Upload
fadli-azhari
View
120
Download
2
Embed Size (px)
Citation preview
Ini mini-tinjauan memberikan pemahaman umum ionisasi elektrospray spektrometri massa (ESI-
MS) yang telah menjadi teknik yang semakin penting dalam laboratorium klinis untuk studi
struktural atau pengukuran kuantitatif metabolit dalam sampel biologis kompleks. Bagian
pertama dari review menjelaskan proses ionisasi elektrospray, desain spektrometer massa dengan
kemampuan pemisahan, karakteristik spektrum massa, dan pertimbangan praktis dalam analisis
kuantitatif. Bagian kedua kemudian berfokus pada beberapa aplikasi klinis. Kemampuan ESI-
tandem-MS dalam mengukur bio-molekul berbagi struktur molekul yang sama membuatnya
sangat berguna dalam skrining untuk kesalahan bawaan dari asam amino, asam lemak, purin,
pirimidin metabolisme dan diagnosis gangguan galaktosemia dan peroxisomal. Ionisasi
elektrospray juga efisien dalam menghasilkan ion cluster untuk penjelasan struktural
makromolekul. Ini telah mendorong pendekatan baru dan lebih baik (vs elektroforesis) untuk
identifikasi dan kuantifikasi varian hemoglobin. Dengan pemahaman struktur glycohaemoglobin,
metode referensi IFCC untuk pengujian glycohaemoglobin telah dibentuk menggunakan ESI-MS.
Ini merupakan kemajuan yang signifikan untuk standardisasi HbA1c dalam pemantauan diabetes.
Dengan aplikasi lainnya seperti dalam pemantauan obat terapeutik, ESI-MS akan terus
mengerahkan pengaruh penting dalam pengembangan masa depan dan organisasi dari layanan
laboratorium klinis.
Pergi ke:
Pengantar
Spektrometri massa merupakan teknik analisis yang dapat memberikan baik kualitatif (struktur)
dan kuantitatif (massa molekul atau konsentrasi) informasi tentang molekul analit setelah
konversi mereka untuk ion. Molekul-molekul dari bunga pertama kali diperkenalkan ke sumber
ionisasi spektrometer massa, di mana mereka pertama kali terionisasi untuk memperoleh muatan
positif atau negatif. Ion kemudian perjalanan melalui analisa massa dan tiba di bagian yang
berbeda dari detektor sesuai dengan massa / rasio muatan mereka (m / z). Setelah ion melakukan
kontak dengan detektor, sinyal useable yang dihasilkan dan dicatat oleh sistem komputer.
Komputer menampilkan sinyal grafis sebagai spektrum massa menunjukkan kelimpahan relatif
dari sinyal sesuai dengan m / z rasio mereka.
Selama dekade terakhir, elektrospray ionisasi spektrometer massa (ESI-MS) telah muncul sebagai
teknik yang penting dalam laboratorium klinis. Ini menyediakan alat, sensitif yang kuat, dan
dapat diandalkan untuk belajar, di femto-mol jumlah dalam mikro-liter volume sampel, non-
volatile dan termal labil bio-molekul yang tidak setuju untuk analisis dengan teknik konvensional
lainnya. Ditambah dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) untuk fraksionasi molekul
sebelum analisis spektrometri massa, HPLC / ESI-MS telah menjadi teknik yang sangat kuat
yang mampu menganalisis kedua molekul kecil dan besar polaritas berbagai sampel biologis
kompleks. Dengan kemampuan pemisahan tambahan tandem spektrometri massa (MS dalam seri,
biasanya dilambangkan sebagai MS / MS), sampel pemurnian yang rumit dan prosedur untuk
pembentukan derivatif yang biasa digunakan dalam kromatografi gas (GC)-MS dapat lebih
disederhanakan. Bersama dengan pengenalan sampel otomatis, HPLC / ESI-MS / MS adalah
analisis aliran teknik untuk analisis cepat dan throughput sampel tinggi. Fokus dari produsen MS
dalam beberapa tahun terakhir telah pada pengembangan analisis MS dikendalikan oleh user-
friendly perangkat lunak komputer. Ahli biokimia klinis dan ilmuwan biomedis lainnya dapat
mengelola teknik ini tanpa pemahaman mendalam tentang proses fisik yang rumit dan prinsip-
prinsip matematika. Artikel ini bertujuan untuk memberikan pemahaman dasar dari proses ESI,
analisa massa, akuisisi data, dan persyaratan khusus untuk analisis molekuler kualitatif dan
kuantitatif. Metode untuk studi kesalahan metabolisme bawaan (molekul kecil) dan varian
hemoglobin (makromolekul) akan diringkas untuk ilustrasi dari aplikasi klinis.
Pergi ke:
Elektrospray Ionisasi Spektrometri Massa
Clin Biochem Rev. 2003 February; 24(1): 3–12.
PMCID: PMC1853331
Electrospray Ionisation Mass Spectrometry: Principles and Clinical ApplicationsCS Ho, CWK Lam,* MHM Chan, RCK Cheung, LK Law, LCW Lit, KF Ng, MWM Suen, and HL Tai
Author information ► Copyright and License information ►
1. Proses ionisasi elektrospray
ESI menggunakan energi listrik untuk membantu transfer ion dari larutan ke dalam fase gas
sebelum mereka dikenakan analisis spektrometri massa. Spesies ion dalam larutan sehingga dapat
dianalisis oleh ESI-MS dengan sensitivitas meningkat. Senyawa netral juga dapat dikonversi ke
bentuk ionik dalam larutan atau dalam fase gas oleh protonasi atau cationisation (cationisation
logam misalnya), dan karenanya dapat dipelajari oleh ESI-MS.
Pengalihan spesies ion dari larutan ke dalam fase gas oleh ESI melibatkan tiga langkah: (1)
penyebaran semprotan halus tetesan biaya, diikuti oleh (2) penguapan pelarut dan (3) ejeksi ion
dari tetesan sangat dituntut (Gambar 1 ). tabung, yang dipertahankan pada tegangan tinggi
(misalnya 2,5-6,0 kV) relatif terhadap dinding ruang sekitarnya. Sebuah kabut tetesan sangat
dituntut dengan polaritas yang sama dengan tegangan kapiler dihasilkan. Penerapan gas
nebulising (misalnya nitrogen), yang gunting di sekitar larutan sampel dielusi, meningkatkan
sample rate aliran yang lebih tinggi. Tetesan dikenakan, dihasilkan di pintu keluar dari ujung
elektrospray, lulus menuruni gradien tekanan dan gradien potensial terhadap wilayah analisa dari
spektrometer massa. Dengan bantuan suhu ESI-sumber tinggi dan / atau lain aliran gas nitrogen
pengeringan, tetesan dikenakan terus dikurangi ukurannya dengan penguapan pelarut, yang
menyebabkan peningkatan kepadatan muatan permukaan dan penurunan radius tetesan.
Akhirnya, kekuatan medan listrik dalam tetesan dibebankan mencapai titik kritis di mana itu
kinetis dan penuh semangat mungkin bagi ion pada permukaan tetesan yang akan dikeluarkan ke
dalam fase gas. Ion-ion yang dipancarkan oleh sampel kerucut skimmer sampling dan kemudian
dipercepat ke analyzer massa untuk analisis selanjutnya massa molekul dan pengukuran intensitas
ion. Mekanisme ESI dijelaskan secara lebih rinci dalam review.1 baru-baru ini
Gambar 1
Mekanisme ionisasi elektrospray
Untuk mendapatkan informasi struktural, ion prekursor dari bunga dapat massa dipilih dan
selanjutnya terfragmentasi dalam sel tabrakan. Ion fragmen kemudian dapat secara massal
dianalisis oleh sebuah analisa massa kedua sistem spektrometer massa tandem yang akan
dijelaskan di bawah ini.
2. Massa Analysers
I. analyzer massa quadrupole
Ketika ion perjalanan melalui medan magnet atau listrik, gerakan mereka dipengaruhi oleh m / z
rasio mereka dan ini merupakan prinsip utama memisahkan ion di MS. Dalam laboratorium
klinis, penganalisis massa quadrupole yang paling sering digunakan. Dalam sistem tersebut,
perakitan 4 batang logam paralel disimpan di jarak yang sama (Gambar 2). Setiap sepasang
batang berlawanan terhubung elektrik. Tegangan DC yang sama tetapi berlawanan ditumpangkan
dengan frekuensi radio (RF) AC tegangan diterapkan ke pasangan diagonal ditempatkan batang.
Medan listrik yang dihasilkan menyebabkan ion untuk melakukan perjalanan ke depan dalam
arah z dengan gerakan berosilasi dalam bidang xy. Amplitudo osilasi beruang hubungan yang
unik dengan rasio m / z dan dapat dikendalikan dengan mengubah tegangan DC dan RF secara
bersamaan dalam rasio pre-fixed. Ini tegangan DC dan RF dapat diatur sehingga amplitudo
osilasi untuk diinginkan m / z rasio yang "stabil" dengan ion bepergian sepanjang z-sumbu tanpa
memukul batang quadrupole, dan akhirnya mencapai detektor. Di sisi lain, amplitudo osilasi ion
yang tidak diinginkan besar dan "stabil", mereka memukul batang-batang besi, bisa dinetralkan,
dan gagal untuk mencapai detektor. Analisis massa quadrupole yang kuat, ekonomis, fisik kecil,
dan lebih mudah dihubungkan dengan berbagai macam sistem inlet bila dibandingkan dengan
analisis massa konvensional seperti sektor magnetik.
Gambar 2
Operasi sebuah analisa massa quadrupole. Ion (M +) perjalanan dari sumbernya, melalui
pengaturan 4 batang logam dalam pola osilasi yang unik, dan mencapai detektor.
II. Tandem quadrupole sistem
Dalam sistem tandem quadrupole khas ada tiga quadrupoles diatur secara linear, sering disebut
"triple-quad" (Gambar 3). Ion analit bunga (biasanya disebut ion prekursor) adalah massa-dipilih
oleh quadrupole pertama (Q1) dan dibiarkan bertabrakan dengan gas tabrakan (biasanya argon)
dalam sel RF-satunya tabrakan kedua quadrupole (Q2), di mana ion prekursor diaktifkan oleh
tabrakan dan menjalani fragmentasi lebih lanjut. Proses ini dikenal sebagai tabrakan-disosiasi
diinduksi (CID). Ion putri dihasilkan dari CID yang terkait dengan struktur molekul ion dan dapat
dipantau oleh sebuah analisa massa quadrupole ketiga (Q3) memberikan informasi struktural dari
ion molekuler. Sistem tandem biasanya dilambangkan sebagai MS / MS dalam literatur. Ketika
Q1 diatur untuk memilih hanya satu spesifik m / z rasio, itu menyaring ion molekul lain yang
memiliki yang berbeda m / z rasio. Ini adalah "pemurnian" langkah dalam sistem MS,
menghilangkan prosedur sampel pemurnian yang rumit dan memakan waktu sebelum analisis
MS.
Gambar 3
Skema diagram dari sistem triple quadrupole. Yang pertama (Q1) dan ketiga (Q3) adalah
spektrometer massa dan pusat (Q2) adalah sel tabrakan.
Modus berikut akuisisi data biasanya digunakan dalam sistem quadrupole tandem:
Produk scan (putri scan): Q1 statis memungkinkan hanya satu ion spesifik m / z rasio untuk
melewati dan Q3 memindai ion produk yang berbeda CID. Mode ini dapat digunakan untuk
mempelajari struktur molekul, misalnya, asam amino urutan molekul peptida.
Prekursor memindai (scan induk): scan Q1 rentang ion prekursor mungkin dan Q3 statis berfokus
pada satu ion produk yang unik yang dihasilkan dari CID dari kelas ion prekursor. Misalnya, m /
z rasio 85 adalah ion fragmen yang sama dari semua prekursor acylcarnitines ion (C2-C18)
butylated .2
Kerugian Netral: Kedua Q1 dan Q3 memindai bersama di sebuah perbedaan yang konstan dalam
m / z rasio. Hal ini digunakan untuk memonitor hilangnya fragmen netral untuk kelas molekul
dari CID. Misalnya, ada kerugian netral 102 dari sebagian besar acids.2 amino butylated
Reaksi Monitoring multi: Kedua Q1 dan Q3 yang statis untuk sepasang ditentukan prekursor dan
ion produk. Ini menganugerahkan kekhususan tertinggi dan sensitivitas dan umumnya digunakan
dalam prosedur kuantifikasi ESI-MS/MS.
III. Analyzer massa ion perangkap
Sistem ini, yang baru-baru ini telah menjadi tersedia, memiliki keuntungan yang lebih kecil
dalam ukuran dan lebih murah, dan mampu melakukan pemantauan tandem CID. Ini terdiri dari
tiga elektroda hiperbolik: elektroda cincin, ujung elektroda masuk topi, dan ujung keluar
elektroda tutup (Gambar 4). Elektroda ini membentuk rongga di mana dimungkinkan untuk
menjebak (toko) dan menganalisis ion. Elektroda end topi Keduanya memiliki lubang kecil di
pusat-pusat mereka melalui mana ion dapat melakukan perjalanan. Elektroda cincin terletak di
tengah antara dua elektroda ujung topi. Ion yang dihasilkan dari sumber masuk perangkap
melalui quadrupole dan ujung elektroda masuk topi. Berbagai tegangan yang diterapkan pada
elektroda untuk ion perangkap dan eject sesuai dengan m / z mereka rasio. Elektroda cincin RF
potensial, potensi AC frekuensi konstan dan variabel amplitudo, diterapkan ke elektroda cincin
untuk menghasilkan medan 3-dimensi potensial quadrupolar dalam rongga perangkap. Ini akan
menjebak ion dalam lintasan osilasi stabil terkurung dalam sel perangkap. Sifat dari lintasan
tergantung pada potensi perangkap dan rasio m / z dari ion. Selama deteksi, potensi sistem
elektroda diubah untuk menghasilkan ketidakstabilan di lintasan ion dan dengan demikian
mengeluarkan ion dalam arah aksial. Ion-ion yang dikeluarkan dalam rangka meningkatkan m / z
rasio, difokuskan oleh lensa keluar dan terdeteksi oleh sistem detektor ion.
Gambar 4
Skema diagram dari sebuah analisa massa perangkap ion. Perangkap ini terdiri dari 2 elektroda
ujung topi dan elektroda cincin. Di dalam perangkap, ion memutar dan berosilasi dalam lintasan
berbentuk 8.
Selama tandem MS, ion prekursor dipilih dalam perangkap di mana gas inert diperkenalkan untuk
CID. Setelah itu, ion produk yang dikeluarkan untuk deteksi. Atau, ion produk dapat disimpan di
dalam perangkap dan lain reaksi CID dapat dimulai dan reaksi ulangi CID dapat berlanjut selama
beberapa kali (dilambangkan sebagai MSN di mana n adalah jumlah reaksi CID). Hal ini dapat
membantu membedakan molekul dengan struktur serupa. Namun, analisis perangkap ion tidak
dapat menyediakan memindai prekursor dan mode hilangnya netral akuisisi data. Untuk
kuantifikasi, analisis ion perangkap adalah 10 kali lebih sensitif bila dibandingkan dengan sistem
quadrupole tandem dioperasikan dalam mode pemantauan beberapa reaksi.
3. Spektrum Massa
Spektrum massa adalah tampilan grafis dari bundance seorang kerabat sinyal ion terhadap m / z
rasio. Ini adalah praktek umum bahwa sinyal tertinggi diambil sebagai kelimpahan 100% dan
semua sinyal lain yang dinyatakan sebagai persentase dari ini. Fragmentasi ion molekul
terprotonasi atau de-terprotonasi dihasilkan dari ESI umumnya terbatas, dan spektrum massa
relatif sederhana. Namun, beberapa-protonasi protein dan peptida terjadi dalam proses ESI, dan
spektrum massa ESI mungkin menjadi lebih rumit. Gambar 5 adalah spektrum massa untuk
persiapan mioglobin kuda sangat murni (5 ìmol / L dalam asetonitril 50% mengandung asam
formiat 0,2%). Sebuah protein tunggal akan menunjukkan ion cluster yang berisi beberapa
karakteristik-ion bermuatan. Jumlah muatan pada molekul protein akan tergantung pada berat
molekul protein dan jumlah situs dasar diakses (misalnya arginin, histidin, dan lisin). Tiga asumsi
dasar yang dibuat dalam penentuan berat molekul protein tunggal. Yakni, bahwa (1) puncak yang
berdekatan dalam satu rangkaian hanya berbeda oleh satu muatan, (2) pengisian hanya karena
keterikatan proton dengan ion molekul, dan (3) ionisasi terjadi hanya molekul utuh. Untuk
menghitung berat molekul protein, yang dapat menggunakan 2 persamaan simultan yang berasal
dari 2 ion yang berdekatan. Sebagai contoh, untuk ion dengan am / z rasio = 1212, ia memiliki
puncak yang berdekatan dengan rasio m / z = 1131. Puncak yang berdekatan harus memiliki
biaya tambahan pada ion molekuler. Oleh karena itu, 2 persamaan simultan dapat diatur: m / z =
1212, dan m / (z +1) = 1131, pemecahan untuk z = 14 dan m = 16968 untuk molekul.
Gambar 5
Spektrum Massa dari ion cluster yang mioglobin protein kuda solusi yang sangat dimurnikan
standar (5 ìmol / L dalam larutan asetonitril 50% mengandung asam formiat 0,2%)
Situasi menjadi lebih rumit jika ada campuran protein yang berbeda hadir dalam sampel. Berbeda
MS produsen menyediakan perangkat lunak mereka sendiri untuk mengubah spektrum massa
rumit mentah menjadi massa molekul relatif individu. Gambar 6 (atas) menggambarkan spektrum
massa campuran dimurnikan alpha-janin glycoforms protein. The MAXENT Micromass Program
(Micrormass, Manchester, Inggris) deconvolutes spektrum massa ke dalam glycoforms individu
(Gambar 6 - bawah). Dengan cara ini, sistem ESI-MS dirancang untuk mengukur m / z rasio dari
4000 Da / e mampu menentukan berat molekul dari molekul protein besar lebih dari 100.000 Da.
ESI-MS juga dapat diterapkan untuk mempelajari makromolekul lainnya, misalnya,
oligonukleotida. Keakuratan ESI-MS untuk molekul protein telah didokumentasikan untuk
menjadi ± 0,01% bila dibandingkan dengan asam amino teoritis sequence.3
Gambar 6
Spektrum Massa dari campuran serum alpha-janin protein dimurnikan dengan kromatografi
afinitas. Spektrum atas terdiri dari data mentah menunjukkan ion kluster komposit dari
glycoforms yang berbeda. Spektrum bawah adalah spektrum deconvoluted on ...
4. Analisis Kuantitatif
Dalam ESI-MS, sinyal ion sebanding dengan konsentrasi analit dan umumnya tidak tergantung
dari laju alir dan volume injeksi yang digunakan untuk sampel introduction.1 Sinyal linier dari
batas deteksi (biasanya pmol / L) menjadi sekitar 10 umol / L analit konsentrasi. Untuk
pengukuran kuantitatif, adalah penting untuk menggabungkan standar internal dalam prosedur
untuk mengkompensasi kerugian selama persiapan sampel dan sensitivitas deteksi variabel dari
sistem MS. Standar internal harus memiliki struktur yang sama dengan analit dan praktek yang
ideal adalah untuk mensintesis standar internal dengan memasukkan isotop stabil pada molekul
bunga. Misalnya, untuk kuantifikasi bebas karnitin (m = 162), standar internal yang mengandung
3 atom deuterium untuk menggantikan 3 atom hidrogen digunakan (m = 165) .4 Ketika sebuah
standar internal yang ideal tidak tersedia, molekul dengan struktur yang sama dapat juga
digunakan. Misalnya, ascomycin telah digunakan sebagai standar internal untuk analisis ESI-
MS/MS dari tacrolimus.5 immunosuppressant
Isu lain yang penting dalam kuantitatif ESI-MS adalah penekanan ionisasi karena gangguan
matriks. Sebuah sampel biologis akan memberikan sinyal ionisasi secara signifikan lebih rendah
dibandingkan dengan solusi standar murni dengan konsentrasi analit yang sama. Fenomena ini
adalah hasil dari konsentrasi tinggi non-volatile bahan dari sampel biologis yang hadir di semprot
dengan analyte.6 Kemungkinan non-volatile zat terlarut campur adalah garam dan lipid dalam
sampel biologis. Untuk mengatasi gangguan matriks, proses pemurnian sampel yang luas yang
diperlukan, misalnya, ekstraksi cair-cair dan ekstraksi fase padat oleh kolom pakai. Namun,
prosedur yang rumit yang memakan waktu dan dapat menyebabkan pemulihan miskin.
Perkembangan terbaru adalah dengan menggunakan kolom pendek LC (atau kolom penjaga) dan
menerapkan pemurnian HPLC cepat (misalnya untuk 2-5 menit) sebelum MS analysis.7 The
HPLC berfungsi untuk memisahkan senyawa non-volatile dari analit. Untuk sistem HPLC dengan
kolom-switching kemampuan, analit dalam sampel biologis dapat dimurnikan dan berkonsentrasi
pada kolom terpisah sebelum analisis MS. Seperti pemurnian sistem sampel otomatis
menggunakan kromatografi afinitas yang terbaik digambarkan oleh metode kuantifikasi yang
baru saja diterbitkan cepat untuk isoform transferin di serum.8
Pergi ke:
Aplikasi Klinis
1. Skrining untuk Kesalahan bawaan Metabolisme
Salah satu aplikasi klinis yang paling umum dari ESI-MS dalam skrining untuk kesalahan
metabolisme bawaan (IEM). Pasien dengan IEM mewarisi cacat jalur metabolisme yang
mengarah ke salah satu akumulasi metabolit toksik, atau kekurangan metabolit penting untuk
homeostasis. Banyak dari cacat memiliki konsekuensi klinis yang serius, termasuk ringan sampai
keterbelakangan mental yang parah, cacat fisik, dan bahkan kematian. Diagnosis dini dan
pengelolaan beberapa gangguan telah terbukti sangat efektif dalam mencegah konsekuensi klinis.
Di antara mereka hanya sebagian kecil telah berhasil ditayangkan pada nasional program skrining
neonatal, misalnya, fenilketonuria (PKU) dan hipotiroidisme neonatal. Masalah dengan metode
skrining meliputi persiapan sampel melelahkan, waktu analisis yang lama, tinggi angka positif-
palsu, dan spektrum penyakit sempit ditutupi oleh setiap metode. Prinsip dari ESI-MS membuat
metode ini paling cocok untuk mengukur kelas yang sama dari bio-molekul berbagi struktur
molekul yang sama, dan kemampuan MS / MS menyingkirkan prosedur persiapan sampel yang
rumit dan membosankan. Sejak awal 1990-an, penggunaan ESI-MS/MS telah merevolusi
skrining neonatal untuk IEM di countries.9 dikembangkan banyak
I. Neonatal skrining untuk gangguan asam amino dan metabolisme asam lemak
Saat ini, secara nasional program skrining neonatal di Amerika Utara, Eropa dan Australia
menggunakan ESI-MS/MS otomatis untuk profiling metabolisme asam amino dan acylcarnitines
dari bercak darah. State-of-the-art laboratorium dapat menyaring beberapa ratus sampel per hari.
Sampling bintik-bintik darah pada kartu Guthrie, ekstraksi analit, pembentukan derivatif, analisis
ESI-MS/MS, dan pengolahan data elektronik dengan komputer-peringatan dari hasil abnormal
semua dapat sepenuhnya otomatis sekarang menggunakan mikro-piring bets processing.9
Profil asam amino dapat mendeteksi aminoacidopathies besar, seperti fenilketonuria (PKU),
penyakit kemih sirup mapel, homocystinuria, dan galaktosemia. Di masa lalu, skrining PKU
diperlukan penggunaan sampel darah dikumpulkan pada atau setelah Hari 5 lahir, sehingga
fenilalanin yang cukup telah terkumpul untuk deteksi dengan uji penghambatan kualitatif sensitif
Guthrie bakteri. ESI-MS/MS Memanfaatkan pengukuran fenilalanin rasio konsentrasi tirosin,
skrining sekarang dapat dilakukan dengan kekhususan tinggi dan sensitivitas menggunakan Day 1
darah spots.10 skrining acylcarnitines terutama untuk cacat oksidasi asam lemak. Contoh IEM
sedang diperiksa adalah: kekurangan dehidrogenase rantai menengah dan sangat-rantai panjang
asil-CoA, tipe acidemia glutarat I dan II, palmitoil karnitin transferase tipe II / translokase
kekurangan, defisiensi karnitin primer, acidemia isovaleric / 2-methylbutyryl-CoA dehidrogenase
defisiensi, dan rantai panjang hydroxyacyl-CoA dehidrogenase / kekurangan protein trifunctional.
Baru-baru ini, ini biaya-efektif metode skrining telah digunakan untuk mempelajari IEM potensi
bayi mendadak death.11
II. Neonatal skrining untuk galaktosemia
Galaktosemia (kejadian, 1: 35.000 di Denmark) 12 adalah IEM yang mengancam jiwa dengan
gejala berat pada periode neonatal. Hal ini paling sering disebabkan oleh defisiensi enzim
galaktosa-1-fosfat uridyl transferase. Dalam gangguan ini, galaktosa berasal dari laktosa tertelan
dalam produk susu dan susu terakumulasi dalam darah dan urin, menyebabkan konsentrasi
intraseluler tinggi galaktosa-1-fosfat yang merupakan racun bagi beberapa jaringan, terutama hati,
otak, dan tubulus ginjal. Manifestasi klinis, termasuk muntah, sakit kuning diare, dan kelesuan
muncul pada neonatus lama setelah konsumsi susu, berkembang menjadi koma dan kematian
akibat septikemia, hati atau gagal ginjal. Perawatan dini dengan diet galaktosa bebas
menyebabkan regresi tanda dan gejala dalam waktu 1-2 minggu. Sebuah metode ESI-MS/MS
baru telah dikembangkan untuk pengukuran dari total heksosa mono-fosfat pada bercak darah
sebagai penanda untuk galaktosa-1-phosphate.12 Prosedur ini sederhana dan tidak memerlukan
pengolahan sampel untuk pembentukan derivatif. Sebuah studi retrospektif telah menunjukkan
sensitivitas dan spesifisitas dari 100% untuk 12 pasien di antara 2.055 controls.12
III. Neonatal skrining untuk penyakit hepatobilier kolestatik
Dalam ikterus neonatal berkepanjangan, penting untuk mendiagnosis adanya penyakit
hepatobilier kolestatik seperti atresia bilier ekstrahepatik, suatu kondisi yang dapat
mengakibatkan morbiditas dan mortalitas yang serius. Sebuah ESI-MS sederhana dan efisien
metode telah dikembangkan untuk mengukur asam empedu terkonjugasi pada bercak darah, 13
dan digunakan dalam upaya untuk mendirikan sebuah program skrining neonatal untuk
diseases.14 hepatobilier kolestatik Namun, pemisahan konsentrasi asam empedu terkonjugasi
antara pasien dan masyarakat umum tidak cukup untuk membuat skrining massal untuk penyakit
hepatobilier kolestatik pilihan layak dengan metode ini saja. Bayi berat badan lahir rendah tanpa
kondisi patologis juga bisa memiliki konsentrasi asam empedu yang cukup tinggi, sehingga
mempengaruhi spesifisitas metode. Selain itu, metode skrining ini juga dipengaruhi oleh
peningkatan yang signifikan terlihat pada konsentrasi asam empedu setelah makan. Oleh karena
itu, waktu sampling yang akurat mungkin diperlukan untuk meningkatkan kegunaannya.
IV. Skrining untuk gangguan peroxisomal
Para peroksisom adalah organel intraseluler bertanggung jawab untuk oksidasi β-rantai yang
sangat panjang dan asam lemak rantai bercabang. Gangguan peroxisomal adalah kelompok
heterogen IEM ditandai dengan gangguan, peroksisom berkurang atau sama sekali tidak ada.
Contoh-contoh termasuk sindrom Zellweger, X-linked adrenoleukodystrophy, asil-CoA defisiensi
oksidase, defisiensi protein bifunctional dan thiolase peroxisomal deficiency.15 Pasien yang
menderita gangguan ini mungkin memiliki peningkatan abnormal pada asam lemak rantai sangat
panjang (VLCFA), pristanic atau phytanic asam dalam serum. Membosankan GC / MS metode
telah digunakan untuk diagnosis kondisi ini. Sebuah metode ESI-MS/MS cepat dilaporkan untuk
skrining peroxisomal disorders.16 VLCFA (C20: 0 eicosanoic, C22: 0 docosanoic, C24: 0
tetracosanoic dan C26: 0 asam hexacosanoic) di tempat darah atau serum harus dikonversi ke
dimetilaminoetil ester. Pemurnian sampel, dan prosedur pembentukan derivatif relatif sederhana
dibandingkan dengan tradisional GC / MS metode. Karena langkah terakhir dalam biosintesis
asam empedu berlangsung di peroksisom, metode lain HPLC / ESI-MS / MS untuk plasma C27
dan C29 asam empedu terkonjugasi juga telah diusulkan, untuk menyaring peroxisomal
disorders.17 Metode ini tidak memerlukan pengolahan sampel untuk pembentukan derivatif, dan
mirip dengan metode yang dijelaskan above.14
V. Skrining untuk gangguan di purin dan metabolisme pirimidin
Kesalahan bawaan dari purin dan metabolisme pirimidin memiliki berbagai presentasi klinis,
misalnya, gout, anemia, imunodefisiensi, batu ginjal, kejang-kejang, keterbelakangan autisme,
mental dan pertumbuhan retardation.18 Diagnosa didasarkan pada adanya metabolit abnormal
atau tidak adanya metabolit normal dalam sel darah serum, urin atau merah. Sebuah metode
skrining HPLC / ESI-MS / MS telah dikembangkan untuk kuantifikasi dari 17 purin dan
pirimidin dalam urin atau air seni-direndam strip kertas saring dengan turn-kali-dari 15 menit per
sample.19
2. Identifikasi dan Kuantifikasi Varian Hemoglobin
Sejak laporan pertama pada pengukuran keberhasilan besar bio-molekul dengan ESI-MS, telah
terjadi revolusi dalam identifikasi molekul protein dalam penelitian biokimia. Dalam
laboratorium klinis, kuantifikasi glycohaemoglobin (GHB) menyediakan alat yang berguna untuk
pemantauan kontrol glikemik pada pasien diabetes. ESI-MS telah menjadi teknologi yang diakui
untuk pengembangan metode referensi. Selain itu, hemoglobin (Hb) varian perlu diidentifikasi
untuk penyelidikan anemia hemolitik, methaemoglobinamea, penyakit sel sabit dan talasemia.
Kadang-kadang, varian ini terdeteksi kebetulan karena mereka mengganggu pengukuran GHB.
ESI-MS juga menjadi teknik yang lebih disukai untuk pendekatan sistematis yang cepat untuk
karakterisasi definitif Hb variants.20
I. Kuantifikasi glycohaemoglobin
GHB adalah produk dari ireversibel non-enzimatik glycation Hb. Persentase GHB merupakan
integrasi plasma rata konsentrasi glukosa pasien selama masa hidup / nya eritrosit (2-3 bulan). Ini
telah digunakan untuk memantau kontrol diabetes selama bertahun-tahun. Sebuah tinjauan baru-
baru ini menegaskan bahwa perbaikan kontrol glikemik pada pasien diabetes sangat terkait
dengan perkembangan menurun dan / atau perkembangan complications.21 HbA1c adalah
spesies dominan GHB dan diukur dalam laboratorium klinis baik menggunakan HPLC dengan
pertukaran ion atau kolom afinitas, atau otomatis immunoassays. Sebagian besar dari metode ini
memiliki presisi analitis diterima dan efisiensi. Namun, mereka menderita gangguan oleh varian
Hb, memberikan hasil palsu tinggi atau rendah. Kebingungan yang cukup besar pada keakuratan
metode telah dilaporkan karena kurangnya standardisasi internasional. Isu mendasar telah
kurangnya pemahaman tentang sifat spesifik HbA1c. Penggunaan ESI-MS menghilangkan
masalah ini.
Kelompok kerja IFCC tentang standardisasi internasional mendefinisikan HbA1c sebagai Hb
yang ireversibel terglikasi pada satu atau kedua N-terminal valines dari globin β chains.22
Berdasarkan definisi ini, metode referensi calon dikembangkan menggunakan HPLC/ESI-MS.23
Ini membutuhkan endoproteinase semalam Glu-C pencernaan, diikuti oleh pemisahan HPLC dari
peptida. Intensitas sinyal ESI dari N-terminal β spesifik hexa-peptida dari Hb0 dan HbA1c
digunakan untuk menghitung persentase HbA1c dalam sampel. Metode ini kemudian diadopsi
sebagai method.24 nilai IFCC referensi referensi awal dilaporkan oleh IFCC, 3,36 ± 0,48% (rata-
rata ± 2 SD), secara signifikan lebih rendah daripada yang dikembangkan oleh metode lain.
Selanjutnya, metode ini referensi yang dimodifikasi untuk adaptasi di laboratorium klinis.
Pemisahan peptida dengan Reverse-fase metode HPLC mengambil 24 menit. Hal ini ditingkatkan
dengan menggunakan fase gradien yang berbeda mobile dan waktu analisis dikurangi menjadi 8
minutes.25 Untuk memperbaiki kekhususan pengukuran, pemantauan beberapa reaksi akuisisi
sinyal digunakan. Presisi metode ini juga ditingkatkan dengan menggunakan intensitas sinyal dari
kedua tunggal dan ganda-bermuatan peptida ions.26 Untuk mengurangi biaya menjalankan
metode, sebuah endoproteinase amobil Glu-C persiapan juga diperkenalkan. Telah terbukti bahwa
metode referensi dapat mengatasi gangguan oleh Hb variants.27 Meskipun perbaikan berbagai
metode referensi IFCC, itu masih terlalu menuntut untuk aplikasi rutin.
Sebuah ESI-MS metode alternatif untuk GHB telah developed.28 Dalam metode ini sampel darah
seluruh diencerkan 500 kali lipat sebelum dianalisis dengan ESI-MS untuk rantai globin Hb utuh.
Gambar 7 (atas) menunjukkan massa spektrum ESI khas Hb normal. Ion klaster telah
deconvoluted ke berat molekul yang benar oleh software komputer (Gambar 7 - bawah). Yang
normal rantai globin α dan β memiliki berat molekul dari 15.126,4 15.867,2 dan masing-masing.
Peningkatan massa 162 Da diberikan karena penambahan glukosa (massa, 180 Da) dan
penghapusan air (-18 Da). Keuntungan dari metode ini ESI-MS adalah bahwa itu adalah
sederhana dan cepat, dengan waktu analisis 3 menit per sampel, dan dapat dengan mudah
otomatis. Selain itu, tidak terpengaruh oleh varian Hb sebagai rantai globin varian dan spesies
terglikasi mereka juga dapat diukur dengan mudah. Metode yang diusulkan juga telah diuji untuk
jangka panjang performance.29 Selama periode 4-bulan operasi rutin, ketidakakuratan antara-
assay adalah 1,6-5,0%, dengan hasil yang berkorelasi baik dengan metode pertukaran ion HPLC,
dan persentase β-terglikasi Hb setuju erat dengan mengacu didirikan values.29
Gambar 7
Spektrum Massa dari hemoglobin normal. Spektrum atas terdiri dari data mentah menunjukkan
ion cluster dari globins baik α dan β. Spektrum bawah adalah spektrum deconvoluted pada skala
massal benar setelah transformasi software.
II. Identifikasi varian hemoglobin
Elektroforesis dan otomatis HPLC saat ini metode utama yang digunakan di laboratorium klinis
untuk identifikasi varian Hb. Namun, metode ini tidak memberikan karakterisasi definitif dari
varian, terutama mereka dengan substitusi asam amino tidak menghasilkan perubahan apapun
pada biaya keseluruhan pada molekul Hb. Dalam karakterisasi, masa lalu definitif varian Hb
melibatkan prosedur analitis membosankan dan memakan waktu membutuhkan hari dan bahkan
berbulan-bulan untuk menyelesaikan.a