ING. EN BIOTECNOLOGIA

OPERACIONES UNITARIAS II

M.C. GENARO CERON

“PRACTICA II: EXTRACCION DE FLAVONOIDES A PARTIR DE MAIZ AZUL”

POR:

CALVO SALAZAR VIOLETA

CERVANTES PINEDA AIDE

GARCIA CENICEROS DAVID

8IBT3

EXTRACCION DE FLAVONOIDES A PARTIR DE MAIZ AZUL

INTRODUCCION

Los flavonoides son un amplio grupo de compuestos polifenólicos de bajo peso molecular, los cuales se encuentran en las frutas, en los vegetales y también en algunos productos procesados a partir de productos naturales, tales como los jugos, los néctares y el vino.

FLAVONOIDES

Flavonas

Flavonales

Chalconas

Auronas

Antocianinas

Blanco-crema

Amarillo-blanco

Amarillo

Amarillo

Rojo-azul

Fig. 1 Clasificación de los flavonoides

En México existen varios tipos de maíz azul, los cuales poseen altas concentraciones de antocianinas.

La utilización de estos compuestos como pigmentos en alimentos ha estado limitada por su susceptibilidad, entre otros factores, al pH y a la temperatura. De acuerdo al valor del pH, se presenta una variación en el color que adquieren las antocianinas cuando están en solución. Por consiguiente, es posible observar un color rojo o anaranjado a pH ácido de aproximadamente 2 ó menor, un color azuloso a pH entre 2 y 4, predominando la base quinoidal. Con un pH de 5 la antocianina es incolora y presenta la pseudo base carbinol; si el pH es de 6 se tiene la pseudo base chalcona, que es también incolora. Y cuando el pH se incrementa por arriba de 7, la antocianina se degrada de forma irreversible.El descubrimiento de las antocianinas de tipo acilado, que son más estables a cambios de temperatura y pH que las no aciladas, ha venido a reactivar nuevamente la búsqueda de fuentes naturales de estos compuestos para su uso como pigmentos en alimentos.La mayor estabilidad que muestran las antocianinas aciladas a cambios de pH y temperatura se considera que se debe a que los radicales acilo interactúan con los núcleos de flavilium y logran así dar mayor estabilidad a la copigmentación intramolecular, además de prevenir la reacción de hidratación del C2 de la molécula.

Las antocianinas (del griego (anthos): ‘flor’ + (kyáneos): ‘azul’) son ἀνθός κυανός pigmentos hidrosolubles que se hallan en las vacuolas de las células vegetales y que otorgan el color rojo, púrpura o azul a las hojas, flores y frutos. Desde el punto de vista químico, las antocianinas pertenecen al grupo de los flavonoides y son glicósidos de las antocianidinas, es decir, están constituidas por una molécula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se le une un azúcar por medio de un enlace glucosídico. Sus funciones en las plantas son múltiples, desde la de protección de la radiación ultravioleta hasta la de atracción de insectos polinizadores.

Estructura QuímicaQuímicamente las antocianinas son glicósidos de las antocianidinas, es decir, están constituidas por una molécula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se le une un azúcar por medio de un enlace glucosídico. La estructura química básica de estas agliconas es el ión flavilio, también llamado 2-fenil-benzopirilio que consta de dos grupos aromáticos: un benzopirilio y un anillo fenólico; el flavilio normalmente funciona como un catión. Las agliconas libres raramente existen en los alimentos, excepto posiblemente como componentes traza de las reacciones de degradación. De todas las antocianidinas que actualmente se conocen (aproximadamente 20), las más importantes son la pelargonidina, la delfinidina, la cianidina, la petunidina, la peonidina y la malvidina, nombres que derivan de la fuente vegetal de donde se aislaron por primera vez; la combinación de éstas con los diferentes azúcares genera aproximadamente 150 antocianinas. Los hidratos de carbono que comúnmente se encuentran son

la glucosa y la ramnosa, seguidos de la galactosa, la xilosa y la arabinosa y, ocasionalmente, la gentiobiosa, la rutinosa y la soforosa.

Figura # 1. Estructura Química del Ion Flavilio

Estructura química del ión flavilio, formando en este caso una sal con el anión cloruro.

Figura 2. Estructura química y posición del grupo fenilo

Antocianidina R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7

Aurantinidina -H -OH -H -OH -OH -OH -OH

Capensinidina -OCH3 -OH -OCH3 -OH -OCH3 -H -OH

Cianidina -OH -OH -H -OH -OH -H -OH

Delfinidina -OH -OH -OH -OH -OH -H -OH

Europinidina -OCH3 -OH -OH -OH -OCH3 -H -OH

Luteolinidina -OH -OH -H -H -OH -H -OH

Pelargonidina -H -OH -H -OH -OH -H -OH

Malvidina -OCH3 -OH -OCH3 -OH -OH -H -OH

Peonidina -OCH3 -OH -H -OH -OH -H -OH

Petunidina -OH -OH -OCH3 -OH -OH -H -OH

Rosinidina -OCH3 -OH -H -OH -OH -H -OCH3

Como se muestra en la figura 2, el grupo fenilo en la posición 2 puede llevar diferentes sustituyentes.

La estabilidad de las antocianinas está determinada por el grado de oxidación, la temperatura, la fuerza iónica, la acidez y la interacción con otros radicales y moléculas complejas.

En maíz se ha reportado la presencia tanto de antocianinas no-aciladas, como aciladas, y según reportes de varios autores, en esta gramínea abundan las de tipo acilado.

Extracción de antocianina

La extracción de antocianina es comúnmente realizada por una serie de repetidas maceraciones o molido con pequeñas cantidades de HCL (1.0% - 1.0%) en metanol o etanol a temperatura ambiente usualmente y es casos complejos se utiliza en frio utilizando ácidos débiles (para evitar la degradación del pigmento), la adición de agua (10% - 15%) en algunos casos permite una extracción completa en algunos casos dependiendo del materia tratado.

Purificación de la antocianina

La purificación de la antocianina es un paso muy importante debido a que en la extracción se arrastran contaminantes los cuales pueden afectar la estabilidad o análisis del pigmento. En la purificación de la antocianina se usa una fase solida para la extracción (PVPP y C 18), que permite mover una gran cantidad de compuestos interferentes (azucares, ácidos).

Para la Purificación de la antocianina se utilizan usualmente los siguientes materiales:

Metanol acidificado 0.01%

Agua acidificada 0.01%

Polivinil o poli-pirolidona (PVPP)

Cartucho C18 (Sep-Pak Cartidge, 360mg)

Embudo de vacío

Papel Whatman #1

Bombas al vacio

Matraz Erlenmeyer para vacío

Pipetas

*La succión al vacio se realiza para agilizar el paso de los solventes a través de papel filtro.

MATERIALES Y METODOS DE EXTRACCION

Material de estudio. Se selecciona una variedad de maíz azul. Se separó el pericarpio y la capa de aleurona del grano (FPCA) mediante una perladora de cebada (Strong-Scott). La separación de estas fracciones del grano requirió determinar el contenido de humedad y tiempo de perlado adecuado, así como el tipo de disco a emplear en la perladora para realizar el perlado. El rendimiento de la FPCA bajo este proceso fue calculado en porcentaje, considerando la cantidad de muestra inicial y el peso de la FPCA obtenida. Cada muestra de maíz se perló por duplicado.

Determinación de antocianinas totales

La cuantificación de antocianinas totales se puede realizar en la FPCA obtenida por perlado de cada uno de los maíces. La FPCA y mezclarse para homogenizar y la cuantificación de antocianina total se puede realizar por duplicado.

Extracción y concentración del pigmento

La extracción de las antocianinas a partir de la FPCA obtenida de cada muestra de maíz se efectúa usando dos disolventes distintos. Uno puede ser etanol: ácido acético: agua, en proporciones de 10:1:9; el otro podría ser metanol: ácido acético: agua, usando exactamente las mismas proporciones. El metanol es más efectivo que el etanol para la extracción de antocianinas, aunque su toxicidad impide que se pueda emplear cuando las sustancias extraídas se usarán para consumo humano. Sin embargo, la extracción se puede realizar con los dos disolventes para comparar los perfiles de antocianinas obtenidos cuando se emplea uno u otro.

Purificación del extracto de antocianinas

Se toma 1 mL de la muestra concentrada para realizar una doble purificación. La primera consistie en hacer pasar el extracto por una columna de Amberlita XAD-7, usando agua acidificada al 5 % con ácido acético (A) y metanol acidificado al 5 % con ácido acético (B). El primero se usa para lavar la columna y el segundo para liberar los pigmentos retenidos en la columna. Se realiza una segunda purificación, empleando una columna Sephadex LH-20 y un gradiente de elusión con dos solventes

(A) MeOH/TFA/H2O (19.8:0.2:80.0 v/v) y (B) MeOH/TFA/H2O (59.4:0.6:40.0 v/v), realizando la elusión.

Resumen de Procedimiento

1. Identificar la fuente del colorante (maíz azul)2. Quitar la cascara y moler el grano hasta obtener una mezcla uniforme3. Para hacer la extracción se utiliza una mezcla de etanol. Acido acético y agua en

proporciones de 10:1:9, se puede sustituir el etanol por metanol, el cual es mas efectivo para la extracción pero su toxicidad limita sus aplicaciones (por cada gramo de extracto se puede utilizar 20 mil de disolvente)

4. Se puede concentrar el extracto en un rotavapor5. Para hacer la purificación se hace pasar por una columna de resina polimérica no iónica, y

se utiliza agua acidificada al 5 % para lavar la columna con metanol acidificado al 5% (con acido acético) para liberar para liberar los pigmentos retenidos en la columna.

6. Se obtiene el extracto de antocianinas de flavonoides.

Diagrama de Proceso de extracción y purificación de Antocianinas a partir de Maíz azul

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Química de los Alimentos, Badui, S., Longman de México Editores. México. 1999.

MOLIDO DE LOS GRANOS DE MAIZ AZUL

EXTRACCION DE ANTOCIANINAS CON UNA MEZCLA DE ETANOL,

ACIDO ACETICO Y AGUA EN PROPORCIONES DE 10:1:9

CONCENTRACION DEL EXTRACTO EN UN ROTAVAPOR

PURIFICACION POR ADSORCION EN COLUMNA DE RESINA POLIMERICA

NO IONICA

OBTENCION DE PIGMENTOS (ANTOCIANINAS) PURIFICADOS

Extracción y uso de pigmentos del grano de maíz (Zea Mays L.) como colorantes en yogur Yolanda Salinas Moreno, David Rubio Hernández y Antonio Díaz Velázquez. Laboratorio de Maíz. INIFAP.Depto. de Ingeniería Agroindustrial. Universidad Autónoma Chapingo. Chapingo, Méx. 2005

Situación del Perú como productor de colorantes (Producción de antocianinas) http://www.monografias.com/trabajos58/produccion-antocianina/produccion antocianina2.shtml] Peru. 2009