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EXTRACCIÓN DE DROGAS ÁCIDAS Y BÁSICAS, SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA CON DETECCIÓN POR REVELADO RESUMEN Durante la práctica se analizaron dos muestras de orina identificadas como A y B, con el fin de conocer en cuál de ellas había presencia de drogas ácidas o básicas. Para lo anterior se realizó la extracción y posterior secado de las muestras, obteniéndose una pequeña fracción de la muestra. Continuamente se realizó Cromatografía en Capa delgada (CCD) para el extracto de droga básica y extracto de drogas acidas/neutras, empleando como sistema eluente cloroformo/acetona (4:1) para drogas acidas/neutras y metanol/amoniaco (100:15) para drogas básicas, al revelar las cromatoplacas no se observó ninguna mancha en éstas y por tanto no fue posible identificar la presencia de alguno de los tipos de droga bajo, el resultado fue atribuible a errores de tipo personal. Palabras claves: Extracción líquido-líquido, Cromatografía capa delgada, drogas básicas, drogas acidas/neutras. INTRODUCCION El análisis de drogas es una parte importante del trabajo toxicológico. En la orina se puede encontrar la mayoría de estas y sus metabolitos, para el caso de este laboratorio fenobarbital, fenitoina, heroína, cocaína y morfina, puesto que el riñón es uno de los principales órganos a través del cual se da el proceso de eliminación. Además la obtención de este fluido se puede realizar de manera no invasiva sin intervenir el cuerpo de una persona. (1) Las mediciones se enfocan a determinar la concentración de la droga libre, que es la forma activa metabólicamente, para ello se requiere realizar procedimientos de extracción y/o de limpieza de los demás componentes del fluido biológico. Para el análisis de drogas, el primer y paso más relevante es la extracción, pues de ella dependerá que logre o no obtenerse el analito o compuesto de interés. La extracción líquido-líquido de drogas y otros tóxicos lipofílicos a partir de la

EXTRACCIÓN DE DROGAS ÁCIDAS Y BÁSICAS

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EXTRACCIÓN DE DROGAS ÁCIDAS Y BÁSICAS, SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA CON DETECCIÓN POR REVELADO

RESUMEN

Durante la práctica se analizaron dos muestras de orina identificadas como A y B, con el fin de conocer en cuál de ellas había presencia de drogas ácidas o básicas. Para lo anterior se realizó la extracción y posterior secado de las muestras, obteniéndose una pequeña fracción de la muestra. Continuamente se realizó Cromatografía en Capa delgada (CCD) para el extracto de droga básica y extracto de drogas acidas/neutras, empleando como sistema eluente cloroformo/acetona (4:1) para drogas acidas/neutras y metanol/amoniaco (100:15) para drogas básicas, al revelar las cromatoplacas no se observó ninguna mancha en éstas y por tanto no fue posible identificar la presencia de alguno de los tipos de droga bajo, el resultado fue atribuible a errores de tipo personal.

Palabras claves: Extracción líquido-líquido, Cromatografía capa delgada, drogas básicas, drogas acidas/neutras.

INTRODUCCION

El análisis de drogas es una parte importante del trabajo toxicológico. En la orina se puede encontrar la mayoría de estas y sus metabolitos, para el caso de este laboratorio fenobarbital, fenitoina, heroína, cocaína y morfina, puesto que el riñón es uno de los principales órganos a través del cual se da el proceso de eliminación. Además la obtención de este fluido se puede realizar de manera no invasiva sin intervenir el cuerpo de una persona. (1)

Las mediciones se enfocan a determinar la concentración de la droga libre, que es la forma activa metabólicamente, para ello se requiere realizar procedimientos de extracción y/o de limpieza de los demás componentes del fluido biológico.

Para el análisis de drogas, el primer y paso más relevante es la extracción, pues de ella dependerá que logre o no obtenerse el analito o compuesto de interés.

La extracción líquido-líquido de drogas y otros tóxicos lipofílicos a partir de la muestra con un solvente orgánico apropiado, inmiscible con el agua,

normalmente a un pH controlado, es ampliamente usada en toxicología analítica. Los tóxicos orgánicos fijos pueden tener carácter ácido (barbitúrico, hidantoína, primidona, salicilatos), neutro (meprobamato) o básico (benzodiacepinas, anorexígenos, alcaloides, neurolépticos, antidepresivos). El procedimiento permite la extracción del analito de su matriz original y lo transfiere a una fase orgánica fácil de manejar y evitando las interferencias. En este proceso de extracción o aislamiento se trata de concentrar el analito para que esté se encuentre dentro del rango de sensibilidad con que opera el sistema de identificación (2)

OBJETIVOS

Emplear la extracción liquido-liquido para obtener la fracción de la muestra que contenía la(s) drogas de interés.

Aplicar técnicas cromatográficas como la CCD para identificar la presencia de drogas acidas/neutras o básicas; y espectrofotométricas como UV-Vis para el reconocimientos de bandas

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correspondientes a la muestra y droga de interés (heroína).

Reconocer la importancia del pH en la extracción de drogas ácidas y básicas.

RESULTADOS

El caso que se abordó durante la práctica fue:

Paciente que entra en estado de coma al hospital Los Chorros, y muere. De acuerdo con la historia clínica y versiones de los hechos, estaba consumiendo alcohol desde hace 1 día, presenta antecedentes de adicción a los depresivos; se quedó dormido en la silla de su casa, con frecuencia respiratoria disminuida. Se envía muestra de orina para el estudio de drogas de abuso y psicofármacos.

Con lo anterior se procede a realizar el análisis toxicológico utilizando la técnica de cromatografía de capa delgada para identificar qué tipo de droga de abuso o psicofármaco genero la muerte del paciente.

Cromatografía de Capa delgada (placas sin revelar).

(a) (b)

Figura 1. (a) Placa con drogas básicas (b) Placa con drogas ácidas.

En la figura 1, se muestra la placa (a) donde placa donde se sembraron los estándares de heroína y cocaína, no se observa la muestra a nivel de alguna de las manchas de las drogas; en la placa (b) se observó la presencia de Fenobarbital y la muestra pero con una pequeña diferencia en la distancia recorrida.

Cromatografía Capa delgada (placas reveladas).

Figura 2: Revelado de CCD para droga básica.

Figura 2: Revelado de CCD para droga ácida.

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ANALISIS DE RESULTADOS

Durante la práctica, con el fin de analizar drogas ácidas y básicas y su presencia en las muestras provistas, se inicia realizando una extracción líquido-líquido con el fin lograr extraer el analito de su matriz original y transferirlo a una fase orgánica; de esta manera y después de realizar el secado de la muestra, se logra concentrar el analito y estabilizarlo dado que en su matriz original (orina) puede ser degradado química o enzimáticamente.

Para realizar el análisis de la muestra de orina, se trata una fracción de la muestra con ácido sulfúrico (Muestra A), y otra fracción de la muestra con hidróxido de sodio.

Es importante mencionar que las muestras A y B fueron tratadas con ácido sulfúrico o hidróxido de sodio en cada caso, con el objetivo de efectuar una adecuada extracción, pues debe tenerse en cuenta que el pH es de elevada importancia en la extracción de drogas ácidas y básicas. Las muestras deben ser tratadas de forma, que se logré obtener un valor de pH en el cual la droga no se encuentra ionizada para así favorecer su solubilidad en el solvente orgánico empleado, en este caso cloroformo. De esta manera las drogas ácidas deben encontrarse en un medio ácido y las básicas a un pH básico para lograr su separación.

Otro aspecto a mencionar, es que la ionización de las drogas depende además del pH del pKa de ésta, pues cuando la droga se encuentre en un medio con pH mayor a su pKa, predomina su forma ionizada. Así por tanto las drogas ácidas se trataron con ácido sulfúrico porque de haberse tratado con NaOH, ésta se hubiese ionizado y así su solubilidad se incrementaría, lo que no es adecuado pues el solvente

cloroformo es apolar y las diferencias de polaridad además de las interacciones de tipo desfavorable que puedan presentarse entre ambos no permitirán la extracción de la droga de interés.

Se realizó la extracción líquido-líquido a ambas muestras. Para la muestra A, se esperaba que en la fase orgánica se encontrara Fenobarbital o Fenitoina, (dado el caso de que el paciente hubiese fallecido por el abuso de drogas ácidas) y para lograr identificarlo, posterior a la extracción, se procedió a retirar la fase inorgánica (orina) y dejar solo la fase orgánica, sin embargo en esta parte se presentó dificultad para eliminar la orina de la muestra ya que no había los implementos que facilitaran su separación, solo se contaba con un tubo de ensayo y un gotero que dificultaba la eliminación de la pequeña cantidad de orina que quedaba en contacto con la fase orgánica. En el momento de realizar el secado también se presentaron dificultades debido a la presencia de orina en la muestra, lo que llevo a la pérdida de parte de la fase orgánica en el intento de eliminar la orina; así se obtuvo solo una pequeña cantidad de muestra que se reconstituyo con 2 gotas de metanol.

Tras la extracción, se realizó Cromatografía de Capa fina, sabiendo que realmente no es la idónea, pues solo brinda información acerca de la presencia o no de Fenobarbital o Fenitoina en la muestra, es decir la identificación es solo de tipo cualitativo. Teniendo en cuenta la estructura química de las drogas acidas y la polaridad que esta le confiere es posible hacer separaciones por sus propiedades fisicoquímicas; así a partir del principio de cromatografía se logró hacer separaciones de acuerdo a la afinidad que existe entre la fase móvil y estacionaria. Para lo anterior se colocó una placa que contenía la muestra A y fenobarbital y fue llevada a la cámara de

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elución, donde se empleó con cloroformo: acetona (4:1) como fase móvil. Finalmente se dejo secar la placa y se observo en la cámara UV-Vis, donde no se evidencio la presencia de droga acida en la muestra. También se realizó el revelado de estas drogas con solución de cloruro mercúrico de difenilcarbazona, donde se esperaba observar manchas violetas en la placa que serían el indicativo de barbitúricos o compuestos relacionados; sin embargo no fueron visibles éstas manchas.

Para el análisis de las drogas básicas, se realizó igualmente CCD, y para ello se disolvió el extracto en 50 ul de cloroformo y se sembraron distintos estándares de drogas básicas, en el orden en que se nombran aparecen en la cromatoplaca (ver fig. 1): -Heroína-Cocaína-Morfina-Amitriptilina

Continuamente se llevaron las placas a una cámara de elución, y se empleó como fase móvil metanol: amoniaco 100:1.5; se dejó secar la placa y se observó bajo luz UV, pero solo se evidenciaron 2 manchas correspondientes a dos de los estándares sembrados, no se observo la aparición de dos manchas al mismo nivel (igual distancia recorrida en la placa) que deberían corresponder a la muestra y al estándar, y lo que por tanto permitiría conocer cuál fue la droga que causó la muerte.

Después se procedió a realizar el revelado de la placa, empleando una solución acidificada de yodoplatino para las bandas correspondientes a heroína, cocaína y morfina, lo que se esperaba observar eran manchas de color violeta o azul que indicaran la presencia de drogas básicas; para amitriptilina se empleó como revelador una solución de

Mandelin´s, donde la presencia de varios colores indica la presencia de drogas básicas. Sin embargo fue posible identificar la droga presente en la muestra.

Es oportuno mencionar que no se logró obtener un resultado o dar correspondencia a la muestra con una droga ácida o básica, no por errores de método, si no por errores introducidos por las personas que realizaron el análisis en cuanto a la manipulación de las muestras, orden de trabajo y falta de un poco de destreza. Lo anterior se menciona, dado que fue posible observar durante la práctica aspectos como: inadecuado manejo de las cámaras de elución (pues ésta no debe permanecer abierta cuando se está llevando a cabo la elución, pues es necesario que ésta se encuentre saturada), también se evidenció que algunos procesos de extracción fueron realizados a la ligera, lo cual puede llevar a que la separación de las drogas no sea completa.

CONCLUSIONES

La muestra de orina no contenía drogas acidas confirmando este resultado con una prueba cualitativa que era la CCD.No fue posible determinar la presencia de drogas ácidas en la muestra de orina, a cusa de errores introducidos durante la realización del análisis; razón por la cual se sugiere la realización de la prueba nuevamente y así lograr dar correspondencia a la muestra con algún tipo de droga ácida.

REFERENCIAS

(1) Guía de laboratorio de Toxicología: Extracción de drogas ácidas y básicas, separación por cromatografía de capa delgada con detección por revelado. Universidad Icesi, Facultad de Ciencias Naturales.

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(2)

http://www.ataonline.org.ar/bibliotecavirtual/documentos_utilies/toxicologia_libro_analitica.pdf. Visitado: Marzo 03 de2012.