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Extracción, detección y cuantificación de compuestos fenólicos.

Objetivo Llevará a cabo la extracción, detección y cuantificación de polifenoles totales en 6 muestras de origen natural. Introducción Marco Teórico Material (por equipo)

Solo el equipo 1: 5 Probetas de 10ml

Bata de laboratorio, guantes, lentes de seguridad y cubrebocas

Franela

Gradilla

Balanza gravimétrica y analítica

Espectrofotómetro ajustado a 765nm

Papel filtroWhatman No. 1

Mortero de porcelana con pistilo

1 Portaobjetos

2 probetas de 25ml

2 Matraz aforado de 20ml

1 Matraz aforado de 50ml

1 Vaso precipitados 25ml

4 tubos de ensayo

2 pipetas graduadas de 10ml

2 cubetas de 1-cm, 2-ml de plástico o vidrio.

1 Bureta de 15ml

1 Espátula

1 Pipeta graduada de 1ml

1 parrilla eléctrica con agitación y calentamiento

2 Baño de agua

1 Lanceta

Facultad de Ciencias Químicas

Km.9 Carr. Colima-Coquimatlán, C.P. 28400, Coquimatlán, Colima.

Tel. int (+52) 312 3261163

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Disoluciones y muestras biológicas ( a distribuir)

50 g Muestra de arándano, uva, manzana, vino tinto 10% v/v, café y espinacas (1 muestra por equipo)

Disolución de grenetina al 1% -20ml Disolución de NaOH al 10% - 25ml Disolución FeCl3al 1% - 10ml Estándar de calibración de Ácido Gálico -25ml Reactivo Folin-Ciocalteau (FC) -10ml Disolución de Na2CO3 7.5%

Reactivos (por grupo)

Grenetina 0.2g NaOH 2.5g FeCl3 .1g Na2CO3 .16g C6H2(OH)3COOH .05g CH3CH2OH 20ml CH3(CO)CH3 100ml H2O destilada 1L

Preparación de reactivos y disoluciones Usar agua destilada en todos los procedimientos y pasos del protocolo. Estándar de calibración de Ácido Gálico (sólo el equipo que realizará la curva)

Disolver 0.125g de ácido gálico en 2.5ml de etanol en una probeta de 25ml y llenar hasta el aforo con agua (5g/L final). Diluir 0.1, 0.2, 0.5, y 1 ml de esta disolución en un matraz aforado de 10ml y llenar de agua hasta el aforo, esto para crear concentraciones estándar con 50, 100, 250, 500 g/L respectivamente.

Conservar por 2 semanas a 4°C. Los estándares retendrán el 98% de su potencia por 2

semanas si se mantiene cerrado y bajo refrigeración (4°C), pero esta potencia es retenida solo por 5 días a temperatura ambiente. El ácido gálico comercial es usualmente puro, pero se puede recristalizar en agua. Disolución de Na2CO3 al 7.5% Verificar que el reactivo esté listo, de lo contrario, previo acuerdo con el profesor, se preparará de la siguiente manera. Disolver .16g de Na2CO3anhidro en 25 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 25 ml y calentar hasta ebullición por 1 minuto. Después de que se enfrié, agregar 2 cristales de Na2CO3 y dejar reposar por 24h a temperatura ambiente. Filtrar con papel filtro Whatman No. 1.

Guardar indefinidamente a temperatura ambiente.

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Reactivo de Folin- Ciocalteau Verificar que el reactivo esté listo, de lo contrario, previo acuerdo con el profesor, se preparará de la siguiente manera. Disolver 100g de tungstato de sodio en 700ml de agua destilada y 25g de molibdato de sodio. Agregar 50ml de ácido fosfórico al 85% ( p20 =1,71g/ml), 10ml de HCl concentrado (p20= 1,19 g/ml). Llevar a ebullición bajo reflujo durante 10 horas. El reflujo no necesariamente debe ser contínuo. Añadir a continuación 150g de sulfato de litio, algunas gotas de bromo y hervir durante 15 minutos. Enfriar y completar 1L con agua destilada. Disolución de grenetina al 1% Colocar .2g de grenetina en un matraz aforado de 20ml y llenar hasta el aforo con agua. Disolución de NaOH al 10% Colocar 2.5g de NaOH en un matraz aforado de 25ml y llenar hasta el aforo con agua. Disolución de FeCl3 al 1% Colocar .1g de FeCl3 en un matraz aforado de 10ml y llenar hasta el aforo con agua. Recomendaciones para el desarrollo de la práctica

Sesión de 3 horas. Previo a cada sesión a realizar se designará un equipo distinto para la preparación de soluciones y reactivos, asignado por el catedrático de la materia. Cada equipo manejará una muestra (arándano, roble, manzana, vino tinto 10% v/v, café y espinacas). Cada material es por equipo, los reactivos y soluciones son en general. La disolución de Na2CO3se debe preparar 24 horas antes.

Al inicio de la práctica cada equipo se dividirá en 2 grupos, donde el grupo A se encargará

de las pruebas preliminares, mientras el grupo B se encarga de la cuantificación por método FC; así mismo se designará a un equipo para la preparación del estándar de ácido gálico y para la elaboración de la curva de calibración, donde el grupo A se encargará de esto y el grupo B se encargará de la obtención del extracto como primer paso, esto para agilizar tiempos. El material deberá estar listo en primeros 10 minutos como máximo.

Respecto a la medición espectrofotométrica, cada equipo contará con 10 minutos para

tomar sus lecturas, por triplicado para reportar resultados y obtener grado de fiabilidad >5%. Es muy importante tomar en cuenta el tiempo del desarrollo de la sesión ya que se trata de una prueba colorimétrica.

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Cuadro 1. Actividades

Equipo Grupo A Tiempo (min)

Grupo B Tiempo

Actividades en la primera hora de laboratorio.

Mixto Preparación de curva de calibración y del estándar.

1 Preparación de disoluciones

Todos Preparación del extracto

Actividades en la 2ª Y 3ª hora de laboratorio

1 Pruebas preliminares

Cuantificación de polifenoles

2 30 30

3 30 30

4 30 30

5 30 30

6 30 30

Cuadro 2. Orden cronológico de lectura al espectrofotómetro (se efectuará un sorteo para ver el orden en que deben trabajar).

Equipo Hora de comienzo de lecturas

Mixto Curva 11:20

11:35

11:50

12:00

12:10

12:20

12:30

12:45 Entrega de material

Metodología

1. Cada equipo debe pesar 50g de muestra asignada a trabajar (arándano, uva, té verde, manzana, café, espinacas o vino tinto), para posteriormente moler en un mortero de porcelana con 20ml de solución 7/3 (acetona/agua) por 30 minutos hasta homogenizar. La muestra de vino tinto debe diluirse al 10%. Colocar 5ml en un vaso de precipitados de 50ml con lo restante de agua destilada.

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2. Se procede a filtrar el extracto con papel filtro y embudo. Rotular adecuadamente cada tubo donde se obtendrá el líquido, así como los reactivos y el vaso de precipitados con el extracto.

Parte A. Pruebas preliminares de polifenoles hidrosolubles (taninos)

1. Tomar 2ml del extracto en un tubo de ensayo con 2ml de solución de NaOH al 10% y tratar

con 3-7 gotas de solución de grenetina al 1%. La presencia de taninos se manifiesta con la precipitación del complejo proteína- tanino. Ésta es una prueba de campo.

2. Los compuestos fenólicos se detectan por la coloración parda que presentan en una

solución de FeCl3al 1%. Para ello: Añadir 2 ml del extracto a un tubo de ensayo, seguido de 3-5 gotas de FeCl3. Si los fenoles están presentes producen una coloración marrón.

3. Colocar 2 gotas del extracto en un portaobjetos, añadir 1 gota de sangre y mezclar. Observar hemoaglutinación, la prueba más importante para la clara determinación de presencia de taninos.

Parte B. Cuantificación de polifenoles totales por el método colorimétrico Foulin-Ciocalteau. CURVA DE CALIBRACIÓN (Equipo combinado)

a) Preparación del estándar de ácido gálico a diferentes concentraciones. b) Elaboración de curva de calibración

1. Colocar 2.5ml del reactivo FC diluido con anterioridad 1:10 a 2ml del estándar de ácido

gálico. 2. Incubar por 2 minutos a temperatura ambiente 3. Añadir 2ml de Na2CO3 (75g.L-1) 4. Incubar 15 minutos a 50°C en baño María 5. Colocar en baño frío hasta temperar. No exceder de 5-10 minutos. 6. Medir absorbancia a 765nm para cada estándar ( 50, 100, 250, 500 g/L ) 7. Utilizar los datos para crear curva de calibración (ver análisis de datos)

ÁNALISIS DE MUESTRA PROBLEMA (Todos los equipos).

Protocolo optimizado Foulin- Ciocalteau (tiempo total 30 minutos)

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Nota: Cada equipo verifique a qué hora tiene su turno de lectura en el espectrofotómetro para que así determine su tiempo de inicio de procedimiento 30 min antes. Parte C. Análisis de resultados

Restar la absorbancia del blanco de todas las lecturas y crear la curva de calibración del estándar. Usar esta curva para determinar la concentración correspondiente de ácido gálico en las muestras, asegurándose de multiplicar por cualquier factor de dilución para obtener concentración, en este caso calcular el factor del vino tinto al 10%.

Informar valores en equivalentes de ácido gálico (GAE) usando unidades de mg/L o mg/Kg

según sea debido. Multiplicando la densidad óptica por el factor de disolución se obtiene el índice FC. Resultados y Discusiones Conclusiones Referencias Anexos

1. Hoja de seguridad de reactivos empleados 2. Uso de espectrofotómetro