Expresión Diferencial del Genoma en el

Desarrollo - IIBiol 3019Biología del DesarrolloUniversidad de Puerto

Rico-AguadillaJA Cardé, PhD

ObjetivosRepasar los conceptos de equivalencia genómica

y de expresión diferencial del genoma.Repasar la anatomía de un gen y del mRNA

Promotores, enhancers, TF y silencers

Explicar los mecanismos de transcripción diferencial

Discutir el procesamiento diferencial del mRNAResumir los mecanismos de controlde expresión

genética: transcripcional, traduccional, pos-traduccional; y sus implicaciones en el desarrollo.

Mecanismos de Transcripción diferencial

TF: Ya se sabe quienes son, pero no se sabía su rol?

ChIP-Seq Technique: Aislar y crosslink la cromatinaCortar el DNA (sonicación/enzimas)Incubar con AB vs la proteína de

interésPrecipitar complejo AB-Prot-DNASeparar el DNA, PCR y secuenciar

Mecanismos de Transcripción diferencialChIP-Seq, identifica dos tipos de promotoresHigh CpG content promoters

Default ON, DNA no metilado activo; para inactivarlo metilar las histonas

En genes de control del desarrollo temprano Regulan la síntesis de TF y otras proteínas

reguladorasLow CpG content promotors

proteínas características de etapas tardías, células maduras

Defaults OFF: DNA metilado inactivo, hay que demetilar y esto permite modificar las histonas (H3K4me3) y la RNA pol II entra.

Transcripción diferencial: mecanismosMetilación del DNA: ON/OFF switch

Histonas metiladas para?________________… y el DNA? En las citosinas del promotor5 Metilcitosina (5ta base) estabiliza nucleosomas

previene transcripciónPresente en 5% de las C (seguidas por G) luego de

la replicaciónRegulación transcripcional en vertebradosMetilación del DNA:

Bloquea la unión de TF a enhancers con C metiladaFacilita reclutamiento de metilasas y deacetilasas,

estabilizando el nuclesoma para evitar transcripción (MeCP2)

Transcripción diferencial: mecanismosMetilación del DNA: ON/OFF switch

Como comparan en (términos de metilación) el promotor de las globinas en RBC inmaduros vs RBC maduros durante el desarrollo?

Metilación: Patrones heredables: DNMT3DNMT1

DNA CpG||

DNMT3 (de novo)

||

DNMT1 (forever)

Asignado: 3 estados de la cromatina: activa, reprimida o “poised” (pag 51).

RNAProcesamiento Diferencial:La clave de la diferenciación celular es la síntesis de diferentes

proteínas en diferentes tipos de célulasEn bacteria el control es: transcripcion, traduccion y

postraduccionEn eucariota: uno mas; procesamiento y transporteSplicing isoforms:En humanos 90% de los genes lo usan

“Human Genes are multitaskers” – Christopher BurgeGenoma: 20,000 genes < Proteoma: 20,000 proteínas

Genes Cells ProteinsC elegans 20,000 959 ~20000H sapiens 20,000 100,000 bil ~100,000

Alternative Splicing Variants

Bcl-XS vs Bcl-XL:- large Bcl = inhibe apoptosis- short Bcl = induce apoptosisen tumores cual predomina?

Spliceosome

Factores de splicing- Expresados diferencial-mente

- snRNA U1 y SF2 en 5’

- U2AF en 3’

RNAProcesamiento Diferencial:ER - Drosphila Dscam geneLa clave de la diferenciación celular es la síntesis de

diferentes proteínas en diferentes tipos de célulasSplicing isoforms:

Altenative Splicing: FGF

IIIb vs IIIc - Ambos en

entre ex 7 y 8

- En mesenq IIIC: mesodermo

- En epitelio IIIB :ectodermo

- Metilaciones marcan splicing

Splicing enhancers y recognition factorsSplicing enhancer (cis) sequences (SES)

Cerca de sitios de splicing Promueven el ensamblaje del spliceosome

Recognition factors (trans) proteins Reconocen las SES y reclutan el splicesoma Polypirimidine track binding proteinas (PPT) reprimen

la formacion del spliceosoma

Hay señales que sugieren que el contexto tambien es importante

Aplicación clínicaMutaciones en splicing sites:La mayoria resultan en proteinas NO

funcionalesDistrofina: mutación en un “splicing

site” causa que se salte el exónMyostatin gene: mutacion en el induce

personas mas “fuertes”Su proteina es un regulador negativo

de division celular muscularHipertrofia muscular – como miostatina

no esta, el musculo se sigue dividiendo hasta mas tarde: musculos mas grandes

Myostatin Knockout

Control: Nivel traduccional:longevidad diferencialLongevidad diferencial del mRNA

: media vida del mRNAMientras mas estable mas dura y

mas copias de la proteínaLongitud del poli A, secuencias

en el 3’UTR para mayor longevidad

Estabilización de ciertos mRNA en ciertos momentos en ciertas células

mRNA caseína : 1.1 hr en tejido mamario vs 28.5 hrs en lactancia (prolactina)

Control: Nivel traduccional:Inhibicion selectiva de mRNAsOvocito: fabrica y almacena los mRNAs

que se usarán solamente luego de fecundación.

Se mantienen en estado durmiente hasta que llegue la señal: polaridad / iones

Ej de mRNAs en el huevo: histonas, actina/tubulina, ciclinas

Drosophila: bicoid, caudal, nanos (homeobox)

Regulación traduccional “negativa”: inhibidores

Control: Nivel traduccional:Inhibicion selectiva de mRNAs5’Cap, 3’ Poly A ; si no estan no

traduccionCircularización de mRNA- 5’ cerca de 3’- eIF4E +- eiF4A

(helic)- eiF4G (scaf)- poliABP

- Maskin- CPEB

(3’UTR) (uuuuau)

- eIF4E- Fosforilacio

n de CP y Maskin activa

Control: Nivel traduccional- Tienen favoritismos los ribosomas? NO!- a favor: mRNAs de Euc son traducidos por ribosomas de Proc- sistema reticuloendotelial: traduccion por excelenciaSI: Selectividad ribosomal – Ribosomas

tienen proteinas distintas dependiendo del tejido

Observación de un gen que causaba deformidad esqueleto axial

Por la traducción diferencial del gen : Rpf38

Proteina 38 del ribosoma en las somitas, controla expresion del Hox6

Deficiencia de Rpf38 causa deformidad vertebral

Rpf38 Hox6

Control: Nivel traduccionalpuede el RNA como las proteinas unirse a un acido nucleico y bloquearlo? SImicroRNAs – eficiente y específico medio

de regular la traduccion de un mRNAPequeños, complementarios a mRNA o

parte de elAnti sense RNA, primera vez en C elegansLin-4: RNA 21nctds silencia mRNA de

lin 14 uniéndose a su 3’UTR, marcado para degradación

Lin14 usado en larva temprana, luego inactivado

miRNAs – sobre 1000 en humanos, regulan 50% de nuestros genes estructurales

- Conservado- El precursor tiene

varios repeats, cada uno forma un loop

- Estos loops son procesados por Drosha y Dicer (RNAsas

- Estas lo hacen SS RNA

- Empacado en RISC- Argonauta- Se unen al 3’UTR

- Inhiben traducción

- Perfect

Prim-DroshaPrem-DicermicroAgo

microRNAsmiR1- controla el balance entre crecimiento

ventricular y diferenciacionmiR181 – esencial para la determinacion de celulas

progenitoras en celulas BmiR430 – operacion limpieza de mRNAs maternales el

ovocito una vez traducidos (zebra fish)Fine tuning de Nodal: determinacion de

ectodermo/endodermoSon de 22 ncltds, pero con region “seed” de 5ncltd en

el 5’mRNA con 3’UTR mutado y micro RNA no lo reconoce?Texel sheep: myostatinMutacion en el previene splicing hipertrofia muscular,

por deficiencia de miostatinaOtra forma: transicion AG en 3’UTR, mir1 y mir 206,

degradan el mRNA

Control de expresion de RNA: localización citoplásmicaSe regula el timing y la localizacion de la

expresion3’UTR – represion selectiva y localizacion

selectiva3 mecanismos de localizacion

Difusion y anclaje por proteinas activadoras (nanos)

Proteccion por localizacion (hsp83)Libre difusion como nanos pero no es

degradada en unas zonas especificas (polo posterior)

• Transporte activo (mecanismo mas usado)

• Proteinas motoras ligan el 3’UTR y lo transportan

• Son ATPAsas (Dineina y kinesina, osar y bicoid)