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EXPLORATION DU METABOLISME CELLULAIRE PAR CYTOMETRIE EN FLUX ET EN IMAGES Amira ZARROUK, 1, 2 Anne VEJUX, 1 Gérard LIZARD 1 1 - Université de Bourgogne/Equipe Bio-peroxIL (EA 7270) / INSERM, Dijon, France 2 - Université de Monastir, Laboratoire de Biochimie- UR ‘Nutrition Humaine et Désordres Métaboliques’, Monastir, Tunisie Université de Bourgogne Vèmes Journées Nationales de Cytométrie en Flux (JNCF-2013) م الوطنية اليا ا خامسةوي المتدفقخلقيس الل لFaculté de Pharmacie de Monastir, TUNISIE : 7-9 Mars 2013 Gérard Lizard, EA7270, Université de Bourgogne / INSERM

EXPLORATION DU METABOLISME CELLULAIRE PAR …bioperoxil.u-bourgogne.fr/images/stories/pdf/CONF/conf1... · 2 - Université de Monastir, Laboratoire de Biochimie- UR Nutrition Humaine

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EXPLORATION DU METABOLISME CELLULAIRE PAR CYTOMETRIE EN FLUX ET EN IMAGES

Amira ZARROUK,1, 2 Anne VEJUX,1 Gérard LIZARD1

1 - Université de Bourgogne/Equipe Bio-peroxIL (EA 7270) / INSERM, Dijon, France

2 - Université de Monastir, Laboratoire de Biochimie- UR ‘Nutrition Humaine et Désordres Métaboliques’, Monastir, Tunisie

Université de Bourgogne

Vèmes Journées Nationales de Cytométrie en Flux (JNCF-2013)

للقيس الخلوي المتدفق خامسةااليام الوطنية ال

Faculté de Pharmacie de Monastir, TUNISIE : 7-9 Mars 2013 Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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Métabolisme cellulaire : aspect biochimique

PubMed

20 février 2012

Metabolism + Cytometry

87 397 citations

• Metabolism + Cytometry + Lipids

7 741 citations

• Metabolism + Cytometry + Cholesterol

731 citations

• Metabolim + Cytometry + Carbohydrates

10 222 citations

• Metabolim + Cytometry +Glucose

1 494 citations

Chemistry is the logic of biological

phenomena – Reginald H Garett

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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Le métabolisme regroupe l'ensemble des activités cellulaires qui se

déroulent de manière ininterrompue pour permettre à la cellule de

remplir des fonctions qui lui sont spécifiques.

C'est un processus complexe et ordonné comprenant plusieurs aspects

étroitement liés (métabolisme énergétique, lipidique, glucidique,

protéique, nucléique, oxydatif) qui fait intervenir des processus de

dégradation (catabolisme) et de synthèse organique (anabolisme).

Le métabolisme cellulaire est un mécanisme adaptatif sujet aux

pressions de l’environnement (syndrome métabolique).

Il existe de nombreuses pathologies (maladies génétiques) liées à des

troubles du métabolisme (diabète de type 1, leucodystrophies

peroxysomales, …).

Métabolisme cellulaire : aspect biochimique

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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Acides gras (C22 ≤ )

Métabolisme Lipidique Hépatique

Glycogène

Glucose (Insuline)

glucagon

Protéines

Acides

aminés

Acétyl-CoA

ABCD1

Acétyl-CoA (Cn-2) + Acétyl-CoA

peroxisome

Catalase

( + RH2)

½ O2 + H2O

R + 2 H2O

Acides gras à très longue chaîne ≥ C22 (alimentation, métabolisme)

CO2

Noyau (AGs, cholestérol,

oxystérols, …)

activation

et

répression

de gènes

D-PBE

D-PBE

PPARs, LXRs,

RXR, PXR…

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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Métabolisme Lipidique Cérébral

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM V. Leoni, C. Caccia : Biochimie 95 (2013) 595-612

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Acyl-CoA

VLCFAs (FAs ≥ C22) Eicosanoïdes Acide dicarboxylique Intermédiaires des acides biliaires (DHCA, THCA)

+ CoA (Acyl-CoA synthase)

O2

H2O2

Catalase

(n-2) Acyl-CoA Acetyl-CoA

COT

Acétyl-Carnitine

Acide phytanique +

CoA (Acyl-CoA synthase)

β-oxydation

α-oxydation

Acide pristanique

C24:6, n-3 +

CoA (Acyl-CoA synthase)

C22:6, n-3 (DHA)

DHAP

DHAPAT

Acyl-DHAP

Alkyl-DHAP

synthase

Alkyl-DHAP

plasmalogènes

Réticulum endoplasmique

Oxydation mitochondriale ou élongation

Acyl-Carnitine

CAT

β-oxydation

Voies métaboliques affectées

dans la maladie d’Alzheimer et

Démences du type Alzheimer

Voies métaboliques

affectées

dans les leucodystrophies

peroxysomales

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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Statut Peroxysomal et Physiopathologie des Leucodystrophies

(X-ALD, P-NALD)

Fonctions

du peroxysome Baes M & Aubourg P

Neuroscientist 2009; 15; 367

C24:0

C26:0

ABCD1

- X-ALD (X-Linked Adrenoleukodystrophy)

fréquente : 1:17 000

déficience en ABCD1

déficience en -oxydation peroxysomale

accumulation d’AGTLCs (C24:0; C26:0)

ACOX1

- P-NALD (Pseudo Neonatal ALD)

très rare

déficience en ACOX1

déficience en -oxydation peroxysomale

accumulation d’AGTLCs & déficience en DHA

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Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

Implication du métabolisme lipidique, peroxysomal et mitochondrial

dans les maladies neurodégénératives

Peroxysome et AGTLCs

* leucodystrophies peroxysomales,

* Incidence de dysfonctions peroxysomales sur

- viabilité cellulaire,

- stress oxydant

- inflammation

- myélinisation

* Vieillissement / démences

Relations peroxysome – mitochondrie

Métabolisme du cholestérol et démences (maladie d’Alzheimer)

Métabolisme du cholestérol et démyélinisation

(leucodystrophies, sclérose en plaque)

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Outils et méthodes de cytométrie

pour l’étude du métabolisme peroxysomal, mitochondrial,

oxydatif et lipidique

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Le peroxysome

• Organite cellulaire souvent rond

(0,1 à 1 µm de diamètre)

• Présent dans les cellules animales et

végétales à l’exception des érythrocytes

• Pas d’ADN

Gérard Lizard, EA7270,

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Charactérisation in situ du peroxysome

Hépatocytes murins

0.5 µm

Oligodendrocytes murins 158N

0.5 µm

Oligodendrocytesmurins 158N: ABCD3

5 µm

- Microscopie électronique à transmission (activité catalase)

- Microscopie confocale (ABCD3, catalase)

12 µm

Cellules neuronales humaines SK-N-BE: catalase

Peroxisome: GFP or RFP–PTS1

- Fluorescent protein–based markers

for peroxisomes

- Cytométrie en flux

•ABCD1

•ABCD3

•Catalase

•ACOX1

•L-PBE

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Université de Bourgogne / INSERM

Caractérisation de la biogénèse et du métabolisme peroxysomal

- Biogénèse peroxysomale

Microscopie électronique à transmission

Immunofluorescence (ABCD3; catalase)

Microscopie confocale

Reconstruction-3D

Analyse d’images (quantification)

PAGE / Western blotting

RT-qPCR

- Activitée peroxysomale

β-oxydation

activitée catalase

activitée ACOX1

taux de DHA

taux de C24:0 et C26:0; rapports: C24:0/C22:0; C26:0/C22:0

taux d’acide phytanic

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Caractérisation in situ de la mitochondrie (MET)

Gérard Lizard, EA7270,

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0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm

0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm

m

m

m

m

m m

m m

m m

m

m

m m

m

m m m

Control Vehicle C22:0 (10 µM) C24:0 (10 µM) C26:0 (10 µM)

Zarrouk A et al. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012:623257. doi: 10.1155/2012/623257

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Topographie mitochondriale et quantification

Control

Vehicle

5 µm

C22:0 – 5 µM

C24:0 – 5 µM

C26:0 – 5 µM

C22:0 – 10 µM C22:0 – 20 µM

C24:0 – 10 µM

C26:0 – 10 µM

C24:0 – 20 µM

C26:0 – 20 µM

C22:0 – 10 µM C24:0 – 10 µM C26:0 – 10 µM

Contrôle

Véhicule

VLCFAs

No

mb

re d

e c

ellu

les

Fluorescence Intensité de fluorescence (MitTracker Red)

Zarrouk A et al. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012:623257. doi: 10.1155/2012/623257

MitoTracker Red

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Potentiel Transmembranaire Mitochondrial (∆Ψm)

Coloration avec DiOC6(3) ou JC1

- DiOC6(3) (40 nM ; permet de détecter les cellules avec des mitochondries

dépolarisées ou hyperpolarisées)

- JC-1 (1 µg/mL ; permet la distinction des cellules vivantes (colorées en rouge)

et mortes ( avec des mitochondries dépolarisées et colorées en vert))

Controle Traité

Cellules

mortes

Cellules

mortes

Cellules

vivantes

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Fluorochromes adaptés à la détection

d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote

Espèces réactives de

l’oxygène et de l’azote Fluorochromes et réactifs

• Peroxyde d’hydrogène ; H2O2

•Radical hydroxyl ; HO·

• Acide hypochlorique ; HOCl

• Oxyde nitreux ; ·NO

• Peroxynitrite ; ONOO–

• Anion superoxyde; O2 ·–

CM-H2DCFDA ; AM-H2DCFDA ; Dihydrocalcéine AM;

Dihydrorhodamine 123 ; Dihydrorhodamine 6G ;

H2DCFDA ; Lucigénine ; Luminol

3'-(p-Aminophényl) fluorescéine) ; 3'-(p-Hydroxyphényl) fluorescéine)

CM-H2DCFDA ; AM-H2DCFDA ; Proxyl fluorescamine ; TEMPO-9-AC

Aminophényl fluorescéine ; Dihydrorhodamine 123 ; Luminol DAF-FM ; DAF-FM diacétate ; 2,3-Diaminonaphthalène ; Luminol

3'-(p-Aminophenyl) fluorescéine) ; 3'-(p-Hydroxyphényl) fluorescéine;

H2DCFDA; CM-H2DCFDA ; AM-H2DCFDA ; Coelenterazine;

Dihydrorhodamine 123 ; Dihydrorhodamine 6G ; Luminol

Coelentérazine ; Dihydroéthidium ; Lucigénine ; Luminol ; MTT;

NBT; Mitosox

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Mesure de la Production d’Anions Superoxydes (O2·– )

Mitochondriaux avec le Mitosox

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H2DCF-DA (2’, 7’dichlorofluorescin diacetate) : H2O2 ; HO· ; ONOO– …

λEx=492-495 nm

λEm=517-527 nm

H2DCF-DA

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Dihydroethidium (DHE) : Anion Superoxyde O2·–

DHE

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Dihydrorhodamine 123 : H2O2 ; HOCl ; ONOO–

HENDERSON LM, CHAPPELL JB Eur J Biochem 1993, 217 (3): 973 - 980

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Détection de l’Oxyde Nitrique (·NO)

par la Diaminofluorescéine (DAF)

DAF-FM

diacétate4-amino-5-méthylamino-2',7'-difluorofluorescéine diacétate

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Interaction Métabolisme Peroxysomale et Métabolisme Oxydatif :

Rôle d’ACOX1

Gérard Lizard, EA7270,

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Effet de C24:0 et C26:0 sur la Production de Radicaux Oxygénés

Production de radicaux oxygénés (C24:0, 24 h)

0

20

40

60

80

100

Contrôle Alpha

cyclo

C24

5 µM

C24

10 µM

C24

20 µM

C24

40 µM

IMF

24 h

48 h H2-DCFDA

Production d’anions superoxydes (C26:0, 24 h)

O2.- (Dihydroéthidine)

0

100

200

300

400

500

Contrôle Alpha

cyclo

5 µM 10 µM 20 µM

% C

on

trô

le

Résultats : Baarine M, Lizard G – Inserm 866, Dijon, France Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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Extinction d’Acox1 par différents siRNAs

AR

Nm

, exp

ress

ion

rel

ativ

e

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Scr β-actine Acox1 1 Acox1 2 Acox1 3

Acox1 silencing

WT Scr SiRNA 1 2 3

Acox1 50 KDa

β actine

β actine

Acox1 21 KDa

Résultats : Kattan Z, Baarine M, Lizard G – Inserm 866, Dijon, France Gérard Lizard, EA7270,

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0

100

200

300

400

500

Contrôle Scramble Solvant C24:0

5 µM

C24:0

10 µM

C24:0

20 µM

C26:0

5 µM

C26:0

10 µM

C26:0

20 µM

Cellules non transfectées

Cellules transfectées Acox1

% C

on

trô

le * * * *

* * * #

#

*

Production d’anions superoxides (Dihydroéthidine)

Conséquence de l’Inactivation d’Acox1

sur la Production d’Anions Superoxides

Résultats : Kattan Z, Baarine M, Lizard G – Inserm 866, Dijon, France Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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0

100

200

300

400

500

Control Scr Vehicle C24:0

5 µM

C24:0

10 µM

C24:0

20 µM

C26:0

5 µM

C26:0

10 µM

C26:0

20 µM

Cellules non transfectées

Cellules transfectées Acox1

% C

on

trô

le

* * * * * * *

#

#

*

Production de H2O2 (Dihydrorhodamine 123)

Effet de l’inactivation d’Acox1 sur la production de H2O2

Résultats : Kattan Z, Baarine M, Lizard G – Inserm 866, Dijon, France Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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Interaction Métabolisme Peroxysomale et Métabolisme Lipidique :

Rôle d’ABCD1

Gérard Lizard, EA7270,

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Colorants Cibles Utilisation Applications

Noir Soudan Gouttelettes

lipidiques

Microscopie en

champs clair,

imagerie

Maladies

métaboliques et

dégénératives

Oil Red O Lipides neutres

Microscopie en

champs clair,

imagerie,

biochimie

Toxicologie,maladi

es métaboliques et

dégénératives

Colorants Dédiés à l’Analyse des Lipides

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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Sondes Cibles Utilisation Applications

Nile Red Lipides polaires et

neutres

Microscopie, cytométrie

en flux, analyse spectrale

Phospholipidose,

stéatose

HCS LipidTOX Lipides neutres et

phospholipides

Microscopie, analyse

spectrale

Phospholipidose,

stéatose

Filipine Cholestérol non estérifié Microscopie, cytométrie

en flux Hypercholestérolémie

BODIPY Lipides neutres Microscopie, cytométrie

en flux

Métabolisme des

lipides, radeaux

lipidiques

Laurdan Phospholipides

Polarisation de

fluorescence,

microscopie confocale

multiphotonique

Fluidité membranaire,

radeaux lipidiques

Mérocyanine 540

Phospholipides

Microscopie, cytométrie

en flux

Externalisation des

phosphatidylsérines

Cis-parinaric acid

Acides gras insaturé

Microscopie,

cytométrie en flux Peroxydation lipidique

DPH Lipides de la membrane

plasmique

Polarisation de

fluorescence Fluidité membranaire

Fluorochromes Dédiés à l’Analyse des Lipides

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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10 µm 10 µm

Fibroblastes humains: sujet normal Fibroblastes humains: patient X-ALD

LipidTOX (Réf H34158; Invitrogen)

*Lipides neutres: fluorescence verte * Lipides polaires: fluorescence rouge

Contrairement au Nile Red, l’extinction de fluorescence est faible

Microscopie confocale possible dans de bonnes conditions

Seguin A, Baarine M, Lizard G – Inserm 866, Dijon, France

LipidTOX : Distinction Lipides Polaires et Lipides Neutres

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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HCS LipidTOX : phospholipidose et stéatose

Diminution des lipides polaires et modifications de la répartition spatiale des

lipides neutres et polaires (Résultats: Baarine M, Seguin A, Kahn E, Lizard G – Inserm 678 et 866, Paris-Dijon)

Fibroblastes humains normaux

Acide gras C24:0

10 µm 10 µm 10 µm 10 µm

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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Oil Red-O : Quantification Intracellulaire des Lipides Neutres

Pham NA et al., J Inherit Metab Dis. 2005;28(6):991-1004

Gouttelettes lipidiques visibles en

vidéomicroscopie: granules sombres de

fort contraste de diamètre 0,3 à 0,6 µm

(flèche) et granules plus petits de faible

contraste (tête de flèche)

Fibroblastes vivants observés en contraste de phase

Mouvement des goutelettes lipidiques :

régions du cytoplasme contenant les

gouttelettes de fort contraste (flèche) avec

un mouvement oscillatoire, et les

gouttelettes de faible contraste (tête de

flèche) qui se déplacent à travers le

cytoplasme

5 µm

5 µm

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

Page 33: EXPLORATION DU METABOLISME CELLULAIRE PAR …bioperoxil.u-bourgogne.fr/images/stories/pdf/CONF/conf1... · 2 - Université de Monastir, Laboratoire de Biochimie- UR Nutrition Humaine

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

Conséquences de l’Inactivation d’Abcd1 et Acox1 sur le Métabolisme Lipidique

Baarine M et al. Neuroscience 213 (2012) : 1-18

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Bodipy. 493/503; Réf D3922; Invitrogen

Résultats: Seguin A, Baarine M, Lizard G - Inserm 866, Dijon, France

Fibroblastes humains: sujet normal Fibroblastes humains: patient X-ALD

5 µm 5 µm

Bodipy : Analyse des Lipides Neutres

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM

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Laurdan : Organisation des Bicouches Lipidiques

Laurdan LAURDAN, which is reported to be excited with the UV light (360 nm) and emits a blue fluorescence

(440 nm) in the ordered lipid phase and a green fluorescence (490 nm) in the disordered lipid phase

* Spectre de fluorescence sensible à la polarité et à la phase dans

laquelle se trouve la bicouche lipidique

* Fortement accroché dans le cœur hydrophobe de la bicouche

avec sa partie fluorescente localisée au niveau des glycérols et des

phospholipides

* Le laurdan est utilisé pour la détection des radeaux lipidiques

Cellules 158N

10 µm

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM Kahn E et al. Cytometry A 2011;79(4):293-305

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Incidence du 7-Cétocholestérol sur la Désorganisation des Radeaux Lipidiques:

Micrsocopie Confocale et Analyse Spectrale

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM Kahn E et al. Cytometry A 2011;79(4):293-305

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- Plusieurs approches de cytométrie (flux, image) permettent d’appréhender

le métabolisme grâce à différents fluorochromes et colorants

- Les méthodes de cytométrie (flux, image) sont appropriées pour aborder

différents aspects du métabolisme cellulaire et en particulier le métabolisme

lipidique

-L’identification des mécanismes moléculaires et des cibles nécessite des

approches complémentaires (chromatographie gazeuse, spectrométrie de

masse, western blotting, …)

CONCLUSIONS

Gérard Lizard, EA7270,

Université de Bourgogne / INSERM