Farmaci Biotecnologici Mariapia Vairetti Dipartimento di Medicina Interna e Terapia Sezione di Farmacologia e Tossicologia Cellulare e Molecolare

Farmaci Biotecnologici

Mariapia Vairetti

Dipartimento di Medicina Interna e TerapiaSezione di Farmacologia e Tossicologia Cellulare e Molecolare

Cosa sono?Cosa sono?

1953: La scopertadel DNA

1973 - Università della California:

nasce la tecnologia del DNA ricombinante!

Tecnica del DNA ricombinanteTecnica del DNA ricombinanteTecnica del DNA ricombinante: inserire un segmento di DNA all'interno di un organismo ospite, permettendo la combinazione di geni provenienti da specie molto distanti tra loro: Inserimento di un gene d’interesse (es. gene umano che codifica per la proteina da produrre come farmaco), in un organismo ospite, fatto poi crescere in un fermentatore industriale per produrre la proteina

Cos’è un“farmaco biotecnologico”?Cos’è un“farmaco biotecnologico”?

Farmaco progettato mediante la tecnologia

del DNA ricombinante.Farmaco di sintesi per cui sono usate

pratiche biotech nella fase di progettazione

o di valutazione

Farmaci biotecnologici• Il primo farmaco ottenuto

ingegnerizzando un sistema vivente (batterico) è stato l'insulina, approvato dalla FDA nel 1982.

• Anche l'ormone della crescita umano, precedentemente estratto dai cadaveri, fu rapidamente ingegnerizzato.

• Nel 1986 la FDA approvò il primo vaccino umano, contro l'epatite B.

La struttura dell'Insulinarosso:carbonio, verde:ossigeno; blu:azoto; rosa:zolfo

La produzione industriale di farmaci utilizzando i sistemi viventi come bioreattori si è da allora largamente diffusa, diventando attualmente la via preferita di sintesi di numerosi farmaci, in particolare per il costo di produzione relativamente basso.

http://it.wikipedia.org/wiki/Immagine:Insulin.jpg

Interferone beta: peso molecolare 19.000

Aspirina:

Peso molecolare 180

Chimici Biotecnologici

I medicinali biotecnologici sono più grandi e complessi di quelli chimici

Produzione• Costi di produzioneCosti di produzione

Costo di uno stabilimento di produzione per biofarmaceutici è maggiore di uno stabilimento tradizionale (da 200 a 400 milioni $)Pochi siti produttivi vs i molti dei prodotti tradizionali

• Metodi di produzioneMetodi di produzioneEventuale interferenza con la conformazione finale della molecola.

• Diverso profilo di sicurezza: anche piccole variazioni nei processi produttivi possono influenzare la sicurezza e l’efficacia del farmaco

Farmaco-tossicologia Biotech

Problemi negli studi di assorbimento, distribuzione, metabolismo, eliminazione

Specie animali con sensitività simile agli umani

Reazioni Immunologiche negli animali

Clinica – Prodotti classici• Fase I - Studi iniziali effettuati su volontari sani per determinare il

metabolismo e le azioni farmacologiche del farmaco sull'uomo, la sicurezza e gli effetti collaterali a diversi dosaggi. Questi studi possono essere compiuti anche su pazienti per ottenere informazioni molto preliminari sulla possibile efficacia della terapia (Fase I-II). Il numero di soggetti studiati non supera gli 80.

• Fase II - Studi su pazienti per esplorare l'efficacia del farmaco spesso attraverso il confronto fra un gruppo di pazienti che riceve il trattamento ed un gruppo di controllo che riceve placebo. Anche in questi studi si valutano la sicurezza e gli effetti collaterali. Il numero di soggetti studiati non supera i 300.

• Fase III - Studi su pazienti per una valutazione definitiva del rapporto rischi/benefici ai fini della registrazione del composto come farmaco. Il numero di soggetti studiati non supera i 3000.

Clinica- Biotecnologici

Esperimenti sugli animali meno predittiviDose-risposta specifica: non lineare, a

campana,Studi di dose escalation più approfonditiReazioni immunologiche

es: TNG 1412

Biotech: il mercato globale

63 Miliardi $ (2005)Vendite raddoppiate dal 2000 al 2004

Al momento più di 190 farmaci biotecnologici sonosul mercato (20% del totale) e sono stati assunti da

325 milioni di pazienti

Circa il 40% delle molecole in sperimentazioneclinica sono derivanti dalle biotecnologie

Rischi e benefici dei farmaci biotecnologici

• Le tecniche di ingegneria genetica non sono prive di rischi e pertanto devono essere utilizzate con cautela.

• Per evitare che dai risultati di queste manipolazioni si producano effetti indesiderati o imprevisti, gli esperimenti sul DNA ricombinante sono sottoposti a regole e a controlli molto severi.

• L’importanza assunta dai farmaci biotecnologici è comunque ormai dimostrata dal fatto che a livello mondiale questi prodotti rappresentano circa il 20% di tutti i nuovi farmaci convenzionali approvati ogni anno.

Rischi e benefici dei farmaci biotecnologici.

•Considerando che nel 2001 più di 200 proteine ricombinanti risultavano in fase di sperimentazione clinica nell’uomo è prevedibile che nei prossimi anni i nuovi farmaci biotecnologici continueranno a rappresentare una percentuale significativa di tutti i nuovi farmaci che saranno immessi nel mercato.

•Pertanto la portata di questa metodica è enorme.

•La possibilità di copiare con la massima precisione sostanze prodotte fisiologicamente allarga enormemente la possibilità di intervento del medico. Se da una parte l'impiego del Dna ricombinante consente di creare nuovi farmaci, dall'altra può ottimizzare i farmaci già noti, ad esempio rendendo più facile la loro assunzione.

Sul Journal of Natural Products dove è stato pubblicato questo studio si legge: "l'avvento di nuove tecniche di chimica combinatoria negli anni '90 ha spinto molte industrie farmaceutiche a cambiare metodo di ricerca". Quindi i chimici hanno cercato la loro ispirazione per produrre nuovi farmaci nei loro computer. Il risultato di ciò, spiega Newman, è che ci sono sempre meno farmaci innovativi. Nel 2004 hanno concluso tutti i test e sono giunti in commercio solo 25 nuovi farmaci.

David Newman, direttore del dipartimento Prodotti naturali del National Cancer Institute americano. Dal 1981 ad oggi il 73% di tutti i nuovi farmaci messi in commercio nascono direttamente o indirettamente (tramite ottimizzazioni in laboratorio) da vegetali, animali e invertebrati marini. E questo nonostante i sempre maggiori investimenti in campi come le biotecnologie.

Svantaggi delle biotecnologie

Ricerche in Biotecnologia

La maggior parte delle ricerche sono volte alla produzione di proteine o peptidi per scopi terapeutici:

Ormoni polipetidici

Prodotti del sangue (coagulanti e trombolitici)

Farmaci antinfettivi e antitumorali

Immunomodulatori e vaccini

Prodotti Terapeutici

La maggior parte di farmaci proteici era disponibile in quantità limitate

Prodotti ottenuti per estrazione dal sangue o tessuti e organi dell’uomo o di animali con rischio di trasmissione di malattie infettive

Insulina umana

il primo prodotto

“ricombinante” autorizzato

per uso terapeutico

INSULINA

L’insulina è prodotta dalle cellule delle isole pancreatiche sotto forma di un precursore di 110 aminoacidi detto preproinsulina

La conversione della proinsulina in insulina avviene nel complesso di Golgi ad opera di endopeptidasi.

Effetti immediati e ritardati dell’insulina

1. Favorisce l’entrata di glucosio nelle cellule

2. Nel fegato:

- favorisce la sintesi di glicogeno (utilizzo del glucosio)

- inibisce la glicogenolisi (deg. glicogeno)

- inibisce la gluconeogenesi

3. Nei muscoli:

- promuove la sintesi proteica e inibisce il catabolismo proteico

- promuove la sintesi di glicogeno

4. Nel tessuto adiposo:

- aumenta la sintesi di acidi grassi e trigliceridi, riduce la lipolisi inattivando le lipasi

Meccanismo d’azione dell’Insulina

In seguito al legame con l’insulina il recettore viene subito internelizzato, in seguito ad internelizzazione il recettore può essere degradato o riciclato per tornare sulla superficie della cellula.

Il legame dell’insulina al recettore porta ad una rapida autofosforilazione dei residui di tirosina, questo catalizza la fosforilazione di altri substrati enzimatici.

L’insulina può anche controllare la sintesi di secondi messaggeri, tramite l’attivazione della fosfolipasi C che possono mediare l’azione di enzimi cellulari.

Profilo fisiologico dell’insulina

Produzione: 0,6 U/kg/24h

- produzione basale continua, indipendente dai pasti

- secrezione episodica e rapida, in corrispondenza dei pasti

Ore della giornata

Glu

cosi

o pl

asm

atic

o m

mol

/l

Soggetto normale

Soggetto diabetico

Pasti

0

5

10

15

20

0900 1200 1500 1800 2100 2400 0300 0600

Deficit di insulina: Diabete Mellito

eccesso extracellulare

deficit intracellulareglucosio

fame in mezzo all’abbondanza

Si tratta della principale patologia che interessa il pancreas endocrino. Causa alterazioni del metabolismo ed iperglicemia

entrata di glucosio nelle cellule

di glucosio in circolo: gluconeogenesi epatica

Diabete Mellito

DIABETE DI TIPO Io INSULINO-DIPENDENTE

• Compare soprattutto nei giovani

• Insulina virtualmente assente• Causa chetosi • Sembra avere cause

autoimmuni• Si tratta con insulina esogena

DIABETE DI TIPO IIo INSULINO-INDIPENDENTE

• Compare soprattutto negli adulti obesi

• Carenza recettori insulina• Non causa chetosi• Sembra avere cause ereditarie• Può essere tenuto sotto

controllo con una dieta adeguata ed esercizio fisico

• Si tratta con antidiabetici orali (sulfaniluree)

Analoghi dell’insulina

Sono prodotti in cui la sequenza aminoacidica propria dell’insulina umana viene modificata ad arte con delle sostituzioni di uno o più

aminoacidi.

1996

Insulina Lispro

Azione rapida (< 30 minuti)

Durata breve (3 ore)


Insulina Lispro

Tempo (minuti)

Insulina Lispro

Insulina Umana Normale

Con

cent

razi

one

di in

sulin

a lib

era

nel s

angu

e (µ

g/L)

0 240 4800.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

• Somministrazione al momento del pasto (IR: 30 minuti prima) • Somministrazione dopo il pasto nei bambini molto piccoli • Minor accumulo sottocutaneo: minor rotazione delle sedi d’iniezione

Poiché l’azione termina dopo circa 4 ore è necessario associarla ad un’insulina a lunga durata, per il mantenimento dei livelli basali


Insulina Aspart

Azione rapida ( 60 minuti)

Durata breve (3 ore)

Carica -

• Concentrazione plasmatica doppia in metà tempo rispetto a IR

• Necessario associare un’insulina ad azione ritardata per il controllo della glicemia notturna


Insulina Aspart

3.0

4.0

Tempo (minuti)

Insulina Aspart

Insulina Umana Normale

Con

cent

razi

one

di in

sulin

a lib

era

nel s

angu

e (µ

g/L)

0 240 4800.0

2.0

1.0

Asp


Insulina Glargina

Cariche +

Lunga durata d’azione ( 24 ore)

Tempo di inizio ( 1.5 ore)


Insulina Glargina

• Assenza del picco d’azione• Simula il profilo di secrezione continua di insulina dei soggetti non diabetici • Somministrazione 1 sola volta al giorno

Poiché formulata in soluzioni a pH acido non la si può somministrare insieme ad altra insuline (pH neutro)

Tempo (ore) dopo l’iniezione sottocute

Util

izza

zion

e de

l G

luco

sio

(mg/

kg ·

min

)

0 20 30

0

2

4

10

Insulina Glargina

Insulina

24

Termine dell’osservazione

Altre categorie di farmaci prodotti mediante la tecnologia del DNA ricombinante

Ormoni Polipeptidici

Eritropoietina: regola la produzione di globuli rossi da parte del midollo osseo Epocim®

Peptidi o piccole proteine che svolgono funzioni essenziali nel controllo del

metabolismo nei mammiferi.

Alcuni sono farmaci salvavita

Ormone della crescita: Humatrope®


Proteine del sangue

Fattore VIII: Recombinate®

Proteine o fattori coinvolti nei processi della coagulazione del sangue (fattori VII, VIII, IX) sia nei processi che

degradano i coaguli (TPA)

Si sono eliminati i rischi associati alla potenziale contaminazione da parte di agenti virali (HIV, HBV, HCV)

TPA: Activase®


Immunomodulatori e Antitumorali

Interferone : usato nel trattamento della SM, agisce sui linfociti T inibendone la migrazione e riduce la produzione di citochine. Avonex®, Betaferon®, Rebif®

I più noti sono gli interferoni che a seconda del tipo possono

esplicare attività antivirale ( e ), immunomodulatrice () o

antitumorale ().

Interferone : usato nel trattamento di cancro al rene,

melanoma, alcune forme di linfoma e leucemie. IntronA®, Infergen®,

Alfaferone®, Roferon-A®

Interferone : usato per ridurre l’incidenza di infezioni in pazienti con ridotte difese

immunitarie. Imukin®


Immunomodulatori e Antitumorali

Antagonisti del TNF: usati nel trattamento dell’artrite reumatoide e psoriasica. Enbrel®, Remicade®,

Altre molecole che trovano applicazione nella terapia antitumorale sono le

interleuchine (IL-2), antagonisti del TNF

IL-2: usata nel trattamento di alcune forme tumorali come il cancro al rene e alcuni

melanomi. Proleukin®

I risultati dei farmaci biotecnologici: anticorpi nella antitumorale

Circa il 30% delle pazienti con tumore mammario, produce un'elevata quantità di una proteina, chiamata HER2, fondamentale per la crescita del tumore. Contro l'HER2 è stato messo a punto un farmaco, il trastuzumab, anticorpo monoclonale impiegato con successo negli anni passati per trattare il tumore mammario metastatico. Scarsi gli effetti collaterali con l'eccezione di un certo grado di cardiotossicità in meno del 4-5% delle pazienti trattate.

L'anticorpo monoclonale è stato utilizzato associato alla chemioterapia, nei tumori del seno in fase iniziale, subito dopo il trattamento chirurgico. Il trastuzumab ha ridotto il rischio di ricaduta del 50%. La sopravvivenza libera da malattia a 4 anni nelle pazienti trattate con sola chemioterapia è stata del 67%, mentre in quelle trattate con chemioterapia più trastuzumab è stata dell' 85%.

Vaccini Vaccini

I vaccini “classici”:

- microrganismi uccisi (trattamento fisico o chimico)- microrganismi vivi attenuati- tossoide- coniugati secondo i principi di Jenner e Pasteur

1995: sequenziato il genoma del primo patogeno (H. influenzae)

Mediante la tecnica del DNA ricombinante sono stati prodotti diversi vaccini la maggior parte dei quali è stata allestita clonando in una cellula procariota o eucariota il gene del microrganismo che codifica per la principale proteina immunogena, cioè quella proteina che nell’ospite porta alla produzione di anticorpi in grande quantità.

Vaccini Ricombinanti

Vaccini a sub-unità

Vaccini virali: una proteina del capside o della membrana esterna (envelope)

Vaccini batterici: proteine di adesione (antigeni delle fimbrie) o specifiche tossine modificate (anatossine)

Vaccino contro l’Epatite B: 1° Vaccino Ricombinante Autorizzato

• Epatite B rappresenta un grosso problema sanitario: il virus responsabile (HBV), oltre che a causare la cirrosi epatica è anche un agente cancerogeno (cancro al fegato).

• Ad oggi il numero dei portatori cronici è stimati sui 300 milioni e possono trasmettere il virus a coloro che vengano in contatto con sangue infetto, liquido seminale, secrezioni vaginali, saliva, sudore o lacrime perpetuando così il mantenimento dell’infezione.


• Virus a DNA con envelope

• Il virione contiene due antigeni associati al guscio proteico interno (core): Hbc e Hbe e un antigene di superficie (sull’envelope) HBsAg (Hepatitis B surface Antigen)

HBsAg rappresenta quindi la molecola di scelta per allestire il

vaccino.


• Il gene virale che codifica per HBsAg è stato clonato in un vettore e quindi trasferito ed espresso in un lievito S. Cerevisiae

• L’antigene prodotto dal lievito presenta tutte le caratteristiche della proteina HBsAg nativa (glicosilazione e altre modifiche post-traduzionali)

• Antigene viene purificato per ultracentrifugazione, cromatografia e precipitazioni frazionate (purezza > 98%) viene adsorbito su Al(OH)3 che funziona da

adiuvante

Engerix-B®

Vaccino contro la Meningite Batterica

• Il maggior responsabile di questa patologia è il batterio Haemophilus Influenzae di tipo b (Hib).

• Prima della diffusione del vaccino la Meningite Batterica colpiva negli Stati Uniti 1 bambino su 200

• 1/4 dei bambini che sopravvivevano all’infezione presentavano lesioni cerebrali o perdita dell’udito

Oggi, grazie al vaccino ricombinante la meningite da Hib è una rarità: l’incidenza di infezione si è ridotta del 90% ed in alcuni

paesi è addirittura scomparsa

Hiberix®

Produzione di tossine batteriche modificate, da parte dello stesso ceppo patogeno, dopo

mutazione genetica

• Mediante la tecnica del DNA ricombinante è

stato ottenuto un ceppo di Bordetella

Pertussis capace di produrre una tossina

della pertosse del tutto identica,

antigenicamente, a quella del ceppo

patogeno, ma assolutamente priva di

tossicità.

• La tossina mutata, prodotta in laboratorio su

larga scala, viene purificata e impiegata

come vaccino

Vaccino Antipertosse

Vaccini vivi ricombinanti

Batteri o virus modificati

geneticamente in modo da poter

essere impiegati come vaccini

vivi ricombinanti


• Nuovi vaccini: si sono incorporati i geni di alcuni virus (Epatite B, H. Simplex, Influenza Virus) nel genoma del Vaccinia Virus

• Nel coniglio, esperimenti preliminari di vaccinazione hanno dimostrato che si ottiene protezione valida verso questi virus

• La scelta di questo virus “vettore” sta nella sua resistenza: un vaccino così allestito non deve essere refrigerato e può venire liofilizzato e somministrato mediante scarificazione cutanea

Microrganismi eterologhi naturalmente non patogeni o resi tali

• Alcuni proxivirus e batteri del genere Salmonella ed Escherichia

• Dopo ingegnerizzazione fungono da vettori di geni esogeni, esprimono cioè le proteine immunogene dell’agente patogeno verso cui si vuole proteggere l’individuo


• In questi microrganismi sono stati modificati o deleti i geni che ne condizionano la virulenza

• Il microrganismo potrà moltiplicarsi nel soggetto vaccinato, stimolando attivamente la risposta immunitaria specifica senza però causare la malattia

• Virus Erpetico allo studio quale vaccino dopo delezione del gene TK che causa la virulenza

• Batterio Vibrio Cholerae allo studio quale vaccino dopo averlo privato della capacità di produrre l’enterotossina attiva, ma ancora in grado di indurre immunità

Ceppi di microrganismi patogeni omologhi

Dove è concentrata la ricerca biotech nel mondo

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Onco Infett neuro CVS respi Aids Immuno

Source: PLG Italy – Convegno Novara 12-12-06 – Intervento G. Corsico - modificata

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