Química Biológica Trabajo Práctico III 1

Trabajo Práctico Nº III:

ENZIMAS: ENSAYO CUALITATIVO

Objetivos:

P Caracterizar la actividad enzimática de la -amilasa salival de forma

cualitativa.

P Determinar las propiedades de esta enzima, analizando la acción que

ejercen distintas concentraciones de la amilasa salival sobre el almidón,

así como la influencia del tiempo y la temperatura sobre la actividad

enzimática.

P Reconocer la función de la enzima en el metabolismo de hidratos de

carbono en animales monogástricos y su utilidad clínica en el diagnóstico

clínico veterinario.

Química Biológica Trabajo Práctico III 2

¿Cómo se mide la actividad de una enzima?

Sustrato/s Producto/s

detectando la aparición del producto

detectando la desaparición del sustrato.

•Técnicas colorimétricas cualitativas

(comparando visualmente el color desarrollado)

•Técnicas cuantitativas

(midiendo la absorbancia de la luz a determinada longitud de onda)

enzima

Química Biológica Trabajo Práctico III 3

Determinar cuáles son las condiciones óptimas para suactividad: tiempo, concentración de enzima, pH, temperatura, concentración de cofactores, inhibición o activación

¿Qué significa ...

Caracterizar la actividad de una enzima ?

-Amilasa

(endoamilasa)

Química Biológica Trabajo Práctico III 4

Características generales de las amilasas

Familia de enzimas hidrolíticas : • -amilasa uniones α-1,4 (endoamilasa)

Isoenzimas: Isoamilasa S de glándulas salivales, Isoamilasa P del páncreas

• -amilasa uniones α-1,4 (exoamilasa), libera unidades de maltosa

• Glucoamilasa uniones α-1,4 (exoamilasa), libera -glucosa

Sustrato/s Producto/senzima

• amilosa (10-20%)

• amilopectina (80-90%)

Almidón Glucosa

Dextrinas

Maltosa

O

CH2OH

HOH

HH

OH

OH

H

H

OH

-glucosidasa

-amilasa-amilasa

Dextrinasa límite

Dextrinasa límite

Química Biológica Trabajo Práctico III 5

Química Biológica Trabajo Práctico II 6

α y β-D-Glucosa:

Química Biológica Trabajo Práctico III 7

DEXTRINA

LÍMITE:

Las dextrinas límite

contienen unidades de

glucosa unidas por enlaces

1-4 y 1-6.

No pueden ser hidrolizadas

por las -amilasas.

Química Biológica Trabajo Práctico III 8

Significancias clínicas

En el caso del hombre y el cerdo, la amilasa se produce principalmente en el páncreas y en cantidad mucho menor en las glándulas salivales. Exceptuando al cerdo, el resto de los animales domésticos, producen únicamente amilasa de origen pancreático.

La detección de niveles aumentados en suero sanguíneopermite sospechar una disfunción del páncreas y/o de la glándula parótida. Sin embargo, como por sí sola no permite hacer una diferenciación, se debe recurrir a exámenes complementarios.

Química Biológica Trabajo Práctico III 9

Amilosa

Amilopectina

enlaces glucosídicos.

enlace -1,6

enlace -1,4

enlace -1,4

+ I2 azul

+ I2 rojo

almidón

Química Biológica Trabajo Práctico III 10

Fundamento del TP

Análisis cualitativo para medir la actividad de la -amilasa

test colorimétricocon Lugol

A través de

presencia de

almidón

revela

desaparición del sustratoSe analiza

El almidón en presencia de una solución de iodo

presenta una coloración azulada.

“efecto acromático”

Química Biológica Trabajo Práctico III 11

Variables que se analizarán sobre la actividad de la

enzima -amilasa salival:

•concentración de enzima [E],

•tiempo de reacción,

•temperatura (T°).

En el TP

Química Biológica Trabajo Práctico III 12

Desarrollo del TP

Recolección de saliva baño de hielo y pH

Experimento 1. Dilución óptima de la concentración de enzima y

tiempo de referencia

a) Obtención de la Enzima: Diluir la saliva en un tubo de ensayo, 1:10

(1 mL saliva + 9 mL agua destilada). Mezclar sin agitar y medir pH.

b) Determinación de la actividad enzimática:

1. Colocar el sustrato en un baño térmico a 37°C durante 2 min.

2. Agregarle 1 mL de la saliva diluida (enzima), tapar con tapón de

goma y mezclar por inversión. Tubo S+E

cuál?

Química Biológica Trabajo Práctico III 13

Tubo Tubos con lugol Test colorimétrico Color azul

Agua dest. Lugol Tubo (S+E) (+, ++, etc.)

1-control 5 ml 3 gotas --- tiempo

2 5 ml 3 gotas 3 gotas 0

3 5 ml 3 gotas 3 gotas 1 min

4 5 ml 3 gotas 3 gotas 2 min

5 5 ml 3 gotas 3 gotas 3 min

6 5 ml 3 gotas 3 gotas 4 min

7 5 ml 3 gotas 3 gotas 5 min

8 5 ml 3 gotas 3 gotas 6 min

9 5 ml 3 gotas 3 gotas 7 min

10 5 ml 3 gotas

Mez

clar

con a

git

. vort

ex

3 gotas 8 min

Mez

clar

con a

git

. vort

ex

No lleva enzimaSe enfrentan

al Lugol

Registrar el tubo en el cual NO se produce color azul (corresponde al tiempo

en que no hay más almidón disponible para la enzima)

“efecto acromático”

sin

Química Biológica Trabajo Práctico III 14

A tiempo 0 agregar 1 mL dilución saliva (enzima), mezclar y cada 60 seg sacar 3 gotas y realizar test colorimétrico

AMILASAS: Hidrólisis del almidón

El almidón en presencia de una solución de iodo (Lugol) presenta unacoloración azulada Se analiza desaparición del sustrato “efectoacromático”.

Ensayo Cualitativo por Desaparición de Sustrato

pag 15

Almidón + Saliva 37 °C + Lugol

Almidón 37 °C + Lugol

“efecto acromático”

Química Biológica Trabajo Práctico III 16

Si el tiempo del efecto acromático está entre 3 y 8 min ok.

Si el tiempo es > 8 min diluir menos la saliva

Si el tiempo es < 3 min diluir más la saliva

Experimento 2. Efecto del pre-tratamiento de la enzima con calor(100°C)

Colocar en un tubo de ensayo 1 mL de la saliva a la diluciónóptima e incubarlo 10 min en un baño de agua a 100°C.

Dejar enfriar a temperatura ambiente.

Medir la actividad enzimática como se detalló anteriormente

- Determinar el tiempo necesario para que se produzca el efecto acromático.

- Comparar con el tiempo de referencia.

Química Biológica Trabajo Práctico III 17

Experimento 3. Efecto de la temperatura sobre la actividadenzimática

- Medir la actividad enzimática como antes, empleando 1 mL de lasaliva a la dilución óptima pero incubando a temperaturas

- a) 0°C (baño de agua y hielo) ,

- b) temperatura ambiente,

- c) 70°C.

- Determinar en cada caso el tiempo necesario para que se produzca el efecto

acromático.

- Comparar con el tiempo de referencia.

Sustrato: almidón 1 %

Baño a 0 °C

Sustrato: almidón 1 %

a T° amb

Sustrato: almidón 1 %

Baño a 70°C

Química Biológica Trabajo Práctico III 18

FIN DEL TP III!!!

REALIZAR INFORME Y

RESPONDER PREGUNTAS DE

AUTOEVALUACIÓN!!!