БИ ОХИ М И Я, 1999, том 64, вып. 4, с. 483 - 489

УДК 577.152.3

Ф Е РУ Л О И Л Э С Т Е РА ЗА И З A SPE R G IL L U S SP.: В Ы Д Е Л Е Н И Е , С ВО Й С ТВА И Д Е Й С Т В И Е Н А П Р И Р О Д Н Ы Е С У Б С Т РА Т Ы

© 1999 г. Е.И. Дзедзюля1, Е.Г. Беккер2*, О.Н. Окунев3, А.П. Синицын2

1Кафедра микологии и альгологии, Биологический факультет,Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова,

119899 Москва; факс: (095)939-0997, электронная почта: kdz@enzyme.chem.msu.su2Кафедра Химической Энзимологии, Химический факультет,

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова,119899 Москва; факс; (095)939-0997, электронная почта: lbecker@enzyme.chem.msu.su

3Институт Биохимии и Физиологии Микроорганизмов РАН,142292 Пущино, Московская обл.; факс: (095) 923-3602,

электронная почта: okunev@ibpm.serpukhov.suП оступила в редакцию 11.06.98

П осле доработки 03.07.98

Ф ерм ент, обладаю щ ий эстеразной активностью по отнош ению к метиловому эф иру ф еруловой кислоты, бы л вы делен из гриба рода Aspergillus sp. и очищ ен до гомогенного состояния с пом ощ ью ионообм енной и гидроф обной хроматографии. М олекулярная масса фермента бы ла равна 42 кД а, изоэлектрическая точка - 3,7, p H -оптимум находился в области 4-6 , температурны й оптимум - от 40 до 60°. И зучение субстратной специф ичности выделенного фермента с использованием ряда синтетических и природны х субстратов поз- воли ло установить, что он является ф ерулоил эстеразой. Ф ерулоил эстераза практически не гидролизовала пш еничную солому, а при действии н а пш еничны е отруби и свекловичный жом образовы валась феруловая кислота . Б ы ло показано, что при гидролизе свекловичного ж ом а кроме ф еруловой кислоты образую тся другие продукты деструкции.

К Л Ю Ч Е В Ы Е СЛОВА: метиловы й эф ир феруловой кислоты, пшеничные отруби, пш еничная солом а, свек- л ови ч н ы й жом, ферулоил арабинозид, ф ерулоил эстераза.

Эстеразы, участвующие в биодеградации руют как ферулоил (кумароил) эстеразы, так и природных полисахаридов, подразделяют на ацегилксилан эстеразы [1, 3, 7, 8]. Из бактери- несколько групп в зависимости от их специфич- альных источников выделяют ацетилксилан эс- ности и физиологической роли [1]. Первая труп- теразы [9].па включает эстеразы, способные отщеплять от Скрининг ряда продуцентов из коллекции ксилана ароматические кислоты (феруловую, ИБФМ РАН (г. Пущино) позволил выявить кумаровую и коричную). Ароматические кисло- один из грибов рода Aspergillus, характеризую- ты входят в состав гемицеллюлозы „и играют щийся значительным уровнем внеклеточной як- роль. мостиков между полисахаридными цепями тивности эстераз по двум субстратам - метило- [2]. Кроме того, они соединяют лигнин и целлю- вому эфиру феруловой кислоты и ферулоил ара- лозу [2]. бинозиду. Целью настоящей работы было выде-

Ко второй и третьей группам относятся аце- ление эстеразы, продуцируемой грибом рода тил эстеразы и ацетилксилан эстеразы, отщеп- Aspergillus, и исследование ее биохимических ляющие ацетильную группу соответственно от свойств, субстратной специфичности и действия коротких и длинных цепей ацетилированного на растительные, ксилансодержащие субстраты, ксилана, что приводит к увеличению доступнос­ти ксилана для действия ксиланаз [1,2].

В литературе в основном описаны эстеразы, М ЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯпродуцируемые грибами родов Aspergillus,Penicillium, Trichoderma и Fusarium [3-5], извест- М атериалы. Лиофилизованный препарат ны также бактериальные ферменты из Bacillus культуральной жидкости гриба рода Aspergillus subtilis и Streptomyces sp. [1, 6]. Грибы продуци- был предоставлен И БФ М РАН (г. Пущино)._________ Метиловые эфиры и-кумаровой и феруловой* А дресат для корреспонденции и запросов оттисков. кислот, метил 5-о-транс-ферулоил-а-Ь-арабино-

483 4*

.

©1999 Российская Академия Наук. Материал из электронного архива журнала ”Биохимия”. Статья оцифрована в Отделе Научной Информации НИИФХБ

им. А.Н. Белозерского МГУ. Использование материала автоматически предполагает выполнение условий Пользовательского соглашения.

Постоянная ссылка на материал: http://journals.belozersky.msu.ru/biochemistry/paper/1999/04/483.

1

484 ДЗЕДЗЮ ЛЯ и др.

фуранозид (ферулоил арабинозид) были синте­зированы на кафедре органической химии Хи­мического факультета МГУ по методикам [10, 11]. Были использованы «-нитрофенил ацетат и а-нафтил ацетат фирмы «Sigma» (США).

Первая стадия очистки была проведена с по­мощью ионообменной хроматографии на колон­ке (1,6 х 10 см) с DEAE-Spheron 1000 («Chemapol», Чехия). Лиофилизованный препарат культу­ральной жидкости, обессоленный на колонке с Акрилексом П4 («Reanal», Венгрия) (1,6 х 20 см) в стартовом 0,05 М натрий-ацетатном буфере, pH 5,0, наносили на колонку и элюировали свя­завшиеся белки в градиенте концентрации NaCl (0-1 М) в общем объеме 480 мл. Скоростыю то- ка - 1 мл/мин, объем фракций ~ 2 мл.

Следующая стадия очистки включала гидро­фобную хроматографию на Phenyl Superose HR 5/5 (FPLC, «Pharmacia», Швеция). Обладающие фе­рулоил эстеразной активностью фракции диа- лизовали против 0,1 М аммоний-ацетатного бу­фера, pH 5, содержащего 1,7 М (NH4)2S 0 4, и на­носили на колонку Phenyl Superose H R 5/5. Свя­завшиеся в стартовых условиях белки элюиро­вали, снижая концентрацию (NH4)2S 0 4 до нуля в объеме 30 мл. Скорость потока - 0,5 мл/мин, объем фракций - 1 мл.

Содержание белка определяли по методу Лоури [12], используя БСА в качестве стандар­та. Электрофорез в денатурирующих условиях (Ds-Na-ПААГ-электрофорез) и изоэлектрофо­кусирование (ИЭФ) белков проводили согласно стандартным методикам [13, 14], белковые по­лосы окрашивали серебром [13].

Ферулоил эстеразную активность определя­ли по образованию феруловой кислоты при ги­дролизе ее метилового эфира [7].

Запасной раствор метилового эфира феруло­вой кислоты готовили в 0,04 мл этанола и раз­бавляли 10 мл воды до концентрации 0,6 мМ. Реакционная смесь (0,5 мл) содержала 0,355 мл 0,1 М натрий-ацетатного буфера, pH 5,0,0,085мл запасного раствора субстрата и 0,06 мл раство­ра фермента. Реакцию проводили при темпера­туре 50° в течение 15 мин и останавливали до­бавлением 0,025 мл 0,5 М НС1. Затем проводили трехкратную экстракцию образовавшейся феру­ловой кислоты с помощью эфира (0,5 мл) и цен­трифугировали 5 мин при 10 000 об/мин, после чего верхний эфирный слой отбирали. Объеди­ненные эфирные фракции (1,5 мл) сушили в ва­кууме, сухой остаток перерастворяли в 0,067 мл метанола и анализировали методом обращенно- фазовой хроматографии на колонке Spherisorb RP18 (0,4 х 25 см) (Чехия), используя жидкост­ный хроматограф фирмы «Bio-Rad» (СШ А) с фотометрическим детектором (325 нм). В каче­

стве элюента использовали смесь - вода (93,8%): : бутанол (6,0%): уксусная кислота (0,2%). В ка­честве стандарта использовали 1 мМ раствор феруловой кислоты («Sigma»).

Измерение активности эстеразы с использова­нием ферулоил арабинозида проводили по методу Hatfield et al. [11]. Ферулоил арабинозид раство­ряли в 0,02 М натрий-ацетатном буфере, pH 5,0, до концентрации 1,38 мМ, с добавлением 0,01% N aN 3. Реакционная смесь (0,4 мл) содержала 0,02 М натрий-ацетатный буфер, pH 5,0 (0,1 мл), растворы субстрата (0,25 мл) и фермента (0,05 мл). Реакцию проводили 20 мин при комнатной тем­пературе и прекращали добавлением 0,5 М НС1. Анализ образовавшейся феруловой кислоты проводили методом, описанным выше.

Активность эстеразы по метиловому эфиру я-ку- маровой кислоты измеряли тем же методом, что и для эфира феруловой кислоты, используя в ка­честве стандарта и-кумаровую кислоту («Sigma»).

Активность фермента выражали в междуна­родных единицах, т.е. 1 единица активности со­ответствовала такому количеству фермента, ко­торое приводило к образованию 1 мкмоля феру­ловой (или кумаровой) кислоты в 1 мин на 1 мг (мл раствора) фермента.

Деацетилирующую активность эстеразы оп­ределяли, используя в качестве субстрата и-нит- рофенил ацетат [15]. Реакционная смесь (1 мл) содержала: 0,2 мл субстрата (5 мМ , приготов­ленный в 10% смеси метанол-вода), 0,74 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера, pH 6,0, и 0,06 мл раствора фермента. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 20 мин. Обра­зование «-нитрофенола регистрировали спект­рофотометрически при 430 нм (е = 950 М '1 • см-1).

Качественную оценку деацетилирующей ак­тивности эстеразы делали, проводя изоэлектро­фокусирование выделенного фермента и окра­шивая гель а-нафтил ацетатом [16]. Для этого гель первоначально фиксировали 10 мин в 0,2 М растворе Н 3В 03, затем помещали в 0,2 М на- трий-фосфатный буфер, pH 7,0, и добавляли раствор а-нафтилацетата («Sigma») в ацетоне (Ю мг в 1,5 мл ацетона) и краситель Fast blue RR («Sigma») (50 мг на 100 мл буфера). После прояв­ления окраски гель отмывали и фиксировали 7%-ным раствором уксусной кислоты.

Активность фермента но отношению к при­родным субстратам определяли, используя пре- добработанные пшеничные отруби, свеклович­ный жом и пшеничную солому. Предобработка пшеничных отрубей и свекловичного жома осу­ществлялась с целью удаления крахмала и за­ключалась в инкубировании субстратов с 0,25% СН 3СООК в течение 10 мин при температуре 95е [17].

БИОХИМИЯ том 64 вып. 4 1999

ФЕРУЛОИЛ ЭСТЕРАЗА ИЗ ASPERGILLUS SP. 485

10 мг природного субстрата инкубировали с 0,06 мл фермента в 0,1 М натрий-ацетатном бу­фере (1 мл) с перемешиванием на магнитной ме­шалке 5 ч при температуре 50°. Реакцию прекра­щали кипячением в течение 3 мин. После цент­рифугирования (7000 g, 2 мин) 0,5 мл суперна­танта отбирали, экстрагировали эфиром и ана­лизировали содержание феруловой кислоты описанным выше методом. Активность фермен­та выражали двумя способами: в мкмоль обра­зованной за 1 мин феруловой кислоты и в % об­разованной феруловой кислоты от общего ее со­держания в субстрате.

Общее содержание феруловой кислоты в пшеничных отрубях, свекловичном жоме и со­ломе определяли путем щелочного гидролиза субстратов [17]. Для этого 10 мг субстрата обра­батывали 1 мл 1 М NaOH в течение 24 ч при комнатной температуре и перемешивании на ка­чалке (150 об/мин). После этого раствор нейтра­лизовали добавлением двух объемов 1 М НС1, центрифугировали 5 мин при 7000 g. Суперна­тант отбирали, экстрагировали эфиром и анали­зировали описанным выше методом.

Молекулярно-массовое распределение (ММР) продуктов гидролиза пшеничных отрубей, пше­ничной соломы и свекловичного жома, раство­римых в диметилформамиде, получали следую­щим образом [18]. После окончания реакции от­бирали 0,75 мл реакционной смеси, заморажи­вали и лиофильно высушивали. Полученный осадок перерастворяли в 0,3 мл элюента и про­водили гель-фильтрацию на Separon Р1000 («Chemapol»), используя ВЭЖХ («Bio-Rad»). Продукты регистрировали спектрофотометри­чески при 280 нм. Элюент - диметилформамид, содержащий 0,03 М LiBr и 0,03 М Н 3Р 0 4, ско­рость потока - 1 мл/мин. В качестве стандартов использовали полистирол (Мг = 3600), феруло- вую кислоту (194) и вератрол (138).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖ ДЕНИЕ

Очистку фермента проводили по схеме, пред­ложенной для эстеразы из A. awamori [7]. Она со­стояла из двух стадий - ионообменной хромато­графии на DEAE-Spheron и гидрофобной хрома­тографии на Phenyl Superose. В ходе очистки ак­тивность эстеразы измеряли, используя в качестве субстрата метиловый эфир феруловой кислоты.

Х роматограмма, полученная при элюции белков с DEAE-Spheron (рис. 1), показывает, что все белки выходили в градиенте NaCl от 0,15 до 0,8 М. Среди них фракции, выходившие при концентрации 0,3-0,35 М NaCl, обладали ак­тивностью по отношению к метиловому эфиру

Рис. 1. Х ром атограф ия культуральной ж идкости Asper­gillus sp. на D E A E -Spheron: 1 - белок (А280), 2 - активность по метиловому эфиру феруловой кислоты, 3 - градиент N aC l (0-1 М )

с;

Рис. 2. Х ром атограф ия ф ракций, обладавш их эстеразной активностью , на Phenyl Superose: 1 - белок (А 280), 2 - ак ­тивность по метиловому эфиру феруловой кислоты, 3 - гра­диент (N H 4)2S 0 4 (1,7-0 М )

'<v • кДа

.. WW 97

- m m 66

mm 45

Е 29

1 2

Рис. 3. D s-N a-П А А Г-электрофорез очищ енной ферулоил эстеразы (1) и культуральной ж идкости (2). В качестве м ар ­керных белков использовали карбоангидразу (29 кД а), яичный альбумин (45 кД а), бы чий сы вороточны й альбу­мин (66 кД а) и фосф орилазу Ъ (97 кД а)

БИОХИМ ИЯ том 64 вып. 4 1999

486 ДЗЕДЗЮЛЯ и др.

Т аблица 1. Результаты очистки ферулоил эстеразы

С тадии очистки О бщ аяактивность, ед**

Содержание белка, мг

Удельнаяактивность,

ед/мг**

ВЫХОД; % Степень очистки

И сходны й препарат* 1,25 20 0,063 100, 1 •- '

И онообм енная хром атограф ия н а D E A E -Spheron

0,43 4 0,1 . 34 1,6

Гидроф обная хром атограф ия н а Phenyl Superose

0,16 0,13 1,23 13 19,5

* К ультуральная ж идкость Aspergillus sp. , обессоленная в 0,05 М натрий-ацетатном буфере, p H 5,0. ** А ктивность по отнош ению к м етиловом у эф иру феруловой кислоты.

феруловой кислоты (эстеразной активностью). Степень очистки фермента в результате хрома­тографии на DEAE-Spheron возросла в 1,6 раза (табл. 1).

Фракции, обладавшие наибольшей эстераз­ной активностью, были объединены и подверг­нуты дальнейшей очистке с помощью гидрофоб­ной хроматографии на Phenyl Superose (рис. 2). К ак видно из хроматограммы, в градиенте уменьшающейся ионной силы от 1,7 до 0 М (N H 4)2S 0 4 выходил ряд хорошо разрешенных белковых пиков, которые не проявляли эстераз­ную активность, а при элюции 100% буфером В, не содержавшим (NH4)2S 0 4, выходил белок, об­ладавш ий эстеразной активностью (степень очистки - 19,5). По данным D s-N a-ПААГ-элек- трофореза (рис. 3) и ИЭФ, этот белок был гомо­генным, имел молекулярную массу 42 кДа и изо­

электрическую точку 3,7. Отметим, что молеку­лярные массы для эстераз из других источников варьируют от 24 до 112 кДа [7, 8, 19, 20], а изо- электрические точки находятся в диапазоне 3-4,7 (для грибных эстераз) [7, 8, 20, 21] и 7,9-8,5 (для бактериальных эстераз) [19].

pH -Зависимость активности выделенной на­ми эстеразы имела максимум в области 4-6 (при использовании в качестве субстратов как мети­лового эфира феруловой кислоты, так и феруло­ил арабинозида) (рис. 4, а). Оптимальные значе­ния pH активности эстераз из других источни­ков варьируют от 5,5 до 7 [19, 20, 22].

Максимальная активность гомогенного фер­мента по метиловому эфиру феруловой кислоты наблюдалась при 40°, а температурный опти­мум активности, измеренной по ферулоил ара- бинозиду, составил 50-60° (рис. 4,6).

Аь01 СО S £

<

100 -

80 -

60 ■

40 -

20 -

0—г- 4 5 6

pH

Рис. 4. p H -Зависимость (а) и зависим ость о т температуры (б) активности очищ енной эстеразы по метиловому эфиру фе­руловой кислоты (1) и ферулоил араби н озиду (2)

БИОХИМ ИЯ том 64 вып. 4 1999

487ФЕРУЛОИЛ ЭСТЕРАЗА ИЗ ASPERGILLUS SP.

Гомогенный фермент был достаточно стаби­лен при 50° и рИ 5, период полуинактивации со­ставлял 20 ч (активность измерялась по феруло­ил арабинозиду). При 70° и pH 5 фермент пол­ностью инактивировался в течение 30 мин.

Субстратная специфичность выделенной эс­теразы была исследована с использованием низ­комолекулярных синтетических субстратов (ме­тиловых эфиров феруловой и кумаровой кис­лот, ферулоиларабинозида, и-нитрофенил аце­тата и а-нафтил ацетата), и природных поли­мерных субстратов (пшеничных отрубей* соло­мы и свекловичного жома). В табл. 2 приведены активности эстеразы по отношению к этим суб­стратам.

Удельная активность гомогенного фермента по отношению к ферулоил арабинозиду сущест­венно выше (26 ед/мг), чем к метиловому эфиру феруловОй кислоты (1,2 ед/мг), возможно пото­му, что ферулоил арабинозид является струк­турным аналогом природных субстратов феру­лоил эстераз. Выделенный фермент был неакти­вен по отношению к метиловому эфиру «-кума­ровой кислоты.

Кроме того, фермент катализирует реакцию деацетилирования w-нитрофенил ацетата и а-наф- тил ацетата (табл. 2), что является отличительным свойством ацетил эстераз. Однако активность эстеразы по и-нитрофенил ацетату (0,03 ед/мг) на несколько порядков ниже, чем по метилово­му эфиру феруловой кислоты и ферулоил араби­нозиду. Таким образом, выделенный фермент является ферулоил эстеразой.

Для ферулоил и хсумароил эстераз различных микроорганизмов была показана [8, 22] способ­ность отщеплять ацетильный остаток от низко­молекулярных субстратов (например, «-нитро­фенил ацетата) и полимерных субстратов (аце- тилированного ксилана). Ф ерулоил эстераза A. awamori способна гидролизовать как метило­вый эфир феруловой кислоты, так и «-нитрофе­нил ацетат [7]. Эстераза Л. niger [22] имела широ­кую субстратную специфичность, проявляя ак­

тивность к метиловым эфирам коричной, ко­фейной, феруловой и кумаровой кислот и н-нит- рофенил ацетату. В то же время ацетил эстеразы и ацетилксилан эстеразы [9], как правило, не об­ладают способностью отщеплять ароматичес­кие кислоты (феруловую, кумаровую и корич­ную) от соответствующих эфиров.

Среди природных полимерных субстратов наибольшая активность выделенной нами феру­лоил эстеразы наблюдалась при гидролизе пше­ничных отрубей (активность определяли по об­разованию феруловой кислоты, табл. 2). Актив­ность по отношению к свекловичному жому бы­ла существенно ниже, а по отношению к пше­ничной соломе не проявлялась вообще.

Н а рис. 5 представлены результаты гидроли­за пшеничных отрубей, свекловичного жома и пшеничной соломы под действием очищенного фермента, а также культуральной жидкости гриба-продуцента, выраженные в % образую­щейся в результате реакции феруловой кислоты относительно общего ее содержания в субстрате. Как видно из рис. 5, действие культуральной жид­кости приводило к образованию большего ко­личества феруловой кислоты из отрубей и жома, чем при действии очищенного фермента (при этом фермент и культуральная жидкость были уравнены по активности в отношений метило­вого эфира феруловой кислоты). При гидролизе пшеничной соломы очищенным ферментом фе- руловая кислота не образовывалась, а при дей­ствии культуральной жидкости наблюдалось образование всего 1,4% (относительных) феру­ловой кислоты (рис. 5). Таким образом, эти ре­зультаты свидетельствуют о синергизме между эс­теразой и ферментами, присутствующими в куль­туральной жидкости (речь идет, скорее всего, о синергизме между эстеразой и ксиланазами [1]).

При действии эстеразы на природные субст­раты возможно образование не только феруло­вой кислоты, по и других продуктов деструк­ции. Наличие таких продуктов определяли, ис­следуя изменение М М Р растворимой в диметил-

Таблица 2. А ктивности (ед/мг) гом огенной ферулоил эстеразы по отнош ению к разны м субстратам

С убстратыМ етиловы й

эфирферуловой

кислоты

Ф ерулоилараби н озид

П ш еничныеотруби*

Свекловичныйжом*

П ш еничнаясолом а

и-Нитро-фенилацетат

а-Н аф ти лацетат**

А ктивность,ед/мг 1,2 26 5,8 . 0,2 0 0,003 +

* А ктивности эстеразы в реакции ги д рол и за пш еничны х отрубей и свекловичного ж ом а вы раж али в мкмолях образовав­ш ейся феруловой кислоты за 60 м ин реакции .

** А ктивность эстеразы по а -н аф ти л ац етату бы л а оценена качественно по окраш иванию И ЭФ -геля.

БИОХИМ ИЯ том 64 вып. 4 1999

488 ДЗЕДЗЮЛЯ и др;

О

5

о

■&

Пшеничные Свеклович- Пшеничная отруби ный жом солома

Рис. 5. К оличество феруловой кислоты (% о т общ его со­держ ания в субстрате), выделяемое при гидролизе пш енич­ных отрубей , свекловичного ж ом а и пш еничной соломы п од действием культуральной ж идкости (1) и гомогенной ф ерулоил эстеразы (2)

формамиде фракции природных субстратов по­сле воздействия на них эстеразы. М М Р получа­ли с помощью метода гель-фильтрации, исполь­зуя в качестве элюента диметилформамид.

В случае пшеничной соломы не наблюдали из­менения в молекулярной массе растворимой в ди- метилформамиде фракции в результате гидроли­

за под действием как очищенного фермента, так и культуральной жидкости гриба-продуцента, что коррелирует с отсутствием активности, опреде­ляемой по образованию феруловой кислоты.

При гидролизе пшеничных отрубей под дей­ствием очищенного фермента заметных; измене­ний в М М Р продуктов гидролиза не удалось за­фиксировать (рис. 6, а). П ри действии же куль­туральной жидкости гриба на пшеничные отру­би образовывались продукты деструкции с мас­сой, близкой массе феруловой кислоты (рис. 6, а).

Для свекловичного жома наблюдалось зна­чительное изменение М М Р (рис. 6, б), которое характеризовалось образованием низкомолеку­лярных продуктов деструкции с массой 194 (со­ответствующей массе феруловой кислоты) и ни­же (соответствующих массе 138), причем при действии культуральной жидкости продуктов деструкции с массой 194 образовывалось боль­ше, чем при действии гомогенного фермента.

Таким образом, пшеничная солома практи­чески не гидролизуется как при действии очи­щенной эстеразы, так и при действии культу­ральной жидкости. При гидролизе пшеничных отрубей под действием культуральной жидкости основным продуктом является феруловая кис­лота. При гидролизе свекловичного жома обра­зуются феруловая кислота и другие продукты деструкции,

Содержание феруловой кислоты в пшенич­ных отрубях, свекловичном жоме и пшеничной

а

Рис. 6. Гель-хром атограм м ы продуктов ги дроли за пш еничных отрубей (а) и свекловичного ж о м а (б): 1 - контрольны й об­разец , полученны й инкубированием субстрата в отсутствие фермента, 2 - гидролиз под действием гомогенной ферулоил эстеразы , 3 - гидролиз п од действием культуральной жидкости. Стандарты : а -п оли сти рол (М г = 3600), b - феруловая кис­л о та (194), с - вератрол (138)

БИОХИМ ИЯ том 64 вып. 4 1999

489ФЕРУЛОИЛ ЭСТЕРАЗА ИЗ ASPERGILLUS SP.

соломе, определенное с помощью щелочного гид­ролиза, различается незначительно (в абсолют­ных %): отруби - 0,3, жом - 0,5 и солома - 0,2. Возможно, что разная реакционная способ­ность этих субстратов связана с различиями в их структуре. Низкая реакционная способность пшеничной соломы может объясняться относи­тельно высоким содержанием лигнина, который

усложняет доступ эстеразы к ферулоильным ос­таткам. Пшеничные отруби и свекловичный жом также несколько различаются по структуре. В отрубях остатки феруловои кислоты соединяют преимущественно молекулы ксилана, а в жоме преобладают полигалактуроновые и пектино­вые структуры, соединенные между собой не только феруловой, но и другими кислотами [23].

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. C hristov , L .P., and P rior, В.А. (1993) Enzyme Microb. Technol., 15,460-475.

2. Sm ith, M .M ., and H artley, R .D . (1983) Carbohydr. Res., 118 ,65-80 .

3. B arto lom e, B., Faulds, C.B., K roon , P .A ., W aldron, K., G ilbert, H .J., H azlew ood, G ., and W illiam son, G . (1997) Appl. Environ. Microbiol., 63 (1), 208-212.

4. D o n ag h y , J .A ., and M cK ay , A .M . (1995) J. Appl. Bacteriol, 79 (6), 657-662.

5. T enkanen , T .M . (1997) Characterization of esterases act­ing on hemicelluloses (xylans, mannans, Trichoderma ree- sei, Aspergillus oryzae). V olum e 58/04-C o f D issertation A bstrac ts International. P. 1268.

6. M eC allum , J.A ., T aylor, 1.Е.Р., an d Tow ers, G .H .N . (1991) Anal. Biochem., 196 (2), 360-366.

7. ; M cC rae, S.I., Leith, K .M ., G o rd o n , A .H ., and W ood,T .M . (1994) Enzyme Microb. Technol., 16 (10), 826-834.

8. B ornem an, W .S., L jungdahl, L .G ., H artley , R .D ., and A kin , D .E . (1991) Appl. Environ. Microbiol., 57 (8), 2337-2344.

9. M cD erm id, K .P ., Forsberg, C .W ., an d M acK cnzic, C.R. (1990) Appl. Environ. Microbiol., 56 (12), 3805-3810.

10. Fosdick , L.S., and S tarke, A .C . (1940) J. Amer. Chem. Soc., 62, 3352-3355.

11. H atfield , R .D .,' H elm , R .F ., an d R alph , J. (1991) Anal. Biochem., 194, 25 33.

12. Low ry, O .H ., R osebrough , N .J., F arr, A .L ., and R andall, R .J. (1951) J. Biol. Chem., 193, 265-272.

13. M ini-Protean 11 dual slab cell. Instruction m anual. Bio-Rad Laboratories, 1414 H arbour Way South, Richmond, CA 94801.

14. M odel 111 M ini IE F cell. Instruction manual. Bio-Rad Laboratories, 1414 H arbour Way South, Richmond, CA 94801.

15. Huggins, C .H ., and Lapidcs, J. (1947) J. Biol. Chem., 170, 467-482.

16. R osenberg, M ., R oegner, V., and Becker, F .F . (1975) Anal. Biochem., 66, 206-212.

17. Jo h n so n , K .G ., H arriso n , B.A ., Schneider, H ;, M acK enzie, C .R ., and F on tana , J.D . (1988) Enzyme. Microb. Technol., 10,403-409.

18. Р усаков A .E ., Л а зар е в а M .A ., Н еф едов П .П ., Щ ербакова Л .Д ., И ван ов М .А ., Захаров В.И. (1982) Химия древесины, 5 ,8 9 -9 5 .

19. F au ld s, С .В ., an d W illiam son , G . (1991) J. Gen. Microbiol., 137 (10), 2339-2346.

20. T enkanen, M ., Schuseil, J., Puls, J., and P ou tanen , K. ( 1 9 9 1 ) / Biotechnol., 1 8 (1 -2 ), 69 84.

21. Faulds, G.B., and W illiam son, G . (1993) Biotechnol. Appl. Biochem., 17 (3), 349-359.

22. K roon , P .A ., Fau lds, C .B., and W illiam son, G . (1996) Biotechnol. Appl. Biochem., 23 (3), 255-262.

23. R alet, М .-C., Fau lds, C.B., W illiamson, G ., T h ibau lt, J - F . (1994) Carbohydr. Res., 263, 257-269.

FERULO YL ESTER A SE FRO M ASPERGILLUS SP.: PURIFICATION, PR O PER TIES A N D ACTIO N ON THE NA TURAL SUBSTRATES

E.I. Dzedzyulya1, E.G. Bekker2, O.N. Okunev3, A.P. Sinitsyn2

1Department of Mycology and Algology, School of Biology, Lomonosov Moscow State University,Moscow 119899, Russia; fax: (7-095)939-0997; E-mail: kdz@enzyme.chem.msu.su

2Department of Chemical Enzymology, School of Chemistry, Lomonosov Moscow State University,Moscow 119899, Russia; fax: (7-095)939-0997; E-mail: lbecker@enzyme.chem.msu.su

3 Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,Pushchino, Moscow Region 142292, Russia; fax; (7-095)923-3602; E-mail: okunev@ibpm.serpukhov.ru

Subm itted June 11, 1998 Revision subm itted July 3, 1998

A n enzyme active tow ards the m ethyl ester o f ferulic acid was isolated from Aspergillus sp. fungus and was purified to homogeneity by ion-exchange and hydrophobic chrom atography. The m olecular weight o f the enzyme was 42 kD; its p I was 3.7. O ptim al p H is 4 -6 an d Optimal tem perature is 40-60°C. U sing a num ber o f synthetic and natu ra l substrates, the enzyme w as identified as feruloyl esterase. Feruloyl esterase d id n o t hydrolyze w heat straw . Ferulic acid was detected as the p ro d u c t o f hydrolysis o f w heat b ran and beet pulp . O ther p roducts were also detected d u r- ing the beet pu lp hydrolysis.

KEY W O RDS: m ethyl ester o f ferulic acid, w heat bran, w heat straw , beet pulp , feruloyl arabinoside, feruloyl esterase.

БИОХИМИЯ том 64 вып. 4 1999