Universidad de Ixtlahuaca Licenciatura Qumico Farmacutico Bilogo Mtodos Instrumentales de Separacin Integrantes: Edgar Coln Cayetano Olivia Abisai Favila Martnez Jessica Pia Robles Dante Ramrez Sosa Minely Rendn Becerril Leticia Sanchez Sanchez Diana Tapia Mateos Josu Varela Palma Miguel Ventura Salvador Materia: Anlisis Instrumental Maestra: Janneth Cruz de la Cruz

Cromatografa de lquidosTipos de mtodos de cromatografa de lquidos

1. Cromatografa de Lquidos 1.1 Componentes bsicos de un equipo de HPLC 2. -Mtodos cromatogrficos en HPLC 2.1.- Cromatografa de Reparto 2.1.1.- Cromatografa en Fase Reversa 2.1.2.- Cromatografa en Fase Normal 2.1.3.- Aplicaciones de la Cromatografa de Reparto 2.2.- Cromatografa Inica 2.3.- Cromatografa de Exclusin por Tamaos

1.CROMATOGRAFA DE LQUIDOSEn cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que circula a travs de una columna en la que est contenida la fase estacionaria. La fase mvil no slo arrastra al analito, sino que existen interacciones intensas entre el analito y la fase mvil. La retencin cromatogrfica es funcin de: La fase mvil. La fase estacionaria. El analito. Todas las especies que pueden disolverse pueden separarse eligiendo la combinacin adecuada de fase mvil y fase estacionaria

La cromatografa lquida se clasifica segn el lecho cromatogrfico: Cromatografa Lquida Clsica: La columna es de vidrio y se usa para mezclas complejas. Cromatografa de alta resolucin o HPLC: La columna es de acero inoxidable. La HPLC consta de una columna de acero inoxidable de 10 30 cm de longitud, y un dimetro interno de 4 - 10 mm. Las partculas de la fase estacionara son de un tamao aproximado a las 5 - 10m. Cabe destacar que separa con gran eficacia, identifica los compuestos separados por la columna y adems lo cuantifica por su altura o rea de picos en el cromatograma.

1.1 Componentes bsicos en un equipo de HPLC: De forma esquemtica los componentes bsicos son: Sistema de suministro, Inyector Columna Detector Registrador Bombeo y conducciones de la fase mvil

Esquema de un aparato de HPLC

SISTEMA SUMINISTRO DE LA FASE MVIL: Se trata de un reservorio o varios reservorios para los disolventes. Sirve para desgasificar y eliminar partculas en suspensin de los disolventes que interfieren formando burbujas en los sistemas de deteccin. SISTEMA DE BOMBEO DE LA FASE MVIL: Se usan bombas para impulsar a la fase mvil y deben cumplir los siguientes requisitos: Deben vencer altas presiones. Proporcionar caudales estables entre 0,1 y 10mL/min. Deben estar libres de pulsaciones y tener volmenes muertos pequeos. Deben estar construidas de materiales resistentes a la presin y a las agresiones qumicas.

Fcil manejo y mantenimiento. Se utilizan tres tipos de bombas : Bombas recprocas Bombas de desplazamiento Bombas neumticas INYECTORES: Son los encargados de introducir la muestra en la cabeza de la columna de forma reproducible y adecuada. Hay dos tipos de inyectores Septum: Inyecta la muestra mediante una jeringa. Se usa poco y no permite mucha presin. Bucle de muestreo: Este dispositivo normalmente se encuentra integrado en el equipo cromatogrfico y existen bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra.

PRECOLUMNAS Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes. La composicin del relleno debe ser semejante al de la columna. Aunque el tamao de partcula es mayor para minimizar la cada de presin. En muchas ocasiones se usan para aumentar la vida de la columna. COLUMNA: Normalmente son de acero inoxidable de dimetro interno uniforme aunque en ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. La mayora de las columnas de cromatografa de lquidos tienen una longitud entre 10 y 30 cm. Generalmente son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son 3, 5 y 10m.

Los empaquetados ms comunes son de partculas de slice pero tambin se usa la almina, polmeros porosos y resinas de intercambio inico. La columna ms utilizada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de dimetro interno, empaquetada con partculas de 5 m. Estas columnas tienen de 40.000 a 60.000 platos/metro. Desde hace poco, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin ms rpidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1 y 4,6 mm y se rellenan con partculas de 3 o 5 m. A menudo su longitud es de 3 a 7,5 cm. Pueden tener hasta 100.000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de disolvente caracterstica muy importante ya que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografa de lquidos son muy caros.

DETECTORES: A diferencia de la cromatografa de gases, en HPLC no existen detectores tan universalmente aplicables, ni tan fiables tampoco. En lo que si coinciden cromatografa de gases y HPLC, son las cualidades enumeradas en los detectores de cromatografa de gases. En HPLC existen dos tipos bsicos de detectores: Los basados en una propiedad de la disolucin: Que corresponden a una propiedad de la fase mvil, como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, la densidad... Los basados en una propiedad del soluto: Es decir, responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil.

En la siguiente tabla se presentan los detectores ms comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades ms importantes:

Detectores de Absorbancia: Miden la absorbancia de

los efluyentes de una columna cromatogrfica. Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a travs de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se usan detectores fotoelctricos contrastados. En cualquier caso, el cromatograma consiste en una representacin en funcin del tiempo del logaritmo del cociente de las dos seales transducidas. Tambin se utilizan instrumentos de un solo haz, en cuyo caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el clculo de la absorbancia. Detectores de Fluorescencia: La fluorescencia es detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una fuente de excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la radiacin fluorescente.

Detectores de ndice de refraccin: Los detectores de ndice

de refraccin tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de llama en cromatografa de gases. Se aade que son fiables, no dependen del caudal, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayora de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elucin con gradiente. Detector de dispersin de luz: El efluyente de la columna pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla gracias a un flujo de nitrgeno o aire. Estas finas gotitas pasan por un tubo de conduccin a una determinada temperatura de forma que se evapora la fase mvil y se originan partculas de analito. Estas partculas pasan a travs de un lser y por un fotodiodo de silicio se detecta la radiacin dispersada perpendicularmente al flujo. Su principal ventaja es que resulta ser ms sensible que el detector de ndice de refraccin.

Detectores

Electroqumicos: Actualmente hay varios tipos de detectores electroqumicos, que se basan en cuatro mtodos: amperometra, voltamperometra, coulombimetra, conductimetra. Detectores por espectrometra de masas: Consiste en el acoplamiento de la cromatografa de lquidos con la espectrometra de masas. De forma general se pueden obtener tanto cromatogramas a tiempo real como reconstruidos por ordenador hasta los espectros de los picos eluidos.

2. MTODOS CROMATOGRFICOS EN HPLC Hay cinco mtodos cromatogrficos: Cromatografa de Reparto: Cromatografa en fase normal. Cromatografa en fase reversa.

Cromatografa inica. Cromatografa de Exclusin. Cromatografa de adsorcin. Cromatografa de bioafinidad.

2.1 Cromatografa de Reparto: La cromatografa de reparto es hoy en da el mtodo ms utilizado. La cromatografa de reparto se divide en fase normal, y fase reversa, cuyas principales diferencias radican en las distintas polaridades de sus fases estacionarias y mviles. 2.1.1 Cromatografa en fase reversa: En la cromatografa de fase reversa su fase estacionaria en apolar, y la fase mvil polar. Las fases estacionarias han sido obtenidas haciendo reaccionar qumicamente los centros silanoles activos de la slice con un trialquilclorosilano. La retencin se produce en esta especie de capa lquida depositada qumicamente como consecuencia de la distinta solubilidad relativa entre la fase estacionaria ( apolar) y la fase mvil (polar).

Los compuestos ms retenidos son los ms apolares. La retencin y selectividad se

controlan fundamentalmente con la composicin de la fase mvil. Para obtener una fase mvil de fuerza de elucin ptima, se ensayan mezclas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.

Las polaridades de los solutos son A> B > C

Actualmente, el 75% de los anlisis con HPLC se realizan en fase reversa. Permite un anlisis directo de muestras acuosas y de compuestos solubles en agua o en disolventes relativamente polares (metanol) y con peso molecular no superior a 2000 o 3000 ua. Si se compara con la de adsorcin, su comportamiento cromatogrfico es excelente. 2.1.2 Cromatografa en fase normal: En esta cromatografa a diferencia de en fase reversa, la fase estacionaria es polar y la mvil apolar. Las fases estacionarias se obtienen haciendo reaccionar qumicamente los centros silanoles activos de la slice con un trialquilclorosilano. La retencin tambin (como la de fase reversa) tiene lugar en esa especie de capa lquida depositada qumicamente, como consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la fase estacionaria (polar) y la fase mvil (apolar). Donde el analito menos polar ser el primero que se eluye y el ms polar el ltimo en eluir.

Cromatografa de fase normal La cromatografa de fase normal o "Normal phase HPLC"

(NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de absorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta el tiempo de retencin.

Polaridades de los solutos A > B>C

Se deduce que los analitos A, B, C tardan ms tiempo en eluirse si se usa una fase mvil poco polar. Es decir, cuanto ms polar sea el analito, ms tardar en eluir.

2.2 Cromatografa inica: La cromatografa inica se usa para separar y determinar especies inicas. La fase mvil es un lquido acuoso y salino que contiene un disolvente orgnico como metanol o acetonitrilo y un compuesto inico que aporta un contraion de carga opuesta al analito. La elucin de los pares inicos se consigue mediante una disolucin acuosa de metanol u otro disolvente orgnico soluble en agua. La fase estacionaria es una resina de intercambio inico. Se trata de un material polimrico (Ej: poliestireno), que contiene muchos grupos funcionales por molcula y prcticamente insoluble en agua. Hay dos tipos de cromatografa inica, que se clasifican segn el mtodo empleado, para evitar que la alta conductividad de la fase mvil interfiera en la medida de conductividad del analito. Estos dos tipos son:

Con

detector conductimtrico y supresin qumica: Se coloca una columna supresora del eluyente inmediatamente despus de la columna analtica (de baja capacidad). Esta columna supresora es un intercambiador inico de alta capacidad y de signo opuesto a la columna analtica, que convierte los iones del eluyente en especies moleculares poco ionizadas y no retiene los iones del analito. La columna supresora se debe regenerar peridicamente. Veamos las reacciones entre el eluyente y el supresor:

Reacciones en cromatografa con detector conductimtrico y supresin qumica

- La primera reaccin de la imagen se corresponde a cuando la columna analtica es catinica. - La segunda reaccin de la imagen corresponde a cuando la columna analtica es aninica:

Con detector conductimtrico y supresin electrnica: Se utilizan fases mviles de conductividad muy baja y diluidas. Su conductividad se corrige de forma electrnica.

Comparada con la supresin qumica, requiere un equipo ms sencillo, pero menos sensible.

2.3 Cromatografa de Exclusin por Tamaos: Tambin conocida como cromatografa en geles permeables o de filtracin en geles. Es una tcnica que se aplica particularmente a especies de alto peso molecular. La fase estacionaria est compuesta de partculas de slice o polmeros en forma de gel, que contienen una red de poros uniformes. La retencin est basada en el tamao de las molculas. Si las molculas con ms grandes que los poros, no pueden penetrar en ellos (slo pasan las partculas), y son las primeras que se eluyen. Si las molculas son ms pequeas que los poros, penetran en ellos recorriendo caminos mucho ms largos, y sern las ltimas en eluir. Si las molculas tienen un tamao intermedio, podrn penetrar en los poros ms grandes (camino recorrido intermedio). Por tanto, el tiempo de residencia medio en los poros, depende del tamao afectivo de las molculas de los analitos.

La retencin no se controla con la fase mvil, se controla eligiendo la fase estacionaria, cuya eleccin vendr determinada por: Si la separacin se realiza en fase acuosa (filtracin en gel), o en fase orgnica. El rango de pesos moleculares (tamaos) que contienen la muestra que queremos analizar. Cabe observar, que este tipo de separacin difiere de los dems que han sido considerados, en que no implica una interaccin qumica o fsica entre los analitos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar este tipo de interacciones, dado que originan una mala eficacia de la columna.

La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos

funcionales del compuesto de inters, sino tambin en factores estricos de forma que los ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin. La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el

desarrollo del HPLC de fase reversa o Reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el estado de hidratacin de la slica o almina de la cromatografa.

Cromatografa de exclusin molecular La

cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como cromatografa por filtracin en gel, separa las partculas de la muestra en funcin de su tamao. Generalmente se trata de una cromatografa de baja resolucin de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificacin. Tambin es muy til para la determinacin de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las protenas purificadas.cromatografa en columna por el cual las molculas se separan en solucin segn su peso molecular, o ms precisamente, segn su radio de Stokes.

La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de

En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste

en largos polmeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los fines prcticos, la columnas se empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas por esos polmeros entrecruzados. En consecuencia, estas partculas son porosas, y el tamao de los poros es tal que algunas molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeas) podrn pasar libremente. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las molculas que acceden al interior de esta.

Cromatografa basada en bioafinidad Este tipo de cromatografa se basa en la capacidad

de las sustancias biolgicamente activas de formar complejos estables, especficos y reversibles. La formacin de estos complejos implica la participacin de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones electrostticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofbicas y puentes de hidrgeno entre las partculas de la muestra y la fase estacionaria.

Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de partcula entre 2 y 10 um, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografa de lquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kg-fuerza por centmetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser ms sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografa.La Figura 28-4 muestra un esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta eficacia tpico; cada uno de los componentes se trata en los prrafos que siguen a continuacin.

Figura 28-4

RECIPIENTES PARA LA FASE MVIL Y SISTEMAS PARA EL TRATAMIENTO DE LOS DISOLVENTES.Un aparato moderno de HPLC est equipado con uno o ms recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene de 200 a 1.000 mL de un disolvente. Los recipientes, a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos en general oxgeno y nitrgeno que interfieren formando burbujas en la columna y en los sistemas de deteccin. Estas burbujas provocan ensanchamientos de banda y a menudo interfieren en el funcionamiento del detector. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vaco, un sistema de destilacin, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o, como se muestra en la Figura 28-4, sistemas de purga que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad.

Con frecuencia estos sistemas tambin contienen un dispositivo para la filtracin del polvo y de las partculas slidas en suspensin en los disolventes para evitar que estas partculas daen la bomba o los sistemas de inyeccin u obturen la columna. No es necesario que los desgasificadores y los filtros sean partes integrantes de los sistemas de HPLC como se muestra en la Figura 28-4. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos a vaco a travs de un filtro (millipore) de tamao de poro muy pequeo. Este tratamiento elimina los gases, as como la materia en suspensin. Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se denomina una elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficacia de la separacin se aumenta notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos o tres sistemas disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez que comienza la elucin, se vara la relacin de los disolventes de forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna HPLC a menudo estn equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde dos o ms recipientes en una cmara de mezcla a una velocidad que vara continuamente y la relacin de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo.

SISTEMAS DE BOMBEO

Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen (1) la generacin de presiones por encima de 6.000 psi, (2) un flujo libre de pulsaciones, (3) un intervalo de caudales de 0,1 a 10 mL/min, (4) el control y la reproducibilidad del caudal mejor del 0,5 por 100 relativo y (5) componentes resistentes a la corrosin (juntas de acero inoxidable o Tefln). Debe subrayarse que las altas presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosin, debido a que los lquidos no son muy compresibles. Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas recprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumticas o de presin constante.

Bombas recprocas Las bombas recprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90 por 100 de los sistemas de HPLC comerciales, consisten, por lo general, en una pequea cmara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por un motor de arrastre (vase Fig. 28-6).Dos vlvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro. El disolvente est en contacto directo con el pistn. Tambin se puede comunicar la presin al disolvente mediante un diafragma flexible, el cual a su vez se bombea hidrulicamente por un pistn de vaivn. Las bombas recprocas tienen la desventaja de que producen un flujo pulsado, que se ha de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la lnea base del cromatograma. Entre las ventajas de las bombas recprocas se pueden citar su pequeo volumen interno (35 a 400 fiL), sus altas presiones de salida (por encima de los 10.000 psi), su fcil adaptacin a la elucin con gradiente, y sus caudales constantes, que son prcticamente independientes de la contrapresin de la columna y de la viscosidad del disolvente.

Fig. 28-6

Bombas de desplazamientoLas bombas de desplazamiento consisten por lo general en unas grandes cmaras como una jeringa, equipadas con un mbolo que se activa por un mecanismo de tornillo accionado mediante un motor paso a paso. Las bombas de desplazamiento tambin producen un flujo que tiende a ser independiente de la viscosidad y de la contrapresin. Adems, el flujo que resulta est libre de pulsaciones. Las desventajas incluyen una capacidad de disolvente limitada (250 mL) y una notable incomodidad para el cambio de disolventes. Bombas neumticas En las bombas neumticas ms simples, la fase mvil se encuentra en un recipiente plegable colocado en un vasija que puede presurizarse mediante gas comprimido. Las bombas de este tipo son baratas y estn exentas de impulsos; aunque tienen una limitada capacidad y presin de salida, y adems el caudal depende de la viscosidad del disolvente y de la contrapresin de la columna. Adems, no son utilizables en la elucin con gradiente y estn limitadas a presiones menores de unos 2.000 psi.

Control del caudal y sistemas de programacin. Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos comerciales se equipan con dispositivos controlados por ordenador que permiten medir el caudal mediante la determinacin de la cada de presin a travs de un restrictor colocado en la salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la seal y un valor preestablecido se utiliza para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba. La mayor parte de los instrumentos pueden variar la composicin del disolvente bien sea de una forma continua o bien de forma escalonada.

SISTEMAS DE INYECCIN DE MUESTRA A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se acenta por el ensanchamiento de banda que acompaa a la sobrecarga de las columnas. El medio ms simple y antiguo para la introduccin de las muestras implicaba la inyeccin con una jeringa a travs de un elastmero (septum) que cierra hermticamente. Con esta finalidad se utilizaron microjeringas capaces de resistir presiones de hasta 1.500 psi. En las inyecciones a flujo detenido, el flujo del disolvente se detiene momentneamente, se retira el conector de la cabeza de la columna y la muestra se inyecta directamente en el relleno de la cabeza de la columna despus se retira el accesorio y el sistema se vuelve a presurizar. La ventaja de esta tcnica es su sencillez. Desafortunadamente, la reproducibilidad de la inyeccin con jeringa rara vez es mejor de un 2 o un 3 por 100 y con frecuencia es considerablemente peor.

COLUMNAS PARA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de dimetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes.

Estas ltimas slo se utilizan a presiones menores de unos 600 psi. Se comercializan por distintos fabricantes cientos de columnas rellenas que difieren en el tamao y el relleno y su coste oscila, por lo general, de 200 $ a 500 $.

Columnas analticas. La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tienen una longitud entre 10 y 30 cm. Por lo comn, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. En algunas ocasiones se pueden encontrar columnas configuradas con forma helicoidal aunque el resultado es una cierta prdida de eficacia. El dimetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son 5 o 10 /im. Tal vez la columna ms frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de dimetro interno, y rellena con partculas de 5 pm. Este tipo de columnas tiene de 40.000 a 60.000 platos/metro. Recientemente, se han empezado a fabricar columnas de alta eficacia, ms rpidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas5. Estas columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1 y 4,6 mm y se rellenan con partculas de tamao de 3 o 5 pm. A menudo su longitud es de 3 a 7,5 cm.

Estas columnas tienen hasta 100.000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de disolvente. La ltima propiedad es de considerable importancia, puesto que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografa de lquidos son muy caros

PrecolumnasEn muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca delante una precolum- na que elimina no slo la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes sino tambin componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Adems, en cromatografa lquido-lquido, la precolumna sirve para saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as minimizar las prdidas de sta en la columna analtica. La composicin del relleno de la precolumna debera ser semejante al de la columna analtica; sin embargo, el tamao de partcula es por lo comn mayor para minimizar la cada de presin. Columnas termostatizadas En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado centgrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayora de los instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las dcimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 100 o 150 C.

TIPOS DE RELLENOS DE LA COLUMNA

En cromatografa de lquidos se han utilizado dos tipos bsicos de rellenos, pelicular y de partcula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de polmero, no porosas y esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a 40 /tm. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina, de una resina sinttica de poliestirenodivinilbenceno o de una resina de intercambio inico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria lquida que se mantiene fija por adsorcin. Los tpicos rellenos de partculas porosas para cromatografa de lquidos estn formados por micropartculas porosas con dimetros entre 3 y 10 //m y con la menor dispersin posible con respecto a un tamao determinado. Las partculas son de slice, almina, de una resina sinttica de poliestirenodivinilbenceno o resinas de intercambio inico, aunque la slice es el material de relleno ms comn en cromatografa de lquidos. Las partculas de slice se preparan aglomerando partculas de slice de tamaos inferiores al micrometro en unas condiciones tales que se forman partculas mayores con dimetros muy uniformes.

DETECTORES.

A diferencia de la cromatografa de gases, en la cromatografa de lquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionizacin de llama y de conductividad trmica.Caractersticas de un detector ideal

Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las propiedades relacionadas en la pgina 765, para la cromatografa de gases, con la excepcin de que un detector para cromatografa de lquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas.

Tipos de detectores Los detectores en cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores que se basan en la medida de una propiedad de la disolucin responden a una propiedad del efluente, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por el contrario, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia en el UY, fluorescencia, o corriente lmite, que no son inherentes a la fase mvil. En la Tabla 28-1 se indican los detectores ms comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades ms importantes. Una revisin de 1982 sobre 365 artculos publicados en los que la cromatografa de lquidos tena un papel importante, revel que el 71 por 100 utilizaban la deteccin de la absorcin UV, el 15 por 100 la fluorescencia, el 5,4 por 100 el ndice de refraccin, el 4,3 por 100 empleaba medidas electroqumicas y el 4,3 por 100 restante otras medidas.

Detectores de absorbanciaLa Figura 28-9 muestra el esquema de una celda de flujo en forma de Z para las medidas de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatobricantes ofrecen este tipo de instrumentos, que permiten recoger los datos de un espectro completo en aproximadamente un segundo. De esta forma, los datos espectrales para cada pico cromatogrfico se pueden recoger y almacenar a medida que van saliendo de la columna. Una de las formas de presentacin de los datos espectrales, que resulta til para la identificacin de las especies y para elegir las condiciones de la determinacin cuantitativa, consiste en un grfico tridimensional tal como el que se muestra en la Figura 28-10. En este caso, los espectros se obtuvieron a intervalos de cinco segundos. La aparicin y desaparicin de cada uno de los esferoides en el eluyente de la columna resulta evidente.

Detectores de absorbancia en el infrarrojo. El primero tiene un diseo semejante al del instrumento mostrado en la Figura 16-14, con barrido de longitud de onda que proporcionan tres filtros circulares variables. El intervalo de trabajo de este instrumento es de 2,5 a 14,5 fon o de 4.000 a 690 cmf. El segundo, mucho ms sofisticado, es un tipo de detector infrarrojo que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier. Varios fabricantes de instrumentos con transformada de Fourier ofrecen accesorios que permiten su uso como detectores en HPLC. Las cubetas de los detectores del infrarrojo son semejantes a las de radiacin ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o de fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta oscilan de 0,2 a 1,0 mm, y los volmenes de 1,5 a 10 fiL

Detectores de fluorescencia Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseo a los fluormetros y espectrofluormetros. En la mayora de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una fuente de excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la radiacin emitida.

Los instrumentos ms sofisticados consisten en una fuente de radiacin de xenon y emplean un monocromador de red para aislar la radiacin fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores de fluorescencia probablemente se basarn en el uso de fuentes de lser sintonizables, las cuales permitirn una mayor sensibilidad y selectividad.

Detectores de ndice de refraccin La Figura 28-11 muestra el esquema de un detector diferencial de ndice de refraccin, en el que el disolvente en su camino hacia la columna pasa a travs de una mitad de la cubeta y el eluyente de la columna pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos estn separados por una placa de vidrio montada a un ngulo tal que si las dos disoluciones difieren en el ndice de refraccin se produce una desviacin del haz incidente. El desplazamiento resultante del haz con respecto a la superficie fotosensible del detector provoca una variacin de la seal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada, proporciona el cromatograma. Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de llama o de conductividad trmica en cromatografa de gases. Adems, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante en unas pocas milsimas de grado centgrado.

Detector de luz dispersada tras evaporacin. Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector general para HPLC, el detector de luz dispersada tras evaporacin (ELSD). En este detector, el efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de nitrgeno o aire. Las finas gotitas se llevan a travs de un tubo por el que pasa la corriente del gas a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporacin de la fase mvil, lo que origina unas finas partculas de analito. La nube de partculas de analito pasa a travs de un haz lser. La radiacin dispersada se detecta perpendicular- mente al flujo mediante un fotodiodo de silicio. Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta resulta ser aproximadamente la misma para todos los solutos no voltiles. Adems, es notablemente ms sensible que el detector de ndice de refraccin, ya que se han establecido unos lmites de deteccin de 5 ng/25 uL.

Detectores electroqumicos.

Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de detectores electroqumicos. Estos dispositivos se basan en la amperometra, la voltamperometra, la culombimetra y la conductimetra. En principio, pues, las especies que contienen alguno de esos grupos podran detectarse por procedimientos am- peromtricos, voltamperomtricos o culombimtricos. Por tanto, la deteccin electroqumica parece poder cubrir una necesidad que largo tiempo ha tenido la HPLC, que es la de disponer de un detector general o universal sensible.

Deteccin por espectrometra de masas Un problema fundamental del acoplamiento de la cromatografa de lquidos con la espectrometra de masas es el enorme contraste que existe entre los volmenes relativamente grandes de disolvente de la primera y los requerimientos de vaco de la ltima. Para resolver este problema se han desarrollado diversas interfases. En una de ellas, que est comercializada, el efluente de la columna se divide, y slo una minscula fraccin se introduce directamente en el espectrmetro de masas. Los sistemas de introduccin directa de lquido parecen tener un futuro prometedor cuando se utilizan combinados con las columnas microcapilares, las cuales tienen unos caudales caractersticos de 10 a 50 /iL/min.

En un segundo tipo de interfase, que tambin se puede adquirir en el comercio, el efluente de la columna se deposita sobre una cinta o alambre que se mueve continuamente y que transporta el disolvente y el analito hacia una cmara calorfica para la eliminacin del primero por volatilizacin. Tras la evaporacin del disolvente, los residuos del analito sobre la cinta o el alambre pasan a la zona de la fuente de ionizacin, donde tiene lugar la desorcin-ionizacin

Una nueva y prometedora interfase, tambin comercializada, se denomina termovaporizador. Una interfase de termovaporizacin permite la introduccin directa de todo el efluente de una columna con caudales de hasta 2 mL/min. Con esta interfase, el lquido se vaporiza al pasar por un tubo capilar de acero inoxidable calentado y se forma un chorro de aerosol constituido por las molculas del disolvente y del analito. En el aerosol, el analito se ioniza por un mecanismo de intercambio de carga con una sal, como el acetato de amonio, que se incorpora al eluyente. As, el termovaporizador no slo es una interfase, sino tambin una fuente de ionizacin. Los espectros que resultan son por lo general simples, y proporcionan los datos de la masa molecular, pero falta el detalle que se tiene con los espectros de impacto electrnico que resulta de gran utilidad para la identificacin de los analitos. Con estas limitaciones, la interfase de termovaporizacin proporciona espectros para una amplia gama de compuestos termoestables y no voltiles como los pptidos y los nucletidos. Se han encontrado lmites de deteccin por debajo de 1 a 10 picogramos

Con los detectores de espectrometra de masas, en general, se emplea el control y el almacenamiento de datos por ordenador. Se pueden obtener tanto los cromatogramas en tiempo real como los reconstruidos por ordenador, y tambin los espectros de los picos eluidos. Hasta ahora, los instrumentos para HPLC/MS no estn tan desarrollados como los instrumentos para GC/MS; pero parece probable que esta situacin cambie en los prximos aos.

Los rellenos con fases unidas qumicamente, cuando se utilizan en fase inversa en combinacin con disolventes muy polares se aproximan al sistema ideal y universal para la cromatografa de lquidos. Para investigar la separacin de nuevos tipos de muestras, estos son los rellenos que se utilizan en primer lugar debido a su amplio intervalo de aplicabilidad, su adecuacin, y a la facilidad con que pueden modificarse k y variando las fases mviles acuosas.

La siguiente tabla enumera unos cuantos ejemplos caractersticos entre la gran variedad de aplicaciones de la cromatografa de reparto en diversos campos.CAMPO MEZCLAS TPICAS

Productos farmacuticosBioqumica Productos de alimentacin Productos de la industria qumica Contaminantes Qumica forense Medicina clnica

Antibiticos, sedantes, esteroides, analgsicos Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Aromticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes Plaguicidas, herbicidas, fenoles, PCBsDrogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrgenos

Aplicaciones de la cromatografa de fase enlazadaEn ambos casos la deteccin UV es a 254 nm. a) Aditivos en bebidas b) Insecticidas refrescantes. Columna 4.6 organofosforados. x 250 mm empaquetada con Columna 4.5 x 250 mm rellenos de fase enlazada empaquetada con artculas polares. Disolvente en de 5 m con fase enlazada modo isocrtico: CH3OH C8. Gradiente de CH3OH 6% / H2O 94%. Caudal 1 67% / H2O 33% a CH3OH mL/min. 80% / H2O 20%. Caudal 2 mL/min.

Aplicaciones de cromatografa de la fase enlazada

Aplicacin tpica de cromatografa de adsorcin Separacin de cis y trans

pirazolina. Columna 100 x 0.3 cm, slice pelicular. Fase mvil: 50% cloruro de metileno / isooctano. Caudal 0.25 mL/min. Detector UV 254 nm.

NOTA: la cromatografa de adsorcin es ms adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5000. Los mtodos de cromatografa de adsorcin y los de reparto,, tienden a ser complementarios.

CROMATOGRAFIA IONICA El anlisis de drogas y sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas para vitaminas, azcares y preparaciones farmacuticas.

Aplicaciones de la cromatografa inica(a) Separacin de aniones en una columna de intercambio aninico. Eluyente NaHCO3 0.0028M / Na2CO3 0.0023M. Tamao de muestra 50 L.

(b) Separacin de iones alcalinos en una columna de intercambio catinico. Eluyente: Diclorhidrato de fenilendiamina 0.025 M / HCl 0.0025 M. Tamao de muestra 100 L

Aplicaciones orgnicas y bioqumicas de la cromatografa inicaEn esta imagen se separan con una columna de intercambio catinico 1 x 10-8 moles de cada uno de los 17 aminocidos de una muestra.

Aplicaciones de la cromatografa de exclusin por tamaosUna de las aplicaciones ms tiles del procedimiento de filtracin en gel consiste en separar las molculas de alto peso molecular de productos naturales de las especies de bajo peso molecular y de las sales. Por ejemplo, un gel con un lmite de exclusin de varios miles, puede separar bien las protenas de los aminocidos y de los pptidos de bajo peso molecular.

Una aplicacin til de la cromatografa de gel permeable es la separacin de homlogos y oligmeros.

Estas aplicaciones se ilustran con los ejemplos que se muestran a continuacin:

(a) Separacin de cidos grasos. Columna de poliestireno 7.5 x 600 mm con un lmite de exclusin de 1000. Fase mvil tetrahidrofurano. Caudal 1.2 mL/min. Detector: ndice de refraccin.

(b) Anlisis de una resina epoxi comercial (n= nmero de unidades monomricas en el polmero). Columna de slice porosa 6.2 x 250 mm. Fase mvil tetrahidrofurano. Caudal 1.3 mL/min