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Explicación de TP Nº 3 Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) Química Biológica Patológica. Bioq. Mariana L. Ferramola 2012. Definición de PCR. Es la amplificación enzimática de un fragmento de interés (DNA) localizado entre dos oligonucleótidos (cebadores). - PowerPoint PPT Presentation
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Explicación de TP Nº 3
Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
Química Biológica Patológica
Bioq. Mariana L. Ferramola2012
Definición de PCR
Es la amplificación enzimática de un fragmento de interés (DNA) localizado entre dos oligonucleótidos (cebadores).
Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de interés.
Componentes del sistema de PCR
ADN molde
Oligonucleótidos (cebadores o primers)
Polimerasa termoestable
Solución buffer
dNTPs (dATP; dCTP; dTTP; dGTP)
Máster Mix
Componentes del sistema de PCR: ADN molde
El ADN molde puede ser de cadena sencilla o doble, circular o lineal. En caso de desear amplificar una secuencia de ARN
se debe utilizar primeramente una transcriptasa reversa.
Deben tenerse en cuenta los posibles contaminantes presentes en el ADN molde, que pudieran disminuir la eficiencia de reacción:
Urea SDS Acetato de sodio Agarosa Fenol
La cantidad de ADN molde a utilizar depende de la muestra de partida. Demasiada cantidad de ADN puede inhibir la reacción de PCR.
Componentes del sistema de PCR: ADN molde
Componentes del sistema de PCR: cebadores
Longitud de la región complementaria al ADN molde de entre 18-25pb.
Deben ser específicos. No deben presentar auto-complementariedad. No deben ser complementarios entre ellos. El contenido de G+C debe estar entre el 40-60%. El Tm de los oligos no debe diferir en más de 5ºC. La diferencia entre el Tm de los oligos y del amplicón no
debe superar los 10ºC. Su concentración debe ser de entre 0.1-1μM
(concentraciones excesivas pueden dar lugar a inespeficidad de amplificación).
Componentes del sistema de PCR: polimerasa termoestable
Las ADN polimerasas termoestables presentan las siguientes características:
Polimerizan en dirección 5’→ 3’.Necesitan de un extremo 3’-OH libre para comenzar la polimerización.Incorporan dNTPs por complementariedad en una cadena que sirve de molde.Necesitan la presencia de Mg para funcionar.Son capaces de resistir altas temperaturas por períodos considerables.
Componentes del sistema de PCR: polimerasa termoestable
ADN polimerasa Vida media (95ºC)
A) B) C)
Taq (Thermus aquaticus) 40 + - -
Vent (Thermococcus litoralis) 400 - + -
Pfu (Pyrococcus furiosus) 120 - + -
Tth (Thermus thermophilus) 20 + - +
A) Actividad exonucleasa 5’ → 3’.B) Actividad exonucleasa 3’ → 5’.
C) Actividad de transcriptasa inversa.
Existe una variedad de enzimas con características diferentes, según la finalidad de la PCR a realizar.
Componentes del sistema de PCR: solución buffer y MgCl
Se utiliza un buffer Tris-HCl, de pH 8,4 (tº amb).
La concentración de MgCl influye directamente en la actividad de la polimerasa, y es uno de los parámetros a ajustar:
Si la concentración de Mg2+ es deficiente, ↓ la eficiencia de la enzima.
Si la concentración de Mg2+ es excesiva, ↑ la polimerización inespecífica.
La concentración ideal de MgCl varía entre 0,5-5mM,
dependiendo de:
Conc de ADN molde de partida.
Conc. y longitud de cebadores.
Conc. de dNTPs.Long. del amplicón.
Componentes del sistema de PCR: dNTPs
Generalmente se utilizan concentraciones equimolares de los 4 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en concentraciones que
varían entre 200 – 250 μM de c/u.
Concentraciones mayores a 4mM inhiben la PCR por quelación de Mg2+.
Protocolo típico de una reacción de PCR.
1º) Desnaturalización (94 – 95ºC; 5 min)2º) Desnaturalización (94 – 95ºC; 30 seg – 1 min)3º) Hibridación (tº específica para c/par de cebadores; 30 seg)4º) Elongación (72ºC; 30 seg – 3 min, dependiendo del tamaño del amplicón)5º) Elongación (72ºC, 5 min)
Los pasos 2, 3 y 4 constituyen un
ciclo de PCR y se repiten entre 25-
35 veces.
Etapas de un ciclo de PCR.
94ºC
Tm Primers
72ºC
(min)
Etapas de una PCR: Mezcla inicial
Etapas de un ciclo de PCR: Desnaturalización
Etapas de un ciclo de PCR: Hibridación
Etapas de un ciclo de PCR: Elongación
Reacción de PCR: esquema de amplificación exponencial
Pérdida de eficiencia de PCR
Factores que llevan a la pérdida de eficiencia de PCR
luego de varios ciclos:
Disminución de actividad de la polimerasa.
Disminución de la disponibilidad de dNTPs y
cebadores.Disminución de la
disponibilidad de Mg2+, para el funcionamiento de la
enzima.
[AD
N]
Nº de ciclo
Fase lag
Fase exponencial
Fase de meseta
Tipos de PCR.
• PCR-semicuantitativa• PCR-cuantitativa (PCR-en tiempo
real)• RT-PCR
• PCR-multiplex.• PCR-anidada.
• PCR-aleloespecífica.• PCR-mutagénesis dirigida.
PCR cuantitativa: PCR en Tiempo Real
Permite cuantificar el producto obtenido a partir de cada muestra mientras se lleva a cabo la amplificación.
El equipo se compone de un termociclador y un lector de fluorescencia, adosados a un equipo de recolección de datos (ordenador).
Para la cuantificación se establece un valor de corte
(valor umbral) de fluorescencia emitida por las muestras. Una muestra con mayor concentración inicial de ADN blanco necesitará menos ciclos para alcanzar
dicho valor umbral.
RT-PCR Se parte de una muestra de ARN. Se realiza primero una transcripción reversa, para obtener
DNA copia y luego se realiza la reacción de PCR.
PCR multiplex
Permite amplificar distintos blancos a la vez en una muestra. Se utilizan 2, 3 o más pares de cebadores.
PCR anidada Consiste en amplificar un blanco con un par de cebadores, y en
una reacción posterior amplificar una fracción interna del fragmento previamente amplificado.
Aumenta la especificidad de amplificación.
PCR alelo específica
Se diseñan cebadores que hibridan específicamente con el alelo wild type o con el mutado.
Permite la identificación de individuos que presenten dos alelos normales, de portadores de mutación, y de individuos con dos alelos mutados.
Mutagénesis dirigida por PCR
Consiste en introducir una modificación en la secuencia del amplicón obtenido mediante el diseño de un cebador que contenga dicha mutación.