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Extração Líquido-Líquido
Operação Unitária de transferência de massa utilizada para separar componentes presentes em
uma solução e/ou suspensão, distribuindo-os entre fases líquidas parcialmente solúveis ou
insolúveis.
PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS
Purificação
Clarificação
Rompimento Celular
Separação de Células
Bioprodutos Intracelulares
Bioprodutos Extracelulares
Acabamento
BIOPRODUTO
ELLBio
Sistemas Poliméricos (PEG)
de Duas Fases Aquosas
(SPDFA)
Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas
(SMDFA)
Sistemas Micelares Reversos
(SMR)
ELLBio
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE BIOMOLÉCULAS
Vantagens comuns aos 3 métodos
• Rápidos
• Baixo custo
• Biocompatíveis
- massa
Fase Líquida Inicial
Meio inicial: solução e/ou suspensão
Fase Líquida II(inferior)
Fase Líquida I(superior)
Sistema de duas fases
transferência de massa
Processo de separação de fases
A FI
AFII
K =
FP =Ae(fase ext)
Ae(inicial)
R(%) =AFI
Ainicial
. 100
separação – em função da diferença de solubilidade da biomolécula nas fases
1) Dois polímeros não-iônicos:
PEG x Dextrana
PEG x Polivinil álcool
PPG x Dextrana
Metil Celulose x Hidroxipropil dextrana
2) Polieletrólito x Polímero não-iônico
Sulfato dextrana de sódio x polipropileno-glicol
Carboximetilcelulose de sódio x metil celulose
3) Dois polieletrólitos
Sulfato dextrana de sódio x carboximetildextrana de sódio
Carboximetildextrana de sódio x carboximetilcelulose de sódio
4) Polímero não-iônico x Composto de baixa massa molar
PPG x fosfato de potássio
PEG x fosfato de potássio
metoxipolietileno glicol x fosfato de potássio
PPG x glicose
PEG x glicose
PEG x sulfato de magnésio
PEG x citrato de sódio
PEG x Dextrana
PPG x Dextrana
PEG x fosfato de potássio
PEG x sulfato de magnésio
PEG x citrato de sódio
• Rápida separação de fases
• Baixo custo
• Elevada seletividade na separação baseada na solubilidade
Fase de fundo
Diagrama de fases:
• ordenada: composição da molécula de maior concentração na fase de
TOPO (PEG, por exemplo)
• abscissa: composição da molécula de maior concentração na fase de
FUNDO (Fosfato, por exemplo)
• ambos os componentes do sistema estão presentes nas duas fases
• o diagrama pode ser construído, determinando-se a composição das fases
em equilíbrio de uma série de sistemas
• pontos acima da curva binodal: formação de duas fases
• pontos abaixo da curva binodal: única fase
Formação do SPDFA depende da concentração dos componentes do sistema
PEG (%massa)
T
M
B
Curva de equilíbrio de um sistema PEG/fosfato
Fosfato (%massa)
Composição inicial
Composição da fase Topo
Composição da fase de Fundo
Linha de amarração ou “tie line”Curva binodal
C
Ponto crítico
Linha de amarração sistemas cuja composição inicial encontra-se sobre uma mesma linha de amarração possuem a mesma composição final
• As relação de volumes entre as fases varia com a composição -
de acordo com a razão entre os segmentos TM e BM
• Segmento TM – proporcional ao volume da fase de FUNDO
• Segmento BM – proporcional ao volume da fase de TOPO
• C - Ponto crítico – composições e volumes da fase TOPO e FUNDO são iguais. Sistema instável.
VOLUMES DAS FASES EM FUNÇÃO DAS
CONCENTRAÇÕES DOS COMPONENTES DO
SISTEMA DE EXTRAÇÃO POR SPDFA
0 5 10 15 20 250
10
20
30
40
50
pH 6,5 pH 7,0 pH 8,0 pH 9,0
PE
G 6
00 (%
p/p
)
Fosfato de Potássio (% p/p)
Curvas binodiais de sistemas com PEG 600 em diversos valores de
pH
0 5 10 15
0
10
20
30
40
50
pH 5,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 8,0 pH 9,0
PEG
600
0 (%
p/p
)
Fosfato de Potássio (% p/p)
Curvas binodiais de sistemas com PEG 6000 em diversos
valores de pH
A variação do pH altera a razão H2PO4-/HPO4
-2
varia a composição o equilíbrio entre as fases
0 5 10 15 20 25
0
10
20
30
40
50
PEG 600 PEG 1500 PEG 4000 PEG 6000
PE
G (%
p/p
)
Fosfato de Potássio (% p/p) pH 8,0
Curvas binodiais de sistemas com massas molares 600, 1500, 4000 e 6000 em pH 8,0
fórmula geral: HO-(CH2CH2)n-CH2CH2OH.
Massas molares:
Abaixo de 1000 Daltons: líquido
Acima de 1000 Daltons: sólido (pó, flocos)
Prática:
Soluções-Estoque 50% m/m
Não se trabalha com
volume devido à alta viscosidade
FATORES QUE INFLUENCIAM NO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO (K) DE BIOMOLÉCULAS
Interações HidrofóbicasCargas superficiais / pHDiferença de Potencial Elétrico entre as FasesEfeito de “Salting-Out” da fase salinaDiferenças de ViscosidadeDiferenças de DensidadeInterações BioespecíficasDiagramas de Fases (conc. PEG e sal, p. ex.)Massa molar da biomolécula
Fatores Ambientais
1 Concentração de Polímeros2 Tipo e Concentração de Sal3 Ligantes4 Massa Molar do PEG5 pH6 Temperatura7 Tempo de Mistura e Separação
Fatores Estruturais
1 Resíduos hidrofóbicos
2 Massa molar da Biomolécula
3 Formato da biomolécula
FiCTiC
K =
Coeficiente de Partição
CTi - concentração, ou atividade, do soluto i na fase de topo
CFi - concentração, ou atividade, do soluto i na fase de fundo.
100VCVC
(%)Rinicialinicial
topotopotopo
Rtopo = rendimento na fase de topo (%)
Ctopo = concentração ou atividade da biomolécula na fase de topo (g/L ou U/mL)
Cinicial = concentração ou atividade da biomolécula na amostra antes da extração
(g/L ou U/mL)
totaisproteínas
alvoabiomolécul
KKS
100).VC
VCVC(BM
inicialinicial
fundofundotopotopo
Extração de retamicina (fase de topo) de meio contendo células de Streptomyces olindensis (fase de fundo) em SPDFA formados por PEG/citrato e PEG/fosfato: (1) PEG 400, (2) PEG 1500 e (3) PEG 6000).
PEG/Sodium Citrate PEG/Potassium Phosphate
Clarificação simultânea à purificação
células na interface células no fundo
• Têm como base a capacidade que as biomoléculas têm de reconhecer e se ligar a outras moléculas, especificamente
• Interações por afinidade: aumentam a partição - K Kaf
• O ligante é ligado covalentemente ao polímero – em geral PEG
formação do complexo polímero-ligante-biomolécula
• O PEG reage facilmente com ligantes, pois contém hidroxilas substituíveis
• O ligante pode ser natural ou sintético
• custo x benefício deve ser favorável
•o ligante deve ser bifuncional – um sítio de ligação para afinidade com a biomolécula e outro sítio para imobilização no polímero
• deve ser estável durante a imobilização
• deve ser estável durante o processo de extração
•não deve conter outros grupos que tenham afinidade por outras partes da biomolécula
• não deve ser tóxico
• disponível
• fácil rompimento da interação polímero/biomolécula.
Exemplos de material purificado por partição de afinidadeSistema Material purificado LigantePEG/Dextrana -galactosidase APGP
PEG/palmitato BSA e -lactalbumina Ácidos graxos
PEG/fosfato Proteína A IgG humana
PEG/fosfato Penicilina acilase Trimetilamina
PEG/Dextrana Tripsina Inibidor de tripsina
PEG/Dextrana Lipossomos Avidina
Dext./Hidropropildextrana.
Quimosina pepstatina
PEG/Dextrana Módulos de carbohidrolases Domínios de ligação da celulose
PEG/Dextrana Membranas da glândula lacrimal Aglutinina de trigo
PEG/fosfato Amido Glicoamilase
PEG/Dextrana Aglutinina de germe de trigo Membrana plasmática de fígado de rato
PEG/Dextrana Ácidos graxos de cadeia entre C2 à C18 Albumina do soro humano, ß-lactoglobulina, hemoglobulina, mioglobina
PEG/Dextrana Ácidos graxos saturados de cadeia entre C2 à C18 e insaturados de 18:1, 18:2 e 18:3, grupos acila e Benzoatos
Albumina, lizozima, ribonuclease, α2- macroglobulina
PEG/Dextrana IgG com fluído de ferro magnetizado Proteína A
Sistema de afinidade: fase superior rica em PEG-ligante e a molécula alvo a ser purificada e fase inferior rica em sal (sulfato de sódio) e contaminantes.
Processo de reciclagem do polímero
Proteínas purificadas por partição de metal-afinidade em SDFA
Proteína MetalCitocromo c de Candida krusei CobreHemoglobina bovina Cobre, FerroEritrócitos Cobre, Zinco2macroglobulina Cobre, Zinco
Hemoglobina humana CobreFosvitina FerroOxinitrilase CobreDesidrogenases alcoólicas, lactato e malato desidrogenase
Cobre, Níquel, Zinco e Cádmio
Linfócitos Cobre, Níquel, Zinco
Lactato desidrogenase CobreCélulas de mamíferos Cobre Peroxidase de nabo CobrePeroxidase de soja CobreProteina de membrana: citocromo bo(3) ubiquinol oxidase c
Cobre
Lactato desidrogenase acoplada a resíduo de polihistidina
Cobre
Biomoléculas nucleotídeo-dependentes purificadas em SDFA com afinidade a corantes.
SistemaBiomolécula Ligante acoplado
ao PEG
PEG/Dextrana
Lactato desidrogenase Corante triazina Cibacron Blue F3G-A
PEG/fosfato
Lactato desidrogenase Eudragit-Cibacron Blue
PEG/Dextrana
Fosfofrutoquinase de levedura
Cibacron Blue F3G-A-PEG
PEG/Dextrana
Isoenzimas de fosfatase alcalina
Procion Yellow H-E3G-PEG
PEG/Dextrana
Fosfoglicerato quinase Cibacron Blue-PEG
PEG/Dextrana
Formato desidrogenase Cibacron Blue-PEG
PEG/fosfato
Xilose redutase Drimaren
)(
)(
ligantesemPEG
ligantePEGaf K
KK
Equipamentos para extração com sistemas de duas fases aquosas
Extratores e colunas de extração líquido-líquido têm basicamente duas funções:
1. Estabelecer o contato entre as duas fases líquidas do sistema para possibilitar a transferência de massa
2. Separar os dois líquidos após a extração
Equipamento por estágios
• Misturador – decantador*• Misturador – decantador em cascata vertical
Equipamentos de contato diferencial• Coluna de extração por estágios
• Coluna de extração spray*
• Coluna de extração com recheio
• Extrator de discos rotativos perfurados
• Extrator Graesser
Equipamentos centrífugos
Mais importante: extrator Podbielniak
Tambor cilíndrico com placas concêntricas
Fase pesada é alimentada no centro do tambor enquanto a fase leve é alimentada na periferia do extrator
Escoamento contra-corrente