Upload
tranduong
View
222
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
Individualitzaci de les dosis de
ganciclovir/valganciclovir per predicci bayesiana, a partir dun model farmacocintic poblacional en
pacients transplantats drgan slid
Ariadna Padulls Zamora
Aquesta tesi doctoral est subjecta a la llicncia Reconeixement- NoComercial CompartirIgual 3.0. Espanya de Creative Commons. Esta tesis doctoral est sujeta a la licencia Reconocimiento - NoComercial CompartirIgual 3.0. Espaa de Creative Commons. This doctoral thesis is licensed under the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0. Spain License.
FACULTAT DE FARMCIA
INDIVIDUALITZACI DE LES DOSIS DE
GANCICLOVIR/VALGANCICLOVIR PER PREDICCI
BAYESIANA, A PARTIR DUN MODEL
FARMACOCINTIC POBLACIONAL EN PACIENTS
TRANSPLANTATS DRGAN SLID.
ARIADNA PADULLS ZAMORA 2014
UNIVERSITAT DE BARCELONA
FACULTAT DE FARMCIA
PROGRAMA DE DOCTORAT RECERCA, DESENVOLUPAMENT I
CONTROL DE MEDICAMENTS
INDIVIDUALITZACI DE LES DOSIS DE
GANCICLOVIR/VALGANCICLOVIR PER PREDICCI BAYESIANA, A
PARTIR DUN MODEL FARMACOCINTIC POBLACIONAL EN
PACIENTS TRANSPLANTATS DRGAN SLID
Memria presentada per Ariadna Padulls Zamora per optar al ttol de doctor
per la Universitat de Barcelona
Les Directores de tesi:
Dra. Helena Colom Codina Dra. Nria Lloberas Blanch
La Tutora de tesi: La doctorand:
Dra. Helena Colom Codina Ariadna Padulls Zamora
2014
Les sotasignants, Dra Helena Colom Codina, Professora titular del Dpt. de
Farmcia i Tecnologia Farmacutica de la Universitat de Barcelona, Tutora i
Director de la present tesi; i Dra. Nria Lloberas Blanch, Co-Directora de la
present tesi.
FAN CONSTAR
Que la tesi Doctoral titulada: INDIVIDUALITZACI DE LES DOSIS DE
GANCICLOVIR/VALGANCICLOVIR PER PREDICCI BAYESIANA, A PARTIR DUN
MODEL FARMACOCINTIC POBLACIONAL EN PACIENTS TRANSPLANTATS
DRGAN SLID, realitzada a LHospital Universitari de Bellvitge (UB), sota la
nostra direcci per la llicenciada Ariadna Padulls Zamora per a optar al Grau de
Doctora en Farmcia, s en condicions de ser presentada i sotmesa a laprovaci
del tribunal convocat.
La qual cosa es fa constar per la present i a tots els efectes a Barcelona, 18 de
Novembre de 2014.
Dra Helena Colom Codina Dra. Nria Lloberas Blanch
Professora titular del Dpt. de Co-Directora de la tesi
Farmcia i Tecnologia Farmacutica
de la Universitat de Barcelona
Tutora i Directora de la tesi
Als meus pares i germana
AGRAMENTS
Aquesta tesi no shauria pogut dur a terme sense el treball en collaboraci.
Magradaria agrar a totes aquelles persones que han compartit amb mi la
realitzaci daquest projecte i que han fet possible que arribs fins aqu:
En primer lloc vull donar les grcies a les meves directores de tesi, la Nria
Lloberas, i lHelena Colom. Per donar-me loportunitat de participar en aquest
projecte de recerca, per tots els coneixements transmesos i el suport
incondicional. Moltes grcies pels vostres consells, pacincia i dedicaci en el
meu aprenentatge. Grcies Nria per la teva capacitat de motivaci i superaci
infinita. I a tu Helena, pel teu rigor cientfic, s un privilegi poder aprendre de tu.
Al Dr. Josep M Griny, ideleg del projecte, per haver-me donat la possibilitat i
confiana per dur a terme aquest projecte. Grcies per lesperit crtic, per
sempre constructiu, i la visi danlisi que han perms el desenvolupament
daquesta tesi.
Als metges del servei de Nefrologia de lHospital de Bellvitge i en especial als
responsables de la Unitat de Transplantament Renal. A lOriol, lEduardo, al Joan
i al Josep Maria, per reclutar la gran majoria de pacients transplantats renals i
realitzar el seguiment clnic durant lestudi. Merci per la vostra dedicaci i
disposici en tot moment.
A la unitat dassajos del Servei de Nefrologia, Eullia, Carol, M Jess i Meritxell.
Per tot el suport logstic en lorganitzaci del seguiment i les extraccions de
mostres als pacients. A lAnna, per la teva ajuda en tot moment i la pacincia en
la monitoritzaci de lestudi. Tamb a les infermeres dhospitalitzaci, que de
forma voluntria han extret mostres, per la sobrecrrega de treball que ha
suposat la realitzaci daquest estudi.
Al tot el grup del laboratori de Nefrologia, per acollir-me i ajudar-me en tot
moment. Sn un exemple magnfic de grup dinvestigadors. Voldria fer un
especial agrament a la Gema i la seva alegria, per les bones estones i daltres de
desesperaci davant lUPLC. Al Franc, pel suport analtic i a la Ins, per la seva
constncia, tot el temps invertit en lanlisi de les mostres i per la facilitat de
treballar conjuntament.
Al Ral, per lajuda en la determinaci analtica de les concentracions de GCV.
Grcies per respondre en els moments de crisi, sempre ens has ajudat i sense tu
no haurem pogut tirar endavant.
Als companys de la Unitat de Transplantament Heptic i Cardac, per la seva
collaboraci. De forma especial a la Nria Sab que tant bon punt vam iniciar
lestudi va estar disposada a reclutar pacients. Grcies per lajuda incondicional,
s un plaer treballar amb tu.
Al Jordi Niub, del Servei de Microbiologia, per lanlisi de les crregues virals i
avisar-me quan hi havia algun resultat positiu. Per la sobrecrrega de treball que
ha suposat la realitzaci daquest estudi i la seva collaboraci en lestudi durant
tot aquest temps.
Grcies a tots aquells que duna manera o una altra des dels meus inicis han anat
aportant-me coneixements i experincia, tant personals com professionals. Als
companys i amics del Servei de Farmcia de lHospital de Bellvitge que des de
que vaig arribar com a R1 han sigut una font de coneixement en tots els mbits.
Al Ramon, al Pep i a la Maybe, per donar-me la confiana i el suport per dur a
terme aquesta tesi. Als amics de residncia, amb els que he crescut professional i
personalment i amb els que he passat grans moments durant els anys de
formaci. A la Leti, la meva co-R, amb la que ens vam animar a iniciar el doctorat
i vam fer els dos primers anys juntes. A la Nria, la Sara, lEli i lEugnia, per la
seva constant ajuda i collaboraci. I tamb a tots els residents que sestan
formant, pel suport en el dia a dia. Al personal del Servei de Farmcia que
inconscientment, amb la feina diria em van facilitar fer el seguiment de la
medicaci dels pacients.
A tots els meus amics i companys, que sense saber-ho mhan ajudat en la
realitzaci daquest projecte. Grcies pels moments compartits i per comprendre
les absncies.
A la meva estimada famlia, pares i germana, per encoratjar-me i ajudar-me en
tots els meus projectes i animar-me a continuar en tot moment. Per
transmetrem la cultura de lesfor i dedicaci (sempre endavant).
Finalment, agrair a tots els pacients transplantats que de forma annima i
voluntria han participat en aquest estudi, sense ells no hauria estat possible la
realitzaci daquest estudi.
Aquesta tesis est basada en els segents articles.
I. Padulls A, Colom H, Armendariz Y, Cerezo G, Calds A, Pou L, Torras J,
Griny JM, Lloberas N. Determination of ganciclovir in human plasma by
ultra performance liquid chromatography-UV detection. Clinical
Biochemistry 2012;45(4-5):309-14.
II. Rigo-Bonnin R, Padulls A, Corral-Comesaa S, Cerezo G, Griny JM,
Colom H, Lloberas N, Ala-Ramos P. Measurement of ganciclovir
concentration in human plasma by ultra-performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chim Acta.
2013;427C:58-64.
III. Padulls A, Colom H, Calds A, Cerezo G, Torras J, Griny JM and Lloberas
N. Optimal sparse sampling for estimating ganciclovir/valganciclovir AUC
in solid organ transplant patients using NONMEN. Ther Drug Monit
2014;36(3):371-7.
IV. Padulls A, Colom H, Bestard O, Melilli E, Sab N, Rigo E, Niub J, Torras J,
Llad L, Manito N, Calds A, Cruzado JM, Griny JM and Lloberas N.
Contribution of population pharmacokinetics to dose optimization of
ganciclovir/ valganciclovir in kidney transplant patients. Manuscrit
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Padull%C3%A9s%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Colom%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Armendariz%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cerezo%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Caldes%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pou%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Torras%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Griny%C3%B3%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lloberas%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24120353
NDEX
1
INDEX
INDEX ....................................................................................................................... 1
ABREVIATURES ......................................................................................................... 3
I. INTRODUCCI ....................................................................................................... 7
1. CITOMEGALOVIRUS I TRANSPLANT DRGAN SLID ..................................... 9
1.1. FACTORS DE RISC ................................................................................... 9
1.2. EFECTES DEL CITOMEGALOVIRUS ....................................................... 12
1.3. PREVENCI DE LA INFECCI PER CMV ................................................ 14
1.4. TRACTAMENT DE LA MALALTIA PER CMV ........................................... 17
2. GANCICLOVIR I VALGANCICLOVIR ................................................................. 19
2.1. MECANISME DACCI I FARMACOCINTICA DEL GANCICLOVIR ............ 20
2.2. MONITORITZACI DEL GANCICLOVIR: ESTUDIS DEFICCIA I TOXICITAT CLNICA ........................................................................................................... 23
2.2.1. DETERMINACI ANALTICA DE GANCICLOVIR ............................... 26
2.2.2. ESTRATGIA DE MOSTREIG LIMITAT AMB GANCICLOVIR ............. 27
3. FARMACOMETRIA ......................................................................................... 28
3.1 FARMACOCINTICA POBLACIONAL ......................................................... 30
3.2. MODELS FARMACOCINTICS POBLACIONALS DE GANCICLOVIR ........... 32
4. ESTIMACI DE LEXPOSICI: INDIVIDUALITZACI DE LA DOSI MITJANANT LA UTILITZACI DUN PREDICTOR BAYESI. ..................................................... 35
4.1. CARACTERSTIQUES DEL MODEL APLICAT EN LA TESIS .......................... 35
4.2. AVALUACI DE LEXPOSICI ................................................................... 36
II. HIPTESI ............................................................................................................. 41
III. OBJECTIUS ......................................................................................................... 47
IV. RESULTATS ........................................................................................................ 53
Captol 1 ............................................................................................................ 55
Captol 2 ............................................................................................................ 63
Captol 3 ............................................................................................................ 73
Captol 4 ............................................................................................................ 83
V. DISCUSSI ........................................................................................................ 125
VI. CONCLUSIONS ................................................................................................. 145
VII. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................ 151
2
ABREVIATURES
3
ABREVIATURES
AUC: rea sota la corba de concentracions plasmtiques enfront el temps.
Cl: aclariment plasmtic
ClD1: aclariment intercompartimental
CLCR: aclariment de creatinina
CMV: citomegalovirus
D: donant
dGTP: trifosfat de desoxiguanosina
EBV: virus Epstein-Barr
F: biodisponibilitat
GCV: ganciclovir
HIV: virus de la immunodeficincia humana
HPLC: cromatografia lquida dalta eficcia
IC50: concentraci inhibitria 50
IL6: interleuquina 6
KA: constant dabsorci
OAT2: transportador danions orgnics tipus 2
PD: farmacodinmia
PEPT1: transportador de pptids intestinals tipus 1
PEPT2: transportador de pptids intestinals tipus 2
PCR: reacci en cadena de la polimerasa
PK: farmacocintica
R: receptor
TL: temps de latncia
Tmax: temps per assolir la concentraci plasmtica mxima
TNF-: factor de necrosi tumoral alfa
TOS: trasplantats drgan slid
UHPLC: cromatografia lquida dultra alta eficcia
UV: ultravioleta
ABREVIATURES
4
V2: volum de distribuci del compartiment central
V3: volum de distribuci del compartiment perifric
VGCV: valganciclovir
VVZ: varicella zoster
5
6
7
I. INTRODUCCI
8
INTRODUCCI
9
I. INTRODUCCI
1. CITOMEGALOVIRUS I TRANSPLANT DRGAN SLID
La immunosupressi desprs del trasplantament confereix una especial
susceptibilitat a infeccions virals. Epidemiolgicament, algunes sn resultat de
lexposici a la comunitat (influenza, adenovirus), altres sn transmeses amb
lempelt (citomegalovirus [CMV], virus Epstein-Barr [EBV]) i les ltimes sn
conseqncia de la reactivaci dinfeccions prvies (varicella, varicella zoster
[VVZ]). El CMV s el patogen viral ms com desprs del trasplantament i sense
tractament preventiu o profilctic, al voltant del 75% dels malalts transplantats
presenten infecci per aquest agent viral els primers 3 mesos desprs del
trasplantament.
1.1. FACTORS DE RISC
La infecci per CMV segueix essent una de les majors complicacions en receptors
de transplantament drgan slid (TOS) i es presenta entre el 30-80% dels
pacients1 tot i que la seva incidncia i les manifestacions clniques varien en
funci del tipus de transplantament, dels factors de risc de malaltia i de les
estratgies de prevenci.
Els principals factors de risc de malaltia per CMV (Taula 1) depenen de la
serologia del donant i receptor, del grau dimmunosupressi del receptor, de la
crrega viral i del tipus drgan transplantat. Aix doncs, els factors de risc ms
importants sn: a) transplantament de donant seropositiu a receptor
seronegatiu (D+/R-), b) immunosupressi amb corticosteroides i
immunoglobulines antitimoctiques utilitzades durant el tractament dinducci o
el rebuig i c) trasplantament dintest, pncrees i pulm.
INTRODUCCI
10
La serologia del donant i del receptor (IgG) sn els predictors clau del risc
dinfecci. El principal factor de risc, per desenvolupar una malaltia per CMV en
el post-transplantament s la combinaci dun receptor nave per CMV que rep
lempelt dun donant seropositiu per a CMV (D+/R-) essent el risc del 45% en
absncia de quimioprofilaxi. El CMV roman latent en moncits i macrfags
presents en diferents rgans de lanatomia i donat, que en el moment del
trasplantament, el receptor no presenta immunitat especfica, aquest
desenvolupa una infecci primria. En el cas de que tant el donant com el
receptor siguin seropositius (D+/R+), el risc de malaltia sense rebre profilaxis s
moderat (15-20%). Aquesta es pot presentar com a reactivaci o com a infecci
transmesa pel donant. Pel que fa a la situaci en que el donant s seronegatiu i
el receptor seropositiu (D-/R+), el risc tamb s moderat i la infecci es produeix
per reactivaci viral. El cas de risc ms baix, gaireb nul, s quan tant el donant
com el receptor sn seronegatius (D-/R-)2.
Altres factors pel desenvolupament de la malaltia per CMV sn el grau
dimmunosupressi rebuda, especialment ladministraci de terpia dinducci i
pel tractament del rebuig ja que condicionar la capacitat de resposta immune
efectiva enfront al virus. La terpia dinducci t lobjectiu devitar el rebuig i els
frmacs administrats actuen disminuint la proporci de precursors de cllules T.
La timoglobulina incrementa el risc de malaltia per CMV dun 15.7% al 28.3%3.
Per contra, les dades sobre el risc amb la terpia amb basiliximab sn
controvertides i probablement lincrement de risc s escs. En quan a la
immunosupressi de manteniment, la majoria dels estudis assumeixen que el
seu efecte s nul. La ciclosporina i el tacrolimus no solen donar lloc a una
reactivaci del CMV latent per si que poden accelerar la taxa de replicaci4. Els
inhibidors de la mTOR sassocien amb una disminuci de la incidncia de la
malaltia per CMV que es pot atribuir al bloqueig de certes quinases responsables
INTRODUCCI
11
de la sntesi proteica cellular, fet que podria impedir la sntesi de components
dels virions de CMV5,6.
La incidncia de malaltia s ms freqent en el trasplantament dintest,
pncrees i pulm que en lheptic, cardac i renal degut a que en lintest i
pncrees hi ha abundant teixit limfoide o macrfags amb una crrega elevada de
CMV latent o en replicaci7,8. Tamb shan descrit com a factors de risc les
coinfeccions amb altres herpesvirus i el rebuig de lempelt. Durant el rebuig es
secreten citoquines com el TNF- i interleuquina 6 (IL6) que actuen induint la
replicaci de CMV i el pas des de lestat de latncia a la fase replicativa9.
Taula 1. Factors de risc dinfecci per CMV en pacients TOS.
Infecci primria en receptors seronegatius (D+/R-)
Factors que afavoreixen la progressi de la malaltia
- Immunosupressors
Immunoglobulines antitimoctiques
Micofenolat
Metilprednisolona
- Factors virals
Crrega viral
Virus Herpes 6 (HHV6)
Virus Herpes 7 (HHV7)
- Factors immunolgics
Mutacions en els gens de TLR2 i TLR4
Deficincia en MBL o genotip associat a la baixa producci
Factors que afavoreixen la reactivaci de CMV en els receptors
INTRODUCCI
12
- Estrs
- Cirurgia
- Hiponatrmia intraoperatria
- Sepsis o Infeccions bacterianes greus (pneumococ o bactries gram-negatives)
- Coinfecci per altres virus
- Virus Herpes 6 (HHV6)
- Virus Herpes 7 (HHV7)
Factors que disminueixen la malaltia per CMV
- Immunitat del pacient enfront CMV abans del trasplantament
- Immunosupressors: inhibidors de mTOR (sirolimus i everolimus)
- Profilaxi antiviral
- Tractament antiviral preventiu o anticipat
1.2. EFECTES DEL CITOMEGALOVIRUS
La incidncia de la infecci per CMV en receptors TOS s del 30-80% i les
manifestacions clniques poden anar des de virmia asimptomtica fins a
malaltia teixit invasiva. El perode de mxim risc dinfecci est entre el primer i
el sis mes post-transplantament i la mxima incidncia es troba entre el segon i
tercer mes.
La infecci primria succeeix quan es detecta CMV en un individu que
prviament era seronegatiu mentre que la recurrncia de la infecci s el
resultat de la reactivaci del virus latent (endgena) o de la reinfecci (exgena).
En la infecci primria, la manca dimmunitat especfica del receptor condueix a
una replicaci viral augmentada normalment associada al desenvolupament de
malaltia per CMV. En el cas de les reactivacions, la immunitat humoral i cellular
del receptor redueix el procs replicatiu donant lloc a una menor incidncia i
INTRODUCCI
13
severitat de la malaltia, que noms es desenvolupa entre el 10 i 20% dels
pacients.
Globalment, la infecci per CMV s una de les principals causes de morbi-
mortalitat, secundries tant a la malaltia invasiva per CMV amb dany tissular i
cellular (efectes directes), com als efectes moduladors de CMV sobre el sistema
immune, que sn independents de la crrega viral (efectes indirectes) (Taula
2)10,11. Els efecte directes deriven de la infecci per CMV i es pot manifestar com
a virmia asimptomtica o com a malaltia per CMV. Aquesta ltima es considera
quan un pacient presenta infecci amb signes i smptomes associats. Aquests
smptomes poden presentar-se com un sndrome viral amb febre, leucopnia,
trombocitopnia i augment de les transaminases o b com a malaltia invasiva
amb pneumonitis, enteritis, meningitis, nefritis, retinitis, cistitis, miocarditis,
pancreatitis o encefalitis.
Els efectes indirectes estan causats per la resposta inflamatria amb producci i
alliberament de citoquines o per les alteracions en la resposta immune i resposta
inflamatria de l'hoste. La replicaci viral del CMV produeix una situaci
d'immunosupressi com a conseqncia de les alteracions funcionals en els
limfcits i moncits, modificant la capacitat de resposta i la producci de
citoquines. A ms, la infecci viral pot alterar lexpressi dantgens de superfcie
provocant rebuig i/o causant la desregulaci de la proliferaci cellular. Aquests
efectes indirectes shan descrit en tots el tipus de TOS i inclouen rebuig agut i
crnic (conegut com nefropatia del rony en transplantament renal, vasculopatia
de lempelt en el transplantament cardac i bronquilitis obliterant en el
transplantament pulmonar), arteriosclerosi, diabetis mellitus post-
transplantament, associaci de CMV amb altres infeccions (bacterianes o
fngiques) i malaltia cardiovascular. La infecci per CMV tamb s'ha associat a
l'activaci d'altres herpes virus com a herpes simple, VVZ, EBV (associat amb els
INTRODUCCI
14
sndromes limfoproliferatius associats al transplantament) o herpes virus
humans (HHV-6, -7, -8).
Taula 2. Efectes directes i indirectes de la infecci per CMV
Efectes directes de la infecci per
CMV
Efectes indirectes de la infecci per
CMV
Febre i neutropnia (leucopnia,
trombocitopnia, hepatitis, nefritis,
fatiga, milgia, febre,)
Mielosupressi
Neumonia
Malaltia enteroinvasiva amb colitis,
gastritis, lcera sagnat o perforaci.
Hepatitis
Pancreatitis
Corioretinitis
Augment del risc dinfecci
secundria bacteriana, fngica o viral
Augment del risc de rebuig
Augment del ric de desordre
limfoproliferatiu post-
transplantament
Augment del risc dinfecci per HHV-
6 i 7
Diabetis mellitus
Events cardiovasculars
1.3. PREVENCI DE LA INFECCI PER CMV
Les dos principals estratgies per la prevenci de la malaltia per CMV sn la
profilaxi universal i el tractament preventiu. Les dues estratgies presenten
avantatges i inconvenients (Taula 3). La profilaxi implica ladministraci de
valganciclovir (VGCV) oral o ganciclovir (GCV) intravens (iv) entre 3 i 6 mesos a
tots els pacients o aquells considerats de risc i sinicia en el post-transplantament
INTRODUCCI
15
immediat. La terpia anticipada o preventiva (preemtive therapy) consisteix en la
monitoritzaci setmanal de la crrega viral i en linici de VGCV oral o GCV iv en
cas de detecci de replicaci viral. La primera preveu la reactivaci daltres
herpesvirus aix com els efectes indirectes, per per contra lexposici
perllongada als antivirals pot incrementar el risc de resistncia i toxicitat i sha
relacionat amb malaltia tardana per CMV. La terpia preventiva pot contribuir a
reduir el cost i toxicitat associada a la medicaci antiviral per no preveu el
efectes indirectes de CMV i la seva aplicaci depn de la logstica de cada un dels
centres. La taula 3 presenta de forma comparativa els efectes beneficiosos y les
limitacions de la profilaxis universal vs el tractament preventiu12.
Taula 3. Comparaci del efectes beneficiosos i les limitacions de la profilaxis vs la
terpia preventiva
Efecte Profilaxis Preventiu
Malaltia per CMV
Malaltia tardana per CMV
Recidiva/Fracs del tractament
Menys infeccions oportunistes
Millor supervivncia de lempelt
Prevenci del rebuig
Supervivncia
Altres virus
Limfoma post-transplantament
Sarcoma de Kaposi
+++
++
++
+++
++
++
++
+
+
+
+++
-
++
+
-
-
-
-
-
-
INTRODUCCI
16
Seguretat
Logstica
Menor cost de frmacs
Menor cost de monitoritzaci
Resistncia a CMV
++
+++
+
+++
++
+++
+
+++
+
+
Facilitat daplicar i fora de levidncia essent +++ la de major evidncia i - quan no hi ha evidncia
Les recomanacions generals segons les guies de consens sn les segents12:
- En pacients D+/R- la profilaxi universal i terpia preventiva sn aplicables
malgrat la profilaxi universal est ms recomanada i podria tenir certs
avantatges. La duraci de la profilaxi ha de ser de 3 a 6 mesos i degut a
lelevat risc de malaltia tardana es recomana la terpia preventiva durant
els 3-6 mesos desprs de la finalitzaci de la profilaxi. La incidncia
dinfecci per CMV en pacients D+/R- sense tractament s del 50%13.
- En pacients R+ (amb D+ o D-) es recomana la terpia preventiva excepte
en aquells pacients delevat risc. Aix doncs, en els pacients que reben
transplantament de pulm o intest o que hagin rebut inducci amb
immunoglobulina antitimoctica es recomana profilaxis durant 3 mesos.
- Els pacients D-/R- es consideren de baix risc i no es recomana la profilaxi.
El frmac delecci per a la profilaxi s el VGCV oral a les dosis de 900 mg cada
24h. Tal com sindica a la Taula 4, aquestes dosis shan dajustar dacord a la
funci renal del pacient utilitzant la frmula de Cockcroft-Gault de manera que
ls daltres frmules pot implicar una infradosificaci14,15. Existeix un estudi que
INTRODUCCI
17
demostra que ls de la frmula modification of diet in renal disease MDRD pel
clcul del filtrat glomerular comporta una infraestimaci del 20% en el 63.6% de
la cohort estudiada i que potencialment resultaria en una infradosificaci de
VGCV en el 45.5% dels pacients16. Aquest fet s un factor de risc, que sha de
sumar als prviament descrits, per desenvolupar malaltia per CMV i ja shan
descrit alguns casos en la literatura17.
1.4. TRACTAMENT DE LA MALALTIA PER CMV
Les guies de consens publicades indiquen com a tractament delecci pel CMV el
VGCV oral o GCV iv1,12. Durant el tractament cal monitoritzar la funci renal i
ajustar les dosis de frmac utilitzant la frmula de Cockcroft-Gault com es mostra
a les Taules 4 i 5. Una dosificaci insuficient pot comportar una manca deficcia
clnica i el desenvolupament de resistncies18,19, mentre que dosis
suprateraputiques poden implicar increments de la toxicitat20.
Taula 4. Ajust posolgic de VGCV segons la funci renal
CL creatinina (mL/min) Dosi profilaxi Dosi Infecci
60 900 mg/24h 900 mg /12h
40-59 450 mg/24h 450 mg/12h
25-39 450 mg/48h 450 mg/24h
10-24 450 mg, 2 cops per setmana 450 mg/48h
INTRODUCCI
18
Taula 5. Ajust posolgic de GCV segons la funci renal
CL creatinina (mL/min) Dosi
>50 5 mg/kg/12h
25-50 2,5 mg/kg/12h
10-25 2,5 mg/kg/24h
La reducci de les dosis de VGCV o GCV per efectes secundaris com leucopnia
sha devitar sempre que sigui possible i abans de procedir a disminuir les dosis
es recomana reduir les dosis daltres frmacs mielotxics com sn el micofenolat
de mofetil, els inhibidors de mTOR (sirolimus i everolimus) i/o cotrimoxazol. En
cas de leucopnies severes, amb recompte absolut de neutrfils inferior a 1000
L-1, caldria considerar ls de factors estimulants de granulcits.
La duraci ptima del tractament depn de la resposta clnica i virolgica. La
quantificaci de la crrega viral mitjanant la reacci en cadena de la polimerasa
(PCR) sha de determinar setmanalment per tal de monitoritzar la resposta al
tractament i el desenvolupament de resistncies a GCV. Es recomana mantenir el
tractament durant mnim dues setmanes i fins que la crrega viral sigui negativa,
essent necessari obtenir dos resultats negatius separats una setmana per
assegurar laclariment viral21,22,23. En alguns casos, un cop finalitzat el tractament,
es duu a terme una profilaxi secundria amb VGCV oral durant dos o tres mesos
en funci dels factors de risc de presentar recurrncia (infecci primria, crrega
viral basal elevada, persistncia de virmia a linici de la profilaxi secundria,
afectaci multiorgnica i increment de la immunosupressi degut a la terpia pel
rebuig)24,21.
INTRODUCCI
19
Laparici de resistncies al tractament shan descrit principalment en la
subpoblaci de pacients D+/R- en la qual, la incidncia desprs de la virmia s
del 5-12% i s superior en els pacients receptors de transplantament de
pulm25,26,27. Les resistncies estan relacionades amb mutacions en el gen UL97 i
UL54. Les presentacions clniques inclouen des de casos asimptomtics fins a
infeccions severes. Els factors de risc descrits sn: exposici perllongada a
frmacs antivirals i replicaci viral activa, elevada immunosupressi o exposici
inadequada a lantiviral28. Durant la profilaxis la incidncia de resistncia s
baixa, essent del 0 al 3%29.
2. GANCICLOVIR I VALGANCICLOVIR
El GCV s un anleg del nuclesid acclic de la guanina (Figura 1) considerat com
a primera lnea pel tractament i profilaxi enfront a infeccions per CMV en
pacients immunodeprimits i lestndard per la prevenci i tractament de CMV en
pacients TOS30. Ladministraci de GCV oral t una baixa biodisponibilitat i com a
conseqncia s necessria ladministraci iv i lhospitalitzaci del pacient i est
associat a un elevat cost, augmentant de la incidncia dinfeccions de catter i
molsties pel pacient.
Aquests motius van portar a la necessitat de desenvolupar el VGCV, un profrmac
del GCV. El VGCV s l1-valil ster del GCV (Figura 1) i s substrat dels
transportadors de pptids intestinals31,32 la qual cosa fa que presenti una
biodisponibilitat superior a la del GCV oral. En el tractament profilctic, els
resultat dels estudis dequivalncia de Wiltshire H i col33 van mostrar que
desprs de ladministraci de VGCV oral sassoleixen exposicions a GCV superiors
a les obtingudes desprs de ladministraci de GCV oral i sassocien a una
superioritat en leficcia al tractament34. Pel que fa al tractament de la malaltia
per CMV, en lestudi VICTOR24 es va demostrar la no inferioritat en leficcia de
INTRODUCCI
20
VGCV oral (900 mg/24h) vs GCV iv (5 mg/Kg/12h) en pacients TOS. El perfil de
seguretat va ser similar en els dos grups.
Figura 1. Estructura qumica
Ganciclovir Valganciclovir
2.1. MECANISME DACCI I FARMACOCINTICA DEL GANCICLOVIR
El GCV s un anleg del nuclesid acclic de la guanina que actua inhibint la
replicaci viral. Competeix amb el trifosfat de desoxiguanosina (dGTP), substrat
de la DNA polimerasa20 que s responsable de la sntesis del DNA viral. Per aix,
el GCV requereix una activaci prvia en forma de fosforilacions. La Figura 2
mostra les etapes dactivaci del frmac. El GCV entra en les cl.lules infectades
mitjanant transportadors de nuclesids i una vegada dins s fosforilat a GCV
monofosfat (etapa limitant) per una protena codificada per la UL97. A
continuaci s fosforilat a GCV di i tri-fosfat a travs de lacci de quinases
cellulars humanes. El GCV trifosfat s el responsable de la inhibici de la
replicaci viral. Daltra banda, tal com es descriu en la segent figura, desprs de
ladministraci oral de VGCV, aquest es transforma en GCV i s aquest ltim el
que actua inhibint la replicaci viral (Figura 2).
INTRODUCCI
21
Figura 2. Esquema representatiu de les etapes de trnsit i bioactivaci del GCV i
VGCV a lorganisme desprs de les respectives administracions IV i oral i del
mecanisme dacci una vegada accedeixen a les cllules infectades.
dGP=desoxiguanina trifosfat; GCV=ganciclovir; PEPT1=transportadors de pptids
intestinals; P-GCV=GCV monofosfat; PP-GCV=GCV bifosfat; PPP-GCV=GCV
trifosfat; VGCV=valganciclovir.
GCV
TRACTE GASTROINTESTINAL
VGCV
MEMBRANA GASTROINTESTINAL Transportador PEPT1
SANG
Hidrolasa Valaciclovirasa
Valina
CLLULA
MEMBRANA CELLULAR Nucleobase amb
Transportadors de nuclesids
GCV
P-GCV
PP-GCV
PPP-GCV
Quinasa viral
Quinasa cellular
Quinasa cellular
Inhibici de la sntesis DNA viral
DNA polimerasa viral
PURINA CELLULAR ENDGENA
dGTP
DNA VIRAL
INTRODUCCI
22
El GCV presenta una potent activitat antiviral enfront CMV. Malgrat t un
mecanisme dacci similar a laciclovir, s 26 vegades ms potent enfront al CMV
en base a la concentraci necessria per assolir la inhibici del 50% de la crrega
viral (IC50). Les concentracions intracellulars de GCV trifosfat en cllules
infectades sn aproximadament 10 vegades superiors a les existents en cllules
no infectades. La replicaci viral s inhibida in vitro (IC50) a concentracions entre
0.1 i 1.6 mg/L35,36.
El comportament farmacocintic (PK) del GCV sha caracteritzat en diferents
poblacions (voluntaris sans, pacients de SIDA i pacients transplantats)37,38,39, i els
primers estudis es van dur a terme en voluntaris sans o pacients HIV37. El GCV
administrat per via iv presenta un perfil de disposici biexponencial, amb una
fase inicial que reflexa una distribuci relativament rpida a teixits, i una fase de
disposici terminal ms lenta que reflexa la seva cintica deliminaci. La majoria
destudis PK que utilitzen laproximaci compartimental han descrit el perfil PK
del GCV amb un model de dos compartiments37.
La seva eliminaci s principalment per excreci renal de forma inalterada (87%),
per filtraci glomerular i secreci tubular activa mitjanant els transportadors
danions orgnic tipus 2 (OAT2)40. Per aquest motiu laclariment de GCV es
correlaciona directament amb la funci renal determinada pels valors de
laclariment de creatinina (CLCR). Aquest fet obliga a lajust de dosi per la funci
renal. La seva uni a protenes plasmtiques s baixa (1-2%) dins dun marge de
concentracions de 0-5-51 mg/L20. La relaci entre concentracions en eritrcits i
plasma s molt propera a 1 (0.8) i lequilibri de distribuci entre concentracions
plasmtiques i dins de leritrcit sassoleix rpidament41. En un dels primers
estudis PK realitzats en 4 pacients receptors de transplantament renal38, els
valors de semivida associats a la fase de disposici inicial rpida (fase alfa) van
ser de 0.29-0.47 h, la semivida associada a la fase de disposici lenta (fase beta)
INTRODUCCI
23
o eliminaci va ser de 4.29 a 10.3 h, el volum de distribuci en compartiment
central va presentar valors de 0.22 a 0.29 L/kg, el volum de distribuci en estat
estacionari va ser de 0.63 a 0.82 L/kg i els valors de laclariment plasmtic de
0.04-0.13 L/h/kg.
El GCV administrat per via oral presenta una biodisponibilitat baixa,
daproximadament el 5.6%, fet que limita lexposici sistmica. Per obtenir una
exposici del 40-50% de lobtinguda via iv a dosis de 5 mg/Kg/24h s necessria
ladministraci de 1g/8h de GCV oral42,43. A diferncia del GCV, el VGCV presenta
una biodisponibilitat 10 vegades superior al GCV (66%10%) degut al
reconeixement com a substrat dels transportadors de pptids intestinals (PEPT1 i
PEPT2). Quan sabsorbeix s rpidament hidrolitzat a GCV per acci duna
hidrolasa dsters daminocids (valaciclovirasa)44,45 present tant a la paret
intestinal com al fetge, de forma que VGCV no es troba com a tal en circulaci
sistmica46,47. El GCV entra a la cllula a travs del transportador de nuclesids.
La cintica dabsorci/transformaci del VGCV ha estat descrita com dordre en
la majoria destudis33,48. La presncia duna dieta rica en greixos afavoreix
laugment de la biodisponibilitat del GCV en comparaci amb ladministraci en
dej sense que sobservi un increment significatiu del temps per assolir la
concentraci plasmtica mxima (tmax)49.
2.2. MONITORITZACI DEL GANCICLOVIR: ESTUDIS DEFICCIA I TOXICITAT
CLNICA
Shan dut a terme diferents estudis farmacocintics-farmacodinmics (PK/PD)
clnics en la poblaci de transplantats amb lobjectiu dinvestigar la relaci de
lexposici sistmica a GCV i la prevenci de la virmia, malaltia per CMV i
laparici defectes adversos. En el primer estudi publicat50 es va avaluar
INTRODUCCI
24
leficcia en la prevenci de la malaltia per CMV de 900 mg/24h de VGCV oral vs
1000 mg/8h de GCV oral en pacients TOS dalt risc immunolgic (D+/R-) (N=364).
Els resultats van mostrar que leficcia era similar entre els dos grups de
tractament amb un perfil de seguretat comparable. Tamb van observar que els
valors dAUC desprs de ladministraci de VGCV oral eren superiors als
obtinguts desprs de ladministraci de GCV oral i els autors ho van relacionar
amb la millor supressi de la virmia i el retard en les primoinfeccions en
comparaci amb el grup GCV oral. Els efectes adversos reportats van ser
hematolgics, principalment leucopnia i neutropnia seguit de plaquetopnia i
anmia.
Amb aquestes mateixes dades, Wiltshire H i col34 van realitzar un estudi PD per
relacionar les exposicions obtingudes amb leficcia i toxicitat. Van demostrar
que la supressi de la virmia durant el tractament profilctic estava relacionat
amb lexposici a GCV estimat a travs lrea sota la corba de les concentracions
plasmtiques enfront del temps (AUC). Dacord amb aquests autors, valors
dAUC de 40-50 gh/mL permeten la supressi de la virmia durant el
tractament profilctic i redueixen la incidncia del desenvolupament de la
mateixa un mes desprs de finalitzar el tractament a valors dun 20% i 10% per a
valors dAUC de 33 i 50 gh/mL, respectivament. En lestudi sobre la
mielotoxicitat es va observar una tendncia a una menor incidncia danmia
per major incidncia de leucopnia i neutropnia en els pacients tractats amb
VGCV oral. La correlaci entre lexposici i laparici defectes adversos va
mostrar que noms hi havia una dbil tendncia a augmentar la neutropnia i
leucopnia amb lincrement de lexposici a GCV.
Posteriorment, en lestudi VICTOR24 es va estudiar leficcia del tractament de la
malaltia per CMV amb 900 mg/12h de VGCV oral vs 5 mg/Kg/12h de GCV iv
durant 21 dies seguit de tractament amb VGCV oral fins al dia 49 en tots els
INTRODUCCI
25
pacients TOS (N=321). Es va demostrar la no inferioritat de VGCV oral per no es
va relacionar amb dades dexposici al frmac. El temps mig deradicaci va ser
de 21 dies pel grup VGCV oral vs 19 dies pel grup GCV iv i les discontinuacions de
tractament van ser similars en les dos branques de tractament. La incidncia
defectes adversos va ser similar i els principalment reportats en els dos grups
van ser anmia, leucopnia, infecci del tracte urinari i diarrea.
En lestudi de seguiment dels pacients inclosos en lestudi VICTOR es van avaluar
els resultats del tractament a lany i sincloen les variables de recurrncia,
resistncia a GCV i supervivncia. Els resultats van mostrar que les taxes de
recurrncia (15.1%) eren independents del tractament inicial i que el factor
predictor de recurrncia en lanlisi multivariant era la persistncia de la virmia
al dia 21 dinici del tractament de la malaltia per CMV. Pel que fa a laparici de
resistncies i a lanlisi de supervivncia, no hi van haver diferncies en les dos
branques de tractament.
Les guies de consens sobre la prevenci i tractament de CMV remarquen la
necessitat de la dosificaci adequada per evitar la ineficcia i laparici de
toxicitat12. Malgrat aix, no indiquen la necessitat de la monitoritzaci dels
nivells de GCV en plasma, per a la posterior optimitzaci de dosis en cas dinfra o
sobreexposici, en base als estudi PD que defineixen com a diana teraputica un
AUC=40-50 gh/mL. Tot i aix, existeixen a la literatura autors que remarquen la
necessitat de monitoritzar els nivells principalment en aquells pacients amb
infeccions per CMV greus51.
Existeixen casos en que shan monitoritzat les concentracions predosi de GCV
per no hi ha cap estudi que demostri la correlaci entre la predosi i lexposici.
Calds A i col52 van demostrar la necessitat dajust de dosi en base als nivells
plasmtics de GCV per poder assolir lAUC diana i segons la funci renal. En la
INTRODUCCI
26
poblaci de pacients peditrics tamb shan analitzat les exposicions assolides en
base a diferents algoritmes de dosificaci inicial i alguns autors conclouen la
necessitat de la monitoritzaci PK degut a lelevada variabilitat observada53.
2.2.1. DETERMINACI ANALTICA DE GANCICLOVIR
Tot i que GCV sigui un frmac no incls en la rutina de monitoritzaci PK per
ajust de dosis segons ens nivells plasmtics, existeixen a la literatura diversos
mtodes per a la determinaci analtica de GCV.
Shan publicat diversos mtodes cromatogrfics emprant la cromatografia lquida
dalta resoluci (HPLC) acoblada a diferents detectors per a la detecci de GCV el
plasma, srum i altres fluids biolgics54,55,56,57,58,59,60,61. Alguns dels inconvenients
daquests mtodes es podrien resumir en: temps llargs de preparaci de les
mostres, necessitat dutilitzar tcniques dextracci per aconseguir lmits de
quantificaci ms baixos, requeriment dun volum de mostra de plasma gran
(250-1000 L), procs danlisi de llarga duraci, lmit de quantificaci elevat o
relativa baixa sensibilitat.
Per superar tots aquests els inconvenients calen noves tcniques analtiques
validades per a la quantificaci amb precisi i exactitud de GCV en plasma de
forma rutinria. En la prctica clnica rutinria s fonamental disposar de
tcniques que no suposin un gran consum de temps, que requereixi poc volum
de mostra, que siguin suficientment sensibles i en definitiva que no representin
costos molt elevats.
INTRODUCCI
27
2.2.2. ESTRATGIA DE MOSTREIG LIMITAT AMB GANCICLOVIR
La determinaci de lAUC o de qualsevol altre parmetre PK per un determinat
pacient requereix lextracci intensiva de mostres, s a dir, el nmero suficient
per poder descriure correctament totes les fases de la corba (absorci, disposici
rpida i disposici lenta) i estimar els parmetres amb fiabilitat i robustesa. No
obstant, el mostreig intensiu (8-10 mostres per pacient) no s aplicable en la
rutina clnica habitual ja sigui per motius tics, de temps i econmics i donat que
aix implicaria lhospitalitzaci del pacient.
Una aproximaci molt utilitzada per evitar el mostreig intensiu sn les
estratgies de mostreig limitat basades en predir el valor de lAUC amb la
mxima robustesa possible a partir de poques mostres obtingudes de cada
pacient. No hi ha una norma establerta sobre el nmero de mostres ptim
perqu aix depn fonamentalment de la cintica dels processos dabsorci i de
disposici de cada frmac i de lobjectiu concret de lestudi que es vol dissenyar.
Per garantir la mxima qualitat de vida pel pacient la situaci ideal seria entre
una i tres mostres per pacient. A ms, s convenient que les mostres sextreguin
durant les 8 hores posteriors a ladministraci del frmac per evitar
lhospitalitzaci i reduir costos. Un altre factor que pot condicionar els temps de
mostreig a escollir s la sensibilitat de la metdica analtica de que es disposa,
donat que les concentracions als temps seleccionats han de ser superiors al lmit
inferior de quantificaci de la tcnica analtica.
A la literatura existeixen nombrosos articles referents a mtodes per establir
estratgies de mostreig limitat amb diferents frmacs62,63. Clssicament
sutilitzaven tcniques de regressi lineal combinades amb clcul dAUCs
mitjanant lanlisi no compartimental64. Actualment, el desenvolupament de
laproximaci danlisi PK poblacional mitjanant els models defectes mixtes no
INTRODUCCI
28
lineals, combinat amb la predicci bayesiana ha marcat un canvi en la
metodologia emprada donant molt bons resultats65. En aquest sentit tamb cal
destacar lexistncia dalgoritmes que, a partir dun model poblacional
prviament desenvolupat, permeten estimar els temps ptims dobtenci de
mostra dins dun disseny destratgia limitada per predir el valor dAUC amb la
mxima exactitud respecte al valor calculat a partir dun mostreig intensiu
mitjanant la matriu dinformaci de Fisher (PFIM)66,67,68,69. Linconvenient
daquests mtodes s que, en ocasions, els temps ptims des dun punt de vista
matemtic no sn compatibles amb la prctica clnica.
En el cas de GCV, Wiltshire H i col33,50 ja van emprar una estratgia de mostreig
limitat per a desenvolupar el model PK i PD de GCV utilitzant tres finestres de
mostreig per visita: 1-3 h, 5-12 h i aproximadament 24 h postdosi.
Posteriorment, Perrottet N i col van desenvolupar un model PK poblacional
utilitzant dades de concentraci de GCV extretes a la predosi i a les 3h postdosi48
i els segents estudis PK/PD tamb van utilitzar dos temps de mostreig essent un
dells la predosi70,71. Tot i aix, la selecci dels punts de mostreig no es basen en
una estratgia prviament dissenyada i avaluada.
3. FARMACOMETRIA
Al llarg del temps shan emprat diverses metodologies danlisi de dades en
estudis PK/PD. Actualment i des de fa algun temps sha introdut el terme de
Farmacometria que es defineix com la cincia de desenvolupar i aplicar mtodes
estadstics i matemtics per caracteritzar, comprendre i predir la PK, la PD i el
comportament dels biomarcadors dun determinat frmac72. Les aproximacions
ms utilitzades en lanlisi de dades procedents destudis PK sn laproximaci
no compartimental, laproximaci compartimental clssica i laproximaci
poblacional. La principal utilitat de lanlisi PK en la prctica rutinria s com a
INTRODUCCI
29
eina de suport en la individualitzaci de la dosi durant la monitoritzaci
teraputica.
Figura 3. Eines danlisi PK per la individualitzaci de la dosis.
Tal com indica la figura 3, la individualitzaci de la dosi requereix, en una primera
etapa, la caracteritzaci des dun punt de vista PK del frmac en la poblaci diana
a la que va destinat. Aix es pot dur a terme amb mtodes de dos etapes o b
amb mtodes duna sola etapa. En els mtodes en dos etapes primer sestimen
els valors individuals dels parmetres per mtodes no compartimentals o
compartimentals i en una segona etapa es fa una estadstica descriptiva que
proporciona els valors de tendncia central o poblacionals dels parmetres i la
variabilitat associada (desviaci estndard). A ms, mitjanant tcniques
destadstica multivariant es busquen possibles correlacions entre covariables i
els parmetres PK. Aquests mtodes presenten els segents inconvenients i)
requereixen molta informaci o punts experimentals per pacient, ii) sobtenen
Aproximacin en dos etapas Anlisi en dos etapes Aproximacin en dos etapas Anlisi en una etapa
Aproximaci estndard clssic RNL:WinNonlin
EMVndar
IT2S NONMEM,
SAEM II
Mtodes paramtrics, Non-linear-mixed-effects-
models: NONMEM, Monolix, S-PLUS, R, Phoenix, S-ADAPT
Mtodes no paramtrics:
P-metrics, NONMEM
Modelo
Estimacin Bayesian
Model Farmacocintic poblacional
Estimaci Bayesiana de mxima probabilitat a posteriori
Validaci Estudi prospectiu
Mo
del
itza
ci
po
bla
cio
nal
INTRODUCCI
30
valors sobreestimats de la variabilitat associada als parmetres PK estimats i iii)
els valors dels parmetres estimats shan dimplementar en un programa de
predicci Bayesiana a posteriori per poder utilitzar aquesta informaci en lajust
de dosi. Malgrat aquests mtodes es van utilitzar en el passat ara han quedat
obsolets.
Per contra, els mtodes duna sola etapa sn prpiament els que es consideren
poblacionals dacord amb el que es descriu en el segent apartat.
3.1 FARMACOCINTICA POBLACIONAL
La PK poblacional es defineix com lestudi de les fonts de variabilitat en les
concentracions de frmac entre individus que reben un rgim de dosificaci
estndard. Aquesta aproximaci permet analitzar simultniament la informaci
de tots els subjectes en la poblaci destudi, i a) estimar el valor promig dels
parmetres PK, b) quantificar tant la magnitud de la variabilitat associada als
parmetres PK dins de la poblaci destudi com la contribuci de determinades
caracterstiques individuals (pes corporal, edat, sexe), fisiopatolgiques
(parmetres relacionats amb la funcionalitat renal o heptica) o teraputiques (la
presncia de tractaments concomitants) a aquesta variabilitat c) estimar la
variabilitat o error associat a les concentracions experimentals73,74.
Ofereix la possibilitat defectuar anlisis simultanis integrant tota la informaci
PK dun frmac, no noms a partir de dades procedents de dissenys de mostreig
relativament dispersos ("sparse data") sin tamb a partir de dades procedents
de dissenys intensius ("dense/rich data") o a partir de la combinaci dambds,
dissenys balancejats amb el mateix nmero de mostres per individus vs dissenys
no balancejats, aix com destudis que estan normalment exclosos degut a que el
seu disseny no permet lanlisi PK clssic.
INTRODUCCI
31
Tal com es resumeix en la Figura 3, dins dels mtodes poblacionals nhi ha que
utilitzen laproximaci paramtrica que assumeix distribuci normal o logo-
normals dels parmetres PK i laproximaci no paramtrica que no fa
assumpcions de normalitat i permet la identificaci de subpoblacions, que no es
podria fer amb laproximaci paramtrica. Malgrat tot, laproximaci
paramtrica s la ms emprada tal i com ho demostra el gran nombre destudis i
de publicacions que lhan utilitzat durant els ltims anys75.
El programa ms emprat s el NONMEM (Universitat de California, San Francisco,
Beal i Sheiner76) que t implementats els models no lineals defectes mixtes. No
lineal es refereix al fet que la variable depenent (concentracions) est
relacionada de manera no lineal amb els parmetres del model i a les variables
independents. Efectes mixtes es refereix a la parametritzaci: els parmetres
que no varien entre els individus sn denominats efectes fixes i els parmetres
que varien entre els individus sn denominats efectes aleatoris77. Aix els efectes
fixes corresponen als parmetres PK i coeficients de regressi de les covariables
que descriuen part de la variabilitat interindividual deguda a caracterstiques
individuals conegudes i els efectes aleatoris corresponen a la variabilitat
associada als parmetres i residual associada a les concentracions. Aquesta
aproximaci, permet lanlisi simultani de totes les dades per estimar els valors
dels parmetres PK (efectes fixes) i de la variana associada a les distribucions
dels efectes aleatoris interindividuals () i residuals ().
Mtodes destimaci Bayesiana a posteriori
Una vegada caracteritzat el comportament PK poblacional s possible estimar els
valors individuals dels parmetres PK en cada un dels pacients que pertanyen a la
poblaci destudi, mitjanant mtodes de predicci bayesiana a posteriori78.
Aquesta metodologia ha estat la ms emprada com a suport durant la
INTRODUCCI
32
monitoritzaci teraputica per la individualitzaci de la dosi en els ltims 40
anys. Laproximaci Bayesiana permet predir els valors individuals dels
parmetres i concentracions desprs dun rgim de dosificaci donat (funci de
distribuci de la probabilitat a posteriori) en base a la informaci PK poblacional
prvia (funci de distribuci de la probabilitat a priori) i dinformaci
experimental del pacient com sn les seves caracterstiques individuals,
particularment aquelles que siguin predictives del comportament PK i dalgunes
dades de concentraci plasmtica vs temps (2-3 valors).
Els mtodes destimaci Bayesiana permeten per tant i) predir les
concentracions individuals desprs dun determinat regim de dosificaci i en
funci daix reajustar la dosi ii) comparar els valors de concentracions predites
amb els observats, la qual cosa representa una validaci del model emprat tal
com es descriu tamb a la figura 3, iii) presenten molta flexibilitat en quan als
temps experimentals de presa de mostra i iv) reutilitzar els valors de
concentraci vs temps registrats durant el procs per afegir a la informaci
poblacional i millorar el model poblacional prviament desenvolupat.
3.2. MODELS FARMACOCINTICS POBLACIONALS DE GANCICLOVIR
Laproximaci dels models defectes mixtes no lineals implementada al programa
NONMEM sha aplicat per lestudi PK poblacional, dut a terme a partir de dades
de concentraci srica de GCV vs temps en diferents poblacions destudi: adults
receptors SOT, adults seropositius pel virus de la immunodeficincia hum (HIV) i
en poblaci peditrica receptors SOT. Concretament existeixen en la literatura
quatre models PK poblacionals de GCV per a la poblaci de pacients adults
receptors SOT. A la taula 6 es mostren les diferncies entre el models descrits i
els valors dels parmetres poblacionals, tant els defectes fixes o valors
INTRODUCCI
33
poblacionals dels parmetres PK com els defectes aleatoris, es a dir,
representatius de la variabilitat interindividual i residual.
El primer de tots es va desenvolupar lany 1995 en pacients amb retinitis per
CMV que eren HIV positius (53 pacients) o receptors SOT (7 pacients)79. El segon
model publicat33 es va incloure en lestudi IMPACT80 i les dades dels pacients es
van extreure dun assaig clnic randomitzat, doble cec, que avaluava leficcia i
seguretat de VGCV oral comparat amb GCV oral per a la prevenci de la malaltia
per CMV en pacient SOT dalt risc immunolgic (D+/R-)81. Els dos ltims models
es van publicar al 2009 i van incloure pacients receptors SOT sota tractament
profilctic o per malaltia per CMV. En el primer publicat per Perrottet N i col48 els
pacients estaven sota tractament profilctic i el disseny de mostreig va ser limitat
(2 mostres per pacient), per amb un nmero de pacients relativament elevat
(N=65), mentre que en el segon publicat per Calds i col52, els pacients estaven
en tractament per infecci o malaltia per CMV, la mostra era ms petita (N=20) i
el mostreig va ser intensiu (12 mostres per pacient).
INTRODUCCI
34
Taula 6. Caracterstiques dels models PK poblacionals en adults receptors SOT publicats.
Model 179 Model 233 Model 348 Model 452
Poblaci Pacients HIV o SOT amb retinitis per CMV
Pacient SOT dalt risc immunolgic (D+/R-)
Pacient SOT Pacient SOT
Tipus de tractament Tractament de la retinitis per CMV Profilaxis de CMV Profilaxis i tractament de la malaltia per CMV
Tractament de la malaltia per CMV.
Frmac administrat GCV iv GCV i VGCV oral GCV iv i VGCV oral GCV iv i VGCV oral. Mostres obtingudes Mostreig intensiu en una ocaci:
0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 15 i 24h post inici de la infusi
Mostreig dispers en dos ocasions: 1-3h, 5-12 i 24h post dosi
Mostreig dispers setmanal si tractament o mensual si profilaxis: predosi i 3 h post administraci.
Mostreig intensiu en 2 ocasions: Predosi, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6 i 12 h post inici de la infusi de GCV iv i post administraci de VGCV oral.
Comportament PK Bicompartimental Eliminaci dordre 1
Bicompartimental
Bicompartimental
Bicompartimental
Valors dels parmetres PK poblacionals Parmetres farmacocintics
CL 0.168; 0.168WT(CLCRC-G/100) (1-T)(1-CMV) + 0.382
SOT: T=0.76, CMV=0 HIV: T=0, CMV=0.41
V2 0.391WT V3 0.511WT
CLC-G 12.4 L/h V2 25 L CLD1 12 L/h V3 49 L KA 0.36 h
-1 LT 0.661 h
CL empeltCLCRMDRD1.21 (empelt: kidney 1.68, heart 0.86, lung and liver 1.17) V2 24(pes/70)0.72 L CLD1 4.1 L/h V3 19.6 L KA 0.65 h-1 F1 0.6
CL 7.49 L/h; 7.49(CLCRC-G/57) V2 31.90 L CLD1 10.20 L/h V3 32.0 L KA 0.895 h
-1 F1 0.825 LT 0.382 H
Variabilitat interindividual
2 V2 0.075
2 CL 0.182 2 V2 0.642
2 CL 0.26 2 V1 0.2
2 CL 0.107 2 V2 0.227 2 KA 0.464 2 F1 1.54
Variabilitat residual Proporcional Proporcional 1 Proporcional 1 Additiu 1 Proporcional 22
CL = aclariment; V2 i V3 = volum de distribuci central i perifric; WT = weight (Kg); C-G=Cockcrott-Gault
Per al model 4: CLD1 = aclariment intercompartimental entre el compartiment centra i perifric; KA = constant dabsorci de primer order; F = biodisponibilitat; LT = temps de latncia; 2 = variana
de la variabilitat interindividual; 1 = desviaci estndard del component additiu de la variabilitat residual; 22 = variana del component proporcional de la variabilitat residual; CLCR = aclariement
de creatinina en mL/min calculat amb Cockcroft-Gault; 57 = promig.
INTRODUCCI
35
4. ESTIMACI DE LEXPOSICI: INDIVIDUALITZACI DE LA DOSI MITJANANT
LA UTILITZACI DUN PREDICTOR BAYESI.
Els models poblacionals explicats en lapartat 3.2 mostren les covariables que
influencien la PK de GCV en pacients TOS per noms en el de Calds A i col52 es
proposa la utilitzaci del model com a predictor bayesi de forma prospectiva.
Van desenvolupar un model PK poblacional en la poblaci de pacients
trasplantats SOT infectats per CMV i en tractament amb GCV iv seguit de VGCV
via oral a partir de dades concentraci temps (12 punts per pacient i via
dadministraci) i van utilitzar el model per avaluar la dosificaci descrita pel
fabricant. Van simular els valors dexposici assolits desprs de ladministraci de
GCV i VGCV i en base a lexposici diana descrita per Wiltshire H i col33, es va
estimar lassoliment de lobjectiu teraputic.
4.1. CARACTERSTIQUES DEL MODEL APLICAT EN LA TESIS
Degut a que en aquesta tesi es realitza laplicaci del model PK desenvolupat per
Calds A i col52 en la prctica clnica, aquest sexplica ms detalladament a
continuaci.
El comportament PK del GCV desprs dambds administracions iv i oral, es va
descriure dacord amb un model bicompartimental amb una eliminaci de
primer ordre des del compartiment central, parametritzat en termes
daclariment plasmtic (Cl), volum de distribuci del compartiment central (V2),
aclariment intercompartimental (ClD1), volum de distribuci del compartiment
perifric (V3), constant dabsorci (KA), biodisponibilitat (F) i temps de latncia
(TL).
INTRODUCCI
36
Lanlisi de les dades va identificar laclariment de creatinina (CLCR) com a
predictor de laclariment del GCV (Cl) de forma que CLCR va explicar el 52.03% de
la variabilitat interindividual trobada en laclariment del frmac, que es va reduir
dun 68.19% a un 32.71% respecte al model base. No es va trobar cap influncia
del pes en els valors de Cl, com shavia descrit en al literatura anteriorment. Aix
probablement va ser degut a lestret marge de variaci en els valors del pes dins
dels pacients inclosos en lestudi. La taula 6 mostra els valors dels parmetres PK
poblacionals obtinguts en aquest estudi.
4.2. AVALUACI DE LEXPOSICI
A partir del model desenvolupat i utilitzant leina de la simulaci van avaluar el
rgim de dosificaci. Concretament, van determinar el percentatge de pacients,
que segons funci renal (CLCLR), presentaven valors dAUC entre 40-50 gh/mL.
Van realitzar una comparaci de les exposicions assolides seguint la fitxa tcnica i
seguint lestratgia dajustar les dosis en base al model PK poblacional.
Els resultats de lavaluaci van demostrar que desprs de ladministraci iv de
GCV segons fitxa tcnica, els percentatges de pacients amb AUC entre 40 y 50
gh/mL van ser noms del 13,5%; observant que per CLCR < 30 mL/min ms del
75% dels pacients presentaven AUC superiors a 50 gh/mL. Contrriament, per
CLCR > 70 mL/min, ms del 75% presentaven valors dAUC per sota de 40
gh/mL. Una tendncia similar es va observar desprs de ladministraci de
1 V2 V3 KA
Cl
ClD1 F
TLAG
INTRODUCCI
37
VCGV. Els percentatges de pacients amb AUC entre 40 i 50 gh/mL van ser del
15,6%, presentant el 98.6% (CLCR=10mL/min), 89.5% (CLCR=20mL/min) i 68.8%
(CLCR=30mL/min) de pacients un AUC > 50 gh/mL.
Per contra, els valors de les exposicions simulades amb dosis ajustades segons el
model PK poblacional, van estar en diana teraputica en el 50% dels pacients per
a tots els valors daclariment de creatinina. Els resultats daquest estudi de
Calds A i col52 demostra la importncia de lajust de dosi en base al CL individual
de cada pacient, sobretot en la poblaci de pacients SOT en que la funci renal
evoluciona al llarg del perode post-transplantament.
38
39
40
41
II. HIPTESI
42
HIPTESI
43
II. HIPTESI
s coneguda la relaci entre lexposici sistmica (AUC) a GCV i la prevenci de la
virmia, prevenci de la malaltia per CMV i laparici defectes adversos
hematolgics. Lrea sota la corba de concentracions plasmtiques de GCV est
directament relacionada amb leficcia i seguretat de manera que valors dAUC
de 40-50 gh/mL permetent la supressi de la virmia durant el tractament
profilctic i reduir la incidncia del desenvolupament de la mateixa, un mes
desprs de finalitzar el tractament. Daltra banda, una AUC superior a 50
gh/mL ha demostrat estar relacionada amb un increment tant de la
neutropnia com de la leucopnia. Amb aquests resultats podrem dir que
lassoliment dun valor teraputic dAUC podria ser la clau per aconseguir bona
eficcia en el tractament i evitar efectes adversos aix com laparici de
resistncies.
Daltra banda, s'ha demostrat que la funci renal s la variable predictora ms
important de la variabilitat observada en els nivells srics de GCV. La funci renal
s d'especial importncia en la subpoblaci de transplantats renal que presenta
valors de la funci de l'rgan trasplantat molt baixos (CLCR < 20 mL/min) en el
moment del trasplantament i va millorant al llarg del perode de seguiment. Aix
suposa la necessitat de fer lajust de dosi al llarg de tot el perode post-
transplantament, especialment en la subpoblaci de trasplantats renals i
sobretot quan el tractament sinicia immediatament desprs del
transplantament.
Segons el model poblacional desenvolupat prviament per Calds A i col52,
noms un 16% dels pacients assoleixen lobjectiu teraputic dAUC desprs de
lestratgia de dosificaci del frmac segons fitxa tcnica. Especialment, els
pacients amb valors de funci renal molt disminuda (CLCR < 30 mL/min) o
HIPTESI
44
conservada (CLCR > 70 mL/min) estarien sobredosificats i infradosificats,
respectivament, amb el risc de presentar ms efectes adversos o b fracs
teraputic.
Malgrat que el GCV no sigui un frmac que actualment es monitoritzi de forma
rutinria, la variabilitat PK observada desprs de la seva administraci representa
un problema potencial per leficcia i seguretat. La infecci per CMV juga un
paper important desprs del transplantament en termes de morbi/mortalitat,
essent la incidncia dinfecci per CMV D+/R- en pacients sense tractament del
45%. Per aquest motiu la optimitzaci de la posologia en base a un model
predictiu que permets ajustar la dosi en funci de les caracterstiques
individuals de cada pacient, per assolir lexposici adequada a GCV, seria de gran
utilitat. Com a conseqncia es minimitzarien els efectes adversos, garantint una
major eficcia en la poblaci diana i es reduirien els costs associats. Tanmateix
sevitaria laparici de resistncies secundari a la infradosificaci, com ja shan
descrit en el tractament amb GCV oral.
Per tot aix, s fonamental disposar dun model PK poblacional prviament
desenvolupat aix com del corresponent predictor bayesi. Per tant, la
individualitzaci de la dosi de GCV/VGCV en funci de les caracterstiques de
cada pacient i de les concentracions sriques de GCV, pot contribuir en gran
manera a assolir lexposici ptima al frmac en els pacients transplantats.
45
46
47
III. OBJECTIUS
48
OBJECTIUS
49
III. OBJECTIUS
Objectiu principal
Optimitzar la posologia de GCV i VGCV, assessorada per lexposici al frmac
segons lrea sota la corba de nivells plasmtics (AUC), mitjanant laproximaci
bayesiana en base al model farmacocintic poblacional prviament
desenvolupat. Savaluar lexposici assolida desprs de ladministraci de GCV i
VGCV segons lestratgia doptimitzaci i es comparar amb lAUC assolida
seguint les indicacions del laboratori fabricant.
Objectius secundaris
1. Validaci de la metdica analtica mitjanant UHPLC/UV i UHPL/MSMS
2. Establir un disseny destratgia limitada dextracci de mostres per poder
estimar parmetres farmacocintics, entre ells valors dAUC de GCV,
utilitzant laproximaci dels models defectes mixtes no lineals, amb la
mxima robustesa i fiabilitat possible emprant el menor nmero de
mostres possible.
3. Avaluar limpacte de loptimitzaci de la posologia segons el model
poblacional en leficcia estimada segons la crrega viral i millora clnica i
en els parmetres de tolerncia clnica.
50
51
52
53
IV. RESULTATS
54
RESULTATS
55
Captol 1
Determination of ganciclovir in human plasma by ultra performance liquid
chromatography UV detection.
Padulls A, Colom H, Armendariz Y, Cerezo G, Calds A, Pou L, Torras J, Griny
JM, Lloberas N.
Clinical Biochemistry 2012;45(4-5):309-14.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Padull%C3%A9s%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Colom%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Armendariz%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cerezo%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Caldes%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pou%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Torras%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Griny%C3%B3%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Griny%C3%B3%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lloberas%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106
RESULTATS
56
Clinical Biochemistry 45 (2012) 309314
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Clinical Biochemistry
j ourna l homepage: www.e lsev ie r .com/ locate /c l inb iochem
Determination of ganciclovir in human plasma by ultra performance liquidchromatographyUV detection
A. Padulls c, H. Colom b, Y. Armendariz a, G. Cerezo a, A. Caldes a, L. Pou d, J. Torras a,J.M. Griny a, N. Lloberas a,a Nephrology Department, IDIBELL, Hospital Universitari de Bellvitge, L'Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Spainb Department of Biopharmaceutics and Pharmacokinetics, School of Pharmacy, University of Barcelona, Spainc Pharmacy Department, IDIBELL, Hospital Universitari de Bellvitge, L'hospitalet de Llobregat, Barcelona, Spaind Biochemistry Department, Hospital Valle Hebrn, Barcelona, Spain
Abbreviations: (GCV), Ganciclovir; (VGCV), Valgancacid solution; (UV), Ultraviolet; (HPLC), High-perform(UHPLC), Ultra High-performance liquid chromatogr(AUC), Area under the concentrations time curve; (Lower limit of quantifications; (SD), Standard deviatioCoefficient of variation; (RT), Retention time; (SOT), So Corresponding author at: Nephrology Service, Hos
Lab Exp Nephrology 4122, Pab. Govern, 4a planta, UB, Ftalet de Llobregat, Barcelona, Spain. Fax: +34 93 40358
E-mail address: [email protected] (N. Lloberas).
0009-9120/$ see front matter 2012 The Canadian Sdoi:10.1016/j.clinbiochem.2011.12.014
a b s t r a c t
a r t i c l e i n f oArticle history:
Received 27 September 2011Received in revised form 3 December 2011Accepted 16 December 2011Available online 4 January 2012
Keywords:Therapeutic drug monitoringGanciclovirValganciclovirHPLCUHPLC
Objectives: Implement a sensitive UHPLC method for the assay of ganciclovir in human plasma.Design andmethods:Wedeveloped and validated a chromatographicmethod coupled to ultraviolet detection forquantification of ganciclovir, with a short run time using a small volume of human plasma. Comparison of systemperformance was made with respect to analysis time, efficiency and sensitivity.Results: Correlation coefficients (r) of the calibration curves ranged from 0.999744 to 0.999784. Within-day andbetween-day imprecision and inaccuracy, specificity and recovery were also evaluated for validation. The methodwas precise and accurate and the retention time was 0.7 min. The calibration curves were linear between 0.5 and30 g/mL. There was a good correlation between HPLC and UHPLC techniques.Conclusions:We developed a method that is currently applied in a clinical study assessing GCV plasmaconcentration variability after ganciclovir and valganciclovir administration.
2012 The Canadian Society of Clinical Chemists. Published by Elsevier Inc. All rights reserved.
Introduction
Cytomegalovirus (CMV) is themost common opportunistic pathogenaffecting solid organ transplant (SOT) [1]. Ganciclovir (GCV) a deoxygua-nosine analog was the initial choice for both prevention and treatment ofthe CMV disease in transplant patients [2]. Intravenous (IV) administra-tion of GCV (5 mg/kg/12 h given during 23 weeks or prolonged admin-istrations according to product information [3]), has been the goldstandard for the treatment of established infection, while oral GCV wasadministered for CMV prophylaxis due to its poor bioavalaibility (F) [4].Valganciclovir (VGCV), the valyl ester of GCV, is characterized by a nearten-fold higher bioavailability than GCV [5,6] and offers the perspectiveof replacing suboptimal oral prophylactic (oral GCV) and intravenous
iclovir; (TCA), Trichloroaceticance liquid chromatography;aphy; (PK), Pharmacokinetic;QC), Quality control; (LLOQ),n; (RE), Relative error; (C.V.),lid organ transplant.pital Universitari de Bellvitge,eixa Llarga s/n, 08907 L'Hospi-06.
ociety of Clinical Chemists. Publishe
57
therapeutic regimens. The approved indications [7] of VGCV are the treat-ment of CMV retinitis in HIV patients and the prophylaxis of CMVinfection in SOT patients.
Pharmacokinetic of GCV after IV GCV and/or oral VGCV has beenstudied in different patient populations. New pharmacokineticsanalyses, as population pharmacokinetics, provide predictive modelsthat allow dose adjustment.
Therapeutic GCV plasma concentrations in solid organ transplantrecipients receiving oral VGCV therapy typically range from 2.0 to20 g/mL [8]. The suppression of CMV viremia and disease is related[9] to exposure to GCV, so it is important to achieve the requiredexposure, avoiding adverse events and development of viralresistances. Only one pharmacokinetic (PK) study [10] comparedexposure to GCV between patients receiving GCV IV and oral VGCV,at steady state, in SOT patients suffering of CMV infection. A previousstudy demonstrated viraemia suppression during prophylaxis withGCV exposure (AUC) of 4050 g h/mL [9], suggesting that doseadjustment to a target exposure value would justify the developmentof a clinically applicable population pharmacokinetic model.
Some high-performance liquid chromatographic (HPLC) methodshave been described for the analysis of GCV in plasma, serum andother biological fluids [1118]. However, these HPLC/Ultraviolet(UV) methods have one or more of the following shortcomings:time-consuming extraction procedures (12, 13, 14), a requirementof large plasma volumes (2501000 L) (12, 13, 15), long run times
d by Elsevier Inc. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2011.12.014mailto:[email protected]://dx.doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2011.12.014http://www.sciencedirect.com/science/journal/00099120
310 A. Padulls et al. / Clinical Biochemistry 45 (2012) 309314
(16, 17), high limit of quantification (LLOQ) (18) or relatively lowsensitivity. Actually, ganciclovir concentrations are currently mea-sured in our reference hospital by a validated HPLC with UV detectionmethod [19]. That method either requires large sample volume or haslong run time. In order to overcome these problems, a new methodfor the analysis of GCV was developed. The aim of this work is thevalidation of the method of GCV analysis with UHPLC using UVdetection. Plasma samples of transplant recipients were determinedby the current applied HPLC method and UHPLC, and both resultswere correlated.
Materials and methods
Chemicals
GCV was a gift from Roche Pharma (Palo Alto, CA, USA). Methanol,acetonitrile, trichloroacetic acid solution (TCA) 50% and potassiummonophosphate were purchased from Merck (Darmstadt, Germany).Ultrapure water was obtained from Milli-Q UF-Plus apparatus(Millipore Corporation, Millford, MA, USA).
Apparatous and chromatographic conditions
Chormatography was performed using a Waters AcquityTM UHPLCsystem (Waters, Milford, MA, USA) with a ultraviolet (UV) detectorset to 254 nm. The separation was carried out on a UHPLC AcquityHSS T3 column (1.8 m2.150 mm) obtained from Waters (Milford,MA, USA). A Vanguard HSS T3 precolumn (1.8 m2.15 mm) wasused to prevent particles from clogging the column and to prolongcolumn life. It was equipped with cooling autosampler and columnoven enabling temperature control of the analytical column. Thetemperature of the autosampler chamber was held at 40 C. Theinjection mode was partial loop with needle overfill and the volumeinjectedwas 7.5 L. Elutionwas performed at 0.7 mL/minwith amobilephase solution that was potassiummonophosphate water solution (pH4.0; 0.02 M) containing 1% of acetonitril. The strong and weak washsolvent was methanol and water (20:80 v/v). The Acquity UHPLCsystem was equipped with an HP Pavilion (Hewlett Packard, Palo AltoCA, USA) with the EMPOWERTM software (Waters, Milford, MA, USA)to process the data (area integration, calculation and plotting ofchromatograms) throughout the method validation. The GCV areawas direct extrapolated from the daily calibration curve and only infew samples the area was manually adjusted.
Samples collection
According to a study protocol previously approved by the EthicsCommittee of University Hospital, blood samples were taken fromsolid organ transplant patients under prophylaxis or treatment withGCV and VGCV during their hospital stay and for their subsequentroutine follow-up at their scheduled medical visits. Blood samples(5 mL) were withdrawn in vacuettes tubes before and at 30, 60,90 min and 2, 3, 4, 6, 8, and 12 h after the start of GCV administration.Samples were centrifuged at 13000 rpm for 10 min at 4 C (SorvallCentrifuge, Thermo Fisher, MA, USA) and the plasma was separatedand transferred into two aliquots of 1 mL-polypropylene test tubesand stored at 20 C up to the time of analysis.
Stock solution and plasma calibration standards
Stock solution of GCV 1000 g/mL in HCl 0.1 N was further dilutedwith blank plasma for the preparation of the working solution of GCV80 g/mL. To prepare solutions for the construction of standardcurves, a measured amount of each stock solution was transferredinto a test tube and mixed well. Subsequently, serial dilutions wereperformed to create mixed standard solutions at target concentration
58
ranges of 0.5, 1, 5, 10, 16, 20, 25 and 30 g/mL. Blank plasma wasobtained from a pool of plasma of healthy volunteers and was storedmaximum 48 h at 412 C. The calibration standards were stored upto 3 months at 20 C as 200 L aliquots in 1.5 mL-polypropyleneEppendorf tubes, and thawed on the day of analysis.
Quality control (QC) samples were also prepared by spiking thestock solution into blank plasma, as described for the preparation ofthe calibration standards. The concentration levels of QC samples ofGCV (1.5, 8.5 and 15 g/mL) were selected to encompass the clinicallyrelevant range of concentrations expected in plasma samples. The QCsamples were stored up to 3 months at 20 C and analyzed everytime along with patient samples.
Sample preparation
On the day of analysis, standards and patient samples were thawed,allowed to equilibrate to room temperature and vortex-mixed. For theprecipitation of plasma protein, 50% trichloroacetic acid solution (TCA)solution (20 L) was added to 200 L of plasma samples (calibrationand patients). After being vortex-mixed, the suspensions were centri-fuged for 10 min on a bench top centrifuge at 13000 rpm at roomtemperature (Hettich Benchtop Universal 16R centrifuge, Bch, Swit-zerland). The supernatants collected were introduced into conic 1.5 mLautosampler vials (Bonded Pre-slit slilicone/PTFE septum, Waters,Milford, MA, USA) and a volume of 7.5 L was used for UHPLC analysis.
Method validation
All assay validation procedures were carried out according tocurrent guidelines [20], which include specificity, linearity, intra-dayand inter-day precision and accuracy, lower limit of quantification,recovery and stability.
Linearity and limit of quantificationLinearity was assessed by analyzing a set of five calibration curves
for plasma. Calibration curves were prepared as described in theStock solution and plasma calibration standards section above. Thelinearity of the method was determined by plotting peak area (y) ofGCV against theoretical concentration (x) of GCV. Calibration measure-ments were subjected to least square regression analysis by computerprogram, to provide information on the slope, y-intercept, correlationcoefficient (r) and the back calculated concentrations. The coefficientof correlation should be 0.9800 or greater.
The lowest limit of quantification (LLOQ) is defined as the lowest GCVconcentration that could be quantifiedwith precision and accuracy valueslower than 20%.
Precision and accuracyThe intra-assay and inter-assay precision and accuracy were evalu-
ated by analyzing 5 replicates at four different concentrations, LLOQand QC samples at three concentrations (low, medium and high: 1.5,8.5 and 15 g/mL). Mean and standard deviation (SD) were obtainedfrom back-calculated drug concentrations at each level. Accuracy andprecision were evaluated in terms of relative error (RE) and coefficientof variation (C.V.), respectively. Precision and accuracy values higherthan 15%were not accepted except at LLOQ,where it should not deviateby more than 20%.
RecoveryAbsolute recovery of extraction procedure was assessed by
comparing the peak area of the QCs (1.5, 8.5 and 15 g/mL) withthose of the reference standards prepared in HCl and injecteddirectly into the analytic column. It was expressed as percentagearea ratio of the extracted QC relative to the directly injectedreference standard.
Table A.1Comparison of system performance of UHPLC and HPLC.
Chormatograph Column Injection volume Mobile phase RT(min)
Flow(mL/min)
Detector(nm)
LLOQ(g/mL)
UHPLC Aquity WATERS HSS T3 column1.8 m2.150 mm
7.5 L K3PO4+ACN1%(0.02 M pH 4.0)
0.7 0.7 254 0.5
HPLC Kontron Diode Array ANFA-04 Nucleosil 120 C183 m 40.46 cm
40 L K3PO4(0.02 M pH 4.0)
5 1 254 0.5
311A. Padulls et al. / Clinical Biochemistry 45 (2012) 309314
StabilityFreeze-thaw cycles, autosampler and long-term stability studies
were performed atfive replicates andwere studied on threeQC samples
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
A
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
Mi0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1
Mi0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20
GC
V -
0.7
24
B
Fig. B.1. Representative UHPLC Chromatogram for GCV.Typical chromatogra
59
at three concentrations (1.5, 8.5 and 15 g/mL). To evaluate freeze-thaw stability, samples were subjected to freezing for 24 h at 20 Cand thawed unassisted at room temperature for 3 cycles. Long-term
nutes.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00
nutes1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40
ms showing: (A) blank plasma, (B) plasma spiked with GCV 16 g/mL.
312 A. Padulls et al. / Clinical Biochemistry 45 (2012) 309314
stability after three months under storage at 20 C was alsoperformed [19]. Mean area ratios of extracted samples after eachexperimental condition as a function of the mean area ratios of freshlyextracted samples analyzed at time zero were compared and resultswere expressed as percentages of freshly sample concentrationswhich were considered as 100%.
SpecificityTo evaluate potential chromatographic interference by other
drugs commonly co-administered in renal transplant patients, pooledblank plasma samples from different sources containing 10 g/mL ofeach drug were tested. Specificity was determined by checking theabsence of interfering peaks of endogenous or exogenous materialsat the same retention time of the analytes [19].
Chromatographic interference was studied by injecting the mixtureof GCV with conventionally coadministered drugs, including cyclospor-ine, tacrolimus, mycophenolic acid, everolimus, sirolimus, prednisone,sulfamethoxazole and trimethoprim.
Correlation with HPLC methodSamples of all patients were analyzed in duplicated by two
chromatographic techniques (UHPLC and HPLC) to determine GCVconcentrations following the conditions and performance shown inTable A.1. To ensure linear relationship between data, linearity wastested as described by Passing and Bablok [12] using Analyse-itStandard Edition software integrated into Excel '97. If linearity is given,the test of the null hypothesis a=0 and b=1 is carried out.
The analysis of GCV in serum by high-performance liquidchromatographic (HPLC)methodwithUVvis detectionwasperformedas follows. A nucleosil 120C18 3 m 40.46 cm was used. For theprecipitation of plasma protein, 20 L of TCA solution was added to200 L serum sample and vortexed and centrifugated at 10000 rpmfor 4 min. The supernatant was directly injected into HPLC system.Themobile phasewas a phosphate buffer 0.02 M (pH 4.0) and delivereda flow rate of 1 mL/min. Sample volume injectedwas 40 L and the totalruntime was 5 min.
Results
Assay performance was determined in accordance with FDA [13]guidelines for bioanalytical method validation. The method wasvalidated by determination of linearity, precision, accuracy, sensitivity,lower limit of quantification (LLOQ), and stability. In Table A.1., acomparison of the conditions and performances for the two techniquesHPLC/UHPLC is shown. The UHPLC retention time (RT) was 0.7 minmeanwhile in HPLC was 5 min. Although GCV peak was at 0.7 min,the total run time was 2.5 min because after each analysis, the UHPLCcolumn was washed by methanol and acetonitrile at a flow rate of0.7 ml/min for 1.5 min. The total run time was less than half with re-spect to the HPLC measuring more sample patients per day. TypicalUHPLC chromatogram is depicted in Fig. B.1.
Table A.2Summary of the intra and inter assay precision and accuracy data.
Spiked (g/mL) Analyzed PrecisionCV %
AccuracyRE
Intra assay (n=5)LLQ (0.5 g/mL) 0.56 g/mL 8.32 12.70Low (1.5 g/mL) 1.47 g/mL 13.09 2.00Middle (8.5 g/mL) 8.37 g/mL 1.16 1.53High (15 g/mL) 15.50 g/mL 1.02 3.33
Inter assay (n=5)LLQ (0.5 g/mL) 0.54 g/mL 18.03 7.95Low (1.5 g/mL) 1.49 g/mL 11.72 0.67Middle (8.5 g/mL) 8.45 g/mL 2.58 0.59High (15 g/mL) 15.10 g/mL 2.77 0.67
60
Linearity and limit of quantification
The correlation coefficients for all the standards were greater than0.999 and the slopes of the five curves prepared on five different dayshad a mean coefficient of variation (C.V.) of 3.63%. A typical equationfor the calibration curves was Y=2.81e+004X+2.56e+003 wherey and x were the peak-area and the GCV concentration (g/mL).
The validation of LLOQ was conducted in