EXPOPAPER-Glutamato Oxidasa

5/26/2018 EXPOPAPER-Glutamato Oxidasa

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L-GLUTAMATO

AMINOACIDO

ADITIVO ALIMENTARIO:SABORIZANTE O

POTENCIADOR DEAROMA

INDUSTRIAALIMENTARIA

NEUROQUIMICA

NEUROTRANSMISOREXCITADOR DEL

SISTEMA NERVIOSOCENTRAL

Cooper and Pritchard, 1994; Zilkha et al.1995;

Valero y Garcia Carmona, 1998


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L-GLUTAMATO

METODOS

CROMATOGRAFIA

-PRE TRATAMIENTO

-VOLUMEN GRANDE DE

MUESTRA

- TIEMPO

ENZIMATICO

Kondrat et al.2002;

Hanko y Rohrer,2004.

GLUTAMATO

DESHIDROGENASA

(GDH)

GLUTAMATO

DESCARBOXILASA

(GDC)

Shi y Stein,1996; Liu et al,

1999; Ling, et al , 2000;

Rodriguez et al. 2004

DESVENTAJA:-POBRE ESPECIFICIDAD DEL SUSTRATO

- REQUERIMIENTO DE COENZIMA NAD+


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L-GLUTAMATOOXIDASA (GLOD)

-ESPECIFICIDADRELATIVAMENTE ALTO

DEL SUSTRATO

-NO REQUIERE DE UNA

COENZIMA ADICIONAL

ENZIMA QUE CATALIZA LA DEAMINACION

OXIDATIVA DEL L-GLUTAMATO EN

PRESENCIA DE AGUA Y OXIGENO CON LA

FORMACION DE A-QUETOGLUTARATO,

AMONIO y PEROXIDO DE HIDROGENO.

EL PEROXIDO DE

HIDROGENO FORMADO

RX CROMOGENICA

DE PEROXIDASA

AMPEROMETRIA

Bohmer et al, 1989; Villartaet al, 1995;Almeida y

Mulchandani, 1993; Chang

et al, 2003

PRINCIPAL COMPONENTE EN LADETERMINACION DE L-GLUTAMATOL-GLUTAMATOOXIDASA (GLOD)

DESVENTAJA:

-AMPLIA ESPECIFICIDAD DE LA

ENZIMA DE ALGUNOS M.O.

-ALTO COSTO


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1. SELECCION DE FUENTES NATURALES DE MICROORGANISMOS

PARA LA PRODUCCION DEL GLUTAMATO OXIDASA

2. INVESTIGACION DE LAS CARACTERISTICAS FISICAS Y

BIOQUIMICAS DEL GLOD DESPUES DE LA PURIFICACION.


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3.1 MATERIALES

AMERSHAME BIOSCIENCES Ltd. (Suecia): SP-Sefarosa Fast Flow, Q-Sefarosa Fast Flow y Superdex 200 HR 10/30

SIGMA-ALDRICH Co (USA): Marcadores de proteinas para la filtracin

en gel y los aminoacidos

3.2 CONDICIONES DE LOS MICROORGANISMOS Y EL CULTIVO

Streptomycessp.18G

AISLADO DE

MUESTRA

DEL SUELO

En Khlong

Luang District.

Thailand


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MEDIO ACIDO HUMICO-VITAMINA AGAR

LOS MICROORGANISMOSCULTIVADOS

EN SALES

INORGANICAS ENMEDIO AGARALMIDON

TENIAN MICELIA

ESPIRAL CONESPORAS

COLONIAS

RESISTENTES

DESPUES DE

LA

FORMACION

DE LAS

ESPORAS

SE

DESARROLLARONEN POLVO

ESTAS CARACTERSTICAS SUGIRIERON QUE ELMICROORGANISMO DE PRODUCCIN GLOD ERAN DELGNERO STREPTOMYCES


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3.3 METODOS DE SELECCION

GLOD que se produce fue seleccionado usando el METODO basado

en H2O2-PEROXIDASA DEPENDIENTE CATALIZADA POR LA REACCION

CROMOGENICA.

Papeles de Filtro

SUMERGE EN LA MEZCLADE REACCIN

MEZCLA DE REACCIN:- 2 U/mL Peroxidasa de rabano (HRP)- 10 moles glutamato monosodico (MSG)- 10 moles 4-aminoantipirina (AAP)- 17.5 moles fenol en 0.1 M de buffer pH 7.4fosfato potasico

ANTES DE COLOCARSESOBRE LAS COLONIAS

AISLADAS.

REACCION SE LLEVOA CABO X 15-30

MIN A T C

AMBIENTE SIN LUZ.

LAS COLONIAS PRODUCTORAS DEGLOD CAMBIARON LOS PAPELES

FILTROS A COLOR ROJOYFUERON RECOLECTADOS.


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Streptom ycessp. 18G crecieron en medio precultivado de salvado de

trigo descrito por Bohmer et al 1989 con algunas modificaciones.

MEDIO:2.0% SALVADO DE TRIGO0.5% NaCl0.5% Glutamato monosodico

CULTIVO CRECIO A37C CON AGITACION

A 200 rpm.

ENSAYO DE GLOD

ACTIVIDAD DELGLOD

Metodo descrito

por Li et al, 1996

MEZCLA DE REACCIN:

- 1.0 moles 4-aminoantipirina (AAP)-17.5 moles fenol-2.5 U Peroxidasa de rabano (HRP)- 10 moles glutamato monosodico (MSG)- Suficiente cantidad de GLOD en 0.1 M de bufferpH 7.4 fosfato potasico en un volumen total de

1.30 mL.

DESPUES PREINCUBACION X 2min a 37 C.

LA REACCION FUE INICIADAPOR LA ADICION DE 10moles MSG a la MEZCLA DEREACCION


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INCUBACION X 30 min a37 C CON LIGERA

AGITACION

MEDICION DE LAABSORBANCIA A 500 nm

UNA UNIDAD DE

ACTIVIDAD DE LAENZIMA

CANTIDAD DE ENZIMAREQUERIDA PARA

PRODUCIR 1 mol deH2O2x min bajo las

condiciones de ensayo.

=


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La protena se determin mediante el

mtodo de Bradford, utilizando comoestndar la seroalbmina bovina (BSA).

Concentracin de la enzima. Se utiliz la tcnica de precipitacin conSulfato de amonio (salting out).

Determinacin de la concentracin de la protena

Purificacin de GLOD

Sulfato de amonio

pulverizado

Enzima refrigerada

Agit a 0C / 1Hr

Enzima con 80%saturacin 10 000 rpm

4C/45min

precipitado

Resuspendi en20 M bufferfosfato depotasio pH6.0

Se dializdurante lanoche con elmismo buffer


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Cromatografa de intercambio catinico

Columna SP sepharose FF 30ml(in sulfopropyl,matriz agarosa6%)

La columna se pre

equilibr con 20Mde buffer fosfato depotasio pH6.0

La enzima se eluycon un gradientesalino de 0 0.3Mde NaCl

1ml/min

Cada fraccin de la

solucin de enzima se

analiz la actividad

GLOD.

Las fracciones fueron

concentradas por

ultracentrifugacin y se

mantuvieron en bao de

hielo para las medidas

adicinales depurificacin.


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Cromatografa de intercambio aninico

Columna Q sepharose Fast flow

30ml (in: grupoamino cuaternario,ternarios osecundario, matrizagarosa reticulada6%)

Las fraccionesconcentradas fueronprimero desaladas.

La columna fue lavada

con 20M de bufferTris HCl pH 8.0 a1ml/min.

Las protenas que se uniana la columna fueroneluidas mediantegradiente salido de NaCl 0 0.1M con el mismocaudal de flujo.

Las fracciones fueron

concentradas por

ultracentrifugacin y se

mantuvieron en bao de

hielo para las medidas

adicinales depurificacin.

Las partculas cargadas negativamente se unen a la matriz slida cargada positivamente y sonretenidas.Mientras tanto, las partculas con carga positiva son rechazadas de la matriz eluyndose.

Para regenerar la matriz, se eluyen las particulas retenidas haciendo circular una solucion salina .


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Columna Superdex 200RH 10/30 de 24ml devolumen.

Cromatografa de filtracin en gel

Fue pre equilibradacon 50M de bufferfosfato de sodio pH

7.0 con NaCl 0.15M.

Se utiliz la enzimaconcentrada de laetapa anterior.

La enzima fue eluidacon el mismo buffer a

un caudal de 0.5ml/mim

Se determinaron laactividad GLOD de lasfracciones por elmtodo colorimtrico yse concentraron anms para las pruebasadicionales.
http://www.viarural.com.ar/viarural.com.ar/insumosagropecuarios/agricolas/riego/gaisa/default.htm


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Las molculas pequeas penetran enlos intersticios del gel quedandoretenidas.mientras tanto, las partculas demayor tamao, al no poder ingresar al

interior del gel, son eludas.as, se consigue separar las molculasde acuerdo a su tamao molecular

Esferas de

polmeros

porosos

Se aade una solucinde protenas a la

columna que contiene

el polmero reticulado

Las molculas de

protena son separadas

por su tamao, las

molculas grandes

pasan con ms facilidad.


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Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.

La plancha de gel SDS PAGE se llev a cabo utilizando una mini celda PROTEAN3,los pesos moleculares de los marcadores se obtuvieron de la corporacin Sigma Aldrich, USA. Los geles fueron sometidos a visualizacin de bandas de protenas conel mtodo de tincin de plata.

Determinacin del peso molecular por

Cromatografa de filtracin en gelEl peso molecular relativo (Mr) de la enzima nativa fue determinado usando unacolumna superdex 200 HR 10/30. La elucin se realiz a un caudal de 0.24ml/min conuna elucin de buffer de fosfato de sodio 50 M pH 7.0 y NaCl 0.15M. La curva decalibracin fue construida utilizando marcadores:

citocromo C 12 400anhidrasa carbnica 29 000albmina de suero bovino 66 000alcohol deshidrogenasa 150000 amilasa 200 000Dextran azul 2 000 000vitamina B12 1 355.4


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Estimacin del punto isoelctrico

El punto isoelctrico fue determinado usando PhastGel

IEF 3

9. Losmarcadores del pI estndar consisti en:

El pI de GLOD se estim mediante la ecuacin de regresin lineal.

tripsingeno 9.30banda de lecitina de lentejabase 8.65banda de lecitina de lenteja media 8.45

banda de lecitina de lentejacido 8.15banda de moioglobinabase 7.35banda de mioglobina - acido 6.85anhidrasa carbnica humana B 6.55anhidrasa carbnica bovina B 5.85 lactoglobulina A 5.20inhibidor de tripsina de soya 4.55

Amiloglucosidasa 3.5


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4. 1 Purificacin de la enzima

GLOD extracelular

Medio de precultivo: Salvado de trigo 2% trigo, 0.5% NaCl, 0.5% MSG

30C, 60 horas, 200 rpm.

Actividad: 13.79 mU/ ml


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4.2 Purificacin de GLOD

Precipitacin con sulfato de amonio

Cromatografa

Filtracin en gel

MARCADORES


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GLODPURIFICADA

MARCADORES

DE PROTEINAS

LISOZIMA

BETA-LACTOGLOBULINA

RESTRICCION

ENDONUCLEASA Bsp981

LACTATO

DESHIDROGENASA

OVOALBUMINA

ALBUMINA DE SUERO

BOVINO

BETA-GALACTOSIDASA


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4.3 Peso molecular y estructura de la subunidad


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4.4 Punto isoelctrico


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4.5 pH ptimo y pH para estabilidad


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4.6 Temperatura ptima y estabilidad trmica


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4.7 Especificidad del sustrato


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1. GLOD extracelular fue aislada de Streptomyces sp. 18 G.

2. La enzima fue eficientemente producida en un medio de salvado de trigo.3. La enzima fue purificada aprox. 990 veces del cultivo de crecimiento con

un rendimiento de 16.65%.

4. La actividad especfica fue de 152.36 U /mg.

5. La enzima nativa tiene un peso molecular de 120000 Da con dos

subunidades idnticas.

6. El pI de GLOD de Streptomyces sp. 18G fue estimado en 8.5.

7. Los perfiles de actividad en cuanto a pH y temperatura: 7 7.4, 37C.

Aplicable para determinacin de glutamato.

8. La enzima muestra exclusividad en la oxidacin de L- glutamato.

9. Los resultados implican que el control de las condiciones de cultivo (pH,

sales, etc., pueden facilitar la produccin de GLOD.

10. Uso: biosensor de kits para anlisis clnico, monitoreo de bioprocesos y

control de calidad de alimentos.


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