espécie tipo do

gênero. Como solução, foram propostas grandes alterações na circunscrição de Laelia, e as

espécies brasileiras foram, na sua totalidade, transferidas para o gênero Sophronitis Lindl.

(van den Berg et al., 2000) e combinadas por van den Berg & Chase (2000).

Recentemente, estudos realizados com oito regiões (ITS, matK, trnL-F (intron e

espaçador), trnK, rps16, atpB-rbcL e psbA-trnH), mostraram que as espécies do gênero

Sophronitis (anteriormente classificadas como Laelia “brasileiras”) se agruparam dentro

do gênero Cattleya (van den Berg et al., 2009). Buscando acomodar essas informações, as

espécies desse grupo foram transferidas para o gênero Cattleya (van den Berg, 2008), o

qual juntamente com Brassavola, Rhyncholaelia e Guarianthe Dressler & W.E.Higgins

formam o clado da aliança Cattleya, com cerca de 135 espécies.

Apesar das diferentes classificações propostas ao longo do tempo, tanto para as

espécies brasileiras de Cattleya (Cogniaux, 1898; Pabst & Dungs, 1975; Fowlie, 1977)

quanto para o gênero como um todo (Rolfe, 1895; Withner, 1988; van den Berg et al.,

2000; van den Berg, 2008), vários são os problemas taxônomicos no gênero. Além disso, a

transferência das espécies de Sophronitis (antigas Laelia brasileiras, van den Berg, 2008)

para o gênero fez crescer o número de espécies e também a sua heterogeneidade

morfológica. Contudo, morfologicamente dois grandes grupos podem ser detectados: um

formado pelas espécies unifoliadas (apresentam apenas uma folha sobre o pseudobulbo) e

3

outro formado pelas espécies bifoliadas (apresentam apenas duas ou raramente três folha

sobre o pseudobulbo).

Excluindo as espécies do grupo unifoliado, que são predominantemente andinas

(com seis espécies no Brasil), e as espécies vindas do gênero Sophronitis, ainda sobram

cerca de 21 espécies as quais compõem o grupo bifoliado. Destas, apenas C. violacea

(Kunth) Rolfe, C. nobilior Rchb.f. e C. loddigesii Lindl. ocorrem também em outros países

e as restantes são endêmicas do Brasil. De modo geral, o grupo bifoliado não é

morfologicamente homogêneo, e vários são os questionamentos taxonômicos encontrados

em suas relações internas. Cattley dormaniana (Rchb.f.) Rchb.f. por exemplo, difere das

demais espécies do grupo por apresentar, as vezes, oito polínias (sendo quatro dessas não

funcionais); C. walkeriana Gardner e C. nobilior diferem por serem heteromodulares,

produzindo flores laterais, sobre pseudobulbos especiais, desprovidos de folhas, o que dá a

impressão de que as flores saem do rizoma (Braem, 1984). Além disso, a maioria dos

indivíduos de C. walkeriana apresenta apenas uma folha sobre o pseudobulbo. Braem

(1984) argumentou que alguns pares de espécies apresentam um status específico

duvidoso, como C. harrisoniana Batem. ex Lindl. e C. loddigesii. Situação semelhante

ocorria entre outras espécies do grupo bifoliado como C. nobilior e C. walkeriana, C.

granulosa Lindl. e C. schofieldiana Rchb.f.. Apesar de haver muita semelhança entre essas

espécies de Cattleya, os estudos baseados em dados morfológicos (van den Berg, 1996) e

moleculares (Santos et al., não publicado no caso de C. loddigesii e C. harrisoniana e Jin

et al., (2004) no caso de C. nobilior e C. walkeriana) indicaram a manutenção do status

específicos das mesmas.

1.2. Biogeografia do grupo bifoliado

Segundo van den Berg (1996), o gênero Cattleya se adéqua muito bem à teoria de

refúgios florestais do Pleistoceno (Brown, 1979, 1987), e parcialmente à teoria

biogeográfica de Fowlie (1977). Segundo a teoria de Fowlie (1977), o centro de origem das

Cattleya bifoliadas seria na região costeira, entre o Litoral Norte Paulista e Sul do Rio de

Janeiro, e também o Vale do Paraíba e regiões montanhosas da Serra da Mantiqueira e

Serra dos Órgãos. Durante a evolução do grupo, teria ocorrido uma grande dispersão

seguida de eventos de vicariância e especiação durante as glaciações do Quaternário

recente. Durante o glacial máxima, haveria uma grande área de habitats de brejos

4

litorâneos desde a região de Boracéia, São Paulo, passando pelo Rio de Janeiro, Espírito

Santo e Bahia, penetrando pelos vales do Rio São Francisco e Rio Doce. Nestas áreas teria

havido uma dispersão massiva de C. bicolor Lindl. e outras espécies bifoliadas, seguida de

uma fragmentação diante do retrocesso das geleiras. Para van den Berg (1996), as áreas

que são hoje ocupadas por C. bicolor seriam refúgios florestais do Pleistoceno, entretanto

as ligações através do Vale do São Francisco e Rio Doce são pouco prováveis de terem

existido. Neste caso a melhor hipótese seria uma dispersão anterior à glaciação, seguida de

extinção nas áreas desfavoráveis.

1.3. Incongruências e Evolução Reticulada

Ao longo dos últimos anos a sistemática molecular vem experimentando um

crescente aumento no número de regiões de DNA usadas para resolver as relações

evolutivas (Degnan & Rosenberg, 2009). Entretanto, apesar de todo esforço na coleta de

dados, muitos estudos em plantas apresentam topologias com baixa resolução nos nós,

principalmente em estudos de espécies que divergiram recentemente ou de táxons

intraespecíficos (Crawforf & Mort, 2004; Mort et al., 2007). Para Rokas & Carrol (2005) a

falta de resolução não está necessariamente relacionada à pequena amostragem de regiões,

e sim à combinação entre o tempo curto de cladogênese e a grande quantidade de

homoplasias. Visando uma melhor resolução nas topologias, vários estudos em plantas,

vêm utilizando uma combinação de dados do genoma plastidial (herança uniparental) e do

genoma nuclear (herança biparental). Em relação aos dados do genoma plastidial, a

maioria dos estudos utiliza sequências de DNA não codificantes, as quais pressupõem

apresentarem menos restrições funcionais que regiões codificantes e, portanto, podem

apresentar maiores níveis de variação (Gielly & Taberlet, 1994; Shaw et al., 2005, 2007).

Nas revisões feitas por Shaw et al. (2005, 2007) sobre a utilização de regiões do genoma

plastidial, foi detectado que os espaçadores intergênicos apresentavam maior nível de

variação e poderiam ser utilizados para estudo entre espécies próximas.

Em relação ao genoma nuclear (nDNA), a maioria dos estudos filogenéticos sempre

focaram na utilização da porção ribossomal (rnDNA) em específico os espaçadores

transcritos internos (ITS) e recentemente os espaçadores transcritos externos (ETS)

(Colonge et al., 2009). Apesar das críticas feitas aos dados de ITS (Alvarez & Wendel,

2003), o alto nível de variação apresentado pela região (por exemplo, na família

5

Orchidaceae (Douzery et al., 1999; Smidt, 2007; Monteiro, 2007), o tipo de herança e a

presença de múltiplas cópias facilitando a amplificação o tornam uma valiosa região para

estudos filogenético principalmente em estudos de híbridos (van den Hof et al., 2008;

Alvarez & Wendel, 2003; Feliner & Rossello, 2007). Um dos grandes problemas referentes

a essa região é a presença de cópias parálogas. Contudo, esse não parece ser um grande

problema em Orchidaceae, exceto em Angraecinae (Carlsward et al., 2006). Atualmente

devido ao maiores estudos no genoma nuclear, outras porções vêm sendo cada vez mais

estudas e utilizadas nas reconstruções filogenéticas em plantas, principalmente aos genes

nucleares de baixas cópias LCNG (do inglês, Low-Copy Nuclear Genes) (Small et al.,

2004; Hughes et al., 2006; Wu et al., 2006; Aguileta et al., 2008; Li, et al., 2008; Colonge

et al., 2009; Górniak et al., 2010). Dentre as vantagens dessas regiões, pode-se citar: a

rápida taxa de evolução quando comparado com genomas das organelas, presença de

múltiplos loci independentes (não ligados) e herança biparental. Assim como o ITS, os

LCNG apresentam algumas desvantagens, como a complexa arquitetura genética e

dinâmica evolutiva, bem como dificuldade de isolamento e identificação de genes

ortológos (Small et al., 2004). Dentro dessa perspectiva, vário autores vêm desenvolvendo

primers para essas regiões, como Wu et al. (2006) e Li et al. (2008) (que desenvolveram o

conjunto de genes ortológos conservados COS - do inglês, Conserved Ortholog Set) e Ford

et al., (2006) que desenvolveram primers para a região PgiC (que codifica uma enzima

citoplasmática - citosolic phosphoglucose isomerase).

Análises filogenéticas a partir da combinação de dados do genoma plastidial e

nuclear tem sido muito frequentes nos estudos, entretanto muitas incongruências tem sido

verificas entre esses conjuntos de dados (Topik et al., 2005; Fehrer et al., 2007; Fan et al.,

2009; Spalik et al., 2009; Kelly et al., 2010; Pelser et al., 2010). Estudos revelam que

mesmo dentro de um mesmo genoma, geralmente, quanto mais genes são amostrados mais

incongruência entre as árvores dos genes são encontradas (Rokas et al., 2003). van der Niet

& Linder (2008) argumentaram que as incongruências encontradas entre os conjuntos de

dados podem ser enquadradas em duas classes. A primeira classe, refere-se a fatores não

biológicos que podem estar na gênese das incongruências, como a amostragem insuficiente

de táxons (Stockley et al., 2005) ou a atração de ramos logos na análise de máxima

parcimônia (Felsenstein, 1978; Kennedy et al., 2005). A segunda classe corresponde a

eventos que podem gerar relações filogenéticas diferentes entre os genes devido a histórias

6

filogenéticas diferentes ocorridas com esses genes (Maddison, 1997). Diversos processos

biológicos podem estar por trás desse tipo de incongruência, como conflito entre cópias

ortológas e paralógas (Vanderpoorten et al., 2004), lineage sorting (Doyle et al., 2004),

transferência horizontal de genes (Won & Renner, 2003) e hibridização (Rieseberg et al.,

1996a,b; Sang & Zhong, 2000; Heuertz et al., 2006; Joly et al., 2009). van der Niet &

Linder (2008) também comentam que em muitos estudos os clados incongruentes são

incluídos na análise combinada sem que seja dado um atenção especial as incongruências

ou são ignorados e retirados das análises, e que uma análise mais detalhada dessas

incongruências pode contribuir para uma melhora na resolução da árvore de espécies. Para

Fehrer et al. (2007) o processo de hibridação interespecífica representa um dos maiores

fatores responsável na geração de incongruência entre loci. Entretanto, distinguir

hibridação de lineage sorting a partir de incongruência entre conjuntos de dados não é

tarefa fácil (Pelser et al., 2010). Em relação à lineage sorting, Moore (1995) argumentou

que os dados de plastídeo são menos suscetíveis a esse processo, devido à rápida

coalescência.

A formação e especiação de híbridos naturais é um mecanismo muito comum em

plantas (Hegarty & Hiscock, 2005). Estima-se que 25% das espécies de plantas vasculares

formem híbridos com outras espécies (Mallet, 2005) e talvez 11% das espécies de plantas

tenham surgido através de hibridação (Ellstrand et al., 1996; Russell et al., 2010). O

crescente avanço nas técnicas moleculares tem permitido entender melhor os processos

decorrentes da hibridação, como a mudança no padrão de expressão gênica e alterações na

organização cromossomal (Baack & Rieseberg, 2007). Estudos revelam que o número de

híbridos diplóides identificados é muito menor que o número de espécies híbridas

alopoliplóides (Linder & Rieseberg, 2004; Sang et al., 2004). Entretanto, essa diferença

pare estar mais relacionada a maior dificuldade na detecção da hibridação homoplóide

(Seehausen, 2004; Mallet, 2005). Além disso, o fluxo gênico entre espécies via

introgressão é um evento muito comum, principalmente em genomas de espécies

permeáveis a alelos de outras espécies proximamente relacionadas (Baack & Rieseberg,

2007; Lexer et al., 2009; Russell et al., 2010). De modo geral, a hibridação entre espécies

geram nas análises combinadas conflito no sinal filogenético. Contudo, a percepção desses

conflitos é de suma importância na construção das árvores de espécies e devem ser

representados como eventos de reticulação (Linder & Rieseberg, 2004).

7

Para Linder & Riesenberg (2004) existem pelo menos três linhas de evidências

empregadas para detectar hibridação. A primeira linha assume que, na ausência de outras

causas que geram incongruência entre os conjuntos de dados, as incongruências

representam eventos de reticulação (Fehrer et al., 2007; van der Niet & Linder, 2008). A

segunda linha baseia-se na criação de sequências quiméricas (oriundas da combinação de

múltiplos loci independentes de ambas as espécies suspeitas de hibridação) e utilização na

análise na busca de um sinal filogenético que evidencie uma história evolutiva envolvendo

hibridação (Huson, 1998; Kelly et al., 2010). Uma terceira linha baseia-se na busca de

associação entre desequilíbrio de ligação e hibridação. Essa linha assume que os loci

estreitamente ligados em uma determinada espécie híbrida são geneticamente mais

propensos a vir de uma mesma espécie progenitora, e a gerarem um desequilíbrio de

ligação (Doebley et al., 1984; Rieseberg et al., 1996a, 2003).

Nas análises envolvendo incongruências, os conflitos no sinal filogenético são

interpretados como eventos de hibridação e são representados como redes de relações

filogenéticas. Huson & Bryant (2006) comentam que existe certa confusão na literatura

sobre o conceito de redes filogenéticas. Dentre os conceitos sugeridos por esses autores, as

redes reticuladas representam uma explicita história evolutiva decorrente de eventos de

reticulação, como a hibridação e recombinação. Nessas redes os nós internos representam

espécies ancestrais e os nós com mais de dois “pais” correspondem aos eventos de

reticulação (Huson & Bryant, 2006; Huson et al., 2011). Esses mesmos autores tem ao

longo dos últimos anos implementado vários algoritmos na tentativa de explicitar uma

melhor hipótese de reticulação. Contudo os estudos de hibridação a partir de conflitos no

sinal filogenético estão em fases iniciais.

A família Orchidaceae, em especial, é marcada pela presença de grande quantidade

de híbridos artificiais e naturais, tanto em nível intergenérico como interespecífico (Pabst

& Dungs, 1975, 1977; Braem, 1995; Borba & Semir, 1998; Nielsen, 2000; Klier et al.

1991, Barkman & Simpson, 2002; Azevedo et al., 2006). Assim como na família, o gênero

Cattleya é marcado pela presença de grande quantidade de híbridos naturais. Fowlie (1977)

e Pabst & Dungs (1975) citam pelo menos 24 híbridos naturais para o grupo bifoliado de

Cattleya, entretanto esse número provavelmente é muito maior. Braem (1995), por

exemplo, descreveu mais um híbrido natural dentro do grupo, Cattleya × tenuata

V.P.Castro & Campacci ex G.J.Braem, resultante do cruzamento de C. elongata

8

Barb.Rodr. com C. tenuis Campacci & Vedovello. Alguns híbridos naturais (por exemplo,

C. × dolosa Rchb.f. (C. loddigesii × C. walkeriana), C. × elegans C.Morren (C. tigrina

A.Rich. × C. purpurata (Lindl. & Paxton) van den Berg) e C. × albanensis (C. warneri

T.Moore × C. grandis (Lindl. & Paxton) A.A.Chadwick) chegam a formar verdadeiros

enxames de indivíduos, as vezes compondo populações simpátricas em relação as

populações das espécies parentais. A presença de um número cromossômico pouco

variável (2n = 40) dentro do gênero Cattleya bem como as semelhanças morfológicas e de

polinizadores pode ter contribuído para possíveis processos de hibridação homoplóides.

Estudos anteriores envolvendo espécies do grupo bifoliado usando dados apenas de

ITS e de plastídeos apresentaram baixo suporte para a maioria dos clados formados, e

sugeriram a adição de mais regiões do genoma plastidial e/ou a utilização de genes

nucleares de copia simples para melhorar a compreensão sobre a evolução do grupo (van

den Berg et al., 2000, 2009). Além disso, os estudos sugerem que a evolução de algumas

espécies dentro do gênero Cattleya pode estar associada a processos de reticulação (van

den Berg et al., 2000, 2009). Diante disso, o presente estudo teve como objetivos: (1)

produzir uma hipótese filogenética para as relações entre as espécies dentro do grupo

bifoliado do gênero Cattleya, (2) identificar, a parir das incongruências geradas entre os

diferentes conjuntos de dados, espécies com possível origem envolvendo evolução

reticulada e (3) testar a variabilidade de novas regiões plastidiais e nucleares para a

subtribo Laeliinae.

9

2. METODOLOGIA

2.1. Materiais de plantas

O estudo molecular para o grupo bifoliado de Cattleya foi conduzido a partir de

sequências de DNA. Na análise filogenética foi utilizado um indivíduo de cada espécie, ou

mais indivíduos em espécies que apresentam ampla distribuição geográfica ou variedades

geográficas. O DNA de todas as espécies encontra-se armazenado em Biofreezer a - 85 °C

no Laboratório de Sistemática Molecular de Plantas (LAMOL) da UEFS.

Na reconstrução filogenética, a definição do grupo interno e externo foi baseada

nos resultados dos trabalhos anteriores de filogenia da subtribo Laeliinae (van den Berg et

al., 2000, 2005, 2009). O grupo interno foi composto pelas 21 espécies do grupo

“Bifoliado” (ver Anexo I e II), mais algumas espécies do grupo “Unifoliado”: C. labiata

Lindl., C. lawrenceana Rchb.f., C. lueddemanniana Rchb.f., C. luteola Lindl., C. wallisii

Linden ex. Rchb.f. e alguns representantes do grupo das espécies transferidas do gênero

Sophronitis para Cattleya (as antigas Laelia brasileiras): C. lundii (Rchb.f. & Warm) van

den Berg, C. pfisteri (Pabst & Senghas) van den Berg, C. purpurata (Lindl. & Paxton) van

den Berg e C. sincorana (Schltr.) van den Berg. Para compor o grupo externo, foram

usadas duas espécies do gênero Brassavola (B. cucullata (L.) R.Br. e B. tuberculata

Hook.) e duas espécies do gênero Rhyncholaelia (R. digbyana (Lindl.) Schltr. e R. glauca

(Lindl.) Schltr.).

2.2. Extração de DNA

O DNA de cada amostra foi extraído utilizando uma modificação do protocolo 2x

CTAB de Doyle & Doyle (1987), adicionando um passo inicial de maceração em 2ml de

STE (NaCl 5M, Tris-HCl 1M, EDTA 0,5M, pH 8.0) gelado, seguindo de centrifugação, e

depois tampão CTAB 2% (brometo de cetilmetil amônio) e purificação com

clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) como no protocolo original, adaptado para

microtubos. A limpeza do pellet foi realizada duas vezes com álcool 70% e posterior

suspensão em tampão TE. A concentração do DNA extraído foi estimada no gel de agarose

a 1%, a partir do padrão de banda do marcador Lambda – Hind III, usando o programa

Kodak 1D 3.6.

10

2.3. Obtenção e análise das sequências de DNA

Inicialmente foram feitas buscas no GenBank do NCBI (National Center for

Biotechnology Information) e obtidas todas sequências de estudos prévios para as espécies

em estudo (ver Anexo I e II).

Objetivando encontrar regiões com níveis consideráveis de variação foram testadas

diversas regiões tanto de cpDNA quanto rnDNA e regiões nucleares de cópia única. A

maioria das regiões plastidiais testadas são regiões não codificantes (introns ou

espaçadores intergênicos) relatados por Shaw et al. (2005, 2007) e Hollingsworth et al.

(2009) como variáveis e indicadas para estudos de baixo nível taxonômico. Além dessas

regiões plastidiais foi usada a região ycf1 (hypothetical chloroplast open reading frame 1),

sugerida por Neubig et al. (2009) como uma região variável e informativa para estudos no

nível de espécies dentro da família Orchidaceae. Em relação às regiões nucleares, foram

testadas as regiões sugeridas por Li et al. (2008). Destas, apenas a região amplificada com

o primer Agt1 (gene da enzima alanina-glyoxylato aminotransferase) apresentou sucesso

tanto na amplificação como no sequenciamento e, portanto, foi utilizada nesse estudo.

Mais três regiões nucleares também foram testadas, Rpb2 (Ronçal et al., 2005), PgiC (Ford

et al., 2006) e o espaçador externo transcrito ETS (com o primer ETS-Orchid, Monteiro,

2007, e 18S-IGS, Baldwin & Markos, 1998).

As reações em cadeia da DNA polimerase (PCR), foram executadas em

termociclador (GeneAmp. PCR System 9700) utilizando os pares de oligonucleotídeos

iniciadores (primers) específicos para cada região (Tabela 1). As reações foram realizadas

em um volume total de 15-25 μL, contendo os seguintes componentes: 1× do tampão (100

mM Tris-HCl), 2,5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 7.5 pmol de cada oligunucleotídeo

iniciador (primer), 2,5 unidades de Taq polimerase de DNA (Phoneutria) e

aproximadamente 1 ng de DNA genômico. Em amostras que apresentaram dificuldade na

amplificação foram utilizados aditivos como 1M de Betaína, 1µg de BSA e 2% de DMSO.

Para as regiões Atg1 e rpl32 foi utilizado o Kit de amplificação TopTaq (Quiagen). Os

parâmetros das reações de amplificação para cada região estão descritos na Tabela 1.

Os produtos da reação de PCR foram quantificados através de eletroforese em gel

de agarose a 1% de concentração com tampão Sódio Borato (Brody & Kern, 2004), por

60min à 100V, 62W, 60ma em fonte eetroforética (Consort-E-832). O gel foi corado com

11

brometo de etídio (5μg/mL) e visualizado em um transluminador de luz ultravioleta (UV).

As concentrações (em ng) dos produtos da PCR foram estimadas pela comparação da

intensidade das bandas produzidas na PCR com a intensidade das bandas do marcador

Lambda – Hind III, através do programa Kodak 1D 3.6.

Todos os produtos da PCR foi purificados por precipitação com Polietileno Glicol

(PEG 8000 10% e NaCl 2,5M) e ressuspendidos em mesmo volume da PCR com água

ultrapura.

As reações de sequenciamento ocorreram num volume final de 10µl, com 1,5µl

(tampão 1,0 µl e 0,5µl Big Dye) do Kit Big Dye terminator versão 3.1 (Applied

Biosystems), 2,5 pmol de primer e aproximadamente 5ng de DNA para cada 100pb de

produto da PCR. As amostras foram sequenciadas em ambas as direções no sequenciador

automático 3130XL DNA Analyzer (Applied Biosystems) no LAMOL.

2.4. Edição das sequências e alinhamento das matrizes

Os eletroferogramas obtidos foram editados através do programa PREGAP-4 e

GAP4 do Pacote Staden (Staden et al., 1998) e as sequências obtidas foram submetidas à

pesquisa no BLASTn do NCBI. As sequências editadas foram alinhadas de forma

automática no programa Muscle versão 3.6 (Edgar, 2004). O resultado do alinhamento foi

manualmente revisado no programa Mesquite2 (Maddison & Maddison, 2010), seguindo

as diretrizes de Kelchner (2000). Regiões ambíguas foram excluídas da análise e os indels

foram codificados pelo método de Codificação Simples (Simmons & Ochoterena, 2000) no

programa SeqState versão 1.4.1 (Müller, 2005).

2.5. Análise filogenética dos dados

A construção das árvores de espécies seguiu o protocolo estabelecido por van der

Niet & Linder (2008) que consiste na identificação da incongruência, teste de sua

significância, identificação das causas de incongruência e reconstrução da árvore de

espécies. A identificação das incongruências foi realizada a partir do Testes de

Homogeneidade de Partição (THP) (Farris et al., 1995). Os testes foram conduzidos no

PAUP* (Phylogenetic analysis using parsimony) versão 4.0b10a (Swofford, 2002) através

do critério de Máxima Parcimônia (MP), utilizando busca heurística com 1000 réplicas, 5

adições randômicas de táxon, rearranjo das árvores com algoritmo TBR (tree-bisection

12

and reconnection) e salvando 15 árvores a cada replicação. Os testes de congruência foram

feitos inicialmente entre as regiões de cada genoma par a par (plastidial e nuclear) e depois

entre os conjuntos de dados dos dois genomas. As matrizes de nucleotídeo e a matriz de

gaps de uma mesma região foram tratadas como conjunto de dados independentes. As

análises de THP processaram-se com a inclusão progressiva de uma região e avaliação da

congruência desta com os demais conjuntos de dados já analisados. Caso não fosse

detectada incongruência, um novo conjunto de dados era adicionado, se o contrário fosse

observado, o conjunto de dados incongruente era retirado da análise e esta seguia com a

adição de um novo conjunto de dados. Foram feitas várias réplicas do teste começando

com a adição inicial com regiões diferentes para evitar víeis de confundimento.

As análises de MP foram realizadas individualmente para cada conjunto de dados e

de maneira combinada. As análises combinadas foram assim denominadas: análise

Plastídeo (combinada com todos os dados de plastídeo), análise Combinada I (composta

por todos os dados plastidiais mais os dados de ITS e agt1) e análise Combinada II

conduzida com as mesmas regiões da análise Combinada I, excluindo apenas as espécies

indicada indiretamente no teste de THP como responsáveis pelas incongruências entre as

topologias (C. aclandiae Lindl., C. dormaniana, C. porphyroglossa Linden & Rchb.f., C.

schilleriana Rchb.f. e C. tigrina). Análises de MP foram conduzidas no PAUP a partir de

buscas heurísticas, através da parcimônia de Fitch (1971), com 3.000 replicações, adição

aleatória de táxons e rearranjos das árvores com algoritmo TBR. Foram salvas 15 árvores

em cada pseudo-replicação, evitando assim a buscas extensivas em ilhas subótimas. Uma

segunda análise foi realizada com buscas heurísticas, através da parcimônia de Fitch, sem

limites de replicação, algoritmo TBR, tendo como ponto de partida o conjunto de árvores

produzidas na primeira análise. A segunda análise de cada conjunto de dados foi finalizada

quando o conjunto de árvores encontradas somava 30.000 (trinta mil) árvores. Nas

análises, os caracteres receberam pesos iguais, e os estados dos caracteres foram

especificados como não ordenados. A otimização dos comprimentos de ramos foi do tipo

ACCTRAN (Accelerated transformation). O suporte dos clados foi avaliado através de

bootstrap não-paramétrico dos caracteres (Felsenstein, 1985), por meio de busca

heurística, com 1.000 replicações, adição simples de táxons e rearranjos através do

algoritmo TBR. Foram salvas 15 árvores a cada pseudo-replicação evitando-se assim a

buscas em ilhas subótimas. O suporte do bootstrap, porcentagem de bootstrap (PB), foi

13

interpretado como: de 50-70 baixo, 71-85 moderado e forte quando superior a 85 (Kress et

al., 2002).

Os modelos evolutivos para a Inferência Bayesiana (IB) foram obtidos através do

Critério de Informação de Akaike (AIC) no programa MrModeltest 2.3 (Nylander, 2008),

individualmente para cada região. Para os indels foi utilizado o modelo coding=all

oferecidos pelo MrBayes 3.1.2 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003). Nas análises combinadas,

os dados de cada região foram particionados e a cada um deles aplicado o modelo

evolutivo mais adequado. Eles foram analisados em conjunto, mas desligados entre si, de

modo que os parâmetros foram estabelecidos individualmente para cada uma das regiões.

As análises foram conduzidas no programa Mrbayes com 18.000.000 gerações, salvando

uma árvore a cada 1.000 gerações (evitando assim autocorrelação entre as árvores

produzidas), em duas corridas simultâneas, cada qual com três cadeias quentes e uma fria.

Em cada análise, tentou-se utilizar apenas as árvores geradas após a convergência entre as

corridas (desvio padrão das freqüências entre as corridas < 0,01). As árvores selecionadas

foram utilizadas para construir um consenso de maioria no PAUP*, de modo que as

porcentagens de cada clado representam sua probabilidade posterior (PP).

Vários estudos (Cummings et al., 2003; Simmons et al., 2004) tem mostrado que os

valores de PP são inflados e que devem ser interpretados com cautela. Diante de tais

achados seguimos a recomendações de Erixon et al. (2003) e consideraremos clados bem

sustentados aqueles que apresentarem valores de PP igual ou superior a 95%. O qual

corresponde a valores de bootstrap na parcimônia ao redor de 70% (Hillis & Bull, 1993;

Alfaro et al., 2003).

Os mesmos conjuntos de dados submetidos a análise de MP foram também

submetidas a análises a partir do método de distância, utilizando o algoritmo de Neighbor-

joining (NJ) (Saitou & Nei, 1987) a partir da distância de Jukes e Cantor (JC). O objetivo

principal foi checar a existência de atração de ramos-longos na análise de MP através da

comparação das topologias mais parcimoniosas com a árvore gerada na análise de NJ.

2.6. Evolução Reticulada

Os conflitos no sinal filogenético nas diferentes topologias (incongruências) foram

filtrados e graficamente representados pelo filtro super-rede (supernetwork) (Splitstree

4.10; Huson & Bryant, 2006). A rede de consenso (consensus network) foi construída no

14

programa Dendroscope 2.3 (Huson et al., 2007) a partir do algoritmo de galhas (galled

network algorithm) o qual infere cada evento de reticulação independente de todos os

outros.

O consenso de galhas network foi construído a partir das três árvores geradas nas

análises de bootstrap (MP) realizadas separadamente para a matriz Plastídeo, para os dados

de ITS e para os dados de agt1. Foram utilizadas como árvores de entrada no programa

Dendroscope, o consenso do bootstrap de cada um dos conjuntos de dados com valores de

sustentação igual ou superior a 50%. Foram conduzidas análises adotando como limite de

sustentação da possibilidade de reticulação 20 e 30%. Para as diferenças em amostragem

de táxons nos diferentes conjuntos de dados, devido a problemas na amplificação e

sequenciamento, foi utilizada a correção a partir do algoritmo Z-closure, implementado

dentro do Dendroscope, o qual considera aos táxons ausentes como dados faltantes (Huson

et al., 2004).

15

3. RESULTADOS

3.1. Características gerais do conjunto de dados

O presente estudo utilizou um total de 513 sequências de DNA. Destas, 230 foram

baixadas do GenBenk e 283 foram geradas nesse estudo, das quais 109 são inéditas para o

gênero Cattleya (Anexos I e II). As 283 sequências foram obtidas a partir de onze regiões

plastidiais (atpF-atpH, ndhJ, psbK-psbI, ycf1, rpoB, rpoC1, rpl32-trnL, trnL-trnF (íntron,

exon e espaçador intergênico, considerando aqui o íntron e o espaçador intergênico como

duas regiões), trnD-trnT e trnS-trnG) e duas regiões nucleares (agt1 e ITS) (Tabela 1).

Entre as dezesseis regiões utilizadas, oito continham indels (Tabela 2). Contudo, apenas os

indels de quatro regiões (atpF-atpH, rpl32-trnL, trnL-trnF e ITS) apresentaram sinal

filogenético e, portanto foram utilizados nas análises. A região ETS apresentou boa

amplificação para cinco espécies e apenas três destas apresentaram bom sequenciamento.

Diante deste resultado, a região foi excluída das análises. A região Rpb2 apresentou boa

amplificação para 80% das espécies utilizadas no estudo. Entretanto, as amostras

apresentaram sérios problemas no sequenciamento, muitos desses devido a existência de

cópias paralógas. Frente ao limitado tempo existente para a execução do projeto, optou-se

por não clonar a região e encontrar cópias ortológas, portanto, a mesma foi excluída das

análises. As análises Plastídeo e Combinada I incluíram 44 terminais cada uma e a análise

Combinada II incluiu 39 terminais (Tabela 2).

A matriz completa (Combinada I) com todos os dados das 16 regiões utilizadas

totalizou 11.506 caracteres, sendo 11.308 caracteres referentes aos nucleotídeos e 119

caracteres referentes aos indels. Dos 11.506 caracteres, 5,23% são variáveis, e 3,43% são

informativos para a parcimônia. Os dados referentes ao tamanho das matrizes alinhadas,

número de terminais, número de sítios variáveis, número de passos evolutivos das árvores

geradas, número de árvores salvas, Índices de Retenção, Consistência bem como os

modelos evolutivos selecionados para a análise bayesiana são apresentados na Tabela 2.

As corridas em paralelo na IB não alcançaram a estabilidade (média de desvio <

0,001) em nenhuma análise. Mesmo depois de correr 22.000.000 de gerações para os dados

de Plastídeo e 20.000.000 de gerações para os dados da matriz Combinada I as médias de

desvio entre as duas corridas ainda eram 0,020895 e 0,022649, respectivamente.

16

Entretanto, esses valores de desvio entre as corridas já tinham sido alcançados e

permaneciam mais ou menos constantes desde as 11.000.000 de gerações nos dados

Plastídeo e 13.000.000 de gerações nos dados Combinada I. Objetivando retirar o máximo

de árvores discrepantes, e levando em consideração que foram salvas uma árvore a cada

1.000 gerações, foram excluídas das análises as primeiras 13.000 árvores de cada corrida

na análise Plastídeo e 14.000 de cada corrida na análise Combinada I. Por fim, ao juntar as

árvores das duas corridas dentro de cada análise, os conjuntos finais foram compostos por

18.000 árvores na análise Plastídeo e 12.000 árvores na análise Combinada I. De maneira

similar aos resultados anteriores, a análise Combinada II não alcançou a estabilidade das

corridas. Entretanto, a média de desvio entre as duas corridas ficou constante (0,012345) a

partir de 13.000.000 de gerações. A análise foi conduzida até 20.000.000 de gerações

sendo utilizadas as últimas 7.000 árvores de cada corrida, totalizando 14.000 árvores como

representativas da distribuição posterior.

Os clados encontrados no presente estudo se baseiam na topologia gerada na IB a

partir da matriz Combinada I e foram rotulados da seguinte maneira. O clado A

denominado Walkeriana é formado por C. nobilior, C. violacea e C. walkeriana. O clado B

denominado Intermedia é formado por C. dormaniana, C. forbesii Lindl., C. harrisoniana,

C. intermedia Graham ex Hook., C. loddigesii e C. porphyroglossa. O grande clado C,

denominado Falcata, é formado pelas demais espécies do grupo bifoliado. O clado C se

divide em dois subclados (clado D e clado E). O subclado D (Elongata), pouco sustentado

nas análises, é formado por C. elongata, C. kerrii Brieger & Bicalho e C. schilleriana. O

subclado E (Bicolor) é formado por C. amethystoglossa Linden & Rchb.f. ex Warner, C.

bicolor, C. granulosa, C. guttata Lindl., C. schofieldiana, C. tenuis, C. tigrina e C. velutina

Rchb.f..

3.2. As Incongruências no conjunto de dados

O resultado do THP entre as partições referentes aos nucleotídeos de todos os

plastídeos mais os indels da região rpl32-trnl não apresentaram incongruência significativa

(p = 0,104). O THP realizado com a matriz Plastídeo (com a adição dos indels das regiões

atpF-atpH e trnL-trnF) indicou incongruência entre o conjunto de dados (p = 0,016).

Entretanto se admitirmos 99% como nível de confiança para o teste de THP, como

sugerido por Cunningham (1997) e Hipp et al. (2004), o valor apresentado mostra

17

congruência no conjunto de dados. O resultado do THP indicou incongruência significativa

(p = 0,004) ao combinar a matriz Plastídeo com o conjunto de dados de ITS (nucleotídeos

mais indels). Erros humano representa uma das causas de incongruência nos conjuntos de

dados, esses erros geralmente estão associados a troca de material na amplificação ou

seqüenciamento (van der Niet & Linder, 2008). Diante da diferença no posicionamento de

C. schilleriana e C. porphyroglossa na árvore de ITS em relação aos dados plastidiais, uma

nova amostra de cada espécie foi amplificada e sequenciada para esta região, entretanto as

posições dessas espécies na topologia não se alteraram, mostrando que a incongruência não

está relacionada a essa causa. Testes feitos com a combinação dos dados da região nuclear

agt1 com as demais regiões mostraram que esse conjunto de dados é incongruente tanto

com a região nuclear ITS (p = 0,005) bem como com o conjunto de dados plastidiais (p =

0,009). O THP conduzido na matriz combinada I revelou incongruência entre o conjunto

de dados (p = 0,002).

Seguindo os critérios utilizados por Pelser et al. (2010) na detecção de

incongruências fortemente sustentadas, detectamos que a presença de C. aclandiae, C.

dormaniana, C. porphyroglossa, C. schilleriana e C. tigrina geravam topologias

incongruentes. A análise de THP a partir da matriz Combinada com a remoção dessas

espécies mostrou completa congruência entre os conjuntos de dados (p = 0,110). Diante

desses resultados, optamos por apresentar e comparar as topologias das análises

Combinada I e Combinada II.

3.3. Análises individuais

As comparações entre as topologias apresentadas nas análises de Neighbor-Joining

(árvores não apresentadas) com as da MP não evidenciaram significativa ocorrência de

atração de ramos longos. Esse resultado sugere que não há desbalanços significantes nas

taxas evolutivas entre as espécies a ponto de comprometer as análises de MP.

De modo geral, as análises de MP individuais das regiões plastidiais e da região

nuclear agt1 produziram árvores com pouca resolução entre os terminais (Figuras 1, 2, 3 e

4). Entre os plastídeos, a região rpl32-trnL apresentou maior proporção de caracteres

informativos para a parcimônia (ca. 4,4%) (Tabela 2).

18

3.4. Análises Plastídeo

A matriz Plastídeo totalizou 10.292 caracteres sendo 4,1% variáveis e 2,3%

informativos para a parcimônia. A busca heurística com os dados de plastídeo geraram

30.000 árvores (limitado artificialmente) igualmente parcimoniosas com 843 passos, com

índice de consistência (IC) de 0,9197 e índice de retenção (IR) de 0,8050 (Tabela 2).

Como esperado, o consenso de maioria da IB de Plastídeo gerou uma topologia mais

resolvida que a gerada na análise de MP (Fig. 5). O grupo bifoliado mostrou-se

monofilético com 99% PB e 1.0 PP. O clado A (91% PB e 1.0 PP) aparece na base do

grupo bifoliado. Internamente, C. aclandiae aparece como espécie irmão das demais que se

dividem entre o clado A e clado C. O clado B (83% PB e 1.0 PP) apresentou tanto na

análise de MP como na IB forte suporte para as relações internas. O clado C e E foram

apenas reconhecidos na IB, entretanto o suporte apresentado é muito baixo. Cattleya

guttata e C. tigrina aparecem como espécies irmãs com 96% PB e 1.0 PP. As demais

relações dentro do grupo apresentam baixo suporte de bootstrap e de probabilidade

posterior.

3.5. Análises Combinadas I e II

A matriz Combinada I gerou na busca heurística 48 árvores igualmente

parcimoniosas com 1.522 passos, com CI = 0,7020 e RI = 0,7371 (Tabela 2; Fig. 6). O

grupo bifoliado mostrou-se monofilético (100% PB e 1.0 PP). De maneira similar aos

resultados encontrados na análise Plastídeo, o clado A aparece na base do grupo bifoliado

(86% PB e 1.0 PP), seguido mais internamente por C. aclandiae. O posicionamento de C.

dormaniana na base do clado B foi evidenciado na IB a partir da análise Combinada I (1.0

PP). Entretanto, a análise de MP não recuperou essa relação. Além disso, o suporte do

clado B (C. forbesii, C. harrisoniana, C. intermedia, C. loddigesii e C. porphyroglossa)

apresentou baixa sustentação na análise de MP (54 % PB). Entretanto, as relações entre C.

forbesii, C. intermedia, C. harrisoniana e C. loddigesii apresentam alto suporte nas duas

análises. Diferente da análise de MP, o clado C aparece com bom suporte (0.96 PP) e

abarcam as espécies classificadas por Withner (1988) como pertencentes ao subgênero

Falcata (excluindo C. porphyroglossa e C. schilleriana), subgênero Schomburgkoidea (C.

bicolor e C. tenuis – excluindo C. elongata e C. violacea) e C. velutina (classificada por

este autor como pertencente ao subgênero Aclandia). A IB apresentou alto suporte para o

19

par C. guttata e C. tigrina (0.99 PP). Entretanto a análise de MP não apresentou suporte

para essa relação. O clado E apresentou alto suporte na IB (1.0 PP), entretanto esse clado

não foi reconhecido na MP. Os espécimes de C. bicolor BRA e C. bicolor FOR formam

um clado com 0.94 de PP, seguido por C. granulosa e C. velutina com baixo suporte. O

clado composto por C. bicolor DIA, C. bicolor ITA, C. tenuis e C. schofieldiana BA

aparece com um bom suporte (0.95 de PP). Entretanto as relações entre esses clados não

são resolvidas em nenhuma das análises.

A matriz Combinada II gerou na busca heurística 1.158 árvores igualmente

parcimoniosas com 1.356 passos, com CI = 0,7316 e RI = 0,7632 (Tabela 2; Fig. 7). O

grupo bifoliado mostrou-se monofilético (100% PB e 1.0 PP). A exclusão das espécies que

geravam topologias incongruentes fez desaparecer o subclado D e cosequentemente o

clado C encontrado na IB com a matriz Combinada I (Fig. 7). As espécies que compunham

esse clado se distribuíram: C. kerrii foi para a base do clado B (50% PB e 0.67 PP) e C.

elongata se posicionou com alto suporte (99% PB e 1.0 PP) na base do grado formado

pelos clados B e E (clado C na análise Combinada I, com a exclusão de C. elongata e C.

kerrii). Dentro do clado E, C. amethystoglossa e C. guttata formaram um par de espécies

(0.89 PP). C. schofieldiana BA e C. schofieldiana ES formaram um grado na base do

subclado que contem C.bicolor DIA, C. bicolor ITA e C. tenuis (0.96 e 0.52 de PP,

respectivamente).


As diferenças entre as árvores foram representadas graficamente pelo filtro da

super-rede (Fig. 8). As regiões de interligação na rede representam conflitos no sinal

filogenético entre as topologias das diferentes regiões (plastídeos, ITS e agt1). As áreas de

incongruência dentro do grupo bifoliado residem principalmente na base do clado A, clado

B e nas relações de C. amethystoglossa, C. bicolor ITA, C. guttata e C. tigrina. O

consenso de rede de galhas dentro das interligações representa uma hipótese alternativa de

inferência filogenética entre as árvores dos três conjuntos de dados (Fig.9). Os consensos

de redes de galhas conduzidos com 20 e 30% de limite apresentaram a mesma topologia de

reticulação (Fig. 9). Entre as espécies envolvidas em uma possível reticulação encontra-se

C. tigrina, C. bicolor BRA-2, o complexo (C. dormaniana, C. porphyroglossa e C.

schilleriana) e C. aclandiae.

20

4. DISCUSSÃO

4.1. Evolução molecular

Seguindo uma tendência apontada por Degnan & Rosenberg (2009) em sistemática

molecular, o presente estudo utilizou uma grande quantidade de regiões (dezesseis) tanto

do genoma plastidial (quatorze) quanto do genoma nuclear (duas). Apesar do esforço de

coleta de dados, as topologias geradas não apresentaram boa resolução em todos os nós. De

maneira geral as taxas de evolução de sequências de plastídeo em Orchidaceae parecem

bastante baixas (ex. rbcL, Cameron et al.,1999 e Freudenstein et al., 2004). Além disso, a

baixa resolução poderia estar associada a presença de homoplasias ou mesmo a um curto

tempo de cladogênese, como sugerido por Rokas & Carrol (2005). A presença de

homoplasia dentro da subtribo Laeliinae não é algo incomum e muitos dos caracteres

morfológicos utilizados na classificação podem ser especialmente homoplásticos, sendo a

morfologia floral muito susceptível a mudanças rápidas, geralmente atribuídas à seleção

relacionada ao tipo de polinização (van den Berg et al. 2000). Cattleyaya dormaniana, por

exemplo, apresenta características morfológicas típicas do grupo bifoliado. Entretanto, a

presença de oito polínias (apesar de quatro serem rudimentares) nessa espécie difere de

todas as espécies do grupo (e das Cattleyas no conceito tradicional anterior ao de van den

Berg, 2008) que apresentam quatro. A presença de oito polínias parece ser um estado mais

primitivo na subtribo (van den Berg et al., 2000). Porém, considerando a profunda inserção

filogenética de C. dormaniana no clado bifoliado (Fig. 5 e 6), fica claramente evidenciado

que o se trata de um caráter secundariamente derivado.

O maior nível de variação apresentado pela região rpl32-trnL entre todos os

plastídeos condiz com os resultados de Shaw et al. (2007). Entretanto, a variação

apresentada por essa região não foi suficiente na resolução de alguns clados dentro do

grupo bifoliado. Os indels da região rpl32-trnL foram muito informativos para a

parcimônia, porém o tamanho destes no gênero Cattleya (26 pb) foi bem menor que os

encontrados em outros gêneros de angiospermas (Minuartia (Caryophyllaceace) com 56 pb

e Magnolia (Magnoliaceae) com 50 pb) (Shaw et al., 2007). De maneira similar aos

resultados de Neubig et al. (2009) a região ycf1 mostrou-se mais variável que a região

matK. Entretanto, o nível de variação apresentado pela região não foi capaz de produzir

uma filogenia com boa resolução. As demais regiões plastidiais apresentaram baixa

variação, com destaque para aquelas codificantes utilizadas pelo Plant Working Group do

21

CBOL (accD, rpoB, rpoC1, ndhJ) (Hollingsworth et al., 2009). Apesar da baixa variação

apresentada pelos dados plastidiais, as regiões rpl32-trnL e ycf1 mostram-se como uma boa

opção para estudos de espécies próximas.

4.2. Relações entre as espécies do grupo bifoliado

Como esperado, a análise de inferência bayesiana conseguiu recuperar um maior

número de clados que as análises de MP e, portanto será usada como base para a discussão

entre as relações das espécies.

A presença de duas ou três folhas sobre o pseudobulbo é uma caráter bem marcante

na separação do grupo bifoliado em relação às demais espécies do gênero Cattleya sendo

aqui apenas reafirmado o monofiletismo já reconhecido geneticamente desde os trabalhos

de van den Berg et al. (2000, 2009).

O posicionamento mais basal do clado A (C. nobilior, C. violacea e C. walkeriana)

condiz muito bem com aspectos da morfologia como a presença de uma ou duas folhas

sobre os pseudobulbos em C. walkeriana o pequeno porte e o pseudobulbo fusiforme

presente em C. nobilior e C. walkeriana. As similaridades morfológicas entre essas

espécies são tão grandes a ponto de alguns autores chegaram a questionar sobre a validade

de separar o par em duas espécies (Braem, 1984). Entretanto, estudos feitos a partir da

morfometria floral (van den Berg, 1996) e RAPD (Jin et al., 2004) mostraram uma nítida

separação entre as duas espécies. Os resultados da MP e IB na Combinada I mostraram

uma maior proximidade entre C. nobilior e C. violacea (56% PB e 1.0 PP), sendo C.

walkeriana espécie irmã desse par. Apesar da divergência no posicionamento entre as

espécies do clado A em relação ao esperado pela morfologia, algumas características

comuns entre ela podem ser observadas, como flores de coloração rósea escura e disco

amarelo no labelo (ver Anexo III). Além disso, ao associar a possível origem e irradiação

da subtribo Laeliinae da América Central para a América do Sul (van den Berg et al., 2000;

Antonelli et al., 2010) com o posicionamento basal do clado A e ampla distribuição de C.

violacea (desde as matas de galeria do Planalto Central até a Amazônia Peruana e

Colombiana, bem como Venezuela e Guiana (Braem, 1984)) é completamente admissível a

hipótese de que essa espécie seja derivada da linhagem mais antiga do grupo bifoliado.

Provavelmente, durante sua dispersão em direção ao Brasil, houve processo de especiação

22

e formação de C. walkeriana no bioma cerrado, a qual se expandiu dentro deste bioma na

região Sudeste e Centro-Oeste (Goiás, Minas Gerais e São Paulo) (van den Berg, 1996).

Barreiras geográficas ou fatores ecológicos levaram a especiação dentro das populações de

C. walkeriana originando C. nobilior que preferencialmente ocupou as regiões ao Norte e

Oeste (sobretudo Oeste de Goiás, Mato Grosso, Tocantins e Mato Grosso do Sul) de C.

walkeriana, e se expandiu também até a Bolívia. Populações de C. nobilior, como ocorre

na distribuição atual (Fowlie, 1977; van den Berg, 1996), permaneceram mantendo contato

com populações de C. violacea na transição entre o Planalto Central e a região amazônica.

Esse contato provavelmente pode ter permitido repetidos processos de hibridação e

introgressão entre populações dessas duas espécies. A presença de duas folhas em C.

nobilior poderia ser decorrente desse processo (ou alternativamente ser plesiomófico).

Os estudos morfométricos e de sequência de DNA indicaram proximidade de C.

aclandiae com o clado A (van den Berg, 1996 e van den Berg et al., 2000,

respectivamente). A adição dos dados de plastídeo no presente estudo sugere que C.

aclandiae está mais internamente no grupo e compõe a base das demais espécies

bifoliadas. O conflito detectado no posicionamento de C. aclandiae indica que a origem

dessa espécie possa ter surgido por processo de reticulação, como discutido mais a frente.

Entre todos os clados formados, o clado B (espécies relacionadas a C. intermedia)

foi o mais sustentado em todas as análises. Com exceção de C. porphyroglossa, todas as

espécies do clado B apresentam uma morfologia muito similar e sempre foram

consideradas como espécies próximas (Cogniaux, 1898; Fowlie, 1977; Brieger et al., 1981,

Withner, 1988). A morfologia dessas espécies é muito parecida, sendo marcada pelas

pétalas geralmente mais estreitas que as sépalas, lobos laterais do labelo proeminentes e

arredondados, lobo mediano do labelo relativamente pequeno, e pequenas reentrâncias

(sinus) separando os lobos laterais gerando um istmo (distância entre o término da base dos

lobos laterais a base do lobo mediano) curto. As flores de todas as espécies apresentam

colorações similares em tons rosa-claro (com exceção de C. forbesii que apresenta

coloração creme-arroxeada) (ver Anexo III). A formação dos pares de espécie C.

harrisoniana - C. loddigesii, C. forbesii - C. intermedia e o posicionamento mais basal de

C. dormaniana é completamente concordante com o agrupamento encontrado na análise

morfométrica feita para o grupo (van den Berg, 1996). Todas as espécies que compõe o

grupo ocorrem no litoral Sudeste e Sul do Brasil (apenas C. loddigesii e C. forbesii

23

penetram para o interior), e suas distribuições se sobrepõem na região ao redor da cidade

do Rio de Janeiro e Vale do Paraíba (van den Berg, 1996). Para van den Berg (1996) a

distribuição dessas espécies, o posicionamento mais basal de C. dormaniana dentro do

clado e a presença de oito polínias nessa última indicavam um posicionamento basal do

clado Intermedia dentro do grupo bifoliado. De fato, C. dormaniana é a espécie mais basal

do clado, entretanto a presença de oito polínias parece ser homoplástico ao invés de

plesiomórfico e, portanto esse caráter não serve como indicativo para uma posição basal

para este clado.

A maioria das espécies que compõem o clado C sempre foram mantidas juntas nas

diversas classificações feitas para o gênero. Os resultados dos dados moleculares foram

parecidos aos encontrados na morfometria floral (van den Berg, 1996), ao sugerir a fusão

dos subgêneros Falcata e Schomburgkoidea de Withner (1988) e a inclusão de C. kerrii. A

presença de C. velutina no clado C diverge da posição apresentada pelos dados

morfométricos que a colocaram próxima das espécies que compõe o clado A (van den

Berg, 1996). Withner (1988) defendia que a estrutura vegetativa da planta e a exposição da

coluna eram suficientes para colocar C. velutina como próxima de C. aclandiae. Contudo,

a análise de agrupamento conduzida por van den Berg (1996) a partir dos dados dos

pigmentos de flavonóides em pétalas e sépalas de Cattleya de Tosello (1969) agruparam C.

velutina com C. bicolor, de forma similar aos resultados obtidos no presente estudo.

O posicionamento de C. kerrii e C. schilleriana entre os dados de plastídeo e ITS

foram muito discordantes. Os dados de ITS indicaram uma forte relação de C. kerrii e C.

schilleriana (99% PB) com as espécies mais internas do clado B (C. forbesii, C.

harrisoniana, C. intermedia e C. loddigesii) (Fig. 1 D). O forte suporte (84% PB) para o

posicionamento de C. schilleriana entre as espécies do clado B, apresentado pelos dados

de ITS, foi de certa forma surpreendente do ponto de vista da morfologia. Em virtude desse

posicionamento, outro espécime de C. schilleriana foi amplificado e sequenciado,

entretanto o posicionamento não se alterou. A relação de parentesco entre C. schilleriana,

C. elongata e C. kerrii é fracamente sustentada na IB. A exclusão de C. schilleriana da

análise (análise Combinada II – Fig. 7) mudou o posicionamento de C. kerrii. Essa

mudança na topologia reforça a idéia de que o posicionamento de C. schilleriana na base

de C. kerrii e C. elongata deve-se a uma atração dessa espécie por C. kerrii. O

posicionamento de C. kerrii na base do clado B não é tão conflitante com a morfologia

24

floral dessa espécie, alguns autores já reconheciam essa proximidade (por exemplo,

Brieger et al., 1981; Withner, 1988). Entretanto, a análise morfométrica de caracteres

florais revelou uma maior similaridade de C. kerrii com C. amethystoglossa, C. guttata, C.

elongata, C. schilleriana e C. tigrina (van den Berg, 1996).

A morfologia vegetativa e a distribuição de C. elongata e C. kerrii são bastante

diferentes e não sugerem essa proximidade filogenética encontrada no presente estudo.

Cattleya kerrii apresenta plantas de pequeno porte, flores quase sésseis, e pseudobulbos

muito finos, com a presença de uma ou duas folhas sobre o pseudobulbo e hábito epifítico

(Withner, 1988). Cattleya elongata apresenta um grande porte e hastes florais muito longas

(Cruz et al., 2003, 2011). Seu pseudobulbo é o mais espesso entre todas as espécies

bifoliadas, e geralmente contém duas a três folhas. Além disso, ela é a única espécie dentro

do grupo que apresenta hábito rupícola, crescendo diretamente sobre o sol (van den Berg,

1996) (ver Anexo IV). A análise de agrupamento a partir dos pigmentos de flavonóides das

sépalas e pétalas mostrou uma maior similaridade dos pigmentos de C. elongata com

outras espécies de morfologia vegetativa e floral similar, tais como C. granulosa, C.

guttata, C. schofieldiana e C. tigrina (van den Berg, 1996). Em relação à distribuição, C.

elongata ocorre em abundância na Chapada Diamantina no estado da Bahia (Toscano de

Brito & Cribb, 2005). Cattleya kerrii apresenta uma distribuição bem disjunta de C.

elongata, sendo endêmica das planícies litorâneas na Mata Atlântica do Sul da Bahia.

Os diferentes espécimes de C. bicolor não formaram um grupo monofilético em

nenhum dos dados de sequência de DNA. Esse resultado é bem interessante e reflete

algumas considerações sobre a biogeografia dessa espécie. Cattleya bicolor é uma espécie

que apresenta variedades morfológicas, sendo que algumas delas lembram híbridos entre

C. bicolor x C. amethystoglossa e C. bicolor x C. harrisoniana (Withner, 1988). Essas

variedades morfológicas estão associadas a distintas regiões geográficas (Fowlie, 1977).

No presente estudo foram utilizadas quatro representantes das três subespécies de C.

bicolor: C. bicolor subsp. bicolor Fowlie (C. bicolor ITA, distribuída na Vale do Paraíba,

Serra da Bocaina e Serra dos Órgaos), C. bicolor subsp. brasiliensis Fowlie (C. bicolor

FORM e C. bicolor BRA, com ocorrência em matas ripárias sobre solo calcário no

sudoeste de Minas Gerais e em Mata de Brejo no Distrito Federal, respectivamente) e C.

bicolor subsp. minasgeraiensis Fowlie (C. bicolor DIA ocorrendo em matas ripárias na

região leste e central de Minas Gerais). Fowlie (1977) considerava que mesmo

25

apresentando uma distribuição disjunta, a população de C. bicolor de Formiga-MG

apresentava uma morfologia mais similar a C. bicolor subesp. brasiliensis que ocorre no

planalto central. Os resultados da morfometria floral (van den Berg, 1996) bem como o

presente estudo com sequência de DNA confirmam também essa relação. As outras duas

subespécies apareceram com maior relação filogenética com C. tenuis e C. schofieldiana

(Fig. 6). A ausência ou redução dos lobos laterais do labelo em C. bicolor, deixando a

coluna completamente exposta é uma característica única dentro do grupo bifoliado (ver

Anexo IV). Entretanto, a morfologia, o padrão de coloração floral e os hábitos vegetativos

dessa espécie são similares a C. tenuis e C. elongata. Contudo, essa relação só foi

evidenciada entre C. bicolor subsp. bicolor (C. bicolor ITA), C. bicolor subsp.

minasgeraiensis (C. bicolor DIA) e C. tenuis.

A proximidade filogenética entre C. guttata e C. tigrina sempre foi reconhecida por

diferentes autores (por exemplo, Fowlie, 1977; Brieger et al., 1981; Withner, 1988) e

confirmada nos diferentes estudos, até então, feitos para o gênero Cattleya, como as

análises de agrupamento a partir dos pigmentos de flavonóides a da morfologia floral (van

den Berg, 1996). No presente trabalho os dados de plastídeo e da região nuclear agt1

corroboraram com essa idéia, entretanto os dados de ITS separaram essas duas espécies.

As análises de MP e IB a partir da matriz Plastídeo reafirmaram a proximidade entre as

duas espécies com um bom suporte (96 PB e 1.0 PP), já o consenso estrito da MP a partir

dos dados de ITS não evidenciou essa relação (árvore não apresentada). Além disso, as

análises de MP e IB a partir da matriz Combinada I geraram resultados divergentes em

relação a essas duas espécies. A IB reconheceu o par de espécies com 0.99 de PP,

entretanto a MP não apresentou suporte de bootstrap concistente para o par. As diferenças

encontradas entre os dois métodos podem estar atreladas a no mínimo dois fatores.

Primeiro, a origem de uma das duas espécies pode estar associada a um possível processo

de hibridação natural não detectada nos dados de plastídeo (herança uniparental). Segundo,

as diferenças geradas nos dois métodos podem estar relacionadas a uma desigualdade nas

taxas de evolução entre as espécies em relação a região ITS, as quais podem ocasionar a

atração de ramos longos na análise de MP. O posicionamento de C. guttata e C. tigrina

como espécies irmãs nos dados de agt1 poderia ser utilizado para descartar a hipótese de

origem hibrida para uma das espécies, contudo o padrão de herança dos alelos resultante de

uma origem hibrida ainda são pouco conhecidos. Em relação à atração de ramos longos

26

Felsentein (1978) argumenta que métodos que incorporam um modelo explícito de

evolução das sequências, como a inferência bayesiana, são menos susceptíveis a atração de

ramos longos. Entretanto, a comparação da topologia gerada análise de NJ (árvore não

mostrada) com a topologia gerada na análise de MP para os dados de ITS não

evidenciaram atração de ramos longos nas análises de MP. Na análise Combinada II, C.

guttata formou um par de espécies com C. amethystoglossa o que é completamente

concordante com a morfologia dessas espécies e com os resultados de van den Berg

(1996).

Os dois táxons inicialmente tratados como espécimes de C. granulosa (um com

ocorrência no Sul da Bahia e outro com ocorrência em Pernambuco) não se agruparam em

nenhum das regiões analisadas. Os resultados da análise Combinada II, aliado aos

resultados encontrados na morfometria floral das populações dessa espécie (van den Berg,

1996), sugerem que a populações do Sul da Bahia inicialmente tratada como C. granulosa

BA é na realidade C. schofieldiana BA. Dessa maneira C. granulosa apresenta agora uma

ocorrência mais ao norte desde Pernambuco até o Rio Grande do Norte (principalmente em

regiões de restinga nesse último) e C. schofieldiana passa a ter sua ocorrência ampliada

para o estado da Bahia. Outro achado interessante é o não pareamento entre C. granulosa e

C. schofieldiana. As semelhanças na estrutura vegetativa e na morfologia foral sempre

foram reconhecidas e utilizadas como indício de proximidade entre essas espécies (Braem,

1984; Withner, 1988). Os padrões de pigmentos dos flavonóides e da morfometria floral

(van den Berg, 1996) também apontaram para uma forte relação entre C. granulosa e C.

schofieldiana. Entretanto, os resultados das análises indicaram que C. granulosa é mais

próximos filogeneticamente de C. velutina e C. bicolor subsp. brasiliensis. Já C.

schifieldiana seria mais próxima de C. tenuis e das outras subespécies de C. bicolor.

Apesar de os dados das regiões não apontarem para a relação sugerida pela morfologia, os

resultados aqui encontrados, pelo menos para as relações que envolvem C. granulosa,

apresentaram baixo suporte e, portanto devem ser interpretado com cautela.

27


De modo geral os dados de plastídeos e agt1 sustentam alguns posicionamentos

incongruentes com os dados de ITS. Uma possível explicação para essa incongruência

reside na possibilidade de eventos de reticulação/introgressão envolvendo a origem de

algumas espécies no grupo (van der Niet & Linder, 2008; Spalik et al., 2009; Pelser et al.,

2010, Huson et al., 2011). A presença apenas das incongruências não devem ser tomadas

como prova do processo de reticulação/introgressão, mas associação desta com

características biológicas das espécies envolvidas como: distribuição, morfologia e

fenologia podem ser importantes na sustentação dessa hipótese (Rieseberg et al., 1996a).

Os conflitos no sinal filogenético entre os conjuntos de dados, detectados no filtro

da super-rede (Fig. 8), geraram um topologia que divergiu da esperada pela morfologia, e

dentre outros fatores, sugere uma hipótese de evolução reticulada para algumas espécies do

grupo. Diante da grande quantidade de híbridos naturais dentro do grupo bifoliado (Fowlie,

1977; Pabst & Dungs, 1975), aliado ao sucesso de alguns desses híbridos, torna-se

plausível discutir hipóteses filogenética que envolva processos de hibridação para explicar

a evolução de algumas espécies. Devido à baixa amostragem de terminais dos grupos

externos e de Cattleya fora do grupo bifoliado, a discussão será restrita as relações dentro

desta linhagem.

A rede de consenso sugere uma possível origem de C. aclandiae envolvendo o

ancestral do clado A com o ancestral das demais espécies do grupo bifoliado. C. aclandiae

difere das demais espécies do grupo bifoliado, dentre outros fatores, pela ausência da

espata na inflorescência e raízes excepcionalmente espessas (como em C. nobilior e C.

walkeriana) (Braem, 1984). Entretanto, alguns elementos de sua morfologia são comuns

tanto ao clado A como as demais espécies bifoliadas, como o fino pseudobulbo, similar ao

de C. velutina (lembra um fino) e a exposição da coluna devido ao não recobrimento por

parte dos lobos laterais do labelo, como ocorre em C. nobilior, C. velutina e C. walkeriana

(ver Anexo III). O padrão de pigmentação das sépalas e pétalas presente em C. aclandiae

difere do rosa presente no clado A e no clado B (com exceção de C. forbesii). Seu padrão

de pigmentação das sépalas e pétalas lembra o presente em C. schilleriana e C. tigrina (ver

Anexo IV). Esse padrão de pigmentação, mais a presença de sinus no labelo, pseudobulbos

sem engrossamento e folhas múltiplas, presentes no grupo bifoliado, compunham um

28

conjunto de características denominado por Withner (1988) como "Síndrome Costeira

Brasileira". Com exceção de C. bicolor e C. elongata (que também se distribuem mais para

o interior do país) as demais espécies que expressão esse padrão de pigmentação nas

sépalas e pétalas apresentam uma distribuição intimamente costeira.

A presença de C. porphyroglossa dentro do clado B não condiz com a morfologia e

sugere uma explicação alternativa para sua evolução. A morfologia de C. porphyroglossa é

muito diferente das demais espécies do clado Intermedia. Os pequenos lobos laterais com

ápices pontiagudos, o estreito e longo istmo do lobo mediano do labelo, bem como a

presença de granulações em sua superfície, sugere um maior parentesco dessa espécie com

C. granulosa e C. schofieldiana. Essas semelhanças sempre foram reconhecidas nas

diferentes classificações e levaram os autores a colocarem essas três espécies em uma

seção a parte, seção Granulosae (por exemplo, Fowlie, 1977; Withner, 1988). Em

contraste, as flores de C. porphyroglossa são muito menores do que destas duas espécies, e

a planta também é menor e com pseudobulbos finos, similar a C. velutina. A árvore do

consenso de redes sugere a formação de C. porphyroglossa a partir do ancestral do clado B

com um provável ancestral de C. amethystoglossa, C. guttata, C. kerrii e C. schilleriana.

Rieseberg & Carney (1998) comentam que a formação de híbridos é um processo

assimétrico e unidirecional, onde o sucesso do processo depende da espécie que irá

contribuir com o gameta masculino e da espécie que irá contribuir com o gameta feminino.

O posicionamento de C. porphyroglossa gerados pelos dados plastidiais aliado ao tipo de

herança (uniparental) apresentado por esse marcador sugere que o ancestral do clado B

contribuiu de forma materna para a formação dessa espécie.

Aspectos da morfologia floral e o padrão de coloração de C. schilleriana lembram

C. guttata e C. tigrina (ver Anexo IV), e nas diversas classificações propostas para o

gênero essa espécie sempre foi reconhecida como próxima de C. guttata (Cogniaux, 1898;

Pabst & Dungs, 1975; Brieger et al., 1981; Withner, 1988). Na classificação de Withner

(1988) a espécie foi incluída no subgênero Falcata seção Guttatae. Contudo, o labelo de C.

schilleriana apresenta um istmo reduzido e um lobo mediano bem mais largo diferindo do

labelo das outras espécies dessa seção. A análise de agrupamento a partir da morfometria

floral (van den Berg, 1996) mostrou que C. schilleriana apresenta uma grande distância

fenética em relação às demais espécies do subgênero Falcata. O consenso de redes sugere

que a formação de C. schilleriana envolveu a participação do ancestral de C. kerrii ou

29

algum descendente de C. guttata com o ancestral do clado Intermedia. Essa possível

origem de C. schilleriana faz sentido com sua distribuição. C. schilleriana ocorre desde a

Bacia do pequeno Rio Jucu, no médio Espírito Santo (Withner, 1988) até o extremo sul da

Bahia na região de Juçari. Na Bacia do Rio Jucu populações de C. schilleriana ocorrem em

simpatria com C. schofieldiana, C. velutina e C. harrisoniana. Curiosamente, C.

harrisoniana (clado B) é a única que floresce junto com C. schilleriana (Braem, 1994) e a

ocorrência de híbridos naturais entre essas duas espécies é citada na literatura (Fowlie,

1977).

A análise da topologia gerada a partir da matriz Combinada I e do filtro da super-

rede sugere que o clado C como um todo seria derivado de linhagens ancestrais de C.

elongata, a partir da qual ocorreram vários processos de vicariância, especiação, formação

de híbridos e introgressão. Corroborando com a hipótese de van den Berg (1996), a região

norte do Espírito Santo e sul da Bahia seriam o centro secundário de especiação do grupo

bifoliado onde provavelmente teria ocorrido a formação e diversificação das espécies do

clado C (sendo o primeiro centro responsável pela formação das espécies do clado A e do

clado B). Nesse contexto, C. tenuis e C. elongata parecem ser espécies mais antigas do

grupo. A presença de pseudobulbo quebradiço único nessas duas espécies, bem como a

presença de populações de C. tenuis com três folhas sobre o pseudobulbo, característica

muito comum em C. elongata, corroboram essa idéia. A fenologia floral dessas espécies é

semelhante a apresentada pelas espécies do clado A (florescendo de maio a julho) (van den

Berg, 1996) e ao relacionar com o posicionamento do clado A nas topologias, parece ser

uma condição plesiomórfica no grupo. Entretanto, C. tenuis apresenta característica da

morfologia floral compartilhadas por C. elongata, C. bicolor, C. granulosa e C.

schofieldiana. Provavelmente, C. bicolor descende de linhagens ancestrais de C. tenuis,

pois a morfologia floral de C. bicolor lembra a flor de C. tenuis sem a presença dos lobos

laterais do labelo (ver Anexo IV). Uma linhagem descendente desse complexo teria

originado as espécies do subgênero Falcata (Withner, 1988), as quais teriam se

diversificado, mas algumas continuaram mantendo contato com C. bicolor e

provavelmente se envolvendo em processo de introgressão (como C. granulosa, C.

schofieldiana e C. guttata a qual teria originado C. tigrina, ver discussão mais a frente).

Nesse contexto C. kerrii seria uma espécie antiga, intimamente relacionada com a evolução

de C. elongata e do clado intermedia.

30

O padrão de distribuição de C. amethystoglossa, C. bicolor DIA, C. guttata e C.

tigrina, as semelhanças morfológicas entre C. guttata e C. tigrina e a topologia gerada no

consenso da super-rede, sugerem duas hipóteses diferentes e excludentes para a possível

evolução dessas espécies. A primeira reside na idéia de que C. guttata é resultante da

especiação de linhagens de C. tigrina e que a proximidade entre C. bicolor ITA e C.

tigrina é produto de introgressão entre essas duas espécies. A posição de C. tigrina como

mais antiga em relação a C. guttata pode ser apoiada na sua ampla distribuição (desde o

Rio Grande do Sul e Santa Catarina, Litoral Sul de São Paulo até a região de Campo

Formoso no Norte da Bahia) (van den Berg, 1996). Em contraste, C. guttata apresenta uma

distribuição mais restrita a região Sudeste mais próximo ao litoral (van den Berg, 1996).

Nessa perspectiva, populações de C. tigrina durante o processo de expansão em direção ao

Sul da Bahia e ao Rio Grande do Sul, teriam mantido contato com populações de C.

bicolor culminando em introgressão entre essas espécies. Entretanto, o panorama atual da

destruição dessas espécies nos sugere que esse contato seria pouco provável devido, entre

outros fatores, a ocorrência de C. bicolor em altitudes mais elevadas (1.000 metros) que C.

tigrina, que geralmente ocorre ao nível do mar. A segunda hipótese reside na idéia de que

C. tigrina é resultante do processo de hibridação natural entre C. bicolor e C. guttata.

Provavelmente esse processo teria ocorrido na porção Leste da Cadeia do Espinhaço, onde

essas espécies poderiam manter contato. Entretanto, essas espécies não compartilham de

um mesmo período fenológico (van den Berg, 1996). A grande semelhança de C. guttata

com C. tigrina, bem como o forte suporte registrado pelos dados plastidiais poderia ser

decorrente de uma contribuição assimétrica (nesse caso maternal por parte de C. guttata)

no processo de hibridação (Rieseberg & Carney, 1998). A ampla distribuição de C. tigrina

poderia estar atrelada a formação de híbridos com grande variabilidade a qual permitisse

ocupar novas regiões, como o Norte da Bahia que apresenta condições climáticas

semelhantes a encontradas por populações de C. bicolor em Minas Gerais. O

posicionamento de C. amethystoglossa dentro da rede de interações que envolvem C.

bicolor ITA, C. guttata e C. tigrina se encaixa muito bem na segunda hipótese. Nessa

perspectiva, C. amethystoglossa e C. guttata são decorrentes de especiação que ocorreram

provavelmente no Sul da Bahia. Após esse processo C. amethystoglossa se expandiu em

direção ao Norte até a região do Rio Paraguaçu no Recôncavo Baiano (van den Berg,

1996) e para a Caatinga no interior (Cruz et al., 2003) e C. guttata se expandiu para o Sul

até o Paraná.

31

5. CONCLUSÃO

O presente estudo utilizou um grande conjunto de dados para inferir a filogenia das

espécies do grupo bifoliado do gênero Cattleya. De modo geral, os dados apresentaram

baixa variação nucleotídica, entretanto alguns clados foram reconhecidos e fortemente

sustentados. Entre as regiões que apresentaram nível significativo de variação, vale

destacar as regiões plastidiais rpl32-trnL e ycf1, as quais podem ser uma boa opção para

estudos envolvendo espécies próximas em plantas.

A presença de duas folhas sobre o pseudobulbo se configurou como um caractere

morfológico e geneticamente referenciado na delimitação do grupo bifoliado em relação as

demais espécies do gênero Cattleya. Ambas as análise de máxima parcimônia e inferências

bayesiana reconheceram as proximidades filogenéticas existente entre as espécies

basicamente dentro de três clados: clado A (Walkeriana), clado B (Intermedia) e clado C

(Falcata). De modo geral, os clados encontrados abarcaram espécies consideradas nas

diversas classificações como espécies próximas (Rolfe, 1895, Cogniaux, 1898; Pabst &

Dungs 1975; Fowlie, 1977; Withner, 1988), principalmente em relação as espécies que

compõe o clado B. Entretanto, sempre houve uma falta de consenso entre os autores na

classificação das espécies que compões o clado C. Muitas dessas espécies são

morfologicamente similares e de difícil distinção (como C. guttata – C. tigrina, C.

granulossa – C. schofieldiana). Os resultados desse estudo para esse clado apresentaram

baixa resolução e não esclareceu completamente as relações entre algumas espécies.

Os resultados sugerem que as populações ocorrentes no sul da Bahia reconhecidas

em trabalhos anteriores como C. granulosa (por exemplo, van den Berg, 1996), devam ser

reconhecidas como C. schofieldiana.

Baseado, entre outros fatores, na presença de conflitos no sinal filogenético entre os

dados plastidiais e nucleares, foram levantados algumas hipóteses sobre a evolução do

grupo. Provavelmente C. aclandiae, C. dormaniana, C. porphyroglossa, C. schilleriana e

C. tigrina tiveram suas origens a partir de processos que envolveram reticulação entre

linhagens ancestrais de outras espécies do grupo bifoliado. Como supracitado, os

resultados aqui apresentados são apenas hipóteses (apesar de estarem embasadas em

características morfológicas, fenológicas e de distribuição das espécies) e, portanto

32

carecem de mais estudos experimentais que venham a elucidar esses possíveis processos de

evolução.

33

6. REFERÊNCIAS

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46

Tabela 1. Primers e programas utilizados para a amplificação das regiões utilizadas neste estudo. Primers

Desnaturação

Amplificação

N°. ciclos na

amplificação

Extensão

final

agt11

F forward (GATTTCCGHATGGATGANTGGGG) 95° (2 min) 94° (40 seg) + 52° (30 seg) + 72° (40 seg) 35 72° (5 min)

R reverse (CCAYTCCTCCTTCTGHGTGCAGTT)

atpF-atpH2

atpF forward (ACTCGCACACACTCCCTTTCC) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (40 seg) 30 72° (5 min)

atpH reverse (GCTTTTATGGAAGCTTTAACAAT)

ETS*

ETS-Orchid3 forward (CATATGAGTTGTTGCGGACCWT) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 54° (40 seg) + 72° (40 seg) 38 72° (5 min)

18S-IGG4 reverse (AGACAAGCATATGACTACTGGCAGG)

ITS

17SE5 forward (ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG) 94° (1 min) 94° (45 seg) + 52° (50 seg) + 72° ( min) 28 72° (5 min)

26SE5 reverse (TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC)

926 #

forward (AAGGTTTCCGTAGGTGAAC) Sequenciamento

47 # reverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) Sequenciamento

ndhJ8

forward (CATAGATCTTTGGGCTTYGA) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (40 seg) 30 72° (5 min)

reverse (TACATGAGCATCTTGTATTTC)

PsbA9-trnH

10

psbA forward (GTTATGCATGAACGTAATGCTC) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (40 seg) 30 72° (5 min)

trnH reverse (CGCGAATGGTGGATTCACAAATC)

psbK-psbI11

psbK forward (TTAGCCTTTGTTTGGCAAG) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (40 seg) 30 72° (5 min)

psbI reverse (AGAGTTTGAGAGTAAGCAT)

47

Tabela 1. Continuação

Primers

Desnaturação

Amplificação

N°. ciclos na

amplificação

Extensão

final

Rpb212

*

RPB2-INT-23F forward (CAACTTATTGAGTGCATCATGG) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 52,5° (40 seg) + 72° (1,5 min) 72° (5 min)

RPB2-INT-23R reverse (CCACGCATCTGATATCCAC)

rpl32-trnL13

F forward (CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC) 80° (5 min) 95° (1 min) + 50° (1 min) + 65° (4 min) 30 65° (4 min)

(UAG) reverse (CTGCTTCCTAAGAGCGT)

rpoC114

forward (GTGGATACACTTCTTGATAATGG) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (40 seg) 30 72° (5 min)

reverse (CCATAAGCATATCTTGAGTTGG)

trnL-trnlF15

C forward (CGAAATCGGTAGACGCTACG) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (40 seg) 36 72° (5 min)

F reverse (ATTTGAACTGGTGACACGAG)

trnD-trnT16

(GUG) forward (ACCAATTGAACTACAATCCC) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 54° (40 seg) + 72° (1 min) 35 72° (5 min)

(GGU) reverse (CTACCACTGAGTTAAAAGGG)

trnS-trnG17

(GCU) forward (GTAGCGGGAATCGAACCCGCATC) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 54° (40 seg) + 72° (1 min) 30 72° (5 min)

(UCC) reverse (AGATAGGGATTCGAACCCTCGGT)

ycf118

3720F forward (TACGTATGTAATGAACGAATGG) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (50 seg) 40 72° (5 min)

5500R reverse (GCTGTTATTGGCATCAAACCAATAGCG)

intF forward (GATCTGGACCAATGCACATATT)

intR reverse (TTTGATTGGGATGATCCAAGG)

1- Li et al. (2008); 2- Kress et al. (2005); 3- Monteiro (2007); 4- Baldwin & Markos (1998); 5- Sun et al. (1994); 6- Desfeaux et al., (1996), 7- White et al., (1990), 8-

Kress et al., (2005); 9- Sang et al. (1997); 10- Tate & Simpson, (2003); 11- Kress et al., 2005; 12- Ronçal et al. (2005); 13- Shaw et al. (2007 ); 14- Kress et al., 2005;

15- Taberlet et al. (1991); 16- Demesure et al. (1995); 17- Shaw et al. (2005); 18- Neubig et al. (2009). * significa, amplificada e sequenciada para algumas amostras,

mas não utilizada no presente estudo. # significa primers usados apenas no seqüenciamento. Os demais primers foram usados na amplificação e seqüenciamento.

48

Tabela 2. Características das matrizes e das árvores mais parcimoniosas encontradas nas análises de Máxima Parcimônia individuais e

combinadas e dos modelos evolutivos selecionados para inferência Bayesiana.

Regiões

N° de

táxon

Caracteres

analisados

N° de

caracteres

variáveis

N° de caracteres

inf. p/

parcimônia

N° de

passos da

árvore

Nº de

árvores

N° de

Indels

CI

RI

Modelo

evolutivo

para IB

ITS 44 733 116 (15,8%) 142 (19,4%) 495 239 58 0,6040 0,7863 GTR+G+I

rpl32-trnL 42 955 53 (5,6%) 42 (4,4%) 114 30.000 26 0,8589 0,8794 GTR+G

ycf1 36 1566 46 (2,9%) 61 (3,9%) 120 16 21 0,9339 0,9448 GTR+G

agt1 37 481 50 (10,4%) 18 (3,7%) 94 30.000 - 0,7872 0,7059 HKY+I+G

ndhJ 37 441 15 3,4%) 15 (3,4%) 36 170 - 0,8611 0,8780 F81+I

atpF-atpH 31 373 11 (2,9%) 12 (3,2%) 45 26.640 12 0,8021 0,8467 HKY+I

matK 32 805 37 (4,6%) 24 (3%) 84 30.000 - 0,7857 0,8364 GTR+G+I

psbA-trnH 37 907 32 (3,5%) 22 (2,4%) 64 30.000 38 0,9063 0,8696 F81+I+G

psbK-psbI 31 464 15 (3,2%) 11 (2,4%) 29 30.000 18 0,8966 0,9250 GTR+G

trnL-trnF 33 995 48 (4,8%) 23 (2,3%) 83 30.000 23 0,9033 0,9238 GTR+I

trnD-trnT 31 1781 92 (5,2%) 25 (1,4%) 130 30.000 61 0,9231 0,8734 GTR+G

rpoC1 36 518 19 (3,7%) 5 (1%) 26 12.000 - 0,9231 0,9000 HKY+G

rpoB 30 451 6 (1,3%) 4 (0,9%) 11 6 - 0,9091 0,9583 HKY

accD 30 244 2 (0,8%) 2 (0,8%) 4 1 - 1,0000 1,0000 HKY

trnS-trnG 26 775 19 (2,4%) 6 (0,7%) 26 30.000 - 1,0000 1,0000 GTR

Plastídeo 44 10.292 428 (4,1%) 235 (2,3%) 843 30.000 - 0,9197 0,8050 -

Combinada I 44 11.506 601 (5,2%) 393 (3,4%) 1522 48 - 0,7020 0,7371 -

Combinada II 39 11.506 556 (4,8%) 370 (3,2%) 1356 1158 - 0,7316 0,7632 -

CI = Índice de Consistência e RI = Índice de Retenção.

49


individuais. A, agt1. B, accD. C, atpF-atpH. D, ITS. Os números acima dos ramos

indicam os valores de suporte de bootstrap (%).

50


individuais. E, ndhJ. F, matK. G, psbA-trnH. I, psbK-psbI. Os números acima dos ramos


51


individuais. I, rpl32-trnL. J, trnD-trnT. K, rpoB. L, rpoC1. Os números acima dos ramos


52


individuais. M, trnL-trnF. N, trnS-trnG. O, ycf1. Os números acima dos ramos indicam os

valores de suporte de bootstrap (%).

53


Bayesiana, com modelo de evolução particionado da matriz Plastídeo (dados das 14

regiões de plastídeo). Os números acima dos ramos indicam: a esquerda os valores de

bootstrap (%) oriundo das análises de máxima parcimônia e a direita os valores de

probabilidade posterior (em escala de 0 - 1) gerados na inferência bayesiana. Os ٭


formados, A (Walkeriana), B (Intermedia), C (Falcata) e E (subclado Bicolor).

91/1.00

Cattleya bicolor BRA 2 Cattleya bicolor FORM 2 Cattleya bicolor BRA 1 Cattleya bicolor FORM 1 Cattleya amethystoglossa Cattleya guttata Cattleya tigrina Cattleya schofieldiana ES Cattleya bicolor DIA 1 Cattleya bicolor ITA 1 Cattleya schofieldiana BA Cattleya granulosa Cattleya velutina Cattleya tenuis Cattleya elongata 1 Cattleya elongata 2 Cattleya kerrii 1 Cattleya kerrii 2 Cattleya schilleriana Cattleya forbesii Cattleya intermedia Cattleya harrisoniana Cattleya loddigesii Cattleya porphyroglossa 1 Cattleya porphyroglossa 2 Cattleya dormaniana Cattleya aclandiae Cattleya nobilior Cattleya violacea Cattleya walkeriana Cattleya labiata CE Cattleya labiata PE Cattleya luteola Cattleya lawrenceana Cattleya wallisii Cattleya lueddemanniana Cattleya lundii Cattleya purpurata Cattleya sincorana Cattleya pfisteri

Brassavola tuberculata Rhyncholaelia digbyana Rhyncholaelia glauca

100/1.00

68/0.95

99/1.00

78/1.00

75/1.00

*/0.84

*/0.71

*/0.58

*/0.65

57/0.70

54/0.69

*/0.66 96/1.00

*/0.70 79/1.00

*/0.68

83/1.00

98/1.00

74/1.00 98/1.00

91/1.00 59/0.98

*/0.81

*/0.71

93/1.00 100/1.00

56/97

91/1.00

73/0.92

A

B

C

E

84/1.00

66/0.98

Grupo externo

Cattleya Bifoliada

Brassavola cucullata

54


Bayesiana, com modelo de evolução particionado da matriz Combinada I (dados das 13

regiões de plastídeo, ITS e agt1). Os números acima dos ramos indicam: a esquerda os

valores de bootstrap (%) oriundo das análises de máxima parcimônia e a direita os valores

de probabilidade posterior (em escala de 0 - 1) gerados na inferência bayesiana. Os ٭


formados, A (Walkeriana), B (Intermedia), C (Falcata), D (subclado Elongata) e E

(subclado Bicolor).

100/1.00

Cattleya bicolor BRA 1 Cattleya bicolor BRA 2 Cattleya bicolor FORM 1 Cattleya bicolor FORM 2 Cattleya granulosa Cattleya velutina Cattleya bicolor DIA 1 Cattleya bicolor ITA 1 Cattleya tenuis Cattleya schofieldiana BA Cattleya guttata Cattleya tigrina Cattleya amethystoglossa Cattleya schofieldiana ES Cattleya elongata 1 Cattleya elongata 2 Cattleya kerrii 1 Cattleya kerrii 2 Cattleya schilleriana Cattleya forbesii Cattleya intermedia Cattleya harrisoniana Cattleya loddigesii Cattleya porphyroglossa 1 Cattleya porphyroglossa 2 Cattleya dormaniana Cattleya aclandiae Cattleya nobilior Cattleya violacea Cattleya walkeriana Cattleya labiata CE Cattleya labiata PE Cattleya luteola Cattleya purpurata Cattleya sincorana Cattleya pfisteri Cattleya lundii Cattleya lawrenceana Cattleya wallisii Cattleya lueddemanniana Brassavola cucullata Brassavola tuberculata Rhyncholaelia digbyana Rhyncholaelia glauca

100/1.00

100/1.00

74/0.99

100/1.00

67/1.00

96/1.00

*/0.96

*/1.00

*/0.59

*/0.94 51/0.64

50/0.64

*/0.95

*/0.98

*/0.99

*/0.73

*/0.99 98/1.00

60/0.99

*/1.00

54/1.00

90/1.00

94/1.00

80/1.00

100/1.00

86/100 56/1.00

100/1.00 100/1.00

88/1.00

94/1.00 */0.89

100/1.00

99/1.00 56/0.75

A

B

C

D

E

Grupo externo

Cattleya Bifoliada

55


Bayesiana, com modelo de evolução particionado da matriz Combinada II (dados das 14

regiões de plastídeo, agt1 e ITS) excluindo terminais que geravam incongruência. Os

números acima dos ramos indicam: à esquerda os valores de suporte de bootstrap (%) e a

direita os valores de probabilidade posterior da inferência bayesiana (em escala de 0 - 1).

Os ٭ representam valores de bootstrap inferior a 50%. As letras representam os clados

formados, A (Walkeriana), B (Intermedia), E (subclado Bicolor).

Cattleya bicolor BRA 1 Cattleya bicolor BRA 2

Cattleya bicolor FORM 1

Cattleya bicolor FORM 2 Cattleya velutina

Cattleya granulosa

Cattleya bicolor DIA 1

Cattleya bicolor ITA 1 Cattleya tenuis Cattleya schofieldiana BA

Cattleya schofieldiana ES

Cattleya amethystoglossa Cattleya guttata Cattleya forbesii Cattleya intermedia Cattleya harrisoniana Cattleya loddigesii

Cattleya kerrii 1 Cattleya kerrii 2

Cattleya elongata 1 Cattleya elongata 2

Cattleya nobilior Cattleya violacea Cattleya walkeriana Cattleya labiata CE Cattleya labiata PE Cattleya luteola

Cattleya purpurata Cattleya sincorana Cattleya pfisteri Cattleya lundii

Cattleya lawrenceana

Cattleya wallisii Cattleya lueddemanniana Brassavola cucullata

Brassavola tuberculata

Rhyncholaelia digbyana

Rhyncholaelia glauca

100/1.00

*/1.00

81/1.00

100/1.00

99/1.00

*/0.63

*/0.79

*/0.82 */0.80

52/0.85 */0.51

*/0.52

*/0.52 */0.96

*/1.00

*/0.89

50/0.67

98/1.00

89/1.00

62/0.77

98/1.00

96/1.00 */0.97

100/1.00 100/1.00

88/1.00

67/0.87

100/1.00

94/1.00 */0.80

100/1.00

A

B

E

99/1.00

Grupo

Cattleya Bifoliada

100/1.00

externo

56

Figura 8. Super-rede (supernetwork) das árvores de consenso da análise de máxima parcimônia com valores de bootstrap igual ou superior a

50% a partir dos dados combinados de plastídeo, de ITS e de agt1. O número mínimo de árvores foi igual a 2.

57

Figura 9. Rede de consenso não-enraizado (30% de limite para construção da rede)

sumarizando as incongruências existentes entre as topologias dos três conjuntos de dados

(14 regiões de plastídeo, ITS e agt1) usando árvores de consenso de maioria com > 50% de

bootstrap. Na figura apenas a topologia é apresentada, pois os ramos não são escalonados

com comprimento de ramo. As linhas em negrito representam as possíveis reticulações. As

fotos referem-se as espécies ou represententes de clados envolvidos em possíveis processos

de evolução reticulada.

58

ANEXOS

59

ANEXO I

Espécies analisadas indicando voucher e número de acesso do GenBank para as sequências oriundas de outros trabalhos.

Espécies Voucher accD ITS matK ndhJ psbA-trnH rpoB rpoC1 Brassavola cucullata (L.) R.Br.

MWC (6177) para ITS e

trnL-trnF e W.E. Higgins

130 (FLAS 198290) para os

demais

-

AY008589.1

-

AGB

-

-

-

Brassavola tuberculata Hook. Brieger Coll. 3497 (ESA) - AF260217.1 AF263818.1 AGB - - AGB

Cattleya aclandiae Lindl. * Brieger Coll. 32982 (ESA) EU139872.1 AF260207.1 AF263810.1 - GQ248259.1 GQ248738.1 GQ248899.1

Cattleya amethystoglossa Linden

& Rchb.f. ex Warner *

Brieger Coll. 8272 (ESA) EU139873.1 AY008610.1 EU139957.1 EU140261.1 EU140024.1 EU140099.1 EU140180.1

Cattleya bicolor Lindl. BRA

(Brasília - 1) *

Brieger Coll. 22574 (ESA) EU139875.1 AY008626.1 - EU140263.1 EU140026.1 EU140101.1 EU140182.1


(Brasília - 2) *

Brieger Coll. 22579 (ESA) - AGB - - - - AGB

Cattleya bicolor Lindl. DIA

(Diamantina) *

Brieger Coll. 30656 (ESA) - AY008625.1 - AGB AGB - AGB

Cattleya bicolor Lindl. FORM

(Formiga - 1) *



(Formiga - 2) *

Brieger Coll. 4333 (ESA) - AGB - - - - -

Cattleya bicolor Lindl. ITA

(Itatiaia) *

Brieger Coll. 891 (ESA) EU139877.1 AY008624.1 - EU140265.1 AGB - EU140184.1

Cattleya dormaniana (Rchb.f.)

Rchb.f. *


Cattleya elongata Barb.Rodr. (1) * Brieger Coll. 8078 (ESA) EU139881.1 AY008619.1 EU139964.1 EU140269.1 EU140031.1 EU140107.1 EU140188.1

Cattleya elongata Barb.Rodr. (2) * Brieger Coll. 32748 (ESA) - AGB - - - - -

Cattleya forbesii Lindl. * trnL-trnF: WEH 59 /

demais Brieger Coll. 5358

(ESA)

EU139884.1 AY008617 EU139965.1 EU140270.1 EU140032.1 EU140108.1 EU140191.1

Cattleya granulosa Lindl. * Brieger Coll. 22482 (ESA) EU139885.1 AY008621.1 EU139966.1 EU140271.1 EU140033.1 EU140111.1 EU140192.1

60

ANEXO I

Continuação.

Espécies Voucher accD ITS matK NdhJ psbA-trnH rpoB rpoC1 Cattleya guttata Lindl. * Brieger Coll. 11299 (ESA) EU139886.1 AY008609.1 EU139967.1 EU140272.1 EU140034.1 EU140112.1 EU140193.1

Cattleya harrisoniana Bateman ex

Lindl. *

Brieger Coll. 16036 (ESA) EU139887.1 AY008615.1 EU139968.1 EU140273.1 EU140035.1 EU140113.1 EU140194.1

Cattleya intermedia Graham ex

Hook. *

Brieger Coll. 4095 (ESA) EU139890.1 AF260204.1 EU139969.1 EU140274.1 EU140036.1 EU140116.1 EU140197.1

Cattleya kerrii Brieger & Bicalho

(1) *

Brieger Coll. 18765

(Holotype-HB) EU139893.1 AY008613.1 EU139972.1 EU140277.1 EU140039.1 EU140119.1 EU140200.1


(2) *

Zaslawski s.n. (HUEFS) - AGB - - - - -

Cattleya labiata Lindl. (Ceara) Brieger Coll. 20545 (ESA) EU139895.1 AF260214.1 - EU140278.1 EU140040.1 EU140121.1 EU140203.1

Cattleya labiata Lindl.

(Pernambuco)

Brieger Coll. 5487 (ESA) EU139896.1 AF260214.1 EU139973.1 EU140279.1 EU140041.1 EU140120.1 EU140202.1

Cattleya lawrenceana Rchb.f. Brieger Coll. 3802 (ESA) EU139897.1 AF260208.1 EU139974.1 EU140280.1 EU140043.1 EU140123.1 -

Cattleya loddigesii Lindl. * Brieger Coll. 2483 (ESA) EU139898.1 AY008616.1 U139975.1 EU140281.1 EU140042.1 EU140124.1 EU140204.1

Cattleya lueddemanniana Rchb.f. Brieger Coll. 3759 (ESA) EU139899.1 AY008629.1 EU139976.1 EU140282.1 EU140044.1 EU140125.1 EU140205.1

Cattleya lundii (Rchb.f. & Warm)

van den Berg

Brieger Coll. 30692 (ESA) EU139944.1 AY008645.1 EU140013.1 EU140318.1 EU140318.1 - EU140247.1

Cattleya luteola Lindl. Brieger Coll. 32187 (ESA) EU139900.1 AY008605.1 EU139977.1 EU140283.1 EU140045.1 EU140126.1 EU140206.1

Cattleya nobilior Rchb.f. * Brieger Coll. 30978 (ESA) EU139904.1 AY008607.1 GQ248092.1 EU140285.1 GQ248260.1 GQ248739.1 GQ248900.1

Cattleya pfisteri (Pabst & Senghas)

van den Berg

van den Berg C226 (ESA) EU139947.1 AY008662.1 EU140015.1 EU140321.1 EU140088.1 EU140169.1 EU140251.1

Cattleya porphyroglossa Linden &

Rchb.f. (1) *

sem voucher (Kew 1986–

2034) EU139906.1 AY008612.1 EU139980.1 EU140287.1 EU140049.1 EU140130.1 EU140210.1


Rchb.f. (2) *

sem voucher (LAMOL

389.2) - AGB - - - - -

61

ANEXO I

Continuação.

Espécies Voucher accD ITS matK NdhJ psbA-trnH rpoB rpoC1 Cattleya purpurata (Lindl. &

Paxton) van den Berg

para ITS Selby B.G. 84-

0459 (SEL) e para as

demais Brieger Coll. 1822

(ESA)

EU139950.1 EU140285.1 AY396104.1 EU140324.1 EU140091.1 EU140172.1 EU140249.1

Cattleya schilleriana Rchb.f. * Brieger Coll. 6640 (ESA) EU139908.1 EU139908.1 EU139982.1 EU140289.1 - EU140132.1 EU140211.1

Cattleya schofieldiana Rchb.f. BA

(Bahia) *

Brieger Coll. 19216 (ESA) - AGB - - - - -

Cattleya schofieldiana Rchb.f. ES

(Espírito Santo) *

Brieger Coll. 6656 (ESA) EU139909.1 EU139909.1 EU139983.1 EU140290.1 EU140051.1 EU140133.1 EU140212.1

Cattleya sincorana (Schltr.) van

den Berg

sem voucher (Kew 1990-

1998) EU139952.1 AY008635.1 EU140018.1 EU140325.1 EU140093.1 EU140174.1 EU140255.1

Cattleya tenuis Campacci &

Vedovello *

C211-Machado s.n. (ESA) - AY008622.1 EU139985.1 EU140292.1 EU140053.1 EU140135.1 -

Cattleya tigrina A.Rich. * sem voucher (Kew 1993-

2845) EU139911.1 AY008611.1 EU139986.1 EU140293.1 EU140054.1 EU140136.1 EU140214.1

Cattleya velutina Rchb.f. * Brieger Coll. 7043 (ESA) EU139913.1 AY008618.1 EU139988.1 EU140295.1 EU140056.1 EU140138.1 EU140216.1

Cattleya violacea (Kunth) Rolfe * Brieger Coll. 28495 (ESA) EU139914.1 AF260206.1 EU139989.1 EU140296.1 EU140057.1 EU140139.1 EU140217.1

Cattleya walkeriana Gardner * Brieger Coll. 1627 (ESA) EU139915.1 AF260205.1 EU139990.1 EU140297.1 EU140058.1 EU140140.1 EU140218.1

Cattleya wallisii (Linden ex

Rchb.f.)

Brieger Coll. 28787 (ESA) EU139916.1 - - EU140298.1 EU140059.1 EU140141.1 EU140219.1

Rhyncholaelia digbyana (Lindl.)

Schltr.

Brieger Coll. 6107 (ESA) - AY008583.1 EF079309.1 AGB AGB - AGB

Rhyncholaelia glauca (Lindl.)

Schltr.

Para matK FLAS 200736 e

para as demais MWC 1246 - AY008584.1 AY396101.1 AGB AGB - AGB

Os * indicam as espécies que compões o grupo bifoliado do gênero Cattleya. AGB = Aguardando número de aceso do GenBank.

62

ANEXO II

Espécies analisadas indicando voucher para as sequências oriundas desse trabalho.

Espécies Voucher agt1 atpH-atpH psbK-psbI rpl32-trnL trnD-trnT trnS-trnG ycf1 trnL-trnF

Brassavola cucullata (L.) R.Br.

MWC (6177) para trnL-trnF

e W.E. Higgins 130 (FLAS

198290) para os demais AGB - AGB AGB AGB - AGB AF267058.1

Brassavola tuberculata Hook. Brieger Coll. 3497 (ESA) AGB AGB - AGB AGB AGB AGB AF267057.1

Cattleya aclandiae Lindl. * Brieger Coll. 32982 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB -

Cattleya amethystoglossa Linden

& Rchb.f. ex Warner *

Brieger Coll. 8272 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB - AGB


(Brasília - 1) *

Brieger Coll. 22574 (ESA) - AGB AGB AGB AGB AGB AGB -


(Brasília - 2) *

Brieger Coll. 22579 (ESA) - - - AGB - - - AGB

Cattleya bicolor Lindl. DIA

(Diamantina) *

Brieger Coll. 30656 (ESA) AGB - - - AGB - AGB -


(Formiga - 1) *

Brieger Coll. 4336 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB


(Formiga - 2) *

Brieger Coll. 4333 (ESA) - - - AGB - AGB AGB -

Cattleya bicolor Lindl. ITA

(Itatiaia) *


Cattleya dormaniana (Rchb.f.)

Rchb.f. *


Cattleya elongata Barb.Rodr. (1) * Brieger Coll. 8078 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB

Cattleya elongata Barb.Rodr. (2) * Brieger Coll. 32748 (ESA) - - - AGB - - - AGB

Cattleya forbesii Lindl. * trnL-trnF: WEH 59 / demais,

Brieger Coll. 5358 (ESA) - AGB AGB AGB AGB - AGB AY422405.1

Cattleya granulosa Lindl. * Brieger Coll. 22482 (ESA) AGB - - AGB AGB - AGB AF267051.1

Cattleya guttata Lindl. * Brieger Coll. 11299 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB

63

ANEXO II

Continuação.


Cattleya harrisoniana Bateman ex

Lindl. *


Cattleya intermedia Graham ex

Hook. *

Brieger Coll. 4095 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB


(1) *

Brieger Coll. 18765

(HolotypO-HB) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB


(2) *

Zaslawski s.n. (HUEFS) - - - AGB - - - AGB

Cattleya labiata Lindl. (Ceara) Brieger Coll. 20545 (ESA) AGB - AGB AGB AGB AGB AGB AGB

Cattleya labiata Lindl.

(Pernambuco)

Brieger Coll. 5487 (ESA) AGB AGB AGB AGB - - - AGB

Cattleya lawrenceana Rchb.f. Brieger Coll. 3802 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB - - AGB

Cattleya loddigesii Lindl. * Brieger Coll. 2483 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB

Cattleya lueddemanniana Rchb.f. Brieger Coll. 3759 (ESA) AGB AGB AGB AGB - - AGB AGB

Cattleya lundii (Rchb.f. & Warm)

van den Berg


Cattleya luteola Lindl. Brieger Coll. 32187 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB

Cattleya nobilior Rchb.f. * Brieger Coll. 30978 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB

Cattleya pfisteri (Pabst & Senghas)

van den Berg

van den Berg C226 (ESA) AGB AGB AGB AGB - - AGB AGB


Rchb.f. (1) *

sem voucher (Kew 1986–

2034) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB


Rchb.f. (2) *

sem voucher (LAMOL 389.2) - - - AGB - - AGB AGB

Cattleya purpurata (Lindl. &

Paxton) van den Berg

Brieger Coll. 1822 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AF267024.1

Cattleya schilleriana Rchb.f. * Brieger Coll. 6640 (ESA) AGB AGB AGB AGB - AGB AGB AGB

Cattleya schofieldiana Rchb.f. BA

(Bahia) *

Brieger Coll. 19216 (ESA) - AGB - AGB - - AGB AGB

64

ANEXO II

Continuação.


Cattleya schofieldiana Rchb.f. ES

(Espírito Santo) *

Brieger Coll. 6656 (ESA) - - AGB AGB - - AGB -

Cattleya sincorana (Schltr.) van

den Berg

sem voucher (Kew 1990-

1998) AGB AGB - AGB - AGB AGB AGB

Cattleya tenuis Campacci &

Vedovello*

C211-Machado s.n. (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB - - AGB

Cattleya tigrina A.Rich. * sem voucher (Kew 1993-

2845) AGB - AGB AGB AGB AGB AGB AGB

Cattleya velutina Rchb.f. * Brieger Coll. 7043 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB

Cattleya violacea (Kunth) Rolfe * Brieger Coll. 28495 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB

Cattleya walkeriana Gardner * Brieger Coll. 1627 (ESA) AGB - AGB AGB AGB - AGB AGB

Cattleya wallisii (Linden ex

Rchb.f.)

Brieger Coll. 28787 (ESA) - - - - - - - AGB

Rhyncholaelia digbyana (Lindl.)

Schltr.

Brieger Coll. 6107 (ESA) AGB AGB - AGB AGB AGB AGB AGB

Rhyncholaelia glauca (Lindl.)

Schltr.

MWC 1246 AGB AGB - AGB AGB - AGB AGB

Os * indicam as espécies que compões o grupo bifoliado do gênero Cattleya. AGB = Aguardando número de aceso do GenBank.

65

Anexo III. Variação floral entre as espécies do grupo bifoliado. Clado A (A, C.

nobilior; B, C. violacea; C, C. walkeriana). D, C. aclandiae. Clado B (E, C.

loddigesii; F, C. intermedia; G, C. dormaniana; H, C. porphyroglossa). Destaque

para o padrão de coloração rosa presente nos dois clados e exposição da coluna no

clado A e em C. aclandiae. (Fotos: Cássio van den Berg).

66

Anexo IV. Variação floral entre as espécies do grupo bifoliado. Algumas espécies

representantes do Clado C (I e J, C. elongata. L, C. bicolor. M, C. tenuis. N, C. kerrii. O,

C. amethystoglossa. P, C. schilleriana. Q, C. tigrina. R, C. guttata. S, C. velutina.

Destaque para o padrão de pigmentação das sépalas e pétalas presente nas espécies, bem

como o hábito rupícola em C. elongata diferente de todas as demais espécies. (Fotos: de I-

P e S, Cássio van den Berg; Q e R, © Google, 2011).

Documents

Eventos antigos de especiação híbrida no grupo bifoliado do gênero Cattleya … · 2014. 1. 8. · DNA regions with evidence for reticulate evolution] The bifoliate Cattleya (Orchidaceae)