Algemeen:De artikels die u toegevoegd heeft aan de slides, moeten we daarvan de geel aangeduide tekst kennen?De artikels zijn enkel illustratief. Ik toon ze om jullie een voorbeeld te geven van wat we met een bepaalde methode zoal kunnen doen. De geel gemarkeerde delen bevatten de belangrijkste informatie. Het is niet de bedoeling dat jullie die artikels moeten kennen. Wel vraag ik soms op de examens om van een bepaalde methode een voorbeeld van een toepassing te geven, zodat ik weet dat jullie begrepen hebben waarvoor de methode dient. Dat hoeft dan zeker niet het voorbeeld te zijn van op de slide. je mag daar gerust een ander fictief voorbeeld voor bedenken.

Is er een (groot) verschil tussen het gebruik van sonificatie en lyseren voor mogelijke schade aan het DNA, celorganellen, lipiden etc waardoor men één boven een ander zou verkiezen? Zijn hier dus indicaties waarom een methode wel of niet zou gebruikt mogen worden om de kwaliteit van DNA te garanderen voor komende onderzoeken. Hiervoor heb ik geen duidelijk antwoord gevonden in de cursus.Sonicatie is een methode waarbij DNA makkelijk zal fragmenteren. Als je achteraf een methode wil gebruiken waarvoor je lang intact DNA nodig hebt (bv Southern blotting) gebruik je best geen sonicatie.

Slide 3-5: Wat is juist dedifferentiatie van een weefsel?Dedifferentiatie is een proces waarbij cellen hun weefselspecifieke karakteristieken verliezen. Bv. Levercellen maken typische levereiwitten. Prostaatcellen maken prostaateiwitten. Als deze cellen dedifferentiëren maken ze deze specifieke eiwitten niet meer of veel minder.

Slide 3-6:Verschil tussen digestie en trypsinisatieDigestie is een algemenere term en kan gebeuren door bv hyaluronidase en/of trypsine

Slide 3-8:Wat gebeurt er precies wannneer je cellen transfecteerd met SV40 large T antigen?SV40 T (large T) antigen achieves immortalization by inactivating the tumor suppressor genes p53, Rb, and others that can induce a replicative senescent state in cells. Recent studies have also shown that SV40 T antigen can induce Telomerase activity in the infected cells.

Slide 3-10 :Waarom is het een nadeel dat kankercellijnen vaak een heterogeen karyotype hebben?Het gevolg van het feit dat kankercellijnen vaak een heterogeen karyotype hebben, is dat individuele cellen van de cultuur verschillend zijn en zich verschillend kunnen gedragen. Dat is vooral een nadeel als je deze cellen stabiel transfereert bv met een shRNA of met een crisp/cas9 construct. In die gevallen moet je vaak individuele kolonies oppikken voor verdere studie omdat het construct niet in alle cellen op dezelfde wijze is ingebouwd, of omdat in het geval van crispr/cas9 verschillende editing gebeurt in individuele cellen door het DN hetstelmechanisme. Als de cellijn waarvan je vertrokken bent op zich al hetergeen is, zullen d opgepikte kolonies ook al van elkaar verschillen, los van de transfectie die je gedaan hebt. Als je met deze cellen functionele studies doet (proliferatie, overleving, migratie,

invasivitiet) is het vaak een probleem om uit te maken of de verschillen die je ziet in de sublijnenn die je afleidt van individuele kolonies het gevolg zijn van de editing of onderdrukking van jouw gen in kwestie, dan wel of dit gewoon interindividuele verschillen zijn ten gevolge van de oorspronkelijke heterogeniteit in karyotype.

Slide 3-12:Zijn de modelorganismen leerstof? De modelorganismen zijn geen echte leerstof en je hoeft zeker de details niet te kennen (aantal chromosomen etc). Het is wel nuttig dat je weet welke organismen er zoal gebruikt worden en wat het nut of voordeel is van sommige van die organismen (bv snelle reproductie, makkelijk manipuleerbaar, transparant in het geval van zebravisjes, makkelijk injecteerbaar in het geval van xenopus eitjes etc.

Slide 3-19:Hoe werkt de microdissectie met een IR laser en film?Op het weefsel waarvan je microdissectie wil doen breng jee dun laagje plastiekfolie aan. Met een infraroodlaser schijn je op de cell die je uit het weefsel wil halen. Op die platsen zal de plastiek smelten, zdat je die cellen uit het weefsel kan halen.

Slide 3-20:Hoe worden beads gebruikt om cellen te lyseren?De beads zijn bewoon kleine plastieken, glazen of metalen bolletjes die je toevoegt aan het weefsel. Hier ga je nu sterkt mee schudden (in een toestel) zodat de bolletjes herhaaldelijk tegen het weefsel beuken en het stuk maken.

Slide 3-20: Hoe werkt de Dounce methode en de French Press?Een Dounce homogeniser bestaat uit een glazen buisje maar daarin een nauw passende glazen pestel of staafje. Het systeem komt gewoonlijk met een ste van minstens twee staafjes van verschilelnd edikte zodat je de opening tussen het buisje en het staafje kan kiezen afhankelijk van in welke mate je de cellen wil lyseren, bv kernen nog intact of niet. Een Potter Elvehjem bestaat uit een glazen buisje met daarin een Teflon stamper. De French brengt weefsel of cellen onder hoge druk. Daarna wordt de druk plots verllaagd. Hierdoor ontstaan er belletjes die het weefsel of de cellen fragmenteren.

Slide 3-20:We vinden het onduidelijk wat de volgorde is van de weefselhomogenisatie en cellyse. Duidt de homogenisatie op het homogeniseren van het weefselstaal of van de alreeds gelyseerde cellen? En wat is het verschil met fractioneren?Weefselhomogenisatie en cellyse gaan vaak gepaard. Als je weefsel homogeniseert, ga je, afhankelijk van de methode, meestal ook de cellen stuk doen (tenzij je weefsel enzymatisch digereert bv met hyaluronidase en trypsine). Met fractioneren bedoelen we de subcellulaire organellen van elkaar scheiden (mitochondriën, kernen, membranen etc).

Slide 4-6:

Bij de formule k=t/S, staat deze S voor sedimentatiecoëffcient kleine s ? en voor wat staat de k-factor? Tijd waarin de sedimentatie van 1 deeltje gebeurt? De k-factor = tijd (t) gedeeld door de sedementatiecoefficient in Svedberg (S). De k-factor is een eigenschap die vastligt voor een bepaalde rotor en vertegenwoordigt de relatieve pelletting-efficiëntie van een rotor bij maximale snelheid. De k-factor kan gebuikt worden om de tijd (in uren) in the schatten om een deeltje met een bepaalde sedimentatiecoëfficient (in Svedberg) te sedimenten. Hoe kleiner de k, hoe sneller de sedimentatie van het deeltje en dus hoe beter de rotor.

Slide 4-8: Wilt u mij nog eens uitleggen hoe evenwichts sedimentatie werkt? Bij rate zonale centrifugatie ga je deeltjes scheiden volgens grootte en niet volgens densiteit. Als je te lang draait zit alles op de bodem. Je kan hiermee dus deeltjes scheiden die dezelfde densiteit hebben, maar verschillende massa's. Denk bv aan antistoffen. Bij isopicnische of evenwichtscentrifugatie ga je echt scheiden volgens densiteit. Je mag draaien zolang je wil, de deeltjes blijven mooi in de gradient zitten volgens hun densiteit. Het wordt o.a. gebruikt voor bereiding van DNA (CsCl centrifugatie) (zie hoofdstuk DNA analyse). Hier een passage uit een boek, dat de zaak misschien wat verduidelijkt.: Rate zonal (size) separation Rate-zonal separation takes advantage of particle size and mass instead of particle density for sedimentation. Figure 2 illustrates a rate-zonal separation process and the criteria for successful rate-zonal separation. Examples of common applications include separation of cellular organelles such as endosomes or separation of proteins, such as antibodies. For instance, Antibody classes all have very similar densities, but different masses. Thus, separation based on mass will separate the different classes, whereas separation based on density will not be able to resolve these antibody classes.

Criteria for successful rate-zonal centrifugation:

• Density of the sample solution must be less than that of the lowest density portion of the gradient.• Density of the sample particle must be greater than that of the highest density portion of the gradient.

• The pathlength of the gradient must be sufficient for the separation to occur.

• Time is important. If you perform too long runs, particles may all pellet at the bottom of the tube. Isopycnic separation: In this type of separation, a particle of a particular density will sink during centrifugation until a position is reached where the density of the surrounding solution is exactly the same as the density of the particle. Once this quasi-equilibrium is reached, the length of centrifugation does not have any influence on the migration of the particle. A common example for this method is separation of nucleic acids in a CsCl gradient. Figure 3 illustrates the isopycnic separation and criteria for successful separation.

Criteria for successful isopycnic separation:

• Density of the sample particle must fall within the limits of the gradient densities.

• Any gradient length is acceptable.

• The run time must be sufficient for the particles to band at their isopycnic point. Excessive run times have no adverse effect.

Slide 4-8:Gradiënt vooraf aanbrengen vs. ontstaan tijdens centrifugatie. Staal mengen met medium vs.

bovenaan aanbrengen. Wat gebruik je bij welke methode?Dat hang af van de gradientvormer die je gebruikt. Zie slide 4-9. Sommige vormen spontaan een gradiënt (bv CsCl), met andere moet je voroaf een gradiënt maken (bv sucrose). Sommige (bv sucrose) zijn zo visceus bij hoge concentraties dat je er geen evenwichts-sedimentie mee kan doen omdat geen voldoende hoge concentratie kan bereiken owv de viscositeit. Andere zoals Ficoll kan je gebruiken voor zowel snelheids- als evenwichts-sedimentatie.

Slide 4-13: Hoe werkt de zonale rotor?Zonale rotoren zijn rotoren die ontworpen zijn om grote volumes te kunnen centrifugeren. Ze hebben geen buisjes maar gewoon een grote kuip. Via een buisje het verst van de as verwijderd wordt er voortdurend vloeistof toegevoegd. Via een buisje dicht bij de as wordt er vloeistof weggenomen. Hierdoor krijgen we continue doorstroming en kunnen we erg grote volumes centrifugeren, veel groter dan de inhoud van de kuip. Septa (of tussenschotten) voorkomen dat er teveel convectie optreedt.

Slide 4-19: Hoe werkt de absorptiefilter en de dichroïsche filter?Een absorptiefilter is een filter die voornamelijk golven van een bepaalde golflengte doorlaat bv groen licht. Absorption filters work on the premise of being able to filter light by absorbing all other wavelengths that aren't of interest. They are normally constructed from a colored glass that absorbs over a wide range. Although normally cheaper than interference filters, absorbance filters tend to be less precise at filtering for a selected wavelength and also have the added penalty of absorbing some of the selected light thus lowering the intensity; Een dichroïsche spiegel is een interferntiefilter. Intereference filters are designed to provide constructive or destructive interference of light by taking advantage of the refraction of light through different materials. As light passes from one medium to the other the direction and wavelength of light can be changed based on the index of refraction of both mediums involved and the angle of the incident and exiting light (For more look at Snell's Law). Due to this behavior, constructive and destructive interference can be controlled by varying the thickness (d) of a transparent dielectric material between two semi-reflective sheets and the angle the light is shined upon the surface. As light hits the first semi-reflective sheet, a portion is reflected, while the rest travels through the dielectric to be bent and reflected by the second semi-reflective sheet. If the conditions are correct, the reflected light and the initial incident light will be in phase and constructive interference occurs for only a particular wavelength.

Slide 4-20:Hoe werkt het rooster?Het rooster is een plaatje met heel fijne groefjes. Het licht dat in de groefjes valt, wordt gereflecteerd en zal met elkaar interfereren afhankelijk van de hoek en de golflengte. Hierdoor wordt het licht opgesplitst in verschillend kleuren net zoals bij een prisma. Een mooi voorbeeld hiervan is de klassieke muziek CD. Aan de kant waar de muziek staat in gegraveerd zie je ook dit kleurenspectrum omdat ook hier via grating het licht in de groefjes opsplits in verschillende kleuren. De juiste uitleg is nogal ingewikkeld en vind je hier als je ge¨netersserd bent: http://www.star.ac.za/course-resources/local/david-buckley/spec1.pdf

Slide 4-27:Ik ben in de war over het begrip autoradiografie: bevat je staal dat je wil onderzoeken een bepaalde radioactieve stof en wordt deze dichtbij een emulsie met zilver geplaatst? Wordt de energie van je staal overgedragen naar de film? Is het doel gewoon dat je kan zien waar een bepaalde stof (die je dan radioactief merkt juist zit?Helemaal juist.

Slide 4-27: Bij deze slide snap ik enkel het eerste puntje. Wat doe je met de Atomen H, C, S en P bij deze methode? zijn dit Bèta stralers? en hoezo een lage energie geeft een scherp beeld? Waarom geven sterke Bèta stralers geen efeect op het scherm en hoe wordt hiervoor een intensifierend scherm gebruikt? Wat is juist een Phosfor imager en hoe wordt deze gebruikt voor een beeld te maken? Hebben jullie dit niet gezien bij het vak radioisotopen? Een lage energie geeft een scherp beeld want de golven geraken minder ver er is minder verstrooiing. Sterke stralen gaan gewoon door een scherm. Een intensifiërend scherm vangt de stralen op en zet ze om naar licht. Een phosphorimager is een toestel dat gebruik maakt van een fosforscherm dat de energie van (zwakke) radioactieve stralen opslaat over langere tijd. Als je deze plaat achteraf met zichtbaar licht afscant, krijg je een luminescent signaal op die plaatsen waar de energie was opgeslagen. Zo krijg je een radiografisch beeld ondanks de lage straling.

Slide 4-30: Hoe werkt verdelingschromatografie. Bestaat deze uit een mobiele vloeibare fase en een stationaire vloeibare fase? hoe blijven deze aan elkaar ‘hangen’Bij verdelingen of partition chromatografie kan een deeltje in de mobiel fase (kan vloeistof of gas zijn) een tijdje gaan verblijven in een vaste vloeistoffase die als een dun laagje aan een vaste drager hangt. .Afhankelijk van hun eigenschappen blijven ze daar kort of lang, waardoor de moleculen kunnen gescheiden worden.Slide 5-35

Slide 4-36:Hoe werkt de Bioanalyzer juist?De werking van de bioanalyzer is zeer gelijkaardig aan die van gelektroforese maar alles is geminiaturiseerd en als kant)en-klaar systeem aangeboden. Zie http://biomedicalgenomics.org/How_does_Agilent_2100_Bioanalyzer_work.html voor een eenvoudige uitleg.

Slide 5-1:Deze vraag heeft niet echt betrekking op 1 slide, maar gaat over whole genome sequencing in het algemeen. Ik begrijp niet helemaal hoe de mapping gebeurd indien er de novo gesequenced wordt. Ik begrijp wel het principe van shotgun sequencing, waar er gekeken wordt naar de overlap (contigs), maar hoe wordt de volgorde van deze grotere stukken dan precies bepaald? Ik zal proberen dit te verklaren aan de hand van het Human Genome Project. Het Human Genome Project was een grootscheeps internationaal project om het humane genoom voor het eerst te sequencen. Het genoom van de mens is enorm groot (3 miljard basen) en bevat veel repetitieve

sequenties. Om het voor de eerste keer te sequencen, heeft men het eerst onderverdeeld in kleinere stukken die gecloneerd werden in BACS en YACS en verder in kleinere plasmiden. Om niet teveel te moeten sequencen (als we random fragmenten sequencen, moeten we veel meer sequentiereacties doen om alle regio's minstens 1x gedaan te hebben) en om achteraf de sequenties van de verschillende clones aan elkaar te kunnen hangen (is moeilijk owv repetitieve sequenties), heeft men eerst het genoom gemapt. Met mapping bedoelen we: een restrictiemap maken van het genoom en van de clones van een genomische bank (in BACS en YACS), zodat we de weten welke fragmenten elkaar juist opvolgen. We doen dit door restrictiedigestie (met verschillende restrictie-enzymen) en Southern blotting (telkens met een ander fragment als probe) waardoor we kunnen zien welke fragmenten of welke clones op elkaar volgen. Als we deze clones en subclones nu gaan sequencen weten we hoe we al deze sequenties aan elkaar moeten plakken. Deze aanpak noemen we hiërarchische shotgun sequencing: hierarchisch omdat we eerst mappen en shotgun omdat we grote gemapte fragmenten opspliten in kleinere en deze random sequencen.

Slide 5-1:Er staat in de cursus dat bij next generation sequencing, het niet meer nodig is om het target DNA te kloneren in vectoren alvorens te sequencen. Maar indien er met de shotgun methode gewerkt wordt, moet dit toch wel gebeuren, aangezien er anders geen overlap mogelijk is en dus de volgorde van de fragmenten niet bepaald kan worden? Ik ben niet zeker of mijn redenering klopt. Bij klassieke sequencing doen we aan klonering om de aparte fragmenten te kunnen amplificeren in bacteriën om er voldoende materiaal van te hebben voor de sequencing. Bij next generation sequencing is die amplificatie in bacteriën via klonering niet nodig omdat we amplificatie doen dmv PCR op het gefragmenteerde DNA. Dat spaart heel veel werk en tijd. Het grote DNA (zelfs hele genoom) wordt gewoon random gefragmenteerd, geamplificeerd via PCR en al deze fragmentjes worden gesequenced. De sequenties van al deze fragmentjes worden door de computer gealigneerd volgen overlappende sequenties (vandaar belang van random fragmententatie en geen gebruik van restrictie-enzymen) zodat er zeker overlap tussen de fragmentjes is. ER komt dus geen klonering meer aan te pas en er moeten dus ook geen sequenties van aparte klones nog aan elkaar gehangen worden zoals bij het Human Genome Project wel het geval was.

Slide 5-7:Waarvoor staat de RT?RT staat hier voor Room Temperature, kamertemperatuur

Slide 5-11:Chemische synthese (5.2 in vitro synthese van DNA, puntje a)Wat doen we eigenlijk bij deze techniek? Wat zijn de verschillende stappen in de cyclus? Wat gebeurt er bij stap 2 en de volgende?Met deze methode maken we DNA helemaal synthetisch (dus niet met een DNA polymerase). We hangen gewoon basen chemisch aan elkaar in vitro. Dit heeft als voordeel dat we geen template nodig hebben en we willekeurig DNA kunnen maken. Typische voorbeelden zijn oligonucleotiden die we gebruiken voor PCR. Deze worden op deze wijze aangemaakt. De synthese gebeurt op een vaste drager: Controlled Pore Glass (CPG) (= glazen beads met kleine proriën) of Macroporous Polystyrene (=plastiek met kleine poriën). Om nucleotiden synthetisch aan elkaar te koppelen moeten de fosfaatgroepen voldoende reactief zijn. Dat wordt bereikt door diisopropyl phosphoramidite analogen te gebruiken. Om de nucleotiden specifiek te koppelen moeten alle reactieve zijgroepen van de nucleotiden beschermd

worden. Op de 5' OH positie is dat door een dimethoxytrityl-groep. (bij de eerste base moet deze ook beschermd zijn om deze specifiek aan de bead te koppelen, tenzij we beads kopen met een kant en klare eerste base). We verwijderen deze beschermende groep in zuur milieu om een volgende nucleotide te kunnen koppelen. Een klein percentage (ongeveer 2%) van de nucleotiden aan de bead zal geen reactie ondergaan met een nieuw nucleotide, omdat de efficientie van de reactie nooit 100% is. Er blijft dan een vrije OH groep over waarmee In een volgende stap misschien wel een nucleotide zal reageren, zodat we een getrunceerde keten bekomen, want er mist dan een nucleotide. Om dit probleem te vermijden worden de vrije OH groepen (die niet gereageerd hebben met een inkomend nucleotide) geacetyleerd, zodat ze niet meer verder kunnen reageren. Dit noemen we "capping". Met "oxidatie" bedoelen we dat de trivalente fosforgroep wordt omgezet naar een pentavalente vorm (toevoeging van O) die meer stabiel en natuurlijk is. Soms wordt de O vervangen door een S, zodat we een molecule krijgen die minder makkelijk kan afgebroken worden door nucleases. In dat geval wordt de volgorde van capping en oxidatie omgekeerd. We herhalen de hele cyclus tot we het volledige oligonucleotide gesynthetiseerd hebben. Op het einde worden alle protectieve groepen en de resten van de phosphoramidite groep (cyanoethyl) er chemisch af gehaald.

Slide 5-18:Waarom heeft Nested PCR twee verschillende primersets nodig?Met deze methode wil men zeer kleine hoeveelheden DNA kloneren/amplificeren.Waarom heeft men hier dan twee verschillende sets van primers voor nodig?De beide sets zullen van elkaar verschillen in sequentie en daardoor zal er toch bij een van de twee sets verlies optreden van een deel van de sequentie bij PCR amplificatie? Dit is toch net iets dat men niet wil, aangezien men weinig of kleine stukken DNA heeft om mee te werken. Waarom kan 1 set van primers niet voldoen? De reden waarom we geen twee opeenvolgende PCR reacties doen met eenzelfde primerset, is als volgt. Bij elke PCR-reactie kan er een kleine fractie foutieve fragmenten aangemaakt worden doordat een primer zelden 100% specifiek bindt. Als je met hetzelfde primerset een nieuwe PCR-reactie inzet met het eerste reactieproduct als template, ga je ook de foutieve fragmenten verder versterken. Als je interne primers kiest voor de tweede PCR, ga je alleen de juiste fragmenten verder amplificeren, zodat het eindproduct veel specifieker is. Het uiteindelijke PCR fragment is natuurlijk iets korter dan het eerste fragment, maar daar hou je rekening mee als je de primers kiest, zodat je toch eindigt met het gewenste fragment.

Slide 5-19:Voor het amplificeren van langere fragmenten worden Taq en Pfu gecombineerd, maar ik kan mij dit niet goed voorstellen. Doet eerst Taq zijn werk en daarna Pfu om eventuele fouten te herstellen? Of starten ze samen maar op verschilllende plaatsen? ...Taq polymerase is erg snel omdat het geen proofreading heeft, maar het maakt veel fouten. Telkens als er een foutief nucleotide ingebouwd wordt, valt de reactie even stil. Daarom werkt dit niet goed voor lange temptaties. Enzymen met proofreading kunnen fouten wel herstellen maar zijn daardoor wat traag om lange templates te kunnen amplificeren. Daarom mengt men deze twee: Taq polymerase + een beetje van een enzym met proofreading bv Pfu. Er wordt van uit gegaan dat waneer Taq een fout maakt, het even stopt en makkelijk van de streng komt. Pfu herstelt deze fout en zal daarna weer vervangen worden door Taq omdat dat veel meer (10x meer) in het mengsel voorkomt dan Pfu.

Slide 5-19:Hier staat een filmpje waarin de werking van multiplex PCR is uitgelegd. Moeten we deze werking kennen of is de uitleg op de slides voldoende?Het filmpje op slide 5-19 is lauter een illustratie van de techniek en moet als dusdanig niet gekend zijn. Als je het principe kent zoals uitgelegd op de slide is dat voldoende.

Slide 5-20:Moeten we al de formules die bij de OD meting horen, kennen? Of is enkel de bovenste formule voldoende?Van slide 5-20 zou je wel het bovenste formuletje moeten kennen evenals de verklaring van de symbolen rechts. Als je dat kent is het tweede formuletje ook evident want dat is gewoon de omzetting van concentratie naar molariteit op basis van het Mw van baseparen en de lengte in kb. Voor oligonucleotiden wordt gewoonlijk het onderste formuletje gebruikt dat gebaseerd op de absorptiewaarden van individuele nucleotiden. Dat moet je niet van buiten leren. Als je dat later nodig hebt in het labo zoek je dat gewoon op.

Slide 5.20:Hoe kom je aan die 13.2 en 10 en de onderste bewerking de noemer?De 13.2 is de invulling van F en Mw in de voorgaande formule. F voor ds DNA is 50 en Mw van een basepaar is 660 (660:50= 13.2). Idem voor 10. Voor ssDNA is F=330 en Mw= 330. Men heeft hier de F van ssDN genomen. Afhankelijk van de lengte van de oligonucleotiden (vooral voor erg korte) kan je voor F ook 20 nemen. Voor oligonucleotiden kloppen deze regels niet zo goed, vandaar dat je daarvoor best de onderste formule neemt waarbij in de noemer rekening gehouden wordt met het aantal A’s, G’s, C’s en T’s die allemaal in rekening gebracht worden met een specifieke coëfficiënt omdat de verschillende basen in verschillend mate absorberen.

Slide 5.23:Wat is een star- actviteit en wat wordt er bedoeld met dubbele digestie?Star activiteit is een fenomeen waarbij restrictie-enzymen die in de foute buffer zitten (gewoonlijk bij te hoge zoutconcentraties) op foutieve plaatsen gaan knippen, gewoonlijk herkennen ze dan 4 basen ipv 6, waardoor ze dus vaker knippen dan normaal. Met dubbele digestie bedoelen we knippen met twee restrictiesenzymes in één buffersusteem. Hiervoor moet je een buffer kiezen die best past voor beide restrictie-enzymes. Vaak is dat een compromis waarbij beide enzymen sub-optimale activiteit vertonen (geen maximale efficiëntie), maar waarbij je oplet dat ze nog wel specifiek knippen (vermijden van star-activiteit).

Slide 5.25:Hoe kan je een specifiek dna fragment detecteren als je random primers gebruikt?Je vertrekt van een specifiek DNA fragment bv een cDNA van het gen coderend voor beta-actine. Dat specifieke DNA ga je merken door gebruikt te maken van random primers zodat je verschillende korte gemerkte fragmentjes hebt die hele cDNA vertegenwoordig. Deze fragmentjes vertegenwoordigen echter allemaal het cDNA van beta-actine zodat je er ook alleen het beta-actin-gen mee zou detecteren bv op een Southern blot of een Northern blot.

Slide 5-27: Ik snap het principe van pulse field denk ik wel. Door de richting van het elektrisch veld steeds te veranderen, hebben grote DNA-moleculen niet de kans om verticaal te draaien en zo door de gel matrix heen te zakken. Maar hierdoor blijven deze grote DNA-moleculen gewoon bovenop de matrix liggen, en zijn ze toch nog niet gescheiden op basis van grootte?Zoals bij gewone agarose gelelktroforese wordt het DNA niet op het gel aangebracht maar in een putje in het gel zodat het er wel doorheen moet migreren oiv de elektrische stroom. Om ervoor te zorgen dat het DNA niet overlangs als een worm doorheen het gel zal gaan migeren en daar niet volgens grootte wordt gescheiden, wordt de richting van het veld voortdurend gewisseld over de twee elektrodensets op de hoeken.

Slide 5-31:Ik snap adhv de tekening wat cloneren met recombinatiesystemen is, maar ik begrijp niet waarom we het niet meteen zouden cloneren in de juiste vector (waarom we niet meteen het cDNA cloneren in het acceptorplasmide en we dus eerst een donor plasmide gebruiken). Het entry- of donorplasmide is zo ontworpen met bv verschillende restrictiesites zodat je er makkelijk jouw cDNA in kan brengen netjes tussen de sites die herkent worden door het recombinase. Eens dit gedaan is, is het zeer gemakkelijk om het cDNA via recombinatie uit te wisselen naar verschillende andere vectoren bv voor eukaryote expresse, bacteriële expressie, expressie als fusie met GFP etc. Deze acceptorvectoren hebben al deze restictiesites niet meer want ze zijn ontworpen om te recombineren met het donorplasmide, vandaar dat je eerst in een entry- of donorplasmide kloneert. Deze eenvoudige uitwisseling van het cDNA achteraf is de kracht van heel het systeem. Als je voor jouw cDNA maar één toepassing hebt, bv tot expressie brengen in een eukaryote expressievector, hoef je geen gebruikt te maken van een recombinatiesysteem en kan je eventueel gewoon rechtstreeks in een klassieke eukaryote expressievector kloneren.

Slide 5-31:Cloneren met recombinante systemen (slide 5-31)Ik begrijp het algemeen principe niet. Gebruikt men hierbij nog restrictie-enzymen? Wat is het verschil met overcloneren en wat bedoelt men dan juist met overcloneren? Als men zou overcloneren, hoe zou het dan bijvoorbeeld met de GATEWAY zijn en wat is het principe nu met de GATEWAY?Bij cloneren met een gewone vector, wordt er gewerkt met restrictie-enzymen en wordt een DNA fragment in de vector geligeerd met behulp van DNA ligase. Als we het fragment willen overcloneren naar een andere vector bv een expressievector moeten we opnieuw het fragment eruit knippen en ligeren in een andere vector. Vaak zijn er problemen met niet compatiebele restrictiesites en het proces is sowieso gewoonlijk niet erg efficiënt en arbeidsintensief. Als onze vector een herkenningsplaats heeft voor een recombinase hoeven we maar 1 keer ons fragment in dergelijke vector (donorvector) te kloneren op de klassieke manier. Daarna kunnen we heel makkelijk via recombinasen (en dus niet via klassieke restrictiedigestie en ligatie) het fragment overbrengen naar andere vectoren (acceptorvector bv expressievector) die ook dergelijke recombinatiesites hebben. Dat is veel efficiënter en bespaart veel werk en tijd. Er zijn verschillende commerciële systemen: Gateway, Echo, Creator,... Het komt allemaal wat op hetzelfde principe neer, maar de aard van het recombinase en de wijze van selectie van recombinante klones zijn verschillend. Bij het Gateway-systeem cloneer je eerst op klassieke wijze het fragment van interesse in de donorvector zodat het fragment (bv cDNA) tussen twee recombinatie-sites

van het bacteriofaag lambda recombinase komt te zitten. Je recombineert dit construct dan met een acceptorvector. Om te kunnen selecteren voor gecombineerde klones, heeft het acceptorplasmide een ccdB gen dat codeert voor een bacterieel ligase. Als het recombinatieproduct in bacteriën getransformeerd wordt die gevoelig zijn voor ccdB, zullen bacteriën die het niet-gerecombineerde acceptorplasmide hebben, niet kunnen groeien. Van de gerecombineerde plasmiden zal enkel het juiste, waarbij het fragment van interesse het ccdB vervangen heeft, aanleiding kunnen geven tot kolonies. Het nevenproduct van recombinatie is ook onleefbaar. Dus alleen het juiste construct kan leiden tot kolonievorming. Bij Echo wordt een ander recombinase gebruikt en worden de twee plasmiden gefuseerd. Bij Creator wordt er geselecteerd voor het juiste construct in gram-negatieve bacteriën op basis van chloramphenicol en een sucrase dat tot celdood leidt in gram-negatieve bacteriën.

Slide 5-33:Transformatie en elektroporatie staan uitgelegd in twee verschillende puntjes. Zijn dit dan twee verschillende zaken? Want ik dacht dat elektroporatie een vorm van transformatie is, omdat door de elektrische shock de membraan van het bacterie opent en het DNA opgenomen kan worden?Je zou elektroporatie inderdaad kunnen zien als een vorm van transformatie. Correcter zou het zijn te spreken over chemische transformatie en elektroporatie.

Slide 5-35:Is het mogelijk om wat meer uitleg te krijgen bij de figuur 'high density filter libraries (grids)' van hoofdstuk 5 dia 35.Ik begrijp de figuur niet volledig.De ‘high density filter libraries’ kan je beschouwen als een soort ‘microarray’. De term microarray wordt gewoonlijk gebruikt voor de microchips op glazen plaatjes met geordende en gekende sequenties van genen, cDNAs, oligo's. Bij de 'high density filter libraries', zijn het vaak ongekende clones van de bank die in nette rijtje gespot worden op een filter, cfr de bank van de vorige slide, maar dan ipv van random uitplating gebeurt dit mooi op rijtjes.

Slide 5-35:Blijft onduidelijk ook al staat het id freq ask questions.. (is er een screening voor large numbers of DNAclones?)De high density grid screening is eigenlijk net hetzelfde als de gewone library screening van slide 5-34), alleen worden hier de clones niet random uitgeplaat, maar worden ze netjes gespot in rijtjes en klommen zodat er veel meer clones op een klein oppervlak passen.

Slide 5-35:Ik begrijp het nut van screening van banken niet zo goed. Hoe kan je hier via alle kleine fragmenten van een gen het gehele gen uit afleiden?Op dezelfde slide begrijp ik het principe van filterscreening niet goed. Zou u dat nog eens kunnen uitleggen aub?Een bank is een collectie van kloons met allemaal verschillende fragmenten DNA. Een genomische bank bestaat uit kloons met allemaal verschillende genomische DNA fragmenten. Een cDNA bank bestaat uit kloons met allemaal verschillende cDNAs. Je gebruikt een bank als je bv een klein stukje DNA hebt en je wil het ganse gen hebben bv met introns en exons om een construct te maken voor homologe recombinatie om een gen uit te knocken. Of je wil een promoter hebben van een gen voor

promoter-reporterstdies. Of je hebt een klein stukje van een cDNA en je wil het ganse cDNA bv om het in een vector te brengen voor expressie. Als je kleine DNA sequenties nodig hebt kan je die makkelijkst aanmaken via PCR, maar als je grote fragmenten nodig hebt (bv voor homologe recombinaties of voor promotor studies), dan kan je best een bank screenen. Je kan dat doen op de klassieke manier zoals op slide 5-34 , via high density filter libraries zoals op slide 5-35 of via PCR screening zoals op slide 5-36. Bij de klassike methode (slide 5-34) plaat je bacteriën (elk met een apart DNA fragment) uit op een agarplaat en laat die overnacht groeien tot je mooie kolonies hebt. Op de agarplaat wordt een nitrocellulose- of nylon-membraan gelegd. Hieraan zullen van elke kolonie een aantal bacteriën vastplakken, de rest blijft op de agarplaat achter. Het membraan wordt nu omgekeerd op een andere agarplaat geplaatst om de bacteriën die hierop zitten verder te laten groeien om achertaf meer signaal te hebben (deze stap wordt soms weggelaten). Je neemt het membraan eraf na bv één dag, denatureert het DNA van de bacteriën die eraan hangen en hybridiseert met de gemerkte probe (een kort stukje DNA dat je hebt). Na autoradiografie kan je zien welke kolonie positief is. Nu neem je de originele agarplaat terug waarop eerst het membraan gelegen had en die je even terug in de incubator had gezet om de kolonies te laten regenereren, zodat er opnieuw meer bactereiën per kolonie zijn om een cultuur van te starten. Je pikt hiervan de positieve kolonie om deze in cultuur te brengen. Hiervan bereid je het DNA waarmee je nu kan verder werken voor andere toepassingen. De ‘high density filter libraries’ (slide 5-35) kan je beschouwen als een soort ‘microarray’. De term microarray wordt gewoonlijk gebruikt voor de microchips op glazen plaatjes met geordende en gekende sequenties van genen, cDNAs, oligo's. Bij de 'high density filter libraries', zijn het vaak ongekende clones van de bank die in nette rijtje gespot worden op een filter, cfr de bank van de vorige slide, maar dan ipv van random uitplating gebeurt dit mooi op rijtjes. PCR screening (slide 5-36) is een methode om uit een DNA bank het gen van interesse te isoleren op basis van PCR, zonder dat je de bank als bacteriekolonies of faagplaques hoeft uit te platen. De bank bestaat in dit geval uit een hele stapel 96-wel platen, waarin in elk putje een ander DNA fragment (bv gen) van de bank zit. Je gaat die bank screenen met PCR om te zien in welk putje jouw gen van interesse zit. Deze methode heb ik al eens uitgelegd in FAQ5.

Slide 5.25:Hoe kan je een specifiek dna fragment detecteren als je random primers gebruikt?Je vertrekt van een specifiek DNA fragment bv een cDNA van het gen coderend voor beta-actine. Dat specifieke DNA ga je merken door gebruikt te maken van random primers zodat je verschillende korte gemerkte fragmentjes hebt die hele cDNA vertegenwoordig. Deze fragmentjes vertegenwoordigen echter allemaal het cDNA van beta-actine zodat je er ook alleen het beta-actin-gen mee zou detecteren bv op een Southern blot of een Northern blot.

Slide 5-31:Ik snap adhv de tekening wat cloneren met recombinatiesystemen is, maar ik begrijp niet waarom we het niet meteen zouden cloneren in de juiste vector (waarom we niet meteen het cDNA cloneren in het acceptorplasmide en we dus eerst een donor plasmide gebruiken). Het entry- of donorplasmide is zo ontworpen met bv verschillende restrictiesites zodat je er makkelijk jouw cDNA in kan brengen netjes tussen de sites die herkent worden door het recombinase. Eens dit gedaan is, is het zeer gemakkelijk om het cDNA via recombinatie uit te wisselen naar verschillende andere vectoren bv voor eukaryote expresse, bacteriële expressie, expressie als fusie met GFP etc. Deze acceptorvectoren hebben al deze restictiesites niet meer want ze zijn ontworpen om te recombineren met het donorplasmide, vandaar dat je eerst in een entry- of donorplasmide kloneert. Deze eenvoudige

uitwisseling van het cDNA achteraf is de kracht van heel het systeem. Als je voor jouw cDNA maar één toepassing hebt, bv tot expressie brengen in een eukaryote expressievector, hoef je geen gebruikt te maken van een recombinatiesysteem en kan je eventueel gewoon rechtstreeks in een klassieke eukaryote expressievector kloneren.

Slide 5.36:Na het lezen van je antwoord bij vorige FACs begrijp ik nog steeds niet helemaal hoe pcr screening werkt. Wanneer je weet in welke superpool je fragment van interesse zit, snap ik niet hoe je dan via een juiste rij en kolom, plaat je jouw fragment kan vinden. Hoe wordt die 7*7*7 kubus gemaakt? Hoe maak je van een kolom en een rij een masterplaat?De library bestaat hier uit stapels platen met putjes waarin in elke putje een andere DNA clone zit. Je verdeelt d eplaten in een aantal stapels bv 5 stapels. Van elke stapel maak je een superpool voor clones van alle putjes van die spael te mengen en in één buisje te brengen. SP1 voor stapel 1, SP2 voor stapel 2 etc. Je voert nu eerst een PCR recatie uit op de 5 superpools. In de figuur is superpool 1 (SP1) postiief. Je weet nu dat de clone die je zoekt in stapel 1 zit. Van die stapel 1 hebben we een masterplaat. Op de masterplaat zitten plate pools (eerste twee kolommen). Zo is P1 het mengsel van clones van plaat 1 van stapel 1. P2 is het mengsel van alle clones van plaat 2 van stapel 1 enz. In kolommen 5 en 6 van de masterplaat zit een mengsel van de clones van specifiek rijen van stapel 1. Zo is RA het mengsel van rij A van alle platen in de stapel 1. RB is het mengsel van alle clones van rij B in staple 1. Kolommen 8 tot 10 van de masterplaat bevatten de mengsels van alle clones van specifieke kolommen van spatel 1. Bv C1 is het mengsel van alle clones van kolom 1 van alle platen van stapel 1.enz. Om de positieve clone te vonden in stapel 1 moet je dus enkel een PCR reactie uitvoeren op de masterplaat. In het voorbeeld op de slide waren putjes P2, RC en C9 positief. Dit zegt dat de positieve clone zit in plaat 2, rij C en kolom 9.

Slide 5-36:PCR screening. Het ging nogal snel in de les.PCR screening is een methode om uit een DNA bank het gen van interesse te isoleren op basis van PCR, zonder dat je de bank als bacteriekolonies of faagplaques hoeft uit te platen. De bank bestaat in dit geval uit een hele stapel 96-wel platen, waarin in elk putje een ander DNA fragment (bv gen) van de bank zit. Je gaat die bank screenen met PCR om te zien in welk putje jouw gen van interesse zit. Om niet alle platen te moeten screenen, worden de 96-well platen verdeeld in 5 stapels. Van elke stapel wordt een masterplaat gemaakt met putjes waarin telkens een hele plaat van de stapel gepoold is, of een bepaalde rij of kolom van de hele stapel gepoold is. Van elke stapel wordt ook superpool gemaakt. Dit een mengsel van alle putjes van een ganse stapel. We hebben zo dus 5 superpools (SP1 tot SP5). Om de bank te screenen, ga je eerst dmv PCR kijken in welk van de 5 superpools het gen zit waarin je geïnteresseerd bent. Van de superpool die de positief is (SP1 in het voorbeeld op slide 91) neem je nu een bijbehorende 96 well masterplaat waarop de pools van de platen, rijen en kolommen zitten. Op van welke putjes positief zijn, kan je precies zien in welke plaat, op welk rij en in welke kolom je kloon van interesse zit.

Slide 5-38:Ik begrijp hoe de methode werkt, maar vraag me af hoe de primers die men gebruikt gekozen worden.Want men vertrekt toch van een ongekende DNA-sequentie? Hoe weet men dan de juiste primersequentie?

Voor de Sanger sequencing kloneer je gewoonlijk het te sequencen fragment in een plasmide. Je gebruikt dan een primer die bindt in het plasmide (is gekende sequentie) net voor de cloneringsplaats.

Slide 5-40:Wat is het verschil tussen normale Sanger methode op gels en deze in capillairen?Is het verschil dat men functioneel gewoon meer wells heeft om parallel te meten?(Los staand van de andere opstelling)Meer parallele metingen is zeker een belangrijke reden waarom men capillairen gebruikt. Zo heb je systemen met 384 capillaire in parallel, terwijl er op een gel typisch maar 40 stalen tegelijktijd kunnen gelopen worden. Daarnaast, zijn capillairen heel wat sneller dan gels omdat ze beter af te koelen zijn dan gels, zodat je er een hogere stroom op kan zetten.

Slide 5-44 en 5-45:Ik snap de werking van de primer reset niet en de interpretatie van de sequentie.Bij sequencing by ligation wordt de DNA sequentie bepaald door sequentieel korte complementaire oligonucleotiden te ligeren aan een primer die aan het te sequencen fragment (vaak een adaptor) bindt. We werken hier met fluorescent gemerkte oligonucleotidenpools waarvan de eerste basen (dinucleotiden) de kleur bepalen. Deze twee basen worden gevolgd door random sequenties. Van deze pool van oligonucleotiden zal direct achter de primer alleen het oligonucleotide binden dat complementair is aan de te sequencen streng. Dit oligonucleotide wordt nu aan de primer geligeerd. Op basis van de kleur van het oligo kennen we eerste twee basen (een kleur komt overeen met 4 verschillende eerste basen, maar omdat we de voorgaande base kennen (in de primer) kennen we eenduidig de eerste twee basen van het geligeerde oligonucleotide) (zie verder). Het gebonden oligonucleotide wordt nu gekliefd tussen de nnn en zzz om de fluorescente groep te verwijderen. Hierdoor blijven de eerste vijf basen hangen (dinucleotide + nnn). We kunnen nu in een volgende ronde opnieuw een oligonucleotide ligeren en de kleur aflezen. Dit herhalen we nog enkele malen. Dit levert ons telkens informatie over 2 nucleotiden, gevolgd door 3 onbekende nucloetiden (nnn). We herhalen nu het hele proces met een primer die 1 base is opgeschoven. Nu lezen we ook telkens twee basen, maar die zijn een base opgeschoven tov de reeks reacties met de eerste primer. We doen dit nogmaals opnieuw met een primer die nog een base is opgeschoven. Als we alle informatie nu bij elkaar leggen, kunnen we de hele sequentie afleiden. Het afleiden van de sequentie toont op het eerste zicht wat complex omdat we 16 mogelijkheden van dinucleotiden hebben, en we maar werken met 4 kleuren. Eén kleur komt dus overeen met 4 mogelijke dinucleotiden zoals aangegeven in de figuur 'possible dinucleotides encoded by each color'. Het kleurenschema zit zo in elkaar dat als we als we de eerste base van de sequentie kennen (en die kennen we want we sequencen vanaf een primer met gekende sequentie) we de hele sequentie kunnen aflezen. Als de sequentie bv begint met een A en we krijgen een rode kleur, dan moet de volgende base een T zijn enz (zie figuur 'double interrogation' en figuur 'decoding'). De kleur duidt dus op een opeenvolging van nucleotiden. Het voordeel van dit systeem is dat elke base twee maal gelezen wordt. Dit verhoogt de betrouwbaarheid van de sequentie-analyse.

Slide 5-46:Hybridization sequencing. Ik begrijp niet wat men precies doet. Ik weet niet hoe ik me moet voorstellen hoe dit gebeurt.Deze methode wordt soms gebruikt voor mutatie-analyse van specifieke genen. Bij hybridization

sequencing maak je gebruik van een array met oligonucleotiden met specifieke sequenties waarmee je het gemerkte DNA fragment dat je wil sequencen, laat hybridiseren. De array bevat oligo's waarvan telkens één base verschilt. Alle mogelijke combinaties zitten op de array. De condities van hybridisatie zijn zodanig stringent dat 1 base verschil volstaat dat er geen binding is. Door te kijken aan welke oligo’s in de array het fragment bindt, kan je de sequentie bepalen.

Slide 5-47: Zou u het principe van shotgun nog eens kunnen uitleggen? In de les snapte ik het, maar nu zie ik niet goed meer hoe dat principe verloopt. En waarvoor dienen shotgun en primer walking nu weer juist?Shotgun en primer walking worden gebruikt om een DNA fragment te sequencing dat groter is dan de sequentie die we kunnen lezen in één reactie. Bv ik wil de sequentie kennen van een 10 kb lang fragment. Ik steek dit in een plasmide en bepaal met de Sanger methode de sequentie met primers in de vector (want de sequentie van het fragment ken ik niet). Met Sanger kan ik maar 1 kb lezen, zodat ik hierdoor alleen de uiteinden van het 10kb fragment kan sequencen. De 8 kb die ertussen zit, maar die sequentie wil ik ook kennen. Bij shotgun sequencing maak je van je grote DNA fragment kleinere fragmenten bv via restrictiedigestie. Je cloneert die in een vector en maakt een DNA bankje. Je pikt een aantal clones op van jouw bankje en bepaalt van elke cloon de sequentie met Sanger totdat je van het volledige DNA de sequentie hebt. Bij primer walking lees je met jouw sequentieprimer zo ver je kan. Op basis van het einde van de sequentie die je kan lezen ontwerp je een nieuwe primer. Hiermee zet je een nieuwe sequentie reactie in waarmee je de volgende 500 bp of zo kan aflezen. Op het einde van die sequentie ontwerp je weer een nieuwe primer en zo ga je verder tot je de volledige sequentie hebt.

Slide 5-48:Human genome project. De methode is hierarchische shotgyn sequencing. Waarom gaar men eerst klonen in YAC's, BAC's PAC's en cosmiden? Hoe begint men daarna met mappen?Met mapping bedoelen we dat we fragmenten van het genoom maken via restrictiedigestie, die in vectoren gaan steken en dmv Southern blotting gaan kijken hoe die fragmenten aan elkaar passen. De mapping is nuttig om later te weten waar ongeveer de sequenties die je leest, thuishoren. Het is namelijk zo dat er heel veel repetitief DNA in het genoom zit. Dat maakt het erg moeilijk om kleine stukjes sequenties juist te plaatsen in de uiteindelijke genoomsequentie (ze passen ongeveer op vele plaatsen). Als we YACs en BACs sequencen (shotgun binnen een BAC of YAC clone) en we daarna weten hoe deze YACs en BACs in de juiste volgorde aan elkaar passen kunnen we veel makkelijker de sequenties juist plaatsen. We weten op basis van de map al waar ze ongeveer thuis horen. Dat mappen vraagt natuurlijk enorm veel werk. Venter heeft dat niet gedaan om tijd en kosten van het mappen uit te sparen. Hij heeft gewoon random gesequenced (volledig shotgun). Dat maakte bij hem de assemblage van de fragmentjes veel moeilijker en moest hij hiervoor supercomputers ontwikkelen. Hij had wel het voordeel dat er al delen van het human genoom project bekend waren, zodat hij dit als kapstok kon gebruiken.

Slide 5-50: Wat wordt er juist bedoeld met tailored therapie?Hiermee bedoelen we therapie “op maat “van de patient. We kijken eerst welke genverschillen er zijn bij de patient en geven dan een therapie die meest geschikt is voor patiënten met dergelijke genverschillen.

Slide 5-50:Tailored therapie?Dit is therapie op maat van de patiënt. Men kijkt eerst welke mutaties er zijn en gaat dan een behandeling kiezen die specifiek gericht is tegen dieze mutatie. Bv bij melanomapatiënten komt vaak (maar niet altijd) een mutatie voor in het BRAF gen. Als men bij een patiënt dergelijke mutatie vindt, gaat men die behandelen met vemurafenib, een chemische inhibitor die specifiek gemuteerd BRAF inhibeert. Bij de meeste patiënten met dergelijk mutatie zal vemurafenib zorgen voor een spectaculaire regressie (terugdringen) van de tumor. Bij patiënten die niet dergelijke mutatie vertonen, heeft de inhibitor vaak omgekeerde effecten en doet die de tumor zelfs verder groeien. Het is dus belangrijk om op basis van de DNA sequentiebepaling, de juiste therapie te kiezen voor de juiste patiënt. Dat bedolen we met “tailored” therapie. (Tailor = kleermaker in het Engels; tailored = op maat gemaakt).

Slide 5-51:Miniaturisatie?Miniaturisatie betekent hier dat alles op kleinere schaal gebeurt. Bv in plaats van elke PCR reactie te doen in een apart Eppendorfje gaat men het doen in microreactors zoals bijemulsie-PCR. Sequencing reacties zal men niet langer doen in aparte Eppendorfjjes maar in kleine putjes van een plaatje met miljoenen dergelijke putjes naast elkaar staan.

Slide 5-53: Waarom moet er bij de voorbereiding van je DNA staal voor sequencing aan de ene kant van je fragment een A-adaptor hangen en aan de andere kant een B-adaptor? Waarom mogen dit niet bijvoorbeeld twee A-adaptoren zijn aan beide kanten van het DNA-fragment?De adaptoren dienen niet enkel voor PCR amplificatie, maar hier moeten later ook de sequentieprimers aan hybridiseren. Als we aan beide kanten dezelfde adaptor hebben, zal de sequentieprimer aan beide uiteinden van het fragment binden, en dus beide strengen tegelijkertijd sequencen, wat een onleesbare sequentie oplevert. Als we twee verschillende adaptoren gebruiken zal onze sequentieprimer selectief aan één uiteinde binden en krijgen we wel éénduidige sequentie van enkel één streng. Later kunnen we eventueel met een andere primer die de andere adaptor herkent de andere streng sequencen.

Slide 5-54 :454 Rochedus eerst gaan ze het DNA fragmenteren en dan adaptors toevoegen zodat de fragmenten op beads kunnen binden, maar gaan bij de eerste bead alle fragmenten op 1 bead binden (via biotine-avidine interactie) om zo u library te maken? Of is er hier al 1 fragment per bead? En dan gebeurt er denaturatie en gaan ze dan terug binden met een bead (via primer), maar nu dan elk fragment op een andere bead? voor de rest snap ik hoe het gebeurt, maar ik heb nog enkel vragen waarom we dit zo doen. Ik begrijp niet waarom we de bead nodig hebben en waarom we juist zoveel amplificaties nodig hebben? Dient de bead gewoon om de amplificaties samen te houden en moeten er zoveel amplificaties zijn omdat het licht signaal anders misschien te zwak is? Het genomisch DNA wordt eerst gefragmenteerd. Aan de fragmenten worden adaptoren geligeerd. Deze zijn nodig omdat hier achteraf de PCR primers moeten binden voor amplificatie (dit is nodig om voldoende signaal te kunnen krijgen, zie verder). Ook de sequencing primers binden hier aan (want de sequentie van de fragmenten zelf is voor elk fragment verschillend en maken we dus gebruik van adaptoren waartegen we wel sequencing primers kunnen ontwerpen). We werken met twee verschillende adaptoren. Als we aan beide kanten dezelfde adaptor zouden hebben, zal de

sequentieprimer aan beide uiteinden van het fragment binden, en dus beide strengen tegelijkertijd sequencen, wat een onleesbare sequentie oplevert. Als we twee verschillende adaptoren gebruiken zal onze sequentieprimer selectief aan één uiteinde binden en krijgen we wel éénduidige sequentie van enkel één streng. Om dit te verwezenlijken is één streng van adaptor B gebiotinyleerd aan het 5’ uiteinde. Om fragmenten met beide apatoren te selecteren, gebruiken we nu beads waaraan avidine hangt (dit is niet dezelfde bead die we gebruiken voor PCR, zie verder, en er mogen gerust meedere fragmenten binden per bead). Fragmenten die langs beide kanten een A adaptor hebben, hebben geen biotine en zullen niet binden. Deze worden weggewassen. Fragmenten die aan beide kanten een adaptor B (rood in figuurtje hieronder) hebben, zullen aan beide kanten binden aan de bead en een lusje vormen (zie figuurtje hieronder). Fragmenten met een A en B adaptor zullen alleen binden aan de kant van de B adaptor. De fragmenten worden nu gedenatureerd. Van de fragmenten met een A en en B adaptor komt er een streng vrij (de andere met de gebiotinyleerde streng blijft vast hangen). Het is de vrijgekomen streng die we collecteren en later gaan gebruiken (zie verder). Van het fragment met twee B adaptoren, zullen na denaturatie beide strengen blijven plakken (want allebei de kanten zijn gebiotinyleerd). Er komt dus geen streng vrij om aan de sequencing beads toe te voegen. Na denaturatoie komen er dus alleen fragmenten vrij met een A en een B adaptor. Deze enkelstrengen (die dus zowel A als B bevatten) voegen we toe de sequencing beads (dit zijn andere beads dan die hogerop gebruikt werden). Aan deze beads hangt een primer nodig voor PCR. Aan deze beads proberen we nu slechts éénDNA fragment te binden. Dat is een kwestie van verdunnen. Je verdunt het staal zodanig dat er statistisch één of geen fragment bindt aan elke bead. De beads waarbij er geen fragment gebonden is, kan je elimineren. Als we nu emulsie PCR doen, wordt het ene fragment vele malen gekopieerd op de bead. Dit is nodig om het fluorescent signaal van de sequencing reactie voldoende hoog te krijgen voor detectie. Zulke amplificatie wordt typisch gedaan bij de 2nd generation sequencing platforms. Bij de 3rd generation gaat men meestal wel werken met single molecules omdat men hier veel gevoeligere detectiesystemen ontwikkeld heeft. Per bead mag er uiteraard maar één soort (geamplifceerd) DNA fragment hangen, want het is per bead dat we de sequentiereactie aflezen (1 bead per putje). Als er meerdere verschillende fragmenten per bead zouden geamplificeerd, zou dit geen eenduidige sequentie geven.

Slide 5-58:Deze slide staat vol getallen. Moeten we niet memoriseren he?Degelijke getallen moet je inderdaad niet kennen, maar onthoud wel dat je met de 454 relatief lange sequenties kan lezen tov de andere systemen, waardoor dit platform het meest geschikt is voor de novo sequencing (nieuwe genomen die voor de eerste maal gesequenced worden). De kostprijs per base is wel hoog, wat dit platform minder geschikt maar voor routine sequencing. In dat geval zal je makkelijker kiezen voor bv de Illumina. De SOLID is dan weer heel erg accuraat.

Slide 5-67:Ik snap een bepaalde stap van de ilumna platform niet. Als je eindigt met allemaal clusters in de flowcel. Hoe gaat men dan te werk om die basen af te lezen? Heeft elke cluster allemaal dezelfde fragmenten en dus dezelfde sequentie? Wat is het voordeel dat je niet één keer maar een cluster van

je fragment hebt? Geeft dit gewoon een groter fluo signaal? Wordt hier gewoon direct een mengels van fluo nucleotiden aan toegevoegd die gemodificeerd zijn zodat er niet direct een tweede nucleotide kan ingebouwd worden? Meet je één voor één hetzelfde signaal van een cluster ? welke sequentie wordt er eigenlijk afgelezen, de gefragmenteerde stukken dna? of de complementaire nucleotidenseq?Bij het illumina platform wordt (net zoals bij de andere platforms) genomisch DNA gefragmenteerd en worden er, na size selection, adaptoren aan de fragmenten geligeerd. Deze fragmenten worden gedenatureerd en dan als enkelstrengige fragmenten verdund in een flow cell gebracht. Dit is een glazen plaatje waarop random en aan een hoge densiteit de twee primers gebonden zitten die complementair zijn aan de adpaptoren. Je kan je dat voorstellen als en "weide" met twee soorten grassprieten door elkaar. Hier en daar gaat er in die "weide" van primers een fragmentje (met adaptoren) aan binden. Dit kan doordat één van de adaptoren voorzien is met iets dat plakt aan de flow cell ofwel doordat het enkelstrengige fragmentje via de adaptor bindt aan een primer in de weide (afhankelijk van hoe het systeem gebruikt wordt). We hebben nu een weide van twee primers waarin hier en daar een enkelstrengig fragment met adaptors aan gebonden is. Door de Brownse beweging kan het vrije uiteinde van een gebonden fragment buigen totdat het ergens in zijn omgeving een primers tegenkomt die complementair is aan die adaptor. Er wordt dus een bruggetje gevormd (vandaar de benaming 'bridge PCR"). Vanaf deze primer kan nu het fragment gecopieerd worden zoals in een PCR reactie (alleen zitten hier de primers vast aan het plaatje van de flow cell) zodat we een dubbelstrengig bruggetje bekomen. Na denaturatie gaan de strengen uit elkaar en hebben we nu in de nabijgheid van het oorspronkelijke fragment een complementaire enkelstrengige copie van het fragment. Dit proces wordt meerdere malen herhaald waarbij telkens de fragmenten buigen en een bruggetje vormen en zo heel lokaal gecopieerd worden. Hierdoor ontstaan er "kolonies" van PCR fragmenten in de weide van primers. Elke kolonie is dus afkomstig van een ander individueel fragment en is dus clonaal. Binnen een kolonie komen de fragmenten allemaal overeen met éénzelfde DNA fragment want ze zijn geamplificeerd van 1 fragment. Elke kolonie heeft dus allemaal dezelfde fragmenten en dus dezelfde sequentie. Deze clonale amplificatie wordt inderdaad gedaan om het signaal te verhogen. Een kolonie gesaat uit zo’n 1000 identieke fragmenten en geeft dus ongeveer 1000 x zoveel fluorescent signaal na inbouw van een nucleotide dan wanner je maar één fragment zou hebben. Zulke amplificatie wordt typisch gedaan bij de 2nd generationsequencing platforms. Bij de 3rd generation gaat men meestal wel werken met single molecules omdat men hier veel gevoeligere detectiesystemen ontwikkeld heeft. Terug naar de Illumina. Deze kolonies vormen nu de basis voor de sequentiereactie. Hiervoor hybridiseer je een sequencingprimer aan de fragmenten van de kolonies die complementair is aan een van de adapteren. Bij deze methode met het Illumina platform maakt men gebruik van reversible chain terminator nucleotiden (zie mijn uitleg in FAQ2 slide 5-67) met 4 verschillende kleuren. De 4 verschillende nucleotiden hebben dus elk een eigen kleur (bv G= geel, C= blauw, T=groen, A=rood) en worden als mengsel toegevoegd. Omdat ze ‘terminator’ zijn kan er maar eentje ingebouwd worden. Omdat alle fragmenten binnen een cluster hetzelfde zijn, zal eenzelfde nucleotide ingebouwd worden op alle fragmenten binnen een cluster? Afhankelijk van de sequentie zal dat een A, C, G, of T zijn. Je kan dat bepalen aan de hand van de kleur. Je maakt dus een foto van het ganse plaatje met alle clusters en leest de kleur af van elke cluster. Zo ken je de eerste base van elke cluster. Nu haal je de terminator en de fluorescente groep eraf en vroeg je opnieuw het mengsel met de fluorescente reversibel terminator nucleotiden toe. Nu wordt de tweede base ingebouwd. J maakt weer een foto en je kijk weer naar welke kleur wordt ingebouwd in lek cluster. Zo ken je de 2de base. Je doen hetzelfde voor de 3 de base en de 4 enzovoort…tot je een 75-tal basen gesequenced hebt. Zo lees je de sequentie van de streng die complementair is aan streng waaraan de sequencing primer bindta. Je kan dit opnieuw doen als je wil met een andere sequeningprimer die overeenkomt met de andere adaptor, zodat je uiteindelijk van elk fragment van de fragmentenbank van

beide uiteindes de sequentie leest (van complementaire strengen).

Slide 5-67:Waarom kan men niet de 'gewone' Sanger methode toepassen? Wat is het probleem daarmee? Wat wordt er concreet bedoeld met een terminatorgroep, hoort de fluorescente groep daar ook bij?Wat bedoelt men op de volgende slide met die uitdagingen en de reference sequence?Bij de Sanger-methode worden dideoxy terminator nucleotiden gebruikt, bv ddGTP. Deze zijn niet reversibel. Als er zulke terminator wordt ingebouwd, stopt de synthese van die streng definitief. Aangezien er ook gewone nucleotiden aanwezig zijn, zal er random gestopt worden na een G. We krijgen dus een mengsel van fragmenten allemaal eindigend op een andere G. Als we hier zinvolle sequentie data uit willen halen, moeten we de fragmenten scheiden volgens hun grootte op een gel en kunnen we zo de sequentie aflezen als we dit voor de 4 reacties doen. Deze Sanger methode kunnen we niet gebruiken in het Illumina platform want er is geen scheiding van fragmenten. Als we Sanger zouden doen op de “kolonies” van de bridge amplificatie zijn alle kolonies positief voor alle ddNTPs en zijn er per kolonie allemaal sequentiefragmenten die op een verschillen nucleotide eindigen. Je zou dit kunnen oplossen door geen normale nucleotiden toe te voegen maar alleen terminatornucleotiden te gebruiken. Het probleem is dan dat je maar één base kan lezen per kolonie. Vandaar dat we reversibele terminators gebruiken. In plaats van de OH groep waar normaal het volgende nucleotide aan bindt ,zit hier een andere groep O-CH2-N3. Het is dus geen didieoxy want dan heb he op die plaats gewoon een H. Net zoals de -H groep in de dideoxy's van Sanger, is dit ook een terminator nucleotide, maar in tegenstelling met de dideoxy's is deze hier reversiebel. Je kan chemisch de O-CH2-N3 groep verwijderen en vervangen door een OH, zodat je nu wel een volgende base kan inbouwen. De gebuikte nucleotiden hebben daarnaast ook een fluorescente groep die we ook kunnen verwijderen, wat nodig is, anders hebben we alle kleuren van de voorgaande ingebouwde nucleotiden door elkaar. Dus na inbouw van een reversibel terminatornucleotide (kan er maar één ingebouwd worden) wordt de fluorescente kleur gemeten, waarna de terminatorgrope en de fluorescente groep worden afgesplitst. Aan hetzelfde fragment kunnen we nu telkens weer een volgende reversibele terminator nucleotide inbouwen. Zo kunnen we het hele fragment sequencen.

Slide 5-67:Bij het 2e sequeneringsplatform, Illumina, begrijp ik stap 3 niet. Ik snap niet hoe je de terminator er af kunt nemen, om daarna een volgend nucleotide in te bouwen. Wat gebeurt dan met het vorig nucleotide, je 'hangt' die toch steeds aan elkaar?Het terminatornucleotide heeft een bepaalde chemische group op positie 3’ van de suiker (zie slide 5-67). Hierdoor werkt dit als terminator zodat er maar 1 nucleotide kan ingebouwd worden. Nadat de inbouw van het nucleotide werd geregistreerd door de camera, wordt de terminatorgroep er chemisch afgekliefd zodat er een OH ontstaat op de 3' positie waar het volgende nucleotide kan worden gebonden. Tegelijkertijd wordt de fluorescente groep afgesplitst; zodat alleen het nieuw ingebouwde nucleotide een kleur gan geven.

Slide 5-68: Is mijn interpretatie juist: voor de sequencing, zijn verschiilende cycli nodig om zo elke volgende base te bepalen. De nucleotiden worden elk apart toegevoegd, bijvoorbeeld eerst enkel A's en dan ga je kijken voor eerste base of er complementariteit is. Zodra je een lichtsignaal krijgt weet je dat je een T

in je te bepalen sequentie hebt op je eerste base van je sequentie. Moet je dit proces herhalen voor elke volgende base? en dus honderden malen achter elkaar doen? Dus is het dan zo dat op de slide enkel de eerste 2 bases zijn gelezen en ze dit bedoelen met first read en second read? Of heb ik dit volledig fout bergrepen?Bij deze methode met het Illumina platform maakt men gebruik van reversible chain terminator nucleotiden (zie mijn uitleg in FAQ2 slide 5-67) met 4 verschillende kleuren. De 4 verschillende nucleotiden hebben dus elk een eigen kleur (bv G= geel, C= blauw, T=groen, A=rood) en worden als mengsel toegevoegd. Omdat ze ‘terminator’ zijn kan er maar eentje ingebouwd worden. Afhankelijk van de sequentie zal dat een A, C, G, of T zijn. Je kan dat bepalen aan de hand van de kleur. Zo ken je de eerste base. Nu haal je de terminator en de fluorescente groep eraf en vroeg je opnieuw het mengsel met de fluorescente reversibel terminator nucleotiden toe. Nu wordt de tweede base ingebouwd. je kijk weer naar welke kleur wordt ingebouwd. Zo ken je de 2de base. Je doen hetzelfde voor de 3 de base en de 4 enzovoort…tot je een 75-tal basen gesequenced hebt.

Slide 5-79:Hoe krijg je 1 dna fragment op 1 bead, waarom zullen er geen verschillende fragmenten binden op 1 bead?Dat is een kwestie van verdunnen. Je verdunt het staal zodanig dat er statistisch één of geen fragment bindt aan elke bead. De beads waarbij er geen fragment gebonden is, kan je elimineren. De beads waarbij er toevallig toch twee of meer fragmenten gebonden zijn, zullen geen eenduidige sequentie geven. Je kan deze makkelijk herkennen aan de slechte sequentie en de software zal deze elimineren.

Slide 5-83:Kan u mate-pair reads nog eens uitleggen?Om DNA sequenties van het genoom waarin vele repetitieve sequenties zitten, makkelijker te kunnen mappen met het referentiegenoom wordt vaak mate-pair sequencing gedaan. Het komt erop neer dat van een DNA fragment met gekende lengte (bv 1kb) beide uiteindes gesequenced worden. Zo kennen we de onderlinge afstand tussen de twee sequenties en maakt dit mapping (inpassing in het genoom) makkelijker bv als één kant van het fragment repetitieve sequenties bevat. Doordat de andere kant die niet repetitief is meestal wel eenduidig kan geplaatst worden, kan ook het repetitieve stukje aan de andere kant gemapt worden. Een manier om dit te doen staat op slide 5-83. Hierbij wordt een 1 kb fragment circulair geligeerd aan een linker (rode sequentie in het figuurtje) waarin restrictiesites zitten voor een restrictie-enzym dat verderop in het fragment knipt (niet in de herkenningsplaats zelf, zie pijlen in het figuurtje). Aan dit uitgeknipte fragmant (rood, geflankeerd door twee stukjes geel) hangen we nu adaptoren (licht blauw) voor sequencing. We sequencen de gele stukjes (= uiteindes van het 1 kb fragment) zodat we beide stukjes (met gekende afstand) makkelljk kunnen plaatsen. A1 tem A4 zijn sequencing primers.

Slide 5-83Na vorige les methoden was het nut van 'mate-pair reads' op slide 5-83 mij niet helemaal duidelijk. Ik begrijp niet goed hoe dit systeem de allignatie bij repetitieve sequenties vergemakkelijkt.Om DNA sequenties van het genoom waarin vele repetitieve sequenties zitten, makkelijker te kunnen mappen met het referentiegenoom, wordt vaak mate-pair sequencing gedaan. Het komt erop neer dat van een DNA fragment met gekende lengte (bv 1kb) beide uiteindes gesequenced worden. Zo kennen we de onderlinge afstand tussen de twee sequenties en maakt dit inpassing in het genoom makkelijker bv als één kant van het fragment repetitieve sequenties bevat. Doordat de andere kant die niet

repetitief is meestal wel eenduidig kan geplaatst worden, kan ook het repetitieve stukje aan de andere kant gemapt worden. Een manier om dit te doen staat op slide 5-83. Genomisch DNA wordt eerst random gefragmenteerd door nebulisatie. Fragmenten worden dan volgens lengte gescheiden op een gel en fragmenten van ongeveer 1 kb worden geselecteerd. De fragmenten van 1 kb (geel in de figuur) worden nadat ze blunt-end gemaakt zijn, aan beide kanten geligeerd aan een linker (rood) met restrictiesites voor een restrictie-enzym dat verderop in het gele fragment knipt (niet in de herkenningsplaats zelf). We ligeren aan het geknipte fragment adaptoren voor sequencing (blauw). We sequencen de gele stukjes (= uiteindes van het 1 kb fragment). Doordat we weten dat deze twee gele stukjes sequentie 1 kb van elkaar liggen in het genoom kunnen we ze allebei makkelijk juist positioneren in de genoomsekwentie ook al heeft één ervan repetitieve sequenties.

Slide 5-87:Op welke manier worden de fragmenten hier geknipt of is dit niet zo van belang?Dat is hetzelfde als bij de andere platforms: random dus via nebulisatie of sonicatie.

Slide 5.91:Deze vraag heeft betrekking op de second generation sequencing technieken. Stel dat je een de novo sequentie wil maken van een patient met een genetische ziekte, hoe kies je dan tussen de verschillende systemen van de next generation sequencing? Ze kunnen dit toch bijna allemaal? Met de novo sequentie bedoelen we een allereerste sequentie van een species waarvan we het genoom nog niet kennen. De sequentie van een patiënt met een genetische ziekte is per definitie in dit geval geen de novo sequentie want van de mens hebben we het referentiegenoom. Het wordt dus beschouwd als resequencing. De keuze van het platform hangt valk af van elk platform je ter beschikking hebt. Op Gasthuisberg hebben we nagenoeg alle platformen en kunnen we kiezen. In vele andere instellingen staat er slecht één platform en ben je daaraan geboden. Als je toch kan kiezen speelt de prijs van de analyses een belangrijke role en ook de doorvoersnelheid. In dit geval zou ik de 454 niet gebruiken omdat het om resequencing gaat en we niet echt lange sequenties nodig hebben (wel belangrijk bij de novo sequening) en de 454 is duur wat de analyses betreft. Ik zou hier de Illumina gebruiken. die is goedkoper in gebruik. De kortere sequenties volstaan om te aligneren met de referentiesequentie. je kan ook de Solid beruiken die het voordeel heeft van accurater te zijn. Tegenwoordig gebruike we ook meer de Ion Torrent, die goedkoop is wat de analyses betreft. Voor gans genomen is dit wel wat minder geschikt omdat de capaciteit kleiner is dan bij de andere platforms. Als je een gans genoom wil sequencing is dit minder geschikt. Als je je kan beperken tot het exoot is is dit wel een mogelijke optie.

Slide 5-95:Waardoor is er een stroomverandering als de basen passeren? Omdat elke base een andere grootte heeft? Is er bij een grote base dan een grote stroomonderbreking en zo kunnen we de base ontcijferen?Klopt. Door de porie zelf loopt ook een stroompje (ionen kunnen er vlot door). Als een nucleotide de porie passeert is een inderdaad een vermindering van stroom. Afhankelijk van de grootte van het nucleotide wordt heden porie meer verstopt en kan er minder stroom (ionen) door. Elk van de 4 nucleotiden veroorzaakt een wat andere verandering in het stroompje over de porie. Deze veranderingen worden gemeten en zo kunnen we dus de sequentie van het fragment aflezen.

Slide 5-96:FRETHier snap ik eigenlijk niet veel van. Ze praten over polymerase en primers: dus ik dacht ze beginnen met ss stranded en er word ds gemaakt. Maar dan beginnen ze over energie dat word overgedragen van de ene naar de andere fluor groep en ik snap niet waar die fluor-groep op staat, waar die vandaan komt en waarom die energie wordt overgedragen. Ik snap wel dat energie wordt overgedragen en dat dit voor emissie zorgt bij de acceptor, maar wat is nu juist dit acceptor? En hoe zorgt deze emissie ervoor dat de sequentie bepaald kan worden? DNA sequencing based on FRET is een vorm van single molecule sequencing die gebaseerd is op FRET (Förster/Fluorecence Resonance Energy Transfer). Het polymerase (maakt nieuwe streng vertrekkend van de primer complementair aan de te sequencen streng) wordt zo gemodifceerd dat het een donor fluorecente groep bevat (het vangt licht op van een bepaalde golflengte en geeft licht af aan een lagere golflengte). De 4 nucleotiden hebben een acceptor fluorescente groep die geactiveerd kan worden door het licht afgegeven van de donor als de donor en de acceptor heel dicht bij elkaar zitten. Op het moment dat het nucleotide wordt ingebouwd komen de fluorescente groepen van het polymerase en het nucleotide voldoende dicht bij elkaar om FRET te geven (Förster/Fluorecence Resonance Energy Transfer). Elk van de 4 nucleotiden geeft licht bij een andere golflengte. De kleur van de lichtflits wordt gedecteerd. Op basis van de golflengte kan bepaald worden welk nucleotide wordt ingebouwd.

Slide 5-96:Hoe doet men hier juist aan sequencing? Wat doet men juist?Het is een vorm van single molecule sequencing die gebaseerd is op FRET (Förster/Fluorecence Resonance Energy Transfer). Het polymerase wordt zo gemodifceerd dat het een donor fluorecente groep bevat. De 4 nucleotiden hebben elk een andere acceptor fluorescente groep die licht geeft bij een andere golflengte. Op het moment dat het nucleotide wordt ingebouwd komen de fluorescente goepen van het polymerase en het nucleotide voldoende dicht bij elkaar om FRET te geven (Förster/Fluorecence Resonance Energy Transfer). De lichtflits wordt gedecteerd. Op basis van de golflengte kan bepaald worden welk nucleotide wordt ingebouwd.

Slide 5-97:TEMDNA wordt gesubstitueerd met zwaardere atomen, maar ik snap niet zo goed hoe we een onderscheid gaan kunnen maken tussen A , T , C en G. Gaat men bvb eerst alle A substitueren en daarna de T, G en C’s apart ?Dat gebeurt inderdaad apart.

Slide 5-97Ik snap het principe wel, maar ik weet niet hoe ik me moet voorstellen. Hoe gebeurt dit in de praktijk?Bij sequencing dmv TEM kijk je naar het DNA via elektronenmicroscopie. De normale nucleotiden kan je helaas nauwelijks zien via TEM. Wat je nu doet is je bouwt via PCR nucleotiden in met een hoger atoomgetal in een bepaalde base bv de A. Deze nucleotiden zie je wel als een 'dikker' bolletje op de foto. Je doet nu hetzelfde met de T, de C en de G. Zo kan je uiteindelijk de sequentie aflezen. Zie http://en.wikipedia.org/wiki/Transmission_electron_microscopy_DNA_sequencing voor wat meer uitleg over de oorspronkelijke methode die nu verder geoptimaliseerd werd.

Slide 5-100:

Waarom moet je juist je dna overblotten op een membraan? Ik had tijdens de les opgeschreven dat er anders te veel achtergrond zou zijn. Maar wat wordt hiermee bedoeld?Als je niet overblot op een membraan zitten je fragmenten gewoon in een gel. Hierin kan je probe niet makkelijk is en als die er al in geraakt, kan de overschot van probe die niet hybridiseert met het DNA er niet makkelijk uit, zodat je veel achtergrond zou krijgen. Als je het DNA overblot op een membraan, kan de probe er makkelijker en kan je de overmaat probe die niet gehybridiseerd heeft, makkelijk wegwassen,

Slide 5-100:Ik begrijp niet echt hoe je southern blot kunt gebruiken om DNA te mappen. Is dit dan eerder om te zien of een persoon translokaties heeft in zijn genoom? Want je moet toch altijd een probe hebben om southern blotting uit te voeren? En als dat klopt van die translokaties, hoe kun je die dan bepalen want enkel de plaats waar je probe hybridiseert gaat zichtbaar zijn? Of moet je dan vergelijken hoe een 'normaal' gen door de gel migreert met een 'ziek' gen om te zien of het fragment kleiner of groter is?Southern blotting heeft verschillende toepassingen bv bij het mappen van DNA fragmenten van een genoom zoals bij het Human Genome Project. Om het humane genoom voor de eerste keer te sequencen, heeft men het eerst onderverdeeld in kleinere stukken die gecloneerd werden in BACS en YACS en verder in kleinere plasmiden. Om niet teveel te moeten sequencen en om achteraf de sequenties van de verschillende clones aan elkaar te kunnen hangen (is moeilijk owv repetitieve sequenties), heeft men eerst het genoom gemapt. Met mapping bedoelen we: een restrictiemap maken van het genoom en van de clones van een genomische bank (in BACS en YACS), zodat we de weten welke fragmenten elkaar juist opvolgen. We doen dit door restrictiedigestie (met verschillende restrictie-enzymen) en Southern blotting (telkens met een ander fragment als probe) waardoor we kunnen zien welke fragmenten of welke clones op elkaar volgen. Als we deze clones en subclones nu gaan sequencen weten we hoe we al deze sequenties aan elkaar moeten plakken. Southern blotting kan ook gebruikt worden om bv na te gaan of een construct juist is ingebouwd in het genoom via recombinatie als je transgene muizen maakt. Je zou Southern blotting ook kunnen gebruiken om naar translocaties te kijken, maar dan moet je wel de betrokken genen al kennen omdat je gemerkte probe moet hebben.Je kan het zelfs gebruiken om naar mutaties of SNPs te kijken die toevallig voorkomen in restricitiesites of naar deleties en inserties die een verschil geven de lengte van DNA fragmenten na restrictiedigestie (zie RFLP op slide 5-101).Ook hier kan je alleen kijken naar genen waar je een mutatie of iets dergelijks verwacht omdat je moet werken met een probe. In deze gevallen is het inderdaad ook best om een “ziek” staal te vergelijken met een “gezond”. Waar mogelijk wordt Southern blotting hoe langer hoe meer vervangen door andere methoden gebaseerd op PCR.

lide 5-101:Waarom zijn puntmutaties oorzaken van lengteverschillen bij restrictie-enzymen?Puntmutaties geven normaal gezien geen (significant) verschil in lengte van sequenties? Behalve wanneer deze in de restrictiesites zelf aanwezig zijn, waardoor er geen splitsing plaats kan vinden. Ben ik hier correct in mijn redenering?Helemaal correct.

Slide 5-101:Hoe werkt de PCR methode bij RFLP?

Je voert een PCR reactie uit met twee primers die het fragment amplificeren waarin je de mutatie of SNP wil aantonen en die het fluorescent merken (via een fluorescente primer). Dan knip je het PCR product met een restrictie-enzym waarin je de mutatie of SNP verwacht. Je scheidt de fragmenten via capillaire elektroforese op op een sequentie-gel en kijkt naat de grootte van de restrictiefragmenten om te weten of het restrictie-enzym geknipt heeft (afhankelijk van of een mutatie op die plaats zit of niet).

Slide 5-103:Moet je altijd een outer en een inner primer samen combineren? Kies je op voorhand je primer waarmee je een snp wil ontdekken en als er dan een pcr product gevormd wordt, is dit dan het bewijs voor deze snp? Of werkt het niet zo?Je gebruikt altijd een primer die overeenkomt meteen SNP in combinatie met een andere primer verderop of hogerop in het gen. J kiest op voorhand de primer en kan daardoor maar naar 1 bepaalde SNP of mutatie kijken. ls er een product is met een bepaaalde primer weet je wat d sequentie is op die bepaalde SNP plaats.

Slide 5-103:ARMS. Ik heb er in de les wat bijgeschreven maar ik ben niet meer helemaal mee met het principe. Zou u dit deze methoden nog even kunnen verduidelijken?ARMS is een methode om na te gaan of het te onderzoeken staal een bepaalde puntmutatie (of allelische variant) vertoont. Het principe van ARMS is dat je al dan niet een PCR product bekomt afhankelijk van het feit of de 3' base van de primer overeenkomt met het template of niet. In de figuur op slide 5-103 wordt dit geïllustreerd met twee primersets gericht tegen verschlllende mogelijke allelen (G allel of A allel). Primer P3 past niet aan het G allel, want op het 3' uiteinde van de primer zit een A, zodat er geen extentie kan plaatsvinden. Er zal dan geen PCR product kunnen gevormd worden met primers P3

en P2. Primer P3 past wel aan het A allel en geeft in dat geval wel een PCR product met P2. Met primer P1 en P4 krijgen we een PCR product als er een G allel is, maar niet bij een A allel.

Slide 5-103Hoe kan je nu juist SNP detecteren? Je voegt bij 1ste PCR-reactie primer 1 en 3 toe en bij 2de PCR-reactie primer 2 en 4. Als er geen mutatie is dan vindt er PCR van beide stengen plaats en is er een reactieproduct? Ik begrijp iet goed hoe ik die allelen, strengen en G/G homozygoot enz. moet interpreteren.ARMS is een methode om na te gaan of het te onderzoeken staal een bepaalde puntmutatie (of allelische variant) vertoont. Het principe van ARMS is dat je al dan niet een PCR product bekomt afhankelijk van het feit of de 3' base van de primer overeenkomt met het template of niet. In de figuur op slide 5-103 wordt dit geïllustreerd met twee primersets gericht tegen verschlllende mogelijke allelen (G allel of A allel). Primer P3 past niet aan het G allel, want op het 3' uiteinde van de primer zit een A, zodat er geen extentie kan plaatsvinden. Er zal dan geen PCR product kunnen gevormd worden met primers P3 en P2. Primer P3 past wel aan het A allel en geeft in dat geval wel een PCR product met P2. Met primer P1 en P4 krijgen we een PCR product als er een G allel is, maar niet bij een A allel.

Slide 5-106Hoe gaat men van het denatureren naar bepaalde conformatie en zet men die conformatie dan op gel?Na het denaturen ga je het staal verdunnen om de strengen met zichzelf te laten renatureren. Afhankelijk van de sequentie nemen ze een bepaalde conformatie aan. Dit zet je nu op een niet-denaturerend gel zodat de strengen gescheiden worden volgens hun confomatie.

Slide 5-106 :Single stranded conformation polymorphism. Waarom worden de strands gedenatureerd? Geven ze geen conformatie verandering als ze ds zijn? Zo niet, waarom geven ze geen conformatie verandering als ze ds zijn? Ook op de figuur staat er op elke electrophorese maar één bandje terwijl er 2 strengen zijn, hoe komt dit? Als dubbelstreng zouden we op dit soort gewone polyacrylamidegel inderdaad geen verschil in migratie zien als er een baseverschil zou zijn. In beide gevallen (met mutatie of zonder) zouden we perfecte dubbelstrengen hebben die gewoon scheiden op basis van lengte en niet op basis van sequentie want ze verschillen conformationeel nauwelijks van elkaar (gewoon twee bijna identieke dubbelstrengen). Als we de fragmenten eerste denatureren tot enkelstrengen, verdunnen, en snel renatureren, krijgen we interne hybridisatie van toevallig complementaire stukken binnen één streng. Er zijn dus stukjes van de streng dubbelstrengig terwijl andere stukjes enkelstrengig blijven. Dit is een heel andere confirmatie dan een gewone dubbelstreng. Je kan dit wat vergelijken met de structuur van mRNA. Een verschil in één base, kan een belangrijke conformatieverandering veroorzaken. Het is op basis van deze conformatieverandering dat we de fragmenten met of zonder mutatie van elkaar kunenn onderscheiden op een gel. Je ziet op het figuurtjje maar één streng omdat er maar één van de twee strengen gemerkt is (radioactief of fluorescent). Alleen die ga je zien.

Slide 5-108:Hoe werkt het principe van DGGE? De gel bevat een toenemende concentratie van denaturerende chemische producten? Wanneer het fragment de concentratie van denaturerend product bereikt op welke hij zal ontwinden, wordt dit fragment gestopt. Is het de GC percentage dat dit mee bepaalt? En wat is het verschil bij een fragment met mutatie op vlak van de GC inhoud?Hier nog eens het principe: Er wordt een speciale gel gegoten waarin een gradiënt zit van een denaturerende stof (een middel dat dubbelstrengige DNA uit elkaar doet vallen naar enkelstrengs). Boven in die gel is de concentratie denaturant bijv. 35 v% en onderin 50 v%. De PCR reactie die voorafgaat aan de gelelektroforese amplificeert een zeker fragment van het DNA waarin je mutaties zoekt. Eén van de twee primers bevat een extra stuk DNA, de zogenoemde GC-klem ('clamp'). Dat is in feite gewoon een lange reeks G- en C-basen achter elkaar. Deze nucleotiden zijn, in dubbelstrengige DNA, met elkaar verbonden via 3 waterstofbruggen, terwijl AT paren maar twee H-bruggen delen. Dat maakt deze GC-staart heel stabiel in denaturant, en dat is precies de bedoeling. De PCR fragmenten worden gedurende bv 16 uur aan een hoog voltage en aan denaturant blootgesteld. Het dubbelstrengige DNA smelt gedeeltelijk uit elkaar, al naar gelang van de nucleotidenvolgorde, en de GC-klem houdt de twee strengen bij elkaar. De open vorkstructuur loopt uiteindelijk vast in de matrix van de gel, door de toenemende weerstand. Dus hoe meer A/T, hoe sneller de vork open gaat en hoe vroeger in de gel het fragment stopt. Hoe meer G/C hoe later de vork verder uit elkaar gaat en later het fragment in de gel stopt. Na kleuring zijn bandjes te zien van de positie van elk fragment.

Slide 5-111 en 5-112:Wat doet cot-DNA? Wat is er verschillend tussen de 2 methoden (array in vergelijking met de gewone)? Hoe doet men het met de array methode?Cot-1 DNA is DNA dat aangereikt is voor repetitieve DNA sequenties zoals Alu sequenties. Het wordt gebruikt om niet-specifieke hybridisatie van het gemerkt DN aan repetitieve sequenties tegen te gaan. Bij de klassieke CGH gaat men chromosomaal DNA merken (bv twee stalen: één rood en één groen) en hybridiseren op metafase chromosomen. Bij de array methode gebruikt men ipv metafase chromosomen een oligonucleotidenarrays die de chromosomen vertegenwoordigen wat veel compacter en gestructureerde is dan een chromosoom spread.

Slide 5-112: De microarrays met clones in juiste genvolgorde, ik begrijp niet goed hoe ik dit moet zien. Wordt dit zo aangekocht of moet dat zelf gemaakt worden? Dit wordt zo aangekocht; er zij firma’s die dit zo kant-en-klaar verkopen.

Slides 5-114, 5-115 en 5-116:Wat is het verschil tussen variant 1 2 en 3? Wat is er bij variant 3 dat niet is bij variant 1 en 2 tezamen?Bij variant 1 worden een teststaal en een referentiestaal gemerkt met verschillende kleuren en dan teamen gehybridiseerd op een microarray van oligonucleotiden. Als er een polymorfisme is in het teststaal tov de referentie zal alleen het referentiefragment binden aan de overeenkomste oligo en niet het testfragment en zal dit leiden tot een kleurverschuiving. In Variant 2 gebruikt men maar 1 staal en dus ook maar 1 kleur. Na hybridisatie kijkt men of er aan een bepaald oligo een kleursignaal is of niet. Bij variant 3 worden fragmenten DNA toegevoegd om te hybridiseren, maar worden ook gemerkte terminatornucleotiden toegevoegd zoals getoond wordt in het videofragmentje. Afhankelijk van het allel, wordt een bepaald fluorescent nucleotide ingebouwd of niet. Dit laatste systeem is acurater dan gewoon hybridisatie van gemerkte fragmenten. Hiervan zijn er verschillende varianten zoals getoond in het videofragmentje. In de eerst getoonde procedure heb je een primer die eindigt net voor de SNP en wordt er dan een fluorescent terminatornucleotide toegevoegd. Afhankelijk van de kleur weet je welk nucleotide er op de SNP plaats zit. In de tweede getoonde procedure eindigt de primer net op de SNP site (SNP site is de laatste base van de primer. Afhankelijk van het allel, zal de primer perfect passen of niet. Als de primer perfect past, krijgen we inbouw van een fluorescent nucleotide. In het andere geval (ander allel) past het uiteinde van de primer niet perfect en krijgen we geen inbouw van een nucleotide.

Slide 5-116:Hoe werkt de derde variant?

Bij variant 3 worden fragmenten DNA toegevoegd om te hybridiseren, maar worden ook gemerkte terminatornucleotiden toegevoegd zoals getoond wordt in het videofragmentje. Afhankelijk van het allel, wordt een bepaald fluorescent nucleotide ingebouwd of niet. Dit laatste systeem is accurater dan gewoon hybridisatie van gemerkte fragmenten. Hiervan zijn er verschillende varianten zoals getoond in het videofragmentje. In de eerst getoonde procedure heb je een primer die eindigt net voor de SNP en wordt er dan een fluorescent terminatornucleotide toegevoegd. Afhankelijk van de kleur weet je welk nucleotide er op de SNP plaats zit. In de tweede getoonde procedure eindigt de primer net op de SNP

site (SNP site is de laatste base van de primer. Afhankelijk van het allel, zal de primer perfect passen of niet. Als de primer perfect past, krijgen we inbouw van een fluorescent nucleotide. In het andere geval (ander allel) past het uiteinde van de primer niet perfect en krijgen we geen inbouw van een nucleotide.

Slide 5-117: Zou u mij het principe van MassArray nog eens kunnen uitleggen? En wat is de rol van MALDI-TOF bij deze techniek?Met de Sequenom Massarray Analyzer ga je kijken of er op een bepaalde positie een polymorfisme (verwachte specifieke SNP of mutaties) aanwezig is in de stalen die je wil onderzoeken. Je zet eerst een PCR in van de regio waarin je de SNP/mutatie verwacht.Je inactiveert het overschot dNTPs door deze te defosforyleren en dan gebruik je een primer die reikt tot net voor de SNP/mutatie site. Dan doe je extensie met mass-modified terminator nucleotiden. Dit zijn dideoxynucleotiden zoals je gebruikt bij Sanger sequencing, maar de massa's zijn aangepast zodat er een groter verschil is tussen A, C, G,en T. Er kan er zo maar eentje inbouwen omdat ze dideoxy zijn. De extensie stopt dus na inbouw van één mass-modified dideoxynucleotide. Dit onderwerp je nu aan MALDI-TOF. Op basis van de massa weet je nu precies of er op de positie na de extensieprimer er een A, C, G, of T zit in het staal dat je onderzoekt. Dit gaat zeer snel zodat je per dag duizenden stalen kan analyseren voor specifieke SNPs of mutaties.

Slide 6-4:Waarom met DEPL behandelen? Waarom is dit een oplossing om zuiver te werken? Wat doet DEPL?DEPC bindt aan primaire amines in de catalytische site van RNases. Hierdoor worden RNases dus geïnactiveerd.

Slide 6-9: De Bioanalyzer meet de absorbantie van uv licht door je staal, hoe haal je hieruit info over de concentratie?Dit hebben we gezien in hoofdstuk 4.3. Hoe hoger de concentratie hoe meer absorptie.

Slide 6-11:Dit blijft onduidelijk ondanks de uitleg in freq ask questionsKijk eens op volgende website waar ik denk dat goed staat uitgelegd:http://en.wikipedia.org/wiki/Rapid_amplification_of_cDNA_ends

Slide 6-12:Deze tekening zit vol details (vooral het linkerdeel) Kan zoiets gevraagd worden? Het linkerdeel komt op hetzelfde neer als de rechtse figuur op Slide 6-10. Onthoud van slide 6-12 vooral dit: Je vertrekt van mRNA (links op de slide) en maakt hiervan cDNA zoals we eerder gezien hebben (slide 6-10). Dit dubbelstrengig cDNA steek je nu ofwel in een plasmide (bv van een recombinatiesysteem zoals het Gateway entry plasmide) of je steekt het in een faag (bv een lambda faag). Je plaat de faag cDNA bank uit op platen met bacteriën waardoor je plaques krijgt. Op de bacterieplaten leg je een filter waaraan de fagen blijven plakken. Hiermee kan je nu op twee manieren

screenen: 1. met een gemerkte DNA probe waardoor sommige plaques op de filter die het overeenkomste cDNA hebben zullen oplichten, ofwel 2. met een antistof tegen het eiwit waarin je geînteresseerd bent. De fagen kunnen namelijk ook het cDNA dat ze bevatten tot expressie brengen. Met een antistof kan je dus ook de filters gaan screenen voor cDNAs die het eiwit dat door het antistof herkend wordt, tot expressie brengen.

Slide 6-12:Waar bindt nu juist die radioactieve probe op waarmee je de filter incubeert? Is dit op ons cDNA?Hoe gebeurt de screening met antistoffen juist? En waarom gebeurt die screening?Een cDNA bank is een collectie van kloons met allemaal verschillende cDNAs. Je gebruikt een cDNA bank als je bv een klein stukje DNA hebt en je wil het ganse cDNA hebben om het bv tot expressie te brengen. Dan ga je de cDNA bank screenen met het stukje DNA of met een antistof als je gebruik maakt van een cDNA expressiebank. cDNA banken worden vaak gemaakt in lambda fagen. Je gaat als volgt te werk. Je plaat de fagen uit op een agar plaat die vol zit met bacteriën. Elke vaag heeft aan ander cDNA fragment. Je laat de plaat overnacht groeien tot je mooie plaques hebt dit zijn kleine puntjes waar de vagen de bacteriën gelyseerd hebben). Op de agarplaat wordt nu een nitrocellulose- of nylon-membraan gelegd. Hieraan zullen van elke plaque een aantal fagen vastplakken. Je neemt het membraan eraf, denatureert het DNA van de fagen die eraan hangen en hybridiseert met de gemerkte DNA probe. Na autoradiografie kan je zien welke kolonie positief is. Nu neem je de originele agarplaat terug waarop eerst het membraan gelegen had. Je pikt hiervan de positieve faag om deze in cultuur te brengen. Hiervan bereid je het DNA waarmee je nu kan verder werken voor andere toepassingen.In plaats van te screenen met een DNA probe kan je antistoffen gebruiken op te screenen als je fagen gebruikt die het erin gekloneerde cDNA tot expressie brengen. Je gaat nu het nitrocellulose- of nylon-membraan incuberen met het antistof waaraan je bv een enzym hebt gehangen dat een kleurloos substraat omzet naar een gekleurde stof. Zo kan je de cDNA fagen oppikken die het eiwit tot expressie brengen dat herkend wordt door het antistof. Dit is een mooie manier om het cDNA te isoleren dat codeert voor een bepaald eiwit waartegen je een antistof hebt, of om te weten te komen welk eiwit jouw antistof herkent.

Slide 6-13: Wat zijn contactomeren en hoe worden deze gebruikt voor miRNA’s?Concatameren zijn langere structuren die gemaakt zijn door meerdere miRNAs aan elkaar te hangen.

Slide 6-16:De tekening. Mag ik ophet examen het principe van Northern blotting in woorden uitleggen?Als het principe begrijpt en het kan uitleggen en weet waarvoor je een Northern blot kan gebruiken is dat prima. Je hoeft het daarom niet te kunnen tekenen.

Slide 6-18 en 6-19:Ik begrijp RPA en NPA niet zo goed.Het doel van de ribonulease protection assay (RPA) is om een specifiek transcript te kunnen kwantificeren zoals op een Northern bot, maar dan gevoeliger en meer kwantitatief. Hiertoe maken we

een gemerkte (radioactief of niet) enkelstrengige antisense RNA probe (via SP6 of T7 RNA polymerase) specifiek complementair aan het transcript dat we willen kwantificeren. We hybridiseren deze probe in overmaat (dus meer probe dan we transcripten verwachten) met RNA stalen waarin we het transcript willen kwantificeren. Daarna doe we digestie van enkelstrengig RNA met RNase T1/A. De probe die niet gehybridiseerd heeft met transcript wordt afgebroken. We gaan nu de RNA fragmenten scheiden volgens grootte op gel en doen

autoradiografie / Phosphorimager of niet-radioactieve detectie. Alleen de probe die door hybridisatie met het transcript beschermd werd (dubbelstrenging RNA wordt niet afgebroken door het RNase) zullen we kunnen zien op een gel en kunnen kwantificeren. Dus hoe meer er van het specifieke transcript in het staal zat, hoe meer probeer er overblijft en hoe meer signaal we zien. In de figuur op slide 6-18 is het gemerkte antisense RNA rood. Het transcript dat we willen meten is blauw. Onder het pijltje met “hybridisatie” ernaast, zie je een gemerkte rode probe hybridiseren met blauw transcript en zie je ook een vrije rode die niet gehybridiseerd heeft omdat de probe in overmaat aanwezig is. Door digestie met het RNase worden alle enkelstrengige RNAs afgebroken, dus ook de vrije probe en de stukken van het transcript die niet aan de probe passen. Bij nuclease protection assay (NPA) gebruik je geen antisense RNA als probe, maar een antisense DNA. Je kan die mooi gebruiken om introns te zoeken in genen. Als het gen van interesse een intron heeft, zal zoals in de figuur wordt weergegeven het introngedeelte van de DNA probe niet hybridiseren met het RNA transcript want in mature mRNAs zitten in principe geen introns in. Enkelstrengige (ss) sequenties worden nu geknipt met nuclease S1. De intronsequentie in de ssDNA probe wordt dus ook afgebroken, waardoor de probe als twee fragmenten op het gel te zien is ipv één fragment. Hierdoor kunnen we zien of en waar er intronen zitten in genomisch DNA. Je kan deze methode ook gewoon gebruiken van kwantificatie van transcripten zoals by RPA.

Slide 6-21: Intronoverspannen, waarom wil je dat er een intron inzit als dit toch contaminerend is? en waarom maakt dit uit als het toch niet trecht komt in je cdna? ik snap het nut hier niet van.Zie ook antwoord in FAQ2. Het probleem is het volgende. Als je beide PCR primers kiest in een exonsequentie, kunnen deze primers cDNA amplificeren (wat je wil), maar ook eventueel contaminerend genomisch DNA dat bij je RNA- en cDNA-bereding zit. In dat geval krijg je exact hezlfde bandje, of het nu van cDNA komt of van genomisch DNA. Dit betekent wel dat als je signaal vindt bij QPCR, je dit signaal niet volledig kan toeschrijven aan aanwezigheid van het RNA (omgezet naar cDNA), en dat je dus uit jouw sPCR analyse niets kan beschuiten over expressie van jouw gen.

Slide 6-21:Waarom wordt contaminerend DNA niet mee geamplificeerd?Met intron-overspannend bedoelt men dat de primers zo gekozen worden dat in het amplicon (het stukje DNA dat je amplificeert) een intron zit als contaminerend DNA zou geamplificeerd worden. Het amplicon is daardoor veel te groot om te kunnen amplificeren. In het cDNA zit dit intron er natuurlijk niet en krijg je een mooi PCR fragment. Dit voorkomt dus dat je eventueel contaminerend DNA mee zou meten.

Slide 6-22:Ik begrijp de figuur niet ook de 2 slides die erop volgen vind ik nog al ingewikkeld.De figuur op slide 6-22 toont de fluorescentie (Y-as in log schaal) tov het aantal PCR cycli in een typische Q-RT-PCR opstelling voor detectie van een bepaald transcript (met twee specifieke PCR primers) in twee

stalen A en B met Sybr green. Bij weinig cycli is het fluorescent signaal te laag om te kunnen detecteren. Vanaf een zeker aantal cycli zie je de fluorescentie toenemen. Waar de curve net lineair wordt, trek je een lijn. Dat is de threshold, de drempelwaarde waarbij je toename ziet in fluorescentie. Het aantal cycli nodig om de threshold te overschrijden is threshold cycle of Ct. Het meer van het transcript aanwezig is, hoe vroeger we het gaan detecteren en dus hoe lager de Ct. Voor staal A is de Ct 21. Voor staal B is dat 31. Delta CT is het verschil van de twee. Dus 31-21= 10. Het verschil in expressie van het transcript tussen staal A een B is dus 10 cycli. Je kan dit omrekenen naar een x-voudig verschil in expressie (= fold change, relatief verschil in expressie) door 2 tot de macht delta Ct te doen, in de veronderstelling dat de efficiëntie van amplificatie 2 is. We leren hieruit dat het transcript in staal A 1024 maal meer tot expressie komt dan in staal B. Merk op dat je waar je de threshold legt een beetje artificieel is. Je lan die een beetje hoger of een beetje lager leggen, maar eigenlijk maakt dat nets uit aan het eindresultaat zolang je deze in het lineaire gebied legt (het vescil in Cts blijt 10 in het gebied waarbij beide curves lineair zijn). Op slide 6-23 staat dat je dit best vergelijkt meen een housekeeping gen om voor te normaliseren, of eigenlijk best met een aantal transcripten waarvan je verwacht dat ze niet verschillen in de twee stalen die je wil vergelijken. Deze normalisatie is nodig om artificiële verschillen owv verschillen in zuiverheid en kwaliteit van het RNA en cDNA van beide stalen te neutraliseren. Het kan namelijk zijn dat dat in een bepaald staal meer onzuiverheden zitten die de PCR reactie inhiberen of dat de kwantificatie van het RNA van en bepaald staal niet juist was of de kwaliteit slechter was.. Je zal dit zien aan de Ct’s van alle transcripten die daardoor bv hoger zijn. Hiervoor kan je corrigeren door naar transcripten te kijken die normaal identiek zouden moeten zijn in beide stalen. Hoe je dat best doet, staat uitgelegd op slices 6-24 en 6-25. Dit heb ik al eens beschreven in FAQ3. Op slide 6-23 staat ook nog hoe je absolute kwalificatie (aantal transcripten in een staal) kan doen via vergelijking met een standaardcurve. Hiervoor zorg je dat je zuiver cDNA hebt (bv in ene plasmide) waarvan je nauwkeurig de concentratie meet (bv via OD 260 meting). Op basis hiervan kan je omrekenen hoeveel cDNA moleculen je hebt per microliter. Hiervan maak je een verdunningscurve en op die verdunningcurve voer je een PCR uit, evenals van jouw te meten stalen. Uit de verdunningscurve kan je aflezen met welk aantal transcripten een bepaalde Ct overeenkomt en kan je dus ook uitrekenen op basis van de bekomen CT vanhet te meten staal, hoeveel kopijen van het betrokken transcript er precies in zitten.

Slide 6-23: Ik weet niet hoe de absolute kwantificatie via standaardcurve werkt.Op slide 6-23 staat hoe je absolute kwalificatie (aantal transcripten in een staal) kan doen via vergelijking met een standaardcurve. Hiervoor zorg je dat je zuiver cDNA hebt (bv in een plasmide) waarvan je nauwkeurig de concentratie meet (bv via OD 260 meting). Op basis hiervan kan je omrekenen hoeveel cDNA moleculen je hebt per microliter (zie slide 5-20). Hiervan maak je een verdunningscurve en op die verdunningcurve voer je een PCR uit, evenals van jouw te meten stalen. Uit de verdunningscurve kan je aflezen met welk aantal transcripten een bepaalde Ct overeenkomt en kan je dus ook uitrekenen op basis van de bekomen CT van het te meten staal, hoeveel kopijen van het betrokken transcript er precies in zitten.

Slide 6-24: In de kader over 'fold change' staat een negatieve macht geschreven. Onderaan de slide staat echter dat de fold change in het voorbeeld gelijk is aan 2702. Dit kan toch alleen maar als het een positieve macht is? Want als je 2^-11.4 doet, krijg ik als uitkomst 0.00037.

Moet de kader dan niet aangepast worden naar een positieve macht ipv een negatieve macht? Officieel is de formule met een min-teken. Eigenlijk maakt dat minteken niet zoveel uit. Het hangt er gewoon van af hoe je het bekijkt: control versus treated of treated versus control. In het ene geval krijg je als "fold change” 2702 en in het andere geval 1/2702 wat 0.00037 is.

Slides 6-24 en 6-25:Op slides 6-24 en 6-25 worden de pfaffl methode en de delta delta CT methode uitgelegd. Deze zijn me echter niet meer zo duidelijk. Kan u deze nog eens uitleggen?De ΔΔC t methode is een benaderingsmethode om het verschil in abundantie van een bepaald transcript in twee stalen na te gaan. Het verschil of "fold change" bekomt men door de efficientie van de PCR reactie te verheffen tot de macht delta-delta-Ct (die je berekent zoals in de formule weergegeven wordt). De efficientie is in theorie 2 als de PCR reactie perfect exponentieel opgaat. In werkelijkheid is dat altijd lager. Al we het correcter willen doen, kunnen we de Pfaffl methode gebruiken. Bij de methode van Pfaffl ga je eerst de effcientie van amplificatie na van zowel de het target-gen als van het housekeeping-gen (via het maken van een dilutiecurve). De ratio van genexpressie tussen twee stalen bekom je door de efficientie van de target-gen-recatie te verheffen tot de macht delta Ct van de het target-gen (is Ct van het target-gen in het controlestaal min Ct van het target-gen in het treated staal) en dit delen door de efficientie van het housekeepingen tot de macht delta Ct van het housekeepingen (is Ct van het housekeeping-gen in het controlestaal min Ct van het house-keeping-gen in het treated staal. Om de efficientie van amplifcatie te meten wordt er een verdunningscurve gemaakt van het staal en wordt voor zowel het te meten gen als voor het houskeepinggen (reference) de Ct bepaald. Als de efficiëntiefactor 2 is zal je zien dat als je vertrekt van de dubbele hoeveelheid staal, dat de Ct waarde met een eenheid daalt. Meestal is dit minder en is dit verschillend van gen tot gen. Wat deze figuur ook illustreert is dat als de efficiënties verschillend zijn, de Delta Ct dan verschillend is afhankelijk van de hoeveelheid van start DNA (of RNA). Dus als je voor de verschillen in efficiëntie niet corrigeert, maak je fouten.

Slide 6-25: Moeten we de pfaff formule kennen? Hoe werkt de dilutiecurve?Als je de Pfaffl methode begrijp, is er aan de formule echt niets aan.BIj de dilutiecurve verdun je het staal bv telkens met een factor 10 (is logaritmische X-as) en meet je telkens de CT.

Slide 6-25: Bij de Pfaffl-methode bereken je een ratio van je target gen en je referentiegen. Is de uitkomst van deze ratio dan hoeveel meer het target gen tot transcriptie komt tov het referentiegen? Want dit wil je toch niet weten? Je wil toch weten hoeveel meer het target gen van behandelde staal tot transcriptie komt tov het target gen in het controle staal?BIj de Pfaffl methode meet je effectief de ratio van expressie van het gen van interesse (in het voorbeeld op de slide is dat IL1-B) in de controle conditie versus de treated conditie. Je doet dit door de efficiëntie van amplificatie van het targetgen te verheffen tot de macht deltaCt van control versus treated. Dit ga je nu corrigeren voor veranderingen in het referentiegen (RPLPO in het voorbeeld op de slide) door te delen door de efficiëntie van amplificatie van het referentiegen tot de macht deltaCt van contole versus

treated (zie formule op de slide).

Slide 6-33: Hoe werkt de Differentiele Display juist? wat is een arbitraire primer? De bedoeling van Differential Display is om te gaan kijken naar verschillen in expressie van transcripten (om het even welke) in twee of meer stalen. Het principe is dat je na cDNA synthese, transcripten gaat amplificeren via PCR met een oligo-dT als 3'primer en een willekeurige (arbitraire) primer als 5' primer voor PCR (sequentie vrij te kiezen). Hierdoor amplificeer je niet alle transcripten, maar slecht een fractie daarvan (alleen deze waaraan de primer bindt). Als je dit op een gel zet, krijg je dus een reeks banden die elk overeenkomen met een ander transcript. Hoe intenser de band, hoe meer het transcript voorkwam in het staal. Als je dit nu doet voor verschillende stalen bv tumor versus normaal, kan je de intensiteit van de banden vergelijken in de twee stalen. Als je verschillen ziet in een bepaald bandje is dat een transcript dat differentieel tot expressie komt in de twee stalen. Het zijn deze transcripten waarin je geïnteresseerd bent. Om te weten om welk transcript het gaat, knip je het bandje uit en ga je de sequentie bepalen. Omdat je met één willekeurige primer maar naar een kleine fractie van het transcriptoom kan zien, herhaal je de procedure met andere willekeurige primers en kijk je telkens naar een andere fractie van het transcriptoom.

Slide 6-37: Ik snap niet hoe ze aan het voordeel komen dat je meerdere stalen kan vgl als je een kleur gebruikt. Wat betekent color-flip.De systemen beschreven op slide 6-36 gebruiken twee kleuren. De twee verschillend gekleurde stalen worden gemengd en samen gehybridiseerd op de microarray. Hierdoor kan je maar twee stalen vergelijken.Bij het systeem op slide 6-37 wordt er maar met één kleur gewerkt en gebruik je voor elk staal een andere microarray. Je kan daardoor zoveel stalen met elkaar vergelijken als je wil.Met 'color-flip' bedoelen we: omwisselen van de kleur. Zo wordt op de slide staal A oorspronkelijk rood gekleurd en staal B groen. Om uit te sluiten dat eventuele verschillen te maken hebben met verschillende efficientie van kleuring (bv rood beter dan groen), is het nuttig het experiment te herhalen waarbij je de kleuren omwisselt: staal A groen en staal B rood.

Slide 6-38:Hoe werkt de clustering van gegevens?Zie volgende sites voor een eenvoudige uitleg:http://stn.spotfire.com/spotfire_client_help/heat/heat_what_is_a_heat_map.htmhttp://stn.spotfire.com/spotfire_client_help/hc/hc_method_overview.htm

Slide 6-43: De werking van RNA-seq, waarom ligeren ze die adaptor primers? Ik zie niet helemaal het verschik met microarray. Het principe van RNA-seq is eigenlijk eenvoudig. Je bereidt RNA en selecteert het mRNA via binding aan beads met oligo-dT. Je fragmenteert het mRNA en converteert het tot cDNA met random primers. Je ligeert er adaptors aan en onderwerpt de fragmentjes met adaptors aan next generation sequencing (kan niet zonder adaptors; zie hoofdstuk 5-53 en volgende). Op deze wijze sequencen we het hele (of

toch bijna) transcriptoom. Je mapt en vergelijkt de korte stukjes sequentie met het referentiegenoom en kijkt met welke regio's van het referentiegenoom de sequenties overeenkomen en hoe vaak er korte stukjes sequentie overeenkomen met bepaalde regio's. Er zijn sequenties bij die een intron overspannen (junction reads), die overeenkomen met exons (exon reads), die helemaal op het 3' uiteinde vallen (poly(A) end reads, Dit geeft informatie over welke transcripten er allemaal voorkomen in het staal, hoe frequent deze transcripten (of stukken ervan tot op nucleotiden niveau) (zie grafiekje) voorkomen in het staal, of er verschillende promotorstarts zijn, of er splice varianten zijn, en of er mutaties zijn. Via deze methode krijgen we dus het meest informatie over het transcriptoom.Bij microarrays gebeurt er geen sequencing. Enkel hybridisatie.

Slide 6-49: Hoe moet je de grafiek interpreteren en wat is principe van dekking versus diepte? De grafiek toont dat het moeilijk is om het volledige transcriptoom te sequencen. Dit wordt hier geïllustreerd voor het transcriptoom van gist. Met 1 miljoen reads hebben we 50 van het transcriptoom bepaald (= "dekking”). Als we 80% van het transcriptoom willen bepalen, hebben we 4 miljoen reads nodig. Voor 90%, 10 miljoen. Dat komt omdat de fragmenten random worden opgepikt en het statistisch moeilijk is om ooit alles een keer tegen te komen. De “diepte” is hoe uitgebreid of hoeveel maal je het theoretische transcriptoom sequenced.

Slide 7-6: Wat is de rol van diisopropyl carbodiimide katalysator bij de synthese van eiwitten?Het diisopropyl carbodiimide functioneert als katalysator doordat het elektronen accepteert van O van het aminozuur, dat op zijn beurt aangevallen wordt door het vrije elektronenpaar van NH2 van de linker. Zonder deze katalysator zou de reactie niet op gang komen.

Slide 7-7: Zijn wheat germ extract en reticulocyten lysaat twee mogelijke extracten die gebruikt kunnen worden bij enzymatische aanmaak van eiwitten in vitro? Bevatten ze dus beide alle componenten om transcriptie en translatie te laten optreden (ribosomem e.d.)? Of zijn dit twee extracten die beide nodig zijn om een eiwit enzymatisch aan te maken?Het zijn twee alternatieve volwaardige extracten die je onafhankelijk van elkaar kan gebruiken. Wheat Germ Extract contains the cellular components necessary for protein synthesis (tRNA, ribosomes, initiation, elongation and termination factors). Wheat Germ Extract is prepared by grinding wheat germ in an extraction buffer followed by centrifugation to remove cell debris. The supernatant is subjected to chromatography that separates endogenous amino acids and plant pigments from the extract. The extract is also treated with micrococcal nuclease to destroy endogenous mRNA and thus reduce background translation to a minimum. Rabbit Reticulocyte Lysate is prepared from New Zealand white rabbits using a standard protocol that ensures reliable and consistent reticulocyte production in each lot. After the reticulocytes are lysed, the extract is treated with micrococcal nuclease to destroy endogenous mRNA and thus reduce background translation to a minimum. The lysate contains the cellular components necessary for protein synthes…

Slide 7-9:Ik snap niet hoe je gewenste eiwitten krijgt met polyhedrine.We gebruiken graag een virus als we een recombinant gen tot expressie willen brengen omdat infectie van cellen gewoonlijk veel efficiënter gaat dan andere systemen van gentransfer (bv transvestie of

elektroporatie). Het baculovirus is een virus dat alleen insektencellen kan infecteren. Het is dus veilig voor de onderzoeker, maar we moeten wel insektencellen gebruiken voor de expressie van ons gen van interesse. Vandaar de combinatie met een Drosophila cellijn. Het baculovirus heeft een sterke promotor, deze van het polyhedrine-gen (codeert voor een structuureiwit van het virus). Als we achter deze promotor ons cDNA van interesse steken, komt het cDNA sterk tot expressie in de geïnfecteerde Drosphila cellen.

Slide 7-10:Wat zijn fishing technieken?Dit zijn technieken doe toelaten om naar modulatoren van eiwit-eiwitinteracties te zoeken.

Slide 7-16:Wat is depletie van abundante eiwitten en hoe werkt dit?Als je bv proteomics wil doen van serum dan heb je het probleem dat het merendeel van het totale eiwit uitgemaakt wordt door enkele heel abundante eiwitten, waaronder albumine. Als je proteomics analyse zou uitvoeren op gewoon serum kom je bijna geen ander eiwit tegen dan deze heel abundante. Vandaar dat je deze eerst best verwijdert. Dat kan door een kolommetje te gebruiken met antistoffen tegen eiwitten zoals albumine. Op deze wijze depleteer je het serum van deze abundante eiwitten.

Slide 7-19: Wat is reversed phase? Ik begrijp wat hydrofobiciteitschromatografie is, maar niet wat u bedoelt met reversed phase.Reversed Phase en hydrofobiciteitschromatografie is eigenlijk hetzelfde. Het is een scheiding op basis van hydrofobiciteit. Het is uitgevonden in de jaren 1970 toen chromatografie vooral gedaan werd met silicakolommen. Dat is een hydrofiele vaste drager en daaraan blijven polaire moleculen langer hangen. Hydrofobe molecule lopen er makkelijk door. Dat werd beschouwd als normale chromatografie. Bij reversed phase chromatografie is het omgekeerd. De vaste drager is hydrofoob. Hydrofiele eiwitten zullen hier niet makkelijk aan blijven plakken en lopen vlot door de kolom. Hydrofobe eiwitten blijven wel langer hangen. Deze kunnen we elueren door de mobiele fase meer hydrofoob te maken. Er ontstaat dan competitie en de hydrofobe moleculen komen los. Je kan elueren in batch met één vloeistofmengsel of met een gradient waarbij de organische component toeneemt. Om de gradient te maken gebruik je een pompsysteem waarbij je uit twee flesjes tapt: bv één met water en één met aceonitrille. Het system is computergestuurd om geleidelijk meer of minder uit de flesjes te nemen en te mengen. A typical gradient profile in reversed phase chromatography might start at 5% acetonitrile (in water or aqueous buffer) and progress linearly to 95% acetonitrile over 5–25 minutes. Periods of constant mobile phase composition may be part of any gradient profile. For example, the mobile phase composition may be kept constant at 5% acetonitrile for 1–3 min, followed by a linear change up to 95% acetonitrile.

Slide 7-23:Geeft 2D gel electroforese hetzelfde resultaat als scheiding van eiwitten op een niet-denaturerende PAA-gel? Want bij beide treedt er een scheiding op basis van massa en lading op.

Neen. Scheiding op een niet-denaturerend gel geeft veel minder scheiding van eiwitten. De eiwitten blijven in de natieve conformatie en worden niet echt volgens de ware massa gescheiden, maar volgens de grootte in opgevouwen vorm in combinatie met lading van de opgevouwen vorm (dus niet alle ladingen worden geëxposeerd). Bij 2D ga je de eiwitten eerst denatureren zodat alle aminozuren geëxposeerd worden. De gedenatureerde eiwitten scheiden we nu volgens lading op een IEF gel wat een veel betere scheiding geeft dan in een natief gel. Daarna worden de eiwitten nog eens gescheiden volgens de correcte massa van de volledig gedenatureerde eiwitten die nu ook volledig negatief geladen zijn door SDS.

Slide 7-23:Waarom is 2D-gel elektroforese niet geschikt voor hydrofobe eiwitten?Hydrofobe eiwitten zijn moeilijk in oplossing te krijgen en te houden zonder SDS of andere detergenten. Omdat IEF nu eenmaal zonder SDS moet gebeuren want we gaan hier scheiden op lading ( SDS maakt alles negatief), geraken hydrofobe eiwitten vaak niet goed opgelost en zullen we dus missen in onze analyse.

Slide 7-49: Zou u alstublieft de technieken Electro Spray Ionisation (ESI) en Matrix Assisted laser desorption ionisation (MALDI) nog eens kunnen uitleggen?In MALDI, the analyte (=the substance of interest that needs to be ionised) is mixed with a matrix (= a substance that surrounds the analyte and assists in the ionisation process). There are a variety of different types of matrix molecules; usually it is a small, organic acid. One of the most common matrices is called α-cyano-4-hydroxycinnamic acid. The mixture of analyte and matrix is added, drop wise, to a metal plate. The solvent is allowed to evaporate, and the matrix crystallizes (forms a solid) around the analyte. The metal plate (which is usually stainless steel) is inserted in the instrument. A laser is shot at the sample, and ionization of the analyte is promoted. The exact mechanism of ionization is still a mystery. It has been theorized that the matrix molecules donate protons to the analyte molecules to form the positive ions. The ions travel through the instrument, and a mass spectrum is recorded. In MALDI, primarily singly changed ions are formed.Electrospray ionization, or ESI, has a very different ionization process than MALDI. The analyte to be studied is dissolved in a solvent, such as an acid in aqueous solution or an organic solvent. This mixture is pushed through a small syringe. Essentially, the liquid is sprayed while put under high voltage. Tiny droplets of ionized molecules in solvent are formed. An inert gas, such as nitrogen gas, flows over the droplets. Eventually, the solvent completely evaporates and the ionized analyte molecules fly apart from each other and travel through the rest of the instrument. In ESI, multiply charged ions can be formed.

Slide 7-53:Als je aan de C-terminale zijde knipt van Arg en aan de C-terminale zijde van Lys, dan zitten ze toch niet allebei in het stuk peptide dat je ertussen uitknipt? Hoe kan je dan twee positieve ladingen hebben?Als je knipt met een endopeptodase zoals trypsine krijg je fragmenten met aan één kant een Arg of Lys en aan de andere kant een NH2 terminus (trypsine knipt zo dat elk fragment een nieuwe NH2 terminus heeft). Zo zijn beide uiteinden van alle fragmenten geladen en zijn er geen fragmenten met bv 3 of meer positieve ladingen want trypsine knipt na elk positief geladen aminozuur.

Slide 7.53:We doen hier MS/MS sequentiebepaling. Is het correct dat we na het knippen met trypsine een ionisatie met ESI doen? Want dat staat hier niet expliciet vermeld.Meestal is dat inderdaad ESI. De belangrijkste reden hiervoor is dat je ESI makkelijk direct kan koppelen aan LC (liquid chromatografie). Het eluaat van de kolom wordt danrechtstreeks in het ESI apparaat gebracht.Bij klassieke MALDI zou je de fracties eerst moeten collecteren en daarna mengen met de matrix en spotten op een plaatje. Tegenwoordig zijn er wel apparaten die die geautomatiseerd kunnen.

Slide 7-54: Wat gebeurt er bij stap 3?Stap 3 toont dat er massa spectrometrie gebeurt terwijl de peptiden van de kolom elueren. Het bovenste prentje toont het profiel van de peptiden die elueren van de kolom in functie van de tijd. Het onderste figuurtje toont een representatief massa spectrometer profiel van de peptdien die eleueren op tijdspunt 42 min. Zo worden er massa spectrometrie profielen opgenomen op alle tijdspunten van de elutie van de kolom. Het insertie ind onderste figuur toont dat een peptide niet voorkomt als een enkelvoduge massa, maar als meerdere massa's na elkaar owv de aanwezigheid van 13C isotopen.

Slides 7-60 en 7-61: Klopt het dat op slide 7-60 eerst de scheiding op gel gebeurt en dan pas het knippen van proteinen in kleinere peptiden en op slide 7-61 net omgekeerd? Daar wordt het proteine eerst in kleinere peptiden geknipt (om zo een betere identificatie via MS te bekomen) en dan pas gescheiden via kolomchromatografie?Op slide 7-60 worden de eiwitten inderdaad erts gescheiden via 2D elektroforese en woerden individuele spots uitgeknipt. Die worden dan apart in peptiden geknipt en geanalyseerd. Op slide 7-61 wordt het hele eiwit lysaat in peptiden geknipt en dan via 2 kolommen gescheiden.

Slides 7-62 en 7-63: Hoe werkt targeted proteomics nu precies? Bij targeted proteomics kijk je niet naar alle eiwitten in een staal, maar selecteer je er een aantal die mogelijks interessant voor je zijn. Je kijkt alleen naar die eiwitten door in de Q3 quadrupole alleen naar peptidenfragmenten met massa’s overeenkomend met peptiden van d eiwitten van interesse te kijken ipv te scannen voor alle mogelijke massa’s.

Slide 7-63: Waarom treedt er hier geen scanning (wisselspanning veranderen om peptiden met verschillende massa's te kunnen detecteren) op in het Q3-compartiment? Je target proteine moet toch nog steeds in kleinere peptiden gesplitst worden (in het Q2-compartiment bijvoorbeeld) en deze peptiden hebben toch een verschillende massa die allemaal gedetecteerd moeten worden in het Q3-compartiment?Bij targeted proteomics kijk je niet naar alle eiwitten in een staal, maar selecteer je er een aantal die

mogelijks interessant voor je zijn. Je kijkt alleen naar die eiwitten door in de Q3 quadrupole alleen naar peptidenfragmenten met massa’s overeenkomend met peptiden van de eiwitten van interesse te kijken ipv te scannen voor alle mogelijke massa’s. We doen hier inderdaad geen volledige scanning, maar kijken selectief naar peptiden met een bepaalde massa (we geven die massa op voorhand in). We kijken enkele naar die massa’s, wat alles veel eenvoudiger maakt.

Slide 7-64: Wat is die IPG strip en hoe worden de eiwitten daarop gescheiden? IPG staat hier voor "Immobilized pH Gradient”. Het is dus hetzelfde als isoelectric focusing zoals op slide 7-21.

Slide 7-65: Hoe worden hier gegevens uit gehaald? Wat zegt de analyse over de 2 verschillende stalen?SILAC is een methode om naar verschillen te kijken in het proteoom van twee stalen. Om dit op een kwantitatieve wijze te kunnen doen, worden de eiwitten van één van de stalen gemerkt met een aminozuur met een 'zware’ isotoop dat je toevoegt aan de celculturen zodat de label kan ingebouwd worden tijdens de normale eiwitsynthese. Je gaat beide stalen nu mengen en voert proteomics uit via massa spectrometrie. Eenzelfde eiwit in de twee stalen heeft nu een verschillende massa omwille van de inbouw van de zware isotoop. Door de intensiteit van deze twee massa’s met elkaar te vergelijken, weet je hoeveel maal meer of minder het eiwit voorkomt in het ene staal tov het andere.

Slide 7-65/66:Het verschil tussen SILAC en ICAT is dat de labeling van eiwitten met isotopen op een verschillende moment gebeurd? Zal bij SILAC Arginine in de celcultuur toegevoegd worden, zodat dit als de enige bron van Arginine gebruikt moet worden. Bijgevolg zal dit in het gehele systeem opgenomen worden?

C13/C12 zullen dan echte 'tags' zijn die men toevoegd aan eenzelfde eiwit, dat uit een andere kweek komt. (ICAT) Hier gaan dus alleen dit ene eiwit getagged worden, waar bij SILAC alle eiwitten ‘getagged’ worden?Bij SILAC ga je de eiwitten merken met een aminozuur met een 'zware' isotoop. Deze voeg je toe aan celculturen, zodat de label kan ingebouwd worden tijdens de normale eiwitsynthese. Je kan dit niet doen met weefsels, tenzij je het hele organisme (bv muis) zware isotopen zou toedienen. Dat is uiteraard heel duur en bij mensen ligt dat ethisch moeilijk. Bij ICAT worden de eiwitten gemerkt nadat de cellen (of weefsels) gelyseerd zijn. De tag wordt chemisch aan de eiwitten vastgehangen (na cellyse) en dus niet tijdens de nieuwsynthese van eiwitten zoals bij SILAC. ICAT kan dus toegepast worden voor alle (ook reeds bestaande) eiwitlysaten. Bij beide methoden is het de bedoeling dat zoveel mogelijk eiwitten van een staal gemerkt worden, want het is net de bedoeling om differentiële proteomics te doen (van proteomen en niet van individuele eiwitten).

Slide 7-66 Je merkt op voorhand je twee verschillende stalen, is het doel gewoon meten hoeveel je van elke staal (ziek versus gezond) hebt? Binden beide stalen aan cysteine? hetvolgende berhijp ik niet: Avidine kolom bindt de biotines van gelabelde peptides. Wnr ze door kolom gaan, zal de mix van gelabelde proteïnen identieke peptideparen bevatten, afkomstig van identieke proteïnen ?

De bedoeling van al deze technieken van differentiële proteomics is om de proteomen van twee of meer stalen te vergelijken op een zo kwantitatief mogelijke wijze. Hierdoor merken we de eiwitstalen die we willen vergelijken met een verschillende merker en voegen de stalen dan samen zodat we ze in één analyse kunnen meten ipv aparte analyses (aparte analyses kunnen niet nauwkeurig kwantitatief met elkaar vergeleken worden owv variatie van run tot run). Bij ICAT koppelen we aan de eiwitten een tag met een bepaalde massa. Voor elk staal dat we willen vergelijken is dat een andere tag meet een welbepaalde massa. Taggen kan makkelijk doordat de tag een peptide-reactive groep heeft (NHS-) die reageert met de cysteïnes van de eiwitten in de stalen waarvan we vergelijkende proteomics willen doen. We mengen nu de stalen die we willen vergelijken. Omdat de tag ook biotine bevat kunnen we vervolgens de eiwitten met een tag aanzuiveren via een avidine kolommetje. Nu voeren we proteomics uit zoals beschreven bij bovenstaande vraag.

Slide 7-66:Bij afkortingen zoals ICAT en ITRAQ, is het voldoende om enkel de afkorting te studeren? Of is het voldoende om enkel de voluit geschreven vorm te kennen? Of moeten beide gekend zijn?De afkortingen moeten zeker gekend zijn want in de praktijk spreken we over de methoden altijd met de afkorting en zelden met de volledige naam. Toch is het nuttig om ook de volledige naam te kennen. Dat helpt voor het onthouden van de afkorting en zegt vaak ook hoe de methode werkt. Dus best beide.

Slide 7-67:Ik begrijp niet waarom de ITRAQ techniek beter is dan de ICAT. Waarom is het gemakkelijker als de totale massa hetzelfde blijft?De bedoeling van al deze technieken van differentiële proteomics is om de proteomen van twee of meer stalen te vergelijken op een zo kwantitatief mogelijke wijze. Hierdoor merken we de eiwitstalen die we willen vergelijken met een verschillende merker en voegen de stalen dan samen zodat we ze in één analyse kunnen meten ipv aparte analyses (aparte analyses kunnen niet nauwkeurig kwantitatief met elkaar vergeleken worden owv variatie van run tot run). Bij ITRAQ koppelen we aan de eiwitten isobare tags. Taggen kan makkelijk doordat de tag een peptide-reactive groep heeft (NHS-). Elk staal krijgt een andere isobare tag zodat de totale massa van de tag gelijk blijft. We bepalen zelf aan welk staal we welke tag hangen. We mengen nu de stalen die we willen vergelijken. Bij MS in Q1 (eerste quadrupole waarbij we de massa van de intacte peptiden (met tag) kunnen zien) vallen identieke peptiden van de verschillende stalen tesamen in een piek. Dat maakt het patroon eenvoudiger dan bij ICAT (daar vallen identieke peptiden niet samen owv de verschillende tag). Bij MS/MS zullen in de Q3 (derde quadrupole), na botsing van de peptiden met een inert gas in Q2 (tweede quadrupole), de getagde ITRAQ peptiden stuk breken, preferentieel tussen de reportergroep en de balance groep. De "identieke" peptiden van de verschillende stalen die in Q1 samenvallen zullen zich nu opdelen in verschillende pieken omdat ze nu wel een verschillende massa hebben. Door de intensiteit van deze pieken te vergelijken, kunnen we nu makkelijk de relatieve expressie van dit peptide nagaan in de verschillende stalen.

Slide 7-73: Is het de tyrosine kinase receptor het eiwit waarvoor we interagerende partners zoeken? Kies je op voorhand waar prey gaat aan binden? Of kan je dat niet kiezen?Neen. Aan het tyrosine kinase hang de bait waarvoor je naar interagerende partners zoekt (dat is het

zwarte blikje op de slide). Dat is jouw eiwit van interesse. dat kan je zelf kiezen. De prey kies je in principe niet zelf, want die wil je net gaan zoeken door een cDNA bank (alle mifgelihke cDNAs) te koppelen aan gp130. Uit deze hele bank vis je welke prey er precies bindt aan de bait. Je kan natuurlijk ipv van een hele screening van een bank, het systeem ook gebruiken een een interactie tussen de bait en één speciek op voorhand gekozen prey na te gaan als je interactie vermoed tussen deze twee eiwitten en dit wil confirmeren met dit systeem.

Slide 7-76:Bij de tekening van de immuno-blot toont het proteïne 2 geen bandje bij P2/P1-NT. Is dit omdat de immunoglobulines enkel gaan binden indien er proteïne 1 aanwezig is ?Dat is inderdaad juist. Als proteïne 1 niet aanwezig is, zou je met het antistof tegen proteïne 2 geen bandje mogen vinden. Dat is een controle voor specificiteit die men gewoonlijk uitvoert. Hier nog wat uitleg ivm co-immunoprecipitatie. Bij co-immunoprecipitatie ga je met met beads met een antstof tegen een bepaald eiwit bv eiwit 1 in de figuur op slide 7-76, alle eiwitcomplexen met eiwit 1 (= interagerende partners) precipiteren. De rest was je weg. De echt interagerende partners worden niet weggewassen als ze voldoende affiniteit hebben voor elkaar. Deze eiwitcomplexen ga je nu op een wb zetten. Door het SDS daat aanwezig is gaan de complexen nu wel uit elkaar en gaan de eiwitten scheiden volgens massa. Met een antistof tegen eiwit 2 ga je nu kijken of je signaal vindt op de western blot. Is er signaal, dan was er dus een interactie van eiwit 2 met eiwit 1. Deze techniek is nuttig om eiwit-eiwit interacties te confirmeren in intacte cellen (want je bereidt bestaande eiwitcomplexen uit intacte cellen).

Slide 7-76:Co-immunoprecipitatie hoe kan je hiermee interacties controleren?Bij co-immunoprecipitatie ga je met met beads met een antstof tegen eiwit 1, alle eiwitcomplexen met eiwit 1 erin precipiteren. Deze eiwitcomplexen ga je nu op een western blot zetten. Met een antistof tegen eiwit 2 ga je nu kijken of je signaal vindt op de western blot. Is er signaal, dan was er dus een interactie van eiwit 2 met eiwit 1. Deze techniek is nuttig om eiwit-eiwit interacties te confirmeren in intacte cellen (want je bereidt bestaande eiwitcomplexen uit intacte cellen).

Slide 7-79: Wat gebeurt er aan oppervlakte van het metaal en hoe wordt dit gekoppeld aan de laser? Wat wil het zeggen als er bij bepaalde frequentie licht geabsorbeerd wordt?At an interface between two transparent media of different refractive index (glass and water), light coming from the side of higher refractive index is partly reflected and partly refracted. Above a certain critical angle of incidence, no light is refracted across the interface, and total internal reflection is observed. While incident light is totally reflected the electromagnetic field component penetrates a short (tens of nanometers) distance into a medium of a lower refractive index creating an exponentially detenuating evanescent wave. If the interface between the media is coated with a thin layer of metal (gold), and light is monochromatic and polarized, the intensity of the reflected light is reduced at a specific incident angle producing a sharp shadow (called surface plasmon resonance) due to the resonance energy transfer between evanescent wave and surface plasmons. The resonance conditions are influenced by the material adsorbed onto the thin metal film. Satisfactory linear relationship is found between resonance energy and mass concentration of biochemically relevant molecules such as proteins, sugars and DNA. The SPR signal which is expressed in resonance units is therefore a measure of mass concentration at the sensor chip surface. This means that the analyte and ligand association and

dissociation can be observed and ultimately rate constants as well as equilibrium constants can be calculated.

Slide 7-79:Bij punt 7.6 is er een slide over de surface plasmon resonance, ik begrijp deze techniek niet.Dit heb ik al eens uitgelegd bij FAQ3 slide 7-79. Een goede uitleg vind je ook bij http://en.wikipedia.org/wiki/Surface_plasmon_resonance

Slide 7-84:Het effect op de curven door de competitieve en niet-competitieve inhibitor is me niet duidelijk.Ik denk dat dit mooi staat uitgelegd op http://en.wikipedia.org/wiki/Receptor_antagonist bij puntjes 3.1 en 3.2.

Slide 7-85:We meten bij de verschillende methoden de totale binding, maar we willen de specifieke binding. Ik begrijp niet hoe we de niet-specifieke binding meten en we dan daarna de specifieke binding hieruit kunnen afleiden.Specifieke bindingsplaatsen zijn gewoonlijk beperkt owv bv het aantal receptoren. Dit uit zich in een hyperbole curve omdat in het begin als je weinig ligand toevoegt er veel vrije bindingsplaatsen zijn waaraan het ligand kan binden. Als je meer ligand toevoegt worden er al snel veel bindingsplaatsen bezet en is de kans dat nog meer ligand gaat binden steeds kleiner. De binding is dan ook verzadigbaar (beperkt aantel bindingsplaatsen of receptoren). Vele molecule gaan ook op een niet-specifieke wijze binden aan een preparaat. Dit is niet of veel minder beperkt doordat de moleculen aspecifiek binden, dus niet aan welbepaalde receptoren, maar bv algemeen aan eiwit. De curve is dus veel meer lineair en moeilijk verzadigbaar. Deze niet-specifieke binding meet je doordat je bij je gemerkt ligand een overmaat van ongemerkt ligand voegt. De overmaat ongemerkt ligand verzadigt de specifieke bindingsplaatsen. Alle binding die we zien van de gemerkte ligand is dus aspecifiek want de specifieke plaatsen zijn bezet door de ongemerkte ligand. Als je de concentratie gemerkte ligand laat toenemen in een overmaat van ongemerkt ligand, krijg je de lineaire curve van de niet-specifieke binding. Deze trek je af van de hyperbole curve met gemerkt ligand alleen (hiermee meet je totale binding). Wat je overhoudt is de curve van de specifieke binding (totale binding min de niet-specifieke binding).

Slide 7-86: Wanneer er een evenwicht bereikt wordt, meet je dan hierbij ook zoals bij vorige slide de aspecifieke binding? Je meet de totale binding. Onderscheid tussen specieke en aspecifieke binding ka je maken zoals vermeld op slide 7-85.

Slide 7-96:Hoe werkt de microdialyse?Bij microdialyse maak je gebruik van een dialysemembraan waardoor watermoleculen wel doorkunnen maar eiwitten niet. Als de zoutconcentratie hoger is de grooste kamer dan in het kamertje met het eiwit (gele bolletjes in het prentje) zullen watermoleculen geleidelijk weg gaan van de eiwitten en zal de eiwit

en zoutconcentratie toenemen, zodat een supersaturatiezone bereikt wordt.

Slide 7-105:Ik begrijp de 3de en 4de manier om het faseprobleem op te lossen niet. We gebruiken zware atomen omdat we dan gemakkelijker het diffractiepatroon kunnen bepalen, maar wat is het nut hiervan? Hoe komen we de structuur van het eiwit dan te weten? Ik snap niet hoe we hier het faseprobleem oplossen?Bij Multiple isomorphous replacement of MIR ga je het Kristal onderdompelen in een oplossing met een zwaar atoom (bv kwik of platinum die binden aan een specifiek amainozuur) nadat je het Kristal gemaakt hebt, of je doet co-crystallization met het zware atoom. De toevoeging van het zware atoom mag wel de kristalvorm niet beïnvloeden, vandaar “isomorph”. Er worden nu diffractiepatronen geregistreerd van het native kristal en van het kristal met het zware atoom. De zware atomen hebben een wat andere wijze van diffractie waardoor het makkelijker is om hun positive en fase te bepalen. Dat kan via een Patterson difference map (maar daar zijn we niet verder op ingegaan, wat dat zou ons te ver leiden). Aangezien de structuurfactor van het kristal met het zware atoom de som is van het zware atoom alleen en van het natieve kristal, kunnen de fasen van het natieve kristal wiskundig berekend worden. Bij Multi-wavelength anomalous diffraction (MAD) worden geen twee kristalstructuren (natief en met zwaar atoom) met elkaar vergeleken zoals bij MIR, maar worden verschillen in diffractie van zware atomen (anomalous diffraction) in één kristal geregistreerd bij verschilende golflengtes van een synchrotron. Zware atomen kunnen ingebracht worden zoals bij MIR, maar vaak ook tijdens de synthese van het eiwit (bv dmv selenium methionine).

Slide 8-3:Waarom in ppm? Wat staat er in MHz en wat in Hz? Hoe moeten we een shift van 1,5 interpreteren? Is er dan 1,5 ppm meer of minder E of golflengte nodig dan TMS?Om het “kernmagneetje” te doen omkeren van magnetische toestand is een radiostraling nodig van ongeveer 100 megahertz. De juiste frequentie is echter afhankelijk van de sterkt van de magneet, wat voor elk merk en type NMR toestel anders is. Vandaar dat men werkt tov een referentiestof: tetramethylsilaan. Dit heeft waterstoffen die allemaal in dezelfde omgeving zitten zodat ze resoneren bij één bepaalde golflengte die we gelijkstellen aan 0. Het verschil in frequentie die nodig om waterstoffen in andere moleculen te doen resoneren ligt gewoonlijk in de orde van enkele Hertz. Vandaar dat men spreekt van chemical shift (verschuiving van golflengte tov die nodig voor tetrametylsilaan) en dat men dit uitdrukt al ppm (parts per million, in dit geval hertz tov megahertz). Een chemiical shift van 1,5 ppm betekent dat de waterstofkernen van het betrokken molecuul resoneren bij 1,5 miljoenste meer megahertz dan bij tetramethyl silaan (TMS). Als bv in een bepaald NMR apparaat de waterstofkenen van TMS resoneren bij 120.000.000 hertz (= 120 megahertz) en de waterstofkernen van het andere molecule in kwestie bij 120.000.180 hertz is er een ppm van 1,5. Een goede algemene uitleg ivm NMR uitleg vind je op: http://nl.wikipedia.org/wiki/Proton-NMR

Slide 8-4:Is het mogelijk om wat meer uitleg te krijgen over NMR spectroscopie en het principe van chemical shift bij hoofdstuk 8 dia 4.Ik denk dat dit behoorlijk goed staat uitgelegd op http://nl.wikipedia.org/wiki/Proton-NMR.

Slide 8-5: Kan er enkel een diagnostische merker gemaakt worden na analyse van een MS-spectrum of kan dit ook bij NMR-spectra?Dit kan ook met NMR data.

Slide 8-5:Ik begrijp niet goed op welke manier NMR kwantitatief is. Bedoelt men hiermee dat met NMR de concentratie bepaald kan worden van de onderzochte metabolieten? En gebeurt dit dan dmv de hoogte van de pieken te bekijken? Of wordt met kwantitatief de chemical shift tov tertramethylsilaan in ppm bedoeld? NMR is kwantitatief in de zin dat je inderdaad concentraties van metabolieten kan meten en vergelijken tussen stalen onderling. Hoe hoger de intensiteit van een signaal, hoe meer van dat metaboliet er aanwezig is. Met massa spectrometrie is dat moeilijker omdat de ionisatie van elk metaboliet verschillend is en omdat vaak ionsuppressie optreedt, wat betekent dat het ene metaboliet de ionisatie van het andere kan beïnvloeden.

Slide 8.5:Mag ik er vanuit gaan dat als men chemometrie wilt dat men eerder NMR gebruikt en als men identificatie en kwantificatie wil, dat men eerder MS gebruikt?Dat is niet per se zo. Je kan beide methoden gebruiken voor zowel chemometrisch als identificatie en kwantificatie. Wel is het zo dat NMR makkelijker is om metabolielten te kwantificeren (maar kan ook met MS als je geschikte standaarden gebruikt). Identficeren van metabolieten kan vaak makkelijker en gevoeliger met MS.

Slide 8-10: NMR 2D-TOCSY: ik heb begrepen dat we dubbele pieken creëren door 13C in te bouwen in onze lipiden. Dit is duidelijker te zien op het 2D spectrum als 2 puntjes. Nu heb ik ook genoteerd dat afhankelijk van welke intensiteit van die puntjes het hoogste is (nl bij de lactaatC2 of lactaatC3), je kan bepalen welke net die 13C bevat. Klopt het wat ik schrijf?Zeker. Hier wat meer uitleg. De bedoeling hier is het metabolisme van glucose te volgen. Hiertoe behandelt men cellen of weefsel met 13C-gemerkt glucose en volgt men de inbouw hiervan in andere metabolieten bv lactaat. Op deze slide wordt SIRM op twee manieren uitgevoerd: via 2D-NMR (2D-TOCSY: total correlation spectroscopy) (links) en MS (rechts). Het principe van SIRM via NMR is dat als er een 13C in een molecule zit ingebouwd dit een verschuiving zal geven in de chemical shift van nabijgelegen protonen. Het signaal van dat proton zal daardoor opsplitsen. Men spreekt hier van 13C satellieten. In de linkse figuur is dat voor sommige moleculen aangegeven bv bij Ala-C3 of lactaat-C3 (is koolstof 3 van lactaat) (bij 1.4 ppm) zie je die opsplitsing aangegeven. Bij moleculen zoals lactaat kan 13C ingebouwd worden op de C2 (4.4 ppm) of de C3 positie (1.4 ppm). Dit geeft telkens een andere shift. Om dit beter te visualiseren plot men de data in twee dimensies plot met op de X- en Y-assen dezelfde meting (2D-TOCSY). Als je het signaal van lactaatC3 in de X-as verbindt (4.4 ppm) met het signaal van lactaat-C2 in de Y-as (1.4 ppm), zie je In de 2D-plot dat het signaal wordt opgesplitst in 4 spots op de punten van een rechthoekje, waarvan de verhouding verandert als er meer of minder 13C aanwezig is op de C2 of C3 positie.

Slide 8-12:

Bij het stukje lipiden, spreekt u vaak over 'species'. Bedoelt u hier gewoon mee dat er veel verschillende soorten lipiden zijn?Met lipide species bedoel in een specifiek lipide molecule met een unieke structuur en massa.

Slide 8-16:Hoe moet ik mij de silicagel voorstellen bij TLC en hoe bij HPLC?Silica gel werd twee eeuwen geleden ontdekt. Het werd voor het eerst op grote schaal gebruikt om penicilline te bewaren op het einde van de tweede wereldoorlog. Het bestaat uit nagenoeg zuivere silicium dioxide. Onder het blote oog lijkt silica gel op kleine glasbolletjes, maar onder de microscoop is een struktuur te zien zoals bij sponzen. Je vindt het vaak als droogmiddel bij vele producten (zakje met wiite bolletjes dat mee in d everpakking zit van vele producten). Gelijkaardige maar veel kleinere blootejes wirden op een aluminiumplaat gebracht voor TLC of in een kolom voor HPLD. Moleculen zullen er op verschillende wijze aan adsorberen in een bepaalde loopvloeistof en die op die wijze van elkaar scheiden.

Slide 8-20 en 21. Als ik het goed begrijp wordt de lipidenstaal direct geïnjecteerd in de ionisator en daarna door 3 buizen gestuurd? Ik begrijp niet goed wat er daar juist gebeurt.Je gaat je lipidenstaal direct injecteren in een ESI-MS/MS apparaat. Door ESI (electrospray) worden de lipiden geïoniseerd. Dits is een zachte vorm van ionistaoet waardoor de moleculen intact blijven, maar wel een lading krijgen. Vpor sommige lipiden is dat een positieve lading (bv fosfatidylcholine (PC)) , voor andere is dat een negatieve (bv fosfatidylinositol (PI). Andere lipiden kan je ofwel positief, ofwel negatief laden (bv fosfatidylethanolamine (PE). Deze geladen lipiden gaat men nu direct onderwerpen aan MS/MS. Hiervoor heeft men meerdere quadrupolen achter elkaar gezet zoals bij de triple quadrupoles. In de eerste quadrupole (Q1)kan je door de wisselstroom te variëren selecteren welke moleculen (op basis van m/z) je doorlaat. Deze moleculen (bepaalde m/z) die je doorlaat, laat je in de tweede quadruple (Q2) botsen met een enert gas; waardoor ze fragmenteren. In de derde quadrupole (Q3) meet je de massa van de gevormde fragmenten (is dus opnieuw MS). Van daar MS/MS. Je kan dit doen in scanning modus, waarbij je in Q1 alle mogelijke m/z afscant (door de frequentie van de stroom op de quadrupole te variëren) en in Q3 ook zodat je alle mogelijke fragmenten van alle mogelijke moleculen meet. Je hoeft niet per se te kijken naar alle lipiden, maar kan bv specifiek kijken naar fosfatidylcholines. Van deze lipiden komt er in de Q2 een fosfocholine hoofdgroep vrij met m/z van 184. Als je de Q3 instelt op m/z 184 en in Q1 alle m/Z afscant, zie je alle mogelijke fosfatidyl cholines. Het resultaat van shotgun lipidomics waarbij we een scanning doen van alle fosfatidylcholinelipiden van twee stalen wordt geïllustreerd op slide 8-23. We injecteren het lipidenstaal in het MS apparaat (na ESI) en laten het in de tweede quadrupole botsen met inert gas. In de derde quadrupole kijken we alleen naar lipidenspecies waarvan een fosfocholine headgroup dus met een massa/lading (m/z) van +184 losgekomen is (zie slide 8-22). Op deze wijze zien we in de grafiek nu alleen de fosfatidylcholine species. De X as is de massaschaal in toenemende

grootte, de y as is de intensiteit van de piek. Op de grafiek zie je nu groepjes van pieken. Zo zit er rond m/z 760 een groepje van pieken. Op basis van de massa weten we dat deze lipiden twee vetzuurketens hebben waarvan het totaal aantal koolstofatomen 34 is. De meest rechtse piek van dit groepje heeft geen dubbele binding. Het is PC34:0. De piek meer links in het groepje heeft 1 dubbele binding en zit dus twee massaeenheden meer naar links want er zijn twee waterstofatomen minder door de dubbele binding. Het is dus PC34:1. Nog meer naar links in hetzelfde groepje zit PC34:2 (34 koolstofatomen in de twee vetzuurketens samen en twee dubbele bindingen, enz. De intensiteit van elke piek zegt ons iets voor de abundantie van het lipide in ons staal. We moeten wel opletten dat niet alle species even goed

ioniseren zodat de hoogte van de piek niet altijd direct een maat is voor de abundantie. We kunnen dit probleem oplossen door gekende hoeveelheden standaarden toe te voegen aan ons staal en de intensiteiten van de pieken uit te drukken tov de standaarden. Omdat koolstof voor 1% voorkomt als 13C ipv 12C zal in een fractie van de lipiden er ook 1 of meerdere 13C ingebouwd zijn. Deze species zitten dus 1 of meerdere plaatsjes meer naar rechts in de grafiek. Omdat we weten dat 13C slechts voor 1% voorkomt en 99% 12C is, kunnen we omrekenen hoeveel van elk species er een plaatsje verder zit in de grafiek. Je kan het systeem ook gebruiken in targeted modus (MRM, multiple reaction monitoring) (slide 8-21 onderaan). Hier ga je alleen kijken naar vooraf gekozen lipiden op basis van de m/z die doorgelaten wordt in Q1 en op basis van de m/z van verwachte fragmenten (je doet dus geen scan in Q1 maar selecteert welbepaalde m/z. Dat doe je ook in Q3). Het voordeel van deze methode is je elk lipide langer kan meten en de profielen veel eenvoudiger zijn, waardoor het systeem meer kwantitatief is.

Slide 8-21 - 22: Ik begrijp dat er in Q1 een premassaselectie gebeurt en dat in Q2 de fragmenten fragmentatie ondergaan maar wat er in Q3 gebeurt vind ik niet zo duidelijk. Dus in Q3 ga je kijken naar lipidenfragmenten die een bepaalde groep bevatten bv PC en dan wordt er ook weer een bepaalde m/z bepaald door dat in te stellen dus 184. Dan ga je kijken naar alle lipiden van verschillende ketenlengte die PC groepen bevatten?Q3 werkt ook als een quadrupool net zoals Q1. In Q3 kan je de massa’s van de fragmenten afscannen of je kan Q3 instellen op een bepaalde mass. Dat laatste wordt in deze slide gedaan. Je stelt Q3 in op m/z 184. Zo detecteer je alleen lipiden waar er een fosfocholine hoofdgroep afkomt in Q2. Q1 kan je nu ook instellen op vooraf gekozen massas van intacte lipiden waarvan je weet dat ze een fosfocholine groep hebben (MRM mode) of je kan in Q1 scannen (alle massa’s aflopen) zodat je alle lipiden waar een fosfocholine afkomt kan zien.

Slide 8-27: Ga je bij de MALDI imaging techniek ook geen eiwitten in beeld brengen? Want eiwitten worden toch ook geioniseerd door de matrix waardoor deze TOF kunnen ondergaan en gedetecteerd kunnen worden?De lipiden die we meten hebben gewoonlijk een massa tussen de 300 en 1500 Da. Daar zitten inderdaad ook kleine peptiden bij en andere metabolieten. Grote eiwitten zitten in een heel andere massa-range. Om zeker te zijn dat we naar de juiste moleculen aan het kijken zijn, maken we gebruik van toestellen met een heel hoge massa-resoltie (veel plaatsen na de komma).

Slide 8-27:U zei dat we voor lipiden ook Maldi met TOF kunnen doen. Hoe gebeurt dit dan met TOF, want men maakt eerst een matrix en dan? Hoe kan men van een massaspectum naar een moleculair beeld gaan?De matrix is nodig om de moleculen te kunnen ioniseren. De laser ioniseert de matrix, waarvan er een lading overgaat naar het te meten molecuul. De geladen moleculen komen nu in een vacuumbuis terecht. Zoals de naam TOF doet vermoeden, wordt de tijd gemeten die de ionen er over doen om de detector op het uiteinde van de buis te bereiken. Deze tijd is afhankelijk van de massa en de lading van de ionen. Deze tijd is dus karakteristiek voor ieder molecuul. Als we op deze wijze (door middel van het meten van de tijd) de massa heel nauwkeurig kunnen meten, weten we om welk molecule het gaat,

omdat elk molecule een specifieke massa geeft die we theoretisch op basis van de atomaire samenstelling kunnen berekenen. Uiteraard zijn er soms moleculen met heel gelijkaardige massa. De massaresolutie van het toestel is dus belangrijk om de signalen toe te wijzen aan het juiste molecule.

Slide 9-2:Aangezien men bij de run-off assay cellen invriest, kan het dan niet zijn dat men deze cellen activeert zodat deze ‘survival’ genes activeren, die tot expressie komen. Zal dit dan het resultaat van de assay beïnvloeden? (Aangezien deze oorspronkelijk niet tot expressie waren in normale cellen) Of zal de invriezing in zo’n snelle mate gebeuren dat de cel geen tijd heeft om hier tegen te reageren?Je zet de cellen onmiddellijk op ijs zodat alle processen onmiddellijk stilvallen. Er is geen tijd voor de cellen om hierop te reageren. De inbouw met gemerkte nucleotiden achteraf op 37° gebeurt ook snel.

Slide 9-3:Ik begrijp de niet goed hoe je met de promotor-reporter studies transcriptie kan opsporen.Wat we met promoter-reporterstudies vaak willen nagaan is of bepaalde condities de transcriptie van een zeker gen regelen en via welke regelelementen in de promotor. Bv ik wil weten of de promotor van het GLUT-gen geregeld wordt door insuline en door welke DNA-elementen in de promotor dit gebeurt. Je maakt dus eerst een construct met een promotorfragment van het GLUT gen (maak je bv aan door PCR vertrekkende van genomisch DNA en twee primers specifiek voor de GLUT-promotor) waarachter je een reporter plaatst (bv luciferase). Je maakt ook kortere fragmenten hiervan (kan ook via pCR met andere primers). Nu transfecteer je deze constructen in een cellijn en ga je bv een plaatje getransfecteerde cellen behandelen met insuline en een ander plaatje zonder insuline. Als je luciferaseactiviteit in de insuline-conditie hoger is dan in de controle conditie, betekent dit dat jouw GLUT promotor gecativeerd wordt door insuline. Om uit te zoeken waar precies het regel-element in jouw promotor zit (waar een transcriptiefactor bindt) transfereer je de cellen met de constructen met de kortere stukjes van jouwpromotor en kijk je met welke stukjes van jouw promotor je nog effecten ziet van insuline en met welke niet.

Slide 9-5:Hoe kunnen we uit de DNAsequentiebepaling de actieve regulatorische elementen genoomwijd mappen? Ik snap deze slide precies niet?De bedoeling van DNase-seq is om transcriptioneel actieve regulatorische sites in het genoom te kunnen mappen. Het principe is erop gebaseerd dat deze platsen in het genoom een meer open structuur vertonen, waar DNase makkelijker aankan en kan knippen. We permeabiliseren dus cellen of we bereiden nuclei. Het chromatine behandelen we met DNase I. Dit knipt in de meer open en dus transcriptioneel actieve structuren van het chromatine en veroorzaakt daar dus een breuk (het knipt). Al wat we nu moeten doen is deze DNase knipplaatsen identificeren. Dit doen we door aan de knipplaatsen gebiotinlyleerde linkers te ligeren. Omdat dit vaak langer fragmenten oplevert, knippen we die verder met een restrictie-enzym dat vaak knipt, zodat we kleinere fragementen overhouden waarvan we aan de knipplaats van het restrictieenyme een tweede linker ligeren om vervolgens de fragmenten via PCR te kunnen amplificeren. We hebben nu dus een fragmetenbank met allemaal fragmentjes die gelegen zijn rond DNase I knipplaatsen. Deze gaan we identificeren door ze te onderwerpen aan next generation sequencing, waarna we de fragmentjes mappen op het

referntiegenoom. Hierdoor kunenn we zien waar in het genoom het DNase I geknipt heeft en dus waar d emeer open en dus meer transcripotioneel active sites zitten.

Slide 9-7:Hoe weet je nu welke fragmenten transcriptioneel actief zijn? Die met of die zonder eiwit gebonden?EMSA zegt niets over transcriptionele activiteit, enkel over binding van een eiwit aan een oligonuleotide. Om naar transcriptionele activiteit te kijken kan je bv je promoter-reporter studies uitvoeren waarin je bv een mutatie of deletie aanbrengt op de via EMSA geïdentificeerde bindingsplaats.

Slide 9-10:Met welke primers doe je hier PCR? Want je weet nog niet aan aan welk gen bv. HIF1 bindt. Dus kan je geen primers gebruiken voor gen.Gebruik je hier dus een soort van universele primers?Bij gewone ChIP (Slide 9-9) kijk je naar een specifiek gen bv het VEGF gen in dit vorobeeld en gebruik je specieife primers daarvoor. Bij ChIP-chip en ChIP-seq kijk je naar alle genen waaraan het eiwit bindt en kan je inderdaad geen primers vooraf kiezen. Wat je hier gewoonlijk doet is inderdaad adaptors ligeren aan de fragmenten en PCR primers gebruiken die de adaptors herkennen.

Slide 11-5:Hoe werken de modificaties op de figuren? Wat is morpholino? Zijn de modificaties nuttig of zijn er een nadeel?De modificaties zijn vooral bedoeld om het DNA stabieler te maken, zodat het minder makkelijk afgebroken wordt door DNases. Je kan dit doen door bv op de fosfaatgroep een O te vervangen door een S. Of door op de 2’ positie van de suikergrope een methoxyethoxygrope te zetten etc. Morfolino's hebben een morfolino-ring (met een N in de ring) in plaats van een gewone deoxyribose-suikerring, en in plaats van de fosfaatgrope zitten er fosphorodiamidaatgroep. Het voordeel van deze vervanging is dat de ruggengraat van het molecule neutraal geladen is (tegenover de negatief geladen fosfaatketting bij DNA en RNA). Hierdoor worden morpholino’s niet herkend door DNases en activeren ze bv toll-like receptoren niet.

Slide 11-8:Wat is het verschil tussen miRNA en siRNA? Komen ze beiden door hetzelfde mechanisme tot stand en doen ze hetzelfde? Wat gebeurt er op de figuur na 'asymmetric RISC assembly'? Wat zijn de verschillen tussen translationale repressie en mRNA cleavage?RNA interference (RNAi) is an important set of pathways that are used to regulate gene expression. RNAi is a blanket term which can refer to both small interfering RNAs (siRNAs) and microRNAs (miRNAs). There are important similarities and differences between siRNAs and miRNAs and there is a lot of confusion. Both are processed inside the cell by Dicer and incorporated into a complex called RISC. Both siRNA and miRNA regulate gene expression, but do so in different ways. siRNA is specific to a particular target (gene sequence) whereas miRNA is not and a single miRNA can potentially regulate the expression of many different genes. Thus it is possible to regard miRNA as the more "highly evolved" system, especially as siRNA does not occur in higher animals such as mammals, which have replaced siRNA with other antiviral mechanisms such as interferons. For mammalian cells, siRNA is sometimes considered processed miRNA but most frequently as exogenous double-stranded RNA that is taken up by cells, while miRNA is single stranded and comes from endogenous (made inside the cell) found within the introns of larger RNA molecules. In animals, siRNA typically binds perfectly to its mRNA target, a perfect match to the sequence, whereas miRNA can also bind to untranslated regions of

mRNAs and inhibit translation of many different mRNA sequences because its pairing is imperfect. In plants, miRNA tends to have a more perfectly complimentary sequence which induces mRNA cleavage as opposed to just repression of translation. Below you find a table that I think summarises pretty well the main differences between miRNA and siRNA.

Slide 11-9:Hier begrijp ik de interferon respons niet en ook niet hoe de apoptose juist wordt geïnduceerd.RNAi is vele organismen een onderdeel van het natuurlijke immuunsysteem bv om virussen af te weren. Zo zal dsRNA binden aan toll-like receptoren (TLR) en aan proteïnekianses zoals PKR of aan pattern recognition eiwitten zoals RIG-1. Deze activeren o.a. het TANK-kinase (TKB-1) of beïnvloeden het NF-kappa-B eiwit IKK, wat uiteindelijk leidt tot activatie van interferon regulatory factors (IRF3/7) die leiden en productie van interferon. Interferon interfereert met de replicatie van virussen door translatie still te leggen en/of apoptose te induceren. dsRNA kan ook apoptose induceren via PKR-gemedieerde activatie van celdoodreceptoren (FADD) die caspases activeren, of via ander proteïne kinases waaronder Janus kianse (JNK) die o.a. cytochrome c kunenn vrijzetten van mitochondriën en zo apoptose induceren.

Slide 11-11:Zou u me kunnen uitleggen waarom er drie verschillende siRNAs (2 onafhankelijke en 1 scrambled controle) nodig zijn want de slide 11-12 heeft wel als titel 'vermijden off-target effecten' maar siRNA heeft toch sowieso een hoge specificiteit voor zijn target? Wat is het verschil precies tussen de onafhankelijke siRNAs en de controle? siRNAs zijn niet zo specifiek als je zou denken. Ze hebben vaak off-target effecten doordat ze ook een ongewenste knock-down veroorzaken van andere genen die er een beetje op gelijken. Om zeker te zijn dat de effecten die je ziet op de met een siRNA effectief te wijten zijn aan de knockdown van het geoogde gen, herhaal je het experiment best met een ander onafhankelijk siRNA tegen hetzelfde gen.

Ook dat zal allicht naast het beoogde gen andere genen onderdrukken, maar zullen allicht andere zijn dan die met het eerste siRNA (want de twee siRNAs hebben heel andere sequenties van hetzelfde doelwitten). Als je met de twee siRNAs hetzelfde effect ziet op de cellen, kan je behoorlijk gerust zijn de effecten die je ziet het gevolg zijn van de onderdrukking van het doelwitgen. siRNAs kunnen evenwel ook algemene off-target effecten die relatief onafhankelijk zijn van de sequentie, zoals inductie van een interferon respons of via proteïne kinasen apoptose induceren. Ook het transfectiereagens kan bepaalde effecten op de cel veroorzaken. Om hiermee rekening te houden transfereer je best een apart plaatje cellen met een controle siRNA dat niet tegen een specifiek gen gericht is. Je kan hiervoor een scrambled siRNA gebruiken. Dat s een siRNA dat bestaat uit zelfde nucleotiden als je eigenlijke siRNA dat tegen het doelwitten gericht, maar waarvan de volgorde van de basen door elkaar geschud is (scrambled) en waarvan in de databanken gecontroleerd werd wat het met geen enkel gen specifiek een goed match vertoont. Deze getransfereerde cellen gebruik je als controle waarmee je de effecten van de andere siRNAs (gericht tegen het doelwitten) vergelijkt.

Slide 11-14:Ik heb bij deze slide bij A) 2 vectorsystemen en bij B) 1 vectorsysteem geschreven, maar nu begrijp ik niet meer wat hiermee bedoeld wordt. Kan u deze slide misschien kort nog eens toelichten?Bij A worden twee kleine transcripten gemaakt (sense en antisense), onafhankelijk van elkaar door twee aparte vectoren te gebruiken. De transcripten worden achteraf gemengd en aan elkaar gehybridiseerd. Bij B wordt er maar één transcript gemaakt vanaf één vector. Dit ene transcript bevat beide complementaire sequenties (sense en antisense) verbonden door een lusje.

Slide 11-14:Ik begrijp de kader niet helemaal op slide 14. Ook begrijp ik niet hoe ze siRNAs en shRNAs gaan genereren (slide 16)Bij A worden twee kleine transcripten gemaakt (sense en antisense), onafhankelijk van elkaar door twee aparte vectoren te gebruiken met een T7, T3 of SP6 RNA polymerase. De transcripten worden achteraf gemengd en aan elkaar gehybridiseerd. Bij B wordt er maar één transcript gemaakt vanaf één vector met een T7, T3 of SP6 promotor. Dit ene transcript bevat beide complementaire sequenties (sense en antisense) verbonden door een lusje. We spreken hier van een shRNA (short hairpin RNA). Bij C maak je van zoals bij A twee aparte transcripten (sense and antisense), maar dan veel langere bv 500-700 b). Die transcripten ga je met elkaar laten hybridiseren en daana in stukjes knippen met een RNAse zodat je op die manier een mengsel bekomt van siRNAs. Slide 16 geeft een overzicht van hoe je siRN of shRNA kan aanmaken in de cellen zelf waarin je een bepaald gen wil onderdrukken. Je kan dat doen via een plasmide of gewoon een PCR product of een virale vector. Wat het construct in elk geval moet hebben is een promotor, een siRNA template en een terminator sequentie. Je kan een polymerase III promotor (U6, H1) gebruiken in combinatie met 3 tot 5 T’s als terminator, of een polymerase II promotor zoals de CMV promotor gecombineerd met een SV40 poly(A) signaal als terminator.

Slide 11-18: Wat bedoelt u met "transcriptionele niveau's van shRNA is niet gelijk aan eGFP"? En ik had een tijdje geleden een Word-document doorgestuurd met vragen voor Dries Braecken over hoofdstuk 14. Maar ik heb hier nog steeds geen antwoord op, heeft hij ze misschien niet aangekregen?We gebruiken hier GFP om te zien in welke en welk percentage van de cellen van een celcultuur het

shRNA tot expressie komt. Aangezien het shRNA en het GFP door verschillende promotoren worden aangestuurd, zegt de mate van GFP nog niet echt iets over de mate waarin het shRNA tot expressie komt (wel of het in deciel terecht gekomen is).

Slide 11-18-19:Kunt u mij het verschil uitleggen tussen first generation and second generation shRNA bij hoofdstuk 11 dia 18-19.Oorspronkelijk werden shRNAs ontworpen zoals siRNAs maar dan met een klein lusje (hairpin) (= first generation) en werden vaak gegenereerd via een RNA pol III. Meer recente en verbeterde shRNAs (second generation),zijn ontworpen op basis van onze nieuwe kennis over miRNAs. Ze worden vaak gegenereerd als langere lussen via een RNA pol II waarbij de twee strengen niet helemaal complementair zijn en waarbij ook Drosha betrokken is. Het GFP (om te zien in welke cellen het shRNA tot expressie komt) wordt nu ook vaak achter dezelfde pol II promoter gezet als het shRNA (in tegenstelling tot de vorege shRNA waarbij voor het shRNA een pol III promoter werd gebruikt en voor GFP een pol II promotor) , zodat de GFP expressie een betere maat geeft van de expressie van het shRNA (want worden nu gedreven door dezelfde promotor). Hier wat uitleg uit het oorspronkelijke Nature Gentics artikel (Nature Genetics - 37, 1281 - 1288 (2005). "It was initially assumed that miRNAs were transcribed from the genome as short hairpin RNAs (shRNAs) that were directly processed by Dicer to yield the mature small RNAs that enter RISC. Over the past year, however, a different picture has emerged. Numerous studies have shown that, in animals, miRNAs are transcribed by RNA polymerase II to generate long primary polyadenylated RNAs (pri-miRNAs). Through mechanisms not yet fully understood, the pri-miRNA is recognized and cleaved at a specific site by the nuclear Microprocessor complex. This contains an RNase III family enzyme, Drosha, that cleaves the hairpin to produce a miRNA precursor (pre-miRNA) of 70–90 nucleotides (nt) with a 2-nt 3' overhang. This distinctive structure signals transport of the pre-miRNA to the cytoplasm by a mechanism mediated by Exportin-5. Only then is the pre-miRNA recognized by Dicer and cleaved to produce a mature miRNA. This probably involves recognition of the 2-nt 3' overhang created by Drosha to focus Dicer cleavage at a single site 22 nt from the end of the hairpin. Mature miRNAs are superficially symmetrical, with 2-nt 3' overhangs at each end generated by Drosha and Dicer, respectively. But the individual strands of the mature miRNA enter RISC in an unequal manner. As with small interfering RNAs (siRNAs), the thermodynamic asymmetry of the Dicer product is sensed such that the strand with the less stable 5' (end has a greater propensity to enter RISC and guide substrate selection. This observation of thermodynamic asymmetry in small RNAs led to the development of rules for predicting effective siRNA sequences that have greatly improved the efficiency of those RNAs as genetic tools”.

Slide 11-25:Wat is precies het principe achter random gendisruptie? Om genen random uit te schakelen kan je gebruik maken van retrovirussen die zich random integreren in het genoom waardoor het gen waar het virus in geïntegreerd wordt, verstoord wordt. Je kan dit ook doen met transposons. Voor meer uitleg daarover zie: http://nl.wikipedia.org/wiki/Springend_gen.

lide 11-26:Hoe werkt die homologe recombinatie hier juist? Hoe wordt het gen dat je wil uitschakelen uitgewisseld?Homologe recombinatie is een proces waarbij gelijkaardige stukken van chromosomen uitgewisseld worden tijdens de meiose. Hier wordt dit proces uitgebuit om een gen uit te schakelen. Van het uit te

schakelen gen nemen we twee stukken sequentie van ongeveer 2 kb (gele blokjes in figuur) en zetten daartussen een merkergen bv neomycine, dat ons toelaat achteraf makkelijk cellen te kunnen selecteren waarin het gen gerecombineerd is. Als we dit construct in ES cellen brengen, zullen de gele stukken aligneren met het endogene gen. Door recombinatie wordt het stuk daar tussenin uitgewisseld. Zo komt op het chromosoom ipv het coderende stuk van het gen het neomycinegen te zitten en is het eigenlijk gen op het chromosoom dus onderbroken. Na selectie met een antibioticum zoals G418 zullen alleen de cellen die het neomycinegen hebben overleven (rode cellen in het figuurtje links) en verder uitgroeien. Deze cellen brengen we nu in een blastocyst. Als we de blastocyst inbrengen in een draagmoeder, bekomen we chimere muizen waarin in sommige cellen het gen van interesse onderbroken is door het neomycinegen. We kruisen de chimere muizen en selecteren die het uitgeknockte gen in de germline hebben (in één allel) zodat het recombinante (uitgeknockte gen) wordt doorgeven aan nakomelingen. Als we twee van dergelijke heterozygote muizen kruisen, kunnen we homozygote muizen bekomen waarin beide allelen zijn uitgeknockt.

Slide 11-27:Ik snap niet hoe de conditionele Knock out werkt. Wat doet het Cre proteïne juist? Wat zijn de drie mogelijkheden wanneer je cre recombinase toevoegt? Zijn dit gewoon drie verschillende crossings waarvan enkel diegene juist is waar de loxP sites rond het gen van interesse zitten? Hoe wordt deze combinatie geselecteerd? En wat gebeurd er hierna? Hoe kan je nu kiezen in welk weefsel het gen wordt uitgeschakeld?Om een endogeen gen (gen A in bovenste lijntje van het figuurtje bovenaan in de slide) conditioneel (vaak op een weefsel-specifieke wijze) uit te schakelen plaats je er lox-sites omheen (of omheen een stuk van het gen, bv een belangrijk exon van het gen). De loxsites probeer je zo te plaaten dat ze het gen niet verstoren (zie verder) (bv net rond een exon). Lox-sites zijn herkennings-sites voor het Cre recombinase. Om die lox-site rond het gen te krijgen en hiervoor te kunnen selecteren, werk je met construct waarin twee homologe stukken zitten van het gen dat wil targets (witte delen in het figuurtje) en een selectiemerker (M in de figuur). (In het figuurtje links bovenaan op de slide is het bovenste lijntje het endogene gen, het lijntje daaronder is het construct dat je maakt). De selectiemerker is nodig om de recombinante ES (embryonic stem cells) cellen te selecteren. Het construct heeft ook 3 lox sites (waarvan er twee omheen het endogene gen moeten terecht komen, de middelste lox site is nodig om het merkergen er te kunnen uitknippen om het endogene gen zo minimaal mogelijk te verstoren, want het moet blijven functioneren in alle cellen behalve in de cellen waarin je het wil uitschakelen). Door recombinatie tussen de ‘witte delen’ in de figuur, kan je het oorspronkelijke gen vervangen door het construct met de lox sites en de merker. Na het inbrengen van dit construct in ES cellen, ga je de cellen waarin recombinatie gebeurd is, selecteren dmv het resistentiegen (M). Nu ga je het resistentiegen eruit halen door in de recombinante ES cellen Cre tot expressie te brengen. Omdat er 3 lox sites zijn, zijn er 3 mogelijke eindproducten. Wat je wil is het type I, waar de merker weg is, maar waar het gen van interesse ‘A’ aan beide kanten gefloxed is. Je selecteert deze cellen met de gewenste recombinatie gewoon door enkle celkolonies door te groeen en er PCR op te doen met primer sets die de verschilende types kunnen onderscheiden. Van de ES cellen met het type I recombinante gen maak je nu muizen (door in te brengen in blastocysten). Van deze muizen maak je homozygote nakomelingen. Deze ga je nu kruisen met een andere muizenstam die Cre tot expressie brengt in een specifiek orgaan (bv in de lever doordat je Cre na een lever-specifieke promoter het gezet). Zo wordt allleen in dat orgaan het ‘A’ gen eruit knipt en blijft het gen alle andere organen intact.

Slide 11-26 en 11-27:

Begrijp ik niet goed Deze heb ik al eens uitgelegd in FAQ5. Zie hier nogmaals deze uitleg met wat aanpassingen. Om een gen uit te schakelen (knockout) (Slide 11-26) , maken we een plasmide met daarin van uit te schakelen gen twee stukken sequentie van ongeveer 2 kb (gele blokjes in figuur) en daartussenin een merkergen bv neomycine, dat ons toelaat achteraf makkelijk cellen te kunnen selecteren waarin het gen gerecombineerd is. Als we dit construct in ES cellen (embryonale stamcellen) brengen, zullen de gele stukken aligneren met het endogene gen. Door homologe recombinatie wordt het stuk daar tussenin uitgewisseld. Zo komt op het chromosoom ipv het coderende stuk van het gen het neomycinegen te zitten en is het eigenlijk gen op het chromosoom dus onderbroken. Na selectie met een antibioticum zoals G418 zullen alleen de cellen die het neomycinegen hebben overleven (rode cellen in het figuurtje links) en verder uitgroeien. Deze cellen brengen we nu in een blastocyst. Alswe de blastocyst inbrengen in een draagmoeder, bekomen we chimere muizen waarin in sommige cellen het gen van interesse onderbroken is door het neomycinegen. We kruisen de chimere muizen en selecteren die het uitgeknockte gen in de germline hebben (in één allel) zodat het recombinante (uitgeknockte gen) wordt doorgeven aan nakomelingen. Als we twee van dergelijke heterozygote muizen kruisen, kunnen we homozygote muizen bekomen waarin beide allelen zijn uitgeknockt.Om een gen (gen A in bovenste lijntje van het figuurtje bovenaan in de slide 11-27) conditioneel (vaak op een weefsel-specifieke wijze) uit te schakelen plaats je er lox-sites omheen (of omheen een stuk van het gen, bv een belangrijk exon van het gen). De lox sites probeer je zo te plaaten dat ze het gen niet verstoren (zie verder) (bv net rond een exon). Lox-sites zijn herkennings-sites voor het Cre recombinase. Om die lox-site rond het gen te krijgen en hiervoor te kunnen selecteren, werk je met construct waarin twee homologe stukken zitten van het gen dat wil targets (witte delen in het figuurtje) en een selectiemerker (M in de figuur). (In het figuurtje links bovenaan op de slide is het bovenste lijntje het endogene gen, het lijntje daaronder is het construct dat je maakt). De selectiemerker is nodig om de recombinante ES (embryonic stem cells) cellen te selecteren. Het construct heeft ook 3 lox sites (waarvan er twee omheen het endogene gen moeten terecht komen, de middelste lox site is nodig om het merkergen er te kunnen uitknippen om het endogene gen zo minimaal mogelijk te verstoren, want het moet blijven functioneren in alle cellen behalve in de cellen waarin je het wil uitschakelen). Door recombinatie tussen de ‘witte delen’ in de figuur, kan je het oorspronkelijke gen vervangen door het construct met de lox sites en de merker. Na het inbrengen van dit construct in ES cellen, ga je de cellen waarin recombinatie gebeurd is, selecteren dmv het resistentiegen (M). Nu ga je het resistentiegen eruit halen door in de recombinante ES cellen Cre tot expressie te brengen. Omdat er 3 lox sites zijn, zijn er 3 mogelijke eindproducten. Wat je wil is het type I, waar de merker weg is, maar waar het gen van interesse ‘A’ aan beide kanten gefloxed is. Je selecteert deze cellen met de gewenste recombinatie gewoon door enkle celkolonies door te groeen en er PCR op te doen met primer sets die de verschilende types kunnen onderscheiden. Van de ES cellen met het type I recombinante gen maak je nu muizen (door in te brengen in blastocysten). Van deze muizen maak je homozygote nakomelingen. Deze ga je nu kruisen met een andere muizenstam die Cre tot expressie brengt in een specifiek orgaan (bv in de lever doordat je Cre na een lever-specifieke promoter het gezet). Zo wordt allleen in dat orgaan het ‘A’ gen eruit knipt en blijft het gen alle andere organen intact.

Slide 11-29 :Hier snap ik het eerste principe niet (restrictie digestie). Hoe overlappen de sequenties van de 2 primers? Is dit op hun mutatie plek? Wat gebeurt er precies als je de 2 pcr fragmenten gaat mengen? Je brengt jouw te muteren cDNA in een plasmide via twee restrictie-sites. Je maakt twee complementaire (overlappende) primers met de gewenste mutatie in (middelste primers in het linkse figuurtje). Je voert eerst twee PCR reacties uit. Eén met 1 gemuteerde primer en de linkse primer in de vector en één met de andere primer en de rechtse primer in de vector. Je krijgt nu twee PCR

fragmenten. Het gebied waar je de mutatie aangebracht hebt in beide PCR fragmenten overlapt. Als je deze twee fragmenten nu bij elkaar voegt en denatureert, zal het rechtse einde van de bovenste streng van het linkse fragment hybridiseren met het linkse uiteinde van de onderste streng van het rechtse fragment en vice versa. Zo werken de overlappen stukjes van de enkelstrengige fragmenten als primer voor het polymerase zodat de rest van de strengen van het midden naar de uiteinden toe helemaal afgeschreven worden zodat we één lang DNA fragment krijgen met in het midden de mutatie. Dit amplificeren we verder met het buitenste set primers. We knippen dit fragment nu met restrictive-enzymen en ligeren het in de vector

Slide 11-30:Ik snap de methode voor in vivo targeted mutagenese wel denk ik, maar je bent toch niet zeker dat het DNA repair systeem ook wel degelijk een fout maakt? Is er dan geen controlestap nodig om na te gaan of er wel degelijk een mutatie heeft plaatsgevonden?Of is de kans op een verkeerde reparatie zo groot dat men er gewoon van uit gaat dat er een mutatie is?Het hestelmechanisme zal inderdaad in verschillende getransfereerde cellen een andere mutatie veroorzaken of inderdaad soms leiden tot een perfect herstel. Vandaar dat men meestel na dergelijke transfectie individuele cellen zal uitgroeien tot kolonies en deze kolonies apart zal verder opgroeien en zal onderwerpen aan DNA sequentiebepaling. Daarna werk je verder met de cellijn met de gewenste mutatie.

Slide 11-31:Waarom heb je 2 RNA's nodig? Ik begrijp ook niet hoe ik dit mechanisme moet voorstellen?Het natuurlijk mechanisme in bacteriën werkt met 2 RNA’s: een structureel tracrRNA en een crRNA dat met het tracrRNA complexeert en dat de genspecificiteit bepaalt. In de commerciële systemen om dit mechanisme te gebruiken in bv zoogdiercellen worden de twee RNA gecombineerd in één guideRNA. Het commercieel systeem bestaat dus uit een vector die codeert voor het guideRNA (waarvan je deels de sequentie zelf kiest, complementair aan het gen waarin je wil knippen) en het cas 9 eiwit dat het gen op die positie waar het guideRNA het genomisch DNA bindt gaat knippen. De sequentie-specifieke knip die ontstaat in het genoom zal de cel proberen te herstellen, maar dit herstelmechanisme maakt veel fouten zodat je als het ware een mutatie, kleine deletie of insertie aanbrengt in het gen van interesse. Je kan met dit systeem dus een mutatie aanbrengen in een specifiek gen van het genoom van een levende cel. Dat noemen we genomic editing. Zie http://www.clontech.com/US/Products/Cell_Biology_and_Epigenetics/Genome_Modification/CRISPR_Cas9/CRISPR_Cas9_Overview voor een heel eenvoudige uitleg.

Slide 11-31:Ik kon tijdens de les het principe bij slide 11-31, RGEN, niet zo goed volgen, zou u me dit ook kunnen uitleggen?RNA-guided nucleases zij afgeleid van het bacteriële adaptief immuunsysteem om geïntegreerd virus DNA te elimineren. Het maakt gebruik van Cas9. Dit is een sequentie-specifiek endonuclease dat gestuurd wordt door een RNA molecule dat complementair is aan het the knippen DNA. Het systeem

werkt eigenlijk via 2 RNA moleculen: het crRNA en het tracrRNA. Het crRNA besaat uit twee delen: het 5’ uiteinde telt 2” basen waarvan de eerste 20 complementair zijn aan het the knippen DNA, gevolgd door een willekeurige base (N) en dan twee G's (NGG is het PAM of Protospacer Adaptor Motif, nodig voor het vastleggen van de knipplaats). Het 3’ gedeelte van het cRNA is complementair aan het tracrRNA dat ook met CAS9 complexeert. In de cel zal het crRNA zal binden aan het complementaire DNA en zal cas9 knippen op een welbepaalde afstand van het PAM. Om dit systeem nu te kunnen gebruiken voor ‘gene-editing’ van zoogdiercellen, heeft men plasmiden ontwikkeld die coderen voor cas9 (want is een bacterieel eiwit en zit niet endogeen in zoogdiercellen), gewoonlijk in fusie met GFP, evenals voor een chimere RNA dat het crRNA en het TracrRNA combineert in een molecule. Het deel complementair met het DNA wordt in dit geval guideRNA genoemd. Het is het guideRNA stukje van 23 basen dat je als DNA oligo’s aanmaakt op basis van de sequentie van het DNA dat je wil knippen, en in het plasmide moet steken. Dit plasmide transfecteer je dan in de zoogdiercellen waarin je een specifieke DNA sequentie wil knippen. Je selecteert getransfereerde cellen via FACS op basis van GFP expressie. Het plasmide zal nu coderen voor cas9 en voor het chimere RNA zodat een actief sequentie-specifiek endonuclease bekomen wordt dat het gen van interesse zal knippen.

Slide 11-32:Hoe werkt het mechanisme met een CMV promotor?De CMV promoter is de promoter van het cytomegalovirus. Aan deze promoter binden transcriptiefactoren die in de meeste zoogdiercellen tot expressie komen. Het is een sterke promoter die weinig geregeld wordt. We kunnen deze promoter dus gebruiken in constructen om cDBAs van intersesse constitutief tot overexpressie te brengen in zoogdiercellen.

Slide 11-42:Hoe werkt nucleofectie?Nucleofectie is een vorm van elektroporatie (vaak gecombineerd met chemische transactie) die makkelijker toelaat dat het ingebrachte DNA naar de kern gaar voor stabiele transvestie (is inbouw in het genoom). Zie ook http://en.wikipedia.org/wiki/Nucleofection

Slide12-8: Wat wordt er bedoeld met de holle lichtkegel?Het licht dat langs de stopper gaat zorgt voor een kegelvormige lichtbundel die in het midden hol is (geen of weinig licht in het midden van de kegel omdat dit tegengehouden wordt door de stopper). Het licht van de rand van de lichtkegel gaat onder een grote hoek door het specimen en zorgt zo als het ware voor een belichting van de zijkanten ipv licht recht door het specimen.

Slide 12-9:Is het zo dat er bij het eerste plaatje al een faseverschuiving optreedt maar dat deze te klein is om waar te nemen en dat deze daardoor door tweede plaatje moet om de faseverschuiving te versterken? Is dit zo dat er in het tweede plaatje een soort stof zit die zorgt voor de grotere faseverschuiving?Het eerste plaatje (fasering of condensor annulus) is bedoeld om een ring van licht door te laten. De eerste faseverschuiving gebeurt door het specimen zelf en is afhankelijk van de densiteit en dikte van het specimen. Deze faseverschuiving is echter te gering om te zien. Vandaar dat men de ringvormige lichtbundel door een tweede plaatje (faseplaat) laat gaan waar dens materiaal in zit dat het licht van fase doet verschuiven (gewoonlijk met 90°). Door de lichtbundels (door het specimen en door het faseplaatje) weer samen te brengen krijgen we interferentie van de golven en word de faseverschuiving

door het specimen als het ware versterkt.

Slide 12-9 :De tekst zegt dat bij het faseplaatje licht dat door het specimen is gegaan terecht komt op een ringetje aangebracht op de faseplaat. Maar al het licht dat op het hele faseplaatje terecht komt is toch door de specimen gegaan?Dat staat inderdaad wat verwarrend op de slide. Ik zal deze tekst naar volgend jaar toe aanpsassen. Onthou alvast het volgende; Het eerste plaatje (fase-ring of condensor annulus) is bedoeld om een ring van licht door te laten. De eerste faseverschuiving gebeurt door het specimen zelf en is afhankelijk van de densiteit en dikte van het specimen. Deze faseverschuiving is echter te gering om te zien. Vandaar dat men de ringvormige lichtbundel door een tweede plaatje (faseplaat) laat gaan waar dens materiaal in zit dat het licht van fase doet verschuiven (gewoonlijk met 90°). Door de lichtbundels (door het specimen en door het faseplaatje) weer samen te brengen krijgen we interferentie van de golven en word de faseverschuiving door het specimen als het ware versterkt.

Slide 12-10: Geïnverteerde lichtmicroscoop: Voor celculturen: meer ruimte nodig tussen objectief en preparaatMoet dit niet minder ruimte zijn? Want de oplossing is lamp langs boven en 2 objectief lenzen vanonder zodat je dicht bij cellen kan komen.Het objectief moet altijd dicht bij het preparaat kunnen komen. Doordat cellen in cultuurplaatjes of flessen groeien, kan door het plastieken deksel of de dikte van de fles het objectief niet dicht genoeg bij de cellen. Vandaar dat voor celculturen het systeem wordt omgekeerd met de lamp van boven en het objectief beneden zodat het objecteif toch dicht genoeg bij de cellen komt (slechts gecheiden door de bomen van het plaatje of van de fles).

Slide 12-10:In de les had ik genoteerd dat er Twee prisma’s zouden zijn, maar deze kan ik nietterugvinden in de tekening erbij. Ik heb ook opgeschreven dat er gewerkt wordt met verschillend gepolariseerd licht, maar is dit niet hetzelfde voor de twee stralen?Een Wollaston prisma bestaat eigenlijk uit twee prisma’s die aan elkaar gekleefd zijn (zie blauwe balkjes in de de figuur: deze bestaan uit twee driehoekige prisma’s). In de opstelling zijn er zo twee Wollaston prisma’s. We werken hier met één gepolariseerde lichtbundel. In het eerste Wollaston prisma wordt deze lichtbundel opgesplitst in twee bundels. De ene bundel gaat doorheen het specimen. Afhankelijk van de densiteit en dikte van het specimen geeft dit een faseverschuiving. De andere lichtbundel gaat naast het specimen en ondergaat dus geen faseverschuiving. In de tweede Wollaston prima worden de twee lichtbundels weer samengebracht en ontstaat er interferentie van de golven, afhankelijk van de faseverschuiving doorheen het specimen. Dit resulteert in een beeld met lichtere en donkerdere structuren, afhankelijk van de verschillen in dikte en densiteit in het specimen.

Slide 12-12:In de slide staat er dat er 2 filters worden gebruikt, maar zijn er geen 3? De excitatie filter, de dichromatische filter en de emissie filter? Hoe kan de dichromatische spiegel de juiste stralen reflecteren en andere niet? Is dit op basis van een specifieke golflengte die de spiegel gereflecteerd, gekoppeld aan de golflengte die wordt doorgelaten door de excitatiefilter? Dus de golflengte waarbij

je stof geëxciteerd wordt, deze ook enkel laten reflecteren door je dichromatische spiegel?Er zij twee echte filters: een excitatiefiler en een emissiefilter. Daarnaast is er een dichromatische spiegel, die je inderdaad als een soort filter zou kunnen beschouwen, maar die eigenlijk eerder werkt als een golflengte-specifieke spiegel. Deze spiegel laat inderdaad bepaalde golflengtes door, terwijl hij andere golflengtes reflecteert. In dit geval wordt de excitatie-golflengte gereflecteerd (blauwe lichtbundel op prentje links onderdaan) en wordt de emissie golflengte (groene lichtbundel op datzelfde prentje) doorgelaten.

Slide 12-12: Ik weet niet hoe ik de bijkomende grafiek moet interpreteren?Deze grafiek toont het licht dat doorgelaten wordt (%Transmissie in Y-as) tov de golflente van het licht (X-as) van de verschillende onderdelen van de optische filterblok. De blauwe grafiek geeft weer dat de excitatiefilter (EX) alleen golflengtes doorlaat tussen de 450 en de 500 nm. De groene grafiek toont dat deze golflengtes net niet worden doorgelaten door de Beamsplitter (BS) (of dichromatische spiegel), maar worden weerkaatst. De emissiefilter (EM) (rode grafiek) laat enkel licht door tussen de 500 en de 550 nm). Deze optische filterblok is dus ideaal geschikt voor fluoroforen met excitatie tussen de 450 en 500 nm en emissie tussen de 500 en 550 nm. Afhankelijk van het fluorosfoor moeten we andere filterblokken gebruiken.

Slide 12-14:Wat wordt er bedoeld met het focale veld? Is dit gewoon het deeltje waarin je geïnteresseerd bent? Gewoonlijk is de scherptediepte erg beperkt en krijg je geen scherp beeld doorheen het gehele specimen, maar slechts in een bepaald vlak doorheen het specimen. Het focaal veld is dus het vlak in het specimen waar je op schept stelt en waar je naar wil kijken.

Slide 12-19:Hoe werkt het principe van de interferentiepatronen hier? Wordt dit ook gebruikt bij SIM of enkel bij SMI? Bij SIM wordt licht door een grid (rooster) gestuurd zodat het een fijn strepenpatroon van licht zal geven op het preparaat. Enkel de fluorescente groepen in de lichtstrepen zullen licht geven, de rest niet. Het licht van deze fluoroforen zal met elkaar interfereren afhankelijk van hun plaats tov van elkaar. Nu verandert men het patroon van de lichtstrepen (andere oriëntatie van de strepen) zodat andere fluoroforen zulen licht geven). Men kijkt nu weer naar de interferentiepatronen. Bij SMI gebeurt hetzelfde, maar daar maakt men geen gebruikt van een grid om het strepenpatroon van het licht te genereren; hier maakt men gebruikt van twee lasers waarvan men de golflengtes zodanig list dat de lichtgolven een strepenpatroon vormen door met elkaar te interfereren.

Slide 12-25:Bij TEM staat er dat de acceleratie in vacuum gebeurt. Ik heb hierbij geschreven dat dit een nadeel is, maar ik kan mij niet meer bedenken waarom?Het nadeel van vacuum is dat je het specimen moet dehydrateren, anders gaat het water dat in het preparaat zit beginnen koken en verdampen. Om de structuur van het preparaat toch behoorlijk te bewaren moet je dus heel goed fixeren.

Slide 12.27:

Bij het derde laatste puntje staat er “10 tot 500.000 x vergroot beeld ( = 10 x minder dan SEM). Maar deze slide gaat toch net over SEM? Bedoelt u dan niet TEM?Dat moet inderdaad TEM zijn.

Slide 12-29: Is Gimp niet pixel-based ipv vector-based?Inderdaad. Goed gezien. Dat staat fout op de slide.

Slide 13-6:Waarom wordt hierbij ook BrdU gebruikt? Dit meet toch enkel celproliferatie? Wat doet TdT juist?BrdU kan inderdaad gebruikt worden voor proliferatie als je actief delende cellen hiermee lang genoeg incubeert, zodat het tijdens de DNA synthese ingebouwd wordt. Hier wordt BrdU gebruikt als nucleotide om via het terminaal transferase (Tdt) een staartje van nucleotiden te hangen aan breuken in het DNA die ontstaan zijn in het apoptose-proces. Terminaal transferase zijnwe ook Hfst 4 tegengekomen. Het hangt nucleotiden aan het uiteinde van DNA (vb een A staatje). Hier gebruiken we BrdU omdat we hier een goed antistof tegen hebben en ook fluorescente varianten die toelaten de cellen waarin het BrdU in geïncorporeerd is makkelijk te kunnen visualiseren. Omdat je dit doet met gefixeerde cellen of weefsels is er geen actieve celproliferatie zodat BrdU niet in delende cellen kan worden ingebouwd, en je hiermee niet kan verwarren.

Slide 14-10: Hoe kom je aan de conclusies van de wet van Kirchoff? Ik begrijp de achterliggende reden niet waarom de weerstanden zo groot of zo klein mogelijk moeten zijn.De conclusies vloeien uit de algemene wetten van Kirchoff, maar zijn hier vooral toegespitst op de elektrische schema’s die verder aan bod komen. Deze conclusies zijn een samenvatting van voorgaande slides 8 en 9. Deze zijn basiswetten in elektrische schema’s en zijn aan te nemen, en toe te passen op elektrische circuits. Als de twee belangrijkste conclusies onthouden worden, is het voldoende om de verder uitgelegde schema’s te begrijpen.

Slide 14-18: Waarom moet de weerstand van de versterker ook groot zijn?De inputweerstand van de versterker moet groot zijn omdat er geen stroom mag vloeien in de versterker (hoge weerstand betekent dat stroom moeilijk vloeit). Dit zou de meting verstoren. Dit valt trouwens buiten de scope van de lessen.

Slide 14-18: Wat wordt er bedoeld met de uitleg die achter “pipetcapaciteit” staat?Glas is een insulator en vormt daarom een capaciteit. Dit is de capaciteit van de pipet. Een capaciteit met weerstand in serie is een RC circuit (zie slide 12). Dit beinvloedt de potentiaalmeting. Speciale elektronische circuits worden gebruikt om dit te compenseren (in de versterker), maar dit valt buiten de scope van de lessen.

Slide 14-18: Klopt het dat de lekweerstand zo groot mogelijk moet zijn omdat de lekstroom dan klein is?Inderdaad, als de weerstand groot is gaat stroom moeilijk vloeien door die weerstand.

Slide 14-22: Waarom kan je geen scherpe elektrode gebruiken? En waarom wel een lage-weerstand pipet?Omdat scherpe electrodes een grote weerstand hebben (klein gaatje, grote weerstand); we moeten een lage weerstand hebben om nauwkeurig voltage clamp te kunnen uitvoeren.

Slide 14-25: Wat wordt er bedoeld in puntje 2 en in puntje 3?De weerstand Rleak moet heel hoog zijn, en is typisch ook hoog bij een 'Giga-Ohm seal'. Dit om te voorkomen dat de stroom door langs daar wegvloeit. Dit zou de metingen beïnvloeden door weerstanden die in parallel staan.

Slide 14-25: Waarom speelt Cm geen rol en Cpipet wel?Cm speelt geen rol omdat we op dat moment geen elektrische toegang tot de cel hebben; het stukje membraan in de pipet vormt een barriere. Cpipet gaan we altijd in rekening moeten houden omdat we met een glazen pipet werken met een bepaalde capaciteit.

Slide 14-25: Wat is de patch membraan?De patch membraan is het kleine stukje membraan dat zich in de patch pipet bevindt nadat we de negatieve druk hebben uitgeoefend. Dit stukje membraan wordt dan bij de whole-cell mode gebroken.

Slide 14-27: Rm is de grootste weerstand, dus we kunnen hierover stroom meten. Maar stroom in een serie schakeling is toch overal hetzelfde?De uitleg duidt alleen op het feit dat we de stromen over de celmembraan willen meten, dat is het uiteindelijke doel van de meting. In de cel-attached mode gaat dat niet omdat het stukje membraan dan nog een heel grote weerstand is in het circuit.

Slide 14-27: Rm, Raccess en Rpipet staan in serie, dus dan moet je toch de spanning over de grootste weerstand meten en niet de stroom? En waarom speelt Cm hier wel een rol?Inderdaad, het is een spanningsmeting. Maar de stroom die we moeten compenseren om de spanning te behouden op een bepaalde waarde van Vm geeft een indicatie van de stroom door de ionenkanalen (voltage clamp). Raccess en Rpipet zijn klein, dus kunnen we Rm meten. Cm speelt hier een rol omdat we nu volledige toegang tot de cel hebben (whole-cell).

Slide 14-75: Moeten we de calibratie van de fluorescentie kennen, want dit is niet besproken geweest in de les?

Dit hoeft niet gekend te worden, alleen het feit dat er ratiometrische indicators bestaan om de absolute calciumconcentratie van de cel te bestuderen.