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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
Evidência sorológica de infecção por riquétsias do grupo da febre
maculosa e Rickettsia bellii em pequenos mamíferos na área
periurbana de Uberlândia, Minas Gerais.
Marcella Gonçalves Coelho
Uberlândia - MG
Fevereiro - 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
Evidência sorológica de infecção por riquétsias do grupo da febre
maculosa e Rickettsia bellii em pequenos mamíferos na área
periurbana de Uberlândia, Minas Gerais.
Dissertação apresentada ao Colegiado do
Programa de Pós-graduação em
Imunologia e Parasitologia Aplicadas
como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre.
Marcella Gonçalves Coelho
Orientador: Prof. Dr. Matias Pablo Juan Szabó
Uberlândia - MG
Fevereiro - 2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Sistema de Bibliotecas da UFU, MG, Brasil. C672e 2013
Coelho, Marcella Gonçalves, 1990- Evidência sorológica de infecção por riquétsias do grupo da febre maculosa e Rickettsia bellii em pequenos mamíferos na área periurba- na de Uberlândia, Minas Gerais / Marcella Gonçalves Coelho. -- 2013. 68 f. : il. Orientador: Matias Pablo Juan Szabó. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Uberlândia, Pro- grama de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas. Inclui bibliografia. 1. Imunologia - Teses. 2. Parasitologia - Teses. 3. Rickettsioses em animais - Teses. 4. Febre maculosa - Teses. I. Szabó, Matias Pablo Juan. II. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Gradua-ção em Imunologia e Parasitologia Aplicadas. III. Título.
CDU: 612.017
Dedico este trabalho aos meus pais, Marcos e Valéria, ao meu irmão, Matheus, e ao meu namorado, Esdras. Com muito amor, carinho, e sabedoria, estão sempre ao meu lado, me apoiando e incentivando, em uma caminhada para o sucesso.
MUITO OBRIGADA!!!
Agradecimentos...Agradecimentos...Agradecimentos...Agradecimentos...
Primeiramente agradeço a Deus, Ele que me guiou por toda minha vida e neste trabalho, e me protegeu e afastou os perigos do trabalho em campo.
Aos meus pais, irmão e ao meu namorado, que são peças fundamentais na minha vida.
Ao professor Matias pela orientação na realização deste trabalho, auxiliando em todos os momentos, pelo exemplo de profissionalismo e pela oportunidade.
Aos colegas da turma de mestrado, que dividimos muitas risadas, alegrias, momentos de desesperos, e companheirismo, momentos que marcaram e que ajudaram a cada um a reconhecer que é capaz de superar desafios, e que nada é impossível.
Aos colegas do Laboratório de Ixodologia (LABIX), Vanessa, Monize, Jean, Vinícius, Marlene, Grazi, Carol, Tathi, Aline, Sarah, Ana Helena, Khelma, Adha, Elis, Jamile e Guilherme. Em especial a Vanessa que desde o início deste trabalho me auxiliou em todas as etapas, planejamento, campo e análise de dados; ao Jean pela parceria nas campanhas; e ao Vinícius e Carol, pela ajuda no campo.
Aos colegas do Laboratório de Ecologia de Mamíferos (LEMA), prof. Natália Leiner, Jenifer, Ana Letícia, Stefanny, Thomás, Gabriel, Graziella, que me receberam de “braços abertos”, pela parceria em diversas campanhas na Fazenda do Glória e na Reserva do Panga, e empréstimo de algumas armadilhas.
Ao pessoal do Centro de Controle de Zoonoses de Uberlândia que me ajudou no trabalho de campo, Jean, Lázaro, Joel, Darci, Amaral e Luís. E a Cristiane, Elenice e Alcides, que me receberam no Laboratório de Sorologia.
A professora Elba, ao Alex, Sócrates Neto, João e Joaquim, do Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses, e Laboratório de Biologia e Parasitologia de
Mamíferos Silvestres Reservatórios do Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), na parceria das campanhas de captura dos pequenos mamíferos.
Ao pessoal do Laboratório de Doenças Parasitária da Universidade de São Paulo (VPS-USP) pelo auxílio no laboratório e o fornecimento de antígenos de Rickettsia sp.. Em especial ao professor Marcelo Labruna, Jonas, Amália, Tatiana e a Júlia. Aos laboratórios de Imunoparasitologia, Biologia Molecular e o Laboratório do Centro de Referência Nacional em Hanseníase pela utilização dos equipamentos em diversas etapas do estudo.
Às secretárias da Pós-graduação, Lucélia e Lucileide. Obrigada por tudo, pela orientação nas burocracias, na solução de problemas e pelo apoio.
A CAPES pela concessão da bolsa de Mestrado, e ao CNPq e FAPEMIG (Rede Mineira) pelo apoio financeiro aos projetos vinculados.
A todos que de alguma forma contribuíram para este trabalho, e a todas as dificuldades que enfrentei, elas foram o degrau para meu crescimento.
Obrigada!!!Obrigada!!!Obrigada!!!Obrigada!!!
LISTA DE ABREVIAÇÕES
BOD Demanda biológica de oxigênio
BSF Brazilian Spotted Fever
CEUA Comissão de Ética na Utilização de Animais
FITC Fluoresceína isotiocianato
FMB Febre Maculosa Brasileira
g gravidade
G1 grupo 1
G2 grupo 2
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis
IgG Imunoglobulina G
mL mililitro
MSF Mediterranean Spotted Fever
PAIRS possível antígeno indutor da reação sorológica
PBS solução salina tamponada com fosfato
RIFI reação de imunofluorescência indireta
RMSF Rocky Mountain Spotted Fever
GFM Grupo da Febre Maculosa (Spotted Fever Group)
SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade
TG Grupo Tifo (Typhus Group)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Localização geográfica do município de Uberlândia, MG. A) Brasil, em destaque o estado de Minas Gerais. B) Município de Uberlândia em destaque. ........................................ 23
Figura 2. Locais de captura de pequenos mamíferos e de coleta de carrapatos, no município de Uberlândia, MG, 2011-2012. ............................................................................................... 25
Figura 3. Brinco de identificação do roedor. ........................................................................... 27
Figura 4. Coleta de sangue por punção da veia caudal............................................................ 27
Figura 5. Vistoria do roedor a procura de carrapatos fixados (esquerda). Carrapatos fixados no roedor (direita) (Uberlândia, MG, 2011-2012). ................................................................... 30
Figura 6. Coleta de carrapatos no ambiente por arraste (Uberlândia, MG, 2011-2012). ........ 30
Figura 7. Distribuição de pequenos mamíferos soropositivos para Rickettsia spp. do grupo da febre maculosa e R. bellii, e possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS), no município de Uberlândia, de julho de 2011 a agosto de 2012. ................................................. 40
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Disposição das armadilhas, localização e tipo de vegetação nos locais de captura de pequenos mamíferos e de coleta de carrapatos, entre os meses de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG. .................................................................................. 24
Tabela 2. Cronograma, número de armadilhas usadas por campanha e o esforço amostral, nas campanhas de capturas de pequenos mamíferos realizadas entre os meses de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG. .................................................................. 28
Tabela 3. Número, prevalência e intensidade média de carrapatos por espécie de hospedeiros, capturados e recapturados de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG. ........................................................................................................................................... 35
Tabela 4. Número de carrapatos por espécie de hospedeiros capturados e recapturados de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG. ........................................ 36
Tabela 5. Relação das espécies de carrapatos por espécie de pequenos mamíferos capturados e recapturados de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG. ........... 37
Tabela 6. Carrapatos coletados no ambiente nos locais de captura de pequenos mamíferos entre os meses de dezembro de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG. ... 38
Tabela 7. Percentual de amostras de soro reativas para Rickettsia spp. do grupo da febre maculosa e Rickettsia bellii em pequenos mamíferos capturados de julho de 2011 a agosto de 2012 no município de Uberlândia, MG. ................................................................................... 41
Tabela 8. Relação do possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS) com as espécies de pequenos mamíferos capturados de julho de 2011 a agosto de 2012 no município de Uberlândia, MG. .................................................................................................................. 41
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 14
2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 21
2.1. Geral ........................................................................................................................... 21
2.2. Específicos ................................................................................................................. 21
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 23
3.1. Área de estudo ........................................................................................................... 23
3.2. Captura de pequenos mamíferos ................................................................................ 26
3.3. Coleta de carrapatos ................................................................................................... 29
3.4. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para detecção de anticorpos anti-riquétsias em roedores e marsupiais ..................................................................................... 31
3.5. Licenças ..................................................................................................................... 32
4. RESULTADOS ................................................................................................................ 34
4.1. Roedores silvestres e marsupiais capturados ............................................................. 34
4.2. Carrapatos coletados .................................................................................................. 34
4.3. Sorologia para riquétsias ............................................................................................ 39
5. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 43
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 49
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 51
APÊNDICE ............................................................................................................................. 62
Apêndice 1. Fotos dos carrapatos coletados no ambiente e nos pequenos mamíferos capturados no município de Uberlândia, MG, 2011-2012. ................................................... 63
Apêndice 2. Título de anticorpos contra riquétsias do grupo da febre maculosa e Rickettsia
bellii, e possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS) em marsupiais do município de Uberlândia, MG, 2011-2012. .......................................................................... 64
Apêndice 3. Título de anticorpos contra riquétsias do grupo da febre maculosa e Rickettsia
bellii, e possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS) em pequenos roedores do município de Uberlândia, MG, 2011-2012. .......................................................................... 65
ANEXO .................................................................................................................................... 67
Anexo 1. Parecer CEUA ....................................................................................................... 68
RESUMO
Riquetsiose é uma doença causada em humanos por bactérias do gênero Rickettsia, e tem
como principais vetores os carrapatos, que são considerados também reservatórios de
riquétsias do grupo da febre maculosa no Brasil. Frequentemente os estágios imaturos de
carrapatos vetores de riquetsioses têm pequenos mamíferos como hospedeiros, e sabe-se que
algumas espécies de pequenos mamíferos são hospedeiros amplificadores para Rickettsia sp..
O objetivo deste trabalho foi determinar a sororreatividade contra cinco espécies de riquétsias
e a fauna de carrapatos de pequenos mamíferos na região periurbana de Uberlândia, MG,
Brasil. Foram capturados, entre julho de 2011 a agosto de 2012, 416 animais representando
13 espécies de roedores silvestres e marsupiais. Destes, 48 estavam infestados com carrapatos
dos gêneros Amblyomma e Ixodes, e 70 (16,8%) dos animais foram soropositivos para
Rickettsia spp.. Nossos resultados indicam a circulação de quatro espécies de riquétsias, R.
rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali e R. bellii, próximo à área urbana do município de
Uberlândia. As duas primeiras espécies são consideradas patogênicas ao homem,
evidenciando a necessidade de se realizar uma investigação mais minuciosa tanto para a
confirmação das espécies de bactérias circulantes, quanto para a compreensão do ambiente
que mantém as riquétsias nos locais de detecção.
Palavras-chave: Rickettsia, pequenos mamíferos, carrapatos, sorologia, Uberlândia
ABSTRACT
Rickettsiosis is a human disease caused by bacteria of the genus Rickettsia, and its main
vector ticks (Ixodidae), which are also considered reservoirs of the Spotted Fever Group
rickettsiae in Brazil. Small mammals are frequent hosts for immature stages of rickettsial
diseases vector ticks, and it is known that some species of small mammals are hosts amplifiers
for Rickettsia sp..The aim of this study was to determine seropositivity against five species of
Rickettsia and tick fauna of small mammals captured in periurban region of Uberlândia, MG,
Brazil. For this purpose, 416 small mammals representing 13 species of wild rodents and
marsupials were captured between the months of July 2011 to August 2012. Of these, 48 were
infested with ticks of the genus Amblyomma and Ixodes, and 70 (16.8%) of the animals were
seropositive for Rickettsia spp.. Our results indicate the circulation of four species of
Rickettsia, R. rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali and R. bellii, in the periurban area of
Uberlândia. The first two Rickettsia species are considered pathogenic to man and thus a more
thorough investigation to confirm the species of bacteria and epidemiological aspects related
to these Rickettsia spp. is the detection locations.
Keywords: Rickettsia, small mammals, ticks, serology, Uberlândia
14
1. INTRODUÇÃO
Riquétsias são bactérias gram negativas e parasitos intracelulares obrigatórios,
pertencentes à classe Alphaproteobacteria, família Rickettsiaceae, e representam potencial
risco à saúde humana (GILLESPIE et al., 2008; SCHORN et al., 2011), pois muitas espécies
são patogênicas ao homem (GEHRKE et al., 2009; ROZENTAL et al., 2009). O gênero
Rickettsia é subdividido em dois grupos principais, o grupo da febre maculosa (GFM)
(“Spotted Fever Group” - SFG) e grupo tifo (TG – “Typhus Group”), além de duas espécies
genética e antigenicamente distintas destes grupos, R. bellii e R. canadensis (LABRUNA et
al., 2007; FOURNIER, RAOULT, 2009).
O GFM é o grupo de maior importância para saúde pública, sendo que muitas
espécies são patogênicas ao homem e ocasionam infecções de brandas a letais conhecidas
como riquetsioses (GEHRKE et al., 2009; ROZENTAL et al., 2009). De forma geral,
riquetsiose é uma doença transmitida para o ser humano por meio da picada do carrapato
infectado com riquétsia, e caracteriza-se por quadro clínico composto de cefaléia, febre,
erupções com manchas e formação de pápulas, agravando para hemorragia e disfunção
múltipla dos órgãos (RYDKINA, 1999; ANGERAMI et al., 2009).
Entre os principais agentes etiológicos de riquetsioses, podemos citar a R. conorii, o
agente causador da Febre Maculosa do Mediterrâneo (MSF - Mediterranean Spotted Fever )
(LEVIN, KILLMASTER, ZEMTSOVA, 2012) e R. rickettsii, a espécie mais patogênica e
causadora da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas (“Rocky Mountain Spotted Fever” -
RMSF) ou Febre Maculosa Brasileira (FMB) (“Brazilian Spotted Fever” - BSF). Em verdade
o agente da RMSF é o mesmo da FMB, a diferença entre as duas reside nas espécies de
carrapatos envolvidas na transmissão da bactéria e o local de ocorrência; a primeira na
15
América do Norte e a segunda, no Brasil (GUEDES et al., 2005; GEHRKE et al., 2009;
LABRUNA, 2009; ROZENTAL et al., 2009).
Riquétsias do GFM tem como principal vetor e reservatório no Brasil, os carrapatos
pertencentes à família Ixodidae, com destaque para o gênero Amblyomma (LABRUNA, 2009;
SABATINI et al., 2010). A exemplo, os carrapatos vetores da R. rickettsii são variados,
diferindo de acordo com a área geográfica que habitam. Na América do Sul, em especial a
região sudeste do Brasil, o vetor mais importante é o Amblyomma cajennense (popularmente
conhecido como “carrapato-estrela”), (GUEDES et al., 2005; LABRUNA, 2009;
ANGERAMI et al., 2009), enquanto na região da grande São Paulo, o Amblyomma
aureolatum é o principal vetor (LABRUNA, 2009).
Os carrapatos tem importante papel na manutenção da Rickettsia no ambiente
selvagem, sendo que a infecção nos carrapatos por esta bactéria é transmitida para outras
gerações pela transmissão transovariana, e de um estágio para outro pela transmissão
transestadial. Estes dois tipos de transmissão possibilitam a infecção de diversas gerações e
em todos os estágios (DEL FIOL et al., 2010). Outro modo de transmissão é a horizontal,
quando o carrapato ao parasitar hospedeiro com riquetsemia, se infecta (GILLESPIE et al.,
2008; TIJSSE-KLASEN et al., 2011).
Entretanto, vários estudos no sudeste brasileiro demonstram a baixa prevalência de
infecção de populações de carrapatos por R. rickettsii. A espécie A. cajennense demonstra ser
parcialmente refratária a infecção por R. rickettsii, no estudo Guedes e colaboradores (2005) a
população deste carrapato apresentou taxa de infecção em torno de 1%, e outro estudo, uma
amostra com 3.545 espécimes, nenhum A. cajennense estava infectado (PACHECO et al.,
2009). Outro exemplo é a patogenicidade de R. rickettsii ao carrapato vetor A. aureolatum,
este é um vetor eficiente na transmissão da FMB, sendo que a manutenção da infecção por R.
rickettsii neste vetor se mantém por até quatro gerações por meio da transmissão transestadial
16
e transovariana, porém, a infecção interfere na sobrevivência e desempenho reprodutivo das
fêmeas infectadas (LABRUNA et al., 2011).
Outro elemento envolvido na manutenção da Rickettsia no ambiente é o hospedeiro
vertebrado, por atuar como amplificador da taxa de infecção de carrapatos durante a
riquetsemia. Neste período de alguns dias, o hospedeiro amplificador infecta muitos
carrapatos, permitindo a transmissão horizontal (LABRUNA, 2009; LABRUNA et al., 2011).
Segundo Labruna (2009), para serem considerados hospedeiros amplificadores de riquétsias
os hospedeiros devem atender a cinco requisitos: o hospedeiro vertebrado deve ser abundante
na área de endemicidade da Rickettsia; ser hospedeiro para o carrapato vetor; ser susceptível a
Rickettsia spp.; desenvolver a riquetsemia a um grau que possibilite a infecção dos carrapatos
que o parasitar; e por fim, que suas crias não sejam resistentes a primeira infecção por
riquétsia.
Os hospedeiros vertebrados que funcionam como amplificadores, também influenciam
na distribuição das espécies de vetores, por exemplo, o hospedeiro amplificador sabidamente
conhecido para R. rickettsii é a capivara, sendo este parasitado, principalmente, por carrapatos
da espécie A. cajennense e Amblyomma dubitatum (LABRUNA, 2009).
Pequenos roedores são muitas vezes considerados hospedeiros sentinelas por terem o
contato com Rickettsia spp. e soroconverterem, mas seu papel como potencial amplificador
deve ser investigado (FRANKE et al., 2010; SCHEX et al., 2011) considerando a grande
diversidade de espécies e a ixodofauna associada, pois sabe-se que na América do Norte
algumas espécies de pequenos roedores são hospedeiros amplificadores para R. rickettsii, a
exemplo Microtus pennsylvanicus, Pitymus pinetorum, Peromyscus leucopus e Sigmodon
hispidus (BURGDORFER, FRIEDHOFF, LANCASTER JR, 1966; BURGDORFER, 1977).
Estes pequenos mamíferos são hospedeiros importantes para os estágios imaturos de diversas
17
espécies de carrapatos, notadamente do gênero Ixodes spp. e Amblyomma spp. (LABRUNA,
2009; FRANKE et al., 2010; GUGLIELMONE, NAVA, 2011).
A FMB é considerada uma doença reemergente, com os primeiros relatos em 1920,
posterior queda na década de 50, e acentuado registro da patogenia a partir da década de 80.
Entretanto, a classificação de doença reemergente deve ser vista com cautela, uma vez que as
notificações de casos de febre maculosa no Brasil se tornaram obrigatórias a partir do ano
2001, além da disponibilidade de técnicas diagnósticas mais sensíveis e específicas
colaborarem com o aumento no reconhecimento de casos antes não diagnosticados
(LABRUNA, 2009). A detecção de anticorpos reativos contra Rickettsia spp. é uma
metodologia de diagnóstico amplamente utilizada por ser de baixo custo, e permite determinar
a circulação de espécies de riquétsias em uma dada região através do inquérito sorológico em
hospedeiros sentinelas (SAITO et al., 2008).
Até o ano 2000, R. rickettsii era a única espécie do GFM conhecida na América do
Sul, posteriormente sete novas espécies foram descritas, sendo algumas patogênicas como a
R. felis, R. parkeri, e R. massiliae (LABRUNA, 2009). A atual atenção a estas espécies se
deve à descoberta recente de sua patogenicidade (LABRUNA et al., 2011). Exemplo disso foi
o relato do primeiro caso de doença humana causada por R. parkeri nos Estados Unidos em
2004, seis décadas após o seu isolamento no carrapato Amblyomma maculatum (PADDOCK
et al., 2004). Recentemente foi relatado no Brasil um caso de infecção humana por R. parkeri
(SPOLIDORIO et al., 2010) e, há a suspeita de que esta espécie seja o agente etiológico de
inúmeros casos de febre maculosa mais branda (não letal) no sul do país (ANGERAMI et al.,
2009). A infecção por R. parkeri é caracterizada pela escara de inoculação “tache noir”,
linfadenopatia, febre e úlceras na mucosa oral (SILVA et al., 2011).
Outra espécie constantemente detectada é a R. bellii, sua ocorrência é relatada no
Brasil e na Argentina tendo diversas espécies de carrapatos como vetores (LABRUNA, 2009),
18
em El Salvador infectando Amblyomma sabanerae (BARBIERI, ROMERO, LABRUNA,
2012) e no Peru em Amblyomma varium (OGRZEWALSKA et al., 2012). Rickettsia bellii é
espécie com patogenicidade desconhecida para os hospedeiros vertebrados e carrapatos, e
apresenta alta taxa de transmissão transovariana e transestadial (HORTA et al., 2006). Sua
importância está na coinfecção dos carrapatos com riquétsias patogênica, pois R. bellii parece
interferir no mecanismo de transmissão destas riquétsias e, consequentemente no
estabelecimento de infecções por espécies patogênicas (BURGDORFER, 1988; MACALUSO
et al., 2002).
Duas outras espécies de riquétsias são ainda pouco conhecidas quanto a
patogenicidade para humanos e animais, R. rhipicephali e R. amblyommii. Ambas foram
descritas no Brasil, e R. amblyommii encontra-se também na Argentina e Guiana Francesa.
Altas taxas de infecção destas espécies são encontradas no vetor, sugerindo possíveis espécies
não patogênicas para carrapatos (LABRUNA, 2009). Com relação à doença humana não há
relato de casos de infecção humana, porém, há dúvidas sobre a patogenicidade da R.
amblyommii ao homem (NICHOLSON, MASTERS, WORMSER, 2009).
A saber, nenhuma pesquisa com riquétsias foi realizada na região do Triângulo
Mineiro, que está localizada em Minas Gerais, o 2º estado com maior número de casos de
Febre Maculosa no Brasil entre 1997 a 2011 de acordo com o Sistema de Informação de
Agravos de Notificação do Ministério da Saúde (2011). E a forma mais abrangente para se
iniciar uma investigação neste contexto é avaliar a sororreatividade de hospedeiros
importantes, para se definir a possível circulação e regiões afetadas.
Neste trabalho, a infecção por riquétsias em pequenos mamíferos da região periurbana
de Uberlândia, Minas Gerais, foi investigada através da detecção de anticorpos e titulação dos
níveis séricos por meio de testes sorológicos. Este trabalho é justificado pela noção de que
pequenos mamíferos são hospedeiros importantes para os estágios imaturos dos carrapatos,
19
especialmente dos gêneros Ixodes spp. e Amblyomma spp. (LABRUNA, 2009; FRANKE et
al., 2010; GUGLIELMONE, NAVA, 2011), e ao fato de serem hospedeiros amplificadores
para riquétsias nos EUA (BURGDORFER, FRIEDHOFF, LANCASTER JR, 1966;
Burgdorfer, 1977). Além disso, carrapatos são os principais vetores e reservatórios no Brasil
para riquétsias do GFM, com destaque para o gênero Amblyomma (LABRUNA, 2009;
SABATINI et al., 2010). Finalmente sabe-se que em áreas periurbanas a ação antrópica pode
acidentalmente favorecer a circulação de determinadas espécies de patógenos, hospedeiros e
vetores (COMER, PADDOCK, CHILDS, 2001).
21
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Avaliar a sororreatividade contra riquétsias e a fauna de carrapatos de pequenos mamíferos
na região periurbana de Uberlândia, MG, Brasil.
2.2. Específicos
- Avaliar a sororreatividade de marsupiais e pequenos roedores da região peri-urbana de
Uberlândia, Minas Gerais, contra antígenos de R. rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali, R.
amblyommii e R. bellii.
- Identificar as espécies de carrapatos e possíveis vetores de riquétsias nos pequenos
mamíferos da região periurbana de Uberlândia, Minas Gerais.
23
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Área de estudo
O estudo foi realizado no município de Uberlândia (18° 54′S e 48° 15’O), estado de
Minas Gerais, sudeste do Brasil (Figura 1). Esta região é caracterizada por clima tropical com
duas estações bem definidas (verão quente/úmido e inverno frio/seco) e vegetação
característica de cerrado (IBGE, 2010). A coleta de material foi realizada em nove locais do
município, no entorno da área urbana, com vegetação caracterizada por Cerrado nativo
(RIBEIRO, WALTER, 2008) e áreas com alterações antrópicas (Tabela 1; Figura 2).
Figura 1. Localização geográfica do município de Uberlândia, MG. A) Brasil, em destaque o estado de Minas Gerais. B) Município de Uberlândia em destaque.
A) B)
24
Tabela 1. Disposição das armadilhas, localização e tipo de vegetação nos locais de captura de pequenos mamíferos e de coleta de carrapatos, entre os meses de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG.
Grupo* Local de captura Coordenadas geográficas
Vegetação
G1 (Grade)
Fazenda do Glória 18° 57’S 48° 12’O Interior da Mata Seca Semidecídua.
Reserva do Panga 19° 09’S 48° 23’O Cerrado sentido restrito.
G2 (Transecto)
Fazenda do Glória 18° 57’S 48° 12’O Borda da Mata Seca Semidecídua.
Fazenda Veadinho 18° 57’S 48° 03’O Área com plantação de capim e
cana-de-açúcar.
Fazenda da Fernanda 18°57’S 48°04’O Mata Seca Semidecídua.
Instituto Federal 18°46’S 48° 17’O Borda de Mata Seca Semidecídua e
plantação de cana-de-açúcar.
Chácaras Eldorado 18°59’S 48°26’O Área com braquiaria próxima a
domicílios e a represa.
Chácara Bálsamo 19°01’S 48°11’O Vereda
Condomínio Morada do Sol 18°53’S 48°21’O Mata Seca Semidecídua.
Estrada para Campo Florido 19°00’S 48°19’O Cerrado sentido restrito.
* Os grupos 1 e 2 apresentam metodologia diferentes Caracterização da vegetação de acordo com Ribeiro e Walter (2008).
25
Figura 2. Locais de captura de pequenos mamíferos e de coleta de carrapatos, no município de Uberlândia, MG, 2011-2012. a) Fazenda do Glória; b) Reserva do Panga; c) Fazenda Veadinho; d) Fazenda da Fernanda; e) Instituto Federal; f) Chácaras Eldorado; g) Chácara Bálsamo; h) Condomínio Morada do Sol; i) Estrada para Campo Florido. (Fonte: a,c,d, h: Marcella G. Coelho; e,f, g,i: Jean E. Limongi; b: Gabriel P. Lopes)
a c
d e f
g h i
b
26
3.2. Captura de pequenos mamíferos
As campanhas para capturas dos pequenos mamíferos foram realizadas de julho de
2011 a agosto de 2012 em nove localidades no entorno do município de Uberlândia, estas
localidades foram divididas em dois grupos, grupo 1 (G1) e grupo 2 (G2), de acordo com a
disposição das armadilhas no espaço, em grade ou transecto (Tabela 1). Nas localidades do
grupo 1 (Fazenda do Glória e a Reserva do Panga) as armadilhas de captura foram dispostas
em grade (grid), e nas localidades do grupo 2 (Fazenda do Glória, Fazenda Veadinho,
Fazenda da Fernanda, Instituto Federal, Chácaras Eldorado, Chácara Bálsamo, Condomínio
Morada do Sol e Estrada para Campo Florido) foram dispostas em transectos lineares,
totalizando um esforço de captura de 8840 armadilhas x noite (Tabela 2).
Na Fazenda do Glória e a Reserva do Panga, as armadilhas foram dispostas em grades
com 40 e 35 estações de captura, respectivamente, por 4 noites consecutivas. Cada estação era
constituída por duas armadilhas do tipo Sherman, a menor (25 x 8 x 9 cm) era colocada na
árvore a aproximadamente 1,5 metros do solo, e a maior (31 x 8 x 9 cm) no solo. Nas
localidades do grupo 2 as armadilhas foram dispostas em transectos lineares com 20 estações
e uma armadilha por estação, durante 5 noites consecutivas. Nos transectos havia 5
armadilhas do tipo Tomahawk (40 x 12 x12 cm) e 15 do tipo Sherman (30 x 7 x 9 cm).
Para as capturas as armadilhas foram iscadas com massa constituída de banana, paçoca
(doce de amendoim) e aveia, com reposição diária. Os animais capturados foram colocados
em sacos de tecido de algodão e anestesiados com associação anestésica 9:1 de cetamina
(Cloridrato de Cetamina 10% - Syntec) e acepran (Acepromazina 1% - Vetnil) na dosagem de
0,005 mL para cada 10 gramas do peso corpóreo. Sob efeito anestésico os pequenos
mamíferos foram identificados com base em caracteres morfológicos externos (BONVICINO,
DE OLIVEIRA, D’ANDREA, 2008) e marcados com brincos de identificação para permitir
27
seu reconhecimento no caso de recaptura (Figura 3). Foram coletados dos animais 0,5 a 1 ml
de amostras de sangue por punção da veia caudal ou punção cardíaca (Figura 4), após a
retração do coágulo, as amostras foram centrifugadas a 5000 g por 10 minutos e o soro
transferido para outro tubo e armazenado a -20ºC até o uso. No caso de animais recapturados
somente a primeira amostra de sangue foi analisada.
Os animais do grupo 1 eram soltos nas estações de captura após a recuperação da
anestesia, ao passo que todos os animais do grupo 2 foram sacrificados e enviados para o
Museu Nacional da UFRJ (Universidade Federal do Rio de Janeiro).
Figura 3. Brinco de identificação do roedor.
Figura 4. Coleta de sangue por punção da veia caudal.
28
Tabela 2. Cronograma, número de armadilhas usadas por campanha e o esforço amostral, nas campanhas de capturas de pequenos mamíferos realizadas entre os meses de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG.
Grupo Área Número de armadilhas/campanha
Esforço amostral (armadilhas x noite)
2011 2012 Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar Abr Maio Jun Jul Ago
G1 (grade)
Fazenda do Glória 80 - 80 - 80 80 80 80 80 80 80 - - - 2880
Reserva do Panga - - - - - 70 70 70 70 - - 70 - - 1400
G2 (transecto)
Fazenda do Glória - - - - - 40 - - 20 - - - - 20 400
Fazenda Veadinho - - - - - 60 - - 40 - - - - 40 700 Fazenda da Fernanda - - - - - 20 - - 20 - - - - 20 300
Instituto Federal - - - - - 40 - - 20 - - - - 20 400
Chácaras Eldorado - - - - - - - - 40 - - - - 40 400 Chácara Bálsamo - - - - - 40 - - 40 - - - - 40 600
Condomínio Morada do Sol - - - - - 40 - - - - 60 - - - 680
Estrada para Campo Florido - - - - - 40 - - 40 - 60 - - 40 1080
Total
8840
28
29
3.3. Coleta de carrapatos
Os roedores e marsupiais capturados foram minuciosamente examinados e seus
carrapatos coletados com pinça (Figura 5). Carrapatos ainda pouco alimentados foram
armazenados em álcool isopropílico, e aqueles ingurgitados foram mantidos vivos em estufa
BOD a 27°C, umidade relativa de, aproximadamente, 80% e fotoperíodo de 12/12h, para
sofrerem ecdise. Este procedimento visou à obtenção de ninfas ou adultos de carrapatos, para
as quais existem chaves de identificação (ONOFRIO et al., 2006a; ONOFRIO et al., 2006b;
MARTINS et al., 2010). Na análise dos carrapatos estão incluídas amostras coletadas nos
animais recapturados, uma vez que o intuito maior era conhecer a diversidade de espécies de
vetores nos pequenos mamíferos da região periurbana de Uberlândia.
Carrapatos do ambiente foram coletados em todas as localidades do estudo, por arraste
(Figura 6) como descrito por Terassini et al. (2010), com flanelas claras de 1 x 2 m arrastadas
sobre a vegetação por 100 metros em trilhas, sempre no horário de 8 às 10 horas. Todos os
carrapatos coletados desta maneira foram armazenados em álcool isopropílico 100%.
30
Figura 5. Vistoria do roedor a procura de carrapatos fixados (esquerda). Carrapatos fixados no roedor (direita) (Uberlândia, MG, 2011-2012).
Figura 6. Coleta de carrapatos no ambiente por arraste (Uberlândia, MG, 2011-2012).
31
3.4. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para detecção de anticorpos
anti-riquétsias em roedores e marsupiais
Para detecção e avaliação de títulos sorológicos de anticorpos anti-riquétsia, foi
realizada a reação de imunofluorescência indireta (RIFI). Utilizou-se antígenos de cinco
espécies de riquétsias isoladas no Brasil: R. rickettsii cepa Taiaçu, R. parkeri cepa At24, R.
amblyommii cepa Ac37, R. rhipicephali cepa HJ5, R. bellii cepa Mogi das Cruzes, em lâminas
recobertas com os antígenos conforme descrito por Labruna et al. (2007).
A RIFI foi realizada de acordo com trabalhos prévios (HORTA et al., 2004; LABRUNA
et al., 2007; PACHECO et al., 2007). De forma resumida, os soros diluídos a 1:64 em solução
salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) foram aplicados às lâminas contendo os
antígenos fixados e incubados por 30 minutos a 37°C em câmara úmida, seguida por duas
lavagens de 10 minutos com tampão de lavagem (PBS com Triton X-100). Após a secagem
das lâminas foi instilado conjugado apropriado, seguido de incubação a 37°C por 30 minutos.
Na sequência, as lâminas foram lavadas duas vezes por 10 minutos com tampão de lavagem
acrescido de Azul de Evans. Após a secagem, à temperatura ambiente e protegidas da luz,
recobriram-se as lâminas com glicerina tamponada (pH 9,0) e lamínula. A reação foi avaliada
sob microscópio de imunofluorescência (ZEISS – SCOPE A1) em aumento de 40x. Cada
lâmina preparada com soros teste era acompanhada de soros controle sabidamente positivo e
negativo. Os soros que foram considerados positivos (título ≥ 64) na triagem foram titulados.
Para isso, as amostras foram diluídas em série na razão dois e avaliadas por RIFI para
obtenção da maior diluição reativa, definindo o título daquele soro.
Considerando a diversidade de espécies de roedores capturados, todos os soros destes
animais foram testados na triagem com dois anticorpos secundários: 1- Anti-imunoglobulina
G de rato (conjugado anti-rato) (Sigma, IgG de cabra conjugado a FITC) e 2- Anti-
32
imunoglobulina G de camundongo (anti-camundongo) (Sigma, IgG de ovelha conjugado a
FITC), com exceção dos soros de Mus musculus que foram testados somente com conjugado
anti-camundongo. Na triagem, o conjugado de melhor reatividade foi considerado para a
titulação. Os soros dos marsupiais foram testados com anti-imunoglobulina G de gambá (IgG
de coelho conjugado a FITC) produzido pelo Centro de Controle de Zoonoses de São Paulo
(CCZ/SP).
3.5. Licenças
Os procedimentos descritos foram aprovados pela Comissão de Ética na Utilização de
Animais (CEUA) da Universidade Federal de Uberlândia (Nº 071/11) (Anexo 1). Licenças
para a captura dos pequenos mamíferos foram expedidas pelo Instituto Brasileiro do Meio
Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) via Sistema de Autorização e
Informação em Biodiversidade (SISBIO), sob nº 22629-1 e nº 13373-1, e licença para coleta
de ixodídeos sob nº 10762-1.
34
4. RESULTADOS
4.1. Roedores silvestres e marsupiais capturados
Com esforço amostral de 8840 armadilhas x noite, foram capturados 416 animais.
Destes, 48 são da ordem Marsupialia, representada por duas espécies; Didelphis albiventris e
Gracilinanus agilis; e 368 animais da ordem Rodentia, com uma espécie da subfamília
Murinae (Mus musculus) e dez espécies da subfamília Sigmodontinae (Calomys sp.,
Cerradomys sp., Euryoryzomys sp., Hylaeamys megacephalus, Necromys lasiurus, Nectomys
sp., Oecomys bicolor, Oligoryzomys sp., Oxymycterus sp., Rhipidomys macrurus).
4.2. Carrapatos coletados
Dos 416 mamíferos capturados, 48 estavam infestados (Tabela 3). Foram coletados
carrapatos em todos os estágios parasitários de animais capturados e recapturados na mesma
semana e em outras campanhas; 41 espécimes de larvas de Amblyomma sp. e 29 de Ixodes sp.,
destas haviam 5 ingurgitadas que sofreram ecdise, 13 espécimes de ninfas de A. dubitatum e
56 de Ixodes sp., das quais 14 ingurgitadas que sofreram ecdise foram identificadas como
Ixodes loricatus, e os seis adultos de Ixodes loricatus (Tabela 4 e 5).
Das nove localidades pesquisadas apenas cinco apresentaram carrapatos no ambiente,
totalizando 48 espécimes, sendo 29 larvas de Amblyomma sp., nove ninfas e dez adultos de A.
cajennense (Tabela 6).
Fotos dos carrapatos coletados nos hospedeiros e no ambiente encontram-se no
Apêndice 1.
35
Tabela 3. Número, prevalência e intensidade média de carrapatos por espécie de hospedeiros, capturados e recapturados de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG.
Ordem Espécie de mamíferos nº mamíferos capturados
nº mamíferos infestados*
nº carrapatos
Prevalência (%)
Intensidade média
Marsupialia Didelphis albiventris 8 3 19 37,5 6,3
Gracilinanus agilis 40 7 16 17,5 2,3
Rodentia Calomys sp. 32 0 0 - -
Cerradomys sp. 13 0 0 - -
Euryoryzomys sp. 1 0 0 - -
Hylaeamys megacephalus 35 21 47 60 2,2
Mus musculus 2 0 0 - -
Necromys lasiurus 166 4 4 2,4 1
Nectomys sp. 1 0 0 - -
Oecomys bicolor 11 0 0 - -
Oligoryzomys sp. 16 6 41 37,5 6,8
Oxymycterus sp. 5 0 0 - -
Rhipidomys macrurus 86 7 8 8,1 1,1
Total 416 48 135 11,54 2,8 * Os dados referem-se somente as capturas e recapturas mensais, os animais infestados e recapturados na mesma campanha não foram considerados para o cálculo de prevalência e intensidade média.
36
Tabela 4. Número de carrapatos por espécie de hospedeiros capturados e recapturados de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG.
Ordem Espécie N° capturados/ N° infestados*
N° de carrapatos
Estágio evolutivo
Larva Ninfa Adulto Marsupialia Didelphis albiventris 8/3 22 14 3 5
Gracilinanus agilis 40/7 19 12 6 1
Rodentia Calomys sp. 32/0 - - - -
Cerradomys sp. 13/0 - - - -
Euryoryzomys sp. 1/0 - - - -
Hylaeamys megacephalus 35/21 50 12 38 -
Mus musculus 2/0 - - - -
Necromys lasiurus 166/4 4 3 1 -
Nectomys sp. 1/0 - - - -
Oecomys bicolor 11/0 - - - -
Oligoryzomys sp. 16/6 41 24 17 -
Oxymycterus sp. 5/0 - - - -
Rhipidomys macrurus 86/7 9 5 4 -
Total 416/48 145 70 69 6 * Os dados referem-se aos animais capturados e recapturados na mesma campanha e em campanhas diferentes.
37
Tabela 5. Relação das espécies de carrapatos por espécie de pequenos mamíferos capturados e recapturados de julho de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG.
Espécie de mamíferos
Número do
indivíduo
Larva Ninfa Adulto Ixodes
sp.† Amblyomma
sp.
Ixodes sp.
Ixodes
loricatus*
Amblyomma
dubitatum
Ixodes
loricatus
Amblyomma
dubitatum
D. albiventris 1
2
D. albiventris 1 ®
1
D. albiventris 1 ®
2
D. albiventris 1 ®
1
D. albiventris 2
1
D. albiventris 2 ®
1
D. albiventris 3
14
G.agilis 4 1
4
G.agilis 4 ® 3
G.agilis 5 2
1
G.agilis 5 ® 2
G.agilis 6
1
G.agilis 7 1
G.agilis 8 2
G.agilis 9 1
G.agilis 10
1
H. megacephalus 11
1
H. megacephalus 12
1
H. megacephalus 13
1
1
H. megacephalus 13®
1
H. megacephalus 14
2
H. megacephalus 14® 1
H. megacephalus 15 1
H. megacephalus 16
1
H. megacephalus 16 ®
1
H. megacephalus 17
1
H. megacephalus 18
1
H. megacephalus 19
1 1
H. megacephalus 20
2
H. megacephalus 20 ®
1
H. megacephalus 21 1
H. megacephalus 21 ®
11 1
H. megacephalus 21 ®
1
H. megacephalus 22 1
H. megacephalus 23
2
H. megacephalus 24
1
H. megacephalus 25 1
2
H. megacephalus 26
1
H. megacephalus 27 1
38
Continuação Tabela 5.
† Todas as larvas coletadas, inclusive as larvas ingurgitadas que sofreram ecdise; * Ninfas de Ixodes sp. ingurgitadas que sofreram ecdise e foram identificadas com Ixodes loricatus; ® Recaptura.
Tabela 6. Carrapatos coletados no ambiente nos locais de captura de pequenos mamíferos entre os meses de dezembro de 2011 a agosto de 2012, no município de Uberlândia, MG.
Local de coleta Data Espécie Estágio evolutivo
Larva Ninfa Adulto Reserva do Panga fev/12 Amblyomma cajennense - - 3
Condomínio Morada do Sol fev/12 Amblyomma cajennense - - 2 Estrada para Campo Florido mar/12 Amblyomma cajennense - - 1
Reserva do Panga mar/12 Amblyomma cajennense - - 3 Reserva do Panga jun/12 Amblyomma cajennense - - 1 Fazenda do Glória ago/12 Amblyomma sp. 29 - - Fazenda Veadinho ago/12 Amblyomma cajennense - 9 -
Total 29 9 10
Espécie de mamíferos
Número do
indivíduo
Larva Ninfa Adulto Ixodes
sp.† Amblyomma
sp.
Ixodes sp.
Ixodes loricatus*
Amblyomma
dubitatum
Ixodes loricatus
Amblyomma
dubitatum
H. megacephalus 28 4
2
H. megacephalus 29 1
H. megacephalus 30 1
H. megacephalus 31
1
N. lasiurus 32
1
N. lasiurus 33
1
N. lasiurus 34
1
N. lasiurus 35
1
Oligoryzomys sp. 36
2
Oligoryzomys sp. 37
1
Oligoryzomys sp. 38
1
Oligoryzomys sp. 39
9
Oligoryzomys sp. 40
1
Oligoryzomys sp. 41
23
4
R. macrurus 42 1
R. macrurus 43
2
R. macrurus 44 1
R. macrurus 45 1
R. macrurus 45 ® 1
R. macrurus 46
1
R. macrurus 47 1
R. macrurus 48
1
Total 29 41 42 14 13 6 0
39
4.3. Sorologia para riquétsias
Animais soropositivos foram encontrados em oito locais (Figura 7). Do total de 416
soros testados contra cinco antígenos de Rickettsia spp., 70 (16,8%) foram positivos para pelo
menos um antígeno, destes 19 (27,1%) são marsupiais e 51 (72,8%) roedores (Tabela 7). Das
amostras positivas, 46 (65,7%) foram reativas para uma espécie de Rickettsia sp., oito
(11,4%) para duas espécies, cinco (7,1%) para três e cinco espécies, e seis (8,6%) para as
quatro espécies de riquétsias testadas.
Para 37 animais soropositivos, foi definido o possível antígeno indutor da reação
sorológica (PAIRS), ou seja, soro com título pelo menos quatro vezes superior para uma
espécie de riquétsia frente a todas as outras testadas, sendo considerada reação homóloga para
este antígeno (Horta et al., 2004; Pacheco et al. 2007) (Apêndice 2 e 3). Nesta análise foram
detectados nove animais soropositivos para R. rickettsii, quatro para R. parkeri e R.
rhipicephali, e vinte para R. bellii (Tabela 8).
A sorologia dos roedores foi realizada com dois anticorpos secundários optando pelo de
melhor reatividade para a titulação. Dos 51 soros positivos, 28 foram titulados com conjugado
anti-rato e 23 com anti-camundongo.
40
Figura 7. Distribuição de pequenos mamíferos soropositivos para Rickettsia spp. do grupo da febre maculosa e R. bellii, e possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS), no município de Uberlândia, de julho de 2011 a agosto de 2012. Fazenda do Glória (FG); Reserva do Panga (RP); Fazenda Veadinho (FV); Fazenda da Fernanda (FF); Instituto Federal (IF); Chácaras Eldorado (CE); Chácara Bálsamo (CB); Condomínio Morada do Sol (CMS); Estrada para Campo Florido (CF); Os números entre parênteses referem-se (Nº de animais capturados por área/ Nº de animais soropositivos por área); RND (Espécie de Rickettsia não definida).
(Fonte: Google Earth)
41
Tabela 7. Percentual de amostras de soro reativas para Rickettsia spp. do grupo da febre maculosa e Rickettsia bellii em pequenos mamíferos capturados de julho de 2011 a agosto de 2012 no município de Uberlândia, MG.
Ordem Espécie N° capturados/ N° soro positivo
Prevalência soros positivos (%)
Marsupialia Didelphis albiventris 8/3 37,5
Gracilinanus agilis 40/16 40
Rodentia Calomys sp. 32/1 3,1
Cerradomys sp. 13/4 30,8
Euryoryzomys sp. 1/1 100
Hylaeamys megacephalus 35/2 5,7
Mus musculus 2/0 -
Necromys lasiurus 166/18 10,8
Nectomys sp. 1/1 100
Oecomys bicolor 11/0 -
Oligoryzomys sp. 16/1 6,2
Oxymycterus sp. 5/3 60
Rhipidomys macrurus 86/20 23,2
Total 416/70 16,8 Tabela 8. Relação do possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS) com as espécies de pequenos mamíferos capturados de julho de 2011 a agosto de 2012 no município de Uberlândia, MG.
Espécie de mamíferos N° soro positivo
PAIRS R.
rickettsii
R.
parkeri
R.
rhipicephali
R.
bellii RND
Didelphis albiventris 3 1 - - 2 - Gracilinanus agilis 16 - 1 1 9 5
Calomys sp. 1 - - - - 1
Cerradomys sp. 4 1 - - 1 2 Euryoryzomys sp. 1 - - - - 1
Hylaeamys megacephalus 2 - - 1 - 1 Mus musculus 0 - - - - -
Necromys lasiurus 18 4 1 1 1 11 Nectomys sp. 1 - - - - 1
Oecomys bicolor 0 - - - - - Oligoryzomys sp. 1 - 1 - - - Oxymycterus sp. 3 1 - 1 - 1
Rhipidomys macrurus 20 2 1 - 7 10 Total 70 9 4 4 20 33
RND: Espécie de Rickettsia não definida
43
5. DISCUSSÃO
As infestações por carrapatos nos pequenos mamíferos observadas neste estudo foram
às esperadas, uma vez que dos D. albiventris capturados, três estavam parasitados por estágios
imaturos de Amblyomma sp. e adultos de I. loricatus. Estes achados corroboram com dados
anteriores que relatam marsupiais do gênero Didelphis como hospedeiros de estágios imaturos
do gênero Amblyomma (LABRUNA, 2009) e adultos de I. loricatus (SCHUMAKER et al.,
2000). A outra espécie de marsupial, G. agilis, estava infestada com imaturos de Ixodes sp.,
parasitismo já relatado anteriormente neste gênero (MARQUES et al., 2004), e um adulto de
I. loricatus, que se constitui no primeiro relato desta espécie de adulto de carrapato neste
hospedeiro.
Das 11 espécies de roedores silvestres capturados, quatro espécies estavam infestadas
por carrapatos (H. megacephalus, N. lasiurus, Oligoryzomys sp. e R. macrurus). Nestes
animais foram coletadas larvas de Ixodes spp. e Amblyomma spp., e ninfas de A. dubitatum e
Ixodes sp. Estes achados confirmam a importância de pequenos mamíferos como hospedeiros
para fases imaturas dos ixodídeos (MARQUES et al., 2004). A adequação destes hospedeiros
para o ciclo de vida dos carrapatos foi reforçada pela coleta de carrapatos ingurgitados ou
semingurgitados, e que em sua maioria, sofreram muda.
Merece menção também a ligação estabelecida entre roedores e marsupiais no ciclo de
vida de carrapatos; nos roedores foram encontradas larvas e ninfas de Ixodes sp. (algumas
identificadas como I. loricatus após sofrerem muda para adulto), e adultos de I. loricatus
foram coletados em marsupiais D. albiventris. Este fato reforça as observações de Nava e
Guglielmone (2012), os quais ressaltam que roedores e marsupiais compartilham o mesmo
habitat e, consequentemente, as mesmas espécies de carrapatos. Este compartilhamento de
44
carrapatos abre caminho para a transmissão de microorganismos de uma espécie hospedeira
para outra.
Capivara (Hydrochaeris hydrochaeris) é considerada hospedeiro amplificador do agente
da FMB, a R. rickettsii, em áreas endêmicas (LABRUNA, 2009; SOUZA et al., 2009). A
capivara é também hospedeiro primário para todos os estágios parasitários do carrapato A.
dubitatum. Entretanto de maneira geral, os estágios imaturos apresentam uma menor
especificidade, e como consequência alimentam-se também em outros hospedeiros
(LABRUNA, PINTER, TEIXEIRA, 2004). Em nosso trabalho, espécimes de A. dubitatum
foram coletados em pequenos mamíferos na Fazenda do Glória, onde há relatos da presença
de capivaras (ALVES, 2010), na Chácara Bálsamo, e nas Chácaras Eldorado.
Do carrapato A. dubitatum foram detectadas e/ou isoladas as riquétsias, R. belli, R.
parkeri e Rickettsia sp. cepa Pampulha (LABRUNA et al., 2004; HORTA et al., 2007;
PACHECO et al., 2009; ALMEIDA et al., 2011). Assim, podemos conjecturar que se esta
espécie de carrapato estiver infectada com Rickettsia spp. pode vir a participar do ciclo de
transmissão de riquétsias a outros hospedeiros. As observações em nosso trabalho das formas
imaturas de carrapatos A. dubitatum parasitando roedores sigmodontíneos e marsupiais, indica
a necessidade de estudos destes mamíferos na epidemiologia da FMB. O estudo destas
relações é importante principalmente em áreas endêmicas e onde há capivaras, pois não há
informação precisa sobre a origem das riquétsias que depois são amplificadas na infecção de
capivaras, para centenas a milhares de carrapatos (LABRUNA, 2009).
A presença de A. cajennense nos ambientes estudados é resultado que deve ser
analisado com cautela, já que esta espécie é considerada o principal vetor e também um
reservatório da R. rickettsii no Brasil, e seus estágios imaturos são muito agressivos ao ser
humano (ROZENTAL et al., 2009; LABRUNA, 2009). Apesar de ser o principal vetor para
R. rickettsii, o A. cajennense não é um bom hospedeiro para esta riquétsia, em consequência
45
da patogenicidade da bactéria aos carrapatos em que observa-se uma baixa prevalência da
bactéria em populações deste carrapato em áreas endêmicas no sudeste brasileiro
(LABRUNA, 2009; SOARES et al., 2011). Em nosso trabalho o parasitismo dos pequenos
mamíferos por A. cajennense não pôde ser comprovado. Não foi observada nenhuma ninfa
deste carrapato nos animais, porém não podemos descartar a infestação por larvas deste
carrapato em função da não identificação das espécies. Merece menção, entretanto, que nos
trabalhos em que se realizou a identificação de larvas e ninfas de pequenos mamíferos, após
alimentação em laboratório para obtenção das ninfas e adultos correspondentes, ou pela
identificação molecular, a infestação por A. cajennense sempre foi baixa (Ramos
comunicação pessoal). No conjunto estas observações sugerem a pequena participação de
pequenos roedores na alimentação e eventual infecção por riquétsias de imaturos de A.
cajennense, mesmo que o carrapato seja muito prevalente no ambiente.
Devido a grande diversidade de espécies de roedores capturadas, decidiu-se utilizar na
triagem dos soros, dois anticorpos secundários (anti-rato e anti-camundongo), optando pelo de
melhor reatividade para a titulação. Analisando a distância filogenética entre as espécies de
roedores capturadas com as espécies usadas na preparação dos anticorpos, Rattus rattus e Mus
musculus, verificamos que a distância filogenética é semelhante e, por isso, o uso de qualquer
um dos conjugados não influenciaria no resultados. Isso foi confirmado pelos 51 soros de
roedores positivos, destes 28 foram titulados com conjugado anti-rato e 23 com anti-
camundongo. Porém, em análise qualitativa das reações de imunofluorescência, o conjugado
anti-rato apresentou melhor reatividade.
Observou-se em nosso trabalho uma prevalência média de 16,8% na sororreatividade
contra riquétsias em pequenos mamíferos de Uberlândia. Ademais, animais sororeativos
foram capturados em oito das nove localidades estudadas, sugerindo uma distribuição ampla
de Rickettsia spp. na área periurbana de Uberlândia. A sororreatividade em pequenos
46
mamíferos contra Rickettsia spp. foi descrita em vários estudos e indica que estes vertebrados
são hospedeiros sentinelas (LABRUNA, 2009; MILAGRES et al., 2010), o que possibilita a
avaliação epidemiológica de uma área, e a estimativa do risco de infecção humana.
Infelizmente o teste sorológico RIFI não permite distinguir a espécie de riquétsia responsável
pela produção do anticorpo, devido à ocorrência de reação cruzada com os antígenos das
diversas espécies de riquétsias. Esta reação ocorre devido à presença de epítopos semelhantes
em diferentes espécies do gênero Rickettsia (SAITO et al., 2008), entretanto, os títulos de
anticorpos homólogos são mais elevados do que os títulos de anticorpos heterólogos. Por este
motivo, se o título de anticorpos contra determinada espécie de riquétsia for pelo menos
quatro vezes superior as demais, ela pode ser considerada a espécie homóloga e responsável
pela infecção que estimulou o sistema imune do hospedeiro (LA SCOLA, RAOULT, 1997;
HORTA et al., 2004).
Nestas condições nossos resultados indicam a circulação de quatro espécies de
riquétsias, R. rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali e R. bellii, próximo à área urbana do
município de Uberlândia (Figura 7). Dentre as riquétsias, a R. bellii foi a mais prevalente,
notadamente em marsupiais. Esta maior prevalência se justifica pela presença em nossa
amostragem de carrapatos, o A. dubitatum e I. loricatus, e hospedeiros marsupiais
sabidamente associados a transmissão e infecção por esta espécie de riquétsia (PACHECO et
al., 2009; SZABÓ et al., 2013 – no prelo).
Por outro lado, as espécies R. rickettsii e R. parkeri são consideradas patogênicas ao
homem (LABRUNA, 2009) e, por isso, sua presença na região deverá ser confirmada por
métodos moleculares ou isolamento. Porém deve-se ressaltar que, de forma geral os títulos de
anticorpos encontrados foram baixos na maioria das amostras, sugerindo infecções brandas ou
antigas, sem a presença de um foco ativo de multiplicação de riquétsias.
47
Pequenos mamíferos são de suma importância para ecologia de alguns patógenos, a
exemplo, para o Borrelia burgdorferi, o agente etiológico da Doença de Lyme. Levi e
colaboradores (2012) confirmaram o modelo teórico que ilustra a redução dos predadores de
pequenos mamíferos e, consequentemente, o aumento desta população, como fator de
influência direta no aumento de prevalência da Doença de Lyme, isso porque os pequenos
mamíferos são os hospedeiros para as fases imaturas do carrapato vetor da B. burgdorferi.
Esta importante participação dos pequenos mamíferos na cadeia de transmissão da B.
burgdorferi, nos alerta para uma investigação mais minuciosa por meio de técnicas
moleculares, para a confirmação das espécies de riquétsias circulantes no município, visto que
há espécies de roedores e marsupiais soropositivos para riquétsias e há carrapatos vetores
associados a estes mamíferos na área periurbana.
Portanto, a área periurbana, uma área que está em constante modificação devido à ação
antrópica, tem como resultado a aproximação do homem ao ambiente natural, da fauna e seus
patógenos. Neste cenário, há um desequilíbrio ecológico na relação parasito-hospedeiro
(Queirogas, 2010), o que favorece a transmissão acidental de patógenos ao homem. Neste
sentido, constante vigilância epidemiológica deve ocorrer no município de Uberlândia, para
que medidas preventivas possam ser definidas.
49
6. CONCLUSÕES
- Pequenos mamíferos da região de Uberlândia são infestados por larvas de Amblyomma
spp. e Ixodes spp., ninfas de A. dubitatum, Ixodes spp. e I. loricatus, e adultos de I. loricatus;
- Roedores e marsupiais soropositivos contra Rickettsia spp. foram detectados no
município de Uberlândia, com reação homóloga contra quatro espécies, R. rickettsii, R.
parkeri, R. rhipicephali e R. bellii;
- Amblyomma cajennense foi coletado no ambiente, resultado importante, visto que esta
espécie é considerada o principal vetor e também um reservatório da R. rickettsii no Brasil, e
seus estágios imaturos são muito agressivos ao ser humano;
- Este trabalho possibilitou conhecer a situação do município de Uberlândia com relação
à circulação de Rickettsia spp., sendo o passo inicial para mais estudos na região. E um alerta
as autoridades que devem manter constante vigilância epidemiológica.
51
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63
Apêndice 1. Fotos dos carrapatos coletados no ambiente e nos pequenos mamíferos capturados no município de Uberlândia, MG, 2011-2012.
Larva de Ixodes sp. (visão ventral) Ninfa de Ixodes sp. (visão dorsal e ventral)
Macho e fêmea Ixodes loricatus (visão dorsal e ventral)
Larva (esquerda) e ninfa (direita) de Amblyomma dubitatum (Visão dorsal e ventral)
Gnatossoma de uma ninfa de Amblyomma dubitatum (esquerda), e ninfa de Ixodes sp.
Macho e fêmea Amblyomma cajennense (visão dorsal e ventral)
64
Apêndice 2. Título de anticorpos contra riquétsias do grupo da febre maculosa e Rickettsia
bellii, e possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS) em marsupiais do município de Uberlândia, MG, 2011-2012.
Espécie de mamíferos
Título final por antígeno PAIRS R.
rickettsii
R.
parkeri
R.
amblyommii
R.
rhipicephali
R.
bellii
Didelphis albiventris 256 - - - - R. rickettsii
Didelphis albiventris - - - - 128 R. bellii
Didelphis albiventris 128 256 - - 1024 R. bellii
Gracilinanus agilis - 64 - - - * Gracilinanus agilis - - - - 64 * Gracilinanus agilis - - - - 128 R. bellii
Gracilinanus agilis - - - - 128 R. bellii
Gracilinanus agilis - - - - 64 * Gracilinanus agilis - - - - 128 R. bellii
Gracilinanus agilis - - - - 128 R. bellii
Gracilinanus agilis - - - - 256 R. bellii
Gracilinanus agilis - - - 128 - R. rhipicephali
Gracilinanus agilis - - - - 128 R. bellii
Gracilinanus agilis - - - - 256 R. bellii
Gracilinanus agilis - 64 - - - * Gracilinanus agilis - - - - 128 R. bellii
Gracilinanus agilis - - - - 64 * Gracilinanus agilis - - - - 128 R. bellii
Gracilinanus agilis 64 256 - - - R. parkeri
- : soro não reativo no título 64 ou superior * : Espécie de Rickettsia não definida
65
Apêndice 3. Título de anticorpos contra riquétsias do grupo da febre maculosa e Rickettsia
bellii, e possível antígeno indutor da reação sorológica (PAIRS) em pequenos roedores do município de Uberlândia, MG, 2011-2012.
Espécie de mamíferos Título final por antígeno
PAIRS R.
rickettsii
R.
parkeri
R.
amblyommii
R.
rhipicephali
R.
bellii
Calomys sp. - - - - 64 * Cerradomys sp. - - - - 128 R. bellii
Cerradomys sp. - - - - 64 * Cerradomys sp. 128 - - - - R. rickettsii
Cerradomys sp. 512 256 256 256 64 * Euryoryzomys sp. 64 64 - 64 - *
Hylaeamys megacephalus - - - 256 - R. rhipicephali
Hylaeamys megacephalus 64 128 128 64 - * Necromys lasiurus 64 - - - - * Necromys lasiurus - - - - 256 R. bellii
Necromys lasiurus 128 - - - - R. rickettsii
Necromys lasiurus - 128 - - - R. parkeri
Necromys lasiurus 128 - - - - R. rickettsii
Necromys lasiurus - - - - 64 * Necromys lasiurus 128 - - - - R. rickettsii
Necromys lasiurus 64 - - - - * Necromys lasiurus 64 - - - - * Necromys lasiurus - - - 128 - R. rhipicephali
Necromys lasiurus 128 - - - - R. rickettsii
Necromys lasiurus 64 - - 128 - * Necromys lasiurus 128 - - 64 - * Necromys lasiurus 512 128 64 - - * Necromys lasiurus 256 256 256 256 - * Necromys lasiurus 128 128 64 64 - * Necromys lasiurus 256 256 64 256 - * Necromys lasiurus 512 256 128 256 - *
Nectomys sp. 128 128 64 128 64 * Oligoryzomys sp. - 128 - - - R. parkeri
Oxymycterus sp. 128 - - - - R. rickettsii
Oxymycterus sp. - 64 - 256 - R. rhipicephali
Oxymycterus sp. 512 512 256 512 512 * Rhipidomys macrurus - - - - 64 * Rhipidomys macrurus - - - - 128 R. bellii
Rhipidomys macrurus - - - - 256 R. bellii
Rhipidomys macrurus - 128 - - - R. parkeri
Rhipidomys macrurus 128 - - - - R. rickettsii
Rhipidomys macrurus - - - - 128 R. bellii
Rhipidomys macrurus - - - - 256 R. bellii
66
Continuação apêndice 3.
Espécie de mamíferos Título final por antígeno
PAIRS R.
rickettsii
R.
parkeri
R.
amblyommii
R.
rhipicephali
R.
bellii
Rhipidomys macrurus - - - - 512 R. bellii
Rhipidomys macrurus - - - - 64 * Rhipidomys macrurus - - - - 128 R. bellii
Rhipidomys macrurus - - - - 64 * Rhipidomys macrurus 64 64 - - - * Rhipidomys macrurus - - - 64 512 R. bellii
Rhipidomys macrurus 64 - 64 - - * Rhipidomys macrurus 256 - - 64 - R. rickettsii
Rhipidomys macrurus 1024 512 - 512 - * Rhipidomys macrurus 64 128 64 - - * Rhipidomys macrurus 64 64 128 64 - * Rhipidomys macrurus 2048 2048 1024 2048 1024 * Rhipidomys macrurus 2048 2048 512 2048 512 *
- : soro não reativo no título 64 ou superior * : Espécie de Rickettsia não definida