MICHEL BRIENZO

Extração da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar para produção de

xilo-oligossacarídeos

Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências do Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Industrial na área de concentração: Microbiologia Aplicada.

Orientadora: Dra. Adriane M. F. Milagres

Lorena - SP 2010

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Catalogação na Publicação Biblioteca “Cel. Luiz Sylvio Teixeira Leite”

Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo

Brienzo, Michel

Extração de hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar para produção de xilo-oligossacarídeos / Michel Brienzo ; orientadora Adriane M. F. Milagres. – Lorena: 2010.

134 pág. : fig.

Tese (Doutor em Ciências – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial na Área de Microbiologia Aplicada) – Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo.

1. Xilo-oligossacarídeos 2. Hemicelulose 3. Thermoacus aurantiacus 4. Hidrólise

enzimática 5. Bioconversão 6. Endo-β-1,4-xilanase. I. Título 547.458 - CDU

Dedico esse trabalho:

A minha esposa Águeda; A minha avó Amélia;

Aos meus pais Diogo e Aparecida; Aos meus irmãos Gilmar, Gislaine e Ricardo;

A minha sobrinha Rayssa

Pelo carinho e incentivo

AGRADECIMENTOS

É com muita satisfação que agradeço:

A prof. Adriane pela oportunidade, orientação, confiança e ensinamentos, os quais

foram muito além desse trabalho. O seu interesse pela pesquisa, dedicação e

comprometimento fez com que esses anos de trabalho passassem de forma harmoniosa e

prazerosa.

Aos professores André Ferraz, George Rocha e Walter Carvalho pelos ensinamentos,

observações, comentários e sugestões, as quais contribuíram para o desenvolvimento desse

trabalho. Agradeço também pela irrestrita disponibilidade para conversar e discutir

problemas.

A todos os professores do Departamento de Biotecnologia que contribuíram através

das disciplinas para o ensinamento e desenvolvimento intelectual e científico.

A todos os funcionários do Departamento de Biotecnologia e do Programa de Pós-

Graduação, principalmente aos técnicos Djalma, Fabrício, Cibele, Jussara, José Carlos e

Bárbara, que de forma direta ou indireta contribuíram para o desenvolvimento desse trabalho.

Aos amigos Celso, Daniela B., Daniela C., Débora, Fernanda, Germano, Hévila,

Jéssica, Joseana, Luiz Carlos, Márcio, Paula, Ricardo, Robson, Sérgio, Valdeir, Victor e todos

os colegas pela amizade e convívio. Em especial gostaria de agradecer as alunas de iniciação

científica Andressa e Thaianne, que além da amizade contribuíram para o desenvolvimento

desse trabalho.

Aos amigos, que de longe acompanham minha vida, Aline, Claudia, Dorival, Manoela,

Noeli, Fabrício, Peterson, Rose e Stivens e, também ao Sérgio, Celina e Érick.

A FAPESP pelo financiamento do projeto.

RESUMO

BRIENZO, M. Extração da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar para produção de xilo-oligossacarídeos. 2010. 137p. Tese (Doutorado em Ciências) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo – Lorena, 2010. Hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar foi hidrolisada por enzimas de Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei e Aspergilus niger para obtenção de xilo-oligossacarídeos (XOs). A hemicelulose foi extraída com hidróxido de sódio na presença de antraquinona, sulfito de sódio ou peróxido de hidrogênio. O uso de antraquinona ou sulfito aumentou o rendimento de extração, porém a hemicelulose apresentou baixa solubilidade em água, propriedade inadequada para a hidrólise enzimática. A extração da hemicellulose com peróxido de hidrogênio em meio alcalino foi otimizada através de um planejamento fatorial completo 24 variando-se a concentração de H2O2 de 2 a 6% (m/v), tempo de reação de 4 a 16 h, temperatura de 20 a 60°C e presença ou não de 0,5% de sulfato de magnésio. No ponto central o rendimento de extração de hemicelulose foi de 94,5% com remoção de mais que 88% da lignina. Um rendimento de 86% de hemicelulose com baixo teor de lignina (5,9%) foi obtido em 6% de peróxido de hidrogênio por 4h a 20°C. Nessa condição a hemicelulose apresentou massa molar de 21.000 g/mol, composição aproximada de 81% xilose, 4% de arabinose, 4% de glicose e 3% de ácidos urônicos, alta solubilidade em água (90 % em massa) e coloração amarelo claro. As enzimas usadas na hidrólise dessa hemicelulose foram produzidas pelo cultivo dos fungos em meio sólido contento farelo de trigo. Em todos os extratos foi observada baixa atividade de endoglucanase e β-xilosidase e elevadas atividades de endo-β-1,4-xilanase. A máxima atividade de xilanase foi produzida por T. aurantiacus (1500 U/g), enquanto A. niger produziu 500 U/g e T. reesei 240 U/g, em 5 dias de cultivo. O perfil de produção de XOs com enzimas de T. aurantiacus e T. reesei foi semelhante, o principal produto foi xilobiose, seguido por xilose, xilotriose, xilotetraose e xilopentaose, sendo esses XOs de cadeia linear. A hidrólise da hemicelulose com enzimas de A. niger produziu exclusivamente xilose, consequência da presença de elevada atividade de β-xilosidase. A velocidade de conversão da hemicelulose em XOs com as enzimas de T. reesei foi maior no início da reação (6 h), diminuindo a partir de 24 h, período em que inicia a produção de xilose. A influência da concentração de substrato e carga de xilanase na conversão da hemicelulose em XOs foi avaliada através de um planejamento experimental 22 com face centrada. A condição otimizada da hidrólise (2,6% substrato e 60 U/g de endo-β-1,4-xilanase) com o extrato de T. aurantiacus resultou em 42% de conversão em XOs. A otimização da hidrólise da hemicelulose com o extrato de T. reesei resultou em uma conversão máxima de 20%, com ótimo de 3,8 % de substrato e 87,5 U/g de endo-β-1,4-xilanase. A eficiência da hidrólise com enzimas de T. aurantiacus foi maior que a obtida com alguns extratos comerciais testados neste trabalho. Além disso, apresentaram capacidade de degradar hemiceluloses de diferentes fontes: bétula e semente de aveia, com composições variadas. Diferenças na composição de açúcares e teor de lignina não interferiram na ação dessas enzimas. A hidrólise enzimática mostrou-se mais apropriada para a produção de XOs do que a auto-hidrólise, que gerou predominantemente xilose e houve formação de furfural. Apesar do curto tempo de reação, a produção de XOs foi menor e há necessidade de purificação para obtenção de um produto final com características desejáveis.

Palavras-chave: Xilo-oligossacarídeos. Hemicelulose. Thermoascus aurantiacus. Hidrólise enzimática. Bioconversão. Endo-β-1,4-xilanase.

ABSTRACT

BRIENZO, M. Extraction of hemicellulose from sugarcane bagasse for xylooligosaccharides production. 2010. 137p. Thesis (Doctoral of Science) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo – Lorena, 2010.

Hemicellulose extracted from sugarcane bagasse was hydrolyzed by enzymes from Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei and Aspergilus niger to cause the degradation of xylan to xylooligosaccharides (XOs). Hemicellulose was extracted with hydrogen peroxide in the presence of antraquinone, sodium sulphite or hydrogen peroxide. Hemicelluloses extracted with antraquinone or sulphite presented low solubility in water, which is not appropriated to enzymatic hydrolysis. To maximize the hemicellulose yields several extraction conditions were examined applying the 24 factorial design: H2O2 concentration from 2 to 6% (w/v), reaction time from 4 to 16 h, temperature from 20 to 60°C, and magnesium sulfate absence or presence (0.5%, w/v). This approach allowed selection of conditions for the extraction of low and high lignin content hemicellulose. At midpoint the yield of hemicellulose was 94.5% with more than 88% of lignin removed. Hemicellulose in 86% yield with low lignin content (5.9%) was obtained with 6% H2O2 treatment for 4 h and 20°C. This hemicellulose is much lighter in color than samples obtained at the midpoint condition and was found suitable for subsequent enzymatic hydrolysis. The molecular weight of hemicellulose was 21,000 g/mol with composition of aproximately 81% xylose, 4% arabinose, 4% glucose and 3% uronic acids, high water solubility (90 %). Enzymes for hemicellulose hydrolysis were produced by the fungi on wheat bran. Cellulases and hemicellulases were present in all extracts especially the endo-β-1,4-xylanase. The profile of production of XOs obtained on hydrolysis with enzymes from T. aurantiacus and T. reesei was similar, with the main product xylobiose, followed by xylose, xylotriose, xylotetraose and xylopentaose, and these XOs showed linear chain. The hydrolysis of hemicellulose with enzymes of A. niger produced exclusively xylose, a consequence of β-xylosidase content. The rate of conversion of hemicellulose in XOs with enzymes of T. reesei was higher at the beginning of the reaction (6 h), decreasing from 24 h, when starts the production of xylose. The influence of substrate concentration and loading of xylanase in conversion of hemicellulose to XOs was evaluated by an 22 full factorial design with centered face. Optimization of hydrolysis (2.6% substrate and 60 U/g endo-β-1,4-xylanase) with the extract of T. aurantiacus resulted in 42 % conversion XOs. The optimization with the extract of T. reesei resulted in a conversion of hemicellulose up to 20%, with optimal substrate 3.8% and 87.5 U/g endo-β-1,4-xylanase. The efficiency of hydrolysis by enzymes from T. aurantiacus was superior to commercial extracts, and showed ability to degrade hemicelluloses of different compositions (birchwood and oat spelt). The structural differences, such as branches and lignin content did not affect the action of these enzymes. The differences in the efficiency and extent of enzymatic hydrolysis by enzymes of these fungi might have occurred in function of differences in physicochemical properties and specific activity. The enzymatic hydrolysis was more appropriate for production of XOs than autohydrolysis, which generated predominantly xylose and formation of furfural. Despite of short reaction time, the production of XOs was low and purification is needed in order to obtain a final product with desirable characteristics. Keywordes: Xylooligosaccharides. Hemicellulose. Thermoascus aurantiacus. Enzymatic hydrolysis. Bioconversion. Endo-β-1,4-xylanase.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura da celulose (FENGEL; WEGENER, 1984). .............................................. 20Figura 2. Estrutura dos monossacarídeos da hemicelulose (FENGEL; WEGENER, 1984). ... 21Figura 3. A - Estrutura esquemática de hemicelulose (ARO; PAKULA; PENTTILÄ, 2004),

B- estrutura representativa de L-arabino-(4-O-metil-D-glucurono)-D-xilana: 1- Xilopiranose; 2- L-arabinofuranose; 3- ácido 4-O-metil-glucurônico; 4- grupo acetil (McDOUGALL et al., 1993). ....................................................................................... 23

Figura 4. Álcoois precursores da lignina (FENGEL; WEGENER, 1984). .............................. 24Figura 5. Estruturas propostas para as diferentes ligações entre lignina e carboidratos

(adaptado: WATANABE, 2003). ................................................................................. 25Figura 6. Sequência de reações de degradação de lignina em meio alcalino (XIANG; LEE,

2000). ............................................................................................................................ 31Figura 7. Mecanismo oxidativo de clivagem de carboidratos por radicais hidroxilas (GUAY et

al., 2001). ...................................................................................................................... 32Figura 8. Mecanismo proposto para formação de celobiose por radicais hidroxilas a partir de

metil-β-celobiose (GUAY et al., 2001). ....................................................................... 32Figura 9. Thermoascus aurantiacus ATCC 204492. (A) Crescimento em ága-malte; (B) Hifas

e esporos; (C) Ascósporos; (D) Liberação dos esporos por rompimento do ascósporo. (ampliação de 400 vezes). ............................................................................................. 37

Figura 10. Representação esquemática dos procedimentos utilizados para separação dos constituintes principais do bagaço de cana-de-açúcar e extração alcalina da hemicelulose. ................................................................................................................ 53

Figura 11. Superfície de resposta mostrando o efeito do peróxido de hidrogênio (x2) e tempo de reação (x3) no rendimento de hemicelulose. ............................................................ 70

Figura 12. Superfície de resposta descrita pelo modelo linear para o teor de lignina residual na hemicelulose em função das variáveis significativas. .................................................. 72

Figura 13. Aspecto visual das hemiceluloses obtidas dos experimentos relativos ao planejamento 24 completo. ............................................................................................ 74

Figura 14. Espectro de FT-IR das hemiceluloses obtida por extração com H2O2 em meio alcalino (Os números 1, 3, 12, 16 e 17 são referentes aos experimentos do planejamento experimental 24 completo). .................................................................... 76

Figura 15. Análise dos componentes principais do espectro de FT-IR da hemicelulose obtida com H2O2 em meio alcalino (Os números 1, 3, 12, 16 e 17 são referentes aos experimentos do planejamento completo 24). ............................................................... 77

Figura 16. Valores de contrastes entre PC1 e PC2 do espectro de FT-IR das amostras de hemicelulose extraídas com peróxido de hidrogênio em meio alcalino. ...................... 77

Figura 17: pH final do meio de cultivo de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei . .................... 79Figura 18. Produção de xilanase por A. niger, T. aurantiacus e T. reesei em meio sólido com

farelo de trigo (75 % umidade). .................................................................................... 80Figura 19. Produção de endoglucanase por A. niger e T. aurantiacus em meio sólido com

farelo de trigo (75 % umidade). .................................................................................... 81Figura 20. Produção de β-xilosidase por A. niger e T. aurantiacus em meio sólido com farelo

de trigo (75 % umidade). .............................................................................................. 82Figura 21. Atividades enzimáticas de T. aurantiacus detectadas no meio com xilose ( ),

xilobiose ( ) e HXSB. Atividade enzimática detectada nos cultivos: xilanase ( ), β-xilosidase ( ), endo-glucanase ( ), β-glucosidase ( ), arabinofuranosidase ( ). ........................................................................................... 84

Figura 22. Efeito do pH na atividade de xilanase de A niger, T. aurantiacus e T. reesei cultivados em farelo de trigo. ....................................................................................... 85

Figura 23. Efeito da temperatura na atividade de xilanase de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei cultivados em farelo de trigo. ............................................................................ 86

Figura 24. Estabilidade térmica a 50 e 60°C da xilanase de T. aurantiacus cultivado em farelo de trigo. ........................................................................................................................ 87

Figura 25. Estabilidade térmica a 70°C da xilanase de T. aurantiacus cultivado em farelo de trigo. .............................................................................................................................88

Figura 26. Estabilidade térmica a 40 e 50°C da xilanase de A. niger cultivado em farelo de trigo. .............................................................................................................................88

Figura 27. Estabilidade térmica a 40 e 50°C da xilanase de T. reesei cultivado em farelo de trigo. .............................................................................................................................89

Figura 28. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana em xilose durante a hidrólise com extrato enzimático de T. aurantiacus em diferentes concentrações de substrato e enzima. ......................................................................................................................... 94

Figura 29. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana em xilose durante a hidrólise com extrato enzimático de T. reesei em diferentes concentrações de substrato e enzima. .. 95

Figura 30. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar em xilobiose pelas enzimas de T. aurantiacus. ........................................................................................... 96

Figura 31. Conversão total durante hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com enzimas de T. aurantiacus. ................................................................................... 97

Figura 32. (A) Superfície de resposta; (B) Gráfico de contorno descrito pelo modelo que representa a conversão de hemicelulose em XOs, obtido pela hidrólise com enzimas de T. aurantiacus. ............................................................................................................. 99

Figura 33. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar em xilobiose pelas enzimas de T. reesei. .................................................................................................. 101

Figura 34. Conversão total durante a hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com enzimas de T. reesei. .......................................................................................... 102

Figura 35. (A) Superfície de resposta; (B) Gráfico de contorno descrito pelo modelo que representa a conversão de hemicelulose (2 – 5 %) em XOs, obtido pela hidrólise com extrato de T. reesei (60 – 100 U/g). ........................................................................... 105

Figura 36. Espectro de infravermelho das amostras de hemicelulose de bagaço e dos resíduos sólidos obtidos após hidrólise com enzimas de T. aurantiacus (60 U/g de xilanase, 2 % de hemicelulose por 96 h) e T. reesei (80 U/g de xilanase, 3,5% de hemicelulose por 6 h). 107

Figura 37: Cromatografia em camada delgada dos produtos da hidrólise de hemiceluloses de bagaço, bétula e semente de aveia por extrato de T. aurantiacus após 96 h de reação. (1: padrões, 2: xilana do bagaço + 10 U/g endo-xilanase; 3: xilana do bagaço + 30 U/g endo-xilanase; 4: xilana bétula + 10 U/g endo-xilanase; 5: xilana bétula + 30 U/g; 6: xilana de semente de aveia + 10U/g endo-xilanase; 7: xilana de semente de aveia + 30 U/g endo-xilanase; 8: xilana do bagaço; 9: xilana bétula; 10: xilana de semente de aveia). ......................................................................................................................... 111

Figura 38: Cromatografia em camada delgada dos produtos da hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com enzimas de T. aurantiacus. (1: padrões; 2: ácido aldourônico; 3: hidrolisado com 3 h de reação; 4: 6 h; 5: 48 h; 6: 96 h; 7: extrato enzimático; 8: hemicelulose do bagaço). ................................................................... 112

Figura 39. Cromatografia em camada delgada dos produtos da hidrólise de xilo-oligossacarideos (Amostra) obtidos da ação da xilanase de T. aurantiacus sobre a hemicelulose do bagaço. (1: padrões; 2: aldotetraurônico; 3: Amostra + endo-xilanase da família 5 (EX5); 4: Amostra + EX10; 5:Amostra + EX11; 6: Amostra + EX5 + β -xilosidase; 7: Amostra + EX10 + β-xilosidase; 8:Amostra + EX11 + β-xilosidase; 9: Amostra + β-xilosidase; 10: β-xilosidase). ................................................................ 112

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Planejamento fatorial completo 24 para avaliação do processo de extração da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar sob diferentes condições operacionais. . 54

Tabela 2- Planejamento fatorial completo 22 para avaliação da hidrólise enzimática da hemicelulose. .............................................................................................................. 59

Tabela 3- Composição química do bagaço de cana-de-açúcar. .................................................. 63Tabela 4- Composição do bagaço de cana-de-açúcar de diferentes procedências. ..................... 64Tabela 5- Rendimento de extração e composição da hemicelulose obtida com NaOH 1 M,

NaOH/AQ e NaOH/Sulfito a 25°C por 18 h. ............................................................. 65Tabela 6. Rendimento de hemicelulose (%) extraída do bagaço de cana-de-açúcar com H2O2

em meio alcalino proveniente do planejamento 24 completo. .................................... 67Tabela 7 - Significância estatística dos efeitos das variáveis sobre o rendimento de extração de

hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com H2O2 em meio alcalino. ................. 68Tabela 8 - Significância estatística dos efeitos das variáveis sobre o teor de lignina residual da

hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar. ............................................................... 71Tabela 9- Análise de variância para os modelos estatísticos correspondentes às variáveis

respostas: rendimento de extração e lignina residual da hemicelulose, em função das variáveis estudadas. .................................................................................................... 71

Tabela 10- Composição química da hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar com H2O2 em meio alcalino proveniente do planejamento 24 completo. .......................... 73

Tabela 11. Massa molar média (Mw), massa molar numérica média (Mn) e polidispersidade (Mw/Mn) das frações de hemicelulose extraídas do bagaço de cana-de-açúcar. ....... 78

Tabela 12- Linhagens de Aspergilus sp produtoras de xilanase. ................................................ 80Tabela 13 - Linhagens de T. aurantiacus produtoras de xilanase. .............................................. 80Tabela 14: Atividades enzimáticas de A. niger, T. aurantiacus, T. reesei e de preparados

comerciais aplicadas na hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar. .... 91Tabela 15- Efeito da carga enzimática na hidrólise da hemicelulose do bagaço (2 % m/v) pelos

extratos de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei, após 24 h de reação. ....................... 91Tabela 16. Hidrólise da xilana do bagaço com xilanase (60 U/g) de T. aurantiacus. ................ 92Tabela 17. Hidrólise da xilana do bagaço com xilanase (60 U/g) de T. reesei. .......................... 93Tabela 18- Matriz do planejamento experimental completo 22 com face centrada e 3 repetições

no ponto central, aplicado para avaliação da influência da concentração de substrato (V1) e carga de enzima (T. aurantiacus) (V2) na conversão da hemicelulose em XOs após 96 h de reação. ................................................................................................... 98

Tabela 19- Análise de variância dos efeitos principais e interação dos fatores sobre a conversão da hemicelulose em XOs pelo extrato de T. aurantiacus após 96 h de reação. ......... 98

Tabela 20- Conversão da hemicelulose em XOs com extrato de T. reesei em função do tempo segundo o planejamento 22 completo. ...................................................................... 103

Tabela 21- Matriz do planejamento experimental completo 22 com face centrada e 3 repetições no ponto central, aplicado para avaliação da influência da concentração de substrato (V1) e carga de enzima (T. reesei) (V2) na conversão da hemicelulose em XOs após 6 h de reação. ............................................................................................................... 104

Tabela 22- Análise de variância dos efeitos principais e interação dos fatores (2-5% substrato e 60-100 U/g enzima) sobre a conversão da hemicelulose em XOs pelo extrato de T. reesei após 6 h de reação. ......................................................................................... 104

Tabela 23- Produtos de hidrólise da hemicelulose (2 % m/v) do bagaço de cana-de-açúcar por xilanases comerciais (80 U/g). ................................................................................. 108

Tabela 24 – Hidrólise enzimática de diferentes hemiceluloses (2,6 %) pelas enzimas de T. aurantiacus em 96 h de reação. ............................................................................... 110

Tabela 25- Composição química do bagaço após auto-hidrólise a 190°C, 10 % (m/v). .......... 113Tabela 26- Produtos da auto-hidrólise (190°C, 10 % m/v) do bagaço de cana-de-açúcar

presentes na fração líquida. ...................................................................................... 114

ABREVIATURAS

AQ Antraquinona

BCA Bagaço de cana-de-açúcar

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

DNS Ácido dinitrossalicílico

EX10 Endoxilanase da família 10

EX11 Endoxilanase da família 11

EX5 Endoxilanase da família 5

FOs Fruto-oligossacarídeos

FT-IR Espectroscopia de infravermelho médio

gp Grau de polimerização

HBCA Hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar

LCC Complexo lignina-carboidrato

PCA Análise de componentes principais

t 1/2 Tempo de meia vida

TLC Cromatografia de camada delgada

X1 Xilose

X2 Xilobiose

X3 Xilotriose

X4 Xilotetraose

X5 Xilopentaose

XOs Xilo-oligossacarídeos

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 172. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 192.1 COMPOSIÇÃO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR .............................................. 192.1.1 Celulose ........................................................................................................................... 202.1.2 Hemicelulose (Polioses) .................................................................................................. 202.1.3 Lignina ............................................................................................................................. 232.2 PRÉ-TRATAMENTO DE MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS .................................. 262.2.1 Auto-hidrólise .................................................................................................................. 262.2.2 Processo alcalino ............................................................................................................. 292.2.2.1 Processo alcalino oxidativo .......................................................................................... 302.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE POLISSACARÍDEOS .................................................. 332.3.1 Hidrólise enzimática de xilanas ....................................................................................... 342.4 PRODUÇÃO DE XILANASES ......................................................................................... 352.4.1 Hemicelulases de Aspergillus niger ................................................................................ 362.4.2 Hemicelulases de Thermoascus aurantiacus ................................................................... 362.4.3 Hemicelulases de Trichoderma reesei ............................................................................. 392.5 PRODUÇÃO DE XILO-OLIGOSSACARÍDEOS ............................................................ 402.6 PROPRIEDADES E APLICAÇÕES DE XILO-OLIGOSSACARÍDEOS ....................... 432.7 PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE XOs .......................................................... 463. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 483.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 483.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 484. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................. 494.1 PRODUÇÃO DE ENZIMAS ............................................................................................. 494.2 ENZIMAS COMERCIAIS ................................................................................................. 494.3 DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS .............................................. 504.3.1 Endo-β-1,4-xilanase ......................................................................................................... 504.3.2 Endo-β-1,4-glucanase ...................................................................................................... 504.3.3 β-xilosidase ...................................................................................................................... 514.3.4 α-L-arabinofuranosidase ................................................................................................. 514.3.5 Efeito do pH na atividade de xilanase ............................................................................. 514.3.6 Efeito da temperatura na atividade e na estabilidade da xilanase .................................... 524.4 EXTRAÇÃO DE HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR COM

NaOH ................................................................................................................................ 524.5 EXTRAÇÃO DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR COM

H2O2 EM MEIO ALCALINO .......................................................................................... 544.6 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO BAGAÇO E DA HEMICELULOSE ................... 554.6.1 Determinação do teor de cinzas ....................................................................................... 554.6.2 Determinação de ácidos urônicos .................................................................................... 564.7 EFICIÊNCIA DA EXTRAÇÃO DE HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-

AÇÚCAR ......................................................................................................................... 564.8 SOLUBILIDADE DA HEMICELULOSE ....................................................................... 574.9 ANÁLISE DA HEMICELULOSE POR ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO 574.10 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLAR DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE

CANA ............................................................................................................................... 574.11 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA HEMICELULOSE EXTRAÍDA DO BAGAÇO DE

CANA-DE-AÇÚCAR ...................................................................................................... 584.12 HIDRÓLISES ENZIMÁTICAS SUCESSIVAS DA HEMICELULOSE ....................... 594.13 AUTO-HIDRÓLISE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR ..................................... 59

4.14 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS .................. 604.15 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES, ÁCIDO ACÉTICO E

FURFURAL ..................................................................................................................... 604.16 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (TLC) ............................................. 614.17 ENSAIOS DE INDUÇÃO DE ENZIMAS DE T. aurantiacus ....................................... 615. RESULTADOS .................................................................................................................... 635.1 EXTRAÇÃO DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR ........... 635.1.1 Análise química do bagaço de cana-de-açúcar ............................................................... 635.1.2 Extração alcalina da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar ................................... 645.1.3 Otimização da extração da hemicelulose ........................................................................ 665.1.4 Avaliação do teor de lignina residual na hemicelulose ................................................... 705.1.5 Caracterização das hemiceluloses ................................................................................... 735.1.5.1 Análise espectroscópica (infravermelho médio) da hemicelulose do bagaço de cana-

de-açúcar .......................................................................................................................... 755.1.5.2 Determinação da massa molar da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar ........... 785.2 PRODUÇÃO DE CELULASES E HEMICELULASES ................................................. 795.2.1 Indução das enzimas de T. aurantiacus por sacarídeos relacionados à hemicelulose .... 825.2.2 Efeito do pH e temperatura na atividade enzimática de endo-xilanase .......................... 855.2.3 Estabilidade térmica da endo-β-1,4-xilanase .................................................................. 865.2.3.1 Thermoascus aurantiacus ............................................................................................ 865.2.3.2 Aspergilus niger ........................................................................................................... 885.2.3.3 Trichoderma reesei ...................................................................................................... 895.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-

AÇÚCAR ......................................................................................................................... 895.3.1 Efeito da carga enzimática na produção de XOs ........................................................... 905.3.2 Efeito do tempo na produção de XOs ............................................................................. 925.3.3 Otimização da hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar ................................. 935.3.3.1 Produção de xilose ....................................................................................................... 935.3.3.2 Produção de xilo-oligossacarídeos ............................................................................... 955.3.3.2.1 Hidrólise da hemicelulose com as enzimas de T. aurantiacus ................................. 955.3.3.2.2 Hidrólise da hemicelulose com enzimas de T. reesei ............................................. 1005.3.4 Hidrólise enzimática sucessiva da hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar ........... 1065.3.5 Hidrólise da hemicelulose do bagaço com xilanases comerciais .................................. 1075.3.6 Hidrólise enzimática de diferentes xilanas com enzimas de T. aurantiacus ................ 1095.3.6.1 Identificação por cromatografia em camada delgada (TLC) dos produtos de hidrólise

da hemicelulose .............................................................................................................. 1105.4 AUTO-HIDRÓLISE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR .................................... 1136. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 115REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 117ANEXO .................................................................................................................................. 137

17

1. INTRODUÇÃO

Os materiais lignocelulósicos representam uma fonte de matéria prima praticamente

sub-explorada em processos biotecnológicos. Seu uso está baseado principalmente na geração

de energia através da queima e na alimentação animal, entretanto, novas aplicações estão

surgindo e proporcionado um melhor aproveitamento desses materiais.

Atualmente, a conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentescíveis para

produção de combustíveis vem sendo considerada como uma alternativa promissora para

aumentar a produção de etanol visando atender à demanda mundial. Para chegar à celulose, a

qual é o principal composto da parede celular vegetal, deve-se remover as hemiceluloses que

recobrem as microfibrilas. As operações empregadas no fracionamento do bagaço de cana-de-

açúcar dependem da finalidade do processo, ou seja, o que se deseja obter destas frações. Tais

operações implicam em tratamentos físicos e/ou químicos, os quais têm sido objeto de muitos

estudos. O pré-tratamento do bagaço, em condições alcalinas com temperatura e pressão

moderadas é considerado uma etapa importante para a recuperação da hemicelulose,

entretanto, a maioria dos trabalhos relacionados à extração não informa características como

solubilidade, um importante fator para aplicação desse polissacarídeo como em hidrólise

enzimática. Há necessidade de estudos visando à otimização da extração de hemicelulose,

mas que apresente características adequadas. Após uma revisão da literatura constatou-se que

existem poucas informações referentes ao uso de peróxido de hidrogênio nesse processo, o

que justifica uma investigação mais detalhada que leve a melhores resultados.

Dentre muitas aplicações biotecnológicas, a hemicelulose pode ser empregada na

confecção de biofilmes e como aditivos na fabricação de papel. Na sua forma hidrolisada, é

aplicada como oligossacarídeos para fins terapêuticos e analíticos ou na forma de monômeros

para a produção de xilitol. A busca por um estilo de vida saudável através de cuidados com a

alimentação tem impulsionado o interesse por alimentos funcionais, ou seja, àqueles que

auxiliam o bom funcionamento do organismo. Entre esses componentes destacam-se os

oligossacarídeos de xilose (XOs), aos quais se atribuem diversos efeitos benéficos, como a

prevenção de cáries, a diminuição de níveis séricos de colesterol e o estímulo do crescimento

de bifidobactérias no trato gastrointestinal. O seu efeito benéfico à saúde está relacionado às

suas propriedades físico-químicas, por serem moderadamente doces, estáveis em uma ampla

faixa de pH e temperatura e conferirem características organolépticas aos alimentos.

Considerando que as operações de fracionamento do material lignocelulósico

contribuem para o alto custo do processo, a auto-hidrólise do bagaço seria uma forma

18

alternativa de se produzir oligossacarídeos. Entretanto, a hidrólise enzimática da hemicelulose

pode permitir a obtenção de xilo-oligossacarídeos de forma controlada e em maior

concentração quando comparada à auto-hidrólise. As condições reacionais e a ação de

xilanases com propriedades diferentes são importantes para a obtenção de xilo-

oligossacarídeos, pois seu uso controlado pode favorecer a obtenção de produtos com graus

de polimerização e ramificações distintos.

A utilização de xilo-oligossacarídeos é uma realidade em poucos países. No Japão, por

exemplo, essas substâncias já são comumente empregadas em vários produtos alimentícios

para humanos e animais. Além do efeito prebiótico, os XOs tem apresentado uma variedade

de aplicações, tais como, antioxidantes, antialérgicos e na prevenção de anemia e

arteriosclerose. Com o desenvolvimento de uma metodologia eficiente para a produção de

hemicelulose e XOs a partir de materiais lignocelulósicos, como o bagaço de cana-de-açúcar,

espera-se impulsionar o desenvolvimento de muitos estudos relacionados às suas aplicações.

19

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 COMPOSIÇÃO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

Entre os materiais lignocelulósicos destaca-se no Brasil o bagaço de cana-de-açúcar

(que representa de 10 a 16% da planta), do qual 50 (FROLLINI; PIMENTA, 1997) a 90%

(GONÇALVES; ESPOSITO; BENAR, 1998) é utilizado para produção de energia por meio

da co-geração, tornando a usina auto-sustentável energeticamente. Em 2006 o Brasil contava

com 355 usinas de açúcar e álcool e previa-se até 2010 cerca de 89 novas usinas seriam

instaladas no país (OLIVEIRA e VASCONCELOS, 2006). A safra de cana-de-açúcar de 2009

foi de 629 milhões de toneladas (CONAB, 2009), uma tonelada de cana gera 140 quilos de

bagaço e 140 quilos de palha (RODRIGUES et al., 2003), sendo seu custo em torno de US$

15 por tonelada (MARQUES, 2009). O material fibroso, obtido após a moagem da cana para

a extração do caldo, é composto de água (46-52 %), fibras (43-52 %) e pequenas quantidades

de sólidos (2-6 %), sendo essa composição dependente da espécie, do tempo de cultivo, do

método de colheita e da eficiência da moagem (CARVALHO, 2000).

Quimicamente o bagaço apresenta um conteúdo de 46,2 % de celulose, 27,8 % de

hemicelulose, 21,1 % de lignina e 1 % de cinzas (SANTOS et al., 2009). Substâncias

orgânicas de baixa massa molar, denominadas de extrativos, estão associadas à estrutura

lignocelulósica. Estas substâncias não estão ligadas quimicamente a matriz lignocelulósica e

localizam-se em canais de resina e células de parênquima. Os extrativos são compostos por

uma série de componentes como resinas (terpenos, lignanas e outros compostos aromáticos),

ácidos graxos, álcoois, taninos, flavonóides, entre outros (FENGEL; WEGENER, 1984).

As características morfológicas atribuídas aos componentes da parede celular do

material lignocelulósico são responsáveis pela dificuldade em empregá-los como matéria

prima. Naturalmente, os lignocelulósicos são resistentes à degradação enzimática ou

microbiana, o que ocorre graças à organização dos componentes, onde a celulose encontra-se

embebida em uma matriz composta por hemicelulose e lignina. A hemicelulose está

quimicamente ligada à lignina, enquanto que sua associação à celulose é feita por interações

físicas (FENGEL; WEGENER, 1984).

20

2.1.1 Celulose

A celulose é o principal constituinte da parede celular vegetal, composta por uma

cadeia linear de 7000 a 15000 resíduos de glicose unidos por ligações glicosídicas β -1,4, sem

ramificações. A ligação do tipo β provoca uma rotação de 180 graus alternando a unidade de

glicose, resultando em uma cadeia linear (Figura 1) (FENGEL; WEGENER, 1984).

Em função da sua linearidade, as moléculas de celulose apresentam tendência em

formar pontes de hidrogênio inter e intramolecular. Existem pontes de hidrogênio entre

grupos OH de unidades de glicose adjacentes da mesma molécula de celulose (ligação

intramolecular – responsável pela rigidez) e entre grupos OH de moléculas adjacentes de

celulose (ligação intermolecular – responsável pela formação da estrutura supramolecular).

Assim, feixes de moléculas de celulose se agregam na forma de microfibrilas, as quais

formam regiões altamente ordenadas (cristalinas) e regiões menos ordenadas (amorfas). As

microfibrilas se organizam em fibrilas e estas originam as fibras celulósicas. Devido a

estrutura fibrosa a celulose possui resistência à tração e é insolúvel na maioria dos solventes

(FENGEL; WEGENER, 1984).

Figura 1. Estrutura da celulose (FENGEL; WEGENER, 1984).

2.1.2 Hemicelulose (Polioses)

Hemiceluloses, em geral, são constituídas de 80 a 200 unidades de resíduos de açúcar,

dos quais se destacam as pentoses (D-xilose, L-arabinose e L-ramnose), hexoses (D-glicose,

D-manose e D-galactose) e ácidos urônicos (ácidos 4-O-metil-D-glucurônico e D-

galacturônico) (Figura 2) (TIMELL, 1964). A cadeia de hemicelulose pode ser constituída por

um único monossacarídeo (xilanas) ou por duas ou mais unidades (xiloglucanas, 4-O-metil-

glucuronoxilana). A constituição desse polissacarídeo tem relação com o tipo de tecido

21

vegetal que faz parte e da espécie de planta a que pertence (FENGEL; WEGENER, 1984).

As ramificações da cadeia principal determinam a solubilidade, a conformação física

da molécula com os demais componentes lignocelulósicos e influenciam no modo e na

extensão da hidrólise enzimática (KULKARNI; SHENDYE; RAO, 1999). Ainda, comparada

à celulose, apresenta maior reatividade devido à maior acessibilidade pelos reagentes, por

exemplo, na hidrólise ácida, por ser relativamente amorfa e apresentar grande

polidispersidade (FENGEL; WEGENER, 1984).

Figura 2. Estrutura dos monossacarídeos da hemicelulose (FENGEL; WEGENER, 1984).

Apesar de apresentar estrutura amorfa, a hemicelulose é capaz de formar ligações de

hidrogênio e possui tendência a cristalizar após a remoção das cadeias laterais. Os grupos

substituintes, arabinosil e acetil, diminuem a adsorção da hemicelulose à celulose (KABEL et

al., 2007). A partir dessas propriedades tem se verificado que a adição de hemicelulose a

polpas celulósicas aumenta em até 30% as propriedades mecânicas, como a resistência ao

estouro (LIMA; OLIVEIRA; BUCKERIDGE, 2003). Tem-se avaliado a propriedade da

hemicelulose em formar filmes quando combinada com pequenas concentrações de quitosana

22

(5 a 10%). A adição desses níveis de quitosana à hemicelulose aumenta a cristalinidade do

filme devido às interações entre grupos ácidos da xilana e grupos amino da quitosana

(GABRIELII et al., 2000).

Em materiais lignocelulósicos a hemicelulose apresenta grande variação de proporção

e conteúdo, dependendo da espécie, do tipo de tecido, estágio de crescimento, condições

ambientais e fisiológicas. Existe uma grande variedade no conteúdo e composição da

hemicelulose nos talos, folhas, raízes e casca. Por exemplo, a hemicelulose do trigo apresenta

diferentes graus de substituição entre os tecidos. A relação arabinose/xilose é igual a 1,

quando se analisa a parte externa do grão (pericarpo), enquanto que a parte interna apresenta

baixo grau de substituição (0,3) (BRILLOUET; JOSELEAU, 1987).

A xilana é a hemicelulose presente em maior proporção no bagaço, é o segundo

polissacarídeo mais abundante encontrado na natureza, correspondendo a aproximadamente

um terço da fonte de carbono renovável do planeta (COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005).

Xilana de gramíneas, citando o exemplo do bagaço de cana e cereais, apresenta uma cadeia

linear constituída de D-xilopiranosil com ligações β-D-(1,4), podendo ser substituída com α-

L-arabinofuranosil no carbono 2 ou 3, o qual pode apresentar ligações éster com ácido

cumárico e ferúlico (WENDE; FRY, 1997). Aparecem também como substituintes no carbono

2 α-D-glucuronopiranosil ou unidades derivadas de 4-O-metil (CARPITA; GIBEAUT, 1993).

A figura 3 mostra uma representação esquemática de uma hemicelulose com suas

ramificações.

Estudos realizados através de Ressonância Nuclear Magnética (1H e 13C) da

hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar definiram sua estrutura como L-arabino-(4-O-

metil-D-glucurono)-D-xilana com ácido ferúlico e cumárico quimicamente ligados (SUN et

al., 2004a). Outro lignocelulósico abundante, a palha de trigo, apresenta hemicelulose

definida como β-D-xilana substituída no carbono 2 com ácido D-glucurônico ou ácido 4-O-

metil-α-glucurônico e L-arabinofuranosil no carbono 3. A cada 26 xiloses na cadeia principal

existe um ácido urônico e a cada 13 xiloses existe uma arabinose (SUN; LAWTHER;

BANKS, 1996).

23

A

B

Figura 3. A - Estrutura esquemática de hemicelulose (ARO; PAKULA; PENTTILÄ, 2004), B- estrutura representativa de L-arabino-(4-O-metil-D-glucurono)-D-xilana: 1- Xilopiranose; 2- L-arabinofuranose; 3- ácido 4-O-metil-glucurônico; 4- grupo acetil (McDOUGALL et al., 1993).

2.1.3 Lignina

A lignina é composta basicamente de unidades de fenilpropano: unidades guaiacil (G),

unidades siringil (S) e unidades p-hidroxifenil (H). O acoplamento das unidades fenilpropano

não ocorre de forma regular e repetitiva, devido ao mecanismo de biossíntese, que se processa

via radicalar a partir da reação de três álcoois cinamílicos precursores (Figura 4), formando

uma macromolécula tridimensional e amorfa (FENGEL; WEGENER, 1984). Sua composição

varia entre os diversos grupos de plantas: em gimnospermas predomina o tipo G (guaiacila),

em angiospermas, G-S (guaiacila-siringila) e em gramíneas como o bagaço de cana-de-açúcar,

destaca-se a lignina tipo G-S-H (guaiacila-siringila-p-hidroxifenila) (HIGUCHI, 2006). Nas

gramíneas, a lignina incorpora níveis similares de G e S e possuem mais resíduos H do que

dicotiledôneas (BAUCHER et al. 2003).

24

Figura 4. Álcoois precursores da lignina (FENGEL; WEGENER, 1984).

Na estrutura da célula vegetal a lignina está ligada à hemicelulose através de ligações

covalentes. Durante a biossíntese da parede celular, arabinoxilanas com grupos ferulatos são

ligadas pela junção dos ferulatos em diferulato e pela copolimerização de ferulato e diferulato

com monolignóis (GRABBER; RALPH; HATFIELD, 2002) caracterizando o complexo

lignina-carboidrato (LCC) (LAWOKO; HENRIKSSON; GELLERSTED, 2003; WALLACE

et al., 1995). As ligações éster são hidrolisadas facilmente em condições alcalinas, entretanto

as ligações benzil éter são estáveis. De acordo com Watanabe (2003), lignina e carboidratos

podem estar ligados das seguintes formas (Figura 5):

I) ligação benzil éter entre grupos α-hidroxil da lignina com um grupo hidroxil de

carboidrato;

II) ligação benzil éster entre grupos α-hidroxil da lignina com um grupo de ácido

carboxílico de carboidrato;

III) ligação glicosídica entre grupo hidroxil alifático ou aromático de lignina com um

terminal redutor de carboidrato;

IV) ligação acetal entre grupo carbonil da lignina com dois grupos hidroxil de

carboidrato.

25

Figura 5. Estruturas propostas para as diferentes ligações entre lignina e carboidratos

(adaptado: WATANABE, 2003).

A lignina apresenta importante papel no desenvolvimento de plantas, contribui como

força mecânica e as protege contra o ataque de insetos e fungos. Do ponto de vista da

característica da fibra, a lignina representa um dos principais entraves para processos

industriais como a polpação da madeira para fabricação de papel e para produção de açúcares

solúveis a partir de biomassa vegetal. Para viabilizar o emprego dos materiais lignocelulósicos

na biotecnologia é interessante que a lignina seja removida, podendo ser utilizada em

aplicações específicas como produção de quelantes através de oxidação enzimática

(GONÇALVES; OVIEDO, 2002), produção de adesivos para madeira (EL MANSOURI;

SALVADÓ, 2006), vanilina e ácido gálico (HOWARD et al. 2003; PRIEFERT;

RABENHORST; STEINBÜCHEL, 2001).

26

2.2 PRÉ-TRATAMENTO DE MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

A estrutura dos materiais lignocelulósicos os torna resistente à degradação tanto dos

polissacarídeos quanto da lignina. A heterogeneidade dos materiais lignocelulósicos, sua

composição química e características físicas são pontos críticos no isolamento de seus

componentes, sendo necessário às vezes, uma combinação de vários procedimentos

(CONVERSE; OOSHIMA; BURNS, 1990).

A alteração nas características estruturais da matriz lignocelulósica pode ser feita por

diversos pré-tratamentos, os quais são classificados em físicos, químicos, físico-químicos e

biológicos. O pré-tratamento deve ser escolhido com base no componente que se deseja isolar,

e se será mantida ou não a sua integridade física. De modo geral, é desejável que o pré-

tratamento apresente características operacionais e efeitos como: a) produção de fibras

reativas, b) rendimento em pentose não degradada, c) não produza compostos de degradação

que possam inibir fermentações, d) que possa trabalhar em reator de tamanho razoável com

custo moderado, e) não produza resíduos sólidos, e) que tenha um alto grau de simplicidade

(LYND; ELANDER; WYMAN, 1996).

Tratamentos com ácido geralmente removem a hemicelulose e, em função da

severidade, atacam também a celulose e lignina, enquanto os tratamentos com álcali permitem

separar a hemicelulose e lignina da celulose sem degradar os polissacarídeos. Entretanto, em

condições extremas de alcalinidade e temperatura podem ocorrer reações de degradação dos

polissacarídeos.

Será apresentada uma revisão da literatura sobre dois pré-tratamentos utilizados nesse

trabalho: auto-hidrólise e processo alcalino. Na auto-hidrólise será dada ênfase à hidrólise da

hemicelulose e no processo alcalino ao uso de peróxido de hidrogênio.

2.2.1 Auto-hidrólise

A auto-hidrólise é um tratamento hidrotérmico realizado em temperaturas entre 150 e

220°C, em reatores batelada com controle de temperatura e pressão (GARROTE;

DOMINGUEZ; PARAJÓ, 2002a). O reator é preenchido com o material no estado sólido

adicionado de água e as reações são conduzidas em temperatura e tempo pré-fixados

(LADISCH; BREWER; HENDRICKSON, 1997; LYND et al., 1997). Nesse tratamento

ocorre fracionamento do material lignocelulósico (GARROTE; DOMINGUEZ; PARAJÓ,

27

1999). A hemicelulose pode ser completamente solubilizada, grupos acetil são clivados e

pequenas alterações são causadas na lignina e celulose (CONNER; LORENZ, 1986).

Tradicionalmente, a auto-hidrólise é aplicada em subprodutos agrícolas, nos quais as

hemiceluloses são principalmente xilanas (GARROTE; DOMINGUEZ; PARAJÓ, 1999).

Os licores típicos de auto-hidrólise contêm uma mistura de oligômeros de açúcares

(principalmente xilo-oligômeros), monossacarídeos (principalmente xilose), ácido acético,

produtos da decomposição de açúcar, tais como furfural e hidroximetilfurfural. Sob condições

operacionais severas, reações de condensação entre furfural, lignina e/ou reações

intermediárias podem ocorrer (DEKKER; WALLIS, 1983; LORA; WAYMAN, 1978;

MUZZY et al., 1983). Em condições de hidrólise mais brandas os produtos de decomposição

de açúcar são produzidos em menores quantidades, porém ocorre um menor rendimento nos

produtos de interesse, sendo necessário efetuar uma nova hidrólise do material.

Os xilo-oligossacarídeos obtidos por auto-hidrólise apresentam estrutura mais conservada

em relação à forma nativa da xilana, quando comparado a outros métodos. Por exemplo, em

tratamentos hidrotérmicos somente parte dos grupos ésteres são removidos, enquanto que em

processos alcalinos ocorre saponificação desse grupo (MOURE et al., 2006).

A temperatura e tempo de reação são as principais variáveis no processo de auto-

hidrólise. Através da relação entre essas duas variáveis determina-se o fator de severidade do

processo, o qual apresenta efeito direto sobre a acidificação do meio pela clivagem dos grupos

acetil, geração dos produtos de degradação de açúcares e grau de polimerização dos XOs

(GARROTE; DOMINGUEZ; PARAJÓ, 1999).

Em comparação com a hidrólise ácida, na qual um ácido mineral é adicionado no meio

de reação (MALONEY; CHAPMAN; BAKER, 1985; PARAJÓ; ALONSO; VÁZQUEZ,

1993; PARAJÓ; ALONSO; SANTOS, 1995; RANGANATHAN; MACDONALD;

BAKHSHI, 1985), na reação de auto-hidrólise a espécie catalítica vem do ácido acético

gerado dos grupos acetil (AOYAMA; SEKI; SAITO, 1995; BARNET; EXCOFFIER;

VIGNON, 1989; GARROTE; DOMINGUEZ; PARAJÓ, 1999; HEITZ et al., 1991;

OVEREND; CHORNET, 1989; WEIL et al., 1997).

Em termos comparativos de processo, tratamentos hidrotérmicos mostram vantagens em

relação às reações de hidrólise ácida, tais como a ausência de reagentes diferentes da água e

do material lignocelulósico (OVEREND; CHORNET, 1989), o que classifica esse processo

como ecologicamente correto (KUBIKOVA et al., 1996). Ainda, apresenta corrosão limitada

de equipamentos (ABATZOGLOU et al., 1992), como também a ausência de lamas

neutralizadoras (CONNER; LORENZ, 1986) e fases de recuperação de ácidos (SASKA;

28

OZER, 1995).

Uma diferença entre auto-hidrólise e a explosão a vapor (repentina descompressão do

reator no final do processo) é a quantidade e concentração de produtos solubilizados. Na auto-

hidrólise a quantidade de produtos é maior, enquanto que a concentração desses é baixa ao se

comparar com o tratamento a vapor, o que ocorre devido ao conteúdo de água empregado na

auto-hidrólise em relação ao tratamento a vapor (HENDRIKS; ZEEMAN, 2009). Outra

diferença é o teor dos produtos de degradação de açúcar, que são gerados em menor

quantidade na auto-hidrólise, em relação ao processo de explosão a vapor (TAHERZADEH;

KARIMI, 2008).

A auto-hidrólise de resíduo de cervejaria (bagaço de malte) a 190°C por 5 min de

reação produziu 61 % de XOs, com predominância de xilobiose (CARVALHEIRO et al.,

2004), experimentos realizados a 150°C por 20 min permitiram um maior acúmulo de

xilobiose e xilotriose. Os autores observaram que o aumento da temperatura reduziu a

distribuição de massa molar dos oligômeros e em tempo longo ocorreu o aumento de

conversão em monossacarídeos, com consequente diminuição dos XOs e acúmulo de

produtos de degradação de açúcares, como observado em outros trabalhos (AOYAMA; SEKI;

SAITO, 1995; GARROTE; DOMINGUEZ; PARAJÓ, 1999).

Arabinose e ácido metilglucurônico foram encontrados como produtos da auto-

hidrólise (160°C por 60-75 min) de farelo de trigo, resíduo de cervejaria e sabugo de milho.

Os XOs apresentaram estrutura variada em função da origem da xilana. XOs ramificados com

arabinose foram encontrados no hidrolisado de resíduo de cervejaria, e ramificados com ácido

4-O-metilglucurônico foram encontrados no hidrolisado de sabugo de milho e eucalipto. No

hidrolisado de eucalipto também foi encontrado XOs ramificados com grupos acetil (KABEL

et al., 2002).

Xilo-oligossacarídeos obtidos da auto-hidrólise de casca de amêndoas apresentaram

estrutura neutra e ácida (ácido 4-O-metilglucurônico) e pequena quantidade de grupos

fenólicos (NABARLATZ et al., 2007a). Os autores observaram que essa mistura de XOs

apresentou atividade indutiva sobre o sistema imunológico (proliferação de linfócitos-T) de

ratos, e ainda sugeriram que esse efeito pode ter sido potencializado pela presença de grupos

fenólicos.

29

2.2.2 Processo alcalino

Algumas bases também podem ser utilizadas para o pré-tratamento de materiais

lignocelulósicos e a sua eficácia depende do conteúdo de lignina presente na biomassa. A

ação alcalina é atribuída a uma saponificação da ligação éster que separa a hemicelulose da

lignina. Além disso, o tratamento da biomassa com uma solução de NaOH, provoca um

inchamento interno na estrutura da celulose e consequentemente aumenta a área superficial. O

inchamento reduz a interação entre a lignina e os carboidratos, causando ainda, rompimento

na estrutura da lignina que é solúvel nessas condições (WEIL et al., 1994). O tratamento

alcalino tem sido testado em resíduos como casca de trigo (85°C, 3 h), madeira (150°C, 6 h e

14 atm), grama (100°C por 2 h) e sabugo de milho (100°C, 13 h) (MOSIER et al., 2005).

As propriedades mecânicas da fibra do bagaço de cana-de-açúcar mudam após o

tratamento alcalino e em determinadas condições apresentam propriedades superiores à fibra

sem tratamento. Segundo Cao, Shibata e Fukumoto (2006), o tratamento do bagaço a 25°C

por 2 h em uma razão líquido/sólido de 20:1, com solução de NaOH 1 % (m/v), mostrou a

melhor transformação nas características físicas, elevando em 13 % a resistência à tração, 14

% em relação à flexão e 30 % na força de impacto. Um aumento na concentração de NaOH

para 3 % resultou em um leve aumento na flexão, no entanto, a resistência à tração diminuiu.

Uma maior concentração de NaOH (5 %) diminuiu tanto a resistência à flexão quanto à

tração.

Trabalho de Xu et al. (2006) com bagaço de cana-de-açúcar mostrou que em alta

concentração de hidróxido de sódio (1 M) obtém-se um baixo rendimento de extração da

hemicelulose (55,5 %), quando realizado a 25 °C. O rendimento aumentou para 62,1 % a

40°C. Os autores observaram, também, que o aumento da temperatura para 40°C promove

maior remoção da lignina do bagaço.

Em pH e temperatura elevados os carboidratos podem sofrer reações de degradação

que provocam a formação de extremidades redutoras e diminuição da massa molar. Para

minimizar tal degradação pode-se empregar antraquinona, a qual causa a oxidação do grupo

redutor dos carboidratos, estabilizando-os na forma de ácido aldônico, contra as reações de

despolimerização terminal (GOMIDE; OLIVEIRA, 1979). A antraquinona auxilia na quebra

das ligações β -éter reduzindo a massa molar da lignina, o que intensifica a deslignificação

(GIERER, 1980). Em processos de polpação, o emprego de soda-antraquinona leva a maior

formação de fragmentos de lignina de baixa massa molar, quando comparado ao processo

soda (VENICA; CHEN; GRATZL, 2008).

30

2.2.2.1 Processo alcalino oxidativo

O peróxido de hidrogênio é um excelente oxidante em meio alcalino, tem baixa

toxicidade e é de fácil manuseio. Os dois produtos de decomposição do H2O2, água e

oxigênio, não são poluentes. O tratamento com peróxido de hidrogênio é um processo

eficiente para remoção de lignina e hemicelulose de lignocelulósicos e, remove também, sílica

e graxas (CURRELI et al., 1997). O peróxido reage com as estruturas aromáticas e alifáticas

da lignina, sendo muito utilizado em processos de branqueamento de polpa (LIU, 2003). A

ação desse agente pode gerar produtos de degradação devido à formação de radicais

oxidantes. A influência do pH já foi bastante estudada e a literatura apresenta como ótimo o

valor de 11,6 (SUN et al., 2000a; YANG et al., 2002). Em meio alcalino o peróxido de

hidrogênio se decompõe no ânion peroxidrila (HOO-), o principal agente na degradação de

grupos cromóforos, de acordo com a reação 1 (pka = 11,6 a 25°C) (KADLA; CHANG, 2001):

(1) H2O2 + OH- → H2O + HOO-

(2) HOO- + H2O2 → H2O + O2 + OH-

Por outro lado, quando o peróxido é usado como agente de deslignificação em

extração alcalina, a sua decomposição ocorre devido à formação de hidroxila e de oxigênio,

que são os oxidantes que iniciam as reações de deslignificação (reação 2). Embora a

decomposição do peróxido seja necessária para que ocorra a deslignificação, a velocidade de

decomposição deve ser reduzida para que não ocorra formação em excesso de radicais livres,

o que pode levar a uma degradação excessiva dos polissacarídeos.

Alguns metais como ferro, cobre e manganês aceleram a decomposição do peróxido

de hidrogênio em meio alcalino, nos radicais hidroxila (HO·) e ânion superóxido (O2-·), os

quais participam do mecanismo de deslignificação (reações 3, 4 e 5) (SUN; TOMKINSON,

2002). Tais radicais apresentam efeito positivo para o processo de deslignificação, entretanto,

também atuam hidrolisando os carboidratos, o que é indesejável para o rendimento do

processo. Como as conseqüências negativas são maiores, os metais devem ser eliminados do

processo.

31

(3) H2O2 + M(n) → OH- + ·OH + M(n+1)

(4) H2O2 + OH- → H2O + ·OOH

(5) H2O + ·OOH → O2-· + H3O+

Onde: M representa o metal

O ânion peroxidrila é considerado a espécie ativa do peróxido de hidrogênio, age sobre

a macromolécula de lignina decompondo-a em ácidos mono e dicarboxílicos e compostos não

fenólicos, e em menor quantidade ácidos aromáticos e aldeídos (XIANG; LEE, 2000). Entre

os produtos derivados do ácido carboxílico destacam-se os ácidos oxálico, fórmico, acético,

malônico e succínico, e entre os produtos de origem não fenólica e aldeídos destaca-se ácido

vanílico, benzodicarboxílico, vanilina, seringaldeído e hidroxibenzaldeído. A figura 6 mostra

a sequência de degradação da lignina por ação de alta carga de peróxido de hidrogênio (3,7

g/g). Produtos derivados da lignina como vanilina e seringaldeído são formados na via A,

entretanto, estes compostos são rapidamente degradados, sendo encontrados em pequena

concentração. Os compostos cromóforos são formados nas vias B e C, os quais são

responsáveis pelo escurecimento do meio. Estes compostos podem ser degradados a ponto de

rompimento de anel até a formação de ácidos de baixa massa molar (XIANG; LEE, 2000).

Figura 6. Sequência de reações de degradação de lignina em meio alcalino (XIANG; LEE, 2000).

32

O radical hidroxila, produto de decomposição do peróxido, degrada carboidratos pelo

ataque ao carbono 2, formando uma estrutura de cetona e em seguida ocorre a quebra da

ligação glicosídica pela β-eliminação (Figura 7) (GUAY et al., 2001). Entretanto, no mesmo

trabalho os autores afirmam que a etapa de eliminação do superóxido (O2-·) é energeticamente

desfavorável. Utilizando um sistema UV/H2O2 os autores sugeriram que os radicais hidroxilas

provocam uma reação de substituição no carbono 1 do açúcar, clivando a ligação glicosídica e

formando um terminal redutor (Figura 8). Miller e Fry (2001) observaram que o ataque de

radicais hidroxilas diminui o grau de polimerização das cadeias de xilana, entretanto, não

ocorre a formação de oligossacarídeos.

Figura 7. Mecanismo oxidativo de clivagem de carboidratos por radicais hidroxilas (GUAY et al., 2001).

Figura 8. Mecanismo proposto para formação de celobiose por radicais hidroxilas a partir de metil-β-celobiose (GUAY et al., 2001).

33

Íons Mg+2 em meio alcalino origina o hidróxido de magnésio (Mg(OH)2), o qual

apresenta capacidade de complexar metais de transição como ferro, manganês e cobre.

Quando não quelados e na forma iônica, tais metais catalisam a decomposição do peróxido

produzindo espécies reativas de oxigênio, como os íons hidroxila e peroxidrila, que atacam os

carboidratos (THAKORE et al., 2005).

A hemicelulose pode ser extraída de materiais lignocelulósicos em grande proporção

utilizando peróxido de hidrogênio alcalino. Fang et al. (1999) extraíram 92 % da hemicelulose

da palha de trigo empregando 2 % de H2O2 a 50°C por 16 h. Esse polissacarídeo apresentou

massa molar entre 54.980 a 63.730 g/mol, composição de 72 % de xilose, 8,9 % de glicose,

15,6 % de arabinose, pequenas quantidades de ramnose, galactose e 4,7 % de lignina residual.

Os autores observaram que a hemicelulose extraída com H2O2 apresentou cor mais clara que a

extraída com KOH, o que foi atribuído à ação do peróxido sobre grupos cromóforos.

O peróxido de hidrogênio além de extrair a hemicelulose, auxilia também na remoção

da lignina do material lignocelulósico. A aplicação de 4 % de H2O2 a 200°C por 8 min

removeu 63 % da hemicelulose e 64 % da lignina de Miscanthus giganteus (WANG; WANG;

FANG, 2010). Um estudo comparativo de processos de extração da hemicelulose mostrou que

peróxido de hidrogênio (2 % m/m, 30 min por 121°C/1 atm) solubilizou 30 % da xilana e 29,5

% da lignina; o hidróxido de sódio (2 % m/m, 90 min a 121°C/1 atm) solubilizou 25 % da

xilana e 65,6 % da lignina e o ácido sulfúrico (2 % m/m, 90 min a 121°C/1 atm) solubilizou

95 % da xilana e 25 % da lignina (SILVERSTEIN et al., 2007). Nesse estudo, os autores

chamaram a atenção para o baixo desempenho do peróxido de hidrogênio, que nas condições

empregadas deve ter sido degradado.

2.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE POLISSACARÍDEOS

O uso de enzimas na hidrólise de resíduos lignocelulósicos é vantajoso pela alta

especificidade das reações enzimáticas, pelas condições amenas de reação, pouca modificação

química e formação de subprodutos. Apesar de décadas já terem sido dedicadas a esses

estudos, ainda não estão totalmente compreendidas as características do substrato que

atribuem maior eficiência de hidrólise. A hidrólise enzimática não leva a formação de

resíduos tóxicos da catálise, como por exemplo, ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural.

A hidrólise enzimática requer o contato direto entre a enzima e o substrato. A enzima

deve ultrapassar barreiras físicas para adsorver a superfície do substrato e finalmente catalisar

34

a hidrólise. Caso o substrato tenha um alto teor de lignina ou seja altamente cristalino a

efetividade da enzima será baixa, do contrário a efetividade será alta e consequentemente o

tempo necessário para hidrólise será menor (CHANG; HOLTZAPPLE, 2000). Além desses

fatores, a hidrólise enzimática sofre influência da heterogeneidade do material lignocelulósico

(BERLIN et al., 2005).

2.3.1 Hidrólise enzimática de xilanas

A hidrólise da hemicelulose ocorre através da ação de endo-enzimas, que atuam

internamente na cadeia principal, e exo-enzimas que clivam oligossacarídeos e produzem

monossacarídeos (KALOGERIS et al., 2001). A endo-β-1,4-D-xilanase (EC 3.2.1.8) age

sobre a cadeia principal de xilana e gera xilo-oligossacarídeos de baixo grau de polimerização

que são substratos da exo-β1,4-xilanase (EC 3.2.1.37), a qual age através do terminal não

redutor gerando D-xilose (BEG et al., 2001; WONG; TAM; SADDLER, 1988). As enzimas

que atuam nas ramificações são a arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) que remove a arabinose,

a α-glucuronidase (EC 3.2.1.131) que remove os ácidos glucurônicos e acetil-xilana-esterase

(EC 3.1.1.72) que remove os grupos acetil (JUHÁSZ et al., 2005).

Com base na sequência primária de aminoácidos e de seu domínio catalítico, as

xilanases são predominantemente classificadas nas famílias 10 e 11. As xilanases da família

10 em geral apresentam massa molar maior que 30 kDa e ponto isoelétrico baixo, enquanto

que as enzimas da família 11 apresentam baixa massa molar e ponto isoelétrico alto

(COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005; FENEL; ZITTINGA; KANTELINEN, 2006). As

xilanases da família 10 apresentam uma maior versatilidade catalítica, ou seja, menor

especificidade. As xilanases dessa família também podem apresentar atividade sobre celulose

de pequena massa molar. Em contraste, as xilanases da família 11 são consideradas como

verdadeiras, porque agem exclusivamente sobre xilanas (COLLINS; GERDAY; FELLER,

2005). Em função das diferenças catalíticas, xilanases da família 10 produzem XOs menores

do que xilanases da família 11 (MASLEN et al., 2007).

Trabalhos de Li et al. (2000) mostraram que os grupos substituintes influenciam na

taxa de hidrólise da cadeia de xilana, o que é regulado pelo grau de ramificação da cadeia

principal. Puchart e Biely (2008) observaram que, na ausência de β -xilosidase e das enzimas

acessórias α-glucuronidase e α-arabinofuranosidase, a hidrólise de glucuronoxilana por

endoxilanase da família 11 de Thermomyces lanuginosus levou a produção de XOs

35

ramificados.

A presença de ramificação pode ser um entrave mais ou menos acentuado dependendo

do modo de ação da enzima. Xilanase de Aspergillus niger hidrolisa melhor xilana não

ramificada, enquanto xilanase de Trichoderma longibrachiatum age sobre ambas xilanas

(AKPINAR; ERDOGAN; BOSTANCI, 2009). Iwamoto, Sasaki e Inaoka (1973), e Takenishi

e Tsujisaka (1975) observaram que xilanases purificadas de A. niger podem hidrolisar

xilotriose, mas não hidrolisam arabinoxilotriose. A presença de substituintes, os quais

geralmente localizam-se no terminal não redutor de XOs, protege a ligação glicosídica da

cadeia principal (COMTAT; JOSELEAU, 1981).

2.4 PRODUÇÃO DE XILANASES

As enzimas xilanolíticas podem ser induzidas por xilana, na maioria das vezes seu

melhor indutor (FERNÁNDEZ-ESPINAR et al., 1994), entretanto alguns autores evidenciam

o efeito indutor de fragmentos de xilana (ARO; PAKULA; PENTTILÄ, 2005) e sua repressão

por açúcares prontamente assimiláveis como glicose, lactose e xilose (GASPAR et al., 1997).

Os substratos lignocelulósicos são usados para a obtenção de enzimas xilanolíticas em larga

escala e com baixo custo em cultivo submerso ou em meio sólido (MISHRA et al.,1990).

Durante o crescimento em xilana, várias espécies microbianas produzem xilanases

específicas com pouca ou nenhuma celulase. Entretanto, quando crescidas em celulose,

celulases são produzidas juntamente com xilanases. Uma estratégia usada para obter o

complexo xilanolítico livre de celulases é o crescimento dos microrganismos em xilana não

contaminada com celulose (BIELY et al., 1986).

Para alguns organismos a síntese de xilanases e celulases é regulada separadamente,

enquanto em outros organismos, a produção de xilanases está ligada à produção de celulases.

Em Trichoderma reesei, xilana e xilobiose induzem seletivamente a formação de xilanases,

enquanto soforose induz a produção tanto de celulases quanto de xilanases (HRMOVÁ;

BIELY; VRSANSKA, 1986).

Fungos filamentosos são particularmente interessantes como produtores de xilanases do

ponto de vista industrial, pois os níveis de xilanases de culturas de fungos são tipicamente

mais altos do que aqueles de leveduras ou bactérias. Além das xilanases, fungos produzem

muitas enzimas auxiliares necessárias à hidrólise das ramificações das xilanas (HALTRICH et

al., 1996).

36

2.4.1 Hemicelulases de Aspergillus niger

Aspergilus niger é um fungo filamentoso que cresce em materiais orgânicos

depositados em solos, lixo e plantas em decomposição. Produzem hemicelulases na presença

de xilose, xilana ou polissacarídeos como celulose e pectina, mas não na presença de glicose e

galactose. O farelos de arroz e trigo promovem um excelente crescimento e produção de

celulases e hemicelulases (HAMIL et al., 2004).

Van Peij et al. (1998) realizaram estudos do promotor XlnR de A. niger a fim de

avaliar seu papel na regulação dos genes envolvidos na degradação de xilana e celulose. Os

autores observaram que este promotor ativa a expressão de duas endoxilanases (xlnB e xlnC),

uma β-xilosidase (xlnD), uma arabinofuranohidrolase (axhA), uma acetil-xilana-esterase

(axeA), uma α-glucuronidase (aguA), uma feruloil esterase (faeA), e duas endoglucanases

(eglA e eglB), entretanto, verificaram que β-glicosidase (bglA) não é regulada por esse

promotor.

A. niger produz quinze xilanases extracelulares (COLLINS; GERDAY; FELLER,

2005) com propriedades físico-químicas, estrutura e atividade específica diferentes. A ação

conjunta deste complexo enzimático pode aumentar a eficiência e o grau de hidrólise das

xilanas (VRIES; VISSER, 2001).

2.4.2 Hemicelulases de Thermoascus aurantiacus

O fungo termófilo Thermoascus aurantiacus é um ascomiceto que foi isolado pela

primeira vez em 1907 por Hugo Miehe, a partir de pilhas de feno aquecidas (COONEY;

EMERSON, 1964). T. aurantiacus apresenta uma cor laranja luminosa, ascósporos elípticos

e não apresenta fase assexuada (MAHESHWARI; BHARADWAJ; BHAT, 2000), embora no

passado Cooney e Emerson (1964) descreveram tal fase. Esse fungo está presente em diversos

ambientes, como plantas de tabaco, solo, cavacos de madeira, vagem de cacau, esterco de

aves, efluentes, entre outros. A cepa brasileira de T. aurantiacus (Figura 9) foi isolada de

pilhas de cavacos de eucalipto em uma empresa de polpa e papel (AUER; KRUGNER;

BARRICHELO, 1988) e os estudos mostraram que ela possui características diferentes da

maioria das cepas deste mesmo fungo, pois além de enzimas que degradam a celulose e

hemicelulose, ainda produz lacases (MACHUCA, 1991 e 1995).

A temperatura ótima e máxima para a germinação dos ascósporos de T. aurantiacus é

37

de 47,5°C e 60°C, respectivamente (DEPLOEY, 1995), a qual é maior que a relatada para o

crescimento de hifas (40 – 45°C) (COONEY; EMERSON, 1964). As temperaturas mínimas

para a germinação dos ascósporos estão entre 32,5-35°C (DEPLOEY, 1995) e para o

crescimento de hifas entre 20 e 25°C (COONEY; EMERSON, 1964).

Figura 9. Thermoascus aurantiacus ATCC 204492. (A) Crescimento em ágar-malte; (B) Hifas e esporos; (C) Ascósporos; (D) Liberação dos esporos por rompimento do ascósporo. (ampliação de 400 vezes) (Fonte: autor).

Em fermentações em estado sólido conduzidas em reatores, a taxa de aeração exerce

grande efeito na produtividade das xilanases uma vez que uma diminuição na aeração pode

levar a finalização do processo (SANTOS et al., 2003, MILAGRES et al., 2004).

T. aurantiacus cresce em materiais lignocelulósicos de origem agrícola e florestal,

como serragem, sabugo e palha de milho, grama seca ou verde, bagaço de laranja, farelo de

arroz (Da SILVA et al., 2005), bagaço de cana-de-açúcar (MILAGRES et al., 2004), farelo e

palha de trigo (KALOGERIS et al., 2003) e produzem enzimas do complexo celulolítico e

hemicelulolítico (KALOGERIS et al., 1998; MARTINS et al., 2007; SANTOS et al., 2003;

SOUZA; ROBERTO; MILAGRES, 1999).

Trabalhos de Souza, Roberto e Milagres (1999) e Santos (2001), mostraram que a

produção de xilanase por T. aurantiacus ATCC 204492 é regulada principalmente pela

A B

C D

A B

C D

38

natureza e concentração do substrato. O farelo de trigo e o bagaço de cana-de-açúcar

induziram altos níveis de xilanase em cultivo em estado sólido, quando comparados com o

meio líquido. O cultivo do fungo em farelo ou bagaço produziu 2700 U de xilanase/g de

substrato e o nível de enzimas foi dependente da umidade inicial e da massa de substrato

(SOUZA; ROBERTO; MILAGRES, 1999).

Kalogeris et al. (2003) cultivaram T. aurantiacus IMI 216529 em farelo de trigo

(relação sólido: líquido de 1:4) e encontraram 1572 U/g de endo-glucanase e 101 U/g de β-

glicosidase. As enzimas apresentaram elevada estabilidade térmica, com tempo de meia-vida

de 42 e 18 min, respectivamente a 80°C. Kalogeris et al. (1998) relataram a produção de 6193

U/g de xilanase, em cultivo com palha de trigo.

O cultivo de fungos termófilos apresenta baixo risco de contaminação, sendo um

atrativo para processos biotecnológicos, e ainda, tem recebido muita atenção devido a

vantajosas propriedades de suas enzimas (KULKARNI; SHENDYE; RAO, 1999). A

produção de enzimas termoestáveis é de grande interesse industrial, em função das condições

de processos que geralmente ocorrem em temperaturas altas (MAHESHWARI;

BHARADWAJ; BHAT, 2000; YU et al., 1987).

Em uma seleção de linhagens termofílicas realizadas por Yu et al. (1987), a xilanase

de T. aurantiacus C436 foi a mais termoestável. Esta linhagem produziu uma endo-xilanase

cuja atividade manteve-se superior a 90% a 50°C por 12 semanas. Uma menor estabilidade

foi observada por Alam et al. (1994) quando trabalharam com outra linhagem, que apresentou

atividade superior a 80% a 55°C durante 15 dias.

Em geral, xilanases de T. aurantiacus apresentam massa molar entre 39 – 33 kDa

(VISWAMITRA et al., 1993; KALOGERIS et al., 2001), temperatura ótima entre 70 e 75°C,

e pH ótimo próximo de 5 (ALAM et al., 1994; GOMES et al., 2000; YU et al., 1987), mas são

estáveis em uma ampla faixa de pH (3-9) em temperatura ambiente (Da SILVA et al., 2005).

Uma endo-xilanase purificada de T. aurantiacus IMI 216529 mostrou preferência em

hidrolisar a xilana pelo terminal redutor e propriedades catalíticas similares às da família 10.

Essa enzima tolerou alguns substituintes na cadeia principal da xilana, quando agiu sobre

oligômeros acetilados (VARDAKOU et al., 2003; KALOGERIS et al., 2001). Nesse trabalho

foram detectadas duas isoenzimas com pI 6.8 e 5.5, entretanto, a literatura não relata muitos

casos de isoenzimas de T. aurantiacus, diferente de outros microrganismos como Aspergilus

niger (COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005).

A β-xilosidase é uma enzima que hidrolisa xilo-oligômeros de cadeia curta e xilobiose

a partir do terminal não redutor liberando unidades de xilose (SHALLOM; SHOHAM 2003).

39

A expressão dessa enzima é normalmente induzida pelo dissacarídeo (xilobiose) ou

oligossacarídeos curtos, o que depende do microrganismo (GOMES; GOMES; STEINER,

1994). A literatura contém poucos trabalhos sobre a produção dessa enzima por T.

aurantiacus. Em um estudo investigatório de indução de hemicelulases por 14 carboidratos,

Gomes, Gomes e Steiner (1994) verificaram a produção de baixos níveis dessa enzima, até

mesmo na presença de indutores. Entretanto quando cultivado em farelo de trigo, T.

aurantiacus IMI 216529, produziu β-xilosidase com pI 3,5 (KALOGERIS et al., 1998) e

atividade de 40 UI/g (KALOGERIS et al., 1999), o que foi um nível considerado alto para

esse microrganismo.

Gomes et al. (2000) detectaram baixos níveis de exo-α-L-arabinofuranosidase em

cultivos com T. aurantiacus. Essa enzima hidrolisa resíduos de arabinofuranose a partir da

extremidade não redutora de oligossacarídeos curtos e arabinoxilanas substituídas nos

carbonos 2 e 3 por β-D-xilopiranosil. A condição ótima de cultivo para a produção de

arabinofuranosidase foi em meio com polpa de beterraba com 77,8 % de umidade,

suplementado com solução mineral e extrato de levedura (1,2%) em pH 9,5. Essa enzima

apresentou máxima atividade a 70°C e em pH 4, e manteve-se estável por 48 h a 50°C (Roche

et al., 1994).

Uma α-D-glucuronidase de T. aurantiacus apresentou uma única cadeia de

polipeptídeo com massa molar de 118 kDa (base SDS-PAGE), clivou ligações α -(1-2) entre

ácido 4-O-metil-α-D-glucurônico e resíduos de xilose em xilana e várias glucurono-xilo-

oligossacarídeos. Essa enzima apresentou estabilidade em 70°C com tempo de meia vida de

40 min, temperatura e pH ótimos de 65°C e 4,5, respectivamente (KHANDKE;

VITHAYATHIL; MURTHY, 1989a).

2.4.3 Hemicelulases de Trichoderma reesei

Trichoderma sp é encontrado em quase todos os tipos de solo, principalmente aqueles

ricos em matéria orgânica. Esse fungo foi responsável por estimular pesquisas do exército

norte-americano que observavam a rápida deterioração de material composto de algodão,

como barracas, uniformes e pára-quedas quando atuavam em regiões tropicais. A

denominação T. reesei foi homenagem a Elwyn T. Reese, um dos principais pesquisadores

daquele grupo, que também estudou a biossíntese, estrutura e mecanismos de degradação da

celulose por esse fungo (REESE; MANDELS, 1980).

40

Trichoderma reesei apresenta capacidade de produzir um sistema multienzimático e

induzível de enzimas celulolíticas (EVELEIGH et al., 1985), ao qual já foi relatado a

produção de 2 celobiohidrolases, 6 endo-glucanase e 2 β-glicosidases (GRISHUTIN et al.,

2004; SALOHEIMO et al., 2002). Outras espécies destacam-se pela produção de quitinases,

que degradam a parede celular de fungos fitopatogênicos, assim podem ser empregadas como

agentes de controle biológico, por exemplo, o T. harzianum (SAMUELS, 1996).

Trichoderma reesei é também um eficiente produtor de enzimas do complexo

hemicelulolítico (DURAND et al., 1988; FURUKAWA et al., 2009), composto por 3 endo-

xilanases e uma β-xilosidase (OGASAWARA et al., 2006). A expressão do gene xyn1 ocorre

principalmente pela indução por xilose (MACH et al., 1996), xyn2 por xilobiose e soforose

(ZEILINGER et al., 1996) e xyn3 por celulose e derivados (XU et al., 2000). Xilanases de T.

reesei foram isoladas e caracterizadas, as enzimas XYNI e XYNII apresentaram massa molar

de 19 e 20 kDa e ponto isoelétrico de 5,1 e 9, respectivamente (TÖRRÖNEN; ROUVINEN,

1995). De acordo com Tenkanen, Puls e Poutanen (1992), essas enzimas parecem ser

produzidas por genes distintos, além de agirem preferencialmente sobre a cadeia de xilana do

que sobre XOs.

2.5 PRODUÇÃO DE XILO-OLIGOSSACARÍDEOS

Xilo-oligossacarídeos são oligômeros constituídos de xilose e apresentam variedades

na proporção e tipo de grupos substituintes como acetil, ácidos urônicos e fenólicos. A

composição depende da origem do material e do processo de extração (KABEL et al., 2002).

Os XOs podem ser obtidos basicamente por processos hidrolíticos: básico, ácido ou

enzimático. Uma solução extremamente alcalina remove os grupos acetil e ácidos urônicos,

mas pode despolimerizar a hemicelulose.

A hidrólise da fração hemicelulósica de materiais lignocelulósicos com ácidos seguida

ou não por descompressão súbita (explosão), tem-se mostrado bastante eficiente na produção

de XOs. Na auto-hidrólise ocorre acidificação do meio pela clivagem dos grupos acetil do

substrato, o que pode ocorrer de forma parcial em função da severidade do processo, gerando

XOs acetilados. Nesse processo a produção de XOs depende do conteúdo de grupos acetil na

hemicelulose (NABARLATZ; ENBRIGEROVÁ; MONTANÉ, 2007). A hidrólise pode ser

feita com adição de ácidos e aquecida por certo tempo. A composição de XOs obtidos pela

hidrólise com ácido depende da concentração usada e do tempo de reação. A hidrólise ácida

41

de materiais lignocelulósicos (talo de tabaco, talo de algodão, talo de girassol e palha de trigo)

com 0,25 M de ácido sulfúrico por 30 min de reação, produziu entre 8 e 13% de XOs. Nessa

condição foram produzidos 6 % de xilobiose, 3,5 % de xilotriose e 2 % de xilotetraose,

entretanto produziu cerca de 15 % de xilose e 0,018 % de furfural (AKPINAR; ERDOGAN;

BOSTANCI, 2009). Os autores observaram perfil semelhante para a hidrólise ácida dos

diferentes materiais, porém observaram que nos materiais que contém hemicelulose mais

ramificada há uma maior formação de monossacarídeos e furfural, o qual chegou a 0,5 % na

hidrólise de xilana de palha de trigo.

A auto-hidrólise de sabugo de milho com rampa de temperatura (não isotérmica), de

170 a 216°C por 48 min, extraiu 94 % da xilana e solubilizou 26% da lignina (GARROTE;

DOMÍNGUEZ; PARAJÓ, 2009). A concentração de arabinose no hidrolisado foi de 2 g/L a

195°C. A reação de degradação da hemicelulose ocorreu durante a hidrólise chegando a

furfural (GARROTE; DOMÍNGUEZ; PARAJÓ, 2002b).

A auto-hidrólise de palha de trigo com rampa de aquecimento (150 – 240°C, por 24

min) extraiu 64 % da xilana, sendo 80 % obtido na forma de XOs. A solubilização da lignina

foi de 15 % e de glucana de 16 % (CARVALHEIRO et al., 2009). Devido a remoção de

hemicelulose a fração de glucana no material sólido enriqueceu, chegando a 61 %. A rampa

de temperatura (3,8°C/min) alterou a concentração de ácido acético no meio de 0,64 a 3,19

g/L, e o pH variou de 6,28 a 3,7. A concentração de XOs foi máxima na temperatura de

215°C (10,1 g/L), com o aumento do tempo a concentração diminuiu, chegando a 0,17 g/L a

240°C. Na melhor condição de produção de XOs a concentração de furfural foi de 0,16 g/L,

atingindo 1,37 g/L na temperatura máxima.

A hidrólise ácida apresenta vantagem de ser realizada em curto tempo de reação, mas a

formação de furfural e monossacarídeos são fatores negativos ao ponto de destacar a hidrólise

enzimática como mais apropriada à produção de XOs. A característica de formação de maior

quantidade de xilose do que XOs na hidrólise ácida ocorre independente da origem da xilana

hidrolisada (AKPINAR; ERDOGAN; BOSTANCI, 2009).

A obtenção de XOs por hidrólise enzimática ocorre através da degradação da

hemicelulose isolada. A extração da hemicelulose é feita por método alcalino e obtém-se um

material acessível às enzimas (CARA et al. 2009).

Bagaço de cana, sabugo de milho, farelo de trigo e casca de amendoim foram tratados

com solução de NaOH 4 % (m/v) a 100°C por 3 h, extraindo 15,7, 12,5, 18,5 e 3,5 % de

hemicelulose, respectivamente (YANG; YANG; LIU, 2007). A hidrólise enzimática da

hemicelulose de bagaço com 500 U/g de xilanase, 1,75 U/g de β-xilosidase e 1 U/g de acetil

42

esterase de Thermobifida fusca NTU22 produziu 23,7 % de XOs e 2,85 % de xilose. A

proporção de XOs foi enriquecida para 71,4 % com emprego de carvão ativado (YANG;

YANG; LIU, 2007).

Xilo-oligossacarídeos ramificados podem ser obtidos de algumas fontes de

hemicelulose, como de milho, utilizando extratos enzimáticos deficientes nas enzimas β -

xilosidase, α-glucuronidase e α-arabinofuranosidase. A hemicelulose ramificada de milho

apresenta arabinose:xilose:galactose:ácidos urônicos na proporção 33,8:51,9:6,5:7,4

(PUCHART; BIELY, 2008). Os autores verificaram que o emprego de xilanase da família 11

de Thermomyces lanuginosus produziu XOs, ramificados, com grau de polimerização entre 4

e 8, na ausência das enzimas que removem grupos pendentes. Baseado nos grupos

substituintes, 35 % do total de ácidos urônicos se manteve associado aos XOs.

A hidrólise de xilana de bétula por de xilanase de Thermotoga maritima MBS8,

expressa em E. coli, produziu 66 % de xilobiose, 20 % de xilose e pequenas quantidades de

X3 e X4 (JIANG et al., 2004). O emprego de endoxilanase pura não levou a formação de XOs

ramificados, provavelmente porque essa xilana era pouco ramificada.

Um estudo comparativo entre os diferentes métodos de pré-tratamentos de sabugo de

milho com objetivo de produzir XOs: térmico (121°C por 30 min), ácido (1 g/L H2SO4, 12 h a

60°C) e alcalino (2 % NaOH, temperatura ambiente por 1 noite), revelou melhores resultados

para o processo alcalino. Nesses ensaios o resíduo sólido foi submetido à hidrólise com

enzimas de Aspergilus orizae e os produtos de hidrólise (xilose + XOs) foram cerca de duas

vezes maior para o material pré-tratado com álcali, em relação ao obtido por tratamento

térmico. O tratamento ácido apresentou a menor conversão, o que foi atribuído à prévia

hidrólise da hemicelulose (AACHARY; PRAPULLA, 2009). Os principais produtos da

hidrólise enzimática foram xilobiose (73 %) e xilose (19 %) e outros (7,5 %).

Uma opção promissora para hidrólise enzimática é o emprego de enzima imobilizada,

técnica que permite a reutilização da enzima, podendo inclusive melhorar a sua estabilidade

térmica. Outro aspecto que pode auxiliar no desempenho desse processo é a possibilidade de

uso de hemicelulose solúvel. Um trabalho mostrou que xilanase de Streptomyces

olivaceoviridis E-86 imobilizada em Eudragit S-100 alcançou 80 % de conversão total (xilose

+ XOs) (AI et al., 2005).

43

2.6 PROPRIEDADES E APLICAÇÕES DE XILO-OLIGOSSACARÍDEOS

Os xilo-oligossacarídeos (XOs) apresentam notável potencial para a utilização em

muitos campos, incluindo o setor alimentício (alimentos funcionais, prebióticos, aditivos em

ração de animais domésticos e peixes); no setor farmacêutico (controle da obesidade,

tratamento de infecções gastrointestinais, agente ativo contra osteoporose, otite e disfunções

na pele e cabelo) e na agricultura (estimulante e acelerador do crescimento) (VÁZQUEZ et

al., 2001).

Diversas pesquisas estão sendo realizadas para evidenciar as propriedades físico-

químicas e biológicas de oligossacarídeos. Há estudos relacionados à doçura, amargor,

higroscopicidade, atividade de água, ativação e estabilização de proteína, sabor e cor,

destacando-se sua aplicação como agente de reforço organoléptico em bebidas. Entre as

propriedades biológicas investiga-se a digestibilidade e não-digestibilidade, propriedades anti-

cariogênicas e não-cariogênicas, ação bacteriostática, seletividade a proliferação de

bifidobactéria (NAKAKUKI, 2002). Além dessas vantagens, essas substâncias não

apresentam toxicidade ou exibem efeitos negativos em humanos.

O mercado japonês foi pioneiro na incorporação de XOs aos alimentos (GIBSON et

al., 1995) e em 2001 já existiam aproximadamente 60 empresas utilizando XOs em cerca de

100 produtos alimentícios, sendo alguns de caráter prebióticos (VÁZQUEZ et al., 2001). Um

prebiótico é um ingrediente não-digerível do alimento que afeta beneficamente e estimula

seletivamente o crescimento e/ou a atividade de um número limitado de bactérias, melhorando

assim a saúde do hospedeiro (GIBSON et al., 2004). Fooks e Gibson (2002) investigaram o

efeito seletivo de prebióticos em microrganismos probióticos e alguns patogênicos comuns à

flora intestinal humana. Os probióticos cresceram em oligofrutose (FOs) e XOs, inibindo o

crescimento dos patógenos Escherichia coli, Campilobacter jejuni e Salmonella enteritidis. A

adição de xilo-oligossacarídeos mostrou potencial em inibir o crescimento de Clostridium sp e

apresentou ação como agente bacteriostático contra Vibrio anguillarum (IZUMI; AZUMI,

2001).

Os xilo-oligossacarídeos apresentam melhor estabilidade a temperatura e pH quando

comparados aos FOs. Quando foram submetidos a condições de pasteurização (30 min, 60 –

100°C em pH 2) os XOs sofreram degradação de cerca de 3 %, enquanto 35 % de FOs foram

degradados. A 121°C/50 min em pH 2 ocorreu degradação de cerca de 16 % dos XOs, os FOs

foram completamente degradados (WANG et al., 2009). Os XOs não são degradados no trato

gastrointestinal pelo baixo pH ou por enzimas digestivas humana e também não são

44

assimilados pela maioria dos microrganismos indesejáveis presentes na flora intestinal

(GIBSON et al., 1995; OKAZAKI; FUJIKAWA; MATSUMOTO, 1990). O trato intestinal

humano contém um complexo ecossistema microbiológico composto por inúmeras espécies

de bactérias. A maioria destas bactérias apresenta capacidade de assimilar açúcar, e algumas

espécies são consideradas como benéficas ao hospedeiro, enquanto outras podem apresentar

potencial patogênico. Em função de seu efeito benéfico é desejável o aumento de

microrganismos probióticos. A aplicação de XOs promove aumento desse tipo de bactérias,

principalmente Bifidobactérias e Lactobacilos. As bifidobactérias utilizam principalmente

xilobiose e xilotriose para seu desenvolvimento (OKAZAKI et al., 1990).

Os oligossacarídeos são considerados como ingredientes em alimentos funcionais,

onde são utilizados em um grau de polimerização de 2 a 12 (NABARLATZ; FARRIOL;

MONTANE, 2004). Além de fornecer modificações úteis ao sabor e às características físico-

químicas do alimento, muitos destes açúcares possuem propriedades que são favoráveis à

saúde dos consumidores, pois não são cariogênicos, possuem baixo valor calórico e

estimulam o crescimento de bactérias benéficas no colon. As aplicações potenciais mais

importantes de XOs, em termos de mercado, correspondem a ingredientes para alimentos

funcionais (por exemplo, em combinação com extrato solúvel de soja, refrigerantes, chá,

produtos derivados de leite (CRITTENDEN; PLAYNE, 1996), iogurtes, doces, bolos,

biscoitos, massas, e em alimentos especiais para idosos e crianças) ou como componentes

ativos de preparações simbióticas (MOURE et al., 2006).

No processamento de alimentos os XOs mostram maiores vantagens em relação à

inulina, em termos de resistência térmica e a ácidos, permitindo sua utilização em sucos com

baixo pH e bebidas carbonatadas (VÁZQUEZ et al., 2001).

Em recentes estudos, ésteres e éteres de xilo-oligossacarídeos têm sido utilizados

como matéria-prima para produção de compostos termoplásticos biodegradáveis, filme

solúvel em água, cápsulas e hidrogel de quitosana-xilana (MOURE et al., 2006). Esses

produtos apresentam valor agregado e uma nobre característica, a biodegradação, que

colabora para um meio ambiente livre de resíduos. Na área de saúde investiga-se a síntese de

compostos a base de xilana e XOs com atividade contra vírus e processos carcinogênicos. A

ação desses compostos é dependente da estrutura do polissacarídeo (MOURE et al., 2006).

Xilo-oligossacarídeos exibem uma série de outras propriedades e revelam uma ampla

gama de aplicações: antioxidante (devido à presença de grupos fenólicos) (HAYASHI;

SAKAKI; DOI, 2005(a); HAYASHI; SAKAKI; DOI, 2005(b); KATAPODIS et al., 2003;

YUAN; WANG; YAO, 2005; INAFUKU et al., 2002); prevenção de anemia e arteriosclerose

45

(MATSUOKA, 2005; KATAPODIS et al., 2003); antialérgico (TAKAHASHI; IKEMIZU,

2005); citotoxicidade contra células com leucemia linfoblástica (ANDO et al., 2004); indutor

de apoptose em células cancerígenas (ITO; YAMAGUCHI; IZUMI, 2001).

Xilo-oligossacarídeos obtidos por hidrólise enzimática de xilana de bétula com

xilanase de T. aurantiacus apresentou atividade contra Helicobacter pilori e moderada

atividade contra Bacilus cereus e Micrococus flavus (Gram-positivo) (CHRISTAKOPOULOS

et al., 2003). Os ensaios de inibição revelaram que 500 µg/mL de XOs apresentaram efeito

semelhante a 100 µg/mL de ampicilina. XOs com grau de polimerização entre 2 e 25 obtidos

por auto-hidrólise de sabugo de milho e eucalipto foram fermentados in vitro por bactérias da

flora intestinal de porco, onde estimulou a proliferação de bifidobactérias e lactobacilos

(MOURA et al., 2008). XOs acetilados e não acetilados obtidos da auto-hidrólise de casca de

amêndoas apresentaram atividade imunoestimulatória, induziram atividade miogênica e

melhoraram a proliferação de células T (NABARLATZ et al., 2007a).

Linhagens de Leuconostoc lactis SHO-47 e SHO-54 foram cultivadas em hidrolisado

de xilana para produção de ácido láctico. XOs com grau de polimerização de 2 a 6 foram

consumido mais rapidamente que xilose, enquanto XOs com grau de polimerização superiores

a 6 não foram consumidos (OHARA; OWAKI; SONOMOTO, 2006). Segundo os autores,

esses microrganismos produzem xilanases intracelulares, sendo necessária a carreação dos

XOs, o que ocorre pelo sistema de transporte fosfoenolpiruvato e fosfotransferase dependente

de açúcar (PEP-PTS). Lactobacilos assimilam lactose, galactose, glicose, manose e frutose,

sendo verificada a absorção preferencial de XOs à xilose. Os autores sugerem que a xilose

formada em excesso pode ser secretada, assim como xilanases induzidas pela presença de

XOs no meio intracelular.

Para comprovar a ação in vivo têm sido realizado testes em humanos. A adição de

arabino-xilo-oligossacarídeos (AXOs) na alimentação humana não influenciou a absorção de

lipídios, mas apresentou a vantagem de não interferir na absorção de proteínas. Foi

comprovado o efeito da colonização do trato gastrointestinal por bactérias não patogênicas. A

análise foi realizada pelo monitoramento do CO2 liberado na respiração de 10 voluntários para

detectar a digestão de lipídios e proteínas (marcados com 14C), na presença e ausência de

AXOs (CLOETENS et al., 2008).

46

2.7 PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE XOs

Após a produção dos oligossacarídeos, seja por processos hidrotérmicos ou

enzimáticos, a etapa mais importante é a purificação. Os oligossacarídeos de menor massa

molar são separados dos de alta massa e dos compostos que não apresentam interesse. Nessa

etapa, podem ser empregados processos como evaporação, extração com solvente ou métodos

cromatográficos. Recentemente processos com membranas têm sido utilizados na separação e

concentração de oligossacarídeos.

Os oligossacarídeos de diferentes massas molares podem ser separados por

precipitação com gradiente de etanol, metanol ou acetona, ou por cromatografia com os géis

Sephadex, Sephacryl e Sepharose (YANG; ZHANG, 2009). A purificação de XOs é realizada

por permeação em gel usando grandes colunas empacotadas com Bio Gel P-2 em temperatura

de 26°C usando água como eluente (AACHARY et al., 2009). Os oligossacarídeos ácidos

podem ser separados por cromatografia de troca iônica em DEAE-cellulose e DEAE-

Sepharose (YANG; YANG; LIU, 2007).

Há vários métodos apropriados à análise de oligossacarídeos, baseados principalmente

na separação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou cromatografia gasosa

dos oligossacarídeos pré-derivatizados (CHURMS, 1996). A cromatografia de íons (HPAEC)

combinada à detecção amperométrica é muito eficiente na separação de oligossacarídeos

(LEE, 1996). A cromatografia de camada delgada (TLC), por outro lado é um método simples

que provê muitas informações sobre a composição dos oligossacarídeos na mistura

(PUCHART; BIELY, 2008). A identificação de oligossacarídeos por métodos

cromatográficos é geralmente muito difícil tendo em vista que a eluicão dos oligossacarídeos

não é previsível e que os padrões nem sempre estão disponíveis.

A composição dos oligossacarídeos pode ser determinada por ressonância magnética

nuclear (RMN) através de análise quantitativa do espectro. Normalmente, é necessário uma

grande quantidade de material (1 mg) e a análise é relativamente longa. Contudo, NMR

fornece dados inquestionáveis da caracterização dos oligossacarídeos (HOFFMAN et el.,

1992; KOVAC; HIRSCH, 1980). O uso de MALDI-TOF-MS para análise de oligômeros

revela pequenas diferenças na estrutura dos oligossacarídeos como a presença de diferentes

ferulatos e grupos acetil em diversas posições (SORENSEN et al. 2006)

A auto-hidrólise de materiais lignocelulósicos produz uma grande variedade de

compostos derivados da hemicelulose, lignina e extrativos, o que faz necessário a purificação

do produto de interesse (VÁZQUEZ et al., 2005). A adição prévia de acetato de etila em

47

hidrolisado de eucalipto extraiu vários compostos (ácido esteárico 23 %, ácido palmítico 19

%, e em menor quantidade os ácidos oléico, octadecanodióico, tetradecanodióco), compostos

fenólicos como ácido gálico 7,8 %, e outros compostos originados da lignina (vanilina 1,2 %,

trihidroxibenzeno 2,4 %, seringaldeído 4,8 %, ácido dihidroxibenzóico 0,5 %). A subsequente

extração com propanol resultou na recuperação de 93,8 % de sólidos, entretanto nessa fração

não estavam presentes os derivados de hemicelulose. Com acetona o teor de sólidos foi de

89,2 %, sendo 82,7 % correspondente aos derivados de hemicelulose. O menor teor de sólidos

foi obtido na precipitação com etanol (52,3 %), entretanto foi a maior concentração de

derivados de hemicelulose (86 %), e a menor concentração de monossacarídeos (3,6 %).

Esses resultados foram semelhantes aos obtidos com etapa de purificação mais onerosa, como

cromatografia de troca iônica (ENDO; KURODA, 2000).

Uma solução de XOs (58 %) contendo 16 % de lignina, 4,9 % de monossacarídeos,

4,8 % de compostos inorgânicos e 15 % de compostos não identificados (por exemplo,

produtos provenientes de extrativos) foi submetida à ultrafiltração com membranas de cortes

de 1; 2,5; 3,5 e 8 kDa em pressões de 2,6 a 9 atm (NABARLATZ et al., 2007b). Os autores

observaram uma significante porção dos produtos derivados da lignina junto com

monossacarídeos e XOs mesmo quando utilizaram a membrana de 1 kDa. Apesar dos

esforços, uma única etapa de purificação com membrana não permitiu a separação dos

compostos indesejáveis. Vegas et al. (2008) realizaram auto-hidrólise de talo de arroz e

obtiveram uma fração de 21 % de carboidratos. Esse hidrolisado foi concentrado com

membrana de 1 kDa (6 atm) aumentando essa fração para 71 %, mas manteve ainda 30 % de

compostos não carboidratos (derivados de lignina, extrativos e cinzas). A aplicação desse

concentrado em coluna de troca iônica diminuiu a fração não-carboidrato para 9 %.

Paralelamente, o concentrado foi extraído com acetato de etila e submetido à troca iônica,

obtendo-se uma fração de não-carboidratos de 5,6 %, enquanto a fração de carboidratos

apresentou 91 % de XOs.

48

3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi estudar a extração da hemicelulose do bagaço de cana-de-

açúcar para aproveitamento através da produção enzimática de xilo-oligossacarídeos.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Estudar as condições de pré-tratamento com peróxido de hidrogênio para extração da

hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar através de planejamento experimental;

Estudar a hidrólise enzimática da hemicelulose do bagaço com xilanases de diferentes

fungos para obtenção de xilo-oligossacarídeos;

Estudar a auto-hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar para obtenção de xilo-

oligossacarídeos;

Avaliar o hidrolisado enzimático da xilana do bagaço como indutor de hemicelulases e

celulases.

49

4. MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Bioquímica e Microbiologia

Aplicada do Departamento de Biotecnologia da Escola de Engenharia de Lorena – EEL/

Universidade de São Paulo.

O bagaço de cana-de-açúcar utilizado neste trabalho foi obtido da Companhia

Açucareira do Vale do Rosário, em Orlândia-SP.

4.1 PRODUÇÃO DE ENZIMAS

Os fungos utilizados foram o Thermoascus aurantiacus ATCC 204492, Aspergilus

niger e Trichoderma reesei QM6A.

A. niger, T. aurantiacus e T. reesei foram inoculados em tubos de ágar-malte

inclinado. A. niger e T. reesei foram incubados em estufa com temperatura controlada de

28°C por cerca de 4 dias, enquanto T. aurantiacus foi incubado a 45°C pelo mesmo período.

O meio de cultivo sólido foi preparado com farelo de trigo e solução mineral Czapek

(NaNO3, 2 g/L; KH2PO4, 1 g/L; MgSO4, 0,5 g/L; KCl, 1 g/L e FeSO4, 0,01 g/L) a 75% de

umidade em pH inicial 6. Os frascos foram autoclavados por 15 min a 121°C e inoculados

com 2 x 106 , 2,5 x 106 e 3,7 x 106 esporos/g (contagem em Câmara de Neubauer),

respectivamente para A. niger, T. reesei e T. aurantiacus. Os cultivos foram realizados até 10

dias, sendo um frasco para cada dia de cultivo. No final de cada período de cultivo

acrescentou-se 50 mL de tampão acetato de sódio 20 mM, pH 5,4 aos frascos que foram

agitados durante 1 h em banho de gelo. Seguiu-se a filtração em tecido (gaze) e centrifugação

a 6000xg durante 10 min a 4°C. No sobrenadante foram quantificadas as enzimas.

4.2 ENZIMAS COMERCIAIS

As xilanases comerciais utilizadas foram a Luminase PB-200 (Verenium) (enzima

termoestável), EnzOx® e xilanase de Thermomyces lanuginosus (Sigma).

50

4.3 DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS

Uma unidade (UI) de atividade enzimática foi definida como 1 µmol de produto

liberado por minuto de reação, sendo expressas em U/g de substrato.

4.3.1 Endo-β-1,4-xilanase

A atividade de xilanase foi determinada de acordo com o método de Bailey, Biely e

Poutanen (1992), seguido da quantificação de açúcares redutores liberados a partir da xilana,

pelo método do ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS - MILLER, 1959). O método consiste em

acompanhar a reação de 900 μL de xilana 1 % (preparada em tampão acetato de sódio 50 mM,

pH 5,4) com 100 μL de extrato enzimático a 50°C por 5 minutos. A reação foi interrompida

pela adição de 1,5 mL do reagente DNS (ácido 3,5- dinitrossalicílico). No ensaio controle o

reagente de DNS foi adicionado antes da adição da enzima. Os tubos de ensaio foram fervidos

a 100°C em banho-maria por 5 minutos e depois de resfriados foi feita a leitura da

absorbância em espectrofotômetro a 540 nm, a qual foi convertida em concentração de xilose

através da curva analítica (2 a 20 µmol/mL).

4.3.2 Endo-β-1,4-glucanase

A atividade de endo-β-1,4-glucanase foi determinada segundo técnica descrita por

Tanaka et al. (1981), seguido da quantificação de açúcares redutores, determinada pelo

método do DNS (MILLER, 1959). O método consiste em acompanhar a reação de 900 μL de

carboximetilcelulose 0,44% (preparada em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4) com 100

μL de extrato enzimático a 50°C por 30 minutos.

A reação foi interrompida pela adição de 1,5 mL do reagente DNS (ácido 3,5-

dinitrossalicílico). No ensaio controle o reagente de DNS foi adicionado antes da adição da

enzima. Os tubos de ensaio foram fervidos a 100°C em banho-maria por 5 minutos e depois

de resfriados foi feita a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 540 nm, a qual foi

convertida em concentração de glicose através da curva analítica (1 a 11 µmol/mL).

51

4.3.3 β-xilosidase

A atividade β-xilosidase foi determinada utilizando p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo

(pNPX) como substrato enzimático. O p-nitrofenol liberado após ação da β -xilosidase foi

determinado pela leitura da absorbância a 410 nm (TAN; MAYERS; SADDLER, 1987). Os

valores de absorbância obtidos foram transformados em micromoles de p-nitrofenol

relacionados à curva analítica de p-nitrofenol (50 a 300 µmol/mL). Uma unidade de atividade

enzimática foi definida como a quantidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 µmol

de p-nitrofenol por minuto. O método consiste em acompanhar a reação de 400 μL de pNP X

a 0,1% (preparado em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,8) com 100 μL de extrato

enzimático a 50°C por 30 min. A reação foi interrompida pela adição de 1,0 mL de

bicarbonato de sódio 10%. O ensaio controle foi realizado com a adição do bicarbonato de

sódio antes da enzima.

4.3.4 α-L-arabinofuranosidase

A atividade α-L-arabinofuranosidase foi determinada utilizando p-nitrofenil-α-L-

rabinofuranosideo (pNPA). O método consiste em acompanhar a reação de 400 μL de pNPA a

0,1% (preparado em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,8) com 100 μL de extrato

enzimático a 50°C por 30 min. A reação foi interrompida pela adição de 1,0 mL de

bicarbonato de sódio 10 %. O ensaio controle foi realizado com a adição do bicarbonato de

sódio antes da enzima. O p-nitrofenol liberado pela a ação da α-L-arabinofuranosidase foi

determinado pela leitura de absorbância a 410 nm (TAN; MAYERS; SADDLER, 1987), os

valores foram convertidos com curva analítica (50 a 300 µmol/mL).

4.3.5 Efeito do pH na atividade de xilanase

O efeito do pH foi determinado através da medida da atividade de xilanase em

soluções de xilana (birchwood) 1% (Sigma, USA) preparada em tampão citrato fosfato 50

mM (pH 3 – 7) e tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 7 – 9), seguindo a metodologia de

Bailey et al., (1992) para a determinação da atividade enzimática.

52

4.3.6 Efeito da temperatura na atividade e na estabilidade da xilanase

Para determinação do efeito da temperatura a reação enzimática foi conduzida nas

temperaturas de 30, 40, 50, 60, 70, 80 e 90°C, nas condições descritas no método padrão para

determinação da atividade (BAILEY et al., 1992).

Para determinação da estabilidade térmica as enzimas de T. aurantiacus foram

incubadas a 50, 60 e 70°C e de A. niger e T. reesei a 30, 40 e 50°C. A atividade de xilanase

foi monitorada em função do tempo de incubação. As enzimas foram colocadas em tubos

“eppendorf” de 1 mL e em tempos definidos foram retirados do banho com temperatura

controlada e um volume de 100 µl de enzima foram transferidos para tubos contendo solução

de xilana 1% para determinação da atividade enzimática. Considerou-se que a atividade

enzimática diminui exponencialmente ao longo do tempo obedecendo a um modelo de

primeira ordem de desativação das enzimas, cuja equação pode ser representada por:

-(dA/dt) = kd*A

A = Ao*exp(-kd*t)

Onde:

Ao= atividade enzimática inicial;

A= atividade enzimática no tempo t;

Kd= constante de desativação (min-1);

t= tempo de reação (min)

O tempo de meia vida (t1/2) das enzimas foi definido como o tempo no qual após

incubação a uma definida temperatura, a atividade residual da enzima foi 50 % da atividade

original, sendo determinado de acordo com a equação 6:

ln(A/Ao) = -kd* t1/2

t1/2 = ln2/kd (6)

4.4 EXTRAÇÃO DE HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR COM

NaOH

O bagaço foi seco em estufa a 60°C por cerca de 12 h, moído em um moinho de facas

(Manesco & Manieri) e selecionado por uma peneira de 25 mesh. O bagaço foi caracterizado

quimicamente de acordo com o item 4.6.

53

A Figura 10 mostra o esquema usado para a extração da hemicelulose do bagaço.

Inicialmente foi feita uma extração do bagaço em etanol 95% (v/v) por 6 h, em aparelho

Soxhlet. Após extração o material foi seco em estufa com circulação de ar a 60°C durante 12

h. Cem gramas do material foram hidrolisados com 2,5 L de NaOH 1 M por 18 h a 25°C, com

atmosfera de nitrogênio e agitação mecânica. Após a reação, o material foi filtrado e o

resíduo rico em celulose foi lavado com água destilada até a neutralidade e seco em estufa a

60°C. O pH do filtrado foi imediatamente corrigido para 6,0 com adição de HCl 6 M. Esta

solução foi concentrada cerca de 3 vezes (relação volume) em uma estufa com circulação de

ar a 45°C e precipitada utilizando 3 volumes de etanol 95%. Após a sedimentação do

material, o sobrenadante foi removido e ao precipitado adicionado uma solução de etanol

70%. Esta etapa, lavagem com etanol, foi repetida (cerca de 4 vezes) até que obteve-se um

sobrenadante límpido (XU et al., 2006). O resíduo foi separado e seco em estufa a 45°C.

Foram também avaliados os efeitos da adição antraquinona (AQ) 0,3 % (m/m) e

sulfito de sódio 0,3 % (m/m) à solução de NaOH na extração da hemicelulose.

Extração com etanol 95% (v/v) em Soxhlet por 6 h

Figura 10. Representação esquemática dos procedimentos utilizados para separação dos constituintes principais do bagaço de cana-de-açúcar e extração alcalina da hemicelulose.

Bagaço de cana-de-açúcar

Bagaço livre de extrativos

Tratamento com NaOH 1 M por 18 h a 25°C

Resíduo rico em celulose

filtrado

Neutralizado com HCL 6 M para pH 6 Concentrado em estufa a 45°C Precipitação com etanol 3 volumes

Lavagem com etanol 70 % e seca a 45°C

filtrado pellets

Lignina solúvel

Hemicelulose solúvel em meio

alcalino

54

4.5 EXTRAÇÃO DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR COM

H2O2 EM MEIO ALCALINO

O bagaço moído a 25 mesh foi tratado com solução de ácido tetracético etilenodiamina

(EDTA) 0,2 % (m/v) durante 1h a 90°C para remoção de metais (FANG et al., 1999). Dez

gramas de bagaço foram colocados em frascos plásticos de 1L, seguido da adição dos

reagentes preparados em um volume de 200 mL, o pH foi ajustado em 11,6, e o meio foi

agitado a 80 rpm.

Para avaliar a influência das variáveis: temperatura, concentração de peróxido de

hidrogênio, tempo reacional e concentração de sulfato de magnésio na extração de

hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar foi empregado um planejamento fatorial completo

24 com três repetições no ponto central (Tabela 1).

Tabela 1- Planejamento fatorial completo 24 para avaliação do processo de extração da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar sob diferentes condições operacionais. Níveis codificados das variáveis Níveis reais das variáveis

Exp A B C D Temp (°C) H2O2 % (m/v) Tempo (h) MgSO4 % (m/m)

1 - - - - 20 2 4 0

2 + - - - 60 2 4 0

3 - + - - 20 6 4 0

4 + + - - 60 6 4 0

5 - - + - 20 2 16 0

6 + - + - 60 2 16 0

7 - + + - 20 6 16 0

8 + + + - 60 6 16 0

9 - - - + 20 2 4 0,5

10 + - - + 60 2 4 0,5

11 - + - + 20 6 4 0,5

12 + + - + 60 6 4 0,5

13 - - + + 20 2 16 0,5

14 + - + + 60 2 16 0,5

15 - + + + 20 6 16 0,5

16 + + + + 60 6 16 0,5

17* 0 0 0 0 40 4 10 0,25

*experimento realizado em triplicata, correspondente ao ponto central.

55

Após atingir os tempos de reação, os procedimentos de filtração e etapas seguintes

foram realizados como descrito no item 4.4. A análise estatística dos dados obtidos foi

realizada utilizando-se os programas “Design Expert” e “Estatistica 6.0”.

4.6 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO BAGAÇO E DA HEMICELULOSE

Em tubo de ensaio foi pesado aproximadamente 300 mg de bagaço ou hemicelulose. A

massa seca da amostra foi anotada e a ela adicionou-se 1,5 mL de H2SO4 72 % (m/m), a

reação ocorreu a 45ºC por 7 minutos. A reação foi interrompida com adição de 45 mL de água

destilada, transferindo o conteúdo do tubo para um Erlenmeyer de 250 mL. Essa mistura foi

autoclavada a 121ºC por 30 minutos (ROCHA, 2000).

O conteúdo do Erlenmeyer foi filtrado em filtro de placa porosa de vidro sinterizado nº

4, previamente tarado. O resíduo sólido foi lavado com água destilada, seco em estufa a

105ºC até peso constante para a determinação da massa de lignina insolúvel (Klason). A

fração solúvel foi diluída para 100 ml em um balão volumétrico e utilizada para a

determinação dos teores de glicose, xilose e ácido acético por cromatografia líquida. A partir

dessas concentrações foram calculados os teores de glucana, xilana e acetil, multiplicando as

porcentagens de cada composto por 0,9, 0,88 e 0,72, respectivamente. Os fatores

mencionados se referem à adição de água aos polissacarídeos durante a hidrólise ácida.

O teor de lignina solúvel em ácido foi determinado por medida de absorbância em 205

nm. Para o cálculo da concentração de lignina solúvel foi utilizada uma absortividade de 105

L/g.cm nesse comprimento de onda (DENCE, 1992).

4.6.1 Determinação do teor de cinzas

O teor de cinzas do bagaço foi determinado de acordo com metodologia de Silva e

Queiroz (2005). Dois gramas do bagaço foram pesados em cadinho de porcelana previamente

calcinado e tarado a 300°C por 2 h a 1100°C pelo mesmo tempo. Após a calcinação do

material nas mesmas condições, o cadinho foi resfriado em dessecador e pesado. O teor de

cinzas foi calculado pela diferença entre as massas do cadinho com cinzas e vazio (Equação

7).

56

Cinzas (%) = (M2 – M1)/M3x100 (7)

Onde:

M1 = massa do cadinho calcinado;

M2 = massa do cadinho com cinzas;

M3 = massa do bagaço seco.

4.6.2 Determinação de ácidos urônicos

A determinação de ácidos urônicos foi realizada pelo método colorimétrico do ácido

sulfúrico-carbazole de acordo com Li et al. (2007). Um volume de 0,4 mL do hidrolisado

ácido, obtido da hidrólise da hemicelulose com ácido sulfúrico concentrado (item 4.6), foi

adicionado em tubo de ensaio, seguido por 2,4 mL de ácido sulfúrico concentrado. Quando a

mistura atingiu temperatura ambiente foi adicionado 0,1 mL de solução carbazole (0,1 % m/v

em etanol). O tubo foi fechado com filme de polietileno e aquecido em banho-maria a 100°C

por 20 min, seguido por resfriamento em banho de gelo. Realizou-se leitura da absorbância

em espectrofotômetro a 525 nm, a qual foi convertida em concentração de ácido urônico

através da curva analítica com ácido galacturônico (17 a 139 nmol/mL).

4.7 EFICIÊNCIA DA EXTRAÇÃO DE HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-

AÇÚCAR

A eficiência da extração de hemicelulose foi calculada relacionando a quantidade de

hemicelulose obtida (g) pela quantidade de bagaço submetido ao pré-tratamento (g), segundo

a equação 8.

E= Wx * 100 (8) F*Wb Onde:

E = eficiência da extração (%)

Wx = massa de hemicelulose obtida

Wb = massa de bagaço hidrolisado

F= porcentagem de hemicelulose presente no bagaço.

57

4.8 SOLUBILIDADE DA HEMICELULOSE

A solubilidade da hemicelulose foi determinada de acordo com método de Bailey;

Biely; Poutanen, 1992. O método consistiu em preparar uma solução de xilana 1% em tampão

acetato de sódio 50 mM, pH 4,8, em um Erlenmeyer de 250 mL. O frasco foi tampado com

filme de policloreto de vinila (PVC) e aquecido sob agitação magnética até atingir o ponto de

ebulição, em seguida a solução foi resfriada e permaneceu sob agitação de 80 rpm por uma

noite a 25°C. A solução foi centrifugada a 10000xg por 15 min para separação do material

insolúvel, o qual foi seco em estufa a 60°C até massa constante.

4.9 ANÁLISE DA HEMICELULOSE POR ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO

As amostras de hemicelulose foram secas em estufa a 60°C por uma noite, moídas em

almofariz e armazenadas em dessecador. A análise foi realizada com cerca de 2 mg de

amostra homogeneizada com 225 mg de KBr, utilizando um equipamento Perkin Elmer -

Spectrum GX. Os espectros de IR foram obtidos a partir de 32 scans, na região entre 4000 e

400 cm-1, e digitalizados em intervalos de 4 cm-1. A linha de base foi corrigida em regiões

próximas a 4000, 2400 e 800 cm-1, e o espectro normalizado em 900 cm-1. Os dados foram

analisados por análise de componentes principais (PCA) utilizando os softwares FAEN e

BIOTEC.

4.10 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLAR DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE

CANA

A massa molar da hemicelulose foi determinada por cromatografia de exclusão

molecular em uma coluna Superdex 200 (30 x 1 cm – Amershan Bioscience). As amostras

foram dissolvidas em solução NaOH 0,5 % em uma concentração de 2 g/L de hemicelulose, o

volume de injeção foi de 100 µL, fluxo de 0,3 mL/min sendo o eluente solução de NaOH 0,1

% (SARBU; GONÇALVES; PINHO, 2003). A coluna foi calibrada com polietileno glicol

(PEG) (10000 e 6000 g/mol), albumina (67000 g/mol), tripsinogênio (24000 g/mol) e

lisozima (14000 g/mol). Os dados da calibração foram linearizados em uma equação do tipo

log M= a + bVe, onde M é a massa molar e Ve o volume de eluição, a e b representam os

58

coeficientes da equação.

A detecção da hemicelulose eluída da coluna foi feita pelo método do fenol/ácido

sulfúrico (DUBOIS et al., 1956). A área dos cromatogramas correspondente aos picos foi

dividida em n áreas parciais. Cada área parcial foi aproximada à área de um trapézio, sendo

que cada incremento de volume de eluição a massa molar (Mi) foi calculada pela curva de

calibração. A massa molar numérica média (Mn) e massa molar média (Mw) foram

calculados através das seguintes equações 9 e 10:

Mn = ∑Áreai Eq. (9)

∑Áreai/Mi

Mw = ∑Áreai

4.11 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA HEMICELULOSE EXTRAÍDA DO BAGAÇO DE

CANA-DE-AÇÚCAR

Mi Eq. (10)

∑Áreai

A polidispersidade foi calculada pela relação Mw/Mn.

Os experimentos foram conduzidos em tubos de centrífuga de 50 mL com tampa,

contendo 6,0 mL de tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5) em banho-maria a 50°C com

agitação de 120 rpm. Dependendo do experimento variou-se a concentração de hemicelulose,

enzimas e tempo de incubação. Para prevenir a contaminação microbiológica foi adicionado

azida sódica 0,01 % (m/v). A reação foi conduzida com as enzimas de A. niger, T. reesei e T.

aurantiacus produzidas em farelo de trigo (item 4.1). Em intervalos de tempo foram coletados

os tubos para o monitoramento do teor de açúcares e xilo-oligossacarídeos. Após atingir o

tempo reacional, o pH da reação foi corrigido para 6,5, e os tubos aquecidos em banho-maria

a 100°C durante 5 minutos (ISHIHARA et al., 1997). As amostras foram previamente

centrifugadas a 10000xg por 15 minutos (KALOGERIS et al., 2003).

Para maximizar a hidrólise da hemicelulose foram realizados ensaios com as variáveis:

concentração de substrato (% m/v) e atividade enzimática (U/g), de acordo com um

planejamento fatorial 22 completo com triplicata no ponto central (Tabela 2). A variável-

resposta foi conversão em xilo-oligossacarídeos (XOs total).

59

Tabela 2- Planejamento fatorial completo 22 para avaliação da hidrólise enzimática da hemicelulose.

Experimento Substrato (% m/v) Enzima (U/g)

1 0,5 80

2 0,5 40

3 3,5 80

4 3,5 40

5* 2 60

* experimentos realizados em triplicata, correspondentes ao ponto central

A conversão da hemicelulose em XOs foi calculada pela relação entre a massa de

oligômeros gerados pela massa de hemicelulose inicial. A conversão da hemicelulose em

xilose foi calculada pela relação entre a massa de xilose gerada pela massa inicial de

hemicelulose. A conversão total foi calculada pela relação entre a soma das massas de xilose e

XOs gerados pela massa de hemicelulose inicial. A concentração de XOs (mg/mL) foi obtida

pela soma das concentrações de X2 + X3 + X4 + X5 presentes no hidrolisado, determinados

por cromatografia líquida.

4.12 HIDRÓLISES ENZIMÁTICAS SUCESSIVAS DA HEMICELULOSE

O resíduo não hidrolisado, proveniente da hidrólise enzimática (item 4.11), foi

separado por centrifugação a 10000xg por 15 min. Uma nova hidrólise foi realizada nas

mesmas condições. A massa de resíduo não hidrolisado foi determinado pela diferença da

massa inicial pela massa de produtos formados (XOs e xilose).

4.13 AUTO-HIDRÓLISE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

A auto-hidrólise foi realizada com o bagaço in natura e moído a 14 e 25 mesh. Foram

utilizadas ampolas de capacidade 200 mL, confeccionadas em aço-inox, com aquecimento

em banho de óleo com controle de temperatura. Ao final das reações (5, 15, 20, 25, 30, 35

45 e 60 min) o resíduo sólido e o hidrolisado foram separados por filtração e caracterizados

quanto à concentração de xilose, arabinose, xilo-oligossacarídeos e furfural por

60

cromatografia líquida. Uma amostra do resíduo seco foi caracterizada quimicamente para

avaliar a eficiência do processo de remoção da fração hemicelulósica do material

lignocelulósico, segundo metodologia apresentada no item 4.6.

4.14 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS

As concentrações de oligossacarídeos foram determinadas por cromatografia líquida

de alta eficiência (CLAE), em equipamento WATERS, nas seguintes condições: coluna BIO-

RAD Aminex HPX-42A (300 x 7,8 mm); temperatura: 60°C; eluente: água ultrapura com

fluxo 0,6 mL/min; volume de amostra: 20 µL; detector: índice de refração (Waters 2414). O

pH das amostras foram previamente ajustados para 6,5 com NaOH 1 M e filtradas em filtro

“Sep-Pack” C18. Foram utilizados como padrões soluções de xilose (Sigma) e de xilobiose

(X2), xilotriose (X3), xilotetraose (X4) e xilopentaose (X5) (Megazyme-Irlanda).

4.15 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES, ÁCIDO ACÉTICO E

FURFURAL

As concentrações de glicose, xilose, arabinose e ácido acético foram determinadas por

CLAE, utilizando uma coluna Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) mantida a 45°C,

detector de índice de refração WATERS 2414, fase móvel de H2SO4 0,005 M, fluxo de 0,6

mL/min, volume de amostra injetada de 20 μL. As amostras foram previamente filtradas em

filtro “Sep-Pack” C18 (Millipore).

As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural foram determinados utilizando

uma coluna Waters Resolve C18 (300 x 3,9 mm) mantida a 30°C, detector UV em 276 nm

(WATERS 2489), fase móvel composta por acetonitrila:água 1:8 com 1 % de ácido acético

(degaseificada), fluxo de 0,8 mL/min, volume de amostra injetada de 20 μL. As amostras

foram previamente filtradas em membrana de 0,45 µm (Millipore). As concentrações de

furfural e hidroximetilfurfural foram calculadas com curva de calibração obtida com padrões

e convertidas nos respectivos polissacarídeos de origem através dos fatores 1,29 e 1,37,

respectivamente para celulose e hemicelulose.

61

4.16 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (TLC)

Os produtos da hidrólise enzimática de xilanas de bagaço de cana-de-açúcar, bétula e

semente de aveia foram analisados por cromatografia em camada delgada para identificar os

XOs formados. A cromatografia ascendente foi realizada em placas de sílica gel 60 F254

(Merck) empregando como solvente uma mistura de acetato de etila:ácido

acético:propanol:ácido fórmico:água (25:10:5:1:15) (PUCHART; BIELY, 2008). A solução

reveladora foi preparada dissolvendo-se 1,8 g de N-(1-Nafitil)-etilenodiamina dihidrocloreto

em 200 mL de etanol e, sob agitação constante, foi adicionado lentamente 20 mL de ácido

sulfúrico concentrado.

As amostras e padrões foram colocadas a 1 cm da parte inferior da placa através de

aplicações sucessivas de 1 μL (2 a 4 aplicações), a uma distância de 0,8 cm uma da outra,

secas com um secador de ar quente a cada aplicação. Uma cuba com tampa foi utilizada para

acondicionar o solvente e a placa, que foi colocada na posição vertical. Após o solvente

ascender ao topo da placa, esta foi retirada e seca com secador de ar quente até que estivesse

livre de solvente. A revelação das amostras foi realizada por imersão da placa na solução

reveladora e seca em estufa a 110°C por aproximadamente 5 min ou até o aparecimento de

manchas.

4.17 ENSAIOS DE INDUÇÃO DE ENZIMAS DE T. aurantiacus

Cerca de 104 esporos de T. aurantiacus foram inoculados em 25 mL de meio

preparado com sais de Vogel e 1 % de glicose (pH 5,8) em Erlenmeyer de 125 mL. Os frascos

foram incubados a 45°C por 72 h em condição estática. O excesso de líquido foi então

retirado e o micélio lavado com 100 mL de água destilada e autoclavada (15 min/1 atm).

Meios preparados com sais de Vogel e 20 mM de xilose, xilobiose ou xilana hidrolisada

enzimaticamente (HXBC) foram adicionados aos frascos contendo micélio. A concentração

final foi de 20 mM, correspondente a 3,5 mg/mL de xilose, 7 mg/mL de xilobiose e 6.8

mg/mL de HXBC. A composição de HXBC era xilose, xilobiose e XOs e foi produzido pela

hidrólise da hemicelulose do bagaço com enzimas de T. aurantiacus (2,6 % de hemicelulose,

60 U/g de xilanase, 96 h a 50°C).

Após 6, 10, 24 e 30 h de cultivo a 45°C e 120 rpm amostras foram retiradas e

62

centrifugadas a 10000xg por 15 min e no sobrenadante foram determinadas as atividades de

celulases e hemicelulases, o consumo de substrato foi monitorado por cromatografia líquida.

63

5. RESULTADOS

5.1 EXTRAÇÃO DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

Com o objetivo de maximizar a extração de hemicelulose foram investigadas as

condições de pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar com hidróxido de sódio, realizando

a análise dos efeitos das variáveis: tempo, temperatura e concentração de peróxido de

hidrogênio.

5.1.1 Análise química do bagaço de cana-de-açúcar

A composição química do bagaço está apresentada na tabela 3. A conversão dos

açúcares em seus respectivos polissacarídeos revelou 44,9 % de celulose e 27,5 % de

hemicelulose. O teor de lignina foi calculado como a soma dos valores de lignina solúvel e

insolúvel em ácido sulfúrico e correspondeu a 22,1 %. Para o cálculo de rendimento de

extração de hemicelulose foi utilizada a porcentagem de hemicelulose de 25,2 % (xilose +

arabinose, sem ácido acético), uma vez que no processo de extração da hemicelulose em meio

alcalino ocorre saponificação dos grupos acetil.

Os valores obtidos para a composição do bagaço estão próximos da faixa reportada em

outros trabalhos, ou seja, 32-44 % de celulose, 27-32 % de hemicelulose, 19-24 % de lignina

e 1,5-5 % de cinzas (PANDEY et al., 2000; SIXTA, 2006). As variações no teor desses

componentes ocorrem em função de fatores como a espécie da cana e o tempo de colheita

(Tabela 4).

Tabela 3- Composição química do bagaço de cana-de-açúcar. Componentes % (m/m)

Glicose 49,89 ± 0,70

Xilose 25,33 ± 0,12

Arabinose 3,31 ± 0,10

Ácido acético

Lignina

3,20 ± 0,08

22,1 ± 1,03

Cinzas 1,61 ± 0,16

Extrativos 4,11 ± 0,07

64

Tabela 4- Composição do bagaço de cana-de-açúcar de diferentes procedências.

Composição (% massa seca)

Celulose Hemicelulose Lignina Cinzas Referências

50 25 25 2,4 Pandey et al., 2000

38,9 26,19 23,9 - Rodríguez-Chong et al., 2004

41 25,2 23 1,1 Pessoa et al., 1997

40 24 25 - Saha, 2003

35 35,8 16,1 - Sasaki et al., 2003

43,6 33,5 18,1 2,3 Sun et al., 2004a

46,2 27,8 22,1 1,0 Santos et al., 2009

44,9 27,5 22,1 1,6 Presente trabalho

(-) não apresentado

Com relação ao percentual de hemicelulose, o valor encontrado para o bagaço de cana-

de-açúcar foi semelhante ao da palha de trigo (26 %) (CANILHA, 2006) e um pouco superior

ao da palha de arroz (22 %) (GARROTE et al., 2007; MUSSATO, 2002) e eucalipto (17,3 %)

(KABEL et al., 2002; PARAJÓ; ALONSO; SANTOS, 1995).

O bagaço apresentou um baixo teor de cinzas (1,61 %) quando comparado com alguns

materiais, como a palha de arroz (13,3 %) (SUN et al., 2000a), sabugo de milho (8,6 %)

(GASPAR et al., 2005) e palha de trigo (10,1 %) (THOMPSON et al., 2003).

5.1.2 Extração alcalina da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar

As hemiceluloses extraídas com álcali apresentaram cor escura e baixa solubilidade

em água (34 ± 4 %). O tratamento com NaOH, NaOH/antraquinona (NaOH/AQ) e

NaOH/sulfito resultou em uma extração de 72,7, 76,5 e 76,4 % da hemicelulose,

respectivamente (Tabela 5). O rendimento foi próximo para as três extrações e superiores ao

obtido por Xu et al. (2006) (55,7 a 57,3 %) quando utilizaram NaOH. Uma explicação para

essa diferença pode estar relacionada ao modo de separação da hemicelulose. No trabalho de

Xu et al. (2006) a hemicelulose foi separada por filtração e neste trabalho o procedimento

usado foi a decantação. Esse procedimento evitou perdas de hemicelulose, por exemplo por

aderência ao filtro.

65

Tabela 5- Rendimento de extração e composição da hemicelulose obtida com NaOH 1 M, NaOH/AQ e NaOH/Sulfito a 25°C por 18 h. Composição da hemicelulose (% massa seca)

Rendimento

extração (%) Lignina Xilose Arabinose Glicose Ac urônico Total

NaOH1 72,70a ± 4,43 9,09b ± 0,37 54,79± 1,98 6,05± 0,19 3,79 ± 0,35 5,14 ± 0,14 78,86

NaOH/AQ2 76,50a ± 4,22 11,17c ±1,02 52,88± 2,14 5,73± 0,15 3,26 ± 0,25 5,12 ± 0,37 78,16

NaOH/Sulfito3 76,40a ± 3,37 7,43d ± 0,34 57,82± 1,15 6,39± 0,13 3,94 ± 0,26 4,57 ± 0,22 80,15

Concentração de AQ e Sulfito: 0,3 % (m/m) a, b, c e d: Letras semelhantes, na mesma coluna, indicam médias estatisticamente iguais (análise de semelhança estatística realizada com Design Expert); Rendimento de extração calculado descontando-se a massa de lignina.

As hemiceluloses extraídas do bagaço com NaOH, NaOH/AQ e NaOH/Sulfito

apresentaram respectivamente 9,0, 11,2 e 7,4 % de lignina (Tabela 5). No trabalho de Xu et

al. (2006) o conteúdo de lignina foi de cerca de 3 % quando utilizaram NaOH. Verificou-se

que a adição de 0,3% de antraquinona na etapa de extração proporcionou um pequeno

aumento no rendimento total, mas que não foi causado por maior retenção de carboidratos.

Sun et al. (2000b) mostraram que a adição de 0,05 % (m/v) de AQ resultou em pouco efeito

sobre a deslignificação da palha de trigo, mas resultou em aumento de 2,8% no rendimento de

extração da hemicelulose com peróxido de hidrogênio.

As condições utilizadas na extração da hemicelulose do bagaço não eliminaram toda a

lignina, tendo em vista que as ligações éter glicosídicas e a ligação carboidrato-lignina são

relativamente estáveis nessas condições (LAWOKO; HENRIKSSON; GELLERSTED, 2003).

Em função dessa ligação, a lignina comercial apresenta de 2 a 8% de carboidratos (SINGH et

al., 2005). Saake et al. (2004) também relataram a extração de hemicelulose de semente de

aveia com teor de 14,5 % de lignina e rendimento em massa de polissacarídeo de 34,6%. Os

autores observaram que nas condições experimentais: NaOH 5 % (m/v), 1h e temperatura (70

- 90°C), obteve-se um rendimento de extração de 34,6-40,4 % e 14,5-15,4 % de lignina

residual.

66

5.1.3 Otimização da extração da hemicelulose

O pré-tratamento alcalino mostrou-se efetivo para a extração da hemicelulose do

bagaço de cana, no entanto para melhorar o rendimento de extração e obter uma hemicelulose

mais solúvel foram testadas novas variáveis de tratamento que levassem a um menor teor de

lignina sem comprometer o rendimento da extração. Desta forma, os reagentes antraquinona e

sulfito foram desconsiderados na otimização da extração da hemicelulose já que não

trouxeram grandes benefícios ao processo.

Para a otimização da extração da hemicelulose, variou-se o tempo, a temperatura, a

concentração de peróxido de hidrogênio e de sulfato de magnésio. Optou-se por um

planejamento 24 completo, esperando encontrar o máximo global nesse intervalo. As análises

referentes à composição de açúcares e concentração de lignina estão apresentadas na tabela 6

que mostra as variáveis para cada um dos ensaios realizados, sendo os ensaios 17, 18 e 19

repetições no ponto central.

Os rendimentos de extração da hemicelulose variaram de 38,3 a 94,5%. O menor

rendimento foi obtido usando as variáveis no nível mais baixo, exceto para sulfato de

magnésio (ensaio 9) e o maior rendimento foi obtido na condição do ponto central (Tabela 6).

Observa-se uma tendência de aumento do rendimento de hemicelulose ao variar o peróxido de

hidrogênio de 2 para 6%. O tempo foi outro fator que influenciou a eficiência de extração da

hemicelulose, indicando que maiores tempos de extração podem ser importantes para maiores

rendimentos, contudo tempos de extração maiores que 10 h podem ocasionar alterações na

estrutura molecular do polissacarídeo (CAI et al., 2008).

A análise estatística foi realizada com a massa de extração de hemicelulose para

considerar o teor de lignina residual presente em cada ensaio. A concentração de peróxido de

hidrogênio e o tempo de tratamento tiveram um efeito significativo com um sinal positivo,

indicando que o rendimento da hemicelulose foi maior quando essas variáveis foram

aumentadas. A maior influência na resposta foi produzida por peróxido de hidrogênio (p <

0,01). O sulfato de magnésio resultou em efeito negativo na extração da hemicelulose, e

apenas a temperatura (A) não influenciou significativamente o rendimento de extração de

hemicelulose, entretanto, apresentou interações com as demais variáveis (Tabela 7). As

interações da temperatura com peróxido de hidrogênio (AB) e sulfato de magnésio (AD)

apresentaram efeito positivo, enquanto que a interação com o tempo (AC) foi negativa. Deste

modo, o seu efeito não deve ser descartado, principalmente em função da interação negativa

entre as variáveis, temperatura e tempo de reação. A combinação da temperatura e tempo nos

67

níveis altos deve ser evitada para a obtenção de maior rendimento de extração. Xu et al.

(2006) observaram que fixando o tempo reacional, a temperatura apresentou baixa influência

no rendimento de extração da hemicelulose. Nas temperaturas de 20 e 40°C obteve 55,5 e

62,1% de rendimento de extração, respectivamente.

Tabela 6. Rendimento de hemicelulose (%) extraída do bagaço de cana-de-açúcar com H2O2 em meio alcalino proveniente do planejamento 24 completo.

Nível das variáveis

Ensaio A B C D Rendimento de extração

da hemicelulosea (%) Ligninab (%)

1 20 2 4 0 52 10 2 60 2 4 0 49,1 10,2 3 20 6 4 0 86 5,9 4 60 6 4 0 74,2 12,2 5 20 2 16 0 67 14,1 6 60 2 16 0 49,5 13,7 7 20 6 16 0 78 7,4 8 60 6 16 0 60,8 9,6 9 20 2 4 0,5 38,3 9,3

10 60 2 4 0,5 46 9,1 11 20 6 4 0,5 52,5 5 12 60 6 4 0,5 79,8 7,2 13 20 2 16 0,5 72,6 12,9 14 60 2 16 0,5 66,6 9,2 15 20 6 16 0,5 60,9 4,6 16 60 6 16 0,5 64,9 6,1 17 40 4 10 0,25 90,5 11 18 40 4 10 0,25 93,5 10,4 19 40 4 10 0,25 94,5 8,9

A: Temperatura (oC); B: Concentração de H2O2 (%); C: Tempo de reação (h); D: Sulfato de magnésio (%)

(a) Rendimento de extração calculado descontando-se a massa de lignina.

(b) Representa o conteúdo de lignina associado às hemiceluloses

Muitos trabalhos reportam que a extração de hemicelulose é proporcional ao aumento

no tempo e concentração de peróxido de hidrogênio (FANG et al., 1999; SUN et al., 2000a,

CAI et al., 2008), entretanto, os resultados mostraram um mesmo rendimento de extração da

hemicelulose usando o maior tempo e menor concentração de peróxido de hidrogênio ou vice-

versa.

68

Tabela 7 – Análise de variância do modelo e significância estatística dos efeitos das variáveis sobre o rendimento de extração de hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com H2O2 em meio alcalino.

Fatores Efeitos Soma quadrática Graus de

liberdade

Média

quadrática

Nível de

significância (p)

A -2,41 10,68 1 10,68 0,5259

B* 18,15 607,0 1 607,0 0,0030

C* 9,38 162,24 1 162,24 0,0112

D* -8,95 147,56 1 147,56 0,0123

BC* -20,77 83,49 1 83,49 0,0214

AD* 14,33 286,03 1 286,03 0,0064

AC* -12,46 378,4 1 378,4 0,0048

CD* 9,95 795,66 1 795,66 0,0023

BD* -9,76 175,63 1 175,63 0,0103

AB* 6,73 182,45 1 182,45 0,0099

Curvatura 38,56 2739,39 1 2739,39 0,0004

Erro total 6,73 3,68 2 3,68

Total 5717,67 18 5717,67

Modelo 2889,6 13 222,28 0,0221

Resíduo 88,68 4 22,17

Falta de

ajuste

145,43 5 29,09 0,0606

Erro puro 3,68 2 1,84

Total 5717,67 18

Variáveis: A: Temperatura; B: Concentração de H2O2; C: Tempo de reação; D: Sulfato de magnésio

(*) Efeito significativo ao nível de 95% de probabilidade (p ≤ 0,05), R2 = 0,97

O sulfato de magnésio e sua interação com peróxido de hidrogênio apresentaram

efeitos negativos na extração de hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar. A resposta à

adição de MgSO4 no rendimento de extração deve ser analisado com cautela, podendo

desempenhar ou não uma ação positiva durante o tratamento com peróxido de hidrogênio,

dependendo do grau de contaminação do material por metais. Em meio alcalino, o peróxido se

decompõe gerando o anion peridroxila (HOO-), um oxidante poderoso e seletivo capaz de atacar

a maior parte da lignina que está fortemente ligada à hemicelulose (FANG et al., 1999;

LAPIERRE; BERRY; BOUCHARD, 2003). O fato dos íons Mg+2 preservarem o peróxido,

evitando sua decomposição catalítica a radicais hidroxilas (HO·) que atacam tanto a

hemicelulose quanto a lignina, traz como resultado uma melhor deslignificação, mas do ponto

69

de vista do rendimento total significa perda de massa. Embora a decomposição do peróxido

seja necessária para que ocorra a deslignificação, a velocidade de decomposição deve ser

reduzida.

A adição de sulfato de magnésio em baixas concentrações resultou em maior

rendimento da hemicelulose, como pode ser evidenciado na condição do ponto central. Nessa

condição, a presença de íons magnésio não prejudicou o rendimento da extração, atingindo

valores superiores a 90 %.

A adição de MgSO4 em excesso (0,5 % m/m) limitou a extração da hemicelulose

ocasionada provavelmente pela redução do álcali pela formação de Mg(OH)2, condição em

que ocorre a complexação de metais (FANG et al., 1999). Um efeito negativo do excesso de

magnésio também foi reportado no branqueamento de polpas, o que segundo o autor, ocorreu

porque em excesso o magnésio torna a consumo do peróxido muito lento (WÓJCIAK, 2006).

Verifica-se um decréscimo do rendimento de extração de hemicelulose ao trabalhar

com as variáveis no nível alto ou no nível inferior. Este comportamento indica que o ponto

ótimo da extração de hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar localiza-se dentro da região

estudada, provavelmente próximo das condições do ponto central.

A análise de variância indica que o modelo linear é significativo, o que ocorre se

considerar a falta de ajuste não significativa para 90 % de confiança (Tabela 7).

Considerando-se que a curvatura apresentou significância estatística, um modelo quadrático

provavelmente explicaria melhor o rendimento de extração de hemicelulose. Entretanto, os

rendimentos obtidos no ponto central, 90,5 a 94,5 %, são bastante satisfatórios e torna-se

desnecessária a expansão do planejamento fatorial com o objetivo de otimização (Figura 11).

Empregando a análise de regressão múltipla nos dados experimentais a resposta predita para o

rendimento de hemicelulose pode ser obtida pela equação 11, onde um modelo linear foi

utilizado para ilustrar o efeito do peróxido de hidrogênio e tempo de reação no rendimento de

extração da hemicelulose:

y1 = 59.38 + 6.86x2 + 2.49x3 − 3.37x1x3 + 4.88x1x4 − 5.80x2x3 −2.83x2x4 + 3.22x3x4 (11)

Onde x1, x2, x3 e x4 são as variáveis codificadas, temperatura de extração (°C), concentração

de peróxido de hidrogênio (%), tempo de extração (h) e concentração de sulfato de magnésio

(%), respectivamente.

70

O melhor rendimento de extração da hemicelulose ocorreu na condição de baixa

remoção de lignina (Tabela 6), entretanto para algumas aplicações esta hemicelulose não é a

mais apropriada. A hemicelulose extraída com 6 % de peróxido de hidrogênio por 4 h a 20°C

apresenta maior potencial de uso, pois apresenta um teor reduzido de lignina sem

comprometer muito o rendimento da extração (86 %).

Figura 11. Superfície de resposta mostrando o efeito do peróxido de hidrogênio (x2) e tempo de reação (x3) no rendimento de hemicelulose.

5.1.4 Avaliação do teor de lignina residual na hemicelulose

O conteúdo de lignina, baseado na massa seca da hemicelulose, variou de 4,6 a 14,1%,

dependendo da condição de extração (Tabela 6). Os experimentos realizados em altas

concentrações de peróxido de hidrogênio causaram a maior remoção de lignina e praticamente

não interferiram no rendimento de extração da hemicelulose. Apenas as concentrações de

peróxido de hidrogênio e sulfato de magnésio influenciaram significativamente no teor de

lignina residual da hemicelulose (Tabela 8), com um sinal negativo indicando que a remoção

de lignina foi maior quando os níveis de peróxido de hidrogênio e sulfato de magnésio foram

mais altos.

Conforme a tabela 9, um modelo linear apresenta significância estatística (p< 0,05) e

71

boa capacidade de predição, conseguindo explicar acima de 95% da variabilidade

experimental para a resposta lignina residual, conforme mostrado pelo valor de R².

Considerando-se a boa concordância entre os valores observados e preditos pelo modelo, além

de sua significância estatística, os valores do teor de lignina residual foram ajustados ao

modelo linear, o qual está apresentado na Equação 12.

Tabela 8 - Significância estatística dos efeitos das variáveis sobre o teor de lignina residual da

hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar. Fatores Efeitos Soma

quadrática

Graus de

liberdade

Média

quadrática

Nível de

significância (p)

A 1,95 4,07 1 4,07 0,3005

B* -7,36 57,90 1 57,90 0,0013

C 2,11 4,76 1 4,76 0,2647

D* -4,75 24,12 1 24,12 0,0210

Curvatura 1,48 2,34 1 2,34 0,4282

Erro total 2,14 2 2,14

Total 138,75 18 138,75

A: Temperatura; B: Concentração de H2O2; C: Tempo de reação; D: Sulfato de magnésio (*) Efeito significativo ao nível de 95% de probabilidade (p ≤ 0,05), R2 = 0,96.

Tabela 9- Análise de variância para os modelos estatísticos correspondentes às variáveis respostas: rendimento de extração e lignina residual da hemicelulose, em função das variáveis estudadas.

Variável

resposta

Fonte Soma

quadrática

Graus de

liberdade

Média

quadrática

Nível de

significância (p)

Lignina Modelo 82,03 2 41,01 0,0010

residual Resíduo 15 3,63

Falta de ajuste 43,41 11 3,95 0,2324

Erro puro 2,14 2 1,07

R² =0,96 Total 138,75 18

Y1= 9,16 – 1,90x2 – 1,23x4 (12)

Onde x2 e x4 foram as variáveis codificadas, concentração de peróxido de hidrogênio (%), e

concentração de sulfato de magnésio (% m/m), respectivamente.

72

A equação apresentada permitiu a obtenção de superfície de resposta para a resposta

teor de lignina residual em função da concentração de peróxido de hidrogênio e sulfato

magnésio, dentro da região estudada, conforme mostrado na figura 12. A superfície foi obtida

considerando o efeito da temperatura (A) no nível baixo (-1), uma vez que esta variável não

influenciou significativamente no teor de lignina residual. O tempo reacional (C) foi

considerado no nível alto (+) por ter influenciado significativamente no rendimento de

extração da hemicelulose.

Figura 12. Superfície de resposta descrita pelo modelo linear para o teor de lignina residual na

hemicelulose em função das variáveis significativas.

A superfície de resposta para o teor de lignina residual indica que o menor teor de

lignina está presente quando se trabalha com o nível alto das variáveis concentração de

peróxido de hidrogênio e sulfato de magnésio. Entretanto, nessas condições, a extração de

hemicelulose é inferior a 70 % (Tabela 6). A obtenção de baixo teor de lignina residual

proporciona também um baixo rendimento na extração de hemicelulose. A condição do ensaio

3 (Tabela 6) foi a que resultou em uma hemicelulose com baixo teor de lignina (5,9 %) e

ainda assim apresentou um alto rendimento de extração (86 %).

73

5.1.5 Caracterização das hemiceluloses

As hemiceluloses do bagaço, obtidas nas diferentes condições de extração

apresentaram conteúdo semelhante de xilose, mas diferenças nos outros componentes (Tabela

10). Os maiores teores de arabinose e glicose foram obtidos em experimentos com a

temperatura no nível mais alto. O conteúdo de glicose (3,8 – 7,9 %) foi superestimado por

pequenas quantidades de manose e galactose presentes nas hemiceluloses.

Tabela 10- Composição química da hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar com H2O2 em meio alcalino proveniente do planejamento 24 completo.

Composição da hemicelulose (%) Exp Xilose Arabinose Glicose ácidos

urônicos Total

1 80,4 4,4 3,9 4,4 93,1 2 79,3 5,7 6,0 5,5 96,5 3 80,9 3,8 4,2 3,9 92,8 4 77,0 6,0 5,0 6,9 94,8 5 79,0 5,1 4,6 5,5 94,1 6 79,2 6,5 6,1 6,5 98,3 7 77,9 4,8 3,8 4,3 90,7 8 74,9 6,1 6,4 5,2 92,6 9 76,9 5,7 5,4 7,0 95,0

10 80,1 6,5 7,9 4,4 98,9 11 75,5 5,3 4,7 5,2 91,0 12 73,1 7,2 7,2 5,8 93,4 13 74,9 5,3 5,8 5,3 91,3 14 73,5 6,9 6,6 6,5 93,5 15 76,7 7,0 5,4 6,6 95,6 16 79,1 5,8 5,2 3,6 93,8 17 78,6 6,8 6,5 6,5 98,4 18 78,1 5,8 5,4 6,5 95,9 19 82,6 6,2 5,6 5,2 99,7

A: Temperatura (oC); B: Concentração de H2O2 (%); C: Tempo de reação (h); D: Sulfato de magnésio (%)

Alguns pesquisadores relataram que além de promover a deslignificação e

branqueamento, o peróxido de hidrogênio tem efeito positivo na solubilização da

hemicelulose (SUN; TONKINSON, 1999; SUN; FANG; TONKINSON, 2000).

O ensaio de solubilidade foi realizado com a hemicelulose proveniente do ponto 3

(Tabela 6), a qual apresentou 90 ± 2,5 % de solubilidade em massa, muito superior à

hemicelulose extraída apenas com NaOH 1M (25°C/18 h) (34 ± 4 %). Essa diferença na

74

solubilidade pode estar relacionada à estrutura das hemiceluloses, pois segundo Fang et al.

(1999) a hemicelulose extraída com H2O2 permanece mais ramificada do que quando extraída

com NaOH. Isso ocorre porque na extração com H2O2 emprega-se uma concentração de álcali

muito menor, o que evita reações de degradação.

A figura 13 mostra fotografias das hemiceluloses obtidas em cada experimento, onde

se observa que as amostras com menor teor de lignina apresentam tonalidade mais clara. As

amostras correspondentes ao ponto central, os quais apresentaram maior rendimento de

extração, estão entre as de coloração escura. A análise visual das hemiceluloses aliada aos

dados de rendimento e conteúdo de lignina sugerem que o tratamento 3 seja o mais apropriado

para se obter uma hemicelulose com condições apropriadas para hidrólise enzimática.

Figura 13. Aspecto visual das hemiceluloses obtidas dos experimentos relativos ao planejamento 24 completo.

75

5.1.5.1 Análise espectroscópica (infravermelho médio) da hemicelulose do bagaço de cana-

de-açúcar

Os espectros de FT-IR de algumas amostras de hemiceluloses, com níveis

contrastantes de lignina e hemicelulose estão apresentados na figura 14. As amostras 1 e 16

foram escolhidas para análise de infravermelho por serem provenientes de condições opostas

do planejamento (nível baixo e alto), ao mesmo tempo apresentaram características como

rendimento e cor opostas ao experimento 17 (ponto central). Já as amostras 3 e 12 foram

selecionadas por apresentarem características inversas de rendimento e cor, mas teor de

lignina semelhante.

Os espectros de FT-IR apresentaram picos em 900 cm-1 que indica a presença

predominante de ligações β -glicosídicas (C-O-C) na hemicelulose (SUN; TOMKINSON,

2002). O pico em 980 cm-1 é referente à presença de arabinose, o qual é utilizado para

identificar a estrutura de arabinoxilana (SUN e TOMKINSON, 2002). O pico em 1050 cm-1

corresponde às vibrações das ligações C-O, C-C e C-OH (Figura 14). O pico em 1240 cm-1

indica a presença das ligações C-H, OH ou CH2 e em 1465 cm-1 indica CH2. A presença de

lignina é indicada pelo pico em 1510 cm-1, referente à vibração de anel aromático e confirmou

a presença de lignina principalmente nas amostras 1 e 17.

De modo geral a hemicelulose extraída do bagaço apresentou espectro típico desse

polissacarídeo sem muitas diferenças em função do tratamento com peróxido de hidrogênio.

Entretanto a intensidade do pico em 1650 cm-1 variou entre as amostras apresentando

correlação com a cor do material. O pico em 1650 cm-1 indica a presença de grupos C=O e

aumentou a intensidade das amostras mais claras (1 e 3) para as mais escuras (17 e 12). Além

do conteúdo de lignina, a cor do material pode ter relação, provavelmente, com processos

oxidativos que levam a formação de ácidos hexenurônicos, e cromóforos originados da

lignina. De acordo com Dalimova (2005), a intensidade do pico em 1650 cm-1 depende do

grau de oxidação. A ausência de picos na região de 1720 a 1750 cm-1 indica que o tratamento

com peróxido alcalino removeu os grupos ésteres da hemicelulose (FANG et al., 1999).

76

Figura 14. Espectro de FT-IR das hemiceluloses obtida por extração com H2O2 em meio alcalino (Os números 1, 3, 12, 16 e 17 são referentes aos experimentos do planejamento experimental 24 completo).

Para uma melhor exploração dos dados espectroscópicos foi realizada uma análise dos

componentes principais (PCA). Esta análise permite uma projeção multidimensional dos

dados construída através de uma combinação linear das variáveis originais, e identifica grupos

de amostras semelhantes.

Os dados do espectro de FT-IR correspondentes a região de 1800 a 800 cm-1 foram

tratados por análise de componentes principais (PCA). Nesta análise as principais variações

espectrais são descritas pelo primeiro componente principal (PC1), sendo as demais descritas

por PC2, PC3, etc, dos quais a combinação dos respectivos valores permite a construção de

gráficos onde são identificadas semelhanças ou diferenças entre as amostras em função da

dispersão. Os valores de PC1 mostraram distinção entre as amostras obtidas por extração

alcalina com peróxido de hidrogênio (Figura 15). A amostra 16 foi discriminada de um grupo

composto pelas amostras 1, 3 e 12, os quais também foram separados da amostra 17, ao longo

do eixo PC1, que contém a maioria das informações espectrais (85 %). As amostras 1, 3 e 12

foram discriminadas ao longo do eixo PC2.

77

Figura 15. Análise dos componentes principais do espectro de FT-IR da hemicelulose obtida com H2O2 em meio alcalino (Os números 1, 3, 12, 16 e 17 são referentes aos experimentos do planejamento completo 24).

A figura 16 indica em quais comprimentos de onda ocorre discrepância no cálculo dos

valores de PC1 e PC2. O gráfico mostrou que os comprimentos de onda mais relevantes estão

nas regiões de 1010, 1240, 1510 e 1650 cm-1, os quais são responsáveis pela maioria das

diferenças espectrais. Modificações nas ligações CH, OH e CH2 indicados pela alteração em

1240 cm-1 podem indicar a degradação de polissacarídeo. As diferenças em 1510 e 1650 cm-1

podem indicar a variedade entre as amostras no teor de lignina e grau de oxidação (ácido

hexenurônico e cromóforos), respectivamente.

-0,04-0,02

0,000,020,04

0,060,080,10

0,120,14

800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

cm-1

PC1PC2

Figura 16. Valores de contrastes entre PC1 e PC2 do espectro de FT-IR das amostras de hemicelulose extraídas com peróxido de hidrogênio em meio alcalino.

78

5.1.5.2 Determinação da massa molar da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar

A tabela 11 apresenta os valores da massa molar média e a polidispersidade das

hemiceluloses de bagaço de cana-de-açúcar. As frações de hemicelulose extraídas com

hidróxido de sódio, hidróxido de sódio/antraquinona e hidróxido de sódio/sulfito

apresentaram alta massa molar. As hemiceluloses extraídas com peróxido de hidrogênio em

meio alcalino apresentaram massa molar média inferior às extraídas com NaOH.

Provavelmente o peróxido extraiu fragmentos menores de hemicelulose que estavam ligados à

lignina, e também clivou internamente a cadeia de hemicelulose através das reações de

degradação, o que leva a redução da massa molar.

O emprego de H2O2 em concentrações de 4 ou 6 % (m/v) não causou diferença na

massa molar média, ensaios 19 e 11, respectivamente (Tabela 11). No entanto, se uma

concentração de peróxido da ordem de 0,5 % tivesse sido usada poderia ter obtido uma

hemicelulose com maior massa molar. Esse resultado foi relatado por Sun et al. (2004a) que

determinaram que o aumento na concentração de H2O2 de 0,5 para 3% levou a redução na

massa molar média de 34.070 para 23.340 g/mol, na hemicelulose extraída de bagaço de cana-

de-açúcar, em reação de 2 h a 55°C.

As frações de hemicelulose extraídas com hidróxido de sódio acrescido ou não de

antraquinona e sulfito e com peróxido de hidrogênio apresentaram um baixo índice de

polidispersidade (1,21 – 1,67). Sun et al. (2004) obtiveram índices de polidispersidade na

faixa de 4,4 a 8,1, indicando ampla faixa de distribuição molar. Apesar da massa molar da

hemicelulose extraída com peróxido de hidrogênio ser relativamente baixa, o baixo grau de

polidispersidade indica que as hemiceluloses apresentam cadeias homogêneas.

Tabela 11. Massa molar média (Mw), massa molar numérica média (Mn) e polidispersidade (Ip: Mw/Mn) das frações de hemicelulose extraídas do bagaço de cana-de-açúcar.

Condição de extração

da hemicelulose Mw (g/mol) Mn Ip

NaOH 46.396,81 38.475,83 1,21

NaOH + Antraquinona 41.188,57 33.909,09 1,21

NaOH + Sulfito 37.529,92 29.566,28 1,27

ensaio 3 (6 % H2O2) 21.118,97 14.928,35 1,41

ensaio 11 (6 % H2O2) 21.391,05 14.765,05 1,45

ensaio 19 (4 % H2O2) 22.185,75 13.309,37 1,67

Ensaios 3, 11 e 19 referem-se às hemiceluloses extraídas nas condições apresentadas na tabela 9.

79

5.2 PRODUÇÃO DE CELULASES E HEMICELULASES

Thermoascus aurantiacus, Aspergilus niger e Trichoderma reesei apresentaram uma

rápida colonização do meio preparado com farelo de trigo, em 10 dias de cultivo o meio

estava completamente tomado pelos fungos. De acordo com Dobrev et al. (2007) o farelo de

trigo apresenta de 20 a 30 % de arabinoxilana, o que provavelmente induziu a produção de

xilanases.

T. aurantiacus aumentou o pH do meio do segundo para o terceiro dia e depois disso o

pH permaneceu constante até 10 dias. O pH do meio da cultura de A. niger reduziu durante

os três primeiros dias, seguido por um aumento, enquanto o crescimento de T. reesei

provocou pouca variação do pH final do meio de cultivo (Figura 17).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

pH

tempo (dias)

A. niger

T. aurantiacus

T reesei

Figura 17: pH final do meio de cultivo de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei .

A máxima atividade de xilanase foi produzida por T. aurantiacus (1500 U/g) em 5

dias de cultivo. A. niger produziu 500 U/g e T. reesei 240 U/g no mesmo período (Figura 18).

A comparação dos resultados de xilanase com a de outros fungos (Tabelas 12 e 13) evidencia

o potencial de produção das xilanases por essas linhagens, apesar dos processos serem

diferentes no que diz respeito à aeração, umidade, agitação e fonte de carbono, variáveis que

afetam a produção de enzimas.

80

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2 3 4 5 6 7 8 9 10

Xila

nase

(U

/g)

tempo (dias)

A. niger

T. reesei

T. aurantiacus

Figura 18. Produção de xilanase por A. niger, T. aurantiacus e T. reesei em meio sólido com farelo de trigo (75 % umidade).

Tabela 12- Linhagens de Aspergilus sp produtoras de xilanase. Linhagem Xilanase UI/g Substrato Referência

A. niger B03 3750 Farelo de trigo Dobrev et al., 2007

A. niger Na-1.15 500 Sabugo de milho Yuan et al., 2005

A. niger 3T5B8 76,55 Farelo de trigo Couri et al., 2000

A. niger USM A1 I 33,99 Núcleo de palma Kheng et al., 2005

A. niger 500 Farelo de trigo Presente trabalho

Tabela 13 - Linhagens de T. aurantiacus produtoras de xilanase.

Linhagem Atividade (U/g)

Estabilidade térmica

Temperatura/ pH ótimo

Substrato Referência

- 45,5 - - farelo de trigo Stoilova et al., 2005 Miehe 535 60°C/1 h 75/5 sabugo de milho

- grama verde Da Silva et al., 2005

ATCC 204492 1597 - - BCA Milagres et al., 2004 - 500 - - BCA + farelo

arroz Santos et al., 2003

IMI 216529 6193 t½ 41 min/80°C

70/4,5 palha de trigo Kalogeris et al., 1998

- 705,7 55°C/15 dias 70/5 farelo de trigo Alam et al., 1994 179-5 1288,8 - - BCA + BL Martins et al., 2003 ATCC 204492 1500 50°C/30 dias 70-80/5 BCA Presente trabalho

BCA = bagaço de cana-de-açúcar; BL = bagaço de laranja; (-) = não informado/conhecido

81

T. aurantiacus e A niger não produziram altas atividades de celulases em farelo de

trigo, corroborando os resultados de Alam et al. (1994); Kitpreechavanich; Hayashi; Nagai

(1984) e Yu et al. (1987) que definiram esses fungos muito mais xilanolíticos do que

celulolíticos. T. aurantiacus produziu 6 U/g de endoglucanase a partir do quarto dia de

cultivo, enquanto que A. niger atingiu 15 U/g no terceiro dia (Figura 19).

Figura 19. Produção de endoglucanase por A. niger e T. aurantiacus em meio sólido com farelo de trigo (75 % umidade).

Aspergilus niger produziu cerca de 30 U/g de β-xilosidase a partir do quarto dia de

cultivo (Figura 20), valor superior ao obtido no trabalho de Couri et al. (2000) que relataram a

produção de 3,5 U/g de β -xilosidase. Entretanto há relatos de produção de elevados níveis

desta enzima por linhagens mutantes cultivadas em materiais lignocelulósicos (100 U/g)

(KANG et al., 2004).

T. aurantiacus produziu atividades inferiores a 0,5 U/g de β-xilosidase (Figura 20), o

que parece ser uma característica desta cepa, conforme já descrito por Milagres et al. (2004).

A presença de baixa atividade de β -xilosidase no extrato de T. aurantiacus é um aspecto

positivo, uma vez que o objetivo principal deste estudo é a obtenção de xilo-oligossacarídeos

por hidrólise enzimática, e essa enzima leva à formação de xilose.

82

Figura 20. Produção de β-xilosidase por A. niger e T. aurantiacus em meio sólido com farelo de trigo (75 % umidade). 5.2.1 Indução das enzimas de T. aurantiacus por sacarídeos relacionados à hemicelulose

A síntese de xilanase por T. aurantiacus é induzida durante o crescimento em xilanas e

em materiais lignocelulósicos. A indução das enzimas por esses substratos é geralmente

baixa, pois esses compostos não podem penetrar na célula por possuírem alta massa molar.

Fragmentos de xilana devem ser gerados para servirem de indutores das xilanases, conforme

já descrito para vários microrganismos (ARO; PAKULA; PENTTILÄ, 2005). A busca de tais

compostos ainda permanece um desafio para indução de xilanase em muitos microrganismos,

inclusive para T. aurantiacus.

Foi realizado um estudo com produtos de degradação da hemicelulose para indução de

xilanase de T. aurantiacus. Para isso utilizou-se uma grande massa micelial e uma pequena

concentração de indutores. Desta forma obtém-se uma resposta rápida, o que é esperado de

um verdadeiro indutor. Os experimentos de indução foram conduzidos em cultivos contendo

xilose, xilobiose e xilana hidrolisada enzimaticamente (HXBC) nas respectivas concentrações

de açúcares totais: 3,5, 7,0 e 6,8 mg/mL (Figura 21). Não foi detectada atividade na ausência

de indutores, portanto as atividades enzimáticas detectadas nos cultivos foram induzidas pelos

sacarídeos.

A xilanase foi produzida nos três meios de cultivo, mas a atividade em xilose e

xilobiose foi maior que em HXBC. A concentração de xilose empregada para induzir a

xilanase provavelmente foi alta, porque a indução ocorreu depois que parte do substrato foi

consumido. O pico de produção de xilanase em cultivo com xilose ocorreu após a exaustão do

83

açúcar, em 25 h de indução. Estudos com outros microrganismos mostraram que em altas

concentrações, a xilose pode reprimir a síntese de xilanase (ARO; PAKULA; PENTTILÄ,

2005). A indução de xilanase por xilose parece depender da concentração desse substrato

(GOMES et al., 1994). Esse trabalho mostrou que substratos facilmente metabolizáveis como

arabinose, glicose, lactose e xilose na concentração de 1% não induzem a xilanase de T.

aurantiacus. Outros estudos mostraram que xilose induz genes que codificam as xilanases de

Thermomyces lanuginosus (PURKARTHOFER; STEINER, 1995) e de A. niger, além dos

genes de α-glucuronidase, acetilxilana esterase e feruloil esterase (ARO; PAKULA;

PENTTILÄ, 2005).

A xilose não induziu a produção de β -xilosidase, mas induziu atividade de

arabinofuranosidase, sendo a menor atividade dessa enzima, detectada entre os indutores

testados. A fase lag de indução de xilanase em cultivo com xilobiose foi curta e a maior

atividade foi alcançada em 10 h, mesmo com baixo consumo desse substrato. Após esse

tempo a atividade permaneceu constante, sugerindo que a entrada de baixas concentrações de

xilobiose na célula seja suficiente para a indução enzimática (Figura 21).

Uma pequena atividade de xilanase foi determinada no meio com HXBC em 6 h de

indução. Nesse meio houve produção principalmente de endoglucanase e β-glicosidase.

Xilose foi consumida em 18 h, enquanto xilobiose foi consumida mais lentamente que no

meio onde era a única fonte de carbono. No final do experimento apenas 24% da xilobiose

havia sido consumida (Figura 21), em contraponto com 62% de consumo no meio com

xilobiose pura. A incubação em HXBC provocou um consumo simultâneo de xilose e

xilobiose, sem efeito de repressão catabólica.

A β-xilosidase foi induzida pelos XOs presentes em HXBC, uma vez que no meio

cultivado com xilose essa enzima não foi detectada. A atividade de arabinofuranosidase foi

cerca de três vezes superior à produzida em xilose, o que pode indicar que a indução ocorre

principalmente pela presença de xilobiose.

84

Figura 21. Atividades enzimáticas de T. aurantiacus detectadas no meio com xilose ( ), xilobiose ( ) e hidrolisado da xilana de bagaço (HXSB). Atividade enzimática detectada nos cultivos: xilanase ( ), β-xilosidase ( ), endoglucanase ( ), β-glicosidase ( ), arabinofuranosidase ( ).

O perfil da atividade de endoglucanase foi coincidente com a xilanase nos meios com

xilose e xilobiose e as atividades foram três vezes mais baixas do que em HXBC. No meio

com HXBC, xilanase e endoglucanase foram detectadas em diferentes tempos de cultivo. Esse

resultado exclui a possibilidade de que uma única enzima com especificidade cruzada

estivesse sendo produzida por T. aurantiacus.

85

5.2.2 Efeito do pH e temperatura na atividade enzimática de endo-xilanase

A máxima atividade de xilanase no extrato de T. aurantiacus foi obtida em pH 5,0

(Figura 22), concordando com os resultados de Alam et al. (1994) e Da Silva et al. (2005). A

xilanase de T. aurantiacus apresentou cerca de 80% da atividade em pH 6, 50% em pH 4 e

40% em pH 8. A xilanase produzida por A. niger também apresentou máxima atividade em

pH 5,0, porém mostrou um decréscimo mais acentuado da atividade na região alcalina.

Diversos trabalhos com xilanase de A. niger mostraram que o melhor pH restringe-se a uma

faixa entre 4 e 6 (FOURNIER et al., 1985; FREDERICK et al., 1981; GORBACHEVA;

RODIONOVA, 1997; SHEI et al., 1985).

A máxima atividade de xilanase de T. reesei foi em pH próximo de 6,5, próximo do

pH em que foi cultivado (pH 6). A atividade em pH 7 diminuiu sensivelmente e foi mais

afetada do que em pH ácido. Estudos anteriores mostraram que T. reesei produz xilanases

com diferentes valores de pH ótimos dependendo do pH em que é cultivado (XIONG et al.,

2004). As xilanases I, II, III e IV apresentaram pH ótimos entre 4-4,5; 4-6; 6-6,5 e 3,5-4;

respectivamente. As xilanases I e II foram classificadas como pertencentes à família 11

(TÖRRÖNEN; ROUVIENE, 1997) e a xilanase III à família 10 (XU et al., 1998). De modo

geral, para T. reesei a xilanase é produzida em maior quantidade em pH próximo do neutro,

enquanto pH próximo de 4 favorece a produção de celulases (BAILEY; BUCHERT;

VIICARI, 1993).

Figura 22. Efeito do pH na atividade de xilanase de A niger, T. aurantiacus e T. reesei cultivados em farelo de trigo.

86

A máxima atividade da xilanase de A. niger foi determinada a 50°C, enquanto que a

60°C ocorreu uma redução de 10 % na atividade (Figura 23). Alguns trabalhos mostram uma

estreita faixa para a sua temperatura ótima, que varia entre 42 e 55°C (FOURNIER et al.,

1985; FREDERICK et al., 1981; GORBACHEVA; RODIONOVA, 1997; SHEI et al., 1985).

A xilanase de T. aurantiacus apresentou máxima atividade entre 70 e 80°C (Figura

23). De forma geral, xilanases produzidas por esse fungo apresentam temperaturas ótimas

entre 60 e 80°C (ALAM et al., 1994; KHANDKE; VITHAYATHIL; MURTHY, 1989b;

TAN; MAYERS; SADDLER, 1987.

A maior atividade da xilanase de T. reesei foi obtida próximo de 55°C, mas a 70°C a

atividade foi cerca de 20 % da atividade máxima (Figura 23). Cobos e Estrada (2003)

determinaram a máxima atividade da xilanase de T. reesei em 55°C, e nessa temperatura

ocorre perda de 50 % de sua atividade em 30 min.

Figura 23. Efeito da temperatura na atividade de xilanase de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei cultivados em farelo de trigo.

5.2.3 Estabilidade térmica da endo-β-1,4-xilanase

5.2.3.1 Thermoascus aurantiacus

A xilanase de T. aurantiacus manteve mais de 80 % de sua atividade após 50 dias de

incubação a 50°C, e a 60°C, a enzima ficou ativa por 25 dias (Figura 24). Essa estabilidade,

típica da xilanases de T. aurantiacus, permite uma ampla aplicação industrial com um bom

87

aproveitamento do seu potencial catalítico, uma vez que essa xilanase pode suportar

operações em altas temperaturas por longos períodos. Yu et al. (1987), reportaram que este

fungo produziu xilanases muito estáveis, mantendo sua atividade por até 84 dias a 50°C.

A 70°C, a meia vida dessa enzima foi de 1 hora e 54 min (Figura 25), uma redução

causada provavelmente pelo aumento no movimento intracadeia da estrutura protéica das

xilanases que levou a alteração na estrutura protéica, e a consequente perda da atividade

enzimática. Existe um balanço natural entre a rigidez (estabilidade) e flexibilidade (atividade)

a qual é definida pelas interações e forças estabilizadoras da proteína (GOMES et al., 2007).

A xilanase de T. aurantiacus apresenta uma única ligação dissulfeto (SRINIVASA et al.,

1991) e mais de 10 interações do tipo ponte salina, o que se conserva na maioria das

xilanases. Entretanto, xilanase de T. aurantiacus apresenta pontes salinas diferenciadas, entre

Arg124-Glu232 e Arg190-Glu150, sendo que é atribuída a primeira ponte salina o papel de

contribuir para a termoestabilidade por ligar as folhas β4 e β7 estabilizando a cadeia

(NATESH et al., 1999).

Figura 24. Estabilidade térmica a 50 e 60°C da xilanase de T. aurantiacus cultivado em farelo de trigo.

88

Figura 25. Estabilidade térmica a 70°C da xilanase de T. aurantiacus cultivado em farelo de trigo.

5.2.3.2 Aspergilus niger

A xilanase de A. niger apresentou meia vida de 52 h a 40°C e um aumento em dez

graus na temperatura reduziu a meia vida para 12 h. Quando incubado a 40°C, a enzima

permaneceu estável por um tempo maior, apresentando cerca de 40 % da atividade inicial

após 65 h (Figura 26). A 30°C a atividade caiu para 70 % da inicial em 8 h e manteve-se

constante por cerca de 30 dias. Quando à enzima foi adicionado tampão acetato de sódio 50

mM (pH 4,8) a perda de atividade foi menor, a atividade diminuiu para 80 % em 8h e

manteve-se constante por 25 dias.

Figura 26. Estabilidade térmica a 40 e 50°C da xilanase de A. niger cultivado em farelo de trigo.

89

5.2.3.3 Trichoderma reesei

A xilanase de T. reesei apresentou tempo de meia vida 44 h a 40°C e de 7 h a 50°C

(Figura 27). A 30°C o resultado de atividade residual foi semelhante ao de A. niger, porém

um pouco menos acentuado, mantendo cerca de 5 % a mais de atividade.

Na temperatura de 60°C a atividade diminuiu acentuadamente e o tempo de meia vida

(t 1/2) foi de 2,7 min. Esse baixo tempo de meia vida pode ser melhorado com a adição de

polióis ao extrato enzimático de T. reesei (COBOS; ESTRADA, 2003). Os autores

observaram que a adição de etileno glicol, glicerol, xilitol e sorbitol ao extrato enzimático

elevou o tempo de meia vida para 3,6; 4,6; 87 e 303 min, respectivamente.

Figura 27. Estabilidade térmica a 40 e 50°C da xilanase de T. reesei cultivado em farelo de trigo.

5.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-

AÇÚCAR

Os ensaios foram realizados com a hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar

com 6 % (m/v) de peróxido de hidrogênio em pH 11,6 por 4 h a 20°C (condições do ensaio 3

-Tabela 6). Essa hemicelulose é constituída por 80,9 % de xilose, 3,8 % de arabinose, 4,2 %

de glicose e 3,2 % de ácidos urônicos. Através desses valores pode-se deduzir uma relação

entre xilose:arabinose e xilose:ácido urônico de aproximadamente 20:1, indicando que em

média há uma ramificação a cada 10 resíduos de xilose.

A hidrólise foi realizada com enzimas de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei. As

90

xilanases comerciais utilizadas foram: luminase PB 200, EnzOx e de Thermomyces

lanuginosus (Sigma). Foram avaliadas diferentes preparações enzimáticas, nas quais as

proporções das enzimas variaram, assim obteve-se diferentes produtos em cada reação

(Tabela 14).

5.3.1 Efeito da carga enzimática na produção de XOs

Foram avaliadas entre 10 e 200 U de xilanase/g de hemicelulose (U/g) na produção de

XOs. A maior conversão em XOs foi de 31,5% com 120 U/g de xilanase de T. aurantiacus,

entretanto observa-se que a partir de 40 U/g a taxa de hidrólise da hemicelulose diminuiu.

Esse efeito é observado em substratos poliméricos, que se modificam com a hidrólise e novos

substratos são produzidos, os quais normalmente apresentam afinidade diferente com a

enzima e a velocidade da reação é alterada. A geração de pequenos fragmentos de xilana,

assim como a presença de ramificações na cadeia, que não foram retiradas devido a ausência

de enzimas auxiliares, também reduzem a ação das xilanases à hemicelulose (KHANDKE;

VITHAYATHIL; MURTHY, 1989a; ROCHE et al., 1994).

As xilanases de T. aurantiacus são da família 10 e clivam a cadeia da xilana do bagaço

produzindo principalmente xilobiose e xilose (Tabela 15). Essa xilanase também é capaz de

hidrolisar xilobiose, xilotriose e são muito ativas em xilo-oligossacarídeos curtos, indicando

que o sítio se liga a pequenos substratos (COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005). A ação

dessa enzima é restringida em parte na hemicelulose do bagaço, que possui ramificações de

arabinose e ácidos urônicos. Mesmo em altas concentrações de enzimas o rendimento de

xilobiose foi maior que xilose (Tabela 15). A produção de xilotriose (X3) e xilopentaose (X5)

foi baixa e o aumento da carga enzimática favoreceu sua liberação, enquanto que xilotetraose

(X4) não foi produzido em níveis detectáveis. Os resultados da tabela 15 mostram uma

redução na conversão em xilose e xilobiose quando se empregou 200 U/g de xilanase, e nessa

condição detectou-se 0,006 U/g de β-xilosidase. Houve uma maior produção de xilotriose e

xilopentaose o que pode ser atribuído ao efeito de transxilosidação da β-xilosidase. Matsuo et

al. (1998) relataram a atividade de transxilosidação para a β -xilosidase de T. aurantiacus, o

que ocorreu até 1 h de reação produzindo X3 e X4 em pequena proporção a partir de

xilobiose.

As enzimas de A. niger produziram principalmente xilose da hemicelulose do bagaço.

O emprego de altas atividades das enzimas de A. niger resultou na hidrólise de

91

aproximadamente 50 % da hemicelulose do bagaço em xilose (Tabela 15). Uma vez que a

produção de xilobiose e de outros xilo-oligossacarídeos foi muito baixa, decidiu-se não

prosseguir com as enzimas de A. niger para hidrólise da hemicelulose.

As enzimas de T. reesei hidrolisaram a hemicelulose principalmente a xilose, mas

xilobiose também foi produzida. XOs com maior massa molar foram produzidos em

quantidades muito baixas, sendo que X4 não foi detectado a partir de 40 U/g de xilanase e X5

não foi produzido.

Tabela 14: Atividades enzimáticas nos extratos de A. niger, T. aurantiacus, T. reesei e de preparados comerciais aplicadas na hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar.

Endo-xilanase

(U/g)

β-xilosidase

(U/g)

Arabinofuranosidase

(U/g)

A. niger 60 0,53 0,012

T. aurantiacus 60 0,0018 0,26

T. reesei 60 0,0024 0,095

Xilanase PB 200 80 0 0

EnzOx 80 0 0

Tabela 15- Efeito da carga enzimática na hidrólise da hemicelulose do bagaço (2 % m/v) pelos extratos de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei, após 24 h de reação.

Composição do hidrolisado (% massa hemicelulose)

U/g Xilose X2 X3 X4 X5 XOs

mg/mL A. niger 10 11,95 2,64 0,06 0,03 0,01 0,62 40 29,66 0,42 0,02 - - 0,08 80 38,02 0,01 0,01 - - - 120 44,93 - - - - - 200 51,34 - - - - - T. aurantiacus 10 17,1 3,8 0,08 - 0,01 0,61 40 9,78 17,5 0,19 - 0,04 2,96 80 14,2 24,8 0,15 - 0,03 3,92 120 18,0 31,5 0,13 - 0,03 4,75 200 16,8 21,3 0,29 - 0,08 3,04 T. reesei 10 4,00 0,78 0,05 0,02 - 0,20 40 17,46 9,28 0,08 0,02 - 2,00 80 26,13 11,00 0,06 - - 2,47 120 31,90 8,51 0,04 - - 1,74 200 40,30 10,72 0,04 - - 2,15

X2: xilobiose; X3: xilotriose; X4: xilotetraose; X5: xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos; (-) não detectado.

92

Comparativamente, os extratos de T. aurantiacus e T. reesei, continham baixa

atividade de β-xilosidase, e por consequência produziram xilobiose (X2) em maior

concentração do que o extrato de A. niger.

5.3.2 Efeito do tempo na produção de XOs

A hidrólise da xilana do bagaço foi conduzida com 60 U/g de xilanase por vários

tempos (Tabela 16). A produção de xilose e XOs aumentou com o tempo de hidrólise,

obtendo-se o maior rendimento com 96 h. A soma da xilose e xilobiose alcançou a conversão

máxima teórica de 60 % e o restante foi principalmente material com alta massa molar. Yang

e Zhang (2007) reportaram a produção de 3,7 mg/mL de XOs da hemicelulose de bagaço com

48 h de reação. O resultado da hidrólise com as enzimas de T. aurantiacus nesse mesmo

tempo foi maior, 4,36 mg/mL, correspondente a 29 % de XOs (Tabela 16).

Com o decorrer da reação observou-se diminuição na concentração de xilotriose e

aumento de xilobiose e xilose, o que evidencia a predominância de endoxilanase da família 10

no extrato enzimático de T. aurantiacus. Xilo-oligossacarídeos maiores que xilobiose foram

produzidos em baixa quantidade, mas principalmente em 6 h de reação.

Tabela 16. Hidrólise da xilana do bagaço com xilanase (60 U/g) de T. aurantiacus. Tempo (h) Conversão em xilose e xilo-oligossacarídeos (%)a XOs

(mg/mL)

xilose X2 X3 X5 XOs

3 9,34 ± 0,57 13,94 ± 0,94 0,22 ± 0,01 0,05 ± 0 14,21 ± 0,94 2,13

6 9,65 ± 0,71 11,79 ± 1,81 0,20 ± 0 0,05 ± 0 12,04 ± 1,81 1,81

12 10,61 ± 0,73 13,75 ± 0,99 0,19 ± 0,02 0,07 ± 0,01 14,01 ± 1,02 2,10

24 12,97 ± 0,21 21,58 ± 0,67 0,19 ± 0 0,05 ± 0 21,82 ± 0,68 3,27

48 19,42 ± 2,37 28,87 ± 3,01 0,13 ± 0,02 0,05 ± 0,01 29,05 ± 3,04 4,36

72 20,33 ± 1,11 33,01 ± 1,43 0,11 ± 0,01 0,04 ± 0,01 33,17 ± 1,45 4,98

96 22,48 ± 0,77 38,48 ± 0,99 0,08 ± 0 0,02 ± 0 38,58 ± 1,0 5,79

X2: xilobiose; X3: xilotriose; X5: xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos; (a) ensaios realizados em triplicata

93

A hidrólise da hemicelulose com as enzimas de T. reesei resultou em um aumento na

produção de xilose com aumento do tempo reacional, enquanto que a produção de xilobiose

atingiu um máximo em 24 h e diminuiu após esse tempo (Tabela 17). Uma baixa

concentração de xilopentaose e xilotetraose foi detectada no início da reação. Xilopentaose foi

totalmente convertido em outros produtos após 24 h e X4 apareceu somente até 6 h, em

concentrações inferiores a X5. A máxima produção de X3 ocorreu entre 12 e 24 h, a partir de

então sua taxa de formação foi menor que a de hidrólise.

Tabela 17. Hidrólise da xilana do bagaço com xilanase (60 U/g) de T. reesei.

Tempo (h) Conversão em xilose e xilo-oligossacarídeos (%)(a) XOs

(mg/ml)

xilose X2 X3 X5 XOs

3 8,52 ± 0,82 6,44 ± 0,18 0,07 ± 0,04 0,02 ± 0,02 6,53 ± 0,10 1,24

6 11,36 ± 0,04 12,18 ± 0,28 0,10 ± 0 0,02 ± 0 12,30 ± 0,29 1,84

12 15,12 ± 1,06 13,66 ± 1,16 0,13 ± 0,03 0,00 ± 0 13,79 ± 1,17 2,07

24 21,35 ± 1,33 18,12 ± 1,79 0,10 ± 0,01 0,01 ± 0 18,23 ± 1,81 2,73

48 31,05 ± 2,18 12,23 ± 1,96 0,08 ± 0,02 0,00 ± 0 12,31 ± 1,98 1,85

72 37,49 ± 0,27 9,98 ± 0,63 0,05 ± 0 0,00 ± 0 10,03 ± 0,63 1,50

96 40,50 ± 0,05 8,50 ± 0,25 0,03 ± 0 0,00 ± 0 8,53 ± 0,25 1,29

X2: xilobiose; X3: xilotriose; X5: xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos; (a) ensaios realizados em triplicata

5.3.3 Otimização da hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar

A escolha de uma condição de hidrólise que maximize a formação de XOs é de grande

interesse para facilitar a sua recuperação. A partir das informações obtidas nos ensaios

preliminares foi realizado um planejamento experimental para avaliar o efeito interativo da

carga de enzima e substrato na produção de XOs.

5.3.3.1 Produção de xilose

A maior conversão da xilana em xilose com as enzimas de T. aurantiacus (37 %)

ocorreu na menor concentração de substrato (0,5 % m/v). Nessa condição o aumento do

X3,

X4

e X

5 (u

g/m

L)

94

tempo de reação de 6 para 48 h melhorou a conversão em apenas dez por cento (Figura 28).

Adicionalmente, não se observou um efeito positivo na conversão de hemicelulose em xilose

quando se aumentou a carga de enzima.

Nos meios com maior concentração de substrato (3,5 % m/v) observou-se uma

redução na conversão em xilose, o aumento da carga enzimática provocou um discreto efeito

positivo na conversão em xilose. A menor eficiência de conversão em xilose observada nas

maiores concentrações de substrato pode ser causada pela menor disponibilidade de água no

meio, o que geralmente reduz a velocidade de hidrólise, como observado em outros trabalhos

(MOURE et al., 2006; YOON; WOODANS; HANG, 2006).

A hidrólise da hemicelulose com as enzimas de T. reesei alcançou 65 % de conversão

em xilose na menor concentração de substrato (0,5 % m/v) e alta carga de enzima (80 U/g)

(Figura 29). Em concentrações mais altas de substrato a conversão em xilose reduziu, porém o

aumento da carga de enzima resultou em uma melhora na conversão da hemicelulose tanto

quando o substrato estava em baixa quanto em alta concentração.

0

5

10

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20

25

30

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3 6 12 24 48 72 96

tempo (h)

Xilo

se (%

)

S=0,5% E=40U/gS=0,5% E=80U/gS=2% E=60U/gS=3,5% E=40U/gS=3,5% E=80U/g

Figura 28. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana em xilose durante a hidrólise com extrato enzimático de T. aurantiacus em diferentes concentrações de substrato e enzima.

95

0

10

20

30

40

50

60

70

3 6 12 24 48 72 96

tempo (h)

Xilo

se (%

)

S=0,5% E=40U/gS=0,5% E=80U/gS=2% E=60U/gS=3,5% E=40U/gS=3,5% E=80U/g

Figura 29. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana em xilose durante a hidrólise com extrato enzimático de T. reesei em diferentes concentrações de substrato e enzima.

5.3.3.2 Produção de xilo-oligossacarídeos

5.3.3.2.1 Hidrólise da hemicelulose com as enzimas de T. aurantiacus

A conversão da hemicelulose do bagaço em xilobiose aumentou com o progresso da

de reação. A maior concentração de xilobiose foi obtida na condição intermediária da região

de estudo, ou seja, quando se utilizou 2% de hemicelulose e 60 U/g de enzima, porém

observa-se uma redução na taxa de formação de xilobiose após 48 h (Figura 30). A redução na

velocidade da hidrólise enzimática pode ter ocorrido pela maior dificuldade de acesso das

enzimas ao substrato, que sofreu mudanças durante a reação e também pela inibição das

xilanases pelos produtos da hidrólise da hemicelulose (ARO; PAKULA; PENTTILÄ, 2005).

A carga enzimática contribuiu pouco para o aumento da produção de XOs, uma

indicação a mais de que após uma hidrólise inicial rápida deve ocorrer uma limitação

estrutural do substrato às xilanases de T. aurantiacus. Outro fator que poderia cessar a

hidrólise seria a perda de atividade da enzima, entretanto, já foi verificado que esse extrato

mantém total atividade a 50°C em 96 h de reação e mais de 80% da atividade inicial até 50

dias (item 5.2.3).

A hidrólise da hemicelulose do bagaço com as enzimas de T. aurantiacus gerou em

ordem decrescente xilobiose, xilose, xilotriose e xilopentaose, nas condições que favoreceram

96

a produção de XOs. A conversão total da hemicelulose foi de 59,8% em xilobiose e 40 % em

xilose, em relação ao total de XOs produzidos a xilobiose corresponde a 99 % (Figura 31).

Possivelmente a β-xilosidase presente no extrato de T. aurantiacus, mesmo em baixas

concentrações agiu nos xilo-oligossacarídeos transformando-os em xilose. As xilanases de T.

aurantiacus hidrolisam a hemicelulose pela extremidade não redutora liberando xilose e

oligossacarídeos curtos, lineares ou ramificados (BIELY et al., 1997, KALOGERIS et al.,

2001; VARDAKOU et al., 2003). Kalogeris et al. (2001) observaram que em tempos longos

de hidrólise de xilana de bétula por xilanase de T. aurantiacus quase toda xilotriose foi

hidrolisada, enquanto o ácido aldopentaurônico foi convertido em ácido aldotetraurônico.

0

5

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35

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3 6 12 24 48 72 96

Xilo

bios

e (%

)

tempo (h)

S=0,5% E=40U/gS=0,5% E=80U/gS=2% E=60 U/gS=3,5% E=40U/gS=3,5% E=80U/g

Figura 30. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar em xilobiose pelas enzimas de T. aurantiacus.

97

0

10

20

30

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3 6 12 24 48 72 96

Con

vers

ão to

tal (

%)

tempo (h)

S=0,5% E=40U/gS=0,5% E=80U/gS=2% E=60U/gS=3,5% E=40U/gS=3,5% E=80U/g

Figura 31. Conversão total durante hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com enzimas de T. aurantiacus.

A tabela 18 mostra a conversão total da hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-

açúcar pelas enzimas de T. aurantiacus em 96 h de reação. A maior conversão (61 %) foi

obtida com 2 % (m/v) de substrato e 60 U/g de xilanase, sendo 38,5 % de XOs e o restante foi

xilose (22,5 %). Quando se usou a maior concentração de substrato (3,5 % m/v) a conversão

total foi sempre menor, independente do tempo de hidrólise e da carga de enzima.

Como continuidade da análise estatística a influência da concentração de substrato e

carga enzimática foi avaliada com um planejamento 22 com face centrada, uma vez que a

condição de máxima conversão em XOs parece estar dentro da região em estudo. A matriz do

planejamento e os resultados obtidos estão apresentados na tabela 18. Os dados confirmam o

ponto central como região de máxima conversão em XOs.

A significância estatística dos efeitos para a resposta conversão em XOs está

apresentada na tabela 19. Apenas o efeito individual do substrato (componente Linear) não foi

significativo. A interação entre substrato e enzima foi significativa ao nível de 90 % de

confiança.

98

Tabela 18- Matriz do planejamento experimental completo 22 com face centrada e 3 repetições no ponto central, aplicado para avaliação da influência da concentração de substrato (V1) e carga de enzima (T. aurantiacus) (V2) na conversão da hemicelulose em XOs após 96 h de reação.

Níveis

codificados Níveis reais

XOs (% massa hemicelulose)

Ensaio V1 V2 Substrato

(%) Enzima (U/g) Xilose

Arabinose X2 X3 X5

XOs (mg/mL)

1 -1 -1 0,5 40 35,98 0 11,30 0,03 0,01 0,43 2 -1 1 0,5 80 34,91 0 8,49 0,05 0,01 0,32 3 1 -1 3,5 40 13,65 1,48 25,65 0,08 0,02 6,76 4 1 1 3,5 80 16,83 2,73 30,30 0,04 0,01 7,97 5 0 -1 2 40 16,61 2,52 27,29 0,10 0,03 4,11 6 0 1 2 80 28,03 2,67 27,04 0,05 0,02 4,07 7 -1 0 0,5 60 37,87 2,89 11,28 0,12 0,02 0,43 8 1 0 3,5 60 17,56 1,38 34,97 0,05 0,02 9,20 9 0 0 2 60 22,08 2,25 38,11 0,08 0,02 5,73

10 0 0 2 60 21,98 1,04 37,72 0,07 0,02 5,67 11 0 0 2 60 23,37 1,22 39,60 0,08 0,02 5,96

Experimentos de 9 a 11 correspondem ao ponto central

V1: substrato; V2: carga enzima; X2: xilobiose; X3: xilotriose; X5: xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos.

Tabela 19- Análise de variância dos efeitos principais e interação dos fatores sobre a conversão da hemicelulose em XOs pelo extrato de T. aurantiacus após 96 h de reação.

(*) valores com 95 % de confiança (p < 0,05); (**) valores com 90 % de confiança (p < 0,1); V1: substrato; V2: carga de enzima; SQ: soma dos quadrados; GL: Grau de liberdade; MQ: Média dos quadrados

Através da análise de variância de regressão do modelo verifica-se que as variáveis

respostas apresentam valores de coeficientes de determinação (R2) superior a 0,96. O modelo

Fator SQ GL MQ p

Modelo 249,86 5 249,86 0,0010

Substrato (L) 0,421 1 0,421 0,5801

Planejamento Substrato (Q)* 144,9 1 144,9 0,0067

22 completo Enzima (L)* 597 1 597 0,0016

Com Enzima (Q)* 341,08 1 341,08 0,0028

Face Centrada V1V2 ** 13,91 1 13,91 0,0640

Falta de ajuste 42,98 3 14,32 0,0649

Erro 1,96 2 0,98

Total 1307,15 10

R2= 0,96

99

matemático não apresentou falta de ajuste ao nível de 95% de confiança (p < 0,05) (Tabela

19). Deste modo, os valores obtidos experimentalmente se ajustam à equação do modelo,

sendo a diferença com os valores previstos pela equação explicada pelo erro experimental. O

modelo matemático para descrever a conversão em XOs, na região em estudo, está

apresentado na equação 13.

Y1= 37 + 9,97v1 – 11,62v12 – 7,59v2

2 (13)

Onde:

Y1= conversão em XOs (%);

v1= variável codificada que representa a concentração de hemicelulose (% m/v);

v2= variável codificada que representa a carga de enzima (U/g).

A equação 13 possibilitou a obtenção da superfície de resposta da conversão em XOs na

região em estudo (Figura 32).

A

B

Figura 32. (A) Superfície de resposta; (B) Gráfico de contorno descrito pelo modelo que representa a conversão de hemicelulose em XOs, obtido pela hidrólise com enzimas de T. aurantiacus.

100

Para avaliar o modelo matemático um ponto foi escolhido dentro da região de máximo

(valores codificados: S= 0,4 e E= 0; valores reais S= 2,6 % e E= 60 U/g). Os valores de

conversão em XOs obtidos nesse ponto (41,65 ± 0,45 %) confirmaram que o modelo descreve

bem a região em estudo, uma vez que o resultado está dentro da faixa de variação prevista por

esse modelo (37,08 ± 4,27 %).

A fim de verificar a adequação do modelo na hidrólise da hemicelulose em maior

escala, o ensaio foi repetido na condição otimizada empregando-se um volume de reação dez

vezes maior. Os resultados foram similares aos obtidos na menor escala e corresponderam a

39,4% de xilobiose e 24,1% de xilose.

5.3.3.2.2 Hidrólise da hemicelulose com enzimas de T. reesei

A maior produção de XOs com o extrato de T. reesei foi obtida com 3,5 % (m/v) de

substrato e 80 U/g de enzima entre 6 e 24 h de reação (Figura 33). Em tempos menores

observa-se que a formação de XOs foi maior com os níveis altos de substrato e enzima, assim

é possível que níveis superiores dessas variáveis poderia promover uma maior conversão da

hemicelulose em XOs.

A conversão total de hemicelulose em 24 h foi 45 %, sendo 22 % xilobiose e 23 %

xilose. Em 6 h a conversão em xilose foi de 11 %, com pouca alteração na conversão em XOs

(20 %). Entre os XOs produzidos, a xilobiose correspondeu a 99% do total. O extrato

enzimático de T. reesei contém várias xilanases (TÖRRÖNEN et al., 1992) e uma β-

xilosidase multifuncional que cliva xilo-oligossacarídeos gerando xilose, tem atividade de

arabinofuranosidase e de transglicosilação (HERMANN et al., 1997). Além dessas enzimas,

T. reesei produz arabinofuranosidase (CLARK et al., 1996; NOGAWA et al., 1999),

confirmada pela liberação de arabinose na reação de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar

(Tabela 21). Nos ensaios a carga de β-xilosidase foi de 0,0024 U/g, quando foi aplicado 60

U/g de endo-β-1,4-xilanase, o que certamente incrementou a produção de xilose no

hidrolisado.

As enzimas de T. reesei apresentaram uma conversão 50% menor do que as de T.

aurantiacus por razões que podem estar associadas a diferenças na estabilidade térmica e no

conjunto de hemicelulases presentes em cada extrato (JUHÁSZ et al., 2005; TÖRRÖNEN et

al., 1992; YU et al., 1987). Muitas endo-β-1,4-xilanase são estericamente impedidas de

agirem na hemicelulose que apresenta substituinte na cadeia principal, enquanto outras

101

xilanases agem bem sobre xilose adjacente a grupos substituintes (AKPINAR; ERDOGAN;

BOSTANCI, 2009). T. reesei produz xilanases da família 11, que apresentam menor

versatilidade catalítica, agem apenas em xilanas cuja cadeia principal é constituída apenas por

xilose e são capazes de clivar ligações mais afastadas das ramificações. Como resultado, essas

endoxilanases liberam produtos ramificados maiores que as xilanases da família 10, no

entanto podem hidrolisar xilobiose e xilotriose (TÖRRÖNEN et al., 1992; TÖRRÖNEN,

ROUVINEN, 1995).

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Xilo

bios

e (%

)

tempo (h)

S=0,5% E=40U/gS=0,5% E=80U/gS=2% E=60 U/gS=3,5% E=40U/gS=3,5% E=80U/g

Figura 33. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar em xilobiose pelas

enzimas de T. reesei.

A maior conversão total da hemicelulose com as enzimas de T. reesei foi de 66 % com

0,5 % (m/v) de substrato e 80 U/g de enzima, nos tempos de 72 a 96 h (Figura 34). O

principal produto foi xilose e a conversão em xilobiose foi semelhante para os tempos de 6, 12

e 24 h. O controle do tempo de reação enzimática permite direcionar a formação de XOs ou

xilose, enriquecendo o meio em um ou outro açúcar.

102

0

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20

30

40

50

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70

3 6 12 24 48 72 96

Con

vers

ão to

tal (

%)

tempo (h)

S=0,5% E=40U/gS=0,5% E=80U/gS=2% E=60U/gS=3,5% E=40U/gS=3,5% E=80U/g

Figura 34. Conversão total durante a hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar

com enzimas de T. reesei.

Os resultados do planejamento para os níveis de 0,5 – 3,5 % de substrato e 40 e 80 U/g

de xilanase estão apresentados na tabela 20. Verifica-se que a conversão em XOs foi maior no

experimento 4, onde os níveis das variáveis foram alto. Os melhores resultados de conversão

foram obtidos entre 6 e 24 h, com pouca diferença entre esses tempos. Quando o substrato foi

empregado no nível baixo o aumento da carga de enzima não provocou efeito perceptivo. O

efeito da carga enzimática ficou claro no nível alto de substrato, elevando a conversão em

XOs.

Uma maior conversão em XOs poderia ser obtida se utilizasse níveis ainda maiores de

substrato, uma vez que o melhor resultado foi obtido no nível alto dessa variável. Para

confirmar essa hipótese, quatro passos de ascensão foram gerados pelo programa “Design

Expert”, os níveis de substrato e enzima foram: 1 (3,5 %, 44,6 U/g), 2 (5 %, 49,2 U/g), 3 (6,5

%, 53,8 U/g) e 4 (8 %, 58,4 U/g) e apresentaram conversão de 9,7, 10,9, 13,4 e 17,9 %,

respectivamente (os passos calculados resultaram da relação entre o coeficiente angular da

enzima (X2) pelo coeficiente angular do substrato (X1) encontrados na equação determinada

pelos dados experimentais: y = 6,21 + 6,14X1 + 1,4X2). Esses dados evidenciaram que o

aumento da concentração de substrato promove uma maior conversão, mas inferior a condição

usada anteriormente (3,5 % de substrato e 80 U/g de enzima). Desta forma, os níveis das

103

variáveis foram alterados para 2 e 5 % de substrato e 60 e 100 U/g de atividade xilanase a fim

de que a região de máxima conversão em XOs ficasse localizada dentro da região de estudo,

próxima do novo ponto central (3,5 % de substrato e 80 U/g de xilanase).

Tabela 20- Conversão da hemicelulose em XOs com extrato de T. reesei em função do tempo segundo o planejamento 22 completo.

Níveis das variáveis Conversão em XOs (% massa seca hemicelulose)

Exp V1 V2 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h

1 -1 -1 0,09 0,1 0,1 0,07 0,04 0,06 0,34

2 -1 1 0,1 0,09 0,05 0,07 0,03 0 0,01

3 1 -1 5,44 12,65 17,81 21,02 14,67 15,39 15,53

4 1 1 14,53 20,28 20,23 22,34 15,94 14,28 13,97

5 0 0 8,5 12,35 13,09 18,48 11,53 9,5 8,53

6 0 0 8,25 12,56 13,13 19,9 10,84 9,86 8,28

7* 0 0 2,85 11,99 15,14 16,31 14,56 10,73 8,78

* Experimentos de 5 a 7 correspondem ao ponto central V1: substrato (0,5 – 3,5 %); V2: carga enzima (40 – 80 U/g);

A nova região de estudo foi realizada com 6 h de reação e empregou-se um

planejamento experimental completo 22 com face centrada, uma vez que a máxima conversão

em XOs está dentro da região de estudo. Verificou-se o efeito positivo da carga de enzima

tanto em nível baixo quanto em nível alto de substrato (Tabela 21). Os dados confirmam o

ponto central como região próxima da máxima conversão, sendo a condição intermediária de

substrato (3,5 %) e enzima (80 U/g) que favorece a maior conversão.

A análise estatística de variância está apresentada na tabela 22, onde observa-se que a

variável substrato é significativa com 90 % de confiança e a variável enzima e interações são

significativas com 95 % de confiança.

104

Tabela 21- Matriz do planejamento experimental completo 22 com face centrada e 3 repetições no ponto central, aplicado para avaliação da influência da concentração de substrato (V1) e carga de enzima (T. reesei) (V2) na conversão da hemicelulose em XOs após 6 h de reação.

Níveis

codificados Níveis reais

XOs (% massa hemicelulose)

Ensaio V1 V2

Substrato

(%)

Enzima

(U/g) Xilose

Arabinose X2 X3 X4

XOs

(mg/mL)

1 -1 -1 2 60 30,01 1,24 5,52 0,43 0,1 1,83

2 -1 1 2 100 30,51 1,15 8,39 0,49 0,2 1,65

3 1 -1 5 60 6,33 0,44 5,82 0,20 0,1 1,79

4 1 1 5 100 14,79 0,40 18,07 0,16 0,0 7,42

5 0 -1 3,5 60 14,42 0,58 14,83 0,19 0,1 3,76

6 0 1 3,5 100 20,80 0,63 18,88 0,18 0,0 4,40

7 -1 0 2 80 27,98 0,29 15,46 0,42 0,1 1,64

8 1 0 5 80 12,36 0,43 15,26 0,15 0,0 6,58

9 0 0 3,5 80 11,46 0,49 19,14 0,18 0,1 2,91

10 0 0 3,5 80 12,36 0,49 21,28 0,20 0,1 3,24

11 0 0 3,5 80 11,86 0,51 20,18 0,19 0,1 3,07

Experimentos de 9 a 11 correspondem ao ponto central.

V1: substrato; V2: carga enzima; X2: xilobiose; X3: xilotriose; X4: xilotetraose; XOs: xilo-oligossacarídeos

Tabela 22- Análise de variância dos efeitos principais e interação dos fatores (2-5% substrato e 60-100 U/g enzima) sobre a conversão da hemicelulose em XOs pelo extrato de T. reesei após 6 h de reação.

(*) valores com 95 % de confiança (p < 0,05); (**) valores com 90 % de confiança (p < 0,1); V1: substrato; V2: carga de enzima; SQ: soma dos quadrados; GL: Grau de liberdade; MQ: Media dos quadrados

Fator SQ GL MQ p

Modelo 64,47 5 64,47 0,0034

Substrato (L)** 15,96 1 15,96 0,0653

Planejamento Substrato (Q)* 97,09 1 97,09 0,0117

22 completo Enzima (L)* 61,18 1 61,18 0,0183

Com Enzima (Q)* 55,89 1 55,89 0,0200

Face Centrada V1V2 * 22,0 1 22,0 0,0487

Falta de ajuste 17,26 3 5,73 0,1716

Erro 2,31 2 1,15

Total 325,69 10

R2= 0,94

105

Através da análise de variância de regressão do modelo verifica-se que as variáveis

respostas apresentam valores de coeficientes de determinação (R2) de 0,94. O modelo

matemático (p < 0,05) não apresentou falta de ajuste ao nível de 95 % de confiança. Deste

modo, os valores obtidos experimentalmente se ajustam à equação do modelo, sendo a

diferença com os valores previstos pela equação explicada pelo erro experimental. O modelo

matemático para descrever a conversão de XOs pelo extrato de T. reesei, na região em estudo,

está apresentado na equação 14.

Y2= 20,74 – 6,19 v12 + 3,19v2 – 4,7v2

2 + 2,35v1v2 (14)

Onde:

Y2= conversão em XOs (%);

v1= variável codificada que representa a concentração de hemicelulose (% m/v);

v2= variável codificada que representa a carga de enzima (U/g).

A equação 8 possibilitou a obtenção da superfície de resposta da conversão em XOs na

região em estudo (Figura 35).

A

B

Figura 35. (A) Superfície de resposta; (B) Gráfico de contorno descrito pelo modelo que representa a conversão de hemicelulose (2 – 5 %) em XOs, obtido pela hidrólise com extrato de T. reesei (60 – 100 U/g).

106

Para avaliar o modelo matemático um ponto foi escolhido dentro da região de máxima

conversão (valores codificados: S= 0,5 e E= 0,375; valores reais S= 3,875 % e E= 87,5 U/g).

Os valores de conversão em XOs obtidos nesse ponto (19,32 ± 1,82 %) confirmaram que o

modelo descreve a região em estudo, uma vez que o resultado está dentro da faixa de variação

prevista por esse modelo (20,17 ± 2,37 %).

5.3.4 Hidrólise enzimática sucessiva da hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar

Após a hidrólise da hemicelulose do bagaço com os extratos de T. aurantiacus e T.

reesei, o resíduo sólido foi separado por centrifugação e submetido a uma segunda hidrólise.

Ao resíduo sólido foi adicionado 60 U/g de xilanase de T. aurantiacus, nas mesmas

condições empregada na primeira hidrólise resultando em 9,8 % de xilose e 4,8 % de

xilobiose. A conversão de cada produto foi respectivamente 3 e 8 vezes menor que a obtida

na primeira hidrólise e não houve formação de XOs com massa molar maior que xilobiose.

O resíduo sólido obtido da primeira hidrólise da hemicelulose com enzimas de T.

reesei foi novamente hidrolisado nas mesmas condições. Os resultados foram 11,8 % de

xilose e 4,8 % de xilobiose, correspondente a 4 e 10 vezes menos produto. Nessa reação

também não foram detectados XOs com massa molar superiores a xilobiose.

A formação de produtos na segunda hidrólise enzimática gerou conversões muito

inferiores à primeira hidrólise, principalmente em xilobiose. Isto confirma que mudanças

estruturais na hemicelulose, causada pela degradação das partes mais acessíveis do

polissacarídeo na primeira hidrólise, tenha resultado em um polissacarídeo mais recalcitrante

e menos susceptível à ação das xilanases. No caso do extrato enzimático de T. aurantiacus,

uma segunda hidrólise parece inviável em função da baixa produtividade, entretanto para T.

reesei a segunda hidrólise pode ser viável para obtenção de xilose, dado seu curto tempo de

reação.

A análise de infravermelho do resíduo obtido após a primeira hidrólise enzimática da

hemicelulose evidencia a remoção de arabinose através do desaparecimento do pico em 980

cm-1. Grande parte da hemicelulose (60 % com enzima de T. aurantiacus e 40 % com enzimas

de T. reesei) foi hidrolisada, no entanto o espectro de infravermelho apresentou poucas

mudanças (Figura 36). O fato de a arabinose ser removida parece não ter sido de grande

relevância para a continuidade da hidrólise da hemicelulose, na segunda hidrólise.

107

O espectro de infravermelho não mostra um aumento na intensidade do pico de 1510

cm-1, referente à vibração de anel aromático, o qual é atribuído à lignina. A caracterização

química confirmou que a lignina não se acumulou no resíduo sólido obtido após hidrólise

enzimática. A proporção de lignina na hemicelulose antes e após a hidrólise enzimática é a

mesma, como mostrado pelo espectro de infravermelho, o que evidencia que parte da lignina

está sendo removida durante a reação. Essa fração de lignina provavelmente foi solubilizada

com fragmentos de hemicelulose.

Figura 36. Espectro de infravermelho das amostras de hemicelulose de bagaço e dos resíduos sólidos obtidos após hidrólise com enzimas de T. aurantiacus (60 U/g de xilanase, 2 % de hemicelulose por 96 h) e T. reesei (80 U/g de xilanase, 3,5% de hemicelulose por 6 h).

5.3.5 Hidrólise da hemicelulose do bagaço com xilanases comerciais

Nos extratos comerciais detectaram-se apenas atividade de endoxilanase,

diferentemente dos extratos de T. aurantiacus e T. reesei que apresentaram em sua

108

composição atividade de arabinofuranosidase e β-xilosidase (Tabela 14). O fungo T.

aurantiacus produz várias enzimas das quais a arabinofuranosidase (KATAPODIS;

CHRISTAKOPOULOS, 2004; ROCHE; DESGRANGES; DURAND, 1994) e α-

glucuronidase (KHANDKE; VITHAYATHIL; MURTHY, 1989a) que agem sobre os grupos

substituintes, auxiliando na hidrólise da cadeia de xilana. Uma maior conversão em XOs foi

observada por Verbruggen, Beldman e Voragen (1998) quando misturaram xilanases

diferentes com arabinofuranosidases, em comparação às enzimas isoladas. A formação de

XOs e de xilose pelas xilanases comerciais foi menor que a obtida com as enzimas de T.

aurantiacus e T. reesei (Tabela 23).

Tabela 23- Produtos de hidrólise da hemicelulose (2 % m/v) do bagaço de cana-de-açúcar por xilanases comerciais (80 U/g). Conversão (%, massa hemicelulose)

Xilanases Tempo (h) X1 X2 X3 X4 X5 XOs (mg/mL)

2 10,31 9,93 0,11 0,02 0,02 1,12

EnzOx B 4 10,98 8,51 0,12 0,02 0,02 0,91

8 10,91 15,35 0,08 - 0,02 1,65

24 10,46 14,17 0,07 - 0,02 1,70

48 12,69 19,53 0,07 - 0,02 2,03

2 10,36 14,48 0,06 - - 1,53

Luminase 4 9,79 9,77 0,09 - 0,01 1,05

PB 200 8 12,20 19,23 0,09 - 0,03 2,20

24 12,21 15,40 0,09 - 0,02 1,60

48 12,41 18,76 0,06 - 0,01 2,05

2 - 1,27 0,06 0,01 - 0,26

Thermomyces 4 - 9,23 0,05 0,03 - 1,82

lanuginosus 18 - 12,62 0,12 0,05 - 2,49

24 - 10,97 0,09 0,02 - 2,16

X1: xilose; X2: xilobiose; X3: xilotriose; X4: xilotetraose; X5: Xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos

A xilanase de T. lanuginosus gerou um resultado muito promissor para a produção de

xilo-oligossacarídeos, pois não houve produção de xilose. Na natureza esse fungo cresce em

associação a outros organismos tendo em vista que ele não possui todas as enzimas

necessárias para a completa degradação da parede celular vegetal. Não produz celulases e as

enzimas desramificadoras da hemicelulose (PUCHART; BIELY, 2008), por esse motivo a

hidrólise é relativamente baixa e incompleta (Tabela 23). A xilanase de T. lanuginosus

109

pertence à família 11, que produz oligossacarídeos com maior massa molar que as xilanases

da família 10. A xilanase de T. lanuginosus apresenta atividade máxima em pH 7, e em

temperatura entre 60 e 70°C, é totalmente estável em uma faixa de pH entre 5 e 9, em

temperatura de 60°C por 96 h o que amplia sua aplicação na hidrólise de hemiceluloses

(CÉSAR; MRSA, 1996).

5.3.6 Hidrólise enzimática de diferentes xilanas com enzimas de T. aurantiacus

Determinou-se o efeito da concentração de enzimas na conversão das xilanas de

bagaço, bétula e semente de aveia. Há diferenças entre a composição das hemiceluloses

comerciais e a extraída do bagaço. As hemiceluloses comerciais não possuem lignina na sua

composição, enquanto a de bagaço contém 5,9 % de lignina. A hemicelulose de bétula contem

9,4% de ácidos urônicos, quase o dobro da hemicelulose extraída do bagaço.

A estrutura da xilana do bagaço de cana-de-açúcar, com base na sua composição

química pode ser classificada como arabinofuranosil-(4-O-metil)-glucuronoxilana, a xilana de

bétula é uma metilglucurono-xilana (TIMELL, 1967) e a xilana de semente de aveia é uma

arabinoxilana (KABEL et al., 2007). A hidrólise enzimática das xilanas produziu

principalmente xilobiose e xilose e uma pequena quantidade de xilotriose (X3) e xilopentaose

(X5) (Tabela 24). Observou-se uma maior produção de xilose e xilobiose com o aumento da

carga enzimática, porém esse aumento não foi linear. Considerando que todos os sítios

disponíveis das enzimas estejam ocupados pelo substrato, o aumento na concentração de

enzimas poderia incrementar a taxa de digestão da hemicelulose, entretanto o que se observou

foi uma diminuição na taxa de degradação com a suplementação de enzimas. Esses resultados

reforçam que a discussão anterior para a xilana do bagaço, em relação à formação de

inibidores da reação ou de formação de novos substratos menos apropriados à hidrólise,

também é válido para xilanas de outras origens.

As xilanas do bagaço e de bétula, que possuem composições semelhantes foram

hidrolisadas na mesma extensão, tendo xilose e xilobiose como principais produtos. A

arabinose foi detectada nas reações com as hemiceluloses de bagaço de cana (4,6 %) e de

semente de aveia (6,5 %). A liberação de arabinose é consequência da presença de uma

pequena atividade de arabinofuranosidase (0,0024 U/mL) no extrato enzimático de T.

aurantiacus. A arabinofuranosidase cliva grupos pendentes de arabinose, o que auxilia a ação

de xilanases na hidrólise da cadeia principal da hemicelulose.

110

Tabela 24 – Hidrólise enzimática de diferentes hemiceluloses (2,6 %) pelas enzimas de T. aurantiacus em 96 h de reação. Conversão (%, massa hemicelulose)

Hemicelulose U/g Xilose X2 X3 X5 arabinose XOs1 (mg/mL)

5 7,63 14,06 0,20 0,05 0,60 2,79

Bagaço 10 10,32 20,16 0,20 0,05 1,01 3,98

20 14,21 27,08 0,17 0,05 0,68 5,32

30 16,78 32,55 0,13 0,04 0,31 6,38

5 9,73 15,82 0,11 - 0,07 3,11

Bétula 10 11,89 20,31 0,09 - - 3,98

20 14,90 26,71 0,06 - - 5,22

30 17,00 35,21 - - - 6,87

5 9,63 9,26 0,14 0,04 - 1,84

Semente 10 13,16 14,99 0,15 0,04 1,51 2,96

Aveia 20 16,58 21,22 0,14 0,04 1,05 4,17

30 19,13 25,69 0,12 0,03 0,49 5,04

X2: xilobiose; X3: xilotriose; X4: xilotetraose; X5: xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos

XOs1 mg/mL: soma da concentração de xilobiose (X2), xilotriose (X3 ) e xilopentaose (X5).

5.3.6.1 Identificação por cromatografia em camada delgada (TLC) dos produtos de

hidrólise da hemicelulose

Os produtos resultantes da aplicação de diferentes cargas de xilanases de T.

aurantiacus nas hemiceluloses de bagaço, bétula e de semente de aveia foram analisados por

cromatografia de camada delgada (Figura 37). Em todas as reações foi confirmada a presença

de xilose e oligossacarídeos (X2 a X4). A hidrólise da xilana de semente de aveia (amostras 6

e 7 ) liberou oligômeros maiores, provavelmente X5. A ausência de manchas nos ensaios

controles das amostras de hemiceluloses (Figura 37-colunas 8, 9 e 10), indica que não há

formação de produtos por outros fatores além da ação enzimática.

111

Figura 37: Cromatografia em camada delgada dos produtos da hidrólise de hemiceluloses de bagaço, bétula e semente de aveia por extrato de T. aurantiacus após 96 h de reação. (1: padrões, 2: xilana do bagaço + 10 U/g endo-xilanase; 3: xilana do bagaço + 30 U/g endo-xilanase; 4: xilana bétula + 10 U/g endo-xilanase; 5: xilana bétula + 30 U/g; 6: xilana de semente de aveia + 10U/g endo-xilanase; 7: xilana de semente de aveia + 30 U/g endo-xilanase; 8: xilana do bagaço; 9: xilana bétula; 10: xilana de semente de aveia).

Um ensaio com 60 U de xilanase por grama de xilana do bagaço foi realizado em

diferentes tempos de reação (Figura 38). Xilobiose e xilotriose aparecem após 3 h, entretanto

a mancha correspondente a xilose é nítida apenas após 48 h de reação. A intensidade das

bandas de xilose e xilobiose aumentou com o tempo de hidrólise provavelmente pela

conversão de xilotriose em xilose e xilobiose. Bandas com menor intensidade referentes à

XOs com grau de polimerização superior a 3 aparecem no cromatograma.

Os xilo-oligossacarídeos provenientes da reação da hemicelulose do bagaço com 60

U/g de xilanase de T. aurantiacus foram reincubados com uma xilanase da família 5. A

xilanase da família 5 foi obtida de Erwinia chrysanthemi (HURLBERT; PRESTON, 2001), e

age sobre os xilo-oligossacarídeos ramificados com ácido glucurônico entre o primeiro e o

segundo resíduo de xilose substituído a partir do terminal não redutor liberando xilose e

ácidos aldourônicos (COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005). Os únicos produtos obtidos

após essa hidrólise foram xilobiose e xilotriose (Figura 39, coluna 3), desaparecendo

completamente a banda correspondente a X4 que aparecia no cromatograma anterior (Figura

38 – coluna 2). Esse resultado mostra que os XOs formados não são ramificados. A fim de

dirimir qualquer dúvida que ainda pudesse existir sobre a linearidade dos oligossacarídeos

obtidos da hidrólise com as enzimas de T. aurantiacus, foi realizada a pós-hidrólise dessa

112

amostra com β-xilosidase obtendo se xilose como único produto, comprovando que os XOs

que aparecem no cromatograma são lineares (Figura 39 - amostra 6).

Figura 38: Cromatografia em camada delgada dos produtos da hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com enzimas de T. aurantiacus. (1: padrões; 2: hidrolisado com 3 h de reação; 3: 6 h; 4: 48 h; 5: 96 h; 6: extrato enzimático; 7: hemicelulose do bagaço).

Figura 39. Cromatografia em camada delgada dos produtos da hidrólise de xilo-oligossacarideos (Amostra) obtidos da ação da xilanase de T. aurantiacus sobre a hemicelulose do bagaço. (1: padrões; 2: aldotetraurônico; 3: Amostra + endo-xilanase da família 5 (EX5); 4: Amostra + EX10; 5:Amostra + EX11; 6: Amostra + EX5 + β-xilosidase; 7: Amostra + EX10 + β-xilosidase; 8:Amostra + EX11 + β-xilosidase; 9: Amostra + β-xilosidase; 10: β-xilosidase).

113

5.4 AUTO-HIDRÓLISE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

O tratamento hidrotérmico do bagaço foi realizado na temperatura de 190°C por até 60

min. Ensaios com bagaço in natura e moído a 14 mesh não formaram XOs ou xilose em

níveis detectáveis, provavelmente porque nesse processo a superfície de contato é uma

variável muito importante na eficiência do pré-tratamento. Esperava-se que a adição de água

ao bagaço promovesse a solubilização de parte da hemicelulose do bagaço, pelo menos em

locais de fácil acesso. Outro fator que favorece a hidrólise da hemicelulose de

lignocelulósicos é o conteúdo de grupos acetil que catalisa a hidrólise (NABARLATZ;

EBRINGEROVÁ; MONTANÉ, 2007).

O bagaço com granulometria menor que 25 mesh foi submetido ao tratamento

hidrotérmico em ampolas de aço-inox. A tabela 25 mostra a composição do resíduo de bagaço

insolúvel em água nas condições de pré-tratamento. Como esperado a auto-hidrólise atacou

preferencialmente a hemicelulose. O resíduo sólido obtido após 60 min de auto-hidrólise

apresentou 15,5 % de hemicelulose, 48,9 % de celulose e 29 % de lignina (Tabela 25). A

remoção de hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar aumentou com o tempo de reação.

Tabela 25- Composição química do bagaço após auto-hidrólise a 190°C, 10 % (m/v).

Composição do material tratado (%)

tempo (min) Hemicelulose Celulose Lignina Total

0 27,50 44,90 22,10 94,50

5 24,77 44,90 25,72 95,37

15 22,19 44,90 26,98 94,07

30 17,74 45,72 28,29 91,75

45 16,39 46,58 29,04 92,01

60 15,55 48,92 29,08 93,55

A produção de XOs atingiu 6,9 % com 30 min de pré-tratamento, e chegou a 8 % após

60 min, com o aumento do tempo de pré-tratamento verificou-se que a maior parte da

hemicelulose foi convertida em xilose (31,6 %) (Tabela 26). Provavelmente houve formação

de XOs durante todo o tempo de reação, mas simultaneamente ocorreu a degradação desses a

xilose, sendo essa taxa de conversão em XOs semelhante à de degradação. Estima-se que 35

114

% da hemicelulose foi removida do bagaço em 30 min de reação, e desse percentual, cerca de

10 % foi convertido em XOs e 22 % obtido como xilose. Laser et al. (2002), observaram que

em temperatura de 200°C por 10 min a remoção da fração hemicelulósica do bagaço de cana

foi de 84 %. Nesse ensaio, o bagaço selecionado em peneira de 14 mesh (retido), foi

previamente aquecido com vapor antes da introdução de água aquecida. Os autores não

discutem o tempo para atingir a temperatura de trabalho e nem de resfriamento do reator de

25 L, fator que pode colaborar para maior solubilização da hemicelulose.

A xilose foi bastante estável, com pequena parte (0,6%) sendo convertida a furfural

em 60 min. A produção de hidroximetilfurfural manteve-se inferior a 0,1 % durante todo o

tempo de reação.

Tabela 26- Produtos da auto-hidrólise (190°C, 10 % m/v) do bagaço de cana-de-açúcar presentes na fração líquida.

Conversão (% - base massa hemicelulose)

Tempo

(min) Xilose X2 X3 X4 X5 Furfural HMF

XOs

(mg/mL) Total

5 0,65 0,24 0 0 0 0,01 0,06 0,06 0,89

15 1,36 0,3 0 0 0 0,02 0,08 0,08 1,66

20 2,74 0,7 0 0 0 0,02 0,07 0,18 3,44

25 5,23 2,89 0,01 0 0 0,05 0,07 0,72 8,13

30 15,11 6,92 0,06 0 0 0,43 0,07 1,75 22,1

45 15,72 6,56 0,06 0,04 0,02 0,39 0,05 1,67 22,41

60 31,63 8,04 0,08 0,04 0,06 0,59 0,12 2,06 39,86

X2: xilobiose; X3: xilotriose; X4: xilotetraose; X5: xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos;

HMF: hidroximetilfurfural

A recuperação total dos açúcares derivados da hemicelulose, expressada como

açúcares no filtrado dividido pelos açúcares no bagaço, foi de aproximadamente 40 % no

maior tempo de reação.

Comparativamente à hidrólise enzimática da hemicelulose, a produção de xilobiose

pela auto-hidrólise do bagaço foi 5,8 vezes menor. Uma alternativa para aumentar o teor de

XOs na solução seria concentrar os produtos da auto-hidrólise, entretanto, outros

procedimentos para remoção do furfural e hidroximetilfurfural teriam que ser avaliados para a

115

obtenção de um produto final purificado. Além disso, esse hidrolisado é mais indicado para

obtenção de xilose, pois a sua produção foi de duas a quatro vezes maior.

6. CONCLUSÕES

A partir dos resultados apresentados pode-se concluir que:

Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 produz a maioria das enzimas do complexo

celulolítico e hemicelulolítico. Apresentou bom crescimento em farelo de trigo, destacando a

predominância na produção de endo-β-1,4-xilanase perante as demais enzimas. Os ensaios de

estabilidade térmica confirmaram a estabilidade da xilanase em temperaturas elevadas.

A hemicelulose foi extraída com alto rendimento com peróxido alcalino e apresentou

alta solubilidade, coloração clara e baixo teor de lignina. De acordo com sua composição

química pode ser classificada como L-arabino-(4-O-metil-D-glucurono)-D-xilana. As

propriedades desse polissacarídeo foram adequadas para emprego em ensaios de hidrólise

enzimática, diferente da hemicelulose extraída com hidróxido de sódio, a qual apresentou

baixa solubilidade.

A hidrólise da hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar com enzimas de T.

aurantiacus e T. reesei resultou em maior conversão em XOs do que as enzimas de A. niger.

O uso de xilanases comerciais na hidrólise da hemicelulose não superou o desempenho das

enzimas de T. aurantiacus na produção de XOs, provavelmente pela presença de várias

enzimas acessórias além da xilanase no extrato de T. aurantiacus. A xilanase de T.

lanuginosus mostrou-se uma excelente enzima para a obtenção de xilobiose, uma vez que não

produziu xilose.

A xilanase de T. aurantiacus hidrolisou de modo semelhante as hemiceluloses de

bagaço de cana-de-açúcar, bétula e semente de aveia. As diferenças estruturais como

ramificações e presença de lignina não interferiram na ação dessa enzima. Em todos os casos

houve formação apenas de xilo-oligossacarídeos lineares.

A hidrólise da hemicelulose com as enzimas de T. aurantiacus e T. reesei apresentou

algumas diferenças. T. aurantiacus produziu XOs principalmente em tempos longos de reação

(acima 48 h) e T. reesei produziu XOs em tempos mais curtos (6 a 24 h), sendo que o

aumento do tempo favoreceu a produção de xilose. Os resultados mostram diferenças entre as

xilanases, evidenciando diferenças nas propriedades bioquímicas e atividade específica, o que

116

consequentemente causam diferenças na eficiência e extensão da hidrólise.

A auto-hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar gerou predominantemente xilose e uma

baixa quantidade de XOs. Entre os XOs formados destacou-se a xilobiose, como na hidrólise

enzimática, porém houve formação de furfural.

A produção de XOs pela auto-hidrólise do bagaço foi 5,8 vezes menor que na hidrólise

enzimática da hemicelulose e desta forma etapas de concentração e purificação seriam

necessárias para a obtenção de um produto final com as características desejadas. Por outro

lado, o tempo de reação foi curto e a moagem foi a única operação realizada no bagaço antes

do tratamento térmico.

Os melhores resultados de produção de XOs pelas enzimas de T. aurantiacus foram

diferentes das enzimas de T. reesei. Deve ser levado em consideração o custo de cada etapa,

enquanto a reação com enzimas de T. aurantiacus produz 41,6 % de XOs em 96 h, a reação

com enzimas de T. reesei produz 20 % em 6 h. Entretanto, com T. reesei deve ser empregado

mais substrato e enzima. Considerando o custo de extração de hemicelulose e de produção de

enzima, T. aurantiacus seria mais indicado para esse processo.

Enfim, a produção de XOs se torna possível através de uma etapa de extração da

hemicelulose e outra etapa de hidrólise enzimática. A primeira etapa deve ocorrer em meio

alcalino com peróxido de hidrogênio, por gerar um polissacarídeo solúvel e passível de

hidrólise enzimática. Na segunda etapa, destaca-se a ação das enzimas de T. aurantiacus, pela

maior conversão da hemicelulose em XOs e também pela alta produção de xilanase no cultivo

em meio sólido, fatores que contribuem para viabilidade econômica.

117

REFERÊNCIAS

AACHARY, A.A.; PRAPULLA, S.G. Value addition to corncob: Production and characterization of xylooligosaccharides from alkali pretreated lignin-saccharide complex using Aspergillus oryzae MTCC 5154. Bioresource Technology, v. 100, p. 991–995, 2009. AI, Z.; JIANG, Z.; LI, L.; DENG, W.; KUSAKABE, I.; LI, H. Immobilization of Streptomyces olivaceoviridis E-86 xylanase on Eudragit S-100 for xylo-oligosaccharide production. Process Biochemistry, v. 40, p. 2707–2714, 2005. AKPINAR, O.; AK, O.; KAVAS, A.; BAKIR, U.; YILMAZ, L. Comparison of acid and enzymatic hydrolysis of tobacco stalk xylan for preparation of xylooligosaccharides. LWT - Food Science and Technology, v. 43, p. 119–125, 2010. AKPINAR, O.; AK, O.; KAVAS, A.; BAKIR, U.; YILMAZ, L. Enzymatic Production of Xylooligosaccharides from Cotton Stalks. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 55, p. 5544-5551, 2007. AKPINAR, O.; ERDOGAN, K.; BOSTANCI, S. Enzymatic production of Xylooligosaccharide from selected agricultural wastes. Food and Bioproducts Processing, v. 87, p. 145-151, 2009. ABATZOGLOU, N.; CHONET, E.; BELKACEMI K.; OVEREND, R.P. Phenomenological kinetics of complex systems: the development of a generalized severity parameter and its application to lignocellulosics fractionation. Chemical Engineering Science, v. 47, p. 1109–1200, 1992. ALAM, M.; GOMES, I.; MOHIUDDIN, G.; HOQ, M.M. Production and characterization of thermostable xylanases by Thermoascus lanuginosus and Thermoascus aurantiacus grown on lignocelluloses. Enzyme Microbial and Technology, v. 16, p. 298–302, 1994. ANDO, H.; OHBA, H.; SASAKI, T.; TAKAMINE, K.; KAMINO, Y.; MORIWAKI, S. Hot-compressed-water decomposed products from bamboo manifest a selective cytotoxicity against acute lymphoblastic leukemia cells. Toxicol in vitro, v. 18, p. 765–71, 2004. AOYAMA, M.; SEKI, K.; SAITO, N. Solubilization of bamboo grass xylan by steaming treatment. Holzforschung, v. 49, p. 193–196, 1995. ARO, N.; PAKULA, T.; PENTTILÄ, M. Transcriptional regulation of plant cell wall degradation by filamentous fungi. FMES Microbiology reviews, v. 29, p. 719-739, 2005. AUER, C.G.; KRUGNER, T.L.; BARRICHELO, L.E.G. Fungos termófilos em pilhas decavacos de Eucalyptus spp. com auto-aquecimento. IPEF, Piracicaba, n.38, p.28-32, 1988. BAILEY, M. J.; BIELY, P.; POUTANEN, K. Interlaboratory testing of methodos for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology, v. 23, p. 257-270, 1992. BAILEY, M.J.; BUCHERT, J.; VIIKARI, L. Effect of pH on production of xylanase by Trichoderma reesei on xylan- and cellulose-based media. Applied Microbiology and

118

Biotechnology, v. 40, p. 224–9, 1993. BARNET, D.; EXCOFFIER, G.; VIGNON, M. Valorisation de la biomasse lignocellulosique: autohydrolyse rapide de copeaux de Bois de peuplier. Bulletin de la Societe Chimiqye, v. 6, p. 836-843, 1989. BAUCHER, M.; HALPIN, C.; PETIT-CONIL, M.; BOERJAN, W. Lignin: Genetic engineering and impact on pulping. Cr itical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, v. 38, p. 305–350, 2003. BEG, Q.K.; KAPOOR, M.; MAHAJAN, L.; HOONDAL, G.S. Microbial xylanase and their Applications: a review. Applied of Microbiology and Biotechnology, v. 56, p. 326-338, 2001. BERLIN, A.; GILKES, N.; KILBURN, D.; BURA, R.; MARKOV, A.; SKOMAROVSKY, A.; OKUNEV, O.; GUSAKOV, A.; MAXIMENKO, V.; GREGG, D.; SINITSYN, A.; SADDLERA, J. Evaluation of novel fungal cellulase preparations for ability to hydrolyze softwood substrates; evidence for the role of accessory enzymes. Enzyme and Microbiol Technology, v. 37, p. 175-184, 2005. BIELY, P.; VRSANSKH, M.; TENKANEN, M.; KLUEPFEL, D. Endo-β-1,4-xylanase families: differences in catalytic properties. Journal of Biotechnology, v. 57, p. 151-166, 1997. BIELY, P. Biochemical aspects of the production of microbial hemicellulases. In: Hemicellulose and Hemicellulases, Ed. COUGHLAN, M. P.;HAZLEWOOD, G. P. Cambridge: Portland Press, 1993, p.29-51. BIELY, P.; MACKENZIE, C. R.; PULS, J.; SCHNEIDER, H. Cooperativity of esterases and xylanases in the enzymatic degradation of acetyl xylan. Biotechnology, v. 4, p. 731-733, 1986. BRILLOUET, J.M.; JOSELEAU, J.P. Investigation of the structure of a heteroxylans from the outer pericarp (Beeswing bran) of wheat kernel. Carbohydrate Researche, v. 159, p. 109–126, 1987. CANILHA, L. Produção de xilitol no hidrolisado hemicelulósico de palha de trigo. Tese (Doutorado em Biotecnologia Industrial), Departamento de Biotecnologia, Escola de Engenharia de Lorena, Lorena-SP, 2006. CAO, Y.; SHIBATA, S.; FUKUMOTO, I. Mechanical properties of biodegradable composites reinforced with bagasse fibre before and after alkali treatments. Composites, v. 37, p. 423-429, 2006. CARA, C.; RUIZ, E.; CASTRO, E.; CARVALHEIRO, F.; MOURA, P.; GÍRIO, F. Separation of olive tree pruning oligomers from liquid hot water hydrolyzates using preparative gel filtration chromatography. In press. CARPITA, N.C.; GIBEAUT, D.M. Structural models of primary-cell walls in flowering growth. Plant Journal, v. 3, p. 1-30, 1993.

119

CARVALHO, W. Estudo da imobilização de Candida guilliermondii FTI 20037 para obtenção de xilitol em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Industrial)-Departamento de Biotecnologia, Faenquil, Lorena-SP, 2000. CÉSAR, T.; MRSA, V. Purification and properties of the xylanase produced by Thermomyces lanuginosus. Enzyme and Microbial Technology, v. 19, p. 289-296, 1996. CHANG, V. S.; HOLTZAPPLE, M. T. Fundamental factors affecting biomass enzymatic reactivity. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 84-86, p. 5-37, 2000. CHURMS, S. Recent progress in carbohydrate separation by high-performance liquid chromatography based on hydrophilic interaction. Journal of Chromatography A, v. 720, p. 75-91, 1996. CLARK, E.M.; TENKANEN, M.; NAKARI-SETÄLÄ T.; PENTTILA, M. Cloning of Genes Encoding a-L-Arabinofuranosidase and b-Xylosidase from Trichoderma reesei by Expression in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, p. 3840–3846, 1996. CLOETENS, L.; SWENNEN, K.; DE PRETER, V.; BROEKAERT, W.F.; COURTIN, C.M.; DELCOUR, J.A.; RUTGEERTS, P.; VERBEKE, K. Effect of arabinoxylo-oligosaccharides on proximal gastrointestinal motility and digestion in healthy volunteers. European Journal of Clinical Nutrition and Metabolism, v. 3, p. 220-225, 2008. COBOS A.; ESTRADA, P. Effect of polyhydroxylic cosolvents on the thermostability and activity of xylanase from Trichoderma reesei QM 9414. Enzyme and Microbial Technology, v. 33, p. 810–818, 2003. COLLINS, T.; GERDAY, C.; FELLER, G. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases. FEMS Microbiology review, v. 29, p. 3-23, 2005. Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB). 3º Levant. de cana-de-açucar Nov/2009 Disponível na internet:<http://www.conab.gov.br/conabweb/download/safra/BoletimCana-Novembro2009-07.pdf> Acesso em 07/2009. CONNER, A.H.; LORENZ, L.F. Kinetic modeling of hardwood prehydrolysis. Part III. Water and dilute acetic acid prehydrolysis of southern red oak. Wood and Fiber Science, v. 18, p. 248–263, 1986. CONVERSE, A.; OOSHIMA, H.; BURNS, D. Kinetics of enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials based on surface area of cellulose accessible to enzyme and enzyme adsorption on lignin and cellulose. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 24/25, p. 67-73, 1990. CONTAT, J.; JOSELEAU, J.P. Mode of action a xylanase and its significance for the structural investigation of the branched L-arabino-D-glucurono-D-xylan from redwood (Sequoia sempervirens). Carbohydrate Resources, v. 95, p. 101-112, 1981.

120

COONEY, D.G., EMERSON, R. Thermophilic fungi. An account of their biology, activities and classification. Enzyme and Microbial Technology, v. 11, p. 220–229, 1964. COUGHLAN, M.P., HAZLEWOOD, G.P. β-1,4-d-Xylan-degrading systems: biochemistry, molecular biology and applications. Biotechnology and Applied Biochemistry, v. 17, p. 259–289, 1993. COURI, S.; TERZI, S.C.; PINTO, G.A.S.; FREITAS, S.P.; DA COSTA, A.C.A. Hydrolytic enzyme production in solid-state fermentation by Aspergillus niger 3T5B8. Process Biochemistry, v. 36, p. 255–261, 2000. CRITTENDEN, R. G.; PLAYNE, M. J. Production, properties and applications of food-grade oligosaccharides. Trends in Food Science and Technology, v. 7, p. 353-361, 1996. CURRELI, N.; FADDA, M.B.; RESCIGNO, A.; RINALDI, A.C.; SODDU, G.; SOLLAI, F.; VACCARGIU, S.; SANJUST, E.; RINALDI, A. Mild alkaline/oxidative pretreatment of wheat straw. Process Biochemistry, v. 32, p. 665-670, 1997. DALIMOVA, G.N. Oxidation of hydrolyzed lignin from cotton-seed husks by hydrogen peroxide. Chemistry of Natural Compounds, v. 41, p. 85-87, 2005. DA SILVA, R.; LAGO, E.L.; MERHEB, C.W.; MACCHIONE, M.M.; PARK, Y.K.; GOMES, E. Production of xylanase and CMCase on solid state fermentation in different residues by Thermoascus aurantiacus. Brazilian Journal of Microbiology, v. 36, p. 235-241, 2005. DEKKER, R.F.H.; WALLIS, A.F.A. Autohydrolyses-explosion as pretreatment for the enzymic saccharification of sunflower seed hulls. Biotechnology Letter, v. 5, p. 311-316, 1983. DENCE, C.W. The determination of Lignin. In: LIN, Y.L.; DENCE, C.W. Methods in Lignin Chemistry. Berlin: Ed. Springer, 1992, p. 33-62. DEPLOEY, J.J. Some factors affecting the germination of Thermoascus aurantiacus ascospores. Mycologia, v. 87, p. 362-365, 1995. DOBREV, G.T.; PISHTIYSKI, I.G.; STANCHEV, V.S.; MIRCHEVA, R. Optimization of nutrient medium containing agricultural wastes for xylanase production by Aspergillus niger B03 using optimal composite experimental design. Bioresource Technology, v. 98, p. 2671–2678, 2007. DUBOIS, M.; GILES, K.; HAMILTON, J.K.; REBES, P.A.; SMITH, F. Colorimetric method for determination of sugars and relates substances. Analytical Chemistry v. 28, p. 350-356, 1956. DURAND, H.; BARON, M.; CALMELS, T.; TIRABY, G. Classical and molecular genetics applied to Trichoderma reesei for the selection of improved cellulolytic industrial strains. In: Aubert, J.-P.; Beguin, P.; Millet, J. Editors, Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, San Diego: Academic Press, 1988, pp. 135–151.

121

EBRINGEROVÁ, A.; Z. HROMÁDKOVÁ, Z.; HEINZE, T. Hemicellulose. In: HEINZE, T. Polysaccharydes I. Structure, Characterization and Uses. Heidelberg: Springer Berlin, 2005, v. 186, p. 1-67, Advances in Polymer Science. El MANSOURI, N-E.; SALVADÓ, J. Structural characterization of technical lignins for the production of adhesives: Application to lignosulfonate, kraft, soda-anthraquinone, organosolv and ethanol process lignins. Industrial Crops and Products, v. 24, 8-16, 2006. EVELEIGH, D.E. Trichoderma. In: DEMAIN, A.L.; SOLOMON, N.A. Editors, Biology of Industrial Microorganisms. Menlo Park, CA: Benjamin/Cummings, 1985, p. 487–509. FANG, J. M.; SUN, R. C.; SALISBURY, D.; FOWLER, P.; TOMKINSON, J. Comparative study of hemicelluloses from wheat straw by alkali and hydrogen peroxide extractions. Polymer Degradation and Stability, v. 66, p. 423–432, 1999. FENEL, F.; ZITTINGA, A.; KANTELINEN, A. Increased alkali stability in Trichoderma reesei endo-1,4-β-xylanase II by site directed mutagenesis. Journal of Biotechnology, v. 121, p. 102-107, 2006. FENGEL, D.; WEGENER, G. Wood: Chemistry, Ultrastructure reactions. New York: W. De Gruyter, 1984, p. 613. FERNÁNDEZ-ESPINAR, M.; PIÑAGA, F.; DE GRAAFF, L.; VISSER, J.; RAMÓN, D.; VALLÉS, S. Purification, characterization and regulation of the synthesis of an Aspergillus nidulans acidic xylanase. Applied Microbiology Biotechnology, v.42, p. 555-562, 1994. FOOKS, L. J.; GIBSON, G. R. In vitro investigations of the effect of probiotics and prebiotics on selected human intestinal pathogens. FEMS Microbiology Ecology, v. 39, p. 67, 2002. FOURNIER, R.A.; FREDERICK, M.M; FREDERICK, J.R.; REILLY, P.J. Purification and characterization of endo-xylanases from Aspergillus niger. III. An enzyme of pI 3.65. Biotechnology and Bioengineering, v. 27, p. 539–546, 1985. FREDERICK, M.M., FREDERICK, J.R.; FRAYZKE, A.R; REILLY, P.J. 1981. Purification and characterization of a xylobiose- and xylose-producing endo-xylanase from Aspergillus niger. Carbohydrate, v. 97, p. 87–103, 1981. FROLLINI, E.; PIMENTA, M.J.A. Lignin: Utilization as a macromonomer in the synthesis of phenolic type resins. Anais Associação Brasileira de Química, v. 46, p. 43–49, 1997. FURUKAWA, T.; SHIDA, Y.; KITAGAMI, N.; MORI, K.; KATO, M.; KOBAYASHI, T.; OKADA, H.; OGASAWARA, W.; MORIKAWA, Y. Identification of specific binding sites for XYR1, a transcriptional activator of cellulolytic and xylanolytic genes in Trichoderma reesei. Fungal Genetics and Biology, v. 46 ,p. 564-574, 2009. GABRIELII, I.; GATENHOLM, P.; GLASSER, W.G.; JAIN, R.K.; KENNE, L. Separation, characterization and hydrogel-formation of hemicellulose from aspen wood. Carbohydrate Polymers, v. 43, p. 367–374, 2000.

122

GARROTE, G.; DOMÍNGUEZ, H.; PARAJÓ, J. C. Mild autohydrolysis: an environmentally friendly technology for xylooligosaccharide production from wood. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v. 74, p. 1101–1109, 1999. GARROTE, G.; FALQUÉ, E.; DOMÍNGUEZ, H.; PARAJÓ, J.C. Autohydrolysis of agricultural residues: Study of reaction byproducts. Bioresource Technology, v. 98, p.1951–1957, 2007. GARROTE, G.; DOMÍNGUEZ, H.; PARAJÓ, J.C. Interpretation of deacetylation and hemicellulose hydrolysis during hydrothermal treatments on the basis of the severity factor. Process Biochemistry, v. 37, p. 1067-1073, 2002a. GARROTE, G.; DOMÍNGUEZ, H.; PARAJÓ, J.C. Autohydrolysis of corncob: study of non- isothermal operation for xylooligosaccharide production. Journal of Food Engineering, v. 52, p. 211–218, 2002b. GASPAR, A.; COSSON, T.; ROQUE, C.; THONART. Study on the production of a xylanolytic complex from Penicillium canescens 10-10c. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.67, p.45-67, 1997. GASPAR, M.; JUHÁSZ, T.; SZENGYEL, Z.S.; RÉCZEY, K. Fractionation and utilisation of corn fibre carbohydrates. Process Biochemistry, v. 40, p. 1183–1188, 2005. GIBSON, G.R. Fibre and effects on probiotics (the prebiotic concept). Clinical nutritional Supplements, v. 1, p. 25-31, 2004. GIBSON, G.R.; ROBERFROID, M.B. Dietary modulation ofthe human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. The journal of Nutrition, v. 125, p. 1401-1412, 1995. GIERER, J. Chemical aspects of kraft pulping. Wood Science and Tecnology, v.14, p. 241-266, 1980. GOMES, D.J.; GOMES, J.; STEINER, W. Factors influencing the induction of endo-xylanase by Thermoascus aurantiacus. Journal of Biotechnology, v.33, p. 87–94, 1994. GOMES, I.; GOMES, J.; GOMES, D.J.; STEINER, W. Simultaneous production of high activities of thermostable endoglucanase and β-glicosidase by the wild thermphilic fungus Thermoascus aurantiacus. Applied Microbiology and Biotechnology. v. 53, p. 461–468, 2000. GOMES, J., TERLER, K.; KRATZER, R.; KAINZ, E.; STEINER, W. Production of thermostable β-mannosidase by a strain of Thermoascus aurantiacus: Isolation, partial purification and characterization of the enzyme. Enzyme and Microbial Technology, v. 40, p. 969–975, 2007. GOMIDE, J.L; OLIVEIRA, R.C. Eficiência da antraquinona na polpação alcalina de eucalipto. Revista Árvore, p. 203-214, 1979. GONÇALVES, A.R.; OVIEDO, M.A.S. Production of chelating agents through the enzymatic oxidation of acetosolv sugarcane bagasse lignin. Applied Biochemistry and

123

Biotechnology, v. 98-100, p. 365-371, 2002. GONÇALVES, A.R.; ESPOSITO, E.; BENAR, P. Evaluation of Panus tigrinus in the delignification of sugarcane. Journal of Biotechnology, v. 66, p. 177–185, 1998. GORBACHEVA, I.V.; RODIONOVA, N.A. Studies on xylan degrading enzymes. I. Purification and characterization of endo-β-1,4-xylanase from Aspergillus niger. Biochim. Biophys, v. 484, p. 79–93, 1997. GRABBER, J.H; JOHN, R.; RONALD, H.D.; Model studies of ferulate-coniferyl alcohol cross-product formation in primary maize walls: implications for lignification in grasses. Journal of agricultural and food chemistry, v. 50, p. 6008-6016, 2002. GRISHUTIN, S.G.; GUSAKOV, A.V.; MARKOV, A.V.; USTINOV, B.B.; SEMENOVA, M.; SINITSYN, A.P. Specific xyloglucanases as a new class of polysaccharide-degrading enzymes. Biochimica at Biophysica Acta, v. 16, p. 268–281, 2004. GUAY, D.F.; COLE, B.J.W.; FORT, R.C.; HAUSMAN, M.C.; GENCO, J.M.; ELDER, T.J.; OVERLY, K.R. Mechanisms of oxidative degradation of carbohydrates during oxygen delignification. ii. Reaction of photochemically generated hydroxyl radicals with methyl-β-cellobioside. Journal of Wood Chemistry and Technology, v. 21, p. 67–79, 2001. HALTRICH, D.; NIDETZKY, B.; KULBE, K. D.; STEINER, W.; ZUPANCIC, S. Production of fungal xylanases. Bioresource Technology, v.58, p.137-161, 1996. HAMIL, A., YASMEEN, A., RAJOKA, M. I. Induction, production, repression and de-repression of exoglucanase synthesis in Aspergillus niger. Bioresouse Technology, v. 94, p. 311-319, 2004. HAYASHI, N.; SAKAKI, T.; DOI, K. Carbohydrate-based food having radical scavenging activity and its manufacture. Patent JP 2.005.021.111, 2005(b). HAYASHI, N.; SAKAKI, T.; DOI, K. Water-soluble saccharides useful as health foods and their manufacture by hydrolysis of hemicellulose-containing plants with pressurized hot water. Patent JP 2.005.023.041, 2005(a). HEITZ, M.; CAPEK-MÉNARD, E.; KOEBERLE, P. G.; GAGNÉ, J.; CHORNET, E.; OVEREND, R.P.; TAYLOR, J.D.; YU, E. Fractionation of Populus tremuloides at the pilot plant scale: Optimization of steam pretreatment conditions using the STAKE II technology. Bioresource Technology, v.35, p. 23–32, 1991. HENDRIKS, A.T.W.M.; ZEEMAN, G. Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, v. 100, p. 10–18, 2009. HERMANN, M.C.; VRSANSKA, M.; JURICKOVA, M.; HIRSCH, J.; BIELY, P.; KUBICEK, C.P. The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase. Biochemical Journal, v. 321, p. 375–381, 1997. HIGUCHI, T. Look back over the studies of lignin biochemistry. Journal of Wood Science, v. 52, p. 2-8, 2006.

124

HOFFMAN, R.A.; GEIJTENBEEK , T.; KAMERLING, J.P.; VLIEGENTHART, J.F.G. 1H-NMR study of enzymically generated wheat-endosperm arabinoxylan oligosaccharides: structures of hepta- to tetradecasaccharides containing two or three branched xylose residues. Carbohydrate Resource, v. 223, p. 19-44, 1992. HOWARD, R.L.; ABOTSI, E.; VAN RENSBURG, J.E.L.; HOWARD S. Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African Journal of Biotechnology, v. 2, p. 602-619, 2003. HRMOVÁ, M.; BIELY, P.; VRSANSKA, M. Specificity of cellulase and xylanase induction in Trichoderma reesei QM 9414. Archives of Microbiology, v. 144, p. 307-311, 1986. HURLBERT, J.C.; PRESTON, J.F. Functional characterization of a novel xilanase from corn strain of Erwinia chrysanthemi. Journal of Bacteriology, v. 183, p. 2093-2100, 2001. INAFUKU, M.; FUJINO, T.; KASHIWAGI, Y.; OHARA, S. Antioxidant dietary fiber, its manufacture, and processed food using it. Patent JP 2.002.204.674, 2002. ISHIHARA, M.; NOJIRI, M.; HAYASHI, N.; NISHIMURA, T.; SHIMIZU, K. Screening of fungal xylanases for production of acidic xylooligosaccharides using in situ reduced 4-O-methylglucuronoxylanas substrate. Enzyme and Microbial Technology, v. 21, p. 170-175, 1997. ITO, M.; YAMAGUCHI, K.; IZUMI, K. Xylooligosaccharide compositions, and cancer cell apoptosis inducers containing them. Patent JP 2.001.086.999, 2001. IWAMOTO, T.; SASAKI, T.; INAOKA, M. Purification and some properties of xylanase from Aspergillus niger. Mem. Coll. Agriculture Ehime University, v. 17, p. 185-197, 1973. IZUMI, K.; AZUMI, N. Xylooligosaccharide compositions useful as food and feed additives. Patent JP 2001226409, 2001. JUHÁSZ, T.; SZENGYEL, Z.; RECZEY, K.; SIIKA-AHO, M.; VIIKARI, L. Characterization of cellulases and hemicellulases produced by Trichoderma reesei on various carbon sources. Process Biochemistry, v. 40, p. 3519-3525, 2005. KABEL, M.A.; CARVALHEIRO, F., GARROTE, G.; AVGERINOS, E.; KOUKIOS, E. PARAJÓ, J.C.; GÍRIO, F.M.; SCHOLS, A.G.J.; VORAGEN, A.G.J. Hydrothermally treated xylan rich by-products yield different classes of xylo-oligosaccharides. Carbohydrate Polymers, v. 50, p. 47-56, 2002. KABEL, M.A.; VAN DEN BORNE, H.; VINCKEN, J.P.; VORAGEN, A.G.J.; SCHOLS, H.A. Structural differences of xylans affect their interaction with cellulose. Carbohydrate Polymers, v. 69, p. 94 – 105, 2007. KADLA, J.F.; CHANG, H. The reaction of peroxides with lignin and lignin model compounds, In: ARGYROPOULOS, D.S. Oxidative delignification chemistry: Fundamentals and catalysis. Washington: Ed. McGill University, American Chemical Society, 2001, p. 108-129. ACS Symposium series 785.

125

KALOGERIS, E.; CHRISTAKOPOULOS, P.; ALEXIOU, A.; VLACHOU, S.; KEKOS, D.; MACRIS, B.J. Production and characterization of cellulolytic enzyme from the thermophilic fungus T. aurantiacus under solid state cultivation of agricultural wastes. Process Biochemistry, v. 38, p. 1099-1104, 2003. KALOGERIS, E.; CHRISTAKOPOULOS, P.; KEKOS, D.; MACRIS, B.J. Studies on the solid-state production of thermostable endoxylanases from Thermoascus aurantiacus: Characterization of two isozymes. Journal of Biotechnology, v. 60, p. 155-163, 1998. KALOGERIS, E.; CHRISTAKOPOULOS, P.; VRSANSKÁ, M.; KEKOS, D.; BIELY, P. Catalytic properties of the endoxilanase I from Thermoascus aurantiacus. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 11, p. 491-501, 2001. KALOGERIS, E.; FOUNTOUKIDES, G.; KEKOS, D.; MACRIS, B.J. Design of a solid-state bioreactor for thermophilic microorganisms. Short Communication. Bioresource Technology, v. 67, p. 313-315, 1999. KANG, S.W.; PARK, Y.S.; LEE, J.S.; HONG, S.I.; KIM, S.W. Production of cellulases and hemicellulases by Aspergillus niger KK2 from lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, v. 91, p. 153-156, 2004. KATAPODIS, P.; CHRISTALOPOULOS, P. Induction and partial characterization of intracellular β-fructofuranosidase from Thermoascus aurantiacus and its application in the synthesis of 6-kestose. World Journal of Microbiology & Biotechnology, v. 20, p. 667–672, 2004. KATAPODIS, P.; VARDAKOU, M.; KALOGERIS, E.; KEKOS, D.; MACRIS, B.J.; CHRISTAKOPOULOS, P. Enzymatic production of a feruloylated oligosaccharide with antioxidant activity from wheat flour arabinoxylan. European Journal of Nutrition, v. 42, p. 55–60, 2003. KAYA, F.; HEITMAM, J.A.; JOYCE, T.W. Influence of lignin and its degradation products on enzymatic hydrolysis of xylan. Journal of Biotechnology, v. 80, p. 241-247, 2000. KAYSERILIOGLU, B.S.; KAYSERILIOGLU, U.; BAKIR, L.; AKKAS, N. Use of xylan, an agricultural by-product, in wheat gluten based biodegradable films: Mechanical, solubility and water vapor transfer rate properties. Bioresource Technology, v. 87, p. 239–246, 2003. KHANDKE, K.M.; VITHAYATHIL, P.J.; MURTHY, S.K. Purification and characterization of an α-D-Glucuronidase from a thermophilic fungus, Thermoascus aurantiacus. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 274, p. 511-517, 1989a. KHANDKE, K.M.; VITHAYATHIL, P.J.; MURTHY, S.K. Purification of Xylanase, β-Glucosidase, Endocellulase, and Exocellulase from a Thermophilic Fungus, Thermoascus aurantiacus. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 274, p. 491-500, 1989b. KHENG, P.P,; IBRAHIM, C.O. Xylanase production by a local fungal isolate, Aspergillus niger USM AI 1 via solid state fermentation using palm kernel cake (PKC) as substrate. Journal of Science and Technology, v. 27, p. 325-336, 2005.

126

KITPREECHAVANICH, V.; HAYASHI, M.; NAGAI, S. Purification and properties of endo-1,4-β-xylanase from Humicola lanuginosa. Journal of Fermentation and Technology, v. 5, p. 415–420, 1984. KOLENOVÁ, K.; VRSANSKÁ, M.; BIELY, P. Mode of action of endo-β-1,4-xylanases of families 10 and 11 on acidic xylooligosaccharides. Journal of Biotechnology, v. 121, p. 338–345, 2006.

KOVAC, P.; HIRSCH, J. C-NMR spectra of xylo-oligosaccharides and their application to the elucidation of xylan structures. Carbohydrate Resource, v. 85, p. 177-185, 1980. KUBIKOVA, J.; ZEMANN, A.; KRKOSKA, P.; BOBLETER, O. Hydrothermal pretreatment of wheat straw for the production of pulp and paper. Tappi J., v. 79, p. 63–9, 1996. KULKARNI, N.; SHENDYE, A.; RAO, A. Molecular and biotechnological aspects of xylanases. FEMS Microbiology Reviews, v. 23, p. 411-456, 1999. LADISCH, M.; BREWER, R. HENDRICKSON, R. Pretreatment of lignocellulosic materials by pressure cooking in water: experimental results and engineering analysis, In: SYMPOSIUM ON BIOTECHNOLOGY FOR FUELS AND CHEMICALS, 19, 1997, May 4-8, Colorado Springs, CO. LAPIERRE, L.; BERRY, R.; BOUCHARD, J.R. The effect of magnesium ions and chelants on peroxide bleaching. Hollzforschung, v. 57, p. 627–633, 2003. LASER, M.; SCHULMAN, D.; ALLEN, S.G.; LICHWA, J.; ANTAL, M.J.; LYND, L.R. A comparison of liquid hot water and steam pretreatments of sugar cane bagasse for bioconversion to ethanol. Bioresource Technology, v. 81, p. 33-44, 2002. LAWOKO, M.; HENRIKSSON, G.; GELLERSTEDT, G. New method for quantitative preparation of lignin-carbohydrate complex from unbleached softwood kraft pulp: lignin-polysaccharide networks I. Holzforschung, v. 57, p. 69–74, 2003.

LEE, Y.C. Carbohydrate analysis with high-performance anion-exchange chromatography. Journal of Chromatography A, v. 720, p. 137-149, 1996. LI, K.; AZADIC, P.; COLLINS, R.; TOLAN, J.; KIM, J.S.; ERIKISSOM, K.L. Relationships between activities of xylanases and xylan structures. Enzyme and Microbial Technology, v. 27, p. 89-94, 2000. LI, J.; KISARA, K.; DANIELSSON, S.; LINDSTRÖM, M.E.; GELLERSTEDT, G. An emproved methodology for the quantification of uronic acid units in xylans and other polysaccharides. Carbohydrate Research, v. 342, p. 1442–1449, 2007. LIMA, D.U.; OLIVEIRA, R.C.; BUCKERIDGE, M.S. Seed storage hemicelluloses as wet- end additives in papermaking. Carbohydrate Polymers, v. 52, p. 367–373, 2003. LIU, S. Chemical kinetics of alkaline peroxide brightening of mechanical pulps. Chemical Engineering Science, v. 58, p. 2229 – 2244, 2003.

127

LORA J. H.; WAYMAN, M. Delignification of hardwood by autohydrolysis-extraction. TAPPI, v. 61, p.47–50, 1978. LYND, L. R.; ELANDER, R. T.; WYMAN, C. E. Likely features and costs of mature biomass ethanol technology. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 57/58, p. 741–761, 1996. LYND, R. L.; LASER, M. S.; ALLEN S. G.; ANTAL M. J. Pretreatment of lignocellulosics with liquid hot water and subsequent conversion to ethanol, In: SYMPOSIUM ON BIOTECHNOLOGY FOR FUELS AND CHEMICALS, 19, May 4-8, 1997, Colorado Springs, CO. MACH, R.L.; STRAUSS, J.; ZEILINGER, S.; SCHINDLER, M.; KUBICEK, C.P. Carbon catabolite repression of xylanase I (xyn1) gene expression in Trichoderma reesei. Molecular Microbiology, v. 21, pp. 1273–1281, 1996. MACHUCA, A. Produção e caracterização parcial de um composto de baixa massa molecular, com atividade fenoloxidásica, de T. aurantiacus. 1995 Tese (Doutorado) -I.B., Unicamp, Campinas-SP, 1995. MACHUCA, A. Thermoascus aurantiacus (cepa brasileira): aspectos do crescimento, produção enzimática e utilização no tratamento de materiais lignocelulósicos. 1991 Dissertação (Mestrado) - I.B. Unicamp, Campinas-SP, 1991. MAHESHWARI, R.; BHARADWAJ, G.; BHAT, M.K. Thermophilic fungi: their physiology and enzymes. Microbiology and Molecular Biology, v. 64, p. 461-488, 2000. MALONEY, M.T.; CHAPMAN, T.W.; BAKER, A.J. Dilute acid hydrolysis of paper birch: Kinetic study of xylan and acetyl-group hydrolysis. Biotechnology and Bioengineering, v. 27, p. 355–361, 1985. MARQUES, F. O alvo é o bagaço – Subproduto abundante da indústria da cana dá vantagem competitiva ao Brasil na busca do etanol de segunda geração. Revista Pesquisa Fapesp, n° 163, setembro de 2009. MARTINS, E.S; DA SILVA, R.; LEITE, R.S.R.; GOMES. E. Purification and characterization of polygalacturonase produced by Thermoascus aurantiacus 179-5 in submerged fermentation. Antonie van Leeuwenhoek, v. 91, n. 3, p. 291-299, 2007. MARTINS, E.S.; SILVA, D.; DA SILVA, R.; GOMES, E. Perfil enzimático produzido pelo fungo termofílico Thermoascus aurantiacus através de fermentação em estado sólido e fracionamento de uma poligalacturonase termoestável. In: SIMPÓSIO NACIONAL DE FERMENTAÇÕES, 14 (SINAFERM), 2003, Florianópolis. MARTÝN, C.; GALBE, M.; WAHLBOM, C.F.; HAHN-HÄGERDAL , B.; JÖNSSON, L.J. Ethanol production from enzymatic hydrolysates of sugarcane bagasse using recombinant xylose-utilising Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology, v. 31, p. 274–282, 2002.

128

MASLEN, S. L.; GOUBET, F.; ADAM, A.; DUPREE, P.; STEPHENS, E. Structure elucidation of arabinoxylan isomers by normal phase HPLC-MALDI-TOF/TOF-MS/MS. Carbohydrate Resource, v. 342, p. 724–735, 2007. MATSUO, M.; ENDOU, A.; OKADA,T.; YAMAOKA, Y. Purification and characterization of β-xylosidase from Thermoascus sp. Journal of Fermentation and Bioengineering, v. 86, p. 403-405, 1998. MATSUOKA, M. Xylooligosaccharides for manufacture of dietary fiber health foods. Patent WO 2,005,092,124, 2005. McDOUGALL, G. J.; MORRISON, I. M.; STEWART, D.; WEYERS, J.D.B.E.; HILLMAN, J.R. Plant fibres: botany, chemistry and processing for industrial use. Journal Science Food Agriculture, v. 62, p. 1-20, 1993. MILAGRES, A.M.F.; SANTOS, E.; PIOVAN, T.; ROBERTO, I.C. Production of xylanase by Thermoascus aurantiacus from sugar cane bagasse in an aerated growth fermentor. Process Biochemistry, v. 39, p. 1387–1391, 2004. MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, v. 31, p. 426-428, 1959. MILLER, J.G.; FRY, S.C. Characteristics of xyloglucan after attack by hydroxyl radicals. Carbohydrate Research, v. 332, p. 389–403, 2001. MISHRA, C.; FORRESTER, I.T.; KELLY, B.D.; BURGESS, R.R.; LEATHAM, G.F. Characterization of a major xylanase purified from Lentinula edodes cultures grown on a commercial solid lignocellulosic substrate. Applied Microbiology Biotechnology, v.33, p.226-232, 1990. MOSIER, N.; WYMAN, C.; DALE, B.; ELANDERD, R.; LEE, Y. Y.; HOLTZAPPLE, M.; LADISCH, M. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, v. 96, p. 673-686, 2005. MOURE, A.; GULLÓN, P.; DOMÍNGUEZ, H.; PARAJÓ, J.C. Advances in the manufacture, purification and applications of xylo-oligosaccharides as food additives and nutraceuticals. Process Biochemistry, v. 41, p.1913–1923, 2006. MUSSATO, S.I. Influência do tratamento do hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz na produção de xilitol por Candida guilhermondii. 2002 Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Industrial) - Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, Lorena-SP, 2002. MUZZY, J. D.; ROBERT, R. S.; FIBER, C. A.; FAASS, G. S.; MAMM, T. M. Pretreatment of hardwood by continuous steam hydrolysis. In: Wood and agricultural residues. New York: Academic Press, 1983, p. 351-368. NABARLATZ, D.; EBRINGEROVÁ, A.; MONTANÉ, D. Autohydrolysis of agricultural by-products for the production of xylo-oligosaccharides. Carbohydrate Polymers, v. 69, p. 20–28, 2007.

129

NABARLATZ, D.; MONTANÉ, D.; KARDOSOVÁ, A.; BEKESOVÁ, S.; HRÍBALOVÁ, V.; EBRINGEROVA, A. Almond shell xylo-oligosaccharides exhibiting immunostimulatory activity. Carbohydrate Research, v. 342, p. 1122–1128, 2007a. NABARLATZ, D.; TORRAS, C.; GARCIA-VALLS, R.; MONTANE, D. Purification of xylo-oligosaccharides from almond shells by ultrafiltration. Separation and Purification Technology, v. 53, p. 235–243, 2007b. NABARLATZ, D.; FARRIOL, X.; MONTANÉ, D. Kinetic modeling of the autohydrolysis of lignocellulosic biomass for the production of hemicellulose-derived oligosaccharides. Industrial Engineering Chemistry Research, v. 43, p. 4124-4131, 2004. NACOS, M.K.; KATAPODIS, P.; PAPPAS, C.; DAFERERA, D.; TARANTILIS, P.A.; CHRISTAKOPOULOS, P.; POLISSIOU, M. Kenaf xylan – A source of biologically active acidic oligosaccharides. Carbohydrate polymers, v. 66, p.126–134, 2006. NAKAKUKI, T. Present status and future of functional oligosaccharide development in Japan. Pure Applied Chemistry, v. 74, p. 1245–1251, 2002. NATESH, R.; BHANUMOORTHY, P.; VITHAYATHIL, P.J.; SEKAR, K.; RAMAKUMAR, S.; VISWAMITRA, M.A. Crystal structure at 1.8 A resolution and proposed amino acid sequence of a thermostable xylanase from Thermoascus aurantiacus. Journal of Mololecular Biology. v. 288, p. 999–1012, 1999. NOACK, K. Der Betriebstoffwechsel der thermophilen Pilze. Jahrb. Wiss. Bot, v. 59, p. 593–648, 1920. NOGAWA, M.; YATSUI, K.; TOMIOKA, A.; OKADA, H.; MORIKAWA, Y. An α-L-arabinofuranosidase from Trichoderma reesei containing a noncatalytic xylan-binding domain. Applied and Environmental Microbiology, v. 65, p. 3964-3968, 1999. OGASAWARA, W.; SHIDA, Y.; FURUKAWA, T.; SHIMADA, R.; NAKAGAWA, S.; KAWAMURA, M.; YAGYU, T.; KOSUGE, A.; XU, J.; NOGAWA, M.; OKADA H.; MORIKAWA, Y. Cloning, functional expression and promoter analysis of xylanase III gene from Trichoderma reesei. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 72, p. 995–1003, 2006. OHARA, H.; OWAKI, M.; SONOMOTO, K. Xylooligosaccharide fermentation with Leuconostoc lactis. Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 101, p. 415-420, 2006. ÖHGREN, K.; BURA, R.; SADDLER, J.; ZACCHI.; G. Effect of hemicellulose and lignin removal on enzymatic hydrolysis of steam pretreated corn stover. Bioresearch Technology, v. 98, p. 2503-2510, 2007. OKAZAKI, M.; FUJIKAWA, S.; MATSUMOTO, N. Effect of xylooligosaccharides in the growth of bifidobacteria. Bifidobacteria Microflora, v. 9, p. 77-86, 1990. OLIVEIRA, M; VASCONCELOS, Y. Revolução no canavial. Pesquisa – FAPESP, n. 122, p. 62-70, 2006.

130

OVEREND, R.P.; CHORNET, E. Steam and aqueous pretreatments: are they prehydrolyses? In: Wood Processing and Utilisation. Chichester: Ellis Horwood, 1989, p. 395–400. PANDEY, A.; SOCCOL, C. R.; NIGAM, P.; SOCCOL, V. T. Biotechnological potential of agro-industrial residues. I: sugarcane Bagasse. Bioresource Technology, v. 74, p. 69-80, 2000. PARAJÓ, J.C.; ALONSO, J.L.; SANTOS, V. Delignification and swelling of Eucalyptus wood ahead of enzymatic hydrolysis of the cellulosic fraction. Process Biochemistry, v. 30, p. 537-545, 1995. PARAJÓ, J.C.; ALONSO, J.L.; VÁZQUEZ, D. On the behavior of lignin and hemicellulose during the acetosolv processing of wood. Bioresources Tecnology, v. 46, p. 233-240, 1993. PESSOA, A.J.R.; MANCILHA, I.M.; SATO, S. Acid hydrolysis of hemicellulose from sugarcane bagasse. Brazilian Journal of Chemical Engineering, v. 14, n. 3, 1997. PRIEFERT, H.; RABENHORST, J.; STEINBÜCHEL, A. Biotechnological production of vanillin. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 56, p. 296-314, 2001. PUCHART, V.; BIELY, P. Simultaneous production of endo-β-1,4-xylanase and branched xylooligosaccharides by Thermomyces lanuginosus. Journal of Biotechnology, v. 137, p. 34-43, 2008. PURKARTHOFER, H.; STEINER, W. Induction of endo-β-xylanase in the fungus Thermomyces lanuginosus. Enzyme and Microbial Technology, v. 17, p. 114-118, 1995. RANGANATHAN, S.; MACDONALD, D.G.; BAKHSHI, N. Kinetic studies of wheat straw hydrolysis using sulphuric acid. Canadian Journal of Chemical Engineering, v. 63, p. 840–844, 1985. REESE, E.T.; MANDELS, M. Stability of the cellulase of Trichoderma reesei under use conditions. Biotechnology and Bioengineering, v. 22, p. 323-335, 1980. ROCHA, G. J. M. Deslignificação de bagaço de cana de açúcar assistida por oxigênio. Tese (Doutorado em Físico-Química) - IQSC, USP, São Carlos-SP, 2000. ROCHE, N.; DESGRANGES, C.; DURAND, A. Study on the solid-state production of a thermostable alpha β-L-arabinofuranosidase of Thermoascus aurantiacus on sugar beet pulp. Journal of Biotechnology, v. 38, p. 43-50, 1994. RODIONOVA, N.A.; TAVOBILOV, I.M.; BEZBORODOV, A.M. β-Xylosidase from Aspergillus niger 15: purification and properties. Journal of Applied Biochemistry, v. 5, p. 300-312, 1983. RODRIGUES, R.C.L.B.; FELIPE, M.G.A.; SIL, J.B.A.; VITOLO, M. Response surface methodology for xylitol production from sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolyzate using controlled vacuum evaporation process variables. Process Biochemistry, v. 38, p. 1231–1237, 2003.

131

RODRÍGUEZ-CHONG, A.; RAMÍREZ, J.A.; GARROTE, G.; VÁZQUEZ, M. Hydrolysis of sugar cane bagasse using nitric acid: a kinetic assessement. Journal of Food Engineering, v. 61, p. 143–152, 2004. SAAKE, B.; ERASMY, N.; KRUSE, T.; SCHMEKAL, E.; PULS, J. Isolation and characterization of arabinoxilan from oat spelts. In: GATENHOLM, P.; TENKANEN, M. Hemicelluloses: science and technology. American Chemical Society, 2004. cap. 4, p. 53-65. ACS Symposium Series 864. SAHA, B. Hemicellulose bioconversion. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, v. 30, p. 279-291, 2003. SALOHEIMO, M.; KUJA-PANULA, J.; YLÖSMÄKI, E.; WARD, M.; PENTTILÄ, M. Enzymatic properties and intracellular localization of the novel Trichoderma reesei beta-glucosidase BGLII (cel1A), Applied Environmental and Microbiology, p. 4546–4553, 2002. SAMUELS, G.J. Trichoderma: a review of biology and systematics of the genus. Mycology Research, v. 100, p. 923-935, 1996. SANTOS, E. Produção de xilanase por Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 em cultivo semi-sólido utilizando bagaço de cana de açúcar. 2001 Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Industrial) - DEBIQ, Faenquil, Lorena-SP, 2001. SANTOS, E.; PIOVAN, T.; ROBERTO, I.C.; MILAGRES, A.M.F. Kinetics of the solid state fermentation of sugarcane bagasse by Thermoascus aurantiacus for the production of xylanase. Biotechnology Letters, v. 25, p. 13-16, 2003. SANTOS, V.O.T.; CANILHA, L.; CASTRO, P.F.; BARBOSA, L.D.F.O.; MILAGRES, A.M.F.; CARVALHO, W. Composição química do bagaço de cana-de-açúcar. In: IX SIMPÓSIO DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE BIOMASSA, 9., 2009, Maringá-PR. SARBU, A.; GONÇALVES, F.; PINHO, M.N. Oat spelts xylan molecular mass estimation by size exclusion chromatography. Carbohydrate Polymers, v. 53, p. 297–304, 2003. SASAKI, M.; ADSCHIRI, T.; ARAI, K. Fractionation of sugarcane bagasse by hydrothermal treatment. Bioresource Technology, v. 86, p. 301–304, 2003. SASKA, M.; OZER, E. Aqueous extraction of sugarcane bagasse hemicellulose and production of xylose syrup. Biotechnology and Bioengineering, v. 45, p. 517–523, 1995. SHALLOM, D.; SHOHAM, Y. Microbial hemicellulases. Current Opinion in Microbiology, v. 6, p. 219–228, 2003. SHATALOV, A.A.; PEREIRA, H. Polysaccharide degradation during ozone-based TCF bleaching of non-wood organosolv pulps. Carbohydrate Polymers, v. 67, p. 275–281, 2007. SHEI, J.C.; FRATZKE, A.R; FREDERICK, M.M; FREDERICK, J.R; REILLY, P.J. Purification and characterization of endo-xylanases from Aspergillus niger. II. An enzyme of

132

pI 4.5. Biotechnology and Bioengineering, v. 27, p. 533–538, 1985. SILVA, D.J.; QUEIROZ, A.C. Análise de Alimentos: Métodos Químicos e Biológicos. 3ª ed. Viçosa: Ed. UFV, 2005. SINGH, R.; SINGH, S.; TRIMUKHE, K.D.; PANDARE, K.V.; BASTAWADE, K.B.; GOKHALE, D.V.; VARMA, A.J. Lignin–carbohydrate complexes from sugarcane bagasse: Preparation, purification, and characterization. Carbohydrate Polymers, v. 62, p. 57–66, 2005. SILVERSTEIN, R.A.; CHEN, Y.; SHARMA-SHIVAPPA, R.R.; BOYETTE, M.D.; OSBORNE, J. A comparison of chemical pretreatment methods for improving saccharification of cotton stalks. Bioresource Technology, v. 98, p. 3000–3011, 2007. SIXTA, H. Handbook of Pulp. Weinheim: Ed Wiley-vch Verlag GmbH & Co. KGaA, 2006. SRINIVASA, B.R.; SWAMINATHAN, K.R.; GANAPATHY, C.; ROY, R.P.; MURTHY, S.K.; VITHAYATHIL, P.J. The primary structure of xylanase from Thermoascus aurantiacus. Protein Sequence Data Analalyse, v. 4, p. 15-20, 1991. SOUZA, M.C.O. Produção de xilanase por Thermoascus aurantiacus em meio semi-sólido. 1998, Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Industrial) - DEBIQ, Faenquil, Lorena-SP, 1998. SOUZA, M.C.O.; ROBERTO, I.C.; MILAGRES, A.M.F. Solid-state fermentation for xilanase production by Thermoascus aurantiacus using response surface methodology. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 52, p. 768-772, 1999. SUN, H.J.; YOSHIDA, S.; PARK, N.; KUSAKABE, I. Preparation of (1-4)-β-D-xylooligosaccharides from an acid hydrolysate of cotton-seed xylan: suitability of cotton-seed xylan as a starting material for the preparation of (1-4)-β-D-xylooligosaccharides. Carbohydrate Research, v. 337, p. 657–661, 2002. SUN, J.X.; SUN, X.F.; SUN, R.C.; SU, Y.Q. Fractional extraction and structural characterization of sugarcane bagasse hemicelluloses. Carbohydrate Polymers, v. 56, p. 195–204, 2004a. SUN, J.X.; SUN, X.F.; ZHAO, H.; SUN, R.C. Isolation and characterization of cellulose from sugarcane bagasse. Polymer Degradation and Stability, v. 84, p. 331 - 339, 2004b. SUN, R.C.; TOMKINSON, J. Characterization of hemicelluloses obtained by classical and ultrasonically assisted extractions from what straw. Carbohydrate polymers, v. 50, p. 263-271, 2002. SUN, R. C., LAWTHER, J. M., BANKS, W.B. Fractional and structural characterization of wheat straw hemicelluloses. Carbohydrate Polymers, v. 29, p. 325–331, 1996. SUN, R.C.; TOMKINSON, J.; MA, P.L.; LIANG, S.F. Comparative study of hemicelluloses from rice straw by alkali and hydrogen peroxide treatments. Carbohydrate Polymers, v. 42,

133

p.111–122, 2000a. SUN, R.C.; TOMKINSON, J.; WANG, Y.X.; XIAO, B. Physico-chemical and structural characterization of hemicelluloses from wheat straw by alkaline peroxide extraction. Polymer, v. 41, p. 2647–2656, 2000b. SUN, X.F.; SUN, R.C.; TOMKINSON, J.; BAIRD, M.S. Preparation of sugarcane bagasse hemicellulosic succinates using NBS as a catalyst. Carbohydrate Polymers, v. 53, p. 483-495, 2003. SUN, X.F.; XU, F.; ZHAO, H.; SUN, R.C.; FOWLER, P.; BAIRD, M.S. Physicochemical characterisation of residual hemicelluloses isolated with cyanamide-activated hydrogen peroxide from organosolv pre-treated wheat straw. Bioresource Technology, v. 96, p. 1342–1349, 2005. SUN, Y., CHENG, J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource Technology, v. 83, p. 1-11, 2002. TAHERZADEH, M.J.; KARIMI, K. Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A Review. International Journal of Molecular Sciences, v. 9, p. 1621-1651, 2008. TAKAHASHI, T.; IKEMIZU, S. Antiallergy agents containing acidic xylooligosaccharides for alleviation of allergic rhinitis. Patent JP 200,112.826, 2005. TAN, L.; MAYERS, P.; SADDLER, J. Purification and characterization of a thermostable xylanase from a thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus. Canada Journal Microbiology, v. 33, p. 389-992, 1987. TANAKA, M.; TANIGUCHI, M.A.; MATSUMO, R.; KAMIKUBO, T. Purification and properties of cellulases from Eupenicillium javanicum. Journal Fermentation Technology, v. 59, p. 177-183, 1981. TENKANEN, M.; PULS, J.; POUTANEN, K. Two major xylanases of Trichoderma reesei. Enzyme and Microbial Technology, vol. 14, pp. 566-574, 1992. TAKENISHI, S.; TSUJISAKA, Y. On the modes of action of three xylanase produced by a strain of Aspergillus niger van Tieghem. Agriculture and Biological Chemistry, v. 39, p. 2315-2323, 1975. THAKORE, A.; OEI, J.; RINGROSE, B.; GIBSON, A.; WAJER, M. The use magnesium hydroxide as a cost effective cellulose protector in the pressurized alkaline peroxide (Eop) bleaching stage. Pulp paper Canada, v. 106, p. 46-49, 2005. THOMPSON, D.N.; HOUGHTON, T.P.; LACEY, J.A.; SHAW, P.G.; HESS, J.R. Preliminary investigation of fungal bioprocessing of wheat straw for production of straw–thermoplastic composites. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 105, p. 423–36, 2003. TIMELL, T. Wood Science. Technology, v. 1, p. 45, 1967.

134

TIMELL, T. E. Wood hemicellulose. Part II: Advances in Carbohydrate Chemistry, v. 19, p. 247–302, 1964. TÖRRÖNEN, A.; MACH, R.L.; MESSNER, R.; GONZALEZ, R.; KALKKINEN, N. HARKKI, A. The two major xylanases from Trichoderma reesei: characterization of both enzymes and genes. Biotechnology, v. 10, p. 1461–1465, 1992. TÖRRÖNEN, A.; ROUVINEN, J. Structural comparison of two major endo-1,4-xylanases from Trichoderma reese. Biochemistry, v. 34, p. 847-856, 1995. TÖRRÖNEN, A.; ROUVINEN, J. Structural and functional properties of low molecular weight endo-β-1,4-xylanases. Journal of Biotechnology, v. 57, p. 137–149, 1997. VAN PEIJ, N.N.M.E.; GIELKENS M.M.C.; VRIES, R.P; VISSER, J.; GRAAFF, L.H. The transcriptional activator xlnR regulates both xylanolytic and endoglucanase expression in Aspergillus niger. Applied and Environmental Microbiology, v. 64, p. 3615–3619, 1998. VARDAKOU, M.; DUMON, C.; MURRAY, J.W.; CHRISTAKOPOULOS, P.; WEINER, D.P.; JUGE, N.; LEWIS, R.J.; GILBERT, H.J.; E. FLINT, J.E. Understanding the structural basis for substrate and inhibitor recognition in eukaryotic GH11 Xylanases. Journal of Molecular Biology, v. 375, p. 1293–1305, 2008. VARDAKOU, M., KATAPODIS, P., SAMIOTAKI, M., KEKOS, D., PANAYOTOU, G., CHRISTAKOPOULOS, P. Mode of action of family 10 and 11 endoxylanases on water-unextractable arabinoxylan. International Journal of Biological Macromolecules, v. 33, p. 129–134, 2003. VÁZQUEZ, J.; ALONSO, J. L.; DOMINGUEZ, H.; PARAJÓ, J. C. Xylooligosaccharides: manufacture and applications. Trends in Food Science and Technology, v. 11, p. 387-393, 2001. VERBRUGGEN, M.A.; BELDMAN, G.; VORAGEN, A.G.J. Enzymic degradation of sorghum glucuronoarabinoxylans leading to tentative structures. Carbohydrate Research, v. 306, p. 275–282, 1998. VENICA, A.D.; CHEN, C.L.; GRATZL, J.S. Soda–AQ delignification of poplar wood. Part 1: Reaction mechanism and pulp properties. Holzforschung, v. 62, p. 627–636, 2008. VIIKARI, L., KANTELINEN, A., BUCHERT, J.; PULS, J. Enzymatic acessibility of xylans in lignocellulosic materials. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 41, p. 124-129, 1994. VISWAMITRA, M.A.; BHANUMOORTHY, P.; RAMAKUMAR, S.; MANJULA, M.V.; VITHAYATHIL, P.J.; MURTHY, S.K.; NAREN, A.P. Crystallization and preliminary x-ray diffraction analysis of crystals of Thermoascus aurantiacus xylanase. Journal of Molecular Biology, v. 232, p. 987-988, 1993. VRIES, R.P.; VISSER, J. Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell wall polysaccharides. Microbiology and Molecular Biology Review, v. 65, p. 497-522, 2001.

135

WALLACE, G.; RUSSELL, W.R.; LOMAX, J.A.; JARVIS, M.C.; LAPIERRE, C.; CHESSON, A. Extraction of phenolic-carbohydrate complexes from graminaceous cell walls. Carbohydrate Research, v. 272, p. 41-53, 1995. WANG, B.; WANG, X.; FENG, H. Deconstructing recalcitrant Miscanthus with alkaline peroxide and electrolyzed water. Bioresource Technology, v. 101, p. 752–760, 2010. WANG, J.; SUN, B.; CAO, Y.; TIAN, Y.; WANG, C. Enzymatic preparation of wheat bran xylooligosaccharides and their stability during pasteurization and autoclave sterilization at low pH. Carbohydrate Polymers, v. 77, p. 816-821, 2009. WATANABE, T. Analysis of native bonds between lignin and carbohydrate by specific chemical reaction; in: Association between lignin and carbohydrates in wood and other plant tissue, Eds. T. Koshijima, T. Watanabe, Heidelberg, Germany: Springer-Verlag, 2003, p. 91-130. WEIL, J.; SARIKAYA, A.; RAU, S.L.; GOETZ, J.; LADISCH, C.M.; BREWER, M.; HENDRICSON, R.; LADISCH, M.R. Pretreatment of yellow poplar sawdust by pressure cooking in water. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 68, p. 21–40, 1997. WEIL, J.; WESTGATE, P.; KOHLMANN, K.; LADISCH, M.R. Cellulose pretreatments of lignocellulosic substrates. Enzyme and Microbial Technology, v. 16, p. 1002–1004, 1994. WENDE, G.; FRY, S.C. Digestion by fungal glycanases of arabinoxylans with different feruloylated side-chains. Phytochemistry, v. 45, p. 1123–1129, 1997. WÓJCIAK, A. Influence of magnesium addition on hydrogen peroxide bleaching of the acid treated pinewood kraft pulp. Electronic Journal of Polish Agricultural Universities, v. 9, 2006. WONG , K.K.Y.; TAM, L.U.L; SADDLER, J.N. Multiplicity of β-1,4-endoxylanase. In: microrganisms: functions and aplications. Microbiological Reviews, v. 52, p. 305-317, 1988. XIANG, Q.; LEE, Y.Y. Oxidative cracking of precipitated hardwood lignin by hydrogen peroxide. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 84–86, p. 153-162, 2000. XIONG, H.; VON WEYMARN, N.; LEISOLA, M.; TURUNEN, O. Influence of pH on the production of xylanases by Trichoderma reesei Rut C-30. Process Biochemistry, v. 39, p. 729–733, 2004. XU, J.; NOGAWA, M.; OKADA, H.; MORIKAWA, Y. Regulation of xyn3 gene expression in Trichoderma reesei PC-3-7, Applied Microbiology and Biotechnology, p. 370–375, 2000. XU, F.; SUN, J. X.; LIU, F. C.; SUN, R. C. Comparative study of alkali and acid organic solvent-soluble hemicellulosic polysaccharides from sugarcane bagasse. Carbohydrate Research, v. 341, p. 253-261, 2006. XU, J.; TAKAKUWA, N.; NOGAWA, M.; OKADA, H.; MORIKAWA, Y. A third xylanase

136

from Trichoderma reesei PC-3-7. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 49, p. 718–24, 1998. YÁÑEZ, R.; ALONSO, J. L.; PARAJÓ, J. C. Enzymatic saccharification of hydrogen peroxide-treated solids from hydrothermal processing of rice husks. Process Biochemistry, v. 41, p. 1244-1252, 2006. YANG, C.-H., YANG, S.-F., LIU, W.-H. Production of xylooligosaccharides from xylans by extracellular xylanases from Thermobifida fusca. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 55, p. 3955–3959, 2007. YANG, B.; BOUSSAID, A.; MANSFIELD, S.D.; GREGG, D.J.; SADDLER, J.N. Fast and efficient alkaline peroxide treatment to enhance the enzymatic digestibility of steam-exploded softwood substrates. Biotechnology and Bioengineering, v. 77, p. 678–84, 2002. YANG, L.; ZHANG, L.-M. Chemical structural and chain conformational characterization of some bioactive polysaccharides isolated from natural sources. Carbohydrate Polymers, v. 76, p. 349–361, 2009. YOON, K.Y.; WOODAMS, E.E.; HANG, Y.D. Enzymatic production of pentoses from the hemicellulose fraction of corn residues. Food Science and Technoology, v. 39, p. 387–391, 2006. YU, EKC; LUL, T.; CHAN, M.K.; SADDLER, J.N. Production of thermostable xylanase by Thermoascus aurantaicus. Enzyme of Microbiology Technology, v. 9, p. 16-24, 1987. YUAN, Q.; WANG, J., ZHANG, H.; QIAN, Z. Effect of temperature shift on production of xylanase by Aspergillus niger. Process Biochemistry, v. 40, p. 3255–3257, 2005. YUAN, X.; WANG, J.; YAO, H. Antioxidant activity of feruloylated oligosaccharides from wheat bran. Food Chemistry, v. 90, p. 759–64, 2005. ZEILINGER, S.; MACH, R.L.; SCHNDLER, M.; HERZOG, P.; KUBICEK, C.P. Different inducibility of expression of the two xylanase genes xyn1 and xyn2 in Trichoderma reesei. Journal of Biology and Chemistry, v. 271, p. 25624–25629, 1996. ZHANG, W. Biochemical technology of carbohydrate complexes. Hangzhou: Zhejiang University Press, 1994, p. 193–200.

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ANEXO

A) Trabalhos que já foram publicados em periódicos científicos a partir de resultados obtidos nesta tese.

BRIENZO M.; ARANTES, V.; MILAGRES, A.M.F. Enzymology of the thermophilic ascomycetous fungus Thermoascus aurantiacus. Fungal Biology Reviews, v. 22, p. 120-130, 2009. BRIENZO, M.; SIQUEIRA, A.F.; MILAGRES, A.M.F. Search for optimum conditions of sugarcane bagasse hemicellulose extraction. Biochemical Engineering Journal, v. 46, p. 199–204, 2009. BRIENZO M.; CARVALHO, W.; MILAGRES AMF. Xylooligosaccharides production from alkali-pretreated sugarcane bagasse using xylanases from Thermoascus aurantiacus. Applied of Biochemistry and Biotechnology, DOI 10.1007/s12010-009-8892-5, 2010. BRIENZO, M.; MONTE, J.R.; MILAGRES, A.M.F. Hemicelluloytic and cellulolytic activities in the culture filtrate of Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 induced by products of xylan hydrolysis. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (submetido).