Zeitsehrift ftir K_rebsforsehung, Bd. 58, S. 607--613 (1952).

Aus dem Institut fiir experimentelle Pathologie der ,,Farbenfabriken Bayer" (Leiter: Prof. Dr. G. D0~AGK).

Experimentelle Untersuchungen fiber die Wirkung yon Actinomycin C (ItBF 386)

bei bSsartigen Geschwiilsten. Von

CH. ]{ACK~IANN.

Mi~ 1 Tex~abbildung.

(Ei~tgegangen am 15. Juni 1952.)

I3ber die tumorhemmende und cytostatisehe Wirkung roll allti- biotischen Naturstoffen ist bisher - - im Gegensatz zu der groBen Be- deutung, welche Antibiotcia fiir die Therapie bakterieller Infektionen gewonnen haben - - wenig bekannt geworden.

C. CI~ESTEI~ STocx, der am Sloan Kettering Insti tut ill New York eine gro3e Zahl yon Pr~paraten untersucht hat, kam 1950 zu der Fest- stellung, da~ die bisher bekannten Antibiotica wenig oder gar keine Wirkung bei experimentellen Tumoren haben. Immerhin zeigte ill seinell Versuehen ein aUS Aspergilluskulturen gewonnenes Material eine Iqemmungswirkung beim Sarkom 180.

HARTWELL, SI~AI~ und AI)AMS isolierten 1943 aus Kulturfiltraten yon Bacillus prodigiosus eine Saccharidfraktion, welche bei intraperi- tonealer Verabreiehung an Tumortiere Blutungen und Nekrosen im Tumorgewebe hervorrief. Die Prfifung einer Reihe weiterer Wirkstoffe darunter Penicillin ulld Aetinomycin ergab keine Wirkung auf den Tumor.

C. CI~STE~ STOCK, K. SeOlVl~A und C. P. RltOAI)S ver6ffentlichten ]947 die Ergebnisse einer Versuehsreihe mit verschiedenen Stoffwechsel- produkten yon Bakterien und Pilzen. Bei in vitro-Versuehen wurde mit versehiedenen Kulturfiltraten eine Hemmung der naehfolgenden Transplantation des Sarkoms 180 und des Passey-Melanoms beob- aeh~et, und zwar mit Filtraten yon mehreren nicht n~her identifizier~en Pilzkulturen, mit Kulturfil traten yon Streptomyces griseus, Actino- myces antibioticus, sowie verschiedenen Penicilliumarten. Penicillin und Streptomycin zeigten keinen Effekt. Die Wirkstoffe Gliotoxin, Citrinin, Clavacin und Podophyllin - - vor allem das le~ztere - - be- wirkten eine Wachstumshemmung. Bei ImpftumoreI1 wurden auch in vivo mit versehiedenen Naturstoffen Hemmungen beobachtet, ferner zeigten die Kulturfiltrate yon Aspergillus fumigatus und Penicillium eine schwache Hemmwirkung gegenfiber M~usesloontantumoren. Die Untersuchungen der amerikanischen Forscher insbesondere die ]3eob- aehtung, dag Bakterientoxine und Polysaccharide aus B. prodigiosus

608 CK. HAe~A~:

Hgmorrbagie und Nekrose im Gesehwulstgewebe hervorrufen, ver- anla•ten eine Reihe weiterer Untersuchungen fiber die Wirkung des Podophyllins 7, s und der Wirkstoffe aus B. prodigiosus-Kulturfiltraten~. Kulturfiltrate yon Aspergillus, Penicillium und yon anderen Pilzarten zeigten die erwghnte Wirkung auf das Tumorgewebe nach fiberein- stimmenden Angaben yon C. Cg. STOCX, K. SUGIU~A und C.P. RHOADS, sowie yon HA~TW~LL, S~EA~ und ADAMS nicht.

B. SOKOLOFS und W . H . EDDY nntersuchten die Wirkung des Aureomyeins auf transplantierte Tumoren und stellten bei Tagesdosen yon 1,6 und 3,2 mg je 100 g KSrpergewieht eine Steigerung des Tumor- wachstums lest. Tagesdosen yon 8 mg ffihrten beim Crocker-t%atten- sarkom in einigen Fallen zum Niehtangehen yon Implantaten. Ein Hemmungseffekt auf gltere Implantate desselben Tumors wurde bei der gleichen Dosierung nicht beobaehtet.

Bis jetzt ist noch keiner der antibiotischen Wirkstoffe zu einer nennenswerten therapeutischen Bedeutung bei neoplastischen Erkran- knngen gelangt.

Eigene Untersuchungen. In dem Zeitraum seit 1949 wurden in unserem Laboratorium mit

etwa 400 Kulturfiltraten und Wirkstoffen yon Pilzen (iiberwiegend yon Actinomyceskulturen) Versuche an experimentellen Tumoren dnrch- geffihrt. Die Prgparate wnrden uns yon den Herren Dr. A. B o g ~ und Dr. H. FRIEDRICH (Physiologisches Laboratorium der Farbenfabriken Bayer, Werk Elberfeld) zur Verffigung gestellt. Da die Art und die Menge der gebildeten Wirkstoffe yon den Wachstumsbedingungen und anderen Faktoren, wie Temperatur, Belfiftung, H-Ionenkonzentration u .a . abh~ngt (WAKs~AN), ist es verst~ndlich, dab die mit den ver- schiedenen Knlturl6sungen erzielten Ergebnisse sehr uneinheitlich sind. Wir beobaehteten in unseren Versuchen bei einem Teil der Kultur- filtrate (etwa einem Drittel) sehwache Effekte auf das Wachstum yon Impftumoren und bei etwa 5% der untersuchten N~hrl6sungen deut- lichere Effekte, wobei es vorl~ufig uner6rtert bleiben soll, wieweit diese Unterschiede in der Wirksamkeit auf einen untersehiedlichen Gehalt an Wirkstoff oder aber auf Unterschiede in der Art der Wirkstoffe zurfiekzuffihren sind. Die nieht geringe Sehwierigkeit, aus den N~hr- ]6sungen die Wirkstoffe Ms l%einsubstanzen in einer f fir biologische Versuche ausreichenden Menge zu gewinnen, verhinderte in vielen Fgllen die klare Entscheidung dieser Frage.

Im l%ahmen dieser Versuchsreihe priiften wir auch verschiedene kristallisierte Antibiotica, darunter das Actiomycin C (Priifungs- bezeiehnung: HBF 386), welches uns von den Herren Dr. BOH~E und Dr. FRIEDI~ICK als Ergebnis ihrer Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr. H. BROCKMA~N (GSttingen) in ausreichenden Mengen zur Ver- ffigung gestellt wurde. Diese Substanz war aus der N~hrlSsung einer

Experimentelle Untersuehungen tiber die Wirkung yon Actinomycin C. 609

Streptomyees-Art (Str. ehrysomMlus) erstmalig im Organiseh-ehemisehen Insti tut der Universit/~t GSttingen yon BROCKMANN und GRUBHOFEn isoliert worden. 1Jber die ehemisehen Eigensehaften haben H. BnOC~:- MANN und N. G~UBROF]~, sowie H. BROCKMANN, N. GI~UBI-IOFER, W. KASS und It. KALBE bereits eingehend berichtet. ])arnach ist dieses Antibioticum dem yon Wa~ZS~AN und It. B. WOODRUFF 1940 beschriebenen Actinomycin A und dem spi~ter noch yon ])ALGLIESH und TO1)D isolierten und als vermutlich identisch mit dem Actinomycin A angegebenen antibiotischen Stoff in seinen physikMischen, chemischen und biologisehen Eigensehaf- ten zwar aul3erordentlieh ahn- lich, aber nieht mit ihnen identiseh.

Unsere Beobaehtungen ~aus] Nr. fiber die dureh toxisehe Dosen / bei Tieren hervorgerufenen 1 pathologisehen Veri~nderun- 2 gen stimmen in gewisser Hin- 3 sieht mit den Angaben yon 4: 5 WAKSMaN, ROBINSON, METZ- 6 GER mid WOODRUFF, SO- 7

8 wie yon It. J. ROBINSON und 9 S. A. WAKS~A~ fiber die dureh 10 Actinomyein hervorgerufenen toxischen Erseheinungen fiber-

Tabelle 1o Milzatrophie bei Miiusen (20 g) nach 3 Taqe wiihrender Behandlunq

mit ]e 10 y intraven68.

Gewicht der Milz (rag)

Kontrollen

§ 199,0 104,0 +

98,0 119,5 141,0 140,5 240,5 135,0

HBF 386

37,0 24,0 39,5 58,0 35,5 28,5 32,5 33,0 21,5 35,5

behandelt

1147,5 • 17,5 345,0 -c 3,14

ein. Die ])osis letalis 50 betr~gt ffir die Maus bei einmaliger intraven6ser Injektion etwa 1 mg je Kilogramm K6rpergewieht. Bei mehrmaliger Ver- abreichung bewirken jedoch schon wesentlich kleinere ])osen ernste Sch~digungen. Als besonders auffallender makroskopischer Befund wird nach Verabreichung h6herer Rosen eine heftige h/i, morrhagische Entzfin- dung der Darmsehleimhaut und sehlieglieh Degeneration und AbstoBung der ])armepithelien be0baehtet. Ein ebenfalls eindrueksvoller und regel- mggig zu beobaehtender Befund ist die hoehgradige Atrophie der Milz.

Bei Versuehen an tierisehen malignen Tumoren zeigte die Substanz eine bemerkenswerte Hemmung des Gesehwulstwachstums. Die unmittelbare Einwirkung auI die Gesehwulstzellen in vitro bewirkte noeh in hohen Verdfinnungen eine Zerst6rung der Transplantierbarkeit.

Versuch 1. Ehrlieh-Ascites-Careinom der Maus .

Steigende Verdfinnungen wurden im Verhi~ltnis 1:9 frisch her- gestellten Tumorzellsusl0ensionen zugesetzt. Die Einwirkungsdauer betrug 3 Std bei einer Temperatur yon 0 ~ C. ])ann wurden 0,3 cm a Zellsuspension intramuskulgr auf SW Inzuehtm/~use verimpft. Die aufgetretenen Tumoren wurden nach Beendigung des Versuchs 20 Tage

6 1 0 CH. HACKI~IANN :

nach der Impfung excidiert und fiir jede Versuchsgruppe wurde das Gesamttumorgewicht ermittelt. Das Ergebnis der Transplantat ion ist der ~bersichtl ichkeit halber so dargestellt, dab die negat iv gebliebenen Tiere der Gruppe zucrst, die vorzeitig eingegangenen Tierc jeweils zuletzt in der geihenfolge aufgefiihrt sind.

Tabelle 2.

Ver d i innung

Kontrollen (KochsalzlSsung) HBF386, 1:2500000 . . . HBF386, 1:5000000 . . . HBF386, 1:10000000 . . HBF386, !:20000000 . .

Ergebnis der Transp lan ta t ion (10 Tiere)

- § 2 4 7 2 4 7 2 4 7 t § 2 4 7

+§ §247 ++++

Gesamt- tumorgewich t

g

4 ,05 1,30 1,30 1,70 1,40

Versuch 2. M~usesarkom S 37.

Wie im vorhergehenden Versuch wurden Verdfinnungen des Pr~parates im Verh~iltnis 1 :9 den Tumorzellsuspensionen zugesetzt. Einwirkungs- dauer 3 Std bci 20 o C. Dann wurden 0,3 cm ~ auf je 10 SW Inzucht- m~iuse intramuskul~r verimpft. (Das Tumorgewicht wurde in diesem Versuch nicht bestimmt.)

Tabelle 3.

Verdf innung

K o n t r o l l e n ( K o c h s a l z l S s u n g ) . . . 1 : 2 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . . 1 : 4 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . . E 1 : 1 0 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . . 1 : 2 0 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . . 1 : 4 0 0 0 000 . . . . . . . . . . . 1 : 8 0 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . .

E rgebn is der T ransp l an t a t i on (10 Tiere)

+ § + + + + + + + + t

( + ) ( + ) § + § + + + + §

§ + § + § § § + + §

Versuch 3. Walker-Carcinom der Ratte.

Wie bei den vorstehenden Versuchen wurden Verdiinnungen des Pri~parates im Verhitltnis 1 :9 der Tumorzellsuspension zugesetzt. Ein- wirkungsdauer 3 Std bei 200 C. Dann wurde 1,0 cm a auf je 5 Rat ten verimpft. Die Tiere jeder Versuchsgruppe wurden 10 Tage nach Imp- lung get6te% die Tumoren excidiert und fiir jede Gruppe gemeinsam gewogen.

Tabelle 4.

Verd i innung �9 Ergeb]~is der(5 Tiere)Transplantati~ Gesamttumorgewichtg

] Kontrollen . . . . . . . ! -- § + -}- -~- 53,0 1:150000 . . . . . . . i -}- -c + 45,0 1 : 1 0 0 0 0 0 . . . . . . . . [ _~_ i 4,0 1:60000 . . . . . . . . ~- -~- 15,0 1 : 4 0 0 0 0 . . . . . . . . t t 0,0 1:20000 . . . . . . . . I -t- + 18,0

Experimentelle Untersuchungen fiber die Wirkung yon Aetinomyein C. 6]:[

Die Beein/lussung des Tumorwachstums im therapeutischen Versuch. Zellsuspensionen des Walker-C~reinoms wurden auf Rat ten yon

90--100g Gewieht subeutan transplantiert. Die verwendeten Tiere waren einem erb~hnlichen, jedoch nieht vollkommen erbreinem Stature entnommen. Gruppen yon je 14 Tieren wurden jeweils in g]eicher Weise behandelt. Die erste Behand!ung erfolgte 24 Std naeh Impfung durch Injektion w~13riger LSsungen des Pri~parates. Eine Versuehsgruppe blieb zur Kontrolle unbehandelt, eine weitere erhie]t Injektionen yon :~,thylurethan. Were1 die grSftten Tumoren ein gewisses Ausmaft erreieht hatten, wurden alle Tiere des Versuehs abgetStet und d~s Gesamttumor- gewicht in jeder Versuchsgruppe, sowie das durehsehnittliehe Tumor- gewicht und die Ver~tnderung des durehsehnittlichen KSrpergewiehts w~hrend der Versuehszeit ermittelt (s. Tabelle 5, Versueh 4--10).

Aus den Versuchen geht hervor, dab d~s Antibioticum I{BF 386 bei der unmittelbaren Einwirkung auf die Tumorzelle noch in aul~er- ordentlieh hohen Verdiinnungen eine derartige Zellseh~digung bewirkt, daft das Angehen der Tumoren vielfaeh verhindert wird. Die Konzen~ra- tionen, welehe zur Erreiehung dieses Effektes erforderlich sind, kSnnen je naeh der Art des Tumors sehr verschieden sein, d .h . die Tumoren sind - - wie nieht ~nders zu erwarten - - nieht in gleieher Weise empfind- lich. Im therapeutisehen Versuch lieft sich ein Effekt beim Walker- Careinom ebenfalls in sehr kleinen Dosen erkennen. Die Wirkung lieg sieh sowohl bei intravenSser wie auch bei orMer und bei subcutaner Applikation feststellen.

Die Wir/cung des Pri~parates HBF 386 au/ den Mitoseablau]. M~use yon 20 g Gewicht erhielten eine einmalige Injektion yon je

2,5 y des Pr~parates in die Schwanzvene. Vier M~use derse]ben Zucht blieben als Kontrollen unbehandelt. Von den behandelten Tieren wurden jeweils 4 in versehiedenen Zeitabst/~nden dureh Naekensehlug und Dekapitieren getStet. Von jedem Tier wurde ein Stiiek aus dem Duodenum in Bovx~scher Flfissigkeit fixiert und in Paruffinsehnitten untersueht. Zur Z/ihlung der Mitosen wurden yon jedem Tier 4 Pr~- parate ausgezghlt, yon jeder Gruppe also ]6, und zwar wurden jeweils 4000--6000 Zellen der LIEBE~:fd~sehen Krypten gez~hlt und dar~uf die Prozentzahlen der Gesamtmitosen, der Metaphasen und der Te]o- phasen berechnet.

Das in den ersten 5 Std naeh der Behandlung zu beobaehtende An- steigen der Mitosenzahl und der Metaphasenzahl wird man wohl in dem Sinne deuten d/irfen, dab die Zellgiftwirkung des Pr~parates den Ab- lauf des bereits im Gang befindliehen Teilungsvorg~ngs verz5gert, so daft eine Anh/iufung yon Mitosen vorget~useht wird. Dann erfolgt ein sehr starker Abfall der Werte his yon der 22. S~d an wieder erneut ein Anstieg einsetzt., wenn die Wirkung der einmaligen Dosis abklingt.

612 Cir. HACKMANN :

Behandlung Dosis je kg Gewicht

Kon~rollen . . . . Ure than

5 X 200 rag i.p. H B F 386

5 x 5 0 7 i.p . . . .

Kongrollen . . . . Ure than

9 X 200 mg s.c. t t B F 386

7 • s.c. . . 8 X 5 0 7 . . . . . 7 X 2 5 y . . . . .

Kontrol len . . . . Ure than

7 • 150 mg s.c. H B F 386

7 • o r a l . . . 5 X 5 0 y s.c . . . .

Tabelle 5. Walker-Carcinom der Ratte .

Ergebnis der Transplantation (14 Tiere)

V~su~4 . + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + +

- + + + + + + + + + + + + t

VersuchS.

+ + + + + + + + + + + t

+ + + §

+

+ + +

~ r s u ~ 6 . . . . . + + + + + + +

+ + + + + + +

. . . . . . + + + + + +

Kontrol len . . . . ] - - + + + + + + + H B F 386 I

9 X l y s.c . . . . 6 X 1 0 F s . c . . . .

Versuch 7. +

]{ontrollen . . . . Ure than

7 • 150mg s.c. t t B F 386

7 X 5 ? s.c . . . . 7X0,1 y s.c. . .

- - - - - - + + + + + + + + + + +

Versuch8. + + + + + + + + +

+ + + +

- - - + + + + + + + + +

Versuch 9. - - - - + + + + + +

+ + + +

+ + +

VersuchlO. - - + + + + + + + +

. . . . + + + + + + + +

Kontrol len . . . . U re than

9 X 150 mg s.c. t t B F 386

9 X 0,05 y s.c.

Kon*rollen . . . . H B F 386

8 X 1 0 0 ? i.v. . . 8 x 1 0 0 y s.r . .

+ + + + t

Tumorgewicht -I

durch- [ gesamt Ischnitt-I

lich ] g g I

38,3

27,5

22,2

82,0

21,0

1,0

27,0

+ + + + t 65,o

+ + + + ~ 38,0

+ 4 - + + t 31,0 + t 0,5

+ + + t t 9,0 + + + + + 6,0

t t t t t 42,0

+ + + t t 1!,o

+ + + t t 19,0 + + + + ~ 12,0

+ + + + +[ 75,0 i

+ + + + + l 30,0

+ + q- + ~ I 37,0

+ + + + t ] 30,0 |

+ + + 5 t ] 8,0 + + + + ? 3,o

2,74

1,96

1,85

7,4

4,2

1,0

3,85

5,9

3,4

3,4 0,5

1 , 8 �9

1,0 0,6

5,6

1,6

2,1 1,7

6,8

3,3

5,3

2,5

0,9 0,4

K6rper- gewicht

4- 8,7

+ 1,3

+ 9,4

+ 37,5

q- 36,6

+ 25,0 4- 36,0 + 37,0

4- 36,5

+ 29,5

+ 19,5 q- 9,6

+ 14,8

q- 16,8 + 12,4

4 t0,9

+ 1,2

+ 15,5 + 6,4

I + 15,4

I + 19,2

q- 18,6

I + 16,5

- - 3,2 + 12,5

Experimentelle Untersuchnngen fiber die Wirkung yon Aetinomycin C. 613

Der Verlauf der Kurve und dab Absinken der Mitosenrate weist auf eine Sehgdigung der ruhenden Zellen und der frfihen Stadien der

Zell teilung hin. In entspreehender Weise wie in den LiEB~RKf2I~xschen K r y p t e n haben wir das starke Abs inken der Mitosenrate naeh HBF- Behandlung auch beim Mgusesarkom S 37 und beim Walker -Ra t ten- eareinom feststellen k6nnen . Wie die in vitro-Versuehe gezeigt haben, wirkt dab Prgpal '~t unmi t t e tba r auf die Tumorzel len und nieht e t ~ auI dem Wege fiber den Stoffwechsel. Es besteht eine sehr auffallende Affinitgt zum lymphat i sehen System, dessen Zellen offenbar ganz besonders auffgllig gegenfiber der Wi rkung zu sein seheinen. Diese ,,spezifische" Beeinflussung der lymphat i schen Zellen k6nnte m 6g- 2, q l

lieherweise vonIn te res se bei einer z,2, therapeut i sehenVerwendung sein. a s Es ist eine gewisse ~hn l iehke i t in ~ :,a der Wi rkung mi t Stiekstoff-Lost ~ :'~ zu erkennen, jedoeh ist die st~rke lokale Reizwirkung auf d~s Ge- K :,2

g0 webe hier wesentlich weniger aus- gesproehen. ~ ~3

Die bemerkenswer ten Eigen- o,o

sehaften des Pr/~parates u n d die in 0,2 unseren Versuehen zu beobaeh- tenden hoehgradigen Wirkungen auf GesehwulstzeUen gaben uns Veranlassung, eine versuehsweise klinisehe Anwendung in einer den ToM- eitEtsverh~ltnissen l~echnung t ragenden niedrigen Dosierung einzuleiten.

Uber die biBher vortiegenden ktinisehen Erf~hrungen wird yon Her rn Prof. Dr. G. SC~ULTE in der vors tehenden Arbei t (S. 500) berieh~et.

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Anschri/t: Dr. Cm tIAeKr~A~N, (22a) Wuppertal-Elberfeld, Institut Iiir experimentelle Pathologie der Farbenfabriken ,,Bayer".

..p..: . . . . . . . . . . . . . \ # .,

Abb. 1.