Fagocitose De Células Apoptóticas Por Macrófagos

Humanos

Análise Por Citometria De Fluxo

Células apoptóticas são fagocitadas pelos

macrófagos humanos?

Materiais

Populações de• Macrófagos

• Neutrófilos

• Células apoptóticas

Marcadores:• CMFDA (5-cloromethylfluorescein diacetate)

• CD 14

• CD 15

• CD 16

• CD 62

Métodos

Citometria de Fluxo

Microscopia

Fluorescência

Problemas

Lavagem dos macrófagos – perda de células

Dificuldade na discriminação de células interiorizadas e periféricas

Quantificação microscópica demorada e pode conter erros significativos

Métodos

Amostra em fases – Percoll• Sangue periférico

• Células mononucleares

• Células polimorfonucleares

Separar os polimorfonucleares (95% neutrófilos)

• Ressuspender

• Centrifugar

• Incubar

Métodos

Neutrófilos são marcados com CMFDA

Macrófagos incubados com neutrófilos

Promove-se a fagocitose

Análise por citometria

Resultados – CMFDA

CMFDA marca os neutrófilos sem afectar o processo de apoptose.

• Não altera a velocidade da fagocitose

• Não interfere na superfície da célula

• Não altera a viabilidade dos macrófagos

Resultados – Fluorescência

Duas populações distintas de neutrófilos• Uniformidade da marcação

• Intensidade da fluorescência

Resultados – Fagocitose

R1 analisado por fotomicroscopia• 96% macrófagos

fagocitaram.

R2 e R3 percentagem reduzida (3%)

Resultados – Taxa Fagocítica

Variações da taxa de fagocitose com estímulos exteriores

Resultados – Resposta Fagocítica

Resposta fagocítica máxima demorada

Subestimada

Resultados – Lavagens

Perda de células

Diminuição da capacidade fagocítica

Subestimada

Discussão

Apoptose e remoção das células apoptóticas é fundamental

A quantidade de ensaios aumenta a hipótese de erros

Discussão

A citometria de fluxo é um importante mecanismo:

• Na distinção das células interiorizadas, das periféricas,

• Remoção do erro do observador,

• Elevado número de amostras,

• Não necessita de lavagens.

Ciência Viva

Sara Jorge

Julho 2010