Actualizado el miércoles, 15 febrero 2006

Índice:

1 NOCIONES GENERALES SOBRE EL METABOLISMO ENERGÉTICO BACTERIANO

2 CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS BACTERIAS QUIMIOTROFAS

2.1 FOSFORILACIÓN A NIVEL DE SUSTRATO. FERMENTACIONES

2.2 FOSFORILACIÓN OXIDATIVA. RESPIRACIONES

2.2.1 C ADENA TRANSPORTADORA DE ELECTRONES Y FUERZA MOTRIZ DE PROTONES

2.2.2 MECANISMO DE LA ATP-SINTASA DEPENDIENTE DE PROTONES

2.2.3 DIVERSIDAD DE LAS RESPIRACIONES

2.2.3.1       SEGÚN LOS TIPOS DE DONADORES DE ELECTRONES

2.2.3.1.1       QUIMIORGANOTROFÍA

2.2.3.1.2       QUIMIOLITOTROFÍA

2.2.3.2       SEGÚN LOS TIPOS DE ACEPTORES DE ELECTRONES

2.2.3.2.1       RESPIRACIÓN AEROBIA

2.2.3.2.2       RESPIRACIONES ANAEROBIAS

2.2.3.3       DIVERSIDAD DE CADENAS TRANSPORTADORAS

3 CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS FOTOTROFAS: FOTOFOSFORILACIÓN

3.1 COMPONENTES DEL APARATO FOTOSINTÉTICO

3.2 FUNCIONAMIENTO DE UN FOTOSISTEMA

3.3 TIPOS DE FOTOFOSFORILACIÓN

3.3.1 FOTOFOSFORILACIÓN CÍCLICA

3.3.2 FOTOFOSFORILACIÓN ACÍCLICA

3.3.2.1 FOTOFOSFORILACIÓN ACÍCLICA ANOXIGÉNICA EN ANOXIFOTOBACTERIAS

3.3.2.2 FOTOFOSFORILACIÓN ACÍCLICA OXIGÉNICA EN CIANOBACTERIAS

4 CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN HALOBACTERIUM

5 EL OXÍGENO Y EL METABOLISMO PROCARIÓTICO

5.1 REACCIONES MEDIADAS POR FLAVOPROTEÍNAS

5.2 RELACIONES DE LOS PROCARIOTAS CON EL OXÍGENO

ENLACES

El metabolismo es el conjunto de reacciones bioquímicas que permiten el crecimiento de un organismo (por lo tanto, en bacterias, que conduce a la creación de nuevas células). El metabolismo de la célula comprende dos grandes tipos de reacciones:

1)      reacciones de mantenimiento, que suministran

a)      energía

b)      poder reductor

c)      precursores metabólicos

2)      reacciones del anabolismo (biosíntesis), que usan energía y poder reductor procedente de las reacciones de mantenimiento.

1          NOCIONES GENERALES SOBRE EL METABOLISMO ENERGÉTICO BACTERIANO

Las bacterias requieren aporte continuo y de acceso inmediato de energía, que es usada en procesos de:

biosíntesis (anabolismo)transporte activotranslocación de proteínas a través de la membrana citoplásmicamovimiento flagelarbioluminiscencia

En bacterias, al igual que en eucariotas, la conservación intracelular de energía ocurre principalmente por medio de la síntesis de ATP:

ADP3- + H+ + PO4H2- --------> ATP4- + H2O

La hidrólisis de ATP hasta ADP y P genera una variación de energía libre DGo'= -31 kJ (= -7,3 kcal). La síntesis de ATP a partir de ADP y P requiere una DGo' de +31 kJ. Los métodos usados por las bacterias para generar este ATP son principalmente:

fosforilación a nivel de sustrato (en las fermentaciones);fosforilación oxidativa (en las respiraciones);fotofosforilación (durante la fotosíntesis).

Cada uno de estos procesos implica uno o varios pasos de reacciones redox exergónicas, pero la manera en que esas reacciones exergónicas se acoplan a la síntesis de ATP varía entre la fosforilación a nivel de sustrato y las otras dos.

Veamos en primer lugar las características comunes de estas reacciones redox:

En esta reacción se libera energía libre, cuyo valor viene expresado por la fórmula:

DG0'= - n·F·DE0'

n = nº de electrones transferidos

F = cte. de Faraday = 96,6 kJ·volt—1·equivalentes--1

DE0' es la diferencia entre los potenciales de reducción del donador (pareja D/DH2) y del aceptor (pareja A/AH2).

Una reacción redox exergónica de este tipo se puede acoplar a la consecución de trabajo útil:

formación de un compuesto rico en energía;formación de un gradiente de concentración y/o de carga eléctrica a ambos lados de una membrana.

Ambos tipos de trabajo se pueden usar en la síntesis de ATP.

Por lo tanto, los seres vivos, para poder obtener su moneda energética (principalmente ATP), han de captar alguna fuente de energía externa, del medio ambiente. Veamos, pues, cuáles son los tipos de energía que captan los procariotas y los correspondientes tipos de metabolismos energéticos:

1)      Si la energía procede de radiaciones (en los cuantos de una determinada longitud de onda de la luz visible): bacterias fototrofas, que a su vez pueden ser:

a)     fotolitotrofas: captan energía lumínica en presencia de sustancias inorgánicas;

b)      fotoorganotrofas: captan energía lumínica con requerimiento de sustancias orgánicas.

2)      Si la energía se desprende a partir de moléculas químicas en reacciones biológicas de óxido-reducción: bacterias quimiotrofas, que a su vez pueden ser:

a)      quimiolitotrofas: captación de energía química a partir de sustancias inorgánicas;

b)      quimiorganotrofas: captación de energía química a partir de sustancias orgánicas.

Veamos ahora lo que diferencia a grandes rasgos a la fosforilación a nivel de sustrato respecto de la fosforilación oxidativa y la fotofosforilación:

La fosforilación a nivel de sustrato es un sistema usado por ciertas bacterias quimiorganotrofas. El sustrato orgánico (donador de electrones) es oxidado por un coenzima (p. ej., NAD+), de manera que se origina un intermediario no fosforilado con una gran energía de hidrólisis. Dicho intermediario experimenta una sustitución con un fosfato, para dar la correspondiente forma acil-fosfato (siendo este enlace de alta energía). Finalmente, este acil-fosfato dona su fosfato de alta energía al ADP, que pasa a ATP.

Las fosforilaciones a nivel de sustrato se caracterizan por lo siguiente:

son procesos escalares (es decir, no influye su situación espacial dentro de la célula);son series de reacciones bioquímicas en las que la transferencia de un grupo químico

(ej., el fosfato) se cataliza por enzimas solubles (en el citoplasma);existen intermediarios metabólicos (antes de llegar al ATP) en los que el fosfato está unido covalentemente.

En cambio, tanto la fosforilación oxidativa como la fotofosforilación son procesos caracterizados por:

ser vectoriales (orientados en el espacio);estar ligados a membrana;implicar una secuencia ordenada de transportadores de electrones que sufren oxidaciones y reducciones reversibles (cadena transportadora de electrones, c.t.e.).no hay intermediarios covalentes ricos en energía, sino que la transferencia de energía se realiza por medio de un gradiente electroquímico de protones (y, en algunos casos, de cationes). Este gradiente de protones se puede emplear a su vez para:

síntesis de ATP,transporte de nutrientes,translocación de proteínas fuera del protoplasto,movimiento flagelar.

2          CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS BACTERIAS QUIMIOTROFAS

En los organismos quimiotrofos, la captación de energía consiste esencialmente en la oxidación de un sustrato reducido (orgánico en quimiorganotrofos e inorgánico en quimiolitotrofos) con una redución concomitante de un aceptor de electrones (que a su vez puede ser orgánico o inorgánico), y todo ello acoplado a un sistema de fosforilación del ADP, que se convierte en ATP.

2.1        FOSFORILACIÓN A NIVEL DE SUSTRATO. FERMENTACIONES

            La fosforilación a nivel de sustrato es un sistema usado por ciertas bacterias quimiorganotrofas. El sustrato orgánico (donador de electrones) pasa por una ruta catabólica (p.ej., la ruta glucolítica), y uno de los intermediarios de esa ruta es oxidado por un coenzima (p. ej., NAD+), de manera que se origina un intermediario no fosforilado con una gran energía de hidrólisis. Dicho intermediario experimenta enseguida una sustitución con un fosfato, para dar la correspondiente forma acil-fosfato (siendo este enlace de alta energía). Finalmente, este acil-fosfato dona su fosfato de alta energía al ADP, que pasa a ATP. Ejemplo: gliceraldehido-3-P 1,3-difosfoglicérico 3-fosfoglicérico. Ejemplo:

La fosforilación a nivel de sustrato está acoplada a un proceso metabólico denominado fermentación. Durante la fermentación, el sustrato orgánico reducido (DH2) es catabolizado, de modo que como acabamos de ver, se produce ATP. Este catabolismo genera, además:

equivalentes de reducción (en forma de NADH y otros cofactores reducidos), eintermediarios oxidados de la ruta catabólica.

Pues bien, es característico de las fermentaciones que los equivalentes de reducción reaccionen con uno de esos intermediarios (A), que de este modo se reduce a AH2 (producto de la fermentación), regenerándose el cofactor en forma oxidada (NAD+) para el siguiente ciclo. Ejemplo: la reducción del pirúvico a láctico (este es el producto de la fermentación) permite la regeneración del cofactor oxidado (NAD+):

Observaque, a diferencia de la respiración (en la que el aceptor final de electrones esexógeno) en la fermentación el aceptor de electrones (A) es un compuestoorgánico endógeno producido en la misma ruta de fermentación.El rendimiento de las fermentaciones, expresado como variación de energía libre, es bajo, debido a la poca diferencia de E’0 entre el donador y el aceptor. En la fermentación homoláctica se producen 2 moles de ATP por cada mol de glucosa consumido (frente a los 28 moles de ATP/mol de glucosa en la respiración aerobia). Esto significa que para que el microorganismo crezca en estas condiciones, degrada grandes cantidades de sustrato fermentable. En las fermentaciones el sustrato orgánico se oxida parcialmente, de modo que parte del C se excreta como producto de fermentación y parte se usa para las reacciones biosintéticas.

Las fermentaciones se dan en determinados microorganismos quimiorganotrofos, que pueden ser anaerobios obligados o anaerobios facultativos (cuando crecen en ausencia de O2).

Hay una gran variedad de fermentaciones microbianas, y cada tipo libera uno o varios productos de fermentación característicos. Algunos ejemplos:

Tipo de fermentación Producto(s)

Fermentación láctica Lactato

Fermentación alcohólica etanol, CO2

Fermentación ácida-mixta etanol, succinato, acetato, formiato, lactato, CO2, H2

Fermentación butilénglicólica butilénglicol, CO2

Fermentación aceto-butírica acetato, acetona, butirato, butanol, etanol, CO2, H2

Como ya dijimos, la fosforilación a nivel de sustrato suele ir acoplada a algún tipo de fermentación, pero a la inversa no tiene por qué ser así, lo cual viene a remarcar la ya citada no identidad de ambos conceptos. Algunas bacterias especializadas realizan algún tipo de fermentación sin fosforilación a nivel de sustrato. Por ejemplo, Propionigenium modestum lleva a cabo la siguiente fermentación:

Succinato + H2O propionato + HCO3- (ΔG0’ = -20,5 kJ)

La energía libre generada es insuficiente para acoplarla directamente a la síntesis de ATP por fosforilación a nivel de sustrato, y por otro lado esta bacteria carece de cadenas de electrones respiradoras. Entonces, ¿cómo obtiene la energía? Esto se logra porque la descarboxilasa de membrana que realiza la anterior reacción acopla la descarboxilación del succinato a la salida de iones Na+, con lo que se crea un gradiente electroquímico de Na+. La disipación parcial de dicho gradiente a través de ATP-sintasas de membrana  dependientes de Na+ impulsa la síntesis de ATP.

2.2        FOSFORILACIÓN OXIDATIVA. RESPIRACIONES

Respiración es la obtención de energía por oxidación de sustratos reducidos DH2 (orgánicos en quimiorganotrofas, e inorgánicos en quimiolitotrofas), pero los coenzimas reducidos (ej., NADH) transfieren los electrones a un aceptor final oxidado, no directamente (como en la fermentación), sino a través de una cadena transportadora de electrones al final de la cual existe un aceptor exógeno oxidado (A), que se reduce.

Si el aceptor final es el O2, hablamos de respiración aerobia;Si el aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.), respiración anaerobia.

En ambos casos, la transferencia se da ordenadamente, en la dirección de mayor potencial redox positivo, con la consiguiente liberación de energía libre. Como veremos enseguida, esta energía libre se va a traducir en un potencial electroquímico de protones, cuya disipación a través de ATP-asas de membrana origina ATP, conociéndose este proceso como fosforilación oxidativa.

2.2.1        CADENA TRANSPORTADORA DE ELECTRONES Y FUERZA MOTRIZ DE PROTONES

Como el alumno seguramente sabrá, el mecanismo de la fosforilación oxidativa se suele explicar en base a la teoría quimiosmótica de Mitchell (1961 y años siguientes). Recordemos que la c.t.e. está formada por una serie ordenada de moléculas transportadoras situadas (en bacterias) en la membrana citoplásmica (y en sus invaginaciones), moléculas que sufren oxidaciones y reducciones reversibles.

Los donadores de electrones inmediatos para las c.t.e son el FADH2 y el NADH+H+, que se generan, p.ej., en la glucolisis o en el ciclo de Krebs (ciclo de los ácidos tricarboxílicos o del ácido cítrico). El alumno conocerá por la asignatura de Bioquímica los principales tipos de componentes de las c.t.e. respiratorias:

NADH deshidrogenasas, unidas a la cara interna de la membrana. Aceptan átomos de H a partir del NADH, y se los ceden a las flavoproteínasFlavoproteínas (Fp, un tipo de riboflainas), dotadas de grupos FAD o FMN. Pueden acepar átomos de H, pero a su vez ceden electrones.Proteínas no hémicas de Fe-S (Fe/S proteínas). Algunas poseen agrupamientos de Fe2S2 (como la ferredoxina) y otras Fe4S4. Transportan solamente electrones.Quinonas. Son moléculas muy hidrofóbicas, inmersas en la membrana, capaces de moverse dentro de ella. Sirven como aceptores de átomos de H, pero sólo ceden electrones. En bacterias podemos encontrar dos principales tipos de quinonas:

ubiquinona (UQ)menaquinona (MQ), más frecuente en bacterias Gram-positivas.

Citocromos (proteínas hémicas con Fe quelado). Sufren oxidación y reducción por pérdida y ganancia de un electrón cada vez, a través del Fe del centro de la molécula. Los citocromos son de varias clases, según el tipo de grupo hemo (ej. tipo a, b, c, etc), y a veces forman complejos fuertes con otros citocromos (ej., cit bc1) o con Fe/S-proteínas.

El alumno recordará que los electrones fluyen desde los transportadores con potencial de reducción más negativo hacia los de potencial más positivo, hasta que finalmente reducen un aceptor final de electrones (A) obtenido del ambiente. Observar que algunos de estos transportadores transportan átomos de H (o sea, protones y electrones), mientras que otros transportan únicamente electrones. ¿Qué pasa con los protones? Ahí está la gracia... paciencia, enseguida lo veremos. La situación de los transportadores dentro de la membrana es asimétrica, lo que condiciona que el transporte sea un proceso vectorial (es decir, tiene un sentido determinado), de modo que los H salen hacia afuera y los electrones tienden a entrar al interior. Como resultado de todo ello, tenemos que existen determinados puntos de la c.t.e. (llamados bucles o lazos translocadores de protones) en los que el efecto neto es la salida de protones al exterior de la membrana citoplásmica (concretamente, en los puntos donde confluyen un transportador de H+ y otro de electrones). Es decir, existe una translocación de protones hacia el exterior ligada a las reacciones redox que ocurren en la c.t.e.

Por otro lado, la membrana es impermeable a los protones, por lo que los protones translocados a resultas del funcionamiento de las c.t.e. no pueden entrar directamente. Por lo tanto, se crea un gradiente electroquímico de protones, compuesto de gradiente osmótico de esos iones H+ (DpH) y un gradiente de carga eléctrica (Dy). Este gradiente es una forma de energía potencial que puede realizar trabajo. El valor de este gradiente electroquímico de protones o fuerza protón motriz (f.p.m.) es:

 Dp = yD -Z·DpH (expresado en milivoltios, mV),

donde Z = 2,3 R·T/F, siendo R= constante de los gases, T= temperatura absoluta, F= constante de Faraday

Como ya dijimos, esta Dp (f.p.m.) es capaz de:

realizar trabajo útil directamente: transporte activo ligado a simporte de iones (repasa el capítulo 6)rotación del motor flagelar (repasa el capítulo 8)

usarse para dirigir la formación de enlaces fosfato de alta energía en forma de ATP (fosforilación oxidativa), como veremos a continuación.

2.2.2        MECANISMO DE LA ATP-SINTASA DEPENDIENTE DE PROTONES

            La conversión de la fuerza protón-motriz en ATP se realiza por medio de una ATP-asa. Este complejo proteico consta de dos partes funcionales, un canal integral de membrana (F0) y una estructura globular en el lado citoplásmico de la membrana (F1). La ATP-asa funciona de modo reversible, como ATP-sintasa y como ATP-hidrolasa. La disipación de la fuerza protón motriz supone el funcionamiento como ATP-sintasa, según el siguiente modelo:

F0 es un complejo integral de membrana, que trasloca los protones. Está compuesto de {a, b2, c12}. La subunidad a es la encargada de canalizar los protones a través de la membrana, mientras que las dos subunidades b sobresalen hacia el lado citoplásmico, interaccionando con la F1. Las 12 subunidades de c se disponen formando una especie de cilindro transmembranoso, capaz de rotar en ambos sentidos.F1 constituye la porción intracitoplasmática, dotada de los sitios catalíticos. Su composición se puede expresar como {3, 3, , , ). La parte más saliente de F1 consta de 3 subunidades alternando con 3 subunidades .Al parecer, la traslocación de unos 3 o 4 protones a través de F0 está acoplada, por medio de grandes cambios conformacionales, a la síntesis de una molécula de ATP en las subunidades de la F1, por un notable mecanismo de catálisis rotacional:

El que los 3-4 protones entren por F0 (probablemente a través de la proteína a) provoca la rotación del cilindro de c12, lo que supone una torsión que se transmite a la F1 a través de las proteínas . lo que a su vez provoca un cambio conformacional en las subunidades .

El cambio conformacional en las subunidades permite que a ellas se una ADP y Pi. El trabajo realizado por el sistema se usa para producir entonces el ATP, volviendo las a su configuración original, preparadas para un nuevo ciclo de síntesis de ATP.La función de b2 es equivalente a la del estator del motor: sirven para evitar que las y se muevan cuando se produce la torsión de .

 

 ATP-sintasa de E. coli, el más pequeño motor rotatorio del mundo vivo

Las ATP-sintasas son los motores rotatorios más pequeños del mundo vivo (más pequeños que el motor del flagelo bacteriano). Las ATP-asas de membrana pueden funcionar también en sentido inverso al de síntesis, es decir, como ATP-hidrolasas: se produce hidrólisis de ATP y extrusión de protones al exterior. Por lo tanto, en este sentido de funcionamiento, se genera un gradiente de protones a expensas de gasto de ATP intracelular. Esto muestra una vez más que el ATP y el gradiente de protones se pueden considerar como formas diferentes e interconvertibles de energía celular.

Las ATP-asas productoras de gradientes de protones existen en bacterias no respiratorias, que carecen de c.t.e., como por ejemplo, las bacterias anaerobias del ácido láctico. Estas bacterias obtienen su ATP por fosforilación a nivel de sustrato, en sus procesos de fermentación. Pero al igual que otras bacterias, necesitan realizar procesos de transporte activo ligado a simporte de protones y pueden moverse por flagelos, por lo que necesitan también crear un gradiente de protones para estos fines. En estas bacterias las ATPasas funcionan siempre como ATP-hidrolasas, conviertiendo parte del ATP obtenido por fermentación en una fuerza protón-motriz que se usa para transporte de nutrientes y para alimentar al motor flagelar.

2.2.3        DIVERSIDAD DE LAS RESPIRACIONES

2.2.3.1    SEGÚN LOS TIPOS DE DONADORES DE ELECTRONES

2.2.3.1.1    QUIMIORGANOTROFÍA

            Los organismos que “respiran” una fuente orgánica de electrones se denominan quimiorganotrofos. En ellos, la oxidación de la fuente orgánica de carbono no solo sirve como donante de electrones para la fosforilación oxidativa, sino que también sirve para generar intermediarios metabólicos que serán usados para las reacciones biosintéticas. Por ejemplo, tanto la ruta glucolítica como el ciclo del ácido cítrico producen intermediarios (como α-cetoglutarato y oxalacetato en el ciclo de Krebs) que, llegado el caso son “retirados” del ciclo y usados como precursores de biosíntesis. La diversidad de fuentes de carbono orgánico que pueden usar los procariotas organotrofos respiradores es

asombrosa (aludiremos a ello en el capítulo próximo, cuando tratemos el carbono como nutriente).

2.2.3.1.2    QUIMIOLITOTROFÍA

            En los quimiolitotrofos, el donador de electrones es una molécula inorgánica reducida. Esta capacidad de obtener energía por fosforilación oxidativa a partir de donadores inorgánicos de electrones sólo ha evolucionado en ciertos grupos de procariotas. Los quimiolitotrofos se pueden clasificar en grupos fisiológicos según el tipo de donador inorgánico que “respiran”:

Los quimiolitotrofos “típicos”, son por lo general respiradores aerobios, o sea, el aceptor final de electrones es el oxígeno molecular. Son de varios tipos según la clase de donante inorgánico de electrones que oxidan:

bacterias oxidadoras de hidrógeno (oxidan el H2 hasta H2O)bacterias oxidadoras del hierro ferrroso (pasan Fe2+ a férrico, Fe3+)bacterias oxidadoras de azufre reducido: de sulfuros (S2-) y azufre elemental (S0). La oxidación total de este azufre reducido conduce a la producción de ácido sulfúrico (SO4H2) bacterias nitrificantes, con dos subtipos diferentes:

las oxidadoras de amoniaco (llamadas nitrosas, que respiran NH3 para convertirlo en NO2

-)las oxidadoras del nitrito (llamadas nítricas, que respiran NO2

- para convertirlo en NO3

-)Recientemente se ha descubierto un nuevo tipo de quimiolitotrofos, que acoplan en anaerobiosis la oxidación del amoniaco con la reducción de los nitritos, produciendo nitrógeno molecular y agua (NH4

+ + NO2- N2 + 2 H2O). Este proceso ha recibido el

nombre de oxidación anaerobia del amoniaco (anammox en su abreviatura inglesa, que fácilmente podemos traducir como oxanam en abreviatura castellana, desgraciadamente poco usada).

Las bacterias anammox (como Brocadia anammoxidans) son miembros del phylum de los Planctomicetos, un fascinante grupo de eubacterias con paredes proteicas (sin peptidoglucano), y citoplasma dividido en compartimentos mediante membranas especiales. (Recuerda que decíamos en el capítulo 7 que estas bacterias, a diferencia de las demás, pueden llevar el nucleoide rodeado de membranas). El género Brocadia posee un orgánulo rodeado de este tipo especial de membrana, denominado anamoxisoma, donde tiene lugar esta reacción anammox. El descubrimiento de este proceso ha supuesto una revisión de nuestras ideas tradicionales sobre el ciclo del nitrógeno en la naturaleza (antes se pensaba que el amoniaco era estable en anaerobiosis), y puede tener secuelas prácticas en el campo de la protección ambiental, ya que se han diseñado procesos industriales para eliminar anóxicamente el amoniaco y las aminas de las aguas residuales.

            El mecanismo de generación de ATP en quimiolitotrofos es similar al de quimioorganotrofos respiradores: los electrones extraídos del donador exógeno (en este caso inorgánico) pasan a una cadena transportadora de electrones hasta un aceptor final (que suele ser el oxígeno en los litotrofos típicos, y que es nitrito en los anammox), generando una fuerza protón-motriz que se transforma en ATP por ATP-sintasas. 

            Pero a excepción del H2, los demás donadores inorgánicos de electrones tienen un potencial de reducción E0

’ menor que el del NADH, por lo que la oxidación de estos donadores inorgánicos sólo puede generar energía, pero no poder reductor de modo directo. Para obtener poder reductor emplean transporte inverso de electrones: parte del gradiente electroquímico creado durante la respiración se emplea en hacer que electrones viajen por la cadena transportadora de electrones (o una parte de ella) en sentido inverso, para poder reducir el NAD+.

            Obviamente, los quimiolitotrofos, a diferencia de los quimiorganotrofos, no pueden usar el donador de electrones como fuente de carbono. La mayor parte de los quimiolitotrofos recurren a fijar CO2 de la atmósfera, es decir, son también autotrofos. Para reunir estas dos características se usa el nombre de quimiolitoautotrofos. La fijación del carbónico por parte de las eubacterias litoautotrofas “típicas” se realiza por el ciclo de Calvin, y disponen de reservas de RuBisCo (carboxisomas, estudiados en el tema 7). Las bacterias anammox son también autotrofas aunque carecen de ciclo de Calvin, y aún se desconoce el mecanismo de fijación del CO2.

2.2.3.2    SEGÚN LOS TIPOS DE ACEPTORES DE ELECTRONES

2.2.3.2.1    RESPIRACIÓN AEROBIA

            En la respiración aerobia el oxígeno molecular se usa como sumidero de los electrones procedentes de la cadena transportadora, y junto con protones se reduce hasta agua (½ O2 + 2 ee + 2 H+ H2O). Esos protones proceden de la previa disociación del agua (H2O H+ + OH-), por lo que la oxidación del agua deja el lado citoplásmico de la membrana con pH alcalino y cargado negativamente; mientras tanto, como hemos visto, el funcionamiento de la cadena de transporte de electrones deja el lado externo o periplásmico de la membrana cargado positivamente y ácido).

2.2.3.2.2    RESPIRACIONES ANAEROBIAS

Como ya hemos dicho, en algunas bacterias, al final de la c.t.e. puede existir un aceptor diferente del oxígeno (respiración anaerobia). Los aceptores y sus respectivos productos reducidos (A AH2) son:

Aceptor prod. reducido Procariotas (Ejemplos)

NO3- NO2

- N2 Pseudomonas, Bacillus

NO3- NO2

- Enterobacterias

SO42- S0 SH2 Sulfatorreductoras (Desulfovibrio, Desulfotomaculum)

fumarato succinato Enterobacterias

CO2 CH4 Arqueas metanogénicas

Fe3+ Fe2+ Shewanella, Geobacter

  Con estos aceptores se obtiene menos energía que con el oxígeno, porque la pareja O2/H2O es más oxidante que las otras. Algunos de estos procariotas son

respiradores estrictamente anaerobios (caso de las arqueas metanógenas y de las bacterias sulfatorreductoras). Otros pueden alternar entre respiración aerobia y anaerobia, dependiendo de la disponibilidad de los correspondientes aceptores (caso de las bacterias que usan nitratos como aceptores). Y adicionalmente, existen bacterias como las enterobacterias que aparte de tener respiración aerobia y anaerobia (en este caso usando nitratos) pueden usar igualmente metabolismo fermentativo (en anaerobiosis y en ausencia de aceptores de electrones para sus cadenas respiratorias).

El uso de nitratos, sulfatos y CO2 como aceptores finales de electrones (y no como material a incorporar al metabolismo plástico) se denomina metabolismo disimilativo (o desasimilativo). para distinguirlo del asimilativo (nutricional). El producto reducido se excreta al ambiente de la bacteria.

El uso disimilativo de nitrato se llama desnitrificación, y ocurre por medio de una serie de fases donde el N va cambiando su estado de oxidación:

 NO3- NO2

- (nitrito) NO (óxido nítrico) N2O (óx. nitroso) N2 (dinitrógeno)

Los tres últimos son gases y pueden escapar a la atmósfera. Las enzimas que catalizan esta ruta son reprimidas por el oxígeno molecular y se inducen (en ausencia de oxígeno) por el nitrato:

 La reducción disimilativa de nitrato hasta nitrito se lleva a cabo por la nitrato-reductasa disimilatoria, que viene a ejercer un papel semejante al citocromo terminal (citocromo-oxidasa) de muchas cadenas que usan oxígeno molecular como aceptor. Es de localización intramembranosa.En las bacterias Gram-negativas la nitrito-reductasa es de localización periplásmica. Las nitrito-reductasas de Pseudomonas constan de citocromos c+d1. La óxido nítrico-reductasa (que cataliza el paso NO N2O) es un complejo de citocromo b+c integral de membrana.  La óxido nitroso-reductasa (que cataliza el paso N2O N2) es una enzima de localización periplásmica.

Hasta la llegada de las actividades industriales humanas, todo el dinitrógeno (N2) de la atmósfera procedía de estos procesos desnitrificantes.

            El uso disimilatorio del sulfato (es decir, como aceptor de electrones en respiraciones) solamente ha evolucionado en el grupo de las bacterias sulfatorredutoras (ej.: Desulfovibrio, Desulfotomaculum). Para que el sulfato (SO4

2-) pueda recibir los electrones, primero se tiene que “activar” con ATP (mediante la ATP-sulfurilasa), formándose la adenosina-fosfo-sulfato (APS). La parte sulfato de la APS recibe dos primeros electrones y se reduce (por la APS-reductasa) hasta sulfito (SO3

2-), con liberación de AMP. Luego el sulfito es reducido (aceptando otros seis electrones) hasta sulfuro (S2-) mediante la sulfito-reductasa. La mayoría de sulfatorreductoras son quimiorganotrofos, pero algunos pueden usar también H2 como donador de electrones (quimiolitotrofos).

Las arqueas metanogénicas son los únicos seres vivos capaces de obtener energía acoplando la oxidación del hidrógeno molecular con el uso de CO2 como aceptor de electrones (actuando en estas condiciones como quimiolitotrofos):

4H2 + CO2 CH4 + 2H2O

Además, algunas metanógenas no solo son litotrofas, sino que igualmente fijan autotróficamente el carbónico, aunque por rutas especiales diferentes al ciclo de Calvin.

            El hierro férrico (Fe3+) puede ser usado en la naturaleza como aceptor de electrones por parte de ciertas bacterias quimiorganotrofas (Shewanella putrefaciens) y quimiolitotrofas (Geobacter metallireducens es litotrofo facultativo: puede usar como donador de electrones el hidrógeno molecular y compuestos orgánicos sencillos).

Otros aceptores inorgánicos de electrones:

El manganeso mangánico (Mn4+) puede ser reducido por algunas bacterias, como la ya citada Shewanella putrefaciens cuando crecen respirando acetato y otros sustratos orgánicos. El clorato (ClO3

-)El selenato (SeO4

2-) se puede reducir a selenito (SeO32-) y posteriormente a selenio metálico (Se0).

Se ha aprovechado esta reacción para descontaminar aguas que llevaban estos compuestos tóxicos (biorremedio).El arseniato (AsO4

2-) es un compuesto muy tóxico, y puede ser reducido junto con el sulfato por la bacteria sulfatorreductora Desulfotomaculum, formándose un complejo mineral de arsénico y sulfuro (trisulfuro de arsenio, As2S3), que precipita. Este ejemplo de biomineralización se está intentando aprovechar para detoxificar suelos y aguas contaminados.

2.2.3.3    DIVERSIDAD DE CADENAS TRANSPORTADORAS

            El estudiante seguramente conocerá por otras asignaturas la cadena de transporte electrónico de las mitocondrias. Pues bien, en bacterias existe una gran diversidad de tipos de cadenas transportadoras de electrones, si bien en todos los casos aparecen los elementos que citamos más arriba (flavoproteínas, Fe/S-proteínas, quinonas, citocromos). La cadena sigue el orden derivado de la torre de electrones (desde los componentes más electronegativos a los menos electronegativos o más electropositivos) y se da una alternancia entre transportadores de átomos de hidrógeno (protones y electrones) y de sólo electrones (es decir, aparecen bucles translocadores de protones hacia fuera, lo que genera la fuerza protón-motriz).

La c.t.e. de Paracoccus, una bacteria que posee un sistema similar al de las mitocondrias (Fp --> FeS proteína --> quinona -->  cit bc --> cit c -->  cit aa3 --> O2), donde se observan 3 sitios donde termodinámicamente la variación de energía libre es suficiente para apoyar la síntesis de una molécula de ATP en cada uno.

            La cadena transportadora de electrones de Paracoccus cuando usa oxígeno como aceptor final es similar a la de las mitocondrias (Fpà FeS proteína à quinona (coenzima Q) à cit bc1 à cit c à cit aa3 àO2), y en ella se observan tres sitios donde termodinámicamente la variación de energía libre es suficiente para apoyar la síntesis de una molécula de ATP.

            Muchas cadenas respiradoras aerobias muestran ramificaciones alternativas, sobre todo a nivel de los citocromos terminales. El papel principal de estas ramificaciones es lograr flexibilidad en la ruta de transferencia de electrones, de manera que se obtengan rendimientos máximos en ciertos sustratos y condiciones de crecimiento, y para minimizar los efectos nocivos de otros.

P. ej., si E. coli dispone de oxígeno lo usará como aceptor final de electrones, pero dependiendo de su concentración recurrirá a una u otra rama. (A su vez, esto puede estar relacionado con la fase de crecimiento: en la fase exponencial, cuando hay todavía suficiente nivel de O2, se usa una rama, mientras que en fase estacionaria, cuando el nivel de O2 ha bajado, se usa la otra).El mismo E. coli y otras bacterias anaerobias facultativas, en un ambiente sin oxígeno pero con presencia de nitratos puede usar estos aceptores alternativos con las correspondientes variantes en los citocromos terminales.Cuando Azotobacter (fijador aerobio de N2) crece fijando nitrógeno molecular, usa una ramificación que gasta muchísimo oxígeno como aceptor final (aunque el rendimiento en ATP es menor); con ello logra evitar que el oxígeno pase al citoplasma, con lo que protege a la nitrogenasa de la inactivación por oxígeno.

            En los quimiolitotrofos, cuando el donador de electrones es diferente al hidrógeno molecular, la cadena transportadora de electrones funciona en los dos sentidos:

en su sentido “normal”, ya estudiado. Un donador inorgánico de electrones cede electrones, que llegan a la cadena transportadora de electrones, que crea un gradiente de protones, cuya disipación a través de ATP-asa genera ATP; Sin embargo, salvo en caso de usar H2, los donadores exógenos no sirven para generar poder reductor (coenzimas reducidas);pero estas bacterias necesitan equivalentes de reducción (NADPH) para reducir el CO2 (su fuente exclusiva de C) hasta material orgánico celular [CH2O]. Este NADPH lo logran merced a un flujo invertido de electrones a través de la cadena transportadora de electrones, usando para ello como energía parte del potencial de protones (f.p.m.) generado por el flujo normal.

3         CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS FOTOTROFAS: FOTOFOSFORILACIÓN

            La fototrofía es la capacidad de captar energía de la luz. Aunque la capacidad de usar la luz como fuente para generar ATP (fotofosforilación) depende de un mecanismo característico, tiene en común con la fosforilación oxidativa el hecho de que produce también un gradiente electroquímico de protones a ambos lado de una membrana, el cual a su vez alimenta ATP-sintasas. Estrictamente hablando, la fotosíntesis alude a la fotoautotrofía, es decir, la combinación de fototrofía o captación de esa energía lumínica (obtenida en la “fase luminosa”) con su empleo para fijar el CO2 (autotrofía) hasta material celular (“fase oscura”). Haciendo abstracción del tipo de donante de electrones, la ecuación general de la fotosíntesis sería:

energía de la luz (hn)

2 H2A + CO2 ----------------------------------------------------> [CH2O] + H2O + 2 A

 En cianobacterias, algas y plantas verdes, H2A = H2O, como agente reductor. Por lo tanto, al oxidarse se genera O2 (fotosíntesis oxigénica)En bacterias fotosintéticas anoxigénicas H2A puede ser H2, SH2, S2O3

-, etc. Evidentemente, no pueden liberar oxígeno (fotosíntesis anoxigénica).Por otro lado, existen procariotas fototrofos que captan la energía de la luz, pero emplean materia orgánica como fuente de carbono, por lo que se denominan fotoheterotrofos.

            Más de la mitad de la fotosíntesis de nuestro planeta se debe a bacterias fotosintéticas. (NOTA: nosotros nos vamos a ocupar solamente de la fase luminosa de la fotosíntesis, es decir, el proceso por el que la energía de la luz se convierte en ATP).

            En bacterias tenemos, pues, dos modalidades de fotosíntesis en función de que el donador de electrones sea o no el oxígeno: fotosíntesis oxigénica y fotosíntesis anoxigénica. Como veremos, en ambas pueden existir dos versiones de un mecanismo de obtención de energía a partir de la luz visible: fotofosforilación cíclica y acíclica:

 En la fotofosforilación cíclica (FFC) no existe aporte de un agente reductor externo ni de agente oxidante externo.

Su única función es transformar la energía de la luz en un gradiente de protones (f.p.m.), que a su vez puede convertirse en ATP.No se originan equivalentes de reducción (NADPH), y por lo tanto, no hay fijación de CO2.

En cambio, en la fotofosforilación acíclica (FFA) un donador exógeno de electrones (H2A) servirá para que, por acción de la luz, se produzcan equivalentes de reducción (NADPH, o NADH), que a su vez se usarán para la reducción (asimilación) de CO2 hasta materia orgánica. Al igual que en la cíclica, se produce gradiente de protones, convertible en ATP.

3.1        COMPONENTES DEL APARATO FOTOSINTÉTICO

Los componentes funcionales del aparato fotosintético son los siguientes:

 Fotosistemas: catalizan la conversión de la energía de la luz, capturada en moléculas excitadas de clorofila o bacterioclorofila en una forma útil de energía. Están constituidos por complejo antena (con pigmentos captadores de luz) y centro de reacción (con las clorofilas o bacterioclorofilas fotoactivas). Los centros de reacción suelen estar situados dentro de estructuras membranosas: tilacoides de las cianobacterias, cromatóforos (invaginaciones de membrana) de bacterias anoxigénicas purpúreas o la propia membrana citoplásmica (bacterias anoxigénicas verdes y heliobacterias).Cadenas transportadoras de electrones: estas cadenas situadas en membranas están ligadas de forma estrecha al centro de reacción, y crean una fuerza protón-motriz.

            Antes de describir el funcionamiento del aparato fotosintético, describamos brevemente las principales moléculas implicadas:

A) Clorofilas y bacterioclorofilas. Estos tetrapirroles cíclicos quelados con Mg2+ y dotados de largas cadenas de alcohol (como el fitol) pueden formar parte tanto de los pigmentos antena como de los centros de reacción.

Las clorofilas que no participan en el centro de reacción funcionan como parte del sistema de antena, y pueden llegar a unas 300 en cada uno de estos sistemas.Las clorofilas del centro de reacción son mucho menos abundantes que las del complejo antena. Típicamente son 4 moléculas, de las cuales dos están asociadas a proteínas, de modo que en este estado actúan como “trampas” para los cuantos de luz. Como veremos, estas clorofilas especiales, tras excitarse, se oxidan, por lo que se denominan clorofilas fotoactivas. La luz convierte a estas clorofilas desde su estado basal a su estado excitado, en el que tienen un E0

’ negativo, por lo que entonces pueden ceder electrones (oxidarse) fácilmente.

(Enlace a modelo 3-D de clorofila, manejable por usuario. Requiere un programa de tipo Chime o Protein Explorer)

B) Carotenoides. Forman parte del complejo antena. Sus funciones son:

protección contra los efectos potencialmente perjudiciales derivados de la interacción entre la luz y el oxígeno;como pigmentos antena, captadores de luz (aunque menos eficientes que otros).

(Enlace a modelo 3-D manipulable por el usuario de un carotenoide. Requiere un programa de tipo Chime o Protein Explorer)

C) En las cianobacterias, existe, además un conjunto de ficobiliproteínas, organizadas en complejos supramoleculares denominados ficobilisomas , dispuestos en la superficie de los tilacoides. Las principales ficobiliproteínas son ficocianina, ficoeritrina y aloficocianina, y constituyen el complejo antena en las Cianobacterias.

D) Feofitinas y bacteriofeofitinas. Son similares a las respectivas (bacterio)clorofila s, excepto que no están queladas con Mg++. Actúan como aceptores inmediatos del electrón que pierde cada (bacterio)clorofila del centro de reacción.

(Enlace a modelo 3-D de fefitina manejable por usuario. Requiere Chime o Protein Explorer)

E) Otros componentes. En el mismo centro de reacción se encuentran los primeros componentes de la c.t.e. fotosintética: quinonas especiales acomplejadas con Fe (enlace a 3-D de quinona). Por lo demás, las c.t.e. fotosintéticas contienen moléculas de tipos parecidos a las ya estudiadas en las c.t.e. respiratorias: quinonas, citocromos y ferroproteínas no hémicas.

3.2        FUNCIONAMIENTO DE UN FOTOSISTEMA

Para estudiar el funcionamiento, hagámonos una idea de cómo están organizados los principales componentes que acabamos de citar dentro del aparato fotosintético.

Complejo antena: Es un conjunto de pigmentos captadores de luz, en gran número (desde unos 50 hasta miles). Sobre ellos incide la luz solar, de manera que se van transfiriendo la energía de unos a otros, en paquetes (excitones), pero sin oxidarse, en un fenómeno conocido como resonancia inductiva. El complejo antena actúa como un “embudo”, captando energía lumínica, y canalizándola hacia el centro de reacción, donde como veremos enseguida, esta energía podrá ser convertida a una forma útil.

Centro de reacción: Para hacernos una idea concreta de un centro de reacción, mostraremos uno de los mejor estudiados: el de la anoxifotobacteria purpúrea Rhodopseudomonas viridis (el primero en desentrañarse a nivel molecular, en el año 1985, mediante técnicas de difracción de rayos X).

posee 4 bacterioclorofilas, de las cuales dos (denominadas P870) son las fotoquímicamente activas (también llamadas “par especial”), debido a su asociación con las proteínas citadas abajo 2 bacteriofeofitinas2 ubiquinonas y un Fe, que constituyen el complejo Q·Fe.Proteínas del centro de reacción (denominadas L, M y H).Todo el conjunto se encuentra en la bicapa lipídica.Asociado al C.R., un citocromo c2.Modelo 3-D de los pigmentos del centro de reacción. Requiere  Chime o Protein Explorer

Enlace a todo el C.R: mira y maneja a tu voluntad el centro de reacción, resalta las proteínas, o los pigmentos, etc. Requiere  Chime o Protein Explorer

Todos estos componentes del centro de reacción están dispuestos de tal manera que pueden interaccionar rápidamente para transferirse electrones, según veremos a continuación.

Esquema del funcionamiento del fotosistema de la bacteria purpúrea Rhodopseudomonas viridis

Mecanismo de la fotofosforilación: transferencia de electrones en el centro de reacción, generación de fuerza protón-motriz y producción de ATP:

1)      Antes de excitarse, cada bacterioclorofila especial (P870) tiene un E’0 de +0.5 V.

2)      La energía de la luz capturada por los pigmentos antena llega en forma de “excitones” al centro de reacción, de modo que cada bacterioclorofila especial pasa a una forma excitada (bacterioclorofila*, con un E’0 de –1.0 V). Esta forma excitada con bajo potencial de reducción es, pues, un fuerte donador de electrones, de modo que enseguida…

3)      … cada bacterioclorofila* se oxida (pierde un electrón), pasando a bacterioclorofila+. Esta transición es increíblemente rápida, de 3 billonésimas de segundo (3x10-12). El entorno proteico del centro de reacción (en este caso, proteínas L, M y H unidas al par especial de bacterioclorofilas) estabiliza el estado excitado y evita que los electrones “vuelvan atrás”.

4)      El electrón cedido por cada bacterioclorofila pasa a una cada una de las bacteriofeofitinas.

5)      Los dos electrones (uno por feofitina) pasan a una ubiquinona (QA) estrechamente ligada al centro de reacción (la quinona se reduce a quinol: QAH). Observa que se ha originado una separación de cargas, de modo que se ha formado una especie de “agujero” cargado positivamente: las bacterioclorofilas con carga positiva tienen ahora una alta afinidad por electrones.

6)      La bacterioclorofila+ captura un electrón de un citocromo cercano (cit c2, ligado al centro de reacción). Normalmente este citocromo es un donador débil de electrones, pero ahora los cede, debido al intenso “agujero” de carga positiva representado por las bacterioclorofilas+ (oxidadas).

7)      Mientras tanto, el electrón de la QA pasa a una segunda ubiquinona del centro de reacción (QB), que pasa a la forma quinol.

8)      El electrón abandona el centro de reacción y pasa a otra quinona, perteneciente al “pool” de quinonas que se encuentra libre en la bicapa lipídica. Esta quinona, una vez reducida (forma quinol), es un buen reductor (donador de electrones). El electrón pasa

a la cadena transportadora de electrones (citocromos bc1 cit c2). El citocromo c2 es de localización periplásmica, y conecta el bc1 con el centro de reacción. Cuando el citocromo c2 transfiere electrones a la bacterioclorofila oxidada (P870

+), ésta vuelve a su estado inicial, con un E’0 de +0.5 V, quedando el centro de reacción preparado para otro ciclo de excitación por absorción de energía de la luz.

9)      El funcionamiento de esta cadena transportadora de electrones provoca una translocación de protones fuera de la membrana, o sea, un potencial electroquímico de protones o f.p.m., cuya disipación a favor de las ATP-sintasas se traduce en producción de ATP celular (fotofosforilación).

3.3        TIPOS DE FOTOFOSFORILACIÓN

3.3.1        FOTOFOSFORILACIÓN CÍCLICA

            El mecanismo que acabamos de ver ilustra el concepto de fotofosforilación cíclica: la (bacterio)clorofila del centro de reacción (fotosistema I) sirve tanto como donador primario como aceptor final de electrones procedentes de una cadena transportadora de electrones. Es decir, los electrones no salen del ciclo, están “dando vueltas”, y no hay donador exógeno de electrones.

            Ahora bien, si la bacteria es autotrofa, esta fosforilación cíclica no es suficiente, porque no se crea poder reductor, imprescindible para la fijación (reducción) de CO2, hasta material celular [se necesita NAD(P)H, aparte de ATP]. Para formar equivalentes de reducción hace falta que el fotosistema funcione en su modalidad de fotofosforilación cíclica, que pasamos a estudiar.

3.3.2        FOTOFOSFORILACIÓN ACÍCLICA

            En la fotofosforilación acíclica los electrones cedidos por la (bacterio)clorofila excitada no solo sirven para generar f.p.m. y por lo tanto ATP, sino que también se emplean en producir los equivalentes de reducción [NAD(P)H+H+] que hacen falta para la fijación del CO2. Ahora bien, los electrones empleados en generar equivalentes de reducción, por definición ya no pueden servir para reducir la forma oxidada de la (bacterio)clorofila. Por lo tanto, esos electrones deben de proceder de una fuente exógena para poder regenerar la forma basal del pigmento fotoactivo.

3.3.2.1       FOTOFOSFORILACIÓN ACÍCLICA ANOXIGÉNICA

            En la fotofosforilación acíclica anoxigénica el donador exógeno de electrones para generar poder reductor es siempre una molécula diferente del agua. Hay ciertas variantes según el grupo de bacterias que consideremos:

 Las bacterias purpúreas (o rojas) recurren como donantes exógenos de electrones a compuestos reducidos de azufre inorgánico (principalmente SH2, pero también S0, S2O3

2-), al hidrógeno molecular (H2), o incluso (en el caso de las “purpúreas no del

azufre”) a un compuesto orgánico reducido[1]. Estos compuestos ceden electrones a un citocromo de tipo c. Esos electrones siguen un curso inverso al de la cadena normal que hemos visto y pasan al depósito de quinonas de la membrana. Pero el potencial de reducción de la quinona (casi DE0' = 0 V) no es suficientemente negativo como para poder reducir espontáneamente el NAD+. Los electrones son forzados a retroceder contra el gradiente termodinámico: consumen parte del potencial electroquímico (f.p.m.) producido por la previa excitación del fotosistema para generar los equivalentes de reducción (NADH+H+). Esto es un caso de transporte inverso de electrones. Esta fosforilación acíclica es diferente a la de las otras bacterias fototróficas anoxigénicas:

Observa que, a diferencia de lo que vamos a ver enseguida con esas otras bacterias anoxigénicas, el primer aceptor estable de electrones procedentes de la bacterioclorofila (en este caso la quinona) tiene un potencial de reducción (DE0') menos electronegativo que el par NAD+/NADH+H+, por lo que no puede donar electrones para producir equivalentes de reducción. (Por cierto, la fijación del CO2 es por ciclo de Calvin).Observa igualmente que la producción de los equivalentes de reducción no va ligada directamente a la fase luminosa de la fotosíntesis: el donante exógeno no regenera la bacterioclorofila.

Las bacterias verdes del azufre usan también compuestos reducidos de azufre e hidrógeno molecular, pero a diferencia de las purpúreas, esos donantes sirven para regenerar la bacterioclorofila. En otras palabras, la producción de equivalentes de reducción se realiza, al igual que la fotofosforilación, como resultado de la reacción luminosa. En este caso esto se debe a que el primer aceptor estable de electrones procedentes de la bacterioclorofila excitada y oxidada (una Fe/S proteína) es suficientemente electronegativo (DE0' =-0.54 V), y por mediación de una ferredoxina (DE0' = -0.41 V) dona electrones al NAD+  para generar equivalentes de reducción. (Por cierto, la fijación de CO2 es por una ruta única entre los seres vivos, denominada ciclo reductivo de los ácidos tricarboxílicos, una especie de ciclo de Krebs que funciona al revés).Las heliobacterias (bacterias esporulantes fototrofas, descubiertas hace pocos años) al igual que las bacterias verdes, tienen como primer aceptor estable de electrones una Fe/S proteína con potencial redox suficientemente bajo (DE0' = -0.5 V) como para reducir NAD+. Por lo tanto, su poder reductor deriva igualmente de la reacción luminosa. La regeneración de la bacterioclorofila oxidada es mediante un aceptor exógeno orgánico (son fotoheterotrofos, y parece que no son capaces de fijar CO2).

3.3.2.2       FOTOFOSFORILACIÓN ACÍCLICA OXIGÉNICA EN CIANOBACTERIAS

            Las cianobacterias, al igual que las plantas y algas, usan H2O como donador exógeno de electrones, que sirven tanto para la obtención de energía como para la de poder reductor; la fotofosforilación acíclica oxigénica es más compleja que la anoxigénica, ya que el H2O requiere un elevado potencial de reducción para poder extraerle los electrones, y el FSI no es un oxidante suficientemente fuerte como para captar electrones directamente del agua.

            La manera de resolver este problema es acoplar un fotosistema adicional (FSII), dotado de un E0' más alto que el FSI, y que funciona en paralelo con éste, siguiendo el llamado “esquema en Z” (por la forma de Z “tumbada” que tiene su representación gráfica):

El FSI se activa por la luz de longitud de onda larga (cerca del infrarrojo) y se oxida, de modo que los electrones pasan por una quinona, de ahí a una Fe/S proteína, y terminan en una ferredoxina, que a su vez los cede al NADP+, para generar poder reductor (NADPH + H+)Ahora bien, como hemos dicho, el FSI+ no puede regenerarse directamente por el agua, sino que recibe los electrones desde el FSII, a través de una c.t.e. (por supuesto, con creación de Dp y por lo tanto, ATP).Esta c.t.e. consta de la serie de transportadores siguiente

PQ (plastoquinona) citocromo b·f PC (plastocianina). Como se puede inferir, esos electrones proceden de la anterior excitación y oxidación del FS-II.

El FSII se excita por la luz roja y ,como acabamos de decir, envía los electrones al FSI vía c.t.e.). Este FSII+ sí puede regenerarse extrayendo los electrones directamente del H2O, desprendiéndose O2 (merced a un complejo enzimático que contiene Mn, llamado complejo lítico del agua o “reloj oxidante del agua”).

Esquema en "Z" de la fosforilación acíclica en una cianobacteria

En resumen, el FSI+ actúa como un aceptor final de electrones procedentes del FSII. A su vez, el FSII+ (oxidado) se reduce directamente por el agua.

4          CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN HALOBACTERIUM(NOTA: esta sección del tema no será impartida durante las clases en este tema, y se hará referencia a ella en la parte de Taxonomía)

Algunas arqueas halófilas (p. ej., Halobacterium) presentan una capacidad de síntesis de ATP mediada por la luz, pero sin implicación de clorofilas ni fijación de CO2. Cuando estas bacterias se encuentran en condiciones de baja aireación (bajas tensiones de O2), sintetizan una cromoproteína especial llamada bacteriorrodopsina, que forma “parches” de color púrpura en sus membranas citoplásmicas.

La bacteriorrodopsina consta de:

porción proteica: bacteriopsina, que forma 7 hélices atravesando la membrana;

grupo cromóforo: retinal (el mismo de la rodopsina retiniana de los vertebrados).El retinal es un carotenoide C20 que puede absorber la luz y catalizar la transferencia de protones a través de la membrana. Se encuentra unido como una base de Schiff a una determinada lisina de la bacteriopsina.

Veamos el mecanismo de captación de energía de la luz por parte del retinal de la bacteriorrodopsina (figura).

El retinal, como base de Schiff (con una carga positiva), tiene en principio la configuración 13-cis. Esta forma del retinal absorbe un cuanto de luz de l=565 nm, de lo que resulta un bombeo de un protón fuera de la membrana. Para regenerar la base de Schiff, la forma neutra anterior pasa conformación todo-trans, capta un protón y pasa a la forma protonada 13-cis.

El funcionamiento del sistema crea, pues, un gradiente de protones, cuya disipación a favor de ATP-asas de membrana es convertido a ATP. Obsérvese que funciona como una bomba de protones, que saca H+ al exterior.

5          EL OXÍGENO Y EL METABOLISMO PROCARIÓTICO

5.1        REACCIONES MEDIADAS POR FLAVOPROTEÍNAS

  Aparte de las bacterias que usan O2 como aceptor terminal de electrones de sus c.t.e. respiratorias, todos los procariotas presentan algunos enzimas que pueden reaccionar directamente con este oxígeno. De estos enzimas, los más típicos son las flavoproteínas, que se pueden autooxidar en presencia de O2, dando inevitablemente peróxido de hidrógeno (H2O2), que es un compuesto muy tóxico; también se pueden generar pequeñas cantidades de otro producto tóxico, el radical superóxido (O2

-). Por lo tanto, no es de extrañar que en bacterias haya evolucionado un arsenal de enzimas para detoxificar estas sustancias:

Protección respecto de los peróxidos: En muchas bacterias aerobias existe el enzima catalasa:

catalasa

H2O2 ----------------------------------------------------> H2O + ½ O2

Algunos anaerobios aerotolerantes producen peroxidasa, capaz de eliminar cualquier peróxido, incluyendo el de hidrógeno. Las peroxidasas catalizan la oxigenación de compuestos orgánicos por el peróxido de hidrógeno, que pasa a agua:

peroxidasa

H2O2 + NADH + H+ ---------------------------> 2 H2O + NAD+

Protección respecto del superóxido: El radical superóxido se produce por:

acción de oxidasas;autooxidación de quinonas, ferredoxinas y flavoproteínas.

Este radical es muy tóxico, de modo que todas las bacterias aerobias y anaerobias aerotolerantes presentan el enzima superóxido dismutasa (SOD), que cataliza la conversión del superóxido en oxígeno molecular y agua oxigenada, que a su vez se destruye por los mecanismos que acabamos de ver:

SOD

2 O2· - + 2 H+ --------------------> O2 + H2O2

            En algunos anaerobios estrictos (como ciertas arqueas) se ha descubierto hace poco un nuevo mecanismo de protección frente al superóxido, dependiente de una superóxido-reductasa (SOR), que cataliza la reducción del superóxido con protones y citocromo reducido.

5.2        RELACIONES DE LOS PROCARIOTAS CON EL OXÍGENO

Dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de peróxidos y superóxidos, que acabamos de estudiar. Veamos los tipos de procariotas según sus relaciones con el oxígeno:

Aerobios: Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas ocasiones) como aceptor final de electrones para la captación de energía química. Como el oxígeno tiene poca solubilidad en el agua, cuando queremos cultivar un aerobio en medios líquidos, hay que forzar la aireación, bien sea por agitación de los matraces o tubos de ensayo, o insuflando aire u oxígeno estériles.

Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica (del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%). A estas bacterias se las califica como microaerófilas.

Algunos microaerófilos lo son permanentemente (microaerófilos estrictos).Otros se comportan como microaerófilos sólo cuando crecen usando determinadas fuentes de energía química o de nitrógeno (microaerófilos condicionales).

Anaerobios: Son aquellos que pueden crecer en ausencia de oxígeno, debido a que pueden usar aceptores finales distintos del oxígeno, o porque poseen metabolismo estrictamente fermentativo.

Anaerobios estrictos: El oxígeno les resulta tóxico ya que carecen de catalasa, peroxidasa y SOD, y por lo tanto, no pueden eliminar los productos nocivos resultantes del oxígeno. (Por ejemplo, las especies de Clostridium, y las arqueas metanogénicas).Anaerobios aerotolerantes (= aerodúricos): Al igual que los anteriores, presentan un metabolismo energético anaerobio, pero soportan el oxígeno debido a que poseen enzimas detoxificadores. Ejemplos típicos son las bacterias del ácido láctico, como Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). También se les llama anaerobios indiferentes.Anaerobios facultativos: Pueden realizar metabolismo energético aerobio o anaerobio, dependiendo del ambiente y la disponibilidad de aceptores finales de electrones. Ejemplos son las enterobacterias como E. coli.

            Para cultivar los anaerobios hay que evitar el oxígeno. Los anaerobios que no sean demasiado sensibles al oxígeno se pueden cultivar fácilmente llenando los tubos con el medio hasta arriba y cerrándolos con tapón hermético. También se puede añadir al medio un agente reductor (como el tioglicolato) que reaccione con el oxígeno, reduciéndolo a agua. Los anaerobios más estrictos se suelen cultivar en las llamadas “jarras de anaerobios”, unos contenedores con cierre hermético, en cuyo interior se colocan las placas de Petri o tubos inoculados, junto con un reactivo y catalizadores químicos, que reemplazan el aire por una mezcla de H2 y CO2 u otros gases inertes.

Capítulo 5 Nutrición

 

5.4-5.13

5.14 – no fue discutida pero resume el material discutido

Figura 5.24

 

Capítulo 17 Diversidad Metabólica

 

17.1-17.11

17.12 hasta la pagina 574 (Anamox NO)

17.13-17.14   Use el material discutido en clase como guía al leer esta sección.

17.19

 

Capítulo 12 Diversidad de procariotes

 

Sección 12.19 Figura 12.53 y Texto asociado

Sección 12.20 Figura 12.58 y Texto asociado

NOTA

Este enlace es un resumen de la mayoria del material discutido en español.  La

seccion 5 no corresponde.

ÍNDICE:

1 CONCEPTOS BASICOS

2 CLASES DE NUTRIENTES

2.1 NUTRIENTES UNIVERSALES

2.1.1 EL AGUA

2.1.2 EL CO 2

2.1.3 FÓSFORO

2.1.4 SALES MINERALES

2.2 NUTRIENTES PARTICULARES

2.3 NITRÓGENO Y AZUFRE

2.3.1 FIJACIÓN DE NITRÓGENO

2.4 FACTORES DE CRECIMIENTO

3 MEDIOS DE CULTIVO

1        CONCEPTOS BASICOS  La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se requieren para dos objetivos:

fines energéticos (reacciones de mantenimiento);fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo).

Las biosíntesis de nuevos componentes celulares son procesos que requieren energía procedente del medio ambiente. En el capítulo anterior vimos los principales modos de captación y obtención de energía existentes en las bacterias.

Es importante tener claro desde el principio una serie de conceptos y nomenclaturas relacionados con los principales tipos de nutrición bacteriana. Puesto que, como acabamos de ver, la nutrición presenta un aspecto de aprovisionamiento de energía y otro de suministro de materiales para la síntesis celular, podemos hablar de dos “clasificaciones” de tipos de nutrición:

1)      Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de energía, las bacterias se pueden dividir en:

a)      litotrofas: son aquellas que sólo requieren sustancias inorgánicas sencillas (SH2 S0, NH3, NO2

-, Fe, etc.).

b)      organotrofas: requieren compuestos orgánicos (hidratos de carbono, hidrocarburos, lípidos, proteínas, alcoholes...).

2)      Desde el punto de vista biosintético (o sea, para sus necesidades plásticas o de crecimiento), las bacterias se pueden dividir en:

a)      autotrofas: crecen sintetizando sus materiales a partir de sustancias inorgánicas sencillas. Ahora bien, habitualmente el concepto de autotrofía se limita a la capacidad de utilizar una fuente inorgánica de carbono, a saber, el CO2.

b)      heterotrofas: su fuente de carbono es orgánica (si bien otros elementos distintos del C pueden ser captados en forma inorgánica).

Otros conceptos:

autotrofas estrictas son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia orgánica como fuente de carbono.Mixotrofas son aquellas bacterias con metabolismo energético litotrofo (obtienen energía de compuestos inorgánicos), pero requieren sustancias orgánicas como nutrientes para su metabolismo biosintético.

Sean autotrofas o heterotrofas, todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos químicos, que se pueden clasificar (según las cantidades en que son requeridos) como

macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg), ymicronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo...)(1[1])

En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte de sustancias orgánicas o inorgánicas. Algunos de los nutrientes serán incorporados para construir macromoléculas y estructuras celulares; otros solo sirven para la producción de energía, y no se incorporan directamente como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles.

El mundo bacteriano, como conjunto, exhibe una gigantesca versatilidad metabólica de uso de nutrientes: desde autotrofos que obtienen su carbono por reducción del CO2 y los demás elementos a partir de fuentes igualmente inorgánicas, hasta heterotrofos capaces de usar amplia gama de fuentes orgánicas de carbono.

A su vez, dentro de los heterotrofos, podemos encontrar muchos y variados tipos de nutrición, desde bacterias metilotrofas que sólo usan metano o metanol como fuente de carbono y energía, hasta los muy versátiles Pseudomonas, que pueden recurrir a degradar más de 100 tipos de fuentes de C (incluyendo entre ellas sustancias tan “exóticas” como hidrocarburos alifáticos y cíclicos). De cualquier modo, entre los heterotrofos, una de las fuentes más típicas de carbono consiste en glucosa.

En los heterotrofos-organotrofos, los sustratos carbonados (con un nivel de oxidación no muy distinto del material celular -CH2O-) entran simultáneamente a:

1    ?[1] .- Quizá llame la atención del lector no ver citado aquí el Na. De hecho, el Na no es un requerimiento universal en las bacterias; sólo lo necesitan ciertos procariotas marinos, de lagunas saladas, cianobacterias y anoxifotobacterias.

metabolismo energético (donde la fuente de C se transforma en CO2, o en CO2 junto con otras sustancias no totalmente oxidadas);metabolismo plástico (anabolismo = biosíntesis de nuevo material celular).

Aunque dentro del mundo de los procariotas se encuentre tanta variedad de nutriciones, las bacterias que pueden nutrirse solamente de sustancias inorgánicas sencillas (H2O, CO2, N2, NO3

--, NH3, SO4=, fosfatos, etc.) son minoría, pero sus procesos

metabólicos son muy interesantes. De hecho, existen tipos metabólicos que sólo han evolucionado en procariotas. Como paradigma de esto citaremos los microorganismos quimioautotrofos (o quimiolitoautotrofos): obtienen su energía de la oxidación de sustancias inorgánicas sencillas, el carbono procede del CO2, y el resto de elementos a partir de sales inorgánicas, por lo que pueden vivir en soluciones de sales minerales en ausencia de luz.

  Lo habitual, sin embargo, es que muchas bacterias recurran, siempre que puedan, a tomar del medio ciertos compuestos más complejos, ya que carecen de ciertas rutas biosintéticas.

2          CLASES DE NUTRIENTESPodemos clasificar los nutrientes en las siguientes categorías:

Universales (es decir, aquellos que son requeridos por todos los procariotas): agua, CO2, fosfatos y sales minerales;Particulares;Factores de crecimiento.

2.1        NUTRIENTES UNIVERSALES

2.1.1        EL AGUA

Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se pueden considerar como organismos acuáticos. Requieren cierto grado de humedad para crecer. Desde el punto de vista de sus posibles papeles, el agua es:

el principal constituyente del protoplasto bacteriano;el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas;un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones bioquímicas).

Las fuentes de agua pueden ser:

endógena: procedente de procesos de oxido-reducción;exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las membranas.

Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria:

Existen determinadas sustancias que absorben y superficies que adsorben de modo más o menos intenso moléculas de agua, dejándolas inasequibles para la bacteria.Los solutos disueltos en agua (p. ej., sales, azúcares) tienen afinidad por las moléculas de H2O que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del microorganismo.

La disponibilidad de agua se mide por un parámetro llamado actividad de agua o potencial de agua, indicativo del agua libre, y que se expresa como

aW= PS/PW

donde PS es la presión parcial de vapor de agua en la solución problema y PW es la presión parcial de vapor del agua destilada.

¿Cómo medir el potencial de agua de un medio líquido determinado? Se mide la humedad relativa del aire que hay encima del medio (en frascos), y este valor se refiere al valor de 100, que es la humedad del aire encima del agua destilada. O sea, la aW = humedad relativa/100).

Las bacterias tienen valores de aW normalmente entre 0.90 y 0.99.

Bacterias de hábitats oligotróficos (como Caulobacter, Spirillum) tienen aW cercanos a 1.Bacterias como Escherichia y Streptococcus, que viven en sangre y fluidos corporales, tienen aW de alrededor de 0.995.Bacterias marinas como ciertos Vibrio y Pseudomonas encuentran valores de 0.980.Ciertos bacilos Gram-positivos que resisten mejor la sequedad poseen valores de 0.950.En el extremo de resistencia encontramos ciertas bacterias xerófilas, capaces de vivir a aW muy bajos (en torno a 0.75). Muchas de estas bacterias viven de hecho en medios acuosos, pero donde gran parte del agua no está disponible por las razones arriba citadas:

procariotas halófilos extremos, como la arquea Halobacterium, que habita en lagunas hipersalinas;bacterias (y sobre todo, ciertos microrganismos eucarióticos como levaduras) sacarófilos, que viven en jugos y zumos con altas concentraciones de azúcares.

2.1.2        EL CO2

El anhidrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias:

Las autotrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente de energía la luz (en el caso de las fotoautotrofas) u oxidaciones de determinadas sustancias inorgánicas (los quimioautolitotrofos).

Las arqueas metanogénicas pueden usar el CO2 como aceptor de los electrones procedentes de la oxidación del H2, proceso por el que obtienen su energía de modo litotrofo:

CO2 + 4H2 --> CH4 + 2H2O (DG'0<0)

Además, algunas arqueas no sólo usan CO2 como aceptor de electrones para obtener energía, sino que, además lo usan como fuente de carbono celular (arqueas metanogénicas autotrofas).

Los heterotrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de electrones, necesitan pequeñas cantidades para las carboxilaciones en determinadas rutas anabólicas y catabólicas.

El origen del CO2 puede ser:

endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente orgánica de carbono;exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas.

Normalmente, las bacterias crecen a la concentración de CO2 atmosférico (0.03%), pero algunas bacterias (Neisseria, Brucella), cuando se aislan por primera vez, requieren atmósferas enriquecidas, con 5-10% de CO2. Ello parece deberse a que poseen alguna enzima con baja afinidad hacia el carbónico; sin embargo, tras varios subcultivos, suelen adaptarse a crecer a tensiones normales.

2.1.3        FÓSFORO

Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgánicos o inorgánicos. Las bacterias que pueden usar los fosfatos orgánicos (merced a la posesión de fosfatasas) no dependen absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos. Los fosfatos orgánicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gram-negativas) periplásmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina).

El fósforo se usa principalmente para la síntesis de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos, pero aparece también en coenzimas y en proteínas.

2.1.4        SALES MINERALES

Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl-) y de cationes para la célula. Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K+, Mg++, Ca++, Fe++.

El ión potasio (K+): interviene en la activación de una variedad de enzimas, incluyendo las que participan en la síntesis de proteínas.

En Gram-positivas está asociado con los ácidos teicoicos de la pared.El ión magnesio (Mg++):

estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos;como cofactor en muchas reacciones, especialmente las que implican transferencia de grupos fosfato. Por ejemplo, en las reacciones que requieren ATP, el Mg++ puede unir la enzima al sustrato durante el mecanismo de acción de la primera.Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintéticas.

El ión calcio (Ca++): es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinasas.

El hierro (principalmente como ión ferroso, Fe++) suele estar acomplejado en la naturaleza, formando sales insolubles. Las bacterias disponen de una serie de moléculas, denominadas sideróforos, capaces de captar ese hierro (p.ej., hidroxamatos y enterobactina). El hierro

participa en muchas moléculas implicadas en procesos de respiración, como citocromos y ferroproteínas no hémicas (proteínas con Fe-S);interviene como cofactor en ciertas enzimas.

Aparte de estos iones que se requieren en cantidades relativamente grandes, las bacterias necesitan minúsculas cantidades de otros elementos (oligoelementos), a los que también se denomina como micronutrientes o elementos traza:

El manganeso (Mn++) es un cofactor de ciertas enzimas, y a veces puede sustituir al Mg++.El cobalto (Co++) se requiere casi exclusivamente para la vitamina B12 (de hecho, si suministramos esta vitamina al medio, la bacteria se vuelve independiente del Co++ libre).El zinc interviene en la estabilización de complejos enzimáticos como las ADN- y ARN-polimerasas.El molibdeno participa en las llamadas molibdoflavoproteínas, implicadas en la asimilación de nitratos. Por otro lado, participa como cofactor, junto con el Fe, en el complejo nitrogenasa de las bacterias fijadoras de N2 atmosférico.El níquel participa en hidrogenasas, enzimas que captan o liberan H2.

2.2       NUTRIENTES PARTICULARES

2.3.1            NITRÓGENO Y AZUFRE

  Se trata de elementos que pueden ser cubiertos de modo muy distinto, dependiendo del tipo de bacteria que consideremos. Concretamente, los elementos N y S (que requieren todos los seres vivos) pueden ser captados por las bacterias de modos muy distintos, dependiendo de sus capacidades biosintéticas.

Tanto el N como el S se encuentran en la célula en estado reducido:

el radical -NH2 forma parte de los aminoácidos (que a su vez son los sillares de las

proteínas) y de las bases nitrogenadas (que participan en los ácidos nucleicos y en algunas coenzimas);el radical -SH interviene en determinados aminoácidos y en coenzimas como la CoA.

¿En qué formas químicas entran N y S a las bacterias?

La mayoría de bacterias fotosintéticas y muchas heterotrofas asimilan estos elementos en forma combinada inorgánica oxidada:

como NO3--, merced a la actuación secuencial de nitrato-reductasas y nitrito-

reductasas asimilatorias.como SO4

2-. Este sulfato se activa con ATP, y luego se reduce hasta sulfito y finalmente sulfhídrico, que ya tiene el estado de reducción adecuado para la incorporación del S.

Muchas bacterias heterotrofas pueden usar alguna forma reducida de N inorgánico: amonio (NH4

+)de S inorgánico: sulfuros (S2-, SH-)de N orgánico: aminoácidos, péptidosde S orgánico:cisteína.

Muchas de las bacterias que pueden usar amonio como única fuente de nitrógeno también pueden usar nitratos.

2.3.2        FIJACIÓN DE NITRÓGENO

La atmósfera contiene enormes cantidades de nitrógeno no combinado (libre) en estado gaseoso: el nitrógeno molecular o dinitrógeno (N2), que procede de microorganismos desnitrificantes (véase el capítulo 10). Sin embargo, esta gran reserva sólo puede servir de fuente de nitrógeno a ciertos procariotas, las llamadas bacterias fijadoras de nitrógeno o diazotrofos. Esta notable capacidad bioquímica no ha evolucionado en eucariotas. (Lo más a que ha llegado la evolución es a seleccionar ciertos tipos de asociaciones simbióticas entre procariotas diazotrofos y ciertos eucariotas, como p. ej., la simbiosis entre raíces de leguminosas y bacterias del grupo de Rhizobium).

La fijación del N2 es un proceso de reducción que convierte el nitrógeno molecular en amoniaco, según la siguiente ecuación:

 N2 + 8H+ + 8e + 18 ATP ---------> 2NH3 + H2 + 18 (ADP + Pi)

Esta reacción está catalizada por un complejo enzimático denominado nitrogenasa o dinitrogenasa, que consta de dos componentes:

Componente I o nitrogenasa propiamente dicha; posee un cofactor de hierro y molibdeno (FeMoCo) que forma parte del centro activo. Por ello, a este componente también se le conoce como molibdoferroproteína. (En realidad existen dos copias del cofactor, cuya estequiometría es MoFe7S8-homocitrato)2[2]

Componente II o nitrogenasa-reductasa, que posee átomos de Fe acomplejados con S de determinadas cisteínas (por lo que este componente se denomina a veces ferroproteína).

Mecanismo del complejo dinitrogenasa:

Los electrones para la reducción llegan al complejo por medio de una ferredoxina o una flavodixina (FeS proteínas no hémicas), que los transfiere al componente II, que queda reducido. El componente II reducido se une a dos moléculas de ATP, y cambia su conformación, lo que le permite unirse al componente I. Entonces se produce la transferencia de electrones desde el componente II al componente I, con hidrólisis de ATP, lo que a su vez provoca la separación del componente II respecto del I. Una vez reducido el componente I (la molibdoferroproteína), éste transfiere los electrones (y los protones) al N2, hasta convertirlo en dos moléculas de amoniaco. (El centro activo es FeMoCo). El amoniaco entra entonces en las rutas biosintéticas para convertirlo en N orgánico, incorporable a las macromoléculas.

2[2] Existen ejemplos de nitrogenasas “alternativas” en las que no existe FeMo-co, sino cofactores de hierro y vanadio (FeVa-co) o cofactores con solo sulfuro de hierro. Se supone que estas nitrogenasa funcionan solo mecanismos de apoyo cuando en el medio no hay suficiente molibdeno.

Mecanismo de la nitrogenasa

Dos cosas llaman la atención de la reacción de la nitrogenasa:

Obsérvese que la reacción requiere un gran aporte de energía en forma de al menos 18 ATP (en ocasiones puede llegar a 24 ATP). Ello se debe a que el dinitrógeno (NºN) es una molécula extremadamente inerte (su energía de disociación es de 940 kJ), y su reducción precisa una gran energía de activación para transferirle 6 electrones.Parte de la actividad nitrogenasa (así como ATP y electrones) “se pierden” en reducir dos iones H+ hasta H2. Se desconoce la razón de este “despilfarro”, pero se sabe que es un efecto intrínseco de este complejo enzimático.

Un aspecto muy importante del complejo nitrogenasa es su extrema sensibilidad al oxígeno, de modo que queda rápida e irreversiblemente inactivado por este gas. Ahora bien, esto no significa que la capacidad de diazotrofía esté relegada a bacterias anaerobias, ya que, como veremos en la sección de taxonomía, la evolución ha “inventado” distintas estrategias para proteger a la nitrogenasa en fijadores aerobios:

Eliminando rápidamente el O2 por una intensa respiración (ej: Azotobacter)Produciendo capas mucosas que retardan la entrada del oxígeno a la célula (en Azotobacter, Beijerinkia)En células especiales dotadas de mecanismos protectores, como el heteroquiste de las cianobacterias o los bacteroides de Rhizobium dentro de los nódulos radicales de las leguminosasProtección conformacional: en Azotobacter:  la nitrogenasa se une con proteínas protectoras

Debido a lo “caro” que resulta fijar nitrógeno, no es extraño comprobar que este proceso esté regulado de forma muy estricta ante la presencia en el medio de fuentes combinadas de nitrógeno (nitratos, amonio, aminoácidos):

la actividad nitrogenasa se ve inhibida ante la presencia de N combinado (nitratos, amonio, aminoácidos);ante N combinado, se reprime la transcripción de los genes codificadores de la nitrogenasa y demás funciones relacionadas (genes nif).

La nitrogenasa es una enzima relativamente “inespecífica”, ya que puede reducir otras pequeñas moléculas provistas de triples enlaces, como cianuros (NºC-) y acetileno (HCºCH). La reducción de acetileno a etileno sirve de base al método más usual de medir la actividad nitrogenasa, el llamado ensayo de reducción del acetileno, que se registra mediante aparatos de cromatografía gaseosa.

2.4       FACTORES DE CRECIMIENTO

  Los factores de crecimiento son moléculas orgánicas específicas que, en muy pequeña cantidad, algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen función plástica (no son sillares de macromoléculas) ni sirven como fuente de energía. Suelen ser coenzimas o sus precursores, vitaminas, que determinadas bacterias no pueden fabricar por sí mismas, al carecer de parte o toda una ruta biosintética.

  Ejemplos: las bacterias del género Brucella requieren como factores de crecimiento en sus medios de cultivo la biotina, niacina, tiamina y ácido pantoténico. Haemophilus necesita suplementos de grupos hemo y piridín-nucleótidos.

En la siguiente tabla se muestran algunas de las vitaminas y cofactores requeridos por algunas bacterias:

Factor o vitamina funciones principalesp-aminobenzoico (PABA) precursor del ácido fólicoAcido fólico metabolismo de compuestos C1, transferencia de grupos

metiloBiotina biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO2

Cobalamina (vitamina B12) reducción y transferencia de compuestos C1; síntesis de desoxirribosa

Niacina (ácido nicotínico) precursor del NAD; transferencia de electrones en

reacciones redoxRiboflavina precursor de FAD y FMN  ácido pantoténico precursor de la CoATiamina (vitamina B1) descarboxilaciones; transcetolasas.Complejo B6 (piridoxal, piridoxamina) transformaciones de aminoácidos y cetoácidosGrupo Vitamina K, quinonas transportadores de electrones (ubiquinonas,

menaquinonas, etc.)

3         MEDIOS DE CULTIVO(NOTA: esta parte del tema es para que te sirva de cara a las prácticas de la asignatura, que es el sitio ideal para aprender sobre los medios de cultivo, su fundamento y sus variedades).

El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el laboratorio. Como acabamos de ver, en general, todos los microorganismos tienen parecidos requerimientos de macro- y micronutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que cada nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacterias y otras, así como la cantidad relativa de cada nutriente. Los microbiólogos, en su trabajo cotidiano, están acostumbrados a manejar multitud de “recetas” o fórmulas correspondientes a muchos tipos de medios de cultivo.

Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide en estado de gel) en la que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s). Los medios de cultivo se pueden clasificar, en primera instancia, en tres grandes tipos:

1) Medios complejos o indefinidos: su composición química exacta se desconoce, ya que son el producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos:

 Ejemplos:

Digeridos crudos de extracto de carneDigeridos de extracto de levaduraDigeridos de peptona de carne o de sojaDigeridos de caseína (de la leche).

Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido químicamente. Si lo que pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento bacteriano, este tipo de medios es ideal, ya que su confección es fácil y rápida (basta pesar una cierta cantidad del extracto desecado, suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e incubar la bacteria con la que queramos trabajar). Estos medios contienen fuentes variadas de C y N orgánicos, sales minerales y micronutrientes. Sin embargo, con ellos no podemos tener un control nutricional preciso, ya que desconocemos la composición química y proporción exacta de los distintos nutrientes.

2) Medios sintéticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades concretas de distintas sustancias químicas puras, orgánicas y/o inorgánicas. La composición concreta de un medio sintético dependerá de la bacteria que queramos cultivar: lógicamente, un medio definido para una bacteria con grandes capacidades biosintéticas será más sencillo que el medio definido de otra bacteria con menores posibilidades biosintéticas. En la tabla siguiente se dan las composiciones de sendos medios sintéticos para dos bacterias diferentes.

___________________________________________________________________________

 Medio sintético para Escherichia coli Medio sintético para Leuconostoc mesenteroides

K2HPO4 7.0 g K2HPO4 0.6 g

KH2PO4 2.0 g KH2PO4 0.6 g

(NH4)2SO4 1.0 g NH4Cl 3.0 g

MgSO4 0.1 g MgSO4 0.1 g

CaCl2 0.02 g Glucosa 25 g

Glucosa 10 g acetato sódico 20 g

microelementos:

    (Fe, Co, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo) 2-10 mg cada uno

agua destilada 1000 ml aminoácidos (los 20) 100-200 mg cada uno

purinas (adenina, guanina) 10 mg cada una

pirimidinas (uracilo, xantina), 10 mg cada una

vitaminas: biotina, fólico, nicotínico, piridoxal, piridoxamina, 

piridoxina, riboflavina, tiamina, pantoténico, PABA)...... 0.01-1 mg cada una

elementos traza 2-10 mg cada uno

agua destilada 1000 ml

___________________________________________________________________________

Como se puede deducir de la tabla anterior, Escherichia coli posee muchísimas capacidades biosintéticas, ya que puede crecer en un medio confeccionado exclusivamente a base de glucosa y sales minerales. (Aún más impresionantes son las bacterias autotrofas, que ni siquiera requieren fuente orgánica de carbono, y se “apañan” con medios a base de sales solamente).

En cambio, Leuconostoc, a más de fuente orgánica de C y sales similares a las necesitadas por E. coli, precisa una enorme diversidad de sustancias adicionales, incluyendo todos los aminoácidos proteinogenéticos, las bases nitrogenadas y un buen muestrario de vitaminas.

3) En tercer lugar, podemos fabricar un tipo de medio “mezcla” de los anteriores, denominado medio semisintético: llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinidas.

Cualquiera que sea el tipo de medio, de los tres que acabamos de citar, podemos elaborar dos tipos de “versiones”, según su estado aparente:

medios líquidos (por ejemplo, los dos de la tabla)medios sólidos: derivan de los líquidos simplemente añadiendo a la solución nutritiva un coloide en estado de gel, que solidifica (da consistencia) a esta solución.

En los primeros tiempos de la Bacteriología sólo se conocía como sustancia gelificante incorporable a los medios la gelatina. Sin embargo, presenta muchos inconvenientes, ya que funde a 25oC (por encima de esta temperatura el medio se licúa), y además, muchas bacterias presentan gelatinasas que hidrolizan la gelatina.

El gelificante más usado es el agar-agar, extraído de algas rojas (p. ej. Gelidium), del cual existen versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas en el polisacárido agarosa; son las que se emplean para los medios definidos, con objeto de evitar la introducción de sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las interpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la bacteria). El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los 100oC, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias, que son mesófilas. Un comportamiento notable del agar es que una vez fundido (a 100ºC), no gelifica (solidifica) hasta los 45ºC. En este margen de temperatura hasta el límite de solidificación de 45ºC se dice que el agar está en sobrefusión.

Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautotrofos) se suele recurrir a un gelificante inorgánico, el silicagel o gel de sílice.

Finalmente, introduciremos otra serie de conceptos relativos a medios de cultivo, que al igual que los anteriores, serán tratados con la suficiente amplitud en las sesiones de clases prácticas:

Medios selectivos son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de microorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos sólidos que incorporan ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero

permiten el crecimiento de otras. (P. ej. medios que llevan violeta cristal inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas.

Medios diferenciales son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos de bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del medio. Ese comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de una sustancia indicadora presente en el medio.

Ejemplos:

en el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias producen cambios de color y precipitación de sales cuando producen ácidos por fermentación de ciertas fuentes de carbono.El medio llamado agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela la capacidad (y el tipo) de hemolisis de ciertas bacterias.

Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales.

P. ej., el agar de MacConkey, que el alumno manejará en la segunda tanda de prácticas. Se trata de un medio de color rosado y transparente, que posee, entre otras sustancias, lactosa, peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal.

Este medio es selectivo contra muchas bacterias Gram-positivas debido al violeta cristal, y también contraselecciona muchas Gram-negativas debido a las sales biliares (que son agentes tensioactivos que desorganizan muchas membranas externas). En cambio, las Enterobacterias están evolutivamente adaptadas a soportar sales biliares en su hábitat natural (el intestino de vertebrados superiores), y pueden crecer en este medio.

En su faceta de medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de Enterobacterias según que puedan o no fermentar la lactosa, con producción de ácidos. Las bacterias fermentadoras de lactosa (Lac+), excretan al medio gran cantidad de ácidos orgánicos, lo que provoca que sus colonias, y sus alrededores aparezcan de color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro; además, se forma un halo turbio a cierta distancia de estas colonias, fenómeno ocasionado por la precipitación de las sales biliares inducida por la acidez. En cambio, las bacterias Lac-, al no poder usar la lactosa, recurren como fuente de C a las peptonas, a las que desaminan: incorporan el esqueleto carbonado, excretando iones NH4

+, que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el indicador rojo neutro vira a amarillo.

NOTAS