XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

2

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.

25aniversario

SEFIG

Universidad

MiguelHernándezde

Elche

HotelMeliá

Alicante

68

febrero2013

Librode

AbstractsdelXICongresode

laSEFIG,

68

febrero2013,Alicante,España

ISBN10:84

6956868

XISBN

13:97884

6956868

2

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

3

Presentación

Enrepresentación

delComité

Organizador

quierodaros

labienvenida

aAlicante

eneste

añode

celebracionespara

todosnosotros.Por

unaparte

secelebra

el25aniversario

dela

SEFIGy

porotro

los15

añosde

nuestrajoven

Universidad.

Estasfechas

señaladasson,

habitualmente,

motivo

dealegría

ytam

biénoportunidades

parala

reflexión,la

revisió nde

loya

hechoy

laplanificación

delas

nuevasm

etasy

retospor

delante.Conesa

filosofíay

contoda

nuestrailusión

elcom

itéorganizador

ycientífico

haelaborado

unprogram

aque

quierereflejar

elestado

más

actualde

lainvestigación

enFarm

aciay

ademásofrecerespacio

paraeldebate

yla

expresiónde

opinionesy

pro puestas.Enuna

etapaen

quela

profesiónFarm

acéuticase

cuestionadesde

tantosámbitosquisiéram

osqueeste

congresosirviera

paradejarconstancia

denuestras

capacidadesy

nuestracontribución

esencialen

elm

undodel

medicam

entoy

lasalud

engeneral.

Sigamos

mirando

altopara

poderdecir

como

elpoetaoriolano

“Altosoy

dem

iraralaspalm

eras”.

Querem

osagradecer

alos

ponentessu

contribucióna

laexcelencia

científicadelcongreso

ya

lasentidades

colaboradoraspor

suapoyo.

Como

PresidentadelCom

itéO

rganizadortengo

queexpresar

mireconocim

ientoy

gratituda

mis

compañeros

porsu

esfuerzopara

queelprogram

a,los

actossociales,la

organizaciónlogística

yelm

aterialparalos

congresistassean

dela

mayor

calidadposible.Deseam

osque

vuestraparticipación

seainolvidable

anivelcientífico

ypersonaly

queAlicante,com

osede

yelÁrea

deFarm

aciay

TecnologíaFarm

acéuticade

laU

niversidadM

iguelHernández,como

anfitriona,hayan

alcanzadovuestrasexpectativasen

este25

aniversario.

MªdelValBerm

ejoSanz

PresidentadelCom

itéO

rganizador

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

4

Comité

deHonor

Excm

a. Sra. Dña Sonia C

astedo Ram

os

Alcaldesa de A

licante

Sr. D. Jesús T. Pastor C

iurana

Rector M

agnífico de la Universidad M

iguel Hernández de E

lche

Sr. D Jorge M

anzanares Robles

Decano de la Facultad de Farm

acia de la Universidad M

iguel Hernández de E

lche

Sra. Dña. M

ª del Carm

en Peña López

Presidente del Consejo G

eneral de Colegios O

ficiales de Farmacéuticos

Sr. D. Jaim

e J. Carbonell M

artínez

Presidente del Colegio O

ficial de Farmacéuticos de la Provincia de A

licante

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

5

Comité

Organizador

Presidenta: Mª del V

al Berm

ejo Sanz

Secretaria: Isabel González Á

lvarez

Tesorera: Marta G

onzález Álvarez

Vocales

Víctor M

angas Sanjuán

Elsa Lopez P

intor

Veronica V

ivancos Góm

ez

Mª Teresa M

artínez Martínez

Sarín C

olon Useche

Isabel Lozoya Agulló

Ignacio González G

arcía

Pedro G

arcía Salom

Juan Laborda Álvarez

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

6

Comité

CientíficoPresidenta:

Isabel González Á

lvarez, UN

IVER

SID

AD

MIG

UEL H

ERN

ÁN

DEZ

Vocales:

Mª R

OS

AR

IO A

BE

RTU

RA

S R

AM

OS

JO

AQ

UIM

ALM

ELA

NA

VA

RR

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Mª JO

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ª JES

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LICIA

RO

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IGU

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N

UN

IVE

RS

IDA

D D

E A

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LA

FAR

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CO

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U

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X EL S

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IO

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RS

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TIAG

O D

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OM

PO

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LAU

NIV

ER

SID

AD

DE

L PA

IS V

AS

CO

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

7

Programa

6febrero

2013

8:309:30

Entregadocum

entación

9:3010:20

SesiónInauguraldelIX

Congreso

10:3014:00

Primera

SesiónM

oderadoras:IsabelGonzálezAlvarezy

MarivalBerm

ejo

10:3011:20

ConferenciaPlenaria.

Academia

andIndustry

Consortium:

CollaborativeResearch

onDrug

Development.Prof.

ShinjiYamashita.Setsunan

University,Japan.

11:3012:00

PausaCafé:Prim

eraSesión

dePosters

12:0012:50

ConferenciaPlenaria.

TheScience

PolicyDynam

icInsuring

Pharmaceutical

ProductQ

ualityand

Interchangeability:BCS

Discovery,Developm

ent,Regulation.

Prof.Gordon

Amidon.U

niversityofM

ichigan,USA.

13:0013:50

ConferenciaPlenaria.

Intestinalperm

eabilityconsiderations

when

formulating

lowsolubility

drugs.Prof.

ArikDahan.

BenGurion

University

ofthe

Negev,

Israel.

14:0015:50

Almuerzo

16:0017:50

SegundaSesión:

Mesa

RedondaPatrocinada

porSPLC

CRS:"Drug

DeliverySystem

s:Frombench

toClinic".

Moderadora:Prof.Ruth

Duncan

Ponentes:Prof.Ruth

Duncan.CardiffUniversity

(Prof.Emerita).Introduction.

DraM

aríaJosé

Vicent.Centrode

InvestigaciónPríncipe

Felipe.O

ralDelivery.

ProfMaria

J.Alonso.Universidad

Santiagode

Compostela.N

ovelPolymers.

Dra.M

ercedesPozuelo,

Bioncotech,BO

110,a

newconcept

ofanticancer

therapy

ProfAtilaHincal.Presidente

TUFTAD.U

niversityofHacettepe

(Prof.Emeritus).

Challengesforpharmaceuticalform

ulationscientistson

thenano

sizeddrug

deliverysystem

s

18:0018:30

EntregaPrem

ioInvestigación

SEFIG18:30

20:30ASAM

BLEAGEN

ERALSEFIG

21:0022:30

RecepciónVino

Bienvenida

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

8

7febrero

201309:00

11:00Tercera

SesiónM

oderadoras:RosaHernándezy

VirginiaM

erino

9:009:50

ConferenciaPlenaria.

Lananotecnología

farmacéutica:

¿creamos,

copiamos

oinnovam

os?Prof.

Mª

JoseAlonso

Fernández.U

niversidadSantiago

deCom

postela

10:0010:50

ConferenciaPlenaria.

Polymer

Therapeuticsas

Nanom

edicines:N

owand

Future.Prof.Ruth

Duncan.CardiffUniversity,U

nitedKingdom

.

11:0014:00

CuartaSesión

Moderadores:Antonio

Rabascoy

Marta

GonzálezAlvarez

11:0011:35

Comunicacionesorales:Tecnología

Farmacéutica.I

Nueva

generaciónde

nanopartículaselaboradasa

basede

ésteresdesorbitán

(Span®80):potencialaplicación

enterapia

génica.APensado,GK

Zorzi,ESCarvalho,A

Sánchez,BSeijo.

Theeffectivenessofedelfosine

lipidnanoparticlesin

enhancingthe

drugcytotoxicity

inbreastcancercells.A

AznarGómez,B

LasaSaracíbar,A

EstellaHerm

osode

Mendoza,M

JBlancoPrieto.

Invivo

administration

ofVEGFreleasing

biodegradablenanospheresin

am

ousem

odel(APP/Ps1)ofAlzheimer’sdisease.E

Herrán,RPerez

Gonzalez,M

Igartua,JLPedraz,E

Carro,RMHernández.

11:3512:00

PausaCafé:Segunda

Sesiónde

Posters.

12:0012:50

ConferenciaPlenaria.

Novedades

enBioequivalencia.

Dr.Alfredo

GarciaArieta.Agencia

Españolade

Medicam

entosyProductosSanitarios.

13:0014:00h

Comunicacionesorales:Tecnología

Farmacéutica.II

Optim

izaciónde

laactividad

dedoxorrubicina

encáncer de

mam

am

edianteuna

nanoplataforma

polimérica

biodegradable.JL.Arias,CM

elguizo ,JPrados,R

Ortiz,L

Cabeza,MA

Ruiz,RLuque,B

Gónzalez,VGallardo,A

Aránega.

Sistemassupram

olecularesdepoloxam

inaciclodextrina

simvastatina

como

promotoresde

diferenciaciónde

célulasmadre

aosteoblastos.SM

NSim

ões,FVeiga,JJTorres

Labandeira,ACFRibeiro,A

Concheiro,CAlvarez

Lorenzo.

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

9

Nanopartículasdepolicaprolactona

como

sistema

deliberación

controladade

fármacospara

aplicacióntópica.A

Melero,A

Ourique,A

Pohlmann,S

Guterres,RBeck,U

FSchaeffer.

Acquiringknow

ledgeon

antibacterialeffectofbioactiveglassby

neurofuzzylogic.M

M.Echezarreta,M

Landin.

Longterm

controlledbrain

deliveryofm

icroencapsulatedGDN

Finduces

functionalandstructuralrecovery

ofthedopam

inergicnigrostriatalpathw

ayin

parkinsonianm

onkeys.EGarbayo,E

Ansorena,HLana,JL

Lanciego,MJ

BlancoPrieto.

14:0015:50

Almuerzo

16:0018:00

Quinta

SesiónM

oderadores:IñakiFernándezdeTrocónizy

VicenteG.Casabó

16:0016:50

ConferenciaPlenaria.Terapia

Personalizadaen

laInfección

porelVIH:

Aplicaciónde

CriteriosFarmacocinéticosy

Farmacogenéticos.Prof.

Mª

JoseGarcía

Sánchez.U

niversidadde

Salamanca.

17:0017:50

Comunicacionesorales:Biofarm

aciay

Farmacocinética.

Estudiosfarmacológicoscon

Dpencilam

ina:correlaciónde

niveles plasmáticos

ycerebralesvs.eficacia

clínica.AO

rrico,LM

artíPrats,MJCano

Cebrián,LGranero,A

Polachey

TZornoza.

Modelosbasadosen

reglasyQ

SPRpara

lapredicción

dela

permeabilidad

enCaco

2.MA

CabreraPérez,H

PhamThe,M

Bermejo,IGonzález

ÁlvarezyT

Garrigues.

Análisisdeun

modelo

detrescom

partimentospara

elestudiodeltrasporte

ym

etabolizaciónde

fármacosen

monocapasde

célulasCaco2.

M.Llabrés.

Developmentofa

PBPKm

odelfortheanticancerdrug

vivia009and

itsmain

metabolite

administered

asanew

deliverysystem

inrats.M

.Matoses

Osborne,C

Tudela,MJGarrido,TA

Bennet,JBallesteros,LCaveda,IF

Trocóniz.

Modificación

delmodelo

nolinealpara

elcálculode

laperm

eabilidaden

monocapascelulares.V

Mangas

Sanjuan,IGonzalezAlvarez,VG

Casabó,MBerm

ejo.

18:0018:20

PausaCafé:Tercera

SesiónPóster

18:3020:00

ActoCelebración

25aniversario

SEFIG.

21:30h

–Cena

deGala

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

10

8febrero

2013

09:0014:30

CuartaSesión

9:0011:30

Mesa

Redonda.Título:

Farmacia

Clínica,Atención

Farmacéutica,

Farmacia

Asistencialy....

Moderador:

Prof.EduardoL.M

ariñoHernández.Catedrático

deFarm

aciaGalénica

DirectorUnidad

deFarm

aciaClínica

yFarm

acoterapia.Universidad

deBarcelona.

Ponentes:Prof.Ana

María

SantoveñaEstévez.Vicedecana

dela

Facultadde

Farmacia.

Universidad

deLa

Laguna

Prof.Cecilia

FernándezLastra.

Catedráticade

Farmacia

Clínicay

Farmacoterapia.Coordinadora

deFarm

aciaAsistencial.

Universidad

deBarcelona

Prof.M

ariaLuisa

GonzálezRodríguez.

Directoradel

Departamento

deFarm

aciay

TecnologíaFarm

acéutica.Universidad

deSevilla

Prof.Diego

Marro

Ramón.

Director,M

ásterU

niversitarioen

AtenciónFarm

acéuticay

Farmacoterapia.U

niversidadde

SanJorge

11:3012:00

PausaCafé:Cuarta

SesiónPóster

12:0013:00

Comunicaciones

orales:Docencia,Atención

Farmacéutica

yFarm

aciaClínicaM

oderadores:EduardoM

ariñoy

AliciaRodriguez

RiesgoCardiovascularde

losAntiinflamatoriosN

oEsteroideosy

surepercusión

enelm

anejodelpaciente

condolore

inflamación.E

Lopez

LaDerm

ofarmacia

enla

formación

delFarm

acéuticoen

laUniversidad

deSevilla.M

JLucero.

Primera

valoracióndel41st

ESCPSym

posiumon

ClinicalPharmacy.Barcelona

2012.ELM

ariño,PM

odamio,C

FernándezLastra.

13:0014:30

Mesa

Redonda:Reflexión

sobreel

procesode

implantación

delos

nuevosGradosenFarm

acia:repercusiónen

lasenseñanzasdelÁreade

Farmacia

yTecnología

Farmacéutica

Moderadora

Prof.AliciaRodriguez.Universidad

delPaísvasco

Ponentes:Prof.

AliciaRodríguez.

Universidad

delPaís

Vasco.Estado

actualde

laim

plantacióndelGrado

enFarm

acia

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

11

Prof.JoséB

Fariña.Universidad

dela

Laguna.Efectode

laim

plantacióndel

gradoen

Farmacia

enlos

objetivosform

ativosde

laTecnología

Farmacéutica:

¿Qué

hayde

nuevo?

Prof.TeresaGarrigues.U

niversidadde

Valencia.Retosyoportunidadespara

lam

ovilidaden

elGradoen

Farmacia

14:30Clausura

del Congreso

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

12

ConferenciasPlenarias

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

13

TheScience

PolicyDynam

icInsuring

PharmaceuticalProductQ

ualityand

Interchangeability:BCSDiscovery,Developm

ent,RegulationGordon

L.Amidon

CharlesR.Walgreen,Jr.ProfessorofPharm

acyAnd

PharmaceuticalSciences

CollegeofPharm

acyThe

University

ofMichigan

AnnArbor,M

ichigan48109

1065

Ithasbeenover10

yearssincethe

FDApublished

theBiopharm

aceuticsClassificationSystem

(BCS)guidance(http://w

ww

.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInform

ation/Guidances/default.htm)

Thisguidance

describeshow

drugperm

eabilityand

solubilityand

productdissolutioncan

beused

toclassify

drugsand

drugproducts

anddeterm

inein

vitrobioequivalence

(BE)standards

fororal

drugproducts.

Thisguidance

was

basedon

FDAand

Swedish

MPA

supportedresearch

andsubjected

toextensive

publicdiscussion

anddebate

beforeregulatory

implem

entation(1).Theoreticalanalysisand

experimentalresults

indicatedthata

drugperm

eability/solubilityclassification

scheme

canbe

usedas

abasis

todeterm

ineim

provedoraldrug

productdissolution

standards,for

therapeuticequivalence,

thatboth

reduceregulatory

requirementsand

improve

pharmaceuticalproductquality.

Inthe

caseofBCS

ClassIdrugs

inrapidly

dissolvingdrug

products,gastricem

ptyingisthe

ratedeterm

iningstep

fordrugabsorption,plasm

alevelsare

insensitiveto

formulation

changesand

noIVIVC

isexpected.

Thusbioequivalence

(BE)can

beassured

byproduct

dissolution!

Furtherextensions

ofw

aiversof

invivo

BEstudies

toClass

2and

Class3

drugand

drugproducts

canbe

developedbased

onm

oredetailed

dissolutionconsiderations

particularlyin

vitrodissolution

methods

basedon

thein

vivodissolution

processes.For

example

theEuropean

regulatoryagency

(EMA)

allows

biowaivers

forBCS

ClassIII

drugproducts.This

presentationw

illprovidean

overviewof

thedevelopm

ent,currentstatus

andfuture

extensionsofthe

BCSbased

approachto

regulatingoraldrug

productbioequivalencebased

onan

invitro

dissolutionstandard.Iw

illalsohighlight

theprocess

ofscience

basedregulatory

change,the

significanceof

regulatoryresearch,

andthe

importance

ofpublic

discussionand

debateofregulatory

sciencedevelopm

entsandissues.

1. G

.L. Am

idon, H. Lennernas, V

.P Shah and J.R. C

rison, A theoretical basis for a

biopharmaceutic

drug classification:

the correlation

of in

vitro drug

product dissolution and in vivo bioavailability, Pharm

. Res., 12, 413 (1995).

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

14

IntestinalPermeability

Considerationswhen

Formulating

LowSolubility

Drugs:TheSolubility

Permeability

InterplayArik

Dahan,Ph.D.Departm

entofClinicalPharmacology

SchoolofPharmacy

BenGurion

University

oftheN

egevIsrael

Em

ail:arikd@bgu.ac.il

While

eachofthe

two

keyparam

etersoforaldrug

absorption,thesolubility

andthe

permeability,has

beencom

prehensivelystudied

separately,therelationship

andinterplay

between

thetw

ohas

beenlargely

ignored.Forinstance,w

henform

ulatinga

lowsolubility

drugusing

varioussolubilizationtechniques:w

hatarew

edoing

tothe

apparent permeability

when

we

increasethe

solubility?Perm

eabilityis

equalto

thedrug's

diffusioncoefficient

throughthe

mem

branetim

esthe

mem

brane/aqueouspartition

coefficientdivided

bythe

mem

branethickness.

Thedirect

correlationbetw

eenthe

intestinalperm

eabilityand

them

embrane/aqueous

partitioning,w

hichin

turnis

dependenton

thedrug's

apparentsolubility

inthe

GIm

ilieu,suggests

thatthe

solubilityand

theperm

eabilityare

closelyassociated,exhibiting

certaininterplay

between

them,and

thecurrentview

oftreatingthe

oneirrespectively

oftheotherm

aynotbe

sufficient.

Inthis

lecture,Iwilldescribe

theresearch

havebeen

donethus

far,andpresentnew

data,toshed

lightonthissolubility

permeability

interplay.Ithasbeenshow

nthatdecreased

apparentperm

eabilityaccom

paniedthe

solubilityincrease

when

usingdifferent

solubilizationm

ethods.On

theother

hand,we

haverecently

revealedthatw

henincreasing

theapparent

solubilityby

supersaturatione.g.

viaam

orphoussolid

dispersions,the

solubilityperm

eabilityinterplay

iscircum

vented,and

higherdrug

fluxthrough

them

embrane

andoverallabsorption

isachieved.

Overall,the

solubilityperm

eabilityinterplay

cannotbeignored

when

usingsolubility

enablingform

ulations;looking

solelyat

thesolubility

enhancement

thatthe

formulation

enablesm

aybe

misleading

with

regardsto

predictingthe

resultedabsorption,and

hence,the

solubilityperm

eabilityinterplay

must

betaken

intoaccount

tostrike

theoptim

alsolubility–perm

eabilitybalance,in

ordertom

aximize

theoverallabsorption.

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

15

Academia

andIndustry

Consortium:Collaborative

Researchon

DrugDevelopm

ent.ShinjiYam

ashita,Ph.D.Faculty

ofPharmaceuticalSciences

SetsunanU

niversity,Japan.

Japanesepharm

aceuticalindustrieshave

developedm

anyofinnovative

medicines

sofarsuch

aspravastatin,tacrolim

us,which

made

Japanas

oneofthe

leadingcountries

inthe

pharma

business.However,w

iththe

adventofparadigmshiftin

drugdevelopm

ent,activityof

pharmaceutical

industrydecreased

graduallyin

Japan.In

spiteof

theirhigh

levelin

pharmaceuticalscience

andtechnology,rather

smaller

sizeof

companies

(compared

with

mega

companies

inU

SAand

EU)m

akesa

newdrug

development

verychallenging

becauseofthe

smallersize

ofcompound

library,databaseand

budget.Asoneofthe

possiblew

aystokeep

thehigh

activityof

drugdevelopm

ent,Japanese

companies

shouldshare

theknow

ledgeand

technologiesinsom

eparts.

ConsortiumofO

ralDrugAbsorption

Screeningw

ith25

Japanesepharm

aceuticalcompanies

was

organizedat2001.Finalgoalofthe

consortiumis

toestablish

theeffective

strategyfor

developmentoforaldrug

product.Also,itaims

togive

aplatform

form

utualinteractionof

researchersw

orkingin

differentcom

panies.During

past10

years,various

projectsw

ereperform

edin

theconsortium

relatingto

oraldrug

absorptionand

theiroutcom

esw

ereshared

with

allmem

bercompanies.In

thelecture,asan

organizer,activityofthe

consortiumw

illbe

presentedw

ithshow

ingoutcom

esof

2m

ainprojects

for“assessm

entof

oralabsorption

ofpoorlysoluble

drugs”and

“BCSClassification

toidentify

drugdevelopability

asoralproducts”.

Governmentalsupport

isalso

essentialtoactivate

theindustry.As

anew

strategyof

drugdevelopm

ent,earlyphase

clinicalstudy(exploratory

IND

(eIND)study)including

Microdosing

(MD)study

wasproposed

toenhance

successprobabilityofclinicaltrial.In

Japan,inorderto

promote

eIND

study,nationalprojecton

MD

clinicalstudystarted

at2008

(supportedby

NEDO

:N

ewEnergy

andIndustrial

TechnologyDevelopm

entO

rganization),entitled

as“Establishm

entofEvolutionalDrugDevelopm

entwith

theU

seofM

icrodosingClinicalTrial”.

Inthe

project,w

eperform

edm

orethan

30M

Dclinical

studiesw

ithm

arketeddrugs

tovalidate

theusefulness

ofthisnew

strategyand

toconstructthe

system(both

softandhard)

forconducting

MD

clinicalstudy

inJapan.

Furthermore,

we

challengedthe

molecular

imaging

studyw

ithPET

toinvestigate

theprocess

ofGI

absorptionand

subsequentbio

distributionof

orallyadm

inistereddrugs.

Thisis

alsoa

collaborativew

orkw

itha

governmental

researchcenter

“Riken”.As

asecond

issueof

thelecture,

resultsof

thisinnovative

work

willbe

highlightedw

ithem

phasizingthe

importance

ofintegrationofnew

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

16

technologiesindrug

developmentsuch

asmolecularim

agingm

odalities.N

anopharmaceuticals:creating,innovating

orcopying?M

ariaJosé

AlonsoResearch

CenteronM

olecularMedicine

(CIMU

S),SchoolofPharmacy,

University

ofSantiagode

Compostela,Spain

Email:m

ariaj.alonso@usc.es

Despitethe

recentintroductionofthe

nanomedicine

termin

thescientific

arena,theorigin

ofnano

drugdelivery,dates

fromthe

early60’s.It

isthanks

tothese

originalideas,that

we

havecurrently

inthe

market

asignificant

number

ofnanopharm

aceuticals.How

ever,the

fullpotential

ofnanom

edicineis

stillto

come.

Thispotential

isprom

isingbecause

overthelastdecadesw

ehave

initiateda

nonreturn

pathway,w

hichisthe

adoptionof

transdisciplinaryand

translationalapproaches

tothe

designand

development

ofnew

nanopharmaceuticals.

Inparticular,

theadvances

made

overthe

lastdecade

havebeen

largelyrelated

tothe

progressm

adein

thebiom

edicalfield(im

provedknow

ledgeofdisease

mechanism

s,identification

ofnew

targetsand

newbioactive

compounds…

etc)and

thenanom

aterialsfield

(newbiom

aterialsand

nanotechnologies).The

nanopharmaceutical

technologyarea

hasalso

contributedm

akingit

feasiblethe

nanoencapsulationand

controlleddelivery

ofcom

plexm

olecules,as

well

asdefining

ways

toscale

upthe

productionof

nanomedicines.N

evertheless,asignificant

amount

ofthis

researchrelies

inm

aking“m

eetoo”

deliverycarriers,w

hilethe

most

creativeactivity

stillneedsto

confrontgreathurdlesforitstranslation

tothe

clinic.

Ourgroup,being

comm

ittedw

iththe

translationofideasfrom

theuniversity

throughnovelpharm

aceuticaltechnology,hasdesigned

novelnanostructuredm

aterialsintended

totransport

drugsand

antigensacross

biologicalbarriersand

todeliver

themto

thetarget

tissue.During

my

presentationI

would

liketo

focuson

thedifferent

applicationsof

thenanocarriers

we

havedesigned.

Theseapplications

includecancer

therapy,nanovaccines

andoraldelivery

ofcom

plexm

acromolecules.M

oreinform

ationabout

theseapplications

andthe

literatureassociated

tothem

canbe

foundat:

http://webspersoais.usc.es/m

ariaj.alonso

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

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68

febrero2013

17

PolymerTherapeuticsasN

anomedicines:N

owand

FutureRuth

DuncanCardiff,U

Kand

PolymerTherapeuticsLab,

CIPF,Valencia,Spainhttp://w

ww

.ruthduncan.co.uk,profruthduncan@

btinternet.com

Over

recentdecades

agrow

ingnum

ber(>

40)nanomedicines

haveentered

routineclinical

useas

nanopharmaceuticals

andim

agingagents

(reviewed

in[1]).

Toput

intoperspective,this

compares

with

~1,200

NCEs

and>

100biologicals

approvedsince

1950[2].

Itisclearthatthe

21stcenturyw

illseem

anym

orecom

plexnanom

edicineproducts

arrivingto

firstinm

anstudiesand

intoroutine

clinicaluse.Thereare

currently>70

nanomedicinesin

clinicaltrials

asanticancer

therapiesalone.

Nanom

edicineshave

beendesigned

foradm

inistrationby

variousroutes

andthey

includea

diversearray

oftechnologies;e.g.ironoxide

nanoparticles(treatm

entof

anaemia

andas

MRI

imaging

agents),nano

sizeddrug

crystalsforimproved

oralbioavailability,liposomes,nanoparticlesand

polymertherapeutics.

Thepolym

ertherapeutics

aream

ongstthe

most

successfulfirstgeneration

nanomedicines

beingdesigned

asbiologicallyactive

drugs,andasconjugatesfordrug,protein,aptam

erandsiRN

Adelivery

andas

blockcopolym

ermicelles

tow

hichthe

drugis

covalentlybound

[3,4].An

increasingnum

berof"followon"

nanomedicine

productsare

nowem

ergingw

ithothers

(e.g.polym

ericdrugs,

PEGprotein

conjugates)on

thehorizon.

Itis

evidentthat

classicalrequirem

entsapplied

tosm

allm

oleculegeneric

drugs(pharm

aceuticalequivalence

andpharm

acokineticbioequivalence)

will

notbe

adequateto

ensureequivalent

safetyand

efficacyofcom

plex,multicom

ponentnanomedicines.

Polymer

therapeuticsare

amongst

them

ostsuccessful

firstgeneration

nanomedicines

(productslisted/discussed

in[1,3

6])and

thenum

berof

gainingproduct

approvalandentering

clinicaltrialcontinuestogrow

rapidly.Sow

hatisnew

?Em

erging‘hot’

topicshave

recentlybeen

reviewed

in[5,6]

andthey

include;(i)

useof

biodegradablepolym

erssuch

aspolyglutam

icacid

(PGA),dextrin,hydroxyethylstarch(HES),the

polyacetalFlexim

er®and

polysialicacid

togenerate

conjugatesentering

clinicaltrials

(endocyticcapture

onnon

degradablepolym

ersbrings

thepotentialrisk

oflysosom

alaccumulation

'lysosomal

storagedisease'

syndrome

(discussedin

[7,8]),(ii)

designof

bioresponsivepolym

erprotein

conjugatesw

ehave

recentlyw

ereported

anew

approachfor

proteinconjugation

calledpolym

erm

asking–unmasking

proteintherapy

(PUM

PT)and

(iii)the

developmentofpolym

erconjugatesfordeliveryofcom

binationtherapy

andastheranostics.

Thelatter

areboth

reviewed

in[6].Finally,it

isim

portantto

notethat

>2

decadeshave

passedsince

we

beganfirst

PhaseI

clinicaltrialsw

ithanticancer

syntheticpolym

erdrug

conjugatesand

theirrelated

gamm

acam

eraim

agingagents

(theranostics).Grow

ingunderstanding

ofthe

preclinicaland

clinicalm

echanisms

controllingw

holebody

XICongresode

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18

pharmacokinetics

andbody

distribution,tumour

targetingby

theEPR

effect,drugrelease

rateand

oftheendocytic

andintracellular

traffickingpathw

aysin

healthand

disease[7]is

bringingim

portantnew

opportunitiesfor

improved

preclinicalm

odelsand

theuse

ofpatient

specificbiom

arkersto

aidselection

ofthe

most

appropriatepatients

forpolym

ertherapeutic

therapy(discussed

in[1]).

References

1.Duncan,R.andGaspar,R.(2011)N

anomedicine(s)underthe

microscope,M

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959–968.3.Duncan,R.(2003)

TheDaw

ningEra

ofPolym

erTherapeutics.N

atureRev.Drug

Discov.2(5),347

360.4.Duncan,R.(2006)

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conjugatesas

anticancernanom

edicines.Nature

Rev.Cancer,6,688

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Duncan,R.

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erTherapeutics

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beginning,Adv.DrugDel.Rev.,in

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(2012)Endocytosis

andIntracellular

Traffickingas

Gateways

forN

anomedicine

Delivery:Opportunities

andChallenges,M

ol.Pharmaceutics

2012,9,2380

24028.Duncan,R

(2013)Nanom

edicine(s)andtheir

Regulation:AnO

verview,In:“Safety

assessment

ofnanom

aterials:im

plicationsfor

nanomedicine”,

Ed.Fadeel,

B.,Pan

Stanfo rdPublishing,

inpress

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

19

Novedadesen

bioequivalencia

Dr.AlfredoGarcía

Arieta.Jefe

deServicio

deFarm

acocinéticay

GenéricosDivisión

deFarm

acologíay

EvaluaciónClínica

AgenciaEspañola

deM

edicamentosy

ProductosSanitarios.

Ladem

ostraciónde

equivalenciaen

losproductosdeaplicación

localyefecto

localhaestado

limitada

porla

exigenciade

realizarcostosos

estudioscon

variablesclínicas.A

pesarde

quedichas

variablesson

insensiblespara

detectardiferencias

entreproductos

condistinta

biodisponibilidaddebido

aque

lacurva

dosis–respuesta,en

lam

ayoríade

estosproductos,

esbastante

planaen

elrango

terapéutico.Esta

presentacióndescribe

loscam

biosquese

hanproducido

eneste

campo

enlosúltim

osaños,entrelosque

destacanlas

nuevasaproxim

acionessim

plificadaspara

ladem

ostraciónde

equivalenciaen

losproductos

deinhalación,nasales,cutáneosy

gastrointestinales.

Recientemente,se

haadoptado

laGuía

sobrevalidación

dem

étodosbioanalíticos

dela

AgenciaEuropea

delM

edicamento

(EMA).

Enesta

presentaciónse

comentarán

brevemente

lasnovedadesexistentescon

respectoalestado

delarteque

sevenía

aplicandohasta

elmom

ento,basadasen

laactualguía

dela

Foodand

DrugAdm

inistrationde

EstadosU

nidos(US

FDA).

Próximam

entesaldrá

aconsulta

lanueva

revisiónde

laguía

sobreproductosde

liberaciónm

odificadade

laEM

A.

XICongresode

laSociedad

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febrero2013

20

TerapiaPersonalizada

enla

InfecciónporelVIH:Aplicación

deCriterios

Farmacocinéticosy

Farmacogenéticos.

MªJosé

GarcíaSánchez

Catedrática.Departamento

Farmacia

yTecnología

Farmacéutica.

Facultadde

Farmacia

Universidad

deSalam

anca.

Desdela

introducciónde

laterapia

antirretrovirallaeficacia

virológicaen

pacientesinfectados

deVIH

seha

incrementado

deform

asignificativa

yha

cambiado

lahistoria

deesta

patología,transform

ándolaen

unaenferm

edadcrónica

querequiere

tratamiento

alargo

plazo.Sinem

bargola

toxicidadfarm

acológicaconstituye

elprincipalobstáculopara

eléxito

deltratamiento,observándose

además

unaim

portantevariabilidad

interindividualen

elgrado

deexposición

yconsecuentem

enteen

larespuesta.

Secree

quevariaciones

genéticasentre

lospacientes

podríanjustificar

unafracción

significativade

lavariabilidad

farmacocinética

observada.

Lainform

aciónfarm

acocinéticaobtenida

mediante

lapráctica

dela

monitorización

(TDM)

puedeser

unaherram

ientam

uyútil

parala

optimización

deltratamiento

antirretroviral.Aunque

aúnpresenta

ciertaslim

itaciones,la

medida

rutinariade

lasconcentraciones

plasmáticas

puedeproteger

alospacientes

dela

apariciónde

efectosadversos

yprevenir

elfracasovirológico.

Lavariabilidad

farmacocinética

observadaen

losfárm

acosantirretrovirales

dependede

lasalteraciones

quese

producenen

losprocesos

delLADME,

especialmente

enla

biodisponibilidady

elmetabolism

o.En

consecuencia,la

existenciade

polimorfism

osgenéticos

paraciertasproteínas

implicadas

eneltransporte

ym

etabolismo

deestos

fármacos

puedenexplicar

deform

aim

portanteesta

variabilidadfarm

acocinéticainterindividualque

condicionasu

respuesta;laintegración

dela

información

farmacogenética

yfarm

acocinéticapodría

permitir

ungran

avanceen

laoptim

izaciónde

laposología

deltratamiento

antirretroviral.

EnFarm

acogenéticalas

variantesgenéticas

más

frecuentemente

estudiadasson

lospolim

orfismos

deun

úniconucleótidos

oSN

Ps(single

nucleotidepolim

orphisms)en

genesinvolucrados

enel

trasporte,m

etabolismo

otoxicidad

delos

fármacos.

Lasisoenzim

asCYP3A4,CYP3A5,CYP2C19,CYP2D6,CYP2A6

yCYP2B6

sonlas

dem

ayorparticipación

enel

metabolism

ode

losfárm

acosantirretrovirales

porello,son

lospolimorfism

osrelacionados

conestasisoenzim

aslosmás

ampliam

enteestudiadosen

losúltimosaños.

Apesar

delos

numerosos

estudiosrealizados

sobrela

influenciade

factoresgenéticos

delhuésped

enpacientes

infectadoscon

VIH,cuya

información

actualizadase

puedeencontrar

enla

web

ww

w.hiv

pharmacogenom

ics.org,sonpocos

losbiom

arcadoresgenéticos

convenientemente

validadosque

laFDA

recomienda

utilizarenla

prácticaclínica.

Enelm

omento

actualelmejorejem

plode

aplicaciónclínica

eneltratam

ientodelVIH

esla

XICongresode

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febrero2013

21

asociaciónencontrada

entreel

antígenode

histocompatibilidad

delalelo

B5701

(HLAB*5701)y

elriesgode

reaccionesde

hipersensibilidadpara

abacavir.Dehecho

eltestpara

detectareste

polimorfism

ose

haintroducido

recientemente

como

prácticaclínica

estándarprevia

ala

prescripciónde

estefárm

aco.Otra

asociaciónbien

establecidaes

laobservada

entrealgunos

delos

alelosdelgen

quecodifica

elCYP2B6con

lafarm

acocinéticay

latoxicidad

deefavirenz,

porlo

quesu

caracterizacióntam

biénha

sidopropuesta

parala

individualizaciónde

ladosis

deeste

fármaco

enun

intentode

reducirsus

efectosadversos

sobreel

SNC.

Otras

asociacionessignificativas

incluyenlos

polimorfism

osde

UGT1A1

yM

DR1yla

hiperbilirrubinemia

observadaen

lostratam

ientoscon

atazanaviry

lapresencia

delHLADRB*0101

relacionadacon

unaum

entodelriesgo

dehepatotoxicidad

denevirapina.

También

sehan

descritoasociaciones

genéticaspara

laneuropatía

periférica,la

lipodistrofia,lahiperlipidem

ia,lapancreatitis

yla

tubulopatiaproxim

alrenal,perotodavía

noexisten

resultadosconcluyentes

queperm

itansu

aplicaciónclínica.

No

obstante,la

información

genómica

presentaun

granpotencialen

laindividualización

delos

tratamientos

farmacológicosdelVIH,pero

seprecisan

superarproblemaslogísticosy

realizarmásestudios

decoste

efectividadpara

poderincorporar

laFarm

acogenéticaa

lapráctica

asistencialdeesta

patología.Nuestro

grupoha

incorporadola

farmacocinética

yla

farmacogenética

enel

seguimiento

terapéuticode

lospacientesdentrode

unprogram

aintegraldeltratam

ientode

lainfección

porVIH.

XICongresode

laSociedad

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AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

ComunicacionesO

rales

NU

EVA

GEN

ERA

CIÓ

N D

E NA

NO

PAR

TÍCU

LAS ELA

BO

RA

DA

S A B

ASE D

E ÉSTERES D

E SO

RB

ITÁN

(SPAN

® 80):POTEN

CIA

L APLIC

AC

IÓN

EN TER

APIA

GÉN

ICA

A. Pensado

1,G.K

. Zorzi 3, E.S. Carvalho

4, A. Sánchez

1,2 , B. Seijo

1,2

1Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica,Universidad de Santiago de C

ompostela.

2Grupo de Im

agen Molecular. ID

IS. Com

plejo Hospitalario U

niversitario de Santiago.3Institut für B

iologie und Biotechnologie der Pflanzen

Westfälische W

ilhelms U

niverstät - Münster

4Universidade Federal do R

io de Janeiro - Cam

pus UFR

J - Macaé.

INT

RO

DU

CC

IÓN

La búsqueda

de nuevos

sistemas

para la

vehiculización de fármacos, supone un reto constante

en el ámbito de la investigación farm

acéutica. En este m

arco, la nanotecnología se ha situado como una

alternativa prometedora, sin duda por las m

últiples ventajas que ofrece (1). H

asta el mom

ento se han desarrollado m

uchos tipos de nanosistemas (p.ej.

micelas, em

ulsiones,nanopartículas

y liposomas),

utilizando diferentes

tipos de

biomateriales.

Sin em

bargo la búsqueda de nuevos componentes, a ser

posible, seguros y de bajo precio, así como m

étodos de preparación cada vez m

ás sencillos, no cesa.

En esta línea, el objetivo de este trabajo ha sido el desarrollo una nueva generación de nanopartículas a partir de m

ateriales biocompatibles, biodegradables,

y de bajo coste y que, además, se utilizan desde hace

tiempo en Tecnología Farm

acéutica (por ejemplo

como tensoactivos) que son los ésteres de sorbitán,

conocidos con el nombre com

ercial de Span, por un

procedimiento de preparación sencillo y escalable y,

en la medida de lo posible, versátil con el que sea

posible obtener

nanopartículas de

características fácilm

ente modulables y, por tanto, con capacidad

para incorporar moléculas bioactivas m

uy diversas.

Más concretam

ente, en este trabajo se ha utilizado el m

onooleato de

sorbitán(SP80)

como

material

formador de las nanopartículas, solo o com

binado con la am

ina grasa oleilamina (O

A), y un plásm

ido m

odelo(pEG

FP),con

el objetivo

de evaluar

la posible aplicación de estas nuevas nanopartículas en terapia génica.

MA

TE

RIA

LE

S Y M

ÉT

OD

OS

Preparación :Para

la elaboración

de las

nanopartículas se parte dela disolución de SP80 o

SP80 + OA

en etanol (fase orgánica) la cual seadiciona

bajo agitación

magnética

suave a

una solución acuosa,de m

anera quelas nanopartículas se

forman de m

anera espontánea.A

continuación, el etanol se elim

ina apresión

reducida en un rotavapor(2) obteniéndose

la suspensión

de nanopartículas

blancas.En una fase posterior, es posible asociar a

estas partículasm

oléculas bioactivas en disolución (p.ej.

el plásm

ido m

odelo pEG

FP) m

ediante su

incubación con los nanosistemas en una proporción

1:1 (v/v), bajo agitación.C

aracterísticas fisico-químicas: El tam

año medio de

las partículas se determinó

por espectroscopía de correlación

fotónica y

su carga

superficialen

términos del potencial

, por anemom

etría de Láser D

oppler. Para estudiarsu m

orfología se ha recurrido a

la microscopía electrónica de transm

isión (TEM) y

la asociación del plásmido m

odelo (pEGFP) a los

sistemas se determ

inó mediante electroforesis en gel

de agarosa al 1%.

Cultivos celulares: La línea celular H

EK 293 (H

uman

Embryonic K

idney 293 cells), fue cultivada en medio

MEM

(Modified Eagle M

edium), suplem

entado con un

10%

de suero

fetal bovino

y penicilina/

estreptomicina al 1%

. Se mantuvieron a 37ºC

con un 5%

de CO

2 en atmósfera húm

eda.Estudios

de transfección:

Las células

HEK

293

fueron sembradas a una densidad de 250.000 células

por pocillo. El medio de cultivo fue reem

plazado por H

BSS que contiene los nanosistem

as asociando el pEG

FP a diferentes dosis .Las nanopartículasfueron

incubadas con las células durante 4 horas y se evaluó la transfección pasadas 48

y 72 horas m

ediante m

icroscopía de fluorescencia.

RE

SUL

TA

DO

S Y D

ISCU

SIÓN

Mediante esta nueva técnica que ha sido diseñada y

patentada en

nuestro laboratorio,

se han

podido obtener partículas de m

onooleato de sorbitán SP80, con un tam

año nanométrico (117 nm

) y potencial negativo (-33 m

V). A

mbos valores son fácilm

ente m

odulables ya que, cuando se incorpora OA

junto con el SP80,las partículas que se form

an presentan un

tamaño

mayor

(210 nm

) y

carga superficial

positiva (+30 mV

). Estas partículas son a priori idóneas

paraasociar

moléculas

activascargadas

negativamente

mediante interacciones electrostáticas,

como es el caso del plásm

ido modelo pEG

FP. Este plásm

ido ha

sido incorporado

a distintas

concentraciones, sin que afecte significativamente al

tamaño

nanométrico

de las

mism

as en

elrango

estudiado (~290-340 nm),(Tabla 1).

Por el

contrario, la

incorporación del

DN

A

plasmídico sí produce una inversión en el valor de

potencial, el cual se hace cada vez m

ás negativo a m

edida que se aumenta la proporción de pD

NA

.

Tabla 1:

Caracterización

físico-química

de los

nanosistemas asociando D

NA

plasmídico. (PD

I: Índice de polidispersión)

Mediante el análisis de TEM

, (Figura 1), podemos

corroborar el tamaño nanom

étrico y la forma esférica

de las

partículas así

como

la presencia

de una

población homogénea.

Figura 1. Morfología de las nanopartículas SP80O

A+

pEGFP observadas m

ediante TEM a diferentes aum

entos.

Los sistemas desarrollados son

capaces de asociar eficazm

ente pEGFP a las concentraciones estudiadas,

como

se ha

comprobado

en el

estudio de

electroforesis (Figura 2) ya que, a diferencia de lo que ocurre con el pEG

FP libre, no se observa la m

igración del material genético a través del gel de

agarosa.

Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa 1%, de las

formulaciones SP80O

A con diferentes cargas de plásm

ido. 1) pEG

FP libre 2) pEGFP-

0,15 mg/m

l 3) pEGFP-

0,2 m

g/ml 4) pEG

FP- 0,25m

g/ml 5) pEG

FP-0,3 mg/m

l

Para estudiar la capacidad de transfección de estas nuevas

nanopartículas se

ha seleccionado

la form

ulación preparada con una concentración de 0,2 m

g/ml de plásm

ido, la cual se ha incorporado a las células a distintas dosis (1- Figura 3, se aprecia la expresión celular positiva de la proteína verde fluorescente en la línea celular H

EK

293, transcurridas

72 horas

post-transfección. M

ediante m

icroscopía de

fluorescencia se

ha

comprobado que dicha expresión presenta un perfil

dosis-dependiente hasta alcanzar un máxim

o (3 g),

manteniéndose casi constante a partir de este valor.

Estos resultados nos permiten confirm

ar la elevada eficacia de transfección de esta nueva generación de nanopartículas, incluso a dosis tan bajas del plásm

ido m

odelo como las que se han utilizado en este estudio.

Figura 3. Expresión celular positiva de proteína verde fluorescente

72 post-transfección.

Nanopartículas

SP80OA

+ pEGFP (0,2m

g/ml). A

) 1 g pEG

FP, B) 2

gpEG

FP,C) 3

g pEGFP, D

) 4 g pEG

FP.

CO

NC

LU

SION

ES

Se ha

desarrollado una

nueva generación

de nanosistem

as, usando cono componente principal el

monooleato de sorbitán (Span

®80). El m

étodo de preparación

es sencillo,

rápido, de

bajo coste

y fácilm

ente escalable, lo cual facilitará su producción a

nivel industrial.

Son adem

ás sistem

as m

uy versátiles ya que, gracias a la sim

ple incorporación de com

ponentes adicionales a su estructura (p.ej. OA

), podem

os m

odular am

pliamente

sus propiedades

fisico-químicas y facilitar

por tanto,la incorporación de m

oléculas terapéuticas, como se ha com

probado para

el caso

concreto del

DN

A

plasmídico.

Efectivamente, se ha verificado su gran capacidad

para asociar cantidades elevadas de pDN

A, así com

o tam

bién su eficacia de transfección incluso utilizando dosis bajas de plásm

ido. Por ello consideramos que

estas nanopartículas

son sistem

as potencialm

ente interesantes para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, com

o por ejemplo en el cam

po de la terapia génica.

RE

FER

EN

CIA

S1. D

uncan, R. and R

. Gaspar, N

anomedicine(s)

under the

Microscope.

Molecular

Pharmaceutics,

2011. 8(6): p. 2101-2141.2. Sánchez, A

. Seijo, B. Zorzi, G

.K., et al., Sistem

as nanoparticulares elaborados a base de ésteres de sorbitán. P201131812.

AG

RA

DE

CIM

IEN

TO

SM

ATER

A/B

BM

-1856 10TMT203011PR

MA

T2010-20452-C03-02

Formulación

pDN

A(m

g/ml)

Tamaño

(nm)

PdIPotencial

(mV

)SP80

----116,9±5,3

0,10- 33,2±2,5

SP80OA

----200,5±10,2

0,08+ 30,3±5,5

0,15340,3±15,3

0,13- 11,1±0,4

SP80OA

+pEG

FP0,2

287,1±5,10,12

- 19,5±1,5

0,25295,2±8,3

0,14- 20,5±0,3

0,3317,6±3,2

0,13- 22,2±0,4

AB

CD

B

1 2 3 4 5

D

The effectiveness of edelfosine lipid nanoparticles in enhancing the drug cytotoxicity in breast cancer cells

Ángela A

znar Góm

ez, Beatriz Lasa-Saracíbar, A

nder Estella-Herm

oso de Mendoza, M

aría J. Blanco-Prieto

Pharmacy and Pharm

aceutical Technology Departm

ent, University of N

avarra, Spain.

Introduction

Breast

cancer is

the fifth

most

comm

on cancer

worldw

ide after

lung cancer,

the second

most

comm

on cause of cancer death, and the leading cause of cancer death in w

omen (1). The global burden of

breast cancer

exceeds all

other cancers

and the

incidence rates

of breast

cancer are

increasing.Treatm

ent approaches

for breast

cancer include

surgery, chem

o and

radiotherapy and

hormone-

therapy and depend on the stage and targeted therapy. H

owever, the survival rates for patients in advanced

stages of the disease remain low

(1). Consequently,

new treatm

ent options have to be studied to improve

these rates.

The antitumor ether lipid edelfosine (ET-18-O

CH

3) is the prototype of a novel generation of prom

ising anticancer

drugs that,

in contrast

to m

ost chem

otherapeuticagents currently in use, does not

target the

DN

A

of the

cells (2).

This alkyl-

lysophospholipid is

incorporated into

biological m

embranes

as a

natural lipid

compound

of the

cellular bilayers (3). Edelfosine selectively induces apoptosis in tum

or cells, acting through lipid rafts (4,5). The fact of encapsulating this drug into lipid nanoparticles (LN

) increases its oral bioavailability and decreases toxicity (6). B

esides, LN m

ay modify

the entrance mechanism

of the ether lipid into breast cancer cells and this m

ight overcome the resistance

that some cell lines show

to the free drug (7). They are also able to m

odify the drug distribution profile in order

to im

prove drug

bioavailability through

controlled release (6).

Objectives

The aim of this study w

as to develop LN loaded w

ith edelfosine to enhance its therapeutic activity against breast cancer cells.

Material and M

ethods

Preparation of lipid nanoparticlesLN

w

ere prepared

by the

hot hom

ogenization m

ethod, consisting of high shear homogenization and

ultrasonication (8,

9). The

drug (30

mg

per form

ulation) was m

elted in Precirol ®lipid at 70ºC

. A

Tween

®80 aqueous

solution heated

at the

same

temperature w

as added onto the molten lipid and

dispersed with the help of high shear hom

ogenization and ultrasonication. The em

ulsion that was obtained

was left to cool dow

n at room tem

perature in order for the nanodrolets to solidify into LN

, and these

were concentrated by ultra-filtration using A

micon

®

Ultra 10,000 M

WC

O filters at 4,500 x

gfor 30

minutes and w

ashed twice w

ith distilled water. The

resulting suspension was frozen at -80ºC

for at least 3 hours, freeze-dried and stored at 4ºC

.

Nanoparticle characterization

Nanoparticle

size and

polydispersity index

were

determined

in triplicate

by photon

correlation spectroscopy and zeta potential by laser doppler anem

ometry, using a Zetasizer N

ano (Malvern, U

K).

The am

ount of

edelfosine nanoencapsulated

was

determined using an ultra-high perform

ance liquid chrom

atography-tandem m

ass spectrometry m

ethod (6). C

ell cultureM

CF7

breast cancer

cell line

was

grown

in D

ulbecco's m

odified Eagle's

medium

(D

MEM

) supplem

ented w

ith 50

U/m

l penicillin,

50 U

/ml

streptomycin and 10%

calf serum (H

yclone) at 37in a hum

idified incubator supplemented w

ith 5%

carbon dioxide

In vitro proliferation assay: MTT assay

The M

TT assay

is a

colorimetric

method

for determ

ining the

number

of viable

cells in

proliferation (10). This assay is based on the cleavage of

yellow-colored

tetrazolium

salt, (3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-

2,5-diphenyl tetrazolium

brom

ide) to

a blue-colored

formazan

by the

mitochondrial

enzyme

succinate-dehydrogenase of

the living cells (11). The absorbance of this colored solution can be quantified by m

easurement w

ith a spectrophotom

eter. The

amount

of form

azan produced during a given exposure period is directlyproportional to the num

ber of viable cells per well.

MTT solution w

as added directly to the culture media

at a final concentration of 0.5 mg/m

L and then incubated for 3 hours. A

fterwards, M

TT containing m

edium

was

removed

from

all w

ells and

the rem

ainingcells containing form

azan crystals were

dissolved in DM

SO. O

ptical density was determ

ined w

ith a 96-well plate reader by using an absorption

spectrum of 540 nm

against the blank wells in the

standard curve.

Results and discussion

Nanoparticle characterization

Nanoparticles w

ere characterized in terms of size,

zeta potential,

encapsulation efficiency

and drug

loading. All the form

ulations showed a sim

ilar size, w

ith a mean diam

eter of 164 (8) nm

. Zeta potential w

as -26 mV

, which is an acceptable value to obtain

good physical stability and to avoid cell mem

brane

instability. Drug loading w

as 31.42 (±3.72) g/m

g. The

polydispersity index

was

0.27 (±0.01),

suggesting hom

ogenous dispersion.

The encapsulation efficiency (%

EE) was 64.85 (±6.85) %

.

In vitroassays

The optimized LN

containing edelfosine (ET-LN)

were effective in inhibiting proliferation of M

CF7

breast cancer cell line at an IC50

concentration of 12.9

g/mL after 72 hours of incubation (Fig 1). The

IC50

values of

free edelfosine

(ET) and

blank (unloaded) nanoparticles (B

-LN) w

ere 17.8 and 28.7 g/m

L respectively.

Morphological changes

Optical

inspection of

the cell

cultures revealed

morphological changes in M

CF7 cells 48 hours after

the treatment either w

ith ET or ET-LN. C

ompared

with untreated cells and cells incubated w

ith B-LN

, treated cells show

ed expression of small vesicles

(apoptotic bodies, see arrows in Fig. 2) in som

e cells. In addition, treated groups show

ed unattached and distorted cells, w

hich is indicative of cell death.

Conclusion

The edelfosine loaded LN developed display higher

efficacy in treating MC

F7 breast cancer cells than the free drug. Presently, the cytotoxicity m

echanism of

action of ET-LN is under evaluation by assessm

ent of cell cycle and apoptosis using flow

cytometry.

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Navarra

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), the

Governm

ent of

Navarra,

Departm

ent of

Health

(ref: 63/09,

"Ortiz

de Landázuri" fellow

ship) and the Spanish Ministry of

Science and Innovation (SAF2007-61261, SA

F2010- 15547)

Fig 1 Inhibitory effect ofET, B-LN andET-LN in MCF7

breast cancer cells. Cell viability was determined by MTT assa y after 72 hours of treatment.

Fig 2Morphological changes of MCF7 cells after 48 hours

incubation. Cells grown in medium containing either ET or ET-LN show hints of cell damage and production of apoptotic bodies (arrows).

In vivoadm

inistration of VE

GF-releasing biodegradable nanospheres in a m

ouse model(A

PP/Ps1)of Alzheim

er’s disease

E. H

errán1,2,R

. Perez- Gonzalez

3,4,M. Igartua

1,2, J.L. Pedraz

1, 2,E. C

arro 3,4,R.M

. Hernández

1, 2

1NanoBioC

el Group, Laboratory of Pharm

aceutics, University of the B

asque Country (U

PV/EH

U), School of Pharm

acy, Vitoria, Spain ; 2B

iomedical

Research N

etworking C

enter in Bioengineering, B

iomaterials and N

anomedicine (C

IBER

-BB

N), V

itoria, Spain.3N

euroscience Laboratory, Research

Center,

Hospital

12 de

Octubre,

Madrid,

Spain; 4N

eurodegenerative D

iseases B

iomedical

Research

Center (C

IBER

NED

), M

adrid, Spain.

Introduction:A

lzheimer’s disease (A

D) is the m

ost com

mon neurodegenerative disorder characterized by a

progressivecognitive decline. The pathological signs of

the disease are high levels of amyloid beta-peptide

, presence of neurofibrillary tangles, neuronal lossand

cerebrovascular pathologies.

These regional

microvasculature

alterations establish

an im

portant abnorm

alityin

clearance, resulting in an increasingto

the brain.

This perception suggests that this vascular alteration m

ay have a significant role in A

D1.

VEG

F is a mayor

regulator of angiogenesis into the brain. It is also involved in neuroprotection and B

BB

integrity. For these reasonscurrent research efforts are

focusedin new

V

EGF delivery system

sto obtain

a continuous and direct drug release into the brain

2. In this w

ork we propose a novelstrategy

based onthe

encapsulation of

VEG

F in

PLGA

biodegradable

nanospheres(N

S) w

hich can

be adm

inistered by

craniotomy directly into the brain. The in vivo

and in vitro

studies were carried out in order to evaluate the

capacity of VEG

F-NS to restore the neuronal loss,

cerebrovascular abnorm

alitieclearance.E

xperimental m

ethods:PLG

A (50:50) nanospheres

loaded with V

EGF (V

EGF-N

S)and em

pty-NS

were

preparedby m

odification of a previously described (W

1 /O/W

2 ) double

emulsion

solvent evaporation

technique3.

After

NS

preparation, the

following

parameters

were

characterized: particle

size, m

orphology, zeta

potential, and

encapsulation efficiency.

Moreover,

VEG

F in

vitrorelease

and bioactivity assays in neuronal cultures w

ere conducted.To carry out in vivo

studies24

female 6 m

onth-old am

yloid precursor

protein/presenilin-1 (A

PP/Ps1) double transgenic m

ice(12 m

ice receiving VEG

F-NS

and 12 mice em

pty-NS) w

ere used. The NS

were

dropped directly

into the

cerebral cortex

after craniotom

y and excision of the dura mater(Fig. 1).

Cerebral cortex

PLGA-N

S

Duram

ater

Figure 1.VEG

F-NS

diffusion after the administration into the

brain.

3 m

onthsafter

VEG

F-NS

were

implanted

mice

behavior was evaluated over a

10-day period. Finally, anim

als w

ereperfused

transcardially for

inmunohistochem

ical examination.

Results

and discussion:

All

NS

had a

uniform

morphology

with

a sm

ooth surface

devoid of

irregularities.The mean particle size w

as 235± 0.111

nm for V

EGF-N

S and 267±

0.111nm

for empty-M

S (Fig. 2).

Figure 2. SEM photom

icrographof V

EGF-N

S

Figure 3 representsthe release profile of V

EGF-N

S. The release profile w

as biphasic, with an initial burst in

the first dayand a second constant release rate untilthe

end of the assay.

0 50

100

150

200

250

300

350

05

1015

2025

3035

VEGF (ng/ml)

Time

(days)

Figure 3.In vitroV

EGF-N

S release profile at 37ºC in PBS

buffer (pH 7.4). V

alues are represented as mean ± SD

(n=3).

To confirm the biological activity of the encapsulated

VEG

F, bioactivity assays were perform

ed in neuronal cultures. different V

EGF concentrations released from

V

EGF-M

S were added at the sam

e time of seeding

cells. After 8 days the cell viability w

as statisticallyincreased in V

EGF 10 ng/m

l and 50 ng/ml treated

groups(one w

ay AN

OV

A, **p<0.001and ***p<0.0001

with respect to control and em

pty-MS) (Fig.4).

0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.800

VEGF 1

VEGF 5

VEGF 10

VEGF 50

Control -Em

pty-MS

*****

O.D

Figure 4.Viability evaluation in neuronal cell cultures.

To prove VEG

F protection against lipopolysaccharide (LPS), neuronal cell cultures w

ere treated for 24h with

VEG

F, LPS, VEG

F+LPS and control group (Fig.5).

The addition

of V

EGF

protected neuronal

cultures against

the cytotoxicity

caused by

LPS(one

way

AN

OV

A, **p<0.01and ***p<0.0001

respect to LPS group).

Figure 5.Live/Dead V

iability/Citotoxicity test in neuronal

cultures(green: live cells/yellow: dead cells).

In vivoefficacy

of encapsulated VEG

F was assessed

analyzing behavioral

deficits after

VEG

F-NS

administration. In the T-m

aze, choice trial latencies of V

EGF-N

S group were significantly decrease com

pared w

ith em

pty-NS

group(one

way

AN

OV

A,

***p<0.0001) (Fig. 6).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Empty-N

SVEGF-N

S

Latency (seconds)

***

Figure 6. T-maze behavior test in A

PP/Ps1 mice.

VEG

F-NS

administration

suggested that

the adm

inistration of VEG

F-NS reduced the percentage of

these depositsin A

PP/Ps1 mice brain

(t-student *p< 0.05 em

ty-NS vs V

EGF-N

S)(Fig. 7).

Figure 7. Adeposits in cerebral cortex of A

PP/PS1 mice.

levelsw

ere measured in cerebral cortex. These data

indicate that animals receiving V

EGF-N

S treatment had

(t-student *p<0.01)w

hen compared w

ith empty-N

S(Fig.8).

0 20 40 60 80

100

120

Empty-N

SVEGF-N

S

**

A 1-42 (% Control)

Figure 8.

Conclusion:PLG

AV

EGF - N

Sm

ay be a potential therapeutic strategy to decrease neuronal loss in vitro

in vivo, as well as able to im

prove behavioral deficits in A

PP/Ps1 mice.

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Acknow

ldegements

E. Herran thanks the B

asque Governm

ent for the Fellowship grant.

OPT

IMIZA

CIÓ

N D

E L

A A

CT

IVID

AD

DE

DO

XO

RR

UB

ICIN

A E

N C

ÁN

CE

R D

E M

AM

A

ME

DIA

NT

E U

NA

NA

NO

PLA

TA

FOR

MA

POL

IMÉ

RIC

A B

IOD

EG

RA

DA

BL

EJ.L. A

rias 1,C. M

elguizo2,J. Prados 2,R

. Ortiz

3, L. Cabeza

2, M.A

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1,R. Luque

4, B. G

ónzalez4, V

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allardo1, A

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2Instituto de Biopatología y M

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niversidad de Granada, España.

3Dpto. de C

iencias de la Salud, Universidad de Jaén, España.

4Servicio de Medicina O

ncológica, Hospital V

irgen de las Nieves, G

ranada, España. e-m

ail: jlarias@ugr.es

Introducción: La

necesidad de

encontrar tratam

ientos quimioterápicos eficaces ha hecho

que se incrementen las líneas de investigación

en oncología.

Esto ha

permitido

un m

ayor conocim

iento de los orígenes moleculares del

cáncer, con

el consiguiente

desarrollo de

novedosas estrategias farmacoterapéuticas. Sin

embargo, los

antitumorales

utilizados en clínica suelen exhibir serias

limitaciones que conducen

a unfracaso del tratam

iento, incluso en tipos de cáncer teóricam

ente sensibles (1).Por ejemplo,

a pesar de la notable actividad antitumoral de la

doxorrubicina, suuso se encuentra seriam

ente lim

itado por el desarrollo de resistencias por las células tum

orales y por importantes reacciones

adversas (p. ej., cardiotoxicidad) (2).Para

solventarestos problem

as se han asociado m

oléculas antitumorales con coloides

basados en

nanopartículas biodegradables.

Así,

sepretende aum

entar la acumulación específica

del fárm

aco en la masa

tumoral e increm

entar el tiem

po de exposición de las células cancerosas a éste (1, 3). Las partículas diseñadas con este fin se construyen

principalmente con

polímeros o

materiales de carácter lipídico (1, 3,

4).C

omo

ejemplo, los polím

eros alquilcianoacrilato hanm

ostradograndes posibilidades com

o material

base para el diseño de estos nanosistemas. D

e hecho,

diferentes estudios

preclínicosdem

uestransu

eficacia com

o vehículos

de anticancerosos,

incluso en

células m

alignas resistentes (5). N

uestroobjetivo es desarrollar

una (nano)formulación basada en partículas de

poli(butilcianoacrilato) (PBC

A)

como sistem

a transportador

de doxorrubicina

(DO

X),

y valorar su actividad en cáncer de m

ama.

Materiales y M

étodos: El agua utilizada fuedesionizada

y filtrada

(Milli-Q

, M

illipore, Francia).

Los reactivos

empleados

eran de

calidad analítica (Sigma-A

ldrich, Alem

ania). Elm

onómero butilcianoacrilato fue un regalo de

Henkel Loctite (Irlanda).

La síntesis de nanoesferas de PBC

A (diám

etro m

edio135 nm

) se realizó porpolim

erización en em

ulsión del monóm

ero:éste

(1%, p/v, en

acetona) se

incorporó, bajo

agitación (1200

rpm), a un m

edio acuosocon una concentración

10-4N

de HN

O3

y un 1% (p/v) de pluronic

F-

68. Tras 3 horas deagitación, se neutralizó con

cantidad suficiente de NaO

H para asegurar el

final de la polimerización.

La incorporación deD

OX

en las nanopartículas de PB

CA

se realizó por:i) adsorción superficial del fárm

aco en las partículas preformadas

(t = 24 h.); y, ii) incorporación de D

OX

en la solución de acetona donde el m

onómero está

disuelto antes de polimerizar. En este últim

o caso,

se analizó

la influencia

sobre la

vehiculizaciónde

las concentraciones

de fárm

aco, m

onómero

y tensioactivo.

La incorporación

(y liberación)

de D

OX

se

cuantificó m

ediante un

método

validado de

espectrofotometría

UV

-Vis

(481 nm

). La

liberación de DO

Xse estudió m

ediante diálisis.A

continuación, la actividad antitumoral in vitro

de las partículas cargadas con DO

X (PB

CA

-D

OX

) se investigó en la línea MC

F-7 de cáncer de m

ama, utilizando el test colorim

étrico MTT

(azul de

tetrazolio). Las

células M

CF-7

se incubaron con cantidades

crecientes de PBC

A

(control), D

OX

y PB

CA

-DO

X.

La dosis

La actividad citotóxica se determinó m

ediante el cálculo de la concentración inhibitoria cincuenta(IC

50 ).A

demás, se evaluó cualitativam

ente la captación

intracelular de

DO

X

mediante

microscopía

de fluorescencia (470 y 570 nm).

Finalmente,

se indujeron

tumores

sólidos subcutáneos en ratones C

57BL/6

concélulas

E0771de cáncer de m

ama.

Los grupos de tratam

iento (n

=10)

fueron: suero

salino (control), PB

CA

(placebo), D

OX

(dosis: 10

mg/K

g)y

PBC

A-D

OX

(dosis equivalente a 10m

g/Kg

de D

OX

). El

tratamiento

comenzó

cuando el tamaño de los

tumores era

75m

m3.

Los días 0, 3, 6, 9y 12 se adm

inistraron las form

ulaciones vía i.v., siguiéndose la evolución del tam

año del tumor. El estudio fue aprobado

por el Com

ité Ético de la Facultad de Medicina

(UG

R).

La toxicidad de las formulaciones se

evaluó mediante seguim

iento de la mortalidad,

daño tisular, alteraciones en el comportam

ientoy peso corporal relativo de los anim

ales. Todos

los experim

entos se

realizaron por

triplicadoy su análisis estadístico se realizó

mediante la prueba tde Student.

Resultados y D

iscusión:En com

paración con el m

étodo de adsorción superficial, se lograron unos valores de entrapm

ent efficiency(%

) y drug loading

(%) significativam

ente mejores

mediante el m

étodo de absorción en matriz. Por

ejemplo, si

la concentraciónutilizada de D

OX

era 10

-2M (óptim

a para la vehiculización), estos parám

etros pasaban

de 22.3%

y

3.6%

(adsorción) a 49.3%

y 14.8%

(absorción), respectivam

ente. D

e todas

las variables

que podían afectar a la incorporación de D

OX

en la m

atriz de PBC

A, sólo la concentración de este

fármaco

tuvo una

influencia significativa.

También resultó precisa

una concentración de tensioactivo

del 1%

(m

/v) para

obtener partículas adecuadas para la vía parenteral.La liberación in vitro

de este fármaco (figura 1)

se produce según unproceso bifásico si se

incorpora en la matriz: rápida liberación de la

DO

Xsituada

a nivel superficial (37%

en 1 h.), seguida de una fase lenta consecuencia de la difusión del antitum

oral o de la degradación polim

érica por erosión superficial (completa en

24 h.). Sin embargo,si la D

OX

se incorpora poradsorción, el proceso term

ina en tan sólo 3 h.

Figura 1.Liberación de D

OX

(%), adsorbida

a en PB

CA

,en función del

tiempo de incubación en PB

S (pH 7.4) a 37 ºC

.

La citotoxicidad de PBC

A-D

OX

en la línea M

CF-7 (IC

50significativam

ente superior a la de D

OX

en solución (IC50

= 0.5 p

< 0.001).

Tiempos

de incubación

mayores

(48 y

72 h.)

confirmaron

estos resultados.

El análisis

de m

icroscopía de

fluorescencia puso

de m

anifiesto cóm

o la

asociaciónde

DO

X

con PB

CA

acrecentaba

notablemente la intensidad de la fluorescencia a

nivel citoplasmático y en el núcleo (t = 1, 2 y 4

h.), lo cuál podría ser consecuencia de una m

ayor entradacelular de D

OX

.En cuanto a la actividad antitum

oral de las form

ulaciones en un modelo m

urino (C57B

L/6) de tum

or sólido subcutáneo (células E0771) (figura 2), puede apreciarse cóm

o las partículas PB

CA

-DO

X m

ejoran la actividad antitumoral

de esta molécula quim

ioterápica. La inhibicióndel crecim

iento del tumor, en com

paración con

DO

X, resultó ser significativa los días 21, 24 y

27 (p< 0.05) y m

uy significativa los días 30y

33 (p< 0.001).A

l final del tratamiento (día 12),

el desarrollo de la masa tum

oral fue inhibido en el 90%

de los ratones tratados con PBC

A-D

OX

. Finalm

ente, no se apreció toxicidad alguna en el grupo de anim

ales tratado con PBC

A-D

OX

.

Figura 2.

Actividad

antitumoral

de PB

CA

-D

OX

(equivalente a

10 m

g/Kg)

yde

una solución de D

OX

(10 mg/K

g), comparado con

el grupo

control (suero

salino) y

el grupo

placebo (PBC

A). Figura insertada:

ejemplo de

masas tum

orales de los grupos tratados con PB

CA

-DO

X y D

OX

(t = 33 días).

Conclusiones:

Hem

os desarrollado

un procedim

iento reproducible para la síntesis de nanopartículas PB

CA

-DO

Xadecuadas para la

administración

parenteral. Los

resultados obtenidos en los estudios preclínicos realizadosabren una interesante vía para el

tratamiento

eficaz del cáncer de mam

a.

Referencias:

(1)D

avis ME et al. N

anoparticle therapeutics: an em

erging treatment m

odality for cancer. N

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rug Dicov. 2008;7(9): 771-82.

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advances and pharmacologic developm

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acol. Rev. 2004;56(2):185-229.

(3)A

rias JL. Drug targeting strategies in cancer

treatment: an overview

. Mini R

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Arias

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Vauthier C

et al. Drug delivery to resistant

tumors:

the potential

of poly(alkyl

cyanoacrylate) nanoparticles.

J. C

ontrol. R

elease 2003;93:151-60.

Agradecim

ientos:Proyectos FIS 11/02571 y

FIS 11/01862 (Instituto de Salud Carlos III,

España).

SISTE

MA

S SUPR

AM

OL

EC

UL

AR

ES D

E PO

LO

XA

MIN

A-C

ICL

OD

EX

TR

INA

-SIMV

AST

AT

INA

C

OM

O PR

OM

OT

OR

ES D

E D

IFER

EN

CIA

CIÓ

N D

E C

ÉL

UL

AS M

AD

RE

A O

STE

OB

LA

STO

S. S.M

.N. Sim

ões 1,2, F. Veiga

1,2, J.J. Torres-Labandeira3, A

.C.F. R

ibeiro4, A

. Concheiro

3, C. A

lvarez-Lorenzo

3

1Departm

ent of Pharmaceutical Technology and 2C

entre for Pharmaceutical Studies, Faculty of

Pharmacy, U

niversity of Coim

bra, Portugal.3D

epartamento de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica,

Facultad de Farmacia, U

niversidad de Santiago de Com

postela, España. 4Departm

ent of Chem

istry, Faculty of Sciences and Technology, U

niversity of Coim

bra, Portugal.

Introducción: La

elevada prevalencia

de enferm

edades degenerativas y accidentes obliga a

prestar una

atención creciente

a procedim

ientos de

regeneración de

hueso y

cartílagoque resulten una alternativa eficaz a

los trasplantes.

Adem

ás de

los andam

iajes rígidos

cargados con proteínas morfogénicas, en

el tratam

iento de

defectos críticos

pueden resultar

muy

útileslos sistem

assem

isólidos inyectables

que adquieren

una consistencia

elevada al entrar en contacto con el medio

fisiológico. Estos sistemas se pueden im

plantar por procedim

ientos mínim

amente invasivos, con

lo que la cicatrización es más rápida y el riesgo

para los pacientes es menor. R

ecientemente, se

ha observado quelos copolím

eros de poli(óxido de etileno) (PEO

) y poli(óxido de propileno) (PPO

) de

la fam

ilia de

las poloxam

ina (Tetronic

®) pueden

dar lugar

a sistem

as de

gelificación in

situ[1]

biocompatibles

con osteoblastos

y capaces

de actuar

como

implantes

de cesión

sostenida de

proteínas m

orfogénicas [2]. Adem

ás, algunas variedades de poloxam

ina, como el T908, presentan por sí

mism

as actividad osteoinductora, dandolugar in

vitroa una notable proliferación de células

madre

que, en

unos días,

se diferencian

a osteoblastos y form

an matriz m

ineralizada[2].

Otra alternativa a las

proteínas morfogénicas y

que tam

bién busca

reducir los

costos del

tratamiento,

es el

fármaco

hipolipemiante

simvastatina

que, en un estrechointervalo de

concentraciones,puede inducir la regeneración

ósea [3]; si bien es muy hidrofóbico y difícil de

formular. El objetivo de este trabajo es diseñar

sistemas

inyectables viscoelásticos

que com

binen una elevada retención en eldefecto

crítico conla capacidad osteoinductora de la

poloxamina

T908y

la sim

vastatina. Para

optimizar

la concentración

del copolím

ero bloque,se ensayó el efecto de la incorporación de

-ciclodextrina -C

D),

que puede

engarzarse enlos bloques PEO

y actuar de enlace

entre los

de cadenas

adyacentes, increm

entando de

forma

muy

notable la

viscoelasticidad del entramado [4].

Materiales y M

étodos:Preparación

de los

geles. A

partir

de disoluciones de T908 (B

ASF, A

lemania) y de

-

CD

(Wacker, A

lemania) en tam

pón fosfato se prepararon m

ezclas cubriendo entre 1 y 13% de

T908 y de 0 a 9.7% de

-CD

, y se almacenaron

a 4, 20 y 37ºC.

Reología. Se

registraron los

módulos

de alm

acenamiento (G

’) y de pérdida (G’’) de los

geles a 0.5 Pa en el intervalo de 0.5a

50 rad/s usando una geom

etría cono-plato(6 cm

, 2º) a 10, 25 y 37 ºC

en unR

heolyst AR

-1000N (TA

Instrum

ents, UK

).H

ET-CAM

test.La biocompatibilidad se evaluó

depositando 0.3 ml de gel en la m

embrana

corioalantoidea de huevos incubados siguiendo el protocolo IC

CV

AM

[5]. Solubilización de

simvastatina.

Se incorporó

fármaco en exceso a 5 m

l de gel y los sistemas

se mantuvieron a 25

ºC y 50 rpm

durante 5 días. A

continuación, los sistemas se filtraron, la

concentración total de simvastatina disuelta se

cuantificó espectrofotométricam

ente a 239 nm

(Agilent

8453, A

lemania)

y su

estabilidad quím

ica se valoró mediante H

PLC a 238 nm

utilizando una colum

naLiC

hroCA

RT R

P-C18

(3.9 x 150 mm

, 5 M

) a 25 ºC, y

acetonitrilo:28 m

M tam

pón fosfatopH

4 (65:35, 1 mL/m

in) com

o fase

móvil isocrática Los tiem

pos de retención de las form

as hidroxiácida y lactona fueron 3

y6 m

in, respectivamente.

Cesión de sim

vastatina. Se depositaron 2 ml de

gel en el compartim

ento dador de células Franz-C

hien y 6 ml de tam

pón fosfato pH 7.4 en el

receptor.C

omo

separador se

utilizó una

mem

brana de acetato de celulosa (0.45 m

, 0.785 cm

2). A intervalos de tiem

po, se retiraron

por HPLC

. Actividad

fosfatasa alcalina

(ALP).Se

sembraron

células m

adre m

esenquimales

derivadas de tejido adiposo humano (Stem

Pro, Invitrogen, U

SA) en placas de 6 pocillos (3x10

4

células/pocillo, 2.5

mL)

y sobre

soportes Transw

ell se añadieron de T908 (4 y

8%)/

-CD

(0 y 5%) geles conteniendo o no

simvastatina (0.08 y 8.5

M). C

omo controles

negativo y positivo se utilizaron las células en m

edio de

cultivo y

en m

edio osteogénico,

respectivamente.

Tras 3,

7 y

12 días

de incubación,

se determ

inó la

ALP

[2].La

proliferación celular se determinó m

ediante un ensayo M

TT [2].

Resultados y D

iscusión: Preparación

de los

gelesy

caracterización reológica.

La poloxam

ina T908

da lugar

a sistem

as de gelificación in situa 37ºC

cuando su concentración es del 20%

. La incorporación de -C

Dal

5-7%

permitió

obtener geles

viscoelásticos con tan sólo el 1% de T908

(Figura 1). Los geles se formaron en pocas

horas a 4 ó 20ºC

, resultando estables durante al m

enos un mes. Proporciones m

ás bajas de -C

Do incubación a 37

ºC dio lugar a fenóm

enos de separación de fases.Todos los geles presentaron una elevada citocom

patibilidad en el test HET-

CA

M.1

10100

10-3

10-2

10-1

100

101

102

103

104

105

106

G' y G'' (Pa)

Frecuencia angular (rad/s)

G' 1% T+ 0%

CD G'' 1%

T+ 0% CD

G' 4% T+ 0%

CD G'' 4%

T+ 0% CD

G' 8% T+ 0%

CD G'' 8%

T+ 0% CD

G' 1% T+ 5%

CD G'' 1%

T+ 5% CD

G' 4% T+ 5%

CD G'' 4%

T+ 5% CD

G' 8% T+ 5%

CD G'' 1%

T+ 5% CD

Figura 1.M

ódulos de almacenam

iento (G’) y

de pérdida (G’’) de dispersiones de T908 al 1, 4

y 8% en ausencia y en presencia de

-CD

al 5%.

Solubilización y cesión de simvastatina.

Las dispersiones de

-CD

y T908 presentaron una elevada capacidad para

solubilizar simvastatina,

incrementando su

solubilidad aparente en PBS

entre 3

y 12

veces.A

demás,

los geles

sostuvieron la cesióndurante varios días (Figura

2).

024

4872

96120

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

Simvastatina cedida (mg/cm2)

Tiempo (horas)

1% T908 + 0%

CD

2% T908 + 0%

CD

1% T908 + 5%

CD

2% T908 + 5%

CD

Figura 2.Perfiles de difusión de sim

vastatina en PB

S a partir de dispersiones de T908 al 1 y 2%

en ausencia y en presencia de -C

Dal 5%

.

Actividad fosfatasa alcalina(ALP). El estudio

con células madre m

esenquimales se inició

con un screening de concentraciones de sim

vastatina (0.08 a

equivalente a 0.01 a en el

medio de cultivo) con el fin de identificar la que

da lugar a valores de ALP m

ás elevados. Apartir

de los

resultados de

este estudio

se seleccionaron

0.08 y 8.5sim

vastatinapara

incorporarla en los geles. Los estudios con células m

adre mesenquim

ales confirm

aron la elevada citocompatibilidad y el

efecto osteoinductor de las dispersiones de T908 y revelaron que la presencia de sim

vastatina aum

enta aúnm

ás la ALP

(Figura 3).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

Actividad fosfatasa alcalina (nmol/min/mg proteina)

Tiempo (dias)

C -C +

4 T9084 T908 + 0.08 SV

4 T908 + 8.5 SV4 T908+ 5 CD

4 T908+ 5 CD + 0.08 SV4 T908+ 5 CD + 8.5 SV

37

12

Figura 3.A

ctividad ALP de células m

adre m

esenquimales en m

edio de cultivo (control negativo), m

edio osteogénico estándar (control positivo) y m

edio con T908 al 4%, sin y con

-C

Dal 5%

, y sin y con simvastatina a dos

concentraciones diferentes.

Conclusiones: La com

binación de poloxamina

con -C

Dy sim

vastatina da lugar a inyectablesde elevada citocom

patibilidad y con actividad osteogénica, con propiedades reológicas y de cesión fácilm

ente modulables.

Referencias:

(1) C

. A

lvarez-Lorenzo et

al. Poloxam

ine-based nanom

aterials for drug delivery. Frontiers Biosci.,

2:424-40 (2010)(2) A

. Rey-R

ico y col. Osteogenic efficiency of in

situ gelling poloxamine system

s with and w

ithout bone m

orphogenetic protein-2. Eur. Cells M

ater.,21:317-40

(2011)(3) J. Pagkalos et al. Sim

vastatin induces osteogenic differentiation of m

urine embryonic stem

cells. J. B

one Min. R

es., 25:2470-8 (2010)(4) S.M

.N. Sim

ões et al. Syringeable Pluronic–-

cyclodextrin supramolecular gels for sustained

delivery of

vancomycin.

Eur. J.

Pharm.

Biopharm

., 80:103-12 (2012). (5) N

ICEA

TM-IC

CV

AM

. In vivo test methods for

detecting ocular

corrosives and

severe irritants.http://iccvam

.niehs.nih.gov/methods/ocut

ox/ivocutox.htm (2012).

Agradecim

ientos:Trabajo financiado por la X

unta de Galicia

(10CSA

203013PR),

FEDER

y

MIC

INN

(SA

F2011-22771). S.M.N

. Simões agradece la

beca Praxis

SFRH

/BD

/48324/2008de

FCT

Portugal.

NA

NO

PAR

TÍC

UL

AS D

E PO

LI-C

APR

OL

AC

TO

NA

CO

MO

SISTE

MA

DE

LIB

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IÓN

C

ON

TR

OL

AD

A D

E FÁ

RM

AC

OS PA

RA

APL

ICA

CIÓ

N T

ÓPIC

A.

A.M

elero1,2,A

. Ourique

3,A. Pohlm

ann3,5, S. G

uterres 3,4, R. B

eck3,4,

U

.F. Schaeffer 2

1Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica. Universidad de V

alencia, España.2D

epartment of B

iopharmacy and Pharm

aceutical Technology. Saarland University. G

ermany.

3Programa de Pós-G

raduação em N

anotecnologia Farmacêutica, U

niversidade Federal do Rio G

rande do Sul, Porto A

legre, RS, B

razil

4Programa de Pós-G

raduação em C

iências Farmacêuticas, Faculdade de Farm

ácia, Universidade Federal

do Rio G

rande do Sul, Porto Alegre, R

S, Brazil

5Departam

ento de Quím

ica Orgânica, Instituto de Q

uímica, U

niversidade Federal do Rio G

rande do Sul, Porto A

legre, RS, B

razil.

Introducción: C

lásicamente,

la vía

de adm

inistración tópica se ha utilizado para tratarpatologías locales o m

odificar el aspecto de la piel. La piel hum

ana conforma una barrera que

protege de forma m

uy efectiva al organismo

frente a la entrada de xenobióticos, de forma

que la mayoría de los fárm

acos no son capaces de atravesarla

en cantidad suficiente para dar lugar a un efecto sistém

ico. En las últimas

décadas, sin embargo,

se ha demostrado que

determinados fárm

acos pueden difundir a su través hasta generar niveles plasm

áticos de fárm

aco suficientespara dar lugar a un efecto

terapéutico sistémico, e incluso, toxicidad en

algunos casos. Este fenómeno representa un

problema im

portante para el tratamiento local.

Es el

caso de

la tretinoína,

fármaco

muy

efectivo en casos de acné, dermatitis crónica o

psoriasis 1pero

que presenta

una gran

teratogenia, de forma que las pacientes deben

también

recibir terapia

anticonceptivasuplem

entaria, con

sus subsecuentes

efectos indeseados. Si adem

ás la aplicación de este fárm

aco ha de ser crónica, la calidad de vida de los pacientes puede verse m

uy afectada. La m

ometasona

es un

corticoide m

uy utilizado

también en casos de psoriasis o eccem

a, en que las áreas de aplicación pueden ser m

uy extensas y, por tanto, el acceso de fárm

aco a sangre alto. Los

corticoides, a

su vez,

pueden producir

efectos secundarios muy graves que afecten al

metabolism

o y

reduzcan las

defensas del

sistema inm

unitario.En

este trabajo,

se presenta

una form

a farm

acéutica de

liberación controlada

para fárm

acos lipófilos de aplicación tópica, como

son tretinoína

o m

ometasona,

basada en

la encapsulación

de fárm

aco en

partículas polim

éricas de poli-caprolactona y formuladas

como

hidrogel. El objetivo de este tipo de form

ulación es

conseguir la

liberación controlada

de fárm

aco para

aumentar

su perm

anencia en

la piel,

el tejido

diana, y

retardarla

absorción sistém

ica de

grandes cantidades de fárm

acode form

a rápida, con el

fin de

disminuir

los efectos

sistémicos

indeseados 2. M

ateriales y Métodos:

Para cada fármaco, se

formularon

tres lotes

diferentes de

nanopartículasen suspensión por el m

étodo de deposición

interfacial de

Fessi 3.Las

nanocápsulas se caracterizaron en términos de

tamaño, polidispersión, y m

orfología.Para cada fárm

aco se prepararó un hidrogel con el fármaco

en suspensión

y otro

con el

fármaco

encapsulado, conteniendo

ambos

una concentración final de 0.05%

. En el caso de la tretinoína, el gel se preparó utilizando carbopol (0.5%

). Para la mom

etasona, se utilizó hidroxi-etil-celulosa al 2%

. Se realizaron ensayos de perm

eabilidad a través de epidermis hum

ana separada por calor a partir de los hidrogeles, utilizando células de difusión estáticas de tipo Franz. A

demás, se estudió

la permeabilidad de

fármaco a partir de una solución de fárm

aco yuna

suspensión de

nanopartículas, a

título com

parativo.Los

ensayos se

realizaron en

condiciones de dosis infinita, 32ºC, agitación a

500 rpm, utilizando PB

S pH 5.5/etanol (50:50)

como

solución receptora,

para asegurar

las condiciones sink

2,4. Por últim

o, se realizaron estudios de penetración de fárm

aco a partir del gel de mom

etasona y del gel de partículas de m

ometasona, m

ediante las técnicas de tape-stripping y criosección

5. R

esultados y

Discusión:

Las partículas

obtenidas presentaron forma esférica, incluso

después de ser incorporadas al gel (figura 1), un tam

año de

alrededor de

200 nm

, con

una polidispersión

inferior al

0.2, considerada

adecuada para este tipo de nanopartícula2.

Enlos estudios de perm

eabilidad, se puede observar en am

bos casosuna dism

inución de la perm

eabilidad de fármaco form

ulada en forma

de nanocápsula o de hidrogel respecto a la solución (figuras 2

y3). El efecto es m

ucho más

acusado en el caso de la tretinoína (figura 2).A

demás,

en este

caso, la

encapsulación de

fármaco

permite

un control

mayor

de la

permeabilidad

de tretinoína

respecto del

hidrogel, independientem

ente de

si se

incorporan al hidrogel.En el caso de la m

ometasona, este efecto se

reproduce (figura 3). Si bienlas form

ulaciones con las nanocápsulas

en suspensión presentanuna

permeabilidad

ligeramente

superior respecto

al hidrogel,

las diferencias

no son

significativas.Adem

ás, se pudo comprobar por

microscopía

la form

ación de

cristales de

fármaco dentro de la estructura del gel, que

actuarían com

o reservorio

de fárm

aco. Este

efecto, junto con el efecto de la matriz del gel,

controlaría la liberación final de fármaco. Sin

embargo, el efecto de las nanocápsulas en el

control de la liberación de fármaco es m

ayor, independientem

ente de la formulación utilizada.

Figura 1: Imagen de un hidrogel conteniendo nanocápsulas

de mom

etasona [escala = 100 nm (300,000x)].

Figura 2.Perfiles de permeabilidad de tretinoína a partir de

las distintas formulaciones. M

ometasone

Time (h)

05

1015

2025

30

Permeated Cum Amount/area ( g/cm²)

0 1 2 3 4

MF-Solution

MF-H

GM

F-NC

-HG

MF-N

C-Suspension

Figura 3.Perfiles de permeabilidad de m

ometasona a partir

de las distintas formulaciones.

Figura 4:Distribución de m

ometasona en las distintas capas

de la piel.En

la figura

4se

presentan los

resultados obtenidos

por tape-stripping

con la

mom

etasona. Se comprueba que tras

un periodo de incubación de 2 h, el fárm

aco satura el estrato córneo y perm

ite el paso a capas más

profundas de la piel, siendo mayor en el caso

del hidrogel. Estos resultados complem

entan y son

consistentes con

los obtenidos

en los

ensayos de permeabilidad.

Conclusiones:

Los ensayos

realizadosdem

ostraron que

lasnanocápsulas

de poli-

caprolactona preparadas con ambos fárm

acos presentan

características físico-quím

icas adecuadas para su inclusión en form

ulaciones tipo hidrogel y que son efectivas para el control de

la adm

inistración de

fármacos

de form

a tópica sobre la piel, resultando en form

ulaciones que

producen una

mayor

permanencia

de fárm

aco en

el tejido

diana y

una m

enor absorción

sistémica.

Cabe

esperar de

estos resultados pues una m

ayor eficacia y una menos

aparición de efectos sistémicos adversos.

Referencias:

(1) B

risaertM

.G.,

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Plaizier-V

ercamm

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. Schneider. K

. Turksen (Ed.), Permeability

Barrier: M

ethods and Protocols, Hum

ana Press, N

ew Y

ork (2011), pp. 33–50

Agradecim

ientos:Los

autores desean

agradecer a la fundación CA

PES por la beca de A

.O

urique, los

proyectosIN

CT_if,

CN

Pq/Brazil,

CA

PES/Brazil,

y R

ede N

anocosméticos

MC

T/CN

Pq/Brazil, así com

o el proyecto B

MB

F BR

A 09/017.Tam

bién a P. M

eiers por su asistencia técnica en los ensayos de perm

eabilidad.

Tretinoin Permeation through H

HSE

Time (h)

05

1015

2025

3035

0 5 10 15 20 25

Solution Suspension-ncG

el-ncG

el-no-nc

AC

QU

IRIN

G K

NO

WL

ED

GE

ON

AN

TIB

AC

TE

RIA

L E

FFEC

T O

F BIO

AC

TIV

E G

LA

SS BY

NE

UR

OFU

ZZY

LO

GIC

M.M

. Echezarreta, M. Landin

Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Facultad de Farmacia, U

niversidad Santiago de C

ompostela, 15782, Santiago de C

ompostela, A

Coruña

Introduction:B

ioactive glasses

(BG

) are

special systems com

posed by SiO2 , C

aO, P

2 O5 ,

and NaO

that show bioactive behaviour due to

their ability of bonding soft and hard tissues through com

plex reactions(1). B

Gs have been

employed

for clinical

use for

a variety

of m

edical applications,

including surgical

orthopaedics and dentistry. B

acterial colonisation of the used materials is

the most im

portant reason of failure of thesesurgeries.A

ntibacterialproperties of B

Gs have

been studied by different authors(2). The

wide

variety of biomaterials and conditions (bacteria

and antim

icrobial conditions

or glass

pretreatment)

in those studies hinder general conclusions

beingobtained

onthe

specific factors that influence the bactericidal capacity and the best com

bination of characteristics in achieving the m

aximum

antibacterial effect.A

rtificial intelligence tools allow the treatm

ent of historical data and finding general or new

patterns from

a datasetin a process named “data

mining” (3).In particular, the

neurofuzzy logic(N

FL)approach combines the adaptive learning

capabilities from artificial neural netw

orks with

the generality of representation from fuzzy logic

through sim

ple rules.

NFL

has proven

its usefulness

in m

odelling com

plex non-linear

relationships hidden

in data,

giving higher

accuracy in prediction than classical statistics and

helping the

understanding of

thoserelationships betw

een variables (3).The aim of

this study was to establish general conclusions

about BG

antibacterial effect from an extensive

database from literature,

findingthe specific

factors that influence the results of bactericidal capacity

of B

Gs

experiments

using N

FLapproach M

aterials y Methods:

A large database (348

facts) on antimicrobial

properties of

several bioactive

glasses w

as generated from

10 previously published articles from

2000 to 2010.The grow

th index was

modelled

using 21 variables or inputs thatcan

be classified

intothree

groups. B

Gs

characteristics [production

method,

BG

s

composition regarding com

poundconcentration

(SiO2 , C

aO, N

a2 O

, P2 O

5 , MgO

, K2 O

, Al2 O

3 ,B

2 O3 , A

g2 O

, CuO

) (w/w

%), particle size (

m),

morphology as nanoparticles, pow

der, particles and

fibresand

BG

concentration

(mg/m

L)].B

acterial characteristics [microorganism

specie including S. aureus, S. epiderm

idis, E. faecalis, E.

coli, P.

aeruginosa and

S.typhi,

and m

orphology (bacillus

orcoccus)]

and m

icrobiological experim

ental conditions

[bacterial concentration (CFU

/mL), culture tim

e (h) and culture m

edia (buffered solutionsand

nutrient solution)]. The output recorded w

as the growth index

(GI),

measured

as a

function of

the num

ber of

survival bacteria colonies. Absence of grow

th (G

I= 0)

indicates bactericidal

effect. V

ery sparse, sparse and m

oderate values of GI (G

I=1 betw

een 0-5 colonies, G=2 betw

een 5-50 and G

=3 betw

een 50-300

colonies, respectively

indicate moderate grow

th. The growth index of

4 (>300

colonies) indicates

no effect.

Com

mercial N

FLsoftw

are, FormR

ules v3.31 (Intelligensys Ltd, Stokesley, U

K) w

as used. The training process w

as conducted, in the same

way, as reported previously by other authors (4).

Results and D

iscussion: The com

mon factor in the published studies on

antibacterial properties

of B

Gs

is the

great variability in the conditions used w

ith regard to the bacteria types, com

positions and sizes of B

Gs as w

ell as microbiological param

eters used. In this situation to establish general conclusions on

the optim

al B

Gs

properties to

assure antibacterial activity is a com

plex task.The 21 inputs and the corresponding grow

th index reflect the m

ain variables (independent and dependent) included in the articles from

literature. The large database on antibacterial properties of B

Gs m

aterials was successfully

modeled (train set r 2

= 76.31, computed f-

ratio=5.81 w

ith 19

and 348

f.d., <0.01)

allowing the selection of the critical factors or

inputs which accurately explain the variability

of the growth index, selected as output.

Fig.1 presents the four sub-models considered

by NFL to explain the G

I variability and the inputs included by them

. It is interesting to note the reduced num

ber of inputs, five (SiO2

and A

g2 O

concentration, BG

concentration, bacteria specie and bacteria concentration) out of the tw

enty one that NFL

hadselected as the ones

having an important effect on the grow

th index

or, in

other w

ords, enough

to explain

GI

variability. Therefore, the sub-models

generated pointing out a significant input interaction of SiO

2and B

G concentration (in purple) as the

main

effect and

the interaction

of B

G

concentration and bacteriaspecie, the single

effects of

Ag

2 O

and bacteria

concentrations affecting grow

th index (Fig. 1).

Figure 1. Submodels w

ith indication of significant inputs that explain variability of growth index (G

I) and set of IF…

THEN

rules and corresponding confidencelevelsgenerated by N

FL

NFL

technology allows a set of “IF…

.THEN

” rules per sub-m

odel with their corresponding

mem

bership degrees to be generated(3). U

sing those

rules, N

eurofuzzy generates

understandable and reusable knowledge on the

antibacterial activity of BG

s.The

meaning

of Low

, M

edium

and H

igh depends on the range of dataset values for variables

BG

,A

g2 O

,bacteria

and SiO

2concentrations (explanation at reference 3).Surprisingly,

antibacterial effect

cannot be

explained by particle size or production method

as indicated by other authors. BG

bactericidal effect

depends m

ainly on

BG

chemical

composition and its dissolution properties in the

surrounding medium

. Model indicates that B

G

has no effect when its concentration in the

experiment is low

and the silicon concentration is m

edium or high (subm

odel 1, rules 2 and 3) or the B

G concentration is high and the silicon

concentration is also high (submodel 1, rule 6).

Our findings agree w

ith previous authors which

correlate BG

antibacterial properties with the

imm

ediate release

of alkaline

species. The

higher the silicon concentration the lower the

alkaline species

that can

be release

to the

medium

and the lower its bactericidal effect.

From our results, it can also be deduce that

silver is

decisive for

the B

G

antibacterial

activity (subm

odel 2,

rule 8).

Its effect

is confirm

ed w

hen the

Ag

2 O

concentration is

higher than 1.5%.

The significant effect of the interaction, BG

s concentration and the bacterial specie points out differences

in the

susceptibility of

bacteriatreatm

ent with B

Gs, E. faecalis

and S. typhibeing the m

ost resistant species (submodel 3,

rules 9, 10 and 14). Those differences can be explained by variations in the structure and/or association of bacteria.C

onclusions: N

FLw

as able

to m

odel an

extensive database

of historical

results on

bioactive glasses,

to determ

ine the

critical variables that explain their

antibacterial activity and to present conclusions in an explicit form

at. R

eferences : (1)

Hench

et al., J Biom

ed Mater R

es.5,

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(2)B

ellantone et al., Antim

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Gallego

et al.

http://ww

w.intechopen.com

/books/show/title/artificial-

neural-networks-m

ethodological-advances-and-biom

edical-applications(4)

Landin et al., Eur. J. Pharm. Sci

38, 321-331, 2009.

Acknow

ledgements

This w

ork w

as supported

by the

POC

TEP0330IB

ERO

MA

RE1P project, FED

ER

Long-term

controlled brain delivery of microencapsulated G

DN

F induces functional and structuralrecovery

of the dopaminergic nigrostriatal pathw

ay in parkinsonian monkeys

E. Garbayo

1,E. Ansorena

2, H. Lana

1, J.L. Lanciego3, M

.J. Blanco-Prieto

1

1Pharmacy and Pharm

aceutical TechnologyD

epartment, U

niversityofN

avarra, Spain2B

iochemistry &

Molecular B

iologyD

epartment, U

niversity of Navarra, Spain

3Neurosciences D

ivision,CIM

A, U

niversity of Navarra, Spain

Introduction:G

lial cell

line-derived neurotrophic

factor (G

DN

F), a

promising

therapeutic agent for Parkinson’s disease (PD),

is a naturally occurring protein found in the brain

that prom

otes dopam

inergic neurons

growth, regeneration and protection. D

ifferent approaches

comprising

cell grafts,

gene therapies

and direct

delivery m

ethods using

infusion pum

ps have

been attem

pted (1).

Results obtained in PD

animal m

odels were

confirmed by tw

o phase I trials carried out in PD

patients (2-4). These studies consisted on the

intraputaminal

delivery of

the ‘naked’

protein through an infusion pump. H

owever, by

using a similar approach, a double blind phase II

trial did not confirm earlier expectations and

GD

NF w

as withdraw

n from clinical trials due to

lack of efficacy and safety concernssuch as the

appearance of

blocking antibodies

against exogenous unglycosylated G

DN

F (5). Efficient G

DN

F brain

concentrations using

existing delivery m

ethods require repeated injections or pum

p reservoir refilling and are difficult to sustain, due to protein degradation in solution and

to GD

NF low

penetration when injected

intracerebroventricularly.G

DN

F encapsulation in

biodegradable and

biocompatible

microparticles (M

P)could represent a valuable

therapeutic approach. GD

NF-M

P efficacy was

assessed by

our group

in a

PD

rat m

odel show

ing that GD

NF-M

P were

able to achieve long-term

neuroprotection and neurorestoration and dem

onstrating that MP

were an efficient

vehicle for

sustained neurotrophic

factor delivery to the brain (1,6).

Objetive

The main objective of this w

ork was

to elucidateif the controlled release of G

DN

F through M

Pdrug delivery system

s in a primate

PD anim

al model is

a useful strategy for (i) im

proving motor perform

ance and (ii) restoring the

striatum

dopaminergic

reinnervation, w

ithout leading tosafety concerns.

Material and M

ethods:H

uman

recombinant

glycosylated GD

NF expressed and purified by

our group

was

used in

these studies

(7,8). G

DN

F-MP

were prepared and characterized as

previously described (1).B

riefly, GD

NF-M

P w

ere prepared bysolventextraction/evaporation

method using Total R

ecirculating One M

achine

System

(TRO

MS)

technology.G

DN

F encapsulation

efficiency w

as quantified

by W

estern Blot. R

eleased GD

NF bioactivity w

as assessed using the PC

-12 cellline as described (1).

Anim

al handling

was

conducted in

accordance with

the European Council D

irective 86/609/EEC

. The

experimental

design w

as approved by the U

niversity of Navarra Ethical

Com

mittee for

Anim

al Testing (CEEA

/050-11)as w

ellas by the H

ealth Departm

ent from the

Navarra G

overnment (ES/31-2016-000001-U

S).Ten

adult male M

acaca fascicularism

onkeys w

ere used in the study.A

nimal basal m

otor function

was

assessed using

clinical rating

scales (CR

S). Basal dopam

inergic function was

measured

by 11C

-(+)--dihydrotetrabenazine

positron em

ission tom

ography ( 11C

-DTB

ZPET). This radioligand binds specifically to the vesicular m

onoamine transporter and is use as a

dopaminergic

innervationm

arker.B

lood sam

ples were obtained at various point tim

es before and after treatm

ent to evaluate serum IgG

antibody response against G

DN

F. In order to evaluate fine m

otor skills, animals w

ere trained on a hand-reach test. To create the anim

al m

odel, prim

ates w

ere lesioned

with

the dopam

inergic neurotoxin

1-methyl-4-phenyl-

1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP). M

PTP was

weekly adm

inistered intravenously (0.5mg/kg)

until each monkey reached a stable parkinsonian

syndrome. The severity of the M

PTP-induce parkinsonism

was evaluated using C

RS

and 11C-

DTB

ZPET.O

nly macaques w

ith parkinsonian syndrom

esstables forat least 2 months after last

MPTP injection

were enrolled in the study.

Macaques

were random

ly assigned to receive unilateral adm

inistration of eitherGD

NF-loaded

MP or non-loaded M

P. Each monkey received

25G

DN

Fdivided in four

implantation

siteswithin

the putamen. A

nimal m

otor function w

as evaluated

weekly

after treatm

ent using

CR

S. In

order to

assess changes

in the

dopaminergic

terminal

integrity, the

dopaminergic function w

as measured

by 11C

-D

TBZ PET every 90 days. N

ine months after

MP

injection anim

als w

ere perfused

transcardiacally w

ith a

fixing solution

containing 4%paraform

aldehyde in 0.125 M

phosphate buffer, pH 7.4. C

oronal sections (40 w

ere used for imm

unohistochemistry

studies.

Results:

Hum

an glycosylated

GD

NF

was

successfully m

icroencapsulated in

MP

using TR

OM

S technology.

The m

ean particle

size m

easured by laserdifractom

etry was 39

mw

hichw

as totally compatible w

ith stereotaxic injection according

with previous studies.

Drug

entrapment efficiency w

as 70%. The in vitro

bioactivity assay with PC

-12 cells showed that

released GD

NF from

MP w

as biologically active.The potential neurorestorative

effect exerted by m

icroencapsulated GD

NF w

as next evaluated in a PD

primate m

odel. GD

NF dose appeared to be

well tolerated and no

apparent safety or toxicity concern after G

DN

F-MP putam

inal deliveryw

as observed. N

oneof the m

acaques showed w

eight loss, a com

mon side effect observed after G

DN

F adm

inistration.M

icroencapsulated G

DN

F im

proved bradycinesia,

rigidity and

postural instability, the m

ain cardinal PD sym

ptoms. C

RS

scores im

proved steadily

after treatm

ent in

GD

NF-treated

animals

compared

to control

animals for m

ost time periods. The perform

ance on the hand-reach task w

as also improved in

GD

NF-treated

animals.

Six-month

PET scan

showed a bilateral increase in 11C

-DTB

Z uptake in G

DN

F-MP

treated monkeys w

hile non-loaded M

P animals did not show

ed a significant change from

baseline

in 11C

-DTB

Z uptake

in either

hemisphere

(Fig1).

Fig 1: 11C-D

TBZ PET im

ages before and after treatment w

ith G

DN

F-MP

and w

ith non-loaded-M

P. G

DN

F-MP

administration

induced a

progresive increase

in the

radioligand uptake in the target areas (striatum; caudate

and putam

en).

The increasein 11C

-DTB

Z uptake was correlated

with

improvem

ents in

the C

RS.

Postmortem

analysis

confirmed

increased dopam

inergic activity

and show

ed enhanced

tyrosine hydroxilase-positive fiber innervation of lesioned putam

en (Fig 2). Further histological studies are currently

being perform

ed in

order to

fully characterize G

DN

F-MP long term

effect and to elucidate the m

echanism by w

hich GD

NF exerts

its neuroprotective/neurorestorative effect.

Fig 2: Coronal section through the prim

ate brain taken at the m

idline decussation of the anterior comm

issurelevel. (A

) Low

-power

photomicrograph

showing

the left

and right

putamen. Square areas indicated by dashed lines show

the places from

which the insets w

ere taken. (B) H

igher-power

photomicrograph

taken from

panel

A

showing

tyrosine hydroxylase-positive (TH

+) fibers density w

ithin the left putam

en following G

DN

F-loaded MP delivery. (C

) Panel illustrating the deposit of G

DN

F-loaded MP. (D

) Higher-

power photom

icrograph showing TH

+fibers density w

ithin the right putam

en. By com

paring B&D

it becomes

evidentthat G

DN

F slow release from

theM

Pinduced an increase on

dopaminergic term

inalsdensity. Such increase is m

aintained in putam

inal territories located far away from

the implanted

site.

Conclusions:

GD

NF-M

Pshow

edlong-term

neuroprotection and neurorestoration in a prim

ate m

odel of PD dem

onstrating that MP

are an efficient vehicle for sustained neurotrophic factor delivery to the brain. G

DN

F-MP m

ight be a viable therapeutic strategy for PD

patients.

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NF brain delivery using

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Acknow

ledgments: C

AN

Foundation, FUN

Estudios farm

acológicos con D-pencilam

ina: correlación de niveles plasmáticos y

cerebrales vs. eficacia clínica

Alejandro Orrico, Lucía M

artí-Prats, Mª José C

ano-Cebrián,

Luis Granero,Ana Polache y Teodoro Zornoza

Departm

entode Farm

acia y Tecnología Farmacéutica, U

niversidad de Valencia, España

Introducción:

En general la comunidad científica acepta que

las drogas

de abuso

generan cam

bios en

determinados sistem

as del cerebro que perduran largo tiem

po después de abandonar su consumo.

La naturaleza duradera de estos cambios sitúa a

los individuos adictos en un estado de elevado riesgo de recaída; de hecho, algunos autores han

estimado que el riesgo de recaída es m

ayor del 60%

en el primer año que sigue al abandono

del consumo (1).

La adicción al alcohol no es una excepción: las recaídas

en el consumo de

alcoholson

uno de

los problem

as m

ás im

portantes con los que se enfrentan tanto el paciente

alcohólico som

etido a

tratamiento

deshabituador como el equipo clínico que lo

trata.

Actualm

ente, sólo

existen tres

moléculas

autorizadas como fárm

acos anti-recaída para el tratam

iento del alcoholismo

y su eficacia clínica puede considerarse m

oderada. En los últimos

años los trabajos realizados por diversos grupos de

investigación sugieren

que el

principal m

etabolito del etanol, el acetaldehído(A

CD

), es el responsable, al m

enos en parte,de ciertos

efectos neuroconductuales que explicarían la adicción al alcohol (2). D

ada la alta reactividad del

AC

D,

la adm

inistración sistém

ica de

sustancias capacesde

reaccionarquím

icamente

con el

AC

D

- en

otras palabras,

“de secuestrarlo”

in vivo- podría, potencialmente,

suprimir

o atenuar

estos efectos

del etanol

abriendo nuevas

posibilidades para

la prevención

de las

recaídas. U

na de

estas sustancias es la D

-penicilamina (D

P): se trata de un fárm

aco ya comercializado para otros fines y

con una elevada capacidad para secuestrar alA

CD

. Nuestro grupo ya ha com

probado en trabajos previos la capacidad de esta m

olécula para suprim

ir de un modo dosis-dependiente

algunos de

los efectos

del etanol

sobre el

sistema

nervioso central.

En este

trabajo pretendem

os analizar

con m

ás detalle

su potencial uso com

o agente anti-recaída y para ello,

perseguimos

alcanzar los

siguientes objetivos:

(1)evaluarla eficacia de la D

P para prevenir las recaídas en el consum

o del alcoholen un

modelo

animal

de consum

o crónico

de etanol a largo plazo.

(2)determ

inarlas concentraciones de fárm

aco en plasm

a y en tejido cerebral que se asociancon la

eficacia farmacológica.

Materiales y M

étodos: Se em

plearon 41 ratas macho de la raza W

istar, que

se som

etieron a

unprotocolo

de alcoholización

a largo

plazoque

facilita la

manifestación de las recaídas en el consum

o (3).La recaída

puede cuantificarsea través de la

medición del conocido com

o fenómeno A

DE

(“Alcohol

Deprivation

Effect”). Todos

los experim

entos se

desarrollaron entre

la finalización del 5º

periodo de abstinenciay el

comienzo

del siguiente

periodo de

re-exposición.

Los anim

ales contaban

en ese

mom

ento con un historial de consum

o de aproxim

adamente 9-10 m

eses.El consum

o de alcohol m

ostrado por cada animal siem

pre se expresa com

o gr de etanol/kg/día

Experimento 1: Efecto de la adm

inistración subcutánea de D

P en el fenómeno AD

E.A

cada animal se le im

plantó quirúrgicamente,

dos días antes de la reintroducción deletanol,

una mini-bom

ba osmótica A

LZET®

2ML1

anivel

subcutáneo. C

ada bom

baliberó

avelocidad constante y durante una sem

ana una de las siguientes soluciones: A

gua (n=8), DP

0.25m

g/h (n=9) oD

P 1 mg/h (n=8).La ingesta

basal se

determinó

a partir

de la

media

aritmética del consum

o de etanol cada 24 horas cuantificado durante los tres días previos al com

ienzo del

quinto periodo

de abstinencia

(valores “B1 ”, “B

2 ” y B3

de la figura 1A). El

consumo de alcohol tras

la re-exposición del anim

al al mism

o, se cuantificó durante 4 días (post-abstinence daysen la

Figura 1A).

Figura 1. (A) Protocolo seguido en el experim

ento 1. (B)

Protocolo seguido en el experimento 2.

Experimento 2: D

eterminación de niveles de D

P en plasm

a y cerebro.Los anim

ales empleados en este experim

ento fueron

sometidos

al m

ismo

protocolo de

alcoholizacióny

quirúrgicoanteriorm

ente descrito.

Un

total de

16anim

ales fueron

utilizados para determinar la concentración de

DP en plasm

a y cerebro tras la administración

subcutánea de DP a las velocidades de 0.25

mg/h

(n=8) y 1mg/h (n=8). Las concentraciones

de DP

se determinaron los días 2 (subgrupo

n=4) y

7(subgrupo

n=4)después

de la

implantación de la bom

ba, correspondiendo a los días 0 y 5 post-abstinencia

del experimento

1 (ver Figura 1B).Las m

uestras de sangre (0.2-0.3

ml)

se recogieron

conjeringuillas

heparinizadas a

las 12:00

a.m.

del día

correspondiente. Tras el muestreo de sangre, las

ratas fueron inmediatam

ente sacrificadas con objeto de m

uestrear dos regiones distintas delcerebro (cerebro

anterior y cerebro medio) que

fueron procesadas

en el

mom

entopara

su análisis. El análisis de las m

uestras empleó un m

étodo crom

atográfico de

HPLC

con

detección electroquím

ica desarrollado

en nuestro

laboratorio a partir de dos protocolos anteriores (4,5).

El límite de detección del m

étodo se estableció en

0.004 g/m

l.Para el análisis de los datos se em

pleó un A

NO

VA

m

ixto seguido

por la

prueba de

Bonferroni

cuando se

detectaron diferencias

significativas.

Resultados y D

iscusión.

Experimento 1: Efecto de la adm

inistración subcutánea de D

P en el fenómeno AD

E.Los cuatro días posteriores a la re-introducción tras

el quinto

periodo de

abstinencia observam

os el típico incremento en el consum

o de alcohol indicativo del fenóm

eno AD

E en el grupo control

(Figura 2A). A

parentemente la

administración de D

P redujo el AD

E de forma

dosis-dependiente. El AN

OV

Am

ixtoconfirm

ó una

interacción significativa

(F(8,88)=2.24;p=0.031). El análisis post-hoc dem

ostró que sólo la adm

inistración subcutánea de DP

1mg/h

fue capaz de suprimirel A

DE durante los cuatro

días post-abstinencia. No ocurrió esto con la

dosis de DP 0.25 m

g/h.La preferencia por el etanol total y el consum

o total de líquido se m

uestra en la Figura 2By 2C

respectivamente. C

omo se puede observar, tras

dos semanas de abstinencia la preferencia se vio

incrementada significativam

ente (F(8,88)=3.74;p=0.02) en los grupos control y D

P 0.25 mg/h

respecto a su basal. Sin embargo, los anim

ales tratados con la dosis grande de D

P no mostraron

cambios significativos en ninguno de los 4 días

post-abstinencia (p=0.877,

p=0.154, p=0.973

and p=0.505).Finalm

ente, la ingesta líquida total (Figura 2C

) no se vio modificada.

Figura 2.R

esultados del experimento 1.

(A)

Ingesta de ettanol, (B

) preferencia de etanol e (C) ingesta total líquida.

Los datos son valores medios

e.e. Los asteriscos reflejan diferencias

significativas respecto

al basal

(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

Las diferentesletras (a,b) indican

diferenciassignificativas

respecto a los grupos en cadadía

post-abstinencia. (p<0.05).

Experimento 2:

Niveles de D

P en plasma y

cerebro.

Los niveles de DP en plasm

a oscilaron entre 0.4-0.5

g/ml en plasm

a en los días 2 y 5 para el grupo D

P 0.25mg/h

y entre 2.8-4.3 g/m

lpara el grupo D

P 1mg/h. Para los dos velocidades de

infusión ensayadas,los nivelesplasmáticosen el

díade m

uestreo 5 tendieron a ser superiores a los

obtenidos en

el día

2, aunque

no se

detectarondiferencias significativas.

Por otro lado, no sedetectó D

P en cerebro de los

animales

del grupo

DP

0.25 m

g/h, independientem

ente de laregión

analizada. Sin em

bargo, en el grupoD

P 1mg/h, los niveles de

DP en cerebro constituyeron alrededor del 2-3%

de los encontrados en plasm

a.

Referencias:

(1) McLellan et al.The journal of the A

merican M

edical A

ssociation.284:1689-1685. (2000)(2) C

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reuzig and Frank. Journal of chromatography.

218:615-620(1981)

MO

DE

LO

S BA

SAD

OS E

N R

EG

LA

S Y Q

SPRPA

RA

LA

PRE

DIC

CIÓ

N D

E L

A PE

RM

EA

BIL

IDA

D E

N C

AC

O-2.

M.A

. Cabrera-Pérez

1,2,3, H. Pham

-The

1,M. B

ermejo

2, I. González-Á

lvarez2y T

. Garrigues 3

1Group of M

olecular Simulation &

Drug D

esign, Center of C

hemical B

ioactives. Central U

niversity of Las Villas, C

uba.2D

epartment of Engineering, A

rea of Pharmacy and Pharm

aceutical Technology, Miguel H

ernández University, Spain.

3Departm

ent of Phamacy and Pharm

aceutical Technology, Faculty of Pharmacy,V

alencia University, Spain.

Introducción:La

permeabilidad

intestinal es

una propiedad farm

acocinética relacionada con el proceso de absorción

y desem

peña un

papel im

portante en

el descubrim

iento y desarrollo de nuevos fármacos y en los

estudios de bioequivalencia de compuestos genéricos.

Las células Caco-2 es un m

étodo in vitro,de bajo costo y con una alta capacidad de cribado, que se utiliza para el estudio de la perm

eabilidad intestinal (1). Por otro lado, los m

étodos in silicohan sido am

pliamente utilizados

para predecir la permeabilidad intestinal y aunque varios

modelos han m

ostrado adecuados valores de exactitud y precisión en la predicción de esta propiedad, su uso práctico ha estado lim

itado debido a la utilización de bases de datos pequeñas, la alta variabilidad de los datos de perm

eabilidad y la pobre validación externa. En este sentido los objetivos del estudio son: 1- D

esarrollar reglas, basadas en propiedades m

oleculares simples, y

modelos de relación cuantitativa estructura-propiedad

(QSPR

) para clasificar la permeabilidad intestinal en

células C

aco-2 y

2- V

alidar las

predicciones com

putacionales utilizando

un set

externo de

compuestos.

Materiales y M

étodos: Se colectó la mayor base de

datos pública

de com

puestos con

valoresde

permeabilidad

en C

aco-2 (

1300 com

puestos) y

se utilizó para el desarrollo de los m

odelos in silico.D

os

valores de corte se utilizaron para dividir la data en com

puestos con ALTA

(H), M

OD

ERA

DA

(M) y B

AJA

(L) perm

eabilidad: Papp20x10

-6cm/s (M

etoprolol,alta perm

eabilidad) y Papp<

0.7x10-6

cm/s (M

anitol,baja

permeabilidad). V

eintidos compuestos fueron utilizados

como un set de predicción externo. U

n total de 265 descriptores m

oleculares (0D-1D

) fueron calculados con los program

as DR

AG

ON

, VolSurf y C

DK

. Un total de

21 propiedades físico-químicas se seleccionaron para

obtener las reglas.Los parám

etros de mayor influencia

sobre los valores de permeabilidad se determ

inaron con el

clasificador O

neR

(Weka).

Cada

clasificador se

obtuvo por un procedimiento de validación cruzada (10

veces) y se compararon los valores de sensibilidad y

especificidad de la curva RO

C. Los parám

etros más

relevantes fueron graficados por pares para una mejor

visualización de las reglas basadas en dos propiedades. El error estándar se utilizó para la selección de las reglas. Las m

ejores clasificaciones basadas en 1 y 2 propiedades fueron ensam

bladas en un regla de 3 propiedades.Para el desarrollo de los m

odelos QSPR

se utilizaron 1006 com

puestos para la serie de entrenamiento y 283

para la de predicción. Se desarrollaron 5 modelos de

árboles

de clasificación,

utilizando 97

descriptores m

oleculares previamente seleccionados y se siguió la

siguiente metodología (Figura 1):

Figura 1. Procedimiento de tres etapas para la clasificación de las diferentes clases de perm

eabilidad en Caco-2, utilizando

modelos consenso.

Resultados y D

iscusión: De las 21 propiedades físico-

químicas evaluadas, el Á

rea Superficial Polar (PSA) es la

que mejor describe las variaciones en la perm

eabilidad (66.4%

de la data), lo que está en correspondencia con su rol en el transporte a través de la m

embrana y en la

absorción de

fármacos

(2, 3).

Otras

propiedades relevantes fueron el peso m

olecular (MW

), el coeficiente de partición (M

LogP) y el coeficiente de distribución (LogD

7.5) con un 60.7%, 61%

y 60.6% de clasificación

de la permeabilidad, respectivam

ente. Para explicar el carácter m

ultifactorial de la permeabilidad, se evaluó la

interacción entre descriptores. A pesar de la excelente

correlación entre

el PSA

y

el coeficiente

de perm

eabilidad, este descriptor tiene una alta correlación con el resto de propiedades físico-quím

icas. En este sentido, para la clasificación basada en dos propiedades, el M

W y el LogD

7.5 mostraron los m

ejores resultados, alcanzando

un 72.1%

de

clasificación para

los com

puestos con alta permeabilidad y un 64.3%

para los de

baja. Sin

embargo,

la com

binación de

las 3

propiedades perm

itió una

mejor

clasificación de

la perm

eabilidad en

Caco-2.

Un

78%

y 70%

de

los com

puestos con

alta y

baja perm

eabilidad fueron

adecuadamente predichos (Figura 2).

Figura 2.Diferentes reglas de clasificación de la perm

eabilidad en Caco-2, basadas en 1, 2 y 3 propiedades físicoquím

icas. Para el desarrollo de los m

odelos QSPR

, se obtuvieron un total de 15 m

odelos de clasificación para las tres clases

seleccionadas (ver

Figura 1).

Tres de

los 5

modelos

en cada

grupo se

utilizaron para

obtener m

odelos consenso y su selección se basó en la capacidad de clasificación del set predicción externa (Figura 3). La predicción final para el sistem

a de modelos consenso

evidenció buenos resultados, siendo la clasificación en la serie de entrenam

iento para los compuestos de H

, M y L

permeabilidad 78.4%

, 76.8 y 79.1%, respectivam

ente. En el caso de la serie de predicción la exactitud en la clasificación

fue de

un 78.6%

para

los de

alta perm

eabilidad, 71.1% para los de m

oderada y de 77.6%

para los de baja permeabilidad.

Los m

odelos desarrollados

por am

bas m

etodologías (reglas y Q

SPR) fueron utilizados para clasificar un set

externo de validación. Los resultados que se muestran en

la Tabla 1 evidencian un 77.3% de buena clasificación.

Figure 3. Selección de los modelos de árboles de clasificación para el voto consenso, basado en la prevalencia de clasificación

del set de predicción externo.

Tabla

1. Resultados de la clasificación del set de validación externa.

Com

puestosPerm

(R-3P)

Perm Q

SPRc

Perm C

aco-2C

ompuestos

Perm (R

-3P)Perm

. QSPR

cPerm

. Caco-2

ASA

ML

MH

Furosemida

LL

LA

moxicilina

LM

MIndom

etacinaM

HH

HA

ntipirinaH

HH

Naproxeno

HH

HA

tenololM

LM

MN

orfloxacinM

LM

MC

afeinaH

HH

Paracetamol

HH

HC

arbamazepina

HH

HPropranolol

HH

HC

eliprololM

HH

LR

anitidinaM

LM

MC

imetidina

ML

MM

TerbutalinaM

LM

MC

olchicinaM

HM

MTeofilina

ML

HH

Cortisol

MH

HH

Verapam

iloM

HN

CH

FexofenadinaM

LL

LV

inblastinaM

LM

M

Referencias:

(1)A

. L. Ungell, P. A

rtursson, in Drug Bioavailability. Estim

ation of Solubility, Perm

eability, Absorption and Bioavailability, Vol. 40, Second ed. (Eds.: H

an van de Waterbeem

d, B. Testa),

WILEY

-VC

H, W

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elder, P. D. G

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. Res. 1999,16, 1514-9.(3)

P. Stenberg, U. N

orinder, K. Luthm

an, P. Artursson, J. M

ed. C

hem. 2001,44, 1927-37.

Agradecim

ientos: Los

autores agradecen

el apoyo

financiero de

la A

gencia Española

de C

ooperación Iberoam

ericana para el Desarrollo (A

ECID

)al proyecto:

A1/036687/11:

Montaje de un laboratorio de Q

uímica

Com

putacional, con fines académicos y científicos, para el

diseño de

potenciales candidatos

a fárm

acos, en

enfermedades de alto im

pacto socialy a la C

omisión

Europea al proyecto:D

CI-A

LA/19.09.01/10/21526/245-

297/ALFA

111(2010)29:

Red-B

iofarma.

Red para

el desarrollo de m

etodologías biofarmacéuticas racionales

que incrementen la com

petencia y el impacto social de las

Industrias Farmacéuticas Locales.

AN

ÁL

ISIS DE

UN

MO

DE

LO

DE

TR

ES C

OM

PAR

TIM

EN

TO

S PAR

A E

L E

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DIO

DE

L

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ASPO

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E Y

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LIZA

CIÓ

N D

E FÁ

RM

AC

OS E

N M

ON

OC

APA

S DE

CÉ

LU

LA

S C

AC

O-2

M. Llabrés

Dpto. de Ingeniería Q

uímica y Tecnología Farm

acéutica. Facultad de Farmacia. U

niversidad de La Laguna

Introducción.El estudio in vitro de la perm

eabilidad de fármacos utilizando

monocapas cao-2 perm

ite, además de

determinar la perm

eabilidad del fármaco debido

a la difusión pasiva, estudiar la función que desem

peñan diversos sistemas de transporte que

afectan a la absorción y biodistribución de los fárm

acos y el metabolism

o intracelular (1, 2). El parám

etro más utilizado para expresar los

resultados es la permeabilidad aparente o

efectiva (P, )calculada m

ediante la ecuación,0

RcSt

/x

P

(ec. 1)

Donde

t/

xR

es la velocidad media de

entradadel fárm

aco en el compartim

ento receptor (

1T

M); S, la superficie de la

monocapa celular (

2L

); 0

c, la concentración de

fármaco en el com

partimento fuente

que se supone constante durante el experim

ento. La identificación de los m

ecanismos activos de

transporte se basa en comparar las

permeabilidades aparentes en dirección apical –

basolateral (A

BP

) y basolateral – apical (B

AP

), así com

o el efecto que tienen los inhibidores del transporte. La ecuación 1 se deriva de la prim

era ecuación de Fick en

estado estacionario suponiendo adem

ás que se dan las condiciones de sum

idero (concentración de fármaco en el

compartim

ento receptor despreciable). La constatación de que las células caco-2 expresan distintos sistem

as transportadores de fármacos

en los lados apical y basolateral, así como la

posibilidad de metabolización intracelular del

fármaco, ha llevado diversos autores a proponer

el modelo de tres com

partimentos; en

la figura 1 reproduce el publicado por Sun y Pang (1).Es bien conocido que las funciones del tiem

po derivadas de los m

odelos n– com

partimentales

son, en principio, funciones n – exponencialesyla justificación del em

pleo de la ecuación 1 se ha basado en el análisis de sim

ulaciones num

éricas. El objetivo de esta comunicación es

derivar la relación existente entre la ecuación 1 y las funciones del tiem

po derivadas del modelo

de Sun y Pang cuando se da la condición necesaria y suficiente

que el sistema se

encuentre en estado transitorio. Tanto eldesarrollo analítico del m

odelo como las

simulaciones num

éricas se realizaron utilizando el program

a de álgebra simbólica w

xMaxim

a (http://sourceforge.m

axima.net ).

Modelo.La solución general de los sistem

as lineales hom

ogéneos en el dominio de Laplace

es:

0x

KI

x1

s)s

((ec. 2)

Donde x

es el vector de funciones (racionales) en el dom

inio de Laplace; I , la m

atriz unidad de dimensiones n x n; K

, la m

atriz del sistema,

3223

3222

12

2112

kk

0

kk

k

0k

k

K(ec. 3)

La interpretación de las constantes de velocidad se deriva

de la figura 1. El vector de condiciones iniciales

0x

es igual a T

01]0

,0,

x[cando el experim

ento es en dirección basolateral – apical o igual a

T3,

0]

x,0,

0[cuando es el

dirección apical – basolateral.En el problema

que nos ocupa pueden darse dos casos; primero,

si para i = 1…n

n

ij

1j

ijii

kk

el sistema es

cerrado y una de los autovalores de Kes igual a

cero y los n – 1 restantes son reales negativos;

segundo, si para i = 1 … n

n

ij

1j

ijii

kk

el

sistema es abierto y los n autovalores son reales

negativos 1. En el contexto del modelo en

estudio, la primera situación se da cuando

met

Cl=0. Para que la velocidad de entrada en el com

partimento receptor sea constante deben

darse dos condiciones. Primero, la condición de

sumidero,

0c

basoo

0c

ap, según sea el

compartim

ento receptor; la condición de sum

idero puede ajustarse modificando el

volumen del com

partimento receptor o m

ediante el drenaje continuo del fárm

aco. Segundo,debe darse la condición de estado transitorio, es decir,

0td cdcel

(ec. 4)

Obviam

ente la situación de estado transitorio estricta sólo se alcanza para un instante determ

inado, razón por la que hemos relajado su

definición; por lo tanto, si el transporte es, por ejem

plo,en dirección apical – basolateral,ETcell

effluxd

baso

basoc)

Cl

Cl

(V

1t

d cd(ec. 5)

Por otro lado, en condiciones de sumidero,

ap 0

effd

met

absd

ETcellV x

Cl

Cl

2C

lC

lC

lc

(ec. 6)

Las ecuaciones 4 - 6 explican por qué la velocidad de entrada en el com

partimento

receptor es constante durante un cierto tiempo y

proporcional a la concentración inicial en el com

partimento fuente (apical).

Otro punto de interés, el tiem

po necesario para alcanzar el estado transitorio, puede analizarse directam

ente a partir de la matriz del sistem

a. U

na de las propiedades de los autovalores de esta m

atriz es que )

max(

i>

)k

max(

ii; debido

al bajo valor de cell

V(10 – 15

l, referencia 1),

22k

es mucho m

ayor que las restantes constante de velocidad de salida de los com

partimentos y

el estado transitorio en el compartim

ento celularse alcanza en m

enos de un minuto.

Simulación.H

emos com

parado la solución general del m

odelo con la simplificación

introducida a través del estado transitorio sim

ulando el modelo tom

ando valores dentro de los intervalos utilizados por Sun y Pang. C

omo

resumen de los resultados obtenidos se m

uestran las figuras generadas con los valores siguientes; (volúm

enes en ml; aclaram

ientos en ml/m

in):

apV

= 1,50; bas

V= 2;50;

celV

=3

10·56,

11;

dC

l=

0,20; efl

Cl

= 0,50; m

etC

l= 0,20. Las condiciones

iniciales fueronT]

100,0

,0[

0x

. Las constantes de velocidad calculadas fueron 95,23;0,122 y 0,0158

1m

in. La figura 2 m

uestra las curvas predichas por el m

odelo donde se aprecia como

el compartim

ento celular alcanza la concentración m

áxima casi de form

a instantánea.En la figura 3 hem

os incluido los niveles predichos para el com

partimento

receptor (basolateral) y celular, junto con la curva calculada considerando el estado transitorio y la condición de sum

idero (ecuaciones 4 – 6; línea de puntos); hem

os reducido la escala de ordenadas al intervalo 0 – 5 y de tiem

po a 0 – 1 minuto para apreciar con

claridad como el estado transitorio se alcanza

rápidamente.

Conclusiones.H

emos justificado el uso de la

ecuación 1 en el marco del m

odelo de Sun y Pang bajo la hipótesis de que estam

os trabajando en condiciones de sum

idero y en régim

en de estado transitorio. El valor de la perm

eabilidad efectiva, en términos de los

parámetros del m

odelo de Sun y Pang se deduce

inmediatam

ente de las ecuaciones 5 y 6. La determ

inación de los parámetros del m

odelo requeriría el bloqueo selectivo de los procesos de transporte y m

etabolización.

Figura 1. Modelo de tres com

partimentos de

Sun y Pang(1)

Figura 2. Perfiles de concentración – tiempo

simulados

Figura 3. Perfiles de concentración tiempo en el

compartim

ento receptor, compartim

ento celular y valores predichos en estado transitorio y condiciones de sum

idero (línea de puntos)

Bibliografía

(1) Sun, H., Pang, K

. S.,Drug M

etab. Disp.36

(2008) 102(2) Pang, K

. S., Maeng, H

.-J., Fan, J. Mol.

Pharm.6

(2009) 1734

(1)Puede solicitar el desarrollo del modelo a

mllabres@

ull.es

0.01

0.1 1

10

100 0 10

20 30

40 50

60

y

t

0 1 2 3 4 5

0.1 0.2

0.3 0.4

0.5 0.6

0.7 0.8

0.9 1

y

t

DE

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OF A

PBPK

MO

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TIC

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G V

IVIA

009 AN

D IT

S M

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INIST

ER

ED

AS A

NE

W D

EL

IVE

RY

SYST

EM

IN R

AT

SM

.Matoses-O

sborne1,Tudela C

2,Garrido M

J 1, Bennet TA

2, Ballesteros J 2,

Caveda L

2, Troconiz IF1

1Departm

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de N

avarra, España2V

ivia Biotech S.L.; Tres C

antos; Spain

Introduction:V

ivia009 is a patented new drug

indication that

targets B

cell

population overproliferation in N

on-Hodgkings lym

phoma

(NH

L) patients.NH

L are a heterogeneous group of m

alignacies of the lymphoid system

that includes

any kind

of lym

phoma

except the

Hodgkin’s lym

phoma.

The rapid expansion of nanoparticle research dem

ands new

technologies

that w

ill enable

better interpretation of experimental data

and assistance

in the

rational design

of future

nanoparticles. Recently, great efforts have been

made in the study of the biodistribution, toxicity

and medical applications of nanoparticles (89).

Physiological based

pharmacokinetic

models

(PBPK

) are based on the anatomical structure of

the living systems, w

ith each important organ or

tissue listed as an individual compartm

ent. All

compartm

ents are interconnected through the m

ass transportation among them

. PBPK

help sim

ulate the concentration-time profile of a drug

in a species by integrating the physicochemical

properties of the compound w

ith the physiology of

the species.

The applications

of PB

PK

modeling for nanoparticles have appeared as

early as 2006 (8).

The aim of this project w

as to develop an integrated

PBPK

m

odel capable

to describe

simultaneously the biodistribution of V

ivia009 and its m

ain metabolite, after the free drug’s

administration or M

P.

Materials and M

ethods:Fifty-one rats divided in tw

o groups were treated w

ith 0.75 mg/kg of

either free drug(free009)

or MP given as a

bolus. At tim

e points 0.08, 0.16, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6 and 24 hours, three anim

als were sacrificed.

Samples of plasm

a, axillary lymph node, brain,

spleenand

bone m

arrow

were

collected to

measure

Vivia009

and its

metabolite

concentrations. Data regarding blood flow

s and tissue volum

es were taken from

literature (1-4). M

odelling and simulations w

ere performed w

ith N

ON

MEM

version VII using the naïve pool

data approach.

Results and D

iscussion:M

odel development

took part in threesteps: first, the free009 m

odel w

as developed

consisting of

6 anatom

ical com

partments

(blood, brain,

bone m

arrow,

lymph node and rest) connected to each other in

an anatomical fashion via blood flow

(Figure 1,m

iddle part).

Secondly, the

same

six com

partments w

ere addedfor the m

etabolite, produced in the liver and included in the rest com

partment (Figure 1, right part)and bound to

the free009

model

through the

hepatic clearance (Fm

×C

L). Finally,m

icroparticle m

odel isbound to the free009 m

odel through the in vivo release constant (K

REL ) w

ithin the tissues (Figure 1, left part).

Figure 1.- PBPK m

odel for microparticle (all), or

free009(m

iddle & right part). O

rgans are represented by a rectangular com

partment and connected in an

anatomical m

anner with blood flow

(red, blue) and lym

phatic flow (yellow

).Com

partments are nam

ed as follow

s: the

first letter

N,

D,

Mrepresent

microparticle, free drug and m

etabolite respectively. The second and third letter define the organ: PL, B

R,

BM

, LN, SP, R

T, stand for plasma, brain, bone

marrow

, lymph node, spleen and rest of tissues

respectively. CO

,represents cardiac output.

QB

R ,Q

BM

, QLN , Q

SP

and QR

Trepresent blood flow

to the brain, bone m

arrow, lym

ph node, spleen and rest of

tissues, respectively.

PS

LN ,represents

permeability

surface factor

in the

lymph

nodes.K

IS

P , KO

SP

represents constantsof association

and dissociation

of sertraline

in the

spleen, respectively.

Fm,

represent the fraction of drug m

etabolized by

the liver.

CL,

total sertraline

clearance.C

LR,

renal clearance from sertraline.

CLM

,total N

-Desm

ethyl-Sertraline clearance.

Physiological parameters used for the PB

PKs

model

developments can be found in Table 1.

Due to the fast in vitro release profile of

the m

icroparticle (data

not show

n), at

injection tim

e, part of its dose had been already released (F

1 ).

Table 1.-

Physiological param

eters taken

from

literatureand additional inform

ation used to develop the PBPK

models of V

ivia009.

The final model structure w

as based on visual inspection of the fit to the data, the value of N

egative Log

Likelihood, and

theA

kaike Inform

ation C

riterion. Estim

ated param

eter values for both m

odels can be found in Table 2.PB

PK m

odel results for free009 are shown in

Figure 2and PB

PK m

odel results for the m

icroparticle adm

inistration are

shown

in Figure 3.

Table

2.-Estim

ated param

eter values

for the

microparticle (left), free009 (m

iddle) and metabolite

(right).

. Figure 2.-

Com

parison of PBPK m

odel predictions (lines) and observed concentrations dots) of V

ivia009 and its m

etabolite after administration

of FREE009.

Figure 3.-C

omparison of PBPK

model predictions

(lines) and

observed concentrations

(dots) of

Vivia009 and its m

etabolite after administration of

MIC

RO

PAR

TICLES.

Based on the results of the m

odeling exercise, 45%

(F1)

of the

microparticles’

dose w

as released

before the

bolus adm

inistration, behaving as a free drug. C

L,CLM

and Fm increased 2, 1.3 and 1.3 tim

es respectively, w

hen the drug was adm

inistered as a m

icroparticle Table 2.

Referencias:

[1] Covell D

et al. Cancer R

es 1986;46(8):3969. [2] K

awai et al. J Pharm

acokinet Biopharm

1994 O

ct; 22(5): 327-365[3] M

eno-Tetang el al. Drug M

etab Disposition

2006; 34(9):1480-1487[4] D

avis et al. Pharm R

es 1993;10(7): 1093-1095[5] K

ang et al. Pharm R

es 1997;14(3): 337-344. [6]

Balthasar

et al.

J Pharm

acokinet Pharm

acodyn 2011 Feb; 38(1):121-142[7]

Bernareggi

et al.

J Pharm

acokinet Pharm

acodyn 1991; 19(1):21-50.[8] Y

ang et al. J Nanosci N

anotechnol 2010 (10) 8452-8490

Acknow

legments:

- Vivia B

iotech S.L. for supporting me and the

project.

MO

DIFIC

AC

IÓN

DE

L M

OD

EL

ON

O L

INE

AL

PAR

A E

L C

ÁL

CU

LO

DE

LA

PE

RM

EA

BIL

IDA

DE

N M

ON

OC

APA

S CE

LU

LA

RE

SV

. Mangas-Sanjuan

1, I. Gonzalez-A

lvarez1,V

G.C

asabó2,

M.B

ermejo

1

1Depto. de Ingeniería. Á

rea Farmacia y Tecnología Farm

acéutica. Universidad M

iguel Hernández, Elche.

2Departm

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de V

alencia, España

Introducción: El cálculo de la permeabilidad

mediante

estudios de

transporte in

vitroen

monocapas celulares es de gran relevancia en

los estudios preclínicos de desarrollo de nuevos fárm

acos. La

correcta estim

ación de

la perm

eabilidad es fundamental, ya que afecta a

la selección de nuevas moléculas durante su

desarrollopreclínico.

El cálculo

de la

permeabilidad deriva de la Ley de Fick o Ley de

difusión de

la m

ateria, cuya

primera

aproximación es una ecuación lineal ya que se

asumen condiciones sink (o sum

idero) y quela

concentraciónen

la cám

ara dadora

no se

modifica[1].

Posteriormente,

Artursson[2]

publicó un modelo lineal para el cálculo de la

permeabilidad en condiciones sink, en el que se

corrige la concentración en la cámara dadora a

cada tiempo de m

uestreo, mediante el cálculo de

las fracciones

transportadas.La

principal ventaja de am

bas aproximaciones es que son

regresiones lineales

de las

cantidades acum

uladas o fracciones transportadas frente al tiem

popero tienen la lim

itación asociada a aquellos casos en los que no se cum

plen los supuestos previos, es decir condiciones sink y cam

bio despreciable en la concentración dadora.Tavelin[2]

propuso utilizar

una ecuación

general, en

lacual

el cálculo

de la

permeabilidad se realiza m

ediante un modelo no

lineal, válido tanto para condiciones sink como

para condiciones

no sink.

Sin em

bargo, el

mism

o autor refleja la incapacidad de su modelo

para estimar correctam

ente la permeabilidad

en situaciones en las cuales se produce

una latenciaal inicio de la difusión

o un mayor paso inicial

de fármaco a través de la m

onocapa. Por ello,el objetivo de este trabajo ha sido

desarrollar un m

odelo no lineal que permitiera el cálculo de la

permeabilidad en cada una de las situaciones

posibles y realizar simulaciones con el fin de

determinar cual es el m

ejor modelo para el

cálculo de la permeabilidad.

Materiales y M

étodos: El trabajo fue realizado en Excel 2010.

El modelo no lineal propuesto

en este trabajo es una modificación del m

odelo no lineal de Tavelin En el nuevo m

odelose

permite

calcular una

permeabilidad

hasta el

primer tiem

po de muestreo y otra diferente o

igual desde el primer hasta el últim

o tiempo de

muestreo. La com

paración de cada uno delos

cuatro m

odelos se

realizógenerando

una población de m

ilexperimentos,con tres pocillos

por experimento, incorporando un m

odelo de error

interindividual exponencial

entre las

permeabilidades individuales y un m

odelo de error residual exponencial. Los datos fueron sim

ulados para cada uno de los tres tipos de perfiles de concentraciones acum

uladas frente al tiem

po, en condiciones sinky

no sinky cuatro

combinaciones para cada uno de ellos de alta

y/o baja variabilidad interindividual y residual(alta=coeficiente de variación del 20%

y baja del 5%

.).El prim

er perfil asume una latencia

inicial en el paso del fármaco a través de la

monocapa. El segundo perfilno presenta

ningún cam

bio en el paso del fármaco a través de la

monocapa. El tercer perfil asum

e un paso inicial de fárm

aco mayor y una dism

inución posterior al

primer

punto de

muestreo.

Bajo

estas condiciones

se sim

ularon los

datos y

se analizaron con cada uno de los m

odelos para el cálculo

de la

permeabilidad,

es decir

la aproxim

ación lineal (LINEA

L), la aproximación

lineal con corrección de la concentración dadora (LIN

EAL-corregida),

la ecuación

no lineal

original (NO

-LINEA

L)y el nuevo modelo (N

O

LINEA

L-modificada).Se calcularon los errores

medios de estim

ación, error intraensayo y error individual. La com

paración de los modelos se

realizó mediante un A

NO

VA

de los errores m

edios de estimación, errores intraensayo y

errores individuales entre los cuatro métodos

para la determinación de la perm

eabilidad por perfil y variabilidad designadosen SPSS 20.0 R

esultados y Discusión: Los resultados

de los A

NO

VA

para

cada uno

de los

perfiles en

condiciones sink y no sink se muestran en las

tablas 1,2 y 3. El modelo propuesto en este

trabajo presenta un error de estimación

inferior en la m

ayoría de casos al modelo no lineal de

Tavelin. Los modelos lineales presentan valores

de errores de estimación

similares al m

odelo no lineal corregido

en los casos en los que se cum

plen condiciones

sink, ya

que la

acumulación de las cantidades frente al tiem

po siguen un com

portamiento lineal. Sin em

bargo, en

condiciones no

sink, el

sesgo en

la estim

aciónes superior en todos los casos para

los modelos lineales frente a los no lineales y

sólo el modelo de Tavelin no lineal presenta

valores similares al m

odelo no lineal de dos pendientes

en el perfil 2, cuando se presenta una

única pendiente

para todos

los puntos

experimentales.

El modelo no lineal m

odificado propuesto por en este

trabajo presenta

un m

enor error

de estim

aciónfrente al m

odelo no lineal deTavelin

de forma significativa en los perfiles 1 y 3, tanto

en condiciones sink como no sink. Los m

odelos lineales

son com

parables en

preciosión y

exactitud al modelo no lineal m

odificado en condiciones sink para cada uno de los perfiles. Por tanto, la estim

ación de la permeabilidad

mediante el m

odelo no lineal de dos pendienteses en la m

ayoría de situaciones más preciso en la

estimación de la perm

eabilidad que el resto de m

odelos analizados. R

eferencias: 1.

Dawson, D., Principles of m

embrane

transport, in Handbook of physiology, R. B, Editor 1991, Am

erican Physiological Society: Bethesda. p. 1-45.

2. Tavelin, S., et al., Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. M

ethods Mol Biol, 2002. 188: p. 233-72.

NO

SINK

SINK

H IIV

H R

SVH

IIV H

RSV

MC

MC

MC

MC

NS

NS

NS

NS

SS

SN

SC

SS

CS

NS

H IIV

L R

SVH

IIV L

RSV

MC

MC

MC

MC

NS

NS

NS

NS

SS

SN

SC

SS

CS

NS

L IIV

H R

SVL

IIV H

RSV

MC

MC

MC

MC

NS

NS

NS

NS

SS

SN

SC

SS

CS

NS

L IIV

L RSV

L IIV

L RSV

MC

MC

MC

MC

NS

NS

NS

NS

SS

SS

CS

SC

SN

S

NO

SINK

SINK

H IIV

H R

SVH

IIV H

RSV

MC

MC

MC

MC

NS

SN

SS

SS

SN

SC

SS

CS

NS

H IIV

L R

SVH

IIV L

RSV

MC

MC

MC

MC

NS

SN

SS

SS

SS

CS

SC

SN

SL

IIV H

RSV

L IIV

H R

SVM

CM

CM

CM

CN

SS

NS

SS

SS

NS

CS

SC

SN

SL

IIV L

RSV

L IIV

L R

SVM

CM

CM

CM

CN

SS

NS

SS

SS

SC

SS

CS

S

NO

SINK

SINK

H IIV

H R

SVH

IIV H

RSV

MC

MC

MC

MC

NS

SN

SS

SS

SN

SC

SS

CS

NS

H IIV

L R

SVH

IIV L

RSV

MC

MC

MC

MC

NS

SN

SS

SS

SN

SC

SS

CS

NS

L IIV

H R

SVL

IIV H

RSV

MC

MC

MC

MC

NS

SN

SS

SS

SN

SC

SS

CS

SL

IIV L

RSV

L IIV

L R

SVM

CM

CM

CM

CN

SS

NS

SS

SS

NS

CS

SC

SS

Tabla donde se recogen los resultados del ANO

VA para los pefiles 1, 2 y 3 en condiciones sink y no sink y para cada uno de los escenarios de variabilidad propuestos. S hace referencia a significativo, N

S a no significativo, MC m

odelo no lineal modificado, N

S m

odelo no lineal, S modelo lineal sink y CS m

odelo lineal sink corregido. IIV es variabilidad interindividual y RSV variabilidad residual.

PERFIL 1 PERFIL 2

PERFIL 3

NO

LINEAL M

ODIFICADO

NO

LINEAL

MO

DIFICADO

NO

LINEAL

MO

DIFICADO

TAVELIN

TAVELIN

TAVELIN

Figuras 1-6. Las figuras de la izquierda corresponden al m

odelo no lineal de dos permeabilidades y las de la derecha

al modelo no lineal. Las figuras superiores hacen referencia

al perfil 1, las centrales al perfil 2 y las inferiores al perfil 3.

RIESG

O G

ASTRO

INTESTIN

AL Y CAR

DIO

VASC

ULAR

DE LO

S AINE: N

UEVAS

EVIDEN

CIAS Y SU

REPER

CU

SION

EN EL AB

OR

DAJE D

EL PACIEN

TE.

López-Pintor, E1

1D

epartamento

de Ingeniería.

Area de

Farmacia

y Tecnología

Farmacéutica.

Universidad M

iguel Hernández de Elche.

Introducción

Los Antiinflam

atorios N

oEsteroideos

(AINE)

constituyen un

grupo heterogéneo

de fárm

acos que

comparten

acciones terapéuticas

(analgésica, antiinflam

atoria y

antipirética) y

se diferencian

en su

eficacia y

toxicidad relativas.

Constituyen

uno de

los grupos

terapéuticos más consum

idosa nivel

mundial, tanto por prescripción m

édica com

o por automedicación.

Los efectos adversos más im

portantes de

los AIN

E, por

su frecuencia

y potencial gravedad se localizan a nivel gastrointestinal (G

I).La introducción de los inhibidores selectivos de la enzim

a ciclooxigenasa-2

(CO

X-2) m

ejoró la

tolerancia GI de estos fárm

acos, pero puso de m

anifiesto efectos adversos cardiovasculares

(CV

) no específicos

de los CO

X-2 y que podrían responder a un efecto de clase, com

partido, en m

ayor o menor grado, por todos los

AINE.

El objetivo de este trabajo consiste en revisar el perfil de seguridad C

V y GI

de losAIN

E y establecer las pautas para el adecuado m

anejo del paciente consum

idor de AINE por el profesional

sanitario.

Material y M

étodosSe realizó una búsqueda bibliográfica en

Pubmed.

Las palabras

clave seleccionadas

fueron: risk,

safety, toxity,

cardiovascular, gastrointestinal,

NSAID

, non-steriodal anti-inflamm

atory agents..Se establecieron com

o límites:

1) bibliografía anterior a 10 años,; 2) m

eta-análisis; 3)

ensayos clínicos

aleatorizados, y

4) revisiones

sistemáticas.

Resultados y D

iscusión R

iesgo CV

Se revisaron 33 artículos: siete eran ensayos clínicos, 12 m

eta-análisis y el resto

revisiones sistem

áticas. Los

resultados obtenidos muestran que, en

pacientes de riesgo, todos los AIN

Esalvo

la aspirina,

se asocian

a un

incremento del riesgo C

V,m

anifestado com

o infarto

agudo de

miocardio

(IAM

), accidente

o m

uerte cerebrovascular,

sin que

exista una

relación clara entre la especificidad de los

CO

X-2

como

mecanism

o farm

acológico y

el increm

ento del

riesgo cardiovascular.En com

paración con placebo, N

aproxeno parece ser el fárm

aco con

menor

incremento

del riesgo C

V, seguido de C

elecoxib. El consum

o crónico

de Ibuprofeno

y D

iclofenaco se asocia a un incremento

en más de tres veces del riesgo

CV

. Laasociación entre el

aumento de riesgo

CV

con

otros A

INE

como

indometacina,

meloxicam

, piroxicam

apenas ha sido evaluada.R

iesgo GI

Los factores de riesgo de gastropatía por A

INE y los m

ecanismos de profilaxis

GI del paciente están bien establecidose

incorporados en la mayoría de las guías

clínicas. Son: 1) edad superior a 60 años; 2) historia ulcerosa previa o de com

plicaciones ulcerosas relacionadas con la ingesta de A

INE; 3) consum

o concom

itante de anticoagulantes orales ;4)

consumo

concomitante

de glucocorticoides;

5) enferm

edad concom

itante grave;

6) consum

o de

AIN

E a dosis elevadas y 7) asociación

de varios AIN

E de forma concom

itante.

Repercusiones

en el

manejo

del consum

idor de AIN

ESi

bien son

necesariosm

ás ensayos

clínicos controlados

que evalúen

el perfil de

seguridad CV

de los AIN

Ey

permitan definiral paciente de riesgo, la

información

disponible hasta

el m

omento

debe incorporarse

a los

algoritmos

de m

anejo del

paciente consum

idor de AIN

E. Estos protocolos deberían

integrar no sólo el riesgo GI,

sino tam

bién las

nuevas evidencias

sobre riesgo CV

de los AIN

E. En este contexto, eladecuado m

anejo del paciente consum

idor de AINE por

parte del

profesional sanitario,

toma

especial relevancia.D

ebe garantizarse la

adecuada profilaxis

del paciente

frente a la potencial toxicidad GI y C

V de estos fárm

acos, lo que implica la

identificación en

el paciente

de las

posibles situaciones

de riesgo

y su

prevención o resolución.

Los profesionales

sanitarios deben

realizar una

evaluación previa

a la

prescripción y/o

dispensación,del

riesgoG

Iy

CV

delpaciente

que dem

ande un

AIN

E. A

demás,

lam

agnitud de consumo de estos fárm

acos al m

argen de la prescripción hace que los farm

acéuticos comunitarios deban

tomar constancia de la im

portancia de su

actuación, especialm

ente en

el control

de los

pacientes que

se autom

edican con AIN

E.

Referencias

1.Lanza FL, C

han FK, Q

uigley EM;

Guidelines

for prevention

of N

SAID

-related ulcer complications.

Am J G

astroenterol. 2009;104(3): 728-38.

2.Trelle S,R

eichenbach S,Wandel S,

Hildebrand P,Tschannen B

,Villiger

PM,

Egger M

,Jüni

P.C

ardiovascular safety

of non-

steroidal anti-inflam

matory

drugs:

network m

eta-analysis.BMJ. 2011;

342:c7086.

LA

DE

RM

OFA

RM

AC

IA E

N L

A FO

RM

AC

ION

DE

L FA

RM

AC

EU

TIC

O

EN

LA

UN

IVE

RSID

AD

DE

SEV

ILL

A

MJ Lucero

Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de Sevilla, España

Introducción: La Derm

ofarmacia está definida

por el Diccionario de la R

eal Academ

ia de la Lengua y por el C

onsejo General de C

olegios O

ficiales de Farmacéuticos

(CG

CO

F)com

o la ram

a de la Farmacia que estudia, fabrica y

expende productos

de cosm

éticano

relacionados con

patologías (1,2).

En la

actualidad, es

una oferta

en la

cartera de

servicios de la Oficina de Farm

acia junto con la nutrición, ortopedia, etc. Este servicio se hace desde

la propia

Farmacia

y en

las m

ás innovadoras desde internet, bien a través de páginas w

eb o de blogs(3-5). Pero en el cam

po de la C

osmética adem

ás hay que competir con

las grandes superficies,grandes alm

acenes y superm

ercados en los que también se venden

estos productos.

Todos los

laboratorios cosm

éticos solicitan a la Agencia Española del

Medicam

ento y

Productos Sanitarios

(6)la

autorización de puesta en el mercado que, si es

conveniente, se

concede. A

demás,

loslaboratorios

que lo

consideran adecuado,

aunque no es obligatorio, solicitan al CG

CO

F un

código nacional

(CN

) que

parece que

garantiza la calidad del producto cosmético.

Entonces ¿cuál

es la

diferencia entre

uncosm

ético vendido en uno o en otro lugar? La diferencia radica en la persona que hace el consejo y venta del producto. En este sentido, el Farm

acéutico por la formación que recibe a los

largo de sus estudios tiene criterios suficientes para hacer un acto profesional con rigor

y ciencia

y diferenciarse

de otros

vendedores form

ados bien por el establecimiento o por la

marca com

ercial en cuestión. Dentro de estos

estudios, existe

una form

ación opcional

en D

ermofarm

acia.El objetivo del presente trabajo es exponer los m

ateriales docentes

que se

utilizan y

los resultados

obtenidos en

la asignatura

de D

ermofarm

acia y Formulación M

agistral delG

rado de Farmacia de la U

niversidad de Sevilla.M

ateriales y

Métodos:

En la

Facultad de

Farmacia

de Sevilla,

la D

ermofarm

acia y

Formulación

Magistral

(DF

y FM

)es

una asignatura optativa que se cursa en el 2ºaño

del G

rado de Farmacia. Tiene 6 créditos que se han

dividido en 3 para teoría, 1.5 para seminarios y

1.5 para prácticas. En la parte teórica se imparte

Derm

ofarmacia, en los sem

inarios Formulación

Magistral y en las prácticas parte son de FM

y parte de D

F.

El programa teórico se im

parte mediante lección

magistral, a excepción delúltim

o tema que trata

sobre los tratamientos derm

ocosméticos que se

estudiaran a través de casos prácticos. El

programa

de Form

ulación M

agistral, im

partido en los seminarios, se realiza m

ediante clases participativas en las que tras la lectura del las

leyes correspondientes

se les

ensaña a

elaborar un Protocolo Norm

alizado de Trabajo. Por últim

o, las prácticas son de laboratorio y en ellas se elaboran 13 fórm

ulas desde geles de baño y crem

as anticelulíticas hasta jarabe y cápsulas de ranitidina.Los casos prácticos se im

parten al modo de

AB

P. Los alumnos se reúnen en grupos de 4 a 6

alumnos para realizar el trabajo. Se desarrollan

4 historietas distintas en las que se plasma

unsupuesto problem

a cosmético relacionado con

un personaje famoso. Estos textos se entregan

al grupo de trabajo al comienzo del curso y

tendrá que

resolverlo en

el correspondiente

cuatrimestre.

Para poder

elaborar su

trabajo tendrá que visitar cualquier O

ficina de Farmacia

y elegir un cosmético o cosm

éticos con el que

tratar a su paciente famoso. El siguiente paso

será elaborar un power pointen el que, adem

ás de señalar

el cosmético y los activos que lleva,

deberá indicar los componentes, la función de

los m

ismos,

el sistem

a físico-quím

ico que

forman y la acción derm

ofarmacéutica que tiene

el preparado base sin activos. A

l final del periodo de docenciase reservan 4

días para que los alumnos hagan la exposición

de sus consejos dermofarm

acéuticos.U

na vez expuestos

todos los

trabajos y

después del

debate que

se establece

entre los

propios alum

nos, se hace una votación entre ellos para seleccionar el que m

ás les ha convencido. Los casos estudiados en el curso 2011-12

han sido:celulitis, envejecim

iento cutáneo: arrugas, pigm

entación cutánea yprotección solar

(Fig. 1). Los casos prácticos se eligen voluntariam

ente por el grupo de alum

nos.La evaluación global de la asignatura se hace sum

ando la nota de teoría (75%), la nota de

prácticas (10%) y la nota de casos prácticos

(15%). Pese a la repercusión

de esta actividad sobre la nota final, hay alum

nos que optan por no hacerlos.

Figura

1. C

aso práctico

sobre celulitis,

pigmentación cutánea, envejecim

iento cutáneo: arrugasy protección solar.

Resultados y D

iscusión: El Espacio Europeo de Educación Superior tiene com

o objetivo, entre

otros, hacer

que nuestros

estudiantes tengan una form

ación más práctica, es decir,

más

profesional. Sin

abandonar la

lección m

agistral como instrum

ento para impartir la

docencia sobre Derm

ofarmacia, creem

os que esta form

ación no es suficiente si el alumno no

la completa con un conocim

iento real de la actuación sobre un

consejo dermofarm

acéutico(resolución de casos prácticos). En cuanto a la Form

ulación Magistral, som

os conscientes que para un alum

no de 2º curso del Grado le resulta

bastante complicado

comprender en 15 h una

materia tan com

pleja, máxim

e cuando aún no ha cursado

lasTecnologías Farm

acéuticas I y II, Farm

acología, Legislacióny ni siquiera han

definido que

es un

medicam

ento. Tras

las clases,

el alum

no tendrá

que elaborar

un Protocolo

Norm

alizado de Trabajo

según el

protocolo elaborado por el Colegio O

ficial de Farm

acéuticos de la provincia de Alicante

(7).En cuanto a las prácticas de laboratorio, el alum

no elaborará

tanto cosm

éticos com

o fórm

ulas magistrales durante 5 días, 3 h/día.

Adem

ás, se le enseñará el manejo de aparatos

frecuentes en un laboratorio de Formulación

Magistral

como:

Ungüator,

magnetoagitador,

encapsulador y emblistador de cápsulas. Por

último, se m

ostrarán las aplicaciones que tienen el D

ermascope M

DS 800 ó derm

oanalizador determ

inando las propiedades de la piel a un alum

no o alumna.

Los grupos de trabajo se han establecido con 4 a 6 alum

nos, dependiendo de cada uno. De los 4

casos expuestos

este año

(celulitis, arrugas,

protección solar

y pigm

entación cutánea):

33,33%han elegido el de celulitis, 27.7%

el de envejecim

iento cutáneo: arrugas, 11.1%el de

pigmentación cutánea y 27.7%

el de protección solar. Se ve claram

ente como relacionarlos con

unpersonaje fam

oso influye en la motivación

para la elección de los casos. Los grupos de trabajo han buscado en las O

ficinas de Farmacia

la información directam

ente del Farmacéutico,

por lo que en muchos casos no han elegido ellos

mism

os el

cosmético.

Dependiendo

de lo

avanzadoque tenga la D

ermofarm

aciaen

ese establecim

iento, la información y el cosm

ético que reciben se ven claram

ente influido con respecto a otras Farm

acias menos desarrolladas.

Otra

información

con la

que trabajan

los alum

nos es con la página web del laboratorio

cosmético del producto

elegido. Adem

ás, cada grupo tiene al m

enos 1 tutoría en el despacho del

Profesor para

ver los

avances y

la elaboración del pow

er point. Por último, todos

los trabajos son corregidos por el Profesor antes de la exposición. Las

evaluaciones finales

se realizan

de la

siguiente manera:

Examen escrito

de teoría: 20 preguntas cortas de contestación breve.Evaluación

continua de

las clases

prácticas.Evaluación de los casos prácticos:

oR

esolución del problema

oD

esarrollo del power point

oD

efensa pública del trabajo.Los resultados finales de la asignatura son:

34.25%aprueban la teoría

100% aprueban las prácticas

100% aprueban los casos prácticos

56.57%aprueban la asignatura

16.67%no se presentan

Conclusiones:1.

Dado el nivel de conocim

ientos de los alum

nos matriculados en

Derm

ofarmacia

y Form

ulación M

agistral es

necesario realizar

actividades dirigidas

por el

profesor para que aprueben y mejoren las

calificaciones obtenidas.2.

El desarrollo de los casos prácticos les lleva

a conocer

la realidad

de la

Derm

ofarmacia en la O

ficina de Farmacia.

Adem

ás, les

permiten

a los

alumnos

integrar los conocimientos teóricos con la

práctica profesionaly mejorar la nota final.

3.A

unque los conocimientos de los alum

nos son

escasos en

Derm

ofarmacia

y Form

ulación Magistral, la m

otivación que tienen

les perm

iten alcanzar

mejores

resultados.

Referencias:

1 .-http://ww

w.rae.es

2.-http://ww

w.portalfarm

a.es 3.-http://w

ww

.a5farmacia.es

4.-http://ww

w.farm

aciacomercialesforjadores.es

5.-http://blog.lafarmaciadem

odesta.com/tag/m

odesta-cassinello/ 6.-http://w

ww

.aemps.es

7.-L. Ruiz,

JL Vidal.

Documentación

y norm

as de

correcta elaboración en Form

ulación Magistral. CO

F de Alicante. 3º edic., 1999.

PRIM

ER

A V

AL

OR

AC

IÓN

DE

L 41ST

ESC

P SYM

POSIU

M O

N C

LIN

ICA

L PH

AR

MA

CY

. B

AR

CE

LO

NA

2012

Eduardo L. Mariño ,PilarM

odamio, C

ecilia Fernández Lastra.

Unidad de Farm

acia Clínica y Farm

acoterapia. D

epartamento de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica.

Facultad de Farmacia.

Universidad de B

arcelona.

Introducción:La European Society of C

linical Pharm

acy(ESC

P) es una sociedad científica y profesional de larga trayectoria, creada en el año 1979 por profesionales clínicos, investigadores y docentes, que incluye

am

ás de 500 miem

bros de m

ás de 50 países, con el objetivo general de desarrollar

y prom

over el

uso racional

y apropiado

de los

medicam

entos, productos

medicinales y dispositivos,

no sólo para el individuo

sinotam

bién para

la sociedad

(http://ww

w.escpw

eb.org/cms/hom

e).

La ESCP viene realizando cada año su Sim

posio,que ya con antelación tuvo alguna vez lugar en España, pero en la 41 edición fue la prim

era vez que la organización conjunta estuvo a cargo de un

grupo universitario

como

la U

nidad de

Farmacia

Clínica

y Farm

acoterapia del

Departam

ento de

Farmacia

y Tecnología

Farmacéutica

de la Facultad de Farmacia de la

Universidad de B

arcelona

Aunque el C

ongreso tuvo lugar durante los días 28 a 31 de octubre de 2012, prácticam

ente dos años antes habíam

os comenzado los preparativos

para su

realización, previa

aceptación de

la propuesta que nos hizo llegar la ESC

P a tales efectos.

Materiales y m

étodos:Se contó con un amplio

respaldo institucional, que permitió constituir el

siguiente Com

ité de Honor:

Ministra de Sanidad, Servicios Sociales

e Igualdadde España.

Alcalde de B

arcelona. C

onseller de Salut de la Generalitat de

Catalunya.

Rector de la U

niversitat de Barcelona.

Decano de la Facultad de Farm

acia de B

arcelona.Presidenta del C

onsejo General de C

olegios O

ficiales de Farmacéuticos de España.

President del Consell de C

ol.legis de Farm

acéutics de Catalunya.

Presidenta de la Real A

cademia

Nacional de Farm

acia de España.Presidente de la A

cademia

Iberoamericana de Farm

acia.President de la R

eial Acadèm

ia de Farm

àcia de Catalunya.

Por otra parte pretendíamos hacer un C

ongreso integrador, por lo que

invitamos a que se

incluyeran con nuestra Unidad en el C

omité

organizador y aceptarona

formarparte “activa”

del mism

o al Colegio de

Farmacéuticos de

Barcelona, Fundación Pharm

aceutical Care,

Sociedad Española de Farmacia C

omunitaria

(SEFAC

), Sociedad Española de Farmacia

de A

tención Primaria

( SEFAP), Sociedad

Española de Farmacia R

ural (SEFAR

), Sociedad Española de Farm

acia Hospitalaria (SEFH

) y la Societat C

atalana de Farmàcia C

línica (SCFC

).

El program

a resultó

equilibrado para

tratar cuestiones que fueran de interés a la Farm

acia C

omunitaria, a la Farm

acia Hospitalaria, a la

Atención Prim

aria y también para la U

niversidad en las vertientes profesionales y científicas, con tem

áticas de absoluta actualidad presentadas por especialistas de España y del

resto de Europa principalm

ente, aunque

también

del N

orte, C

entro y Sudamérica junto con países Á

rabes y A

siáticos. Se recibió la propuesta para hacer un total de 30 talleres, de los cuales tras su evaluación 28 fueron finalm

ente los ofertados. Los asistentes pudieron participar en 5 talleres

(2 por día (2 horas cada uno)) excepto el últim

o día que sólo hubo una sesión de talleres.

El primer día estuvo dedicado a los tem

as de Efectividad y C

oste-Efectividad,el segundo a Seguridad y

el tercer y último día tuvo com

o lem

a y objetivo prioritario: los Pacientes.

Se contó con la acreditación del Consell C

atalà de Form

ació Continuada de les Professions

Sanitàries de las sesiones plenarias y de los w

orkshops. Para cada sesión plenaria: 0,2 créditos; para cada w

orkshops: 0,3 créditos con validez estatal. Por prim

era vez de todas las realizadas en España, este C

ongreso ha recibido este tipo de acreditación habitual cuando se hace en otros países de Europa.

Por otro lado y además de las sesiones

establecidas para discutir las conferencias plenarias, cada día tuvim

os para darmás la

palabra a los congresistas: 2 horas para com

unicaciones orales y 2 horas para discusión

de poster y así hacer un congreso claramente

participativo.

Todas las comunicaciones presentadas fueron

valoradas mediante un proceso “ciego” de

revisión por pares, aleatorizado.

Fue un Congreso absolutam

ente independiente y libre de cualquier conflicto en el cam

po de la ética y la bioética, y al no estar presente la industria farm

acéutica no hubo lugar a ninguna posible incidencia que pudiera contravenir los códigos de Farm

aindustria ni de la EFPIA .

Resultadosy D

iscusión:Sin pretender hacer una revisión exhaustiva

del Simposio,

señalaremos

sólo algunas cuestiones como que hubo un total

de 700 participantes de más de 30 países de todo

el mundo.

Del total de com

unicaciones presentadas, casi 500,fueron seleccionadas 409.A

demás del libro

del Congreso (por cierto agotado) las

conferencias y comunicaciones (poster

incluidos) presentadas, serán publicadas en la revista International Journal of C

linical Pharm

acy anteriormente conocida com

o Pharm

acy World &

Sciences.

Se hizo notar la presencia decongresistas m

uy jóvenes. La m

ayor parte de los participantes han sido extranjeros m

ientras que españoles eran alrededor de unos 130 y la m

ayoría del ámbito

hospitalario. Teniendo pues en cuenta el número

de integrantes en el colectivo, se observó una baja asistencia de participantes de Farm

acia C

omunitaria.

La presenciade

profesorado y alumnos de las

Universidadesdonde se im

parte los estudios de Farm

acia fue reducidísima, descontado la

de B

arcelona por nuestra Unidad, com

o era deprever, y por una Profesora m

ás. La Decana de

Farmacia de la U

niversidad San Pablo CEU

de M

oncada y profesorado de esta Universidad

estuvieron con nosotros durante los tres días. No

encontramos inscritos ni participantes al m

enos en un núm

ero significativamente alto de los

órganos de gobierno de los demás C

olegios O

ficiales de Farmacéuticos de España, excepto

del de Barcelona.

Tampoco contam

os, salvo honrosas excepciones, con quienes habitualm

entea nivel estatalm

ás suelen opinarsobre las tem

áticasde Farmacia

Clínica y A

tención Farmacéutica, a pesar de que

en esta ocasión si tuvimos la oportunidad de

encontrarnos y debatir con los auténticos líderes sobre estas m

aterias .

Para finalizarsólo agradecer muy sinceram

ente la colaboración de todos los que nos han ayudado en los casi dos añosprevios, para que después de 40 ediciones este C

ongreso CIEN

TÍFICO

Y

PRO

FESION

AL fuera coorganizado, PO

R

PRIM

ERA

VEZ EN

ESPAÑ

A PO

R U

N

GR

UPO

DE LA

UN

IVER

SIDA

D com

o es nuestra U

nidad de Farmacia C

línica y Farm

acoterapia de la UB

.

41st ESCP Sym

posium on Clinical Pharm

acy. Barcelona 2012.

XICongresode

laSociedad

Españolade

Farmacia

IndustrialyGalénica.25

AniversarioSEFIG.Alicante

68

febrero2013

PostersSecciónTecnología

Farmacéutica

55

BIO

SISTE

MA

S BA

SAD

OS E

N H

IDR

OG

EL

ES PA

RA

EL

TR

AN

SPOR

TE

Y L

A R

ET

EN

CIÓ

N

DE

CÉ

LU

LA

S MIC

RO

EN

CA

PSUL

AD

AS.

A.A

carregui 1,2, F.J. Blanco

3, G. O

rive1,2, J.L. Pedraz

1,2, R.M

. Hernandez

1,2

1Grupo N

anoBioC

eL, Laboratorio de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad del País V

asco, Facultad de Farm

acia,Paseo de la Universidad 7. 01006 V

itoria, España2C

entro de Investigación Biom

édica en Red en B

ioingeniería, Biom

ateriales y Nanom

edicina (CIB

ER-

BB

N), V

itoria, España3C

IBER

-BB

N B

ioscaff Cartílago, IN

IBIC

-Hospital U

niversitario, 15006, A C

oruña,España

Introducción: La encapsulación de célulasper-

mite trasplantar cualquier tipo célula y

proteger-la

frente a

la respuesta

inmunológica

delhuésped con el fin de recuperar la funcionalidad de tejidos y órganos dañados o

simplem

ente com

o sistema de liberación de productos

tera-péuticos, a largo plazo, sin el requerim

iento de inm

unosupresión farmacológica(1-3). En los

úl-tim

os años, esta tecnología ha sido objeto de un gran interés por parte de la com

unidad científicalo que ha perm

itido su estudioen

numerosas

aplicaciones terapéuticas (4). Sinem

bargo, para llegar a la aplicación clínica quedan todavía una serie de

limitaciones

por solventar, como

con-trolary optim

izar la administración y extracción

de los sistemas bioencapsulados

yreducir la

inflamación

yla

reacción fibrótica

que se

produce.El propósito del presente estudio fue

desarrollarunbiosistem

a basado en un hidrogel de alginato que contenía

célulasm

icroencapsu-ladas y estudiar el

comportam

iento biológico después

de la

administración

in vivo.

Seelaboraron y evaluaron dos tipos diferentes dehidrogeles: hidrogeles preform

ados ehidrogeles

formados in situ.Estos hidrogeles cargadas con

las células microencapsuladas se com

pararon con

lascélulas microencapsuladas libres.

Materiales y M

étodos: Los mioblastos C

2 C12

modificados genéticam

ente para secretareritro-

poyetina (Epo) murina fueron

encapsulados en m

icrocápsulas alginato

poli-L-lisinaalginato

(APA

) a

una densidad

de 5x10

6células/mL

usando un goteador electrostático(5). Para la

elaboración de

los hidrogeles

se añadieron

100L de m

icrocápsulas APA

auna solución

dealginato

y esta mezcla se gelificó ionicam

en-te

mediante

una soluciónde C

aSO4

utilizando para ello un sistem

a de dos jeringas conectadas.

Figura 1.Figura representativa de las microcápsulas

APA

(A). H

idrogel in situ(B

). Hidrogel preform

ado (C

).

Para los ensayos in vitrolas m

ezclas se dejaron gelificar durante 40 m

inutos entre dos placas de vidrio separadas por un espaciador de 1

mm

(hidrogel preform

ado) o

en un

placa de

6 pocillos

(hidrogel in

situ) (Figura

1).La

actividad metabólica de las células encapsuladas

se determinó

mediante un ensayo colorim

étrico (C

CK

-8). La producción de Epo se cuantificó utilizando un kit ELISA

.Para los ensayos

in vivo se emplearon

ratones B

alb/c hembras

y se dividieron en 3 grupos tratados (n=8 por grupo): (1) hidrogel in situ (lagelificación

de la

mezcla

delas

cápsulas A

PA/alginato

se produce

en el

cuerpo del

animal

trasla

administración),

(2)hidrogel

preformado

(con cápsulas

APA

)y

(3)m

icrocápsulas APA

y enotros 2 grupos control

(n=3 porgrupo): (4) control hidrogel in situ (la

gelificación del hidrogel con las cápsulas APA

vacías se produce

en el cuerpo del animal tras

la adm

inistración)y

(5) control

hidrogelpreform

ado (con cápsulas APA

vacías). En los grupos

1,3

y 4

la adm

inistraciónfue

mínim

amente

invasiva y

se hizo

subcutáneamente

conun

catéter. En

losanim

ales de los grupos 2 y 5 fue necesario realizaruna incisión de 2

cm en la zona

dorsalyse

introdujo el

hidrogelpreform

ado en

el espacio subcutáneo suturando posteriorm

ente la incisión.Se realizaron m

uestreos semanales de

sangredurante el

primer m

es y posteriormente

cada quince díasde la zona subm

andibular utilizando capilares heparinizados. Los

niveles de

hematocrito

se determ

inaronusando

un m

étodo estándar(microhem

atocrito). Dos

meses

después de la implantación, algunos

animales

fueron sacrificados y las microcápsulas fueron

explantadas y fijadas para su posterior análisis histológico (H

& E).

Resultados y D

iscusión: Los ensayos in vitrorealizados pusieron de m

anifiesto que tantola

actividad metabólica com

o la producción de Epo de las células se m

antuvieronelevadas y

estables durante el ensayo y nose

observaron diferencias entre las

3 formulaciones (Figura 2).

Estos resultados podrían sugerirque elhidrogel

de alginato no condicionanegativam

ente en la difusión de los nutrientes y O

2hacia el interior

ni de la difusión dela

Epo al exterior.

56

Figura 2.Actividad m

etabólica (A) y producción de

Epo (B).

En cuanto al ensayo in vivo, los nivelesde

he-m

atocrito enlos gruposhidrogel in situ

y micro-

cápsulas APA

(grupos 1 y 3) sem

antuvieron elevados hasta el últim

o día del ensayo y no se observaron diferencias

significativas entre ellos(Figura 3A

).Losanálisis histológicos de las

mi-

crocápsulasexplantadas m

ostraronla form

ación de

capilares alrededor

de las

microcápsulas

(Figura 3B, flechas negras). A

demás, se observó

uncrecim

iento fibrótico alrededor de lasm

icro-cápsulas en

ambos

grupos tratados, que era más

evidente en el grupo de las microcápsulasA

PA.

Figura 3.N

ivelesde hem

atocrito (A) y análisis

histológico (B

) de

las grupos

hidrogel in

situ,m

icrocápsulas APA

y control in situ.

El nivel de hematocrito de los grupos

hidrogel preform

ado y microcápsulas A

PAfue sim

ilardurante las prim

eras 3 semanas.D

esde estepun-

to, el nivel de hematocrito del grupo hidrogel

preformado sufrió una bajada, pero se m

antuvo en niveles superiores al

80% hasta el final del

experimento y no m

ostródiferencias significati-

vas respecto al grupo de microcápsulas A

PA(Figura 4A

). Los resultados de las histologías m

ostraron una

reacción a

cuerpo extraño

alrededor de las microcápsulas, que fue m

ás

pronunciadaen el grupo de m

icrocápsulas APA

. Tam

bién se observaron capilares rodeandolas

microcápsulas en el grupo

de microcápsulas

APA

(Figura 4B, flecha

negra).

Figura 4.N

ivelesde hem

atocrito (A) y análisis

histológico (B) de las grupos hidrogel preform

ado, m

icrocápsulas APA

y control preformado.

La formación de vasos puede

ser debidoa los

efectos angiogénicos reportados para la Epo, lo que lleva a un m

icroambiente m

ás adecuado,m

ejorando así el acceso de oxígeno ynutrientes

a las células encapsuladas.Lacápsula

fibrótica que se observa es m

ás evidente en el grupo las m

icrocápsulas APA

. Esto puede ser debido a que el hidrogel que rodea

las microcápsulas

APA

en los grupos preformado e in situ

evitael

contacto directo

de la

poli-L-lisinacon

las células

de la respuesta inflamatoria,dando lugar

a una menor reacción de cuerpo extraño.

Conclusión:

Se han elaborado y analizado dostipos

de hidrogeles que contienen microcápsulas

APA

,para

mejorar

laadm

inistración y

la retención

y reducir

la inflam

ación post-

trasplante de las célulasm

icroencapsuladas.Enel futuro, estos biosistem

aspueden perm

itir la incorporación y la coencapsulación de factores de crecim

iento u otroscompuestospara elim

inar la hipoxia, m

ejorar el suministro de oxígeno y

promover la angiogénesis.

Referencias:

(1) Orive G

et al. Nat. M

ed. 2003;9, 104-107. (2)

Hernandez

R.M

et al. Drug. D

eliv. Rev.

2010, 62, (7-8), 711-730.(3) C

hang T.M. Science. 1964,146,524-525.

(4)A

carregui A et al. B

iodrugs 2012; 26 (5): 283-301(5)Lim

F, Sun AM

. Science 1980; 210: 908-10

Agradecim

ientos:Este proyecto ha sido parcialm

ente financiado por la U

niversidad del País Vasco (U

PV/EH

U)

(UFI 11/32). A

. Acarregui agradece al G

obierno V

asco (Departam

ento de Educación,U

niversi-des e Investigación) porsu beca predoctoral.

57

INFL

UE

NC

IA D

EL

PHE

N L

A T

RA

NSFE

CC

IÓN

DE

L PL

ÁSM

IDO

PCM

S-EG

FP ME

DIA

DA

PO

R O

LIG

OQ

UIT

OSA

NO

SM

. Agirre, J.Zarate,G

.Puras, J.L. PedrazN

anoBioC

elGroup, D

epartamento de Farm

acia y Ciencias de los A

limentos, U

PV-EH

U, V

itoria-Gasteiz.

Centro de Investigación en

Red-B

ioingeniería, Biom

ateriales y Nanom

edicina (CIB

ER-B

BN

).

Introducción: El

quitosano es

un polím

ero biodegradable

compuesto

por subunidades

repetidas de

D-G

lucosamina

y N

-acetil-D-

Glucosam

ina, con una amina prim

aria en cada unidad deacetilada y un pK

a de 6,5 que lo convierte soluble en m

edios ácidos. Debido a su

inocuidad demostrada

en animales y hum

anosy

sus adecuadascaracterísticas físico-quím

icas, ha sido

propuesto com

o una

alternativa a

los vectores

virales (1).

Entrelos

factores que

afectan ala transfección con quitosanos, el

grado de

deacetilación(G

DA

)y

el peso

molecular

(Pm)

del quitosano

son los

más

importantes,

además

del ratio

de carga

quitosano/DN

A (ratio N

/P), el tipo de célula, el tam

año y el potencial Z de las nanopartículas yla concentración de sales del m

edio(2). En

comparación con los de alto Pm

, losquitosanos

de bajo

Pm(oligoquitosanos)

son de

bajaviscosidad y m

ejoran la liberación del AD

N

unido al

vector, necesaria

para una

mejor

transfección. Adem

ás, los oligoquitosanos dealto G

DA

han demostrado ser los m

ejores para transfectar

in vivo,

evitan el

riesgo de

acumulación en tejidos y

son menos tóxicos (3,

4).Otras de las características de los com

plejos quitosano/D

NA

es su altasensibilidad por el pH

del m

edio. Num

erosos estudios han demostrado

mejores eficiencias de transfección in vitro

apH

s entorno a 6,5 en comparación con pH

s alrededor

de 7,4

(5).Por

lo tanto,

hemos

analizado la influencia del pH del m

edio en la eficiencia de transfección de células H

EK293 y

AR

PE19, con oligoquitosanos de bajo Pm y alto

GD

A (N

OV

AFEC

T O15: 5,7 kD

a eta 99%;

NO

VA

FECT O

25: 7,3 kDa eta 99%

).

Materiales y M

étodos: Para realizar el estudio de la influencia de las variables N

/P, pH y

concentración de sales en el tamaño

y carga de los poliplexos, se ha llevado

a cabo un diseño factorial 2

3. Mediante electroforesis en geles de

agarosa, se ha analizadoa diferentes ratios N

/P la capacidad de los poliplexos para condensar, liberary proteger el plásm

ido.Posteriormente se

ha llevado a cabo el estudio de transfección in vitro

en células HEK

293 y AR

PE19 a pH 7,4

para seleccionar las proporciones N/P que m

ás transfectan.

Finalmente,

con los

poliplexosseleccionados se ha estudiado el efecto del pH

en la transfección del plásm

idopC

MS-EG

FP en

estas dos

líneas celulares.

El análisis

cualitativo de la transfección se ha llevado a cabo m

ediante microscopia de fluorescencia,

mientras

que por

citometría

de flujo

se ha

medido el porcentaje relativo de células que

expresan EGFP.

El análisis estadístico de losdatos de transfección se ha realizado m

ediante la com

paración de medias aplicando el test T de

Student. Valores de p<0,05 se han considerado

significativos.

Resultados y D

iscusión: Los 8experim

entosde caracterización de tam

año y carga (respuestas) han m

ostrado que los efectos de las variables testadas no tienen la m

isma

influencia sobre el tam

año de

partícula en

los dos

tipos de

poliplexos diseñados.

Mientras

que en

los poliplexos O

15 el pH y el N

/P influyen mucho

en el tamaño, en el caso del O

25 sólo seha

podidoapreciar un leve descenso en el tam

año al aum

entarla N

/P (Figura 1A y 1C

). Por otro lado,

se ha visto que, independientemente del

quitosano utilizado, el parámetro lim

itante del potencial Z

esel

pH del m

edio. Adem

ás, cabe destacar que el efecto de cada variable sobre las respuestas obtenidas

no dependede las dem

ásvariables, salvo en el caso del pH

y la N/P en

los poliplexos elaborados con O15 (Figura 1B

).

Figura 1-Valores de las respuestas (tamaño y carga)

obtenidas analizando

cada variable

de form

a independiente

y considerando

las posibles

interacciones entre

variables, en el

caso de

los poliplexos O

15 y O25

(Ay

C, respectivam

ente). G

ráfica de la interacción entre las variables pH y

N/P en los poliplexos O

15 (B).

En cuanto a los geles de agarosa,el O

25 ha m

ostradouna m

ayor capacidad de retención del plásm

ido, aunque en presencia de SDS y enzim

a todas las proporciones N

/P analizadas (5, 10, 20

58

y 30) han sido capaces de liberar y proteger el plásm

ido(Figura 2).

Figura 2- Geles de agarosa para el estudio de la

capacidad de retención, liberación y protección de los oligoquitosanos O

15 (A) y O25 (B). O

C: form

a circular abierta, SC

: forma superenrrollada. Líneas

1-3: ADN

libre; líneas 4-6: N/P =

5; líneas 7-9: N/P

= 10; líneas 10-12: N

/P = 20; líneas 13-15: N

/P =

30. Los poliplexos han sido tratados con SDS

2%(líneas 2, 5, 8, 11 y 14) y D

Nasa I (1U

/2.5)

(líneas3, 6, 9, y 15).

Por otra parte,enlos resultados obtenidos en los

ensayos de transfección a diferentes pHs (7,4 y

6,5), se ha vistoque en las dos líneas celulares,

independientemente

del vector

y de

la N

/P utilizada,

a pH

6,5

se obtienen

valores de

transfección significativam

ente superiores

(Figura 3, barras).R

especto a la viabilidad de las células, se ha observado que

las AR

PE19 son m

ás sensibles a los efectos tóxicos de los poliplexos, m

ás aún a medida que se aum

entala

N/P (Figura 3, líneas).

Figura 3: Influencia del ratio N/P el pH

en la expresión de EG

FP y viabilidad en células HEK

293 (A) y ARPE19 (B). Los datosde transfección han sido norm

alizados respecto a la Lipofectamina TM

(media

± DS; n=

3).

Esto demuestra la gran influencia del pH

del m

edio de transfección cuando se transfectanin

vitrolíneas

celulares de

diferentes características utilizando com

o vector no-viral el quitosano. A

pesar de ello, el descenso del pH

del medio no ha sido suficiente para llegar a

obtener porcentajes de transfección similares a

los obtenidos conlos liposom

as comerciales

(lipofectamina

TM), utilizados

como

control positivo en transfección

(Figura 4).

Figura 4:

Microfotografías

de células

HEK

293 transfectadas

a pH 6,5 (cam

po claro: columna de la

izquierda; fluorescencia:

columna

del centro)

y gráficas (FL1/FL3) de citom

etría de flujo (columna

de la derecha). Imágenes A1, A2 y A3: O

15, N/P 30.

Imágenes B1, B2 y B3: O

25, N/P 30. Im

ágenes C1, C

2 y C3: Lipofectam

inaTM.

Conclusión: El

descenso del pH del m

edio de transfección increm

enta significativamente el %

relativo de células transfectadas con los dos tipos de quitosanos. Estos resultados sugieren que estos oligoquitosanos podrían ser útiles para transfectar in vivo

células que se encuentran en un

ambiente

ligeramente

ácido, tales

como,

células de la retina o células tumorales.

Referencias:

(1) M

ao S,

Sun W

, K

issel T.

Chitosan-based

formulations for delivery of D

NA

and siRN

A.

Adv D

rug Deliv R

ev. 2010;62(1):12-27.(2) M

ansouri S, Cuie Y

, Winnik F, Shi Q

, Lavigne P, B

enderdour M, et al. (2006). Characterization of

folate–chitosan–DN

A

nanoparticles for

gene therapy. B

iomaterials,27, 2060–2065.

(3) Lavertu

M,

Methot

S, Tran-K

hanh N

, B

uschmann M

D. H

igh efficiency gene transfer using chitosan/D

NA

nanoparticles with specific

combinations of m

olecular weight and degree of

deacetylation. Biom

aterials 2006; 27(27):4815-4824

(4) Klausner EA

, Zhang Z, Chapm

an RL, M

ultack R

F, Volin M

V. U

ltrapure chitosan oligomers as

carriers for corneal gene transfer. Biom

aterials 2010; 31(7):1814-1820.

(5)Nim

esh S, Thibault MM

, Lavertu M, B

uschmann

MD

. Enhanced gene delivery mediated by low

m

olecular w

eight chitosan/D

NA

com

plexes: effect

of pH

and

serum.

Mol

Biotechnol

Oct;46(2):182-196.

Agradecim

ientos:Este proyecto ha sido apoyado

económicam

ente por la UPV

/EHU

(UFI 11/32). Los

autores agradecen el apoyo técnico y humano de los

SGIker (U

PV/EH

U, M

ICIN

N, G

V/EJ, FSE).

59

DISE

ÑO

DE

VE

CT

OR

ES N

O V

IRA

LE

S PAR

A E

L T

RA

TA

MIE

NT

O D

E E

NFE

RM

ED

AD

ES

DE

GE

NE

RA

TIV

AS D

E R

ET

INA

PS. Apaolaza

1, A. del Pozo-Rodríguez

1, AR

Gascón

1, MA

Solinís 1

1Laboratorio de Farmacia y Tecnología Farm

aceútica, Facultad de Farmacia, U

niversidad del País Vasco U

PV/EH

U, V

itoria, 01006, España.

INT

RO

DU

CC

ION

Laterapia génica a nivel ocular con vectores no

virales basados

en N

anopartículas Sólidas

Lipídicas (SLN

s) ha

obtenido resultados

positivos “in vitro” (1) e “in vivo” (2,3). Con el

fin de obtener nuevos vectores más seguros y

eficaces, se pueden incorporar ligandos en la superficie, com

o el Ácido H

ialurónico (HA

). Este

polisacárido es

biocompatible,

muco-

adhesivo, biodegradable y además se encuentra

de forma fisiológica en el ojo (3). El objetivo de

este trabajo es la evaluación de la capacidadde

transfección de vectores basados en SLNs que

contienen HA

y protamina en células A

RPE-19,

así com

o el

estudio de

sucaptación

y disposición

intracelularen

la m

isma

línea celular. Para ello se utilizó el plásm

idom

odelo pC

MS-EG

FP.

MA

TE

RIA

LE

S Y M

ÉT

OD

OS

Elaboración de

los vectores:

Los vectores

compuestos

por H

A-protam

ina-AD

N-SLN

se obtuvieron

tras adición

delcom

plejo H

A-

protamina-A

DN

en solución con la suspensión acuosa de SLN

s elaboradas por el método de

emulsificación

y evaporación

del solvente

descrito por del Pozo-Rodríguez

et al (4). Se utilizó

HA

con

tres pesos

moleculares

diferentes: 150 kDa; 500 kD

a y 1630kD

a. La proporción H

A:protam

ina:AD

N:SLN

fue fijado en 0.5:2:1:5.

Caracterización: El tam

año de partícula y la carga

superficial se

determinaron

por espectroscopía de correlación fotónica (PC

S) y por velocim

etría láser doppler, respectivamente

(LDV

). La capacidad del vector de unir el AD

N,

protegerlo de la acción de la DN

Asa I y la

liberación del vector, inducida por SDS, se

estudiaron mediante

electroforesis en gel de agarosa.

Ensayos en cultivos celulares: La eficacia de transfección

“in vitro”

encélulas

de retina

AR

PE-19se determ

inóm

ediante citometría de

flujo, cuantificando

el porcentaje

de células

EGFP

positivas a

diferentes tiem

pos. La

viabilidad celular se determinó em

pleando el kit A

potox-Glo™

. La

captación celular

de los

vectores 2 horas post-administración se observó

mediante citom

etría de flujo, empleando SLN

s m

arcadas con Nile R

ed.

Mecanism

o de

entrada y

disposiciónintracelular:

El m

ecanismo

de endocitosis

empleado en la internalización de los vectores

se determinó cualitativam

ente por microscopía

confocal(C

LSM).

Para ello

las células

se incubaron

durante 2

horas con

vectores m

arcadas con

Nile

Red

(rojo)junto

a los

marcadores para la endocitosis

mediada por

caveola/lipid rafts (AlexaFluor488-Toxina del cólera)

y clatrinas

(AlexaFluor488-Transferrina).

La coincidencia

de am

bos m

arcadores en un mism

o plano es indicativa de colocalización (am

arillo).

RE

SUL

TA

DO

S Y D

ISCU

SIÓN

En la tabla 1 se recoge el tamaño y carga

superficial de los vectores preparados con elH

A.C

omo

puede observarse, el peso molecular

delHA

no produjo cambios significativos ni en

el tamaño de partícula ni en la

carga superficial.

Vector

Tam

año (nm)

Potencialm

V

HA

150kDa

292.10 ± 51.36+33.00 ± 1.18

HA

500kDa

259.13 ± 16.51+36.77 ± 0.35

HA

1630kDa

271.93 ± 17.11+30.73 ± 1.2

Tabla 1. Tamaño y Potencial Z de los vectores H

A-protamina-AD

N-

SLNform

ados con HA de 150kD

a; 500 kDa y 1630 kD

a. El ratio p/p/p/p se fijo en 0.5:2:1:5.

Com

o se puede observar en la figura 1, todos los vectores fueron capaces

de unir el AD

N,

protegerlo de la acción enzimática y liberarlo

(figura 1).

Figura 1. Electroforesis

en gel de agarosa. Carriles: 1 =

ADN

; 2-4=

Unión

vectores H

A150kDa;

500kDa

y 1630kD

a; 5=

AD

N+

DN

Asa; 6-8= Protección vector H

A150kDa; 500kD

a y 1630kD

a; 9-11=

Liberación vector

HA150kD

a; 500kD

a y

1630kDa.

En la

figura 2

se recoge

la eficacia

de transfección

de los

vectores a

lo largo

del tiem

po. Se puede observar un aumento de la

transfección con los tres vectores desde las 24 horas hasta los 7 días, alcanzándose el valor m

áximo a las 96 horas.

(60-70%de células

transfectadas). Esteaum

ento puede deberse por un lado a la incorporación de protam

ina, péptido capaz

de condensar

el D

NA

y

por ello

protegerlo; adem

ás posee

secuencias de

60

localización nuclear (NLS) (5)

en su estructura capaces

de facilitar

el acceso

del D

NA

al

núcleo. No obstante, la presencia de H

A en el

vector produjo un aumento en la eficacia de

transfección respecto a los resultados obtenidos en estudios previos (1) con vectores elaborados únicam

ente con protamina-A

DN

-SLN.

Figura 2.Eficacia de transfección a lo largo del tiem

po en células ARPE-19.Las barras de error representan D

.E.(n=3).* p<

0.05 con respecto a H

A150kDa-Prot-AD

N-SLN

.

En la

figura 3

se puede

observar que

laviabilidad celular fue siem

pre superior al 70%.

Figura 3.

Viabilidad celular en células ARPE-19. Lasbarras de

error representan D.E.(n=

3).* p<0.05 con respecto a H

A150kDa-

Prot-ADN

-SLN.

La captación celular de los vectores se confirmó

cuantitativamente por citom

etría de flujo. Com

o se observa en la figura 4, el desplazam

iento de los

histogramas

con respecto

al control

de células sin tratar, indica que todas las células fueron capaces de captar los vectores.

Figura 4. Análisis por citom

etría de flujo de la captación celular de vectores H

A-Prot-ADN

-SLN preparados con SLN

s marcadas con

Nile Red.

No se observaron diferencias en la captación

entre los

vectores elaborados

con H

A

de diferente peso m

olecular. No se encontraron

diferencias entre la captación de estos vectores y el vector preparado con protam

ina pero sin HA

y estudiado en un trabajo previo (2), por lo que el increm

ento en la transfecciónde los vectores

que tienen

HA

no

está relacionado

con la

internalización celular.

En la

figura 5

se m

uestran las

imágenes

obtenidas por

CLSM

. Se

observa que

los

vectores elaborados con SLNs m

arcadas con N

ile Red colocalizaban con el m

arcador de la vía endocítica m

ediada por caveola/lipid rafts. Sin em

bargo, no se observó colocalización con el m

arcador de la vía endocítica mediada por

clatrinas. Estudios anteriores han mostrado que

el vector

protamina-A

DN

-SLN

emplea

la endocitosis

mediada

porclatrinas

(1). Este

hecho nos indica que la incorporación de HA

al vector fue capaz de m

odificar su mecanism

o de entrada en las células A

RPE-19, pasando

de la vía clatrina a la vía caveola/lipid rafts. Este cam

bio en

el m

ecanismo

de internalización

puede ser la causa del aumento observado en los

niveles de transfección con las formulaciones

que contienen HA

, ya que la vía caveolar evita la fusión con los lisosom

as y por tanto, la degradación lisosom

al.

Figura

5 C

LSM

imágenes

en ARPE-19.

A)SLN

-Nile

Red y

AlexaFluor488-Toxina del

cólera y

B)SLN

-Nile

Red y

AlexaFluor488-Transferrina.

CO

NC

LU

SION

Los vectores no virales compuestos por H

A,

protamina

y SLN

s perm

iten obtener

altos niveles de transfección en células A

RPE-19. La

alta eficacia

de transfección

obtenida se

relaciona con la capacidad de la protamina de

proteger e internalizar el AD

N en el núcleo, por

su contenido en NLS, y a la presencia de H

A en

la superficie del vector, que dirige el mecanism

o de

internalización celular

hacia la

ruta caveola/lipid rafts.

AG

RA

DE

CIM

IEN

TO

S

Este trabajo fue realizado gracias al Gobierno

Vasco (IT-341-10). PS

Apaolaza agradece a la

Universidad del País V

asco UPV

/EHU

por su beca.

RE

FER

EN

CIA

S

1.D

elgado D, et al. Eur. J. Pharm

. Biopharm

. 2011; 495:502-79.

2.D

elgado D, et al. Int. J. Pharm

. 2012; 35:43-425.3.

Delgado D

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, et al. Int. J. Pharm. 2007;

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Masuda

T, et

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S Lett.

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2148:579.

61

EST

UD

IO PR

EL

IMIN

AR

DE

NA

NO

CO

MPU

EST

OS M

AG

NE

TIT

A/PO

LI(

-CA

PRO

LA

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ON

A)

CO

MO

AG

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TE

S DE

CO

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EN

RE

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CIA

MA

GN

ÉT

ICA

DE

IMA

GE

ND

E

CÁ

NC

ER

DE

CO

LO

N A

VA

NZA

DO

J. Prados 1,J.L. Arias 2,A

. Alberich-B

ayarri 3,E. Sáez-Fernández2,C

. Melguizo

1, R. O

rtiz4, G

. Perazzoli 1,M

.A. R

uiz2,A

. Aránega

1

1Instituto de Biopatología y M

edicina Regenerativa (IB

IMER

), Dpto. de A

natomía y Em

briología H

umana, U

niversidad de Granada, España.

2Dpto. de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica, U

niversidad de Granada, España.

3Hospital Q

uirón, Valencia, España

4Dpto. de C

iencias de la Salud, Universidad de Jaén, España.

e-mail: jlarias@

ugr.es

Introducción:La

resonancia m

agnética de

imagen (R

MI) es una técnica no invasiva que

permite obtener im

ágenes anatómicas de alta

resolución. Éste

es un

método

ampliam

ente em

pleado para el diagnóstico de patologías de tejidos blandos o cartílagos, ya que perm

ite diferenciar tejidos enferm

os (p. ej., cancerosos). A

ctualmente, uno de los agentes de contraste de

RM

I más prom

etedores son las nanopartículas de

óxido de

hierro superparam

agnético. Su

utilidad se debe a lacapacidad de relajación T

2 * que tienen, con una excelente sensibilidad en im

ágenes T2

yT

2 * en comparación con otros

agentes de RM

I como los quelatos de iones

paramagnéticos

(p. ej.,

Gd

3+ –

DTPA

). La

relajación T

2que

inducen estas

partículas superparam

agnéticasse

traduceen

una atenuación

de la señal deim

ágenes T2 . D

e esta m

anera, generanun contraste negativo o negro

en RM

I al provocar una fuerte susceptibilidad m

agnética en las moléculas de agua vecinas (1).

Este trabajo

se centra

en el

diseño y

caracterización de nanocompuestos constituidos

por núcleos superparamagnéticos de m

agnetita (Fe

3 O4 ) em

bebidos en una matriz de poli(

-caprolactona)

(PCL).

La selección

deeste

polímero sem

icristalinose debe a su naturaleza

biodegradable y biocompatible, lo que ha hecho

que sea ampliam

ente utilizado en la formulación

de micro-(nano-)partículas e im

plantes (2).M

ateriales y Métodos: Los productos quím

icos eran

de calidad

analítica (Sigm

a-Aldrich,

Alem

ania). El agua fue desionizada y filtrada (M

illi-Q, M

illipore, Francia). Los núcleosde

Fe3 O

4se obtuvieron m

ediante co-precipitación quím

ica en solución (1).La síntesis de las partículas Fe

3 O4 /PC

L se basa en

el m

étodo de

disposición interfacial

del polím

ero ampliam

ente utilizado en la síntesis de nanoesferas

de PCL (2). B

revemente, la síntesis

comenzó con la adición bajo agitación de 10 m

L de una solución de polím

ero en diclorometano

(0.3%, p/v) sobre una suspensión acuosa de

Fe3 O

4(0.3%

, p/v) con una concentración de pluronic

F-68

del 2%

(p/v).

La agitación

mecánica fue m

antenida durante 1 hora, para a continuación realizar la lim

pieza magnética de

los nanocompuestos.

Para optimizar las condiciones de síntesis, se

obtuvieron nanocom

puestos con

diferentesproporciones de Fe

3 O4 :PC

L (desde 1:4 a 4:1), determ

inándose el rendimiento de la reacción.

La geometría de las

partículasfue estudiada

mediante H

RTEM

y PCS.

A continuación, se investigó

la citotoxicidad de las

partículas Fe

3 O4 /PC

L utilizando

el test

colorimétrico M

TT (azul de tetrazolio), y un rango de concentraciones de 10 a 200 m

M. Para

ello, se seleccionó la línea SW480 de células de

adenocarcinoma de colon hum

ano.Finalm

ente, la caracterización de las partículas Fe

3 O4 /PC

L como agentes de contraste en R

MI

se realizó mediante el estudio de los tiem

pos de relajación T

2 . La figura 1 muestra la disposición

de los

tubos de

las diferentes

suspensiones acuosas de nanocom

puestos en el fantoma. Se

adquirieron secuencias multieco con tiem

pos de eco de 16, 32, 48,64, 80, 96, 112 y 128 m

s.

Figura 1.C

olocación en el fantoma de las

suspensiones de

diferente concentración

de nanocom

puestos Fe3 O

4 :PCL 1:4 (1p4p) y 2:4

(2p4p).

Los experimentos se realizaron por triplicado.

El análisis

estadístico de

los resultados

serealizó m

ediante la prueba tde Student.

Resultados y D

iscusión:La figura 2 recoge las m

icrofotografías H

RTEM

de

laspartículas

Fe3 O

4 /PCL obtenidas según las variantes del

procedimiento de síntesis. Las diferencias m

ás im

portantesse

observaron entre

los nanocom

puestos de relación 1:4 y 4:1. Si la relación

inicial entre

las m

asas es

4:1, el

recubrimiento

polimérico

de los

núcleos de

Fe3 O

4 era

prácticamente

inexistente. C

omo

62

mucho llegó a apreciarse ocasionalm

ente en las zonas de contacto entre los núcleos m

agnéticos (figura 2a). En el caso contrario, cuando la relación es 1:4, las partículas de Fe

3 O4 quedaban

totalmente englobadas por una enorm

e matriz

de polímero. Incluso se apreció la form

ación de una excesiva cantidad de partículas de polím

ero puro (figura 2b). Por otro lado, el análisis de la influencia de esta relación Fe

3 O4 :PC

L sobre el rendim

iento de la síntesis, permitió com

probar que éste era m

áximo para una proporción 2:4

90%).

En estas

condiciones de

formulación

(figura 2c), se obtuvieron nanocompuestos

en los

que el

recubrimiento

polimérico

de los

núcleos de Fe3 O

4era

completo y patente. El

análisis PCS de las partículas preparadas según

esta proporción

2:4 perm

itió confirm

ar su

pequeño tamaño (86 ± 12 nm

), muy adecuado

para la vía de administración parenteral.

Figura 2.

Microfotografías

HR

TEM

de las

nanopartículas Fe3 O

4 /PCL obtenidas partiendo

de una relación de masas inicial Fe

3 O4 :PC

L de 4:1 (a), 1:4 (b) y 2:4 (c).

El ensayo MTT puso de m

anifiesto que ninguna de las nanopartículas Fe

3 O4 /PC

L desarrolladas ejercía

citotoxicidad alguna

en las

células SW

480 en

el rango

de concentraciones

investigado. D

e hecho,

no se

apreciaron diferencias significativas entre los valores de absorbancia del control negativo y los de

los diferentes

nanocompuestos

tras 72

horasde

incubación (p> 0.05).

En relación a la utilidad de las nanopartículas Fe

3 O4 /PC

L como agentes de contraste de R

MI,

la figura 3 muestra cóm

o éstas reducen de forma

progresiva (y dependiente de la concentración)el

valor m

edio del

T2

del aceite

mineral

contenido enel fantom

a (92 ms). Teniendo en

cuenta los resultados obtenidos y los valores típicos

para el

T2

en diferentes

regiones anatóm

icas como el colon (3), el hígado (4) y el

cerebro (5), la suspensión de nanocompuestos

2:4 de concentración 13.4 mg/m

L (T2 : 98 m

s) sería adecuada para utilizarse com

o contraste en estas regiones. D

e igual forma, la suspensión de

nanocompuestos

1:4 de

concentración 31.5

mg/m

L también

sería adecuada aunque presente un

T2 un poco m

ás largo.

Figura 3.Mapa T

2 de las suspensiones acuosas de diferente concentración de nanocom

puestos form

ulados según las proporciones Fe3 O

4 :PCL

1:4 (1p4p) y 2:4 (2p4p).

Conclusiones:

La m

etodología de

síntesis desarrollada

permite

obtener nanopartículas

Fe3 O

4 /PCL

con unas

propiedades adecuadas

como agente de contraste en R

MI: pequeño

tamaño, ausencia de toxicidad y dism

inución del T

2 . Se encuentran en desarrollo ensayos in vitroe

in vivoque perm

itan clarificar este uso en el diagnóstico precoz de cáncer de colon.

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iento:Proyectos

FIS 11/02571

yFIS 11/01862 (Instituto de Salud C

arlos III, España).

63

DIFU

SION

DE

LE

VO

DO

PA E

N D

ISOL

UC

ION

ES A

CU

OSA

S C

ON

DIFE

RE

NT

ES V

AL

OR

ES D

E pH

Marisa C

. F. Barros 1, M

iguel A. E

steso1,V

íctor M.M

. Lobo

2 y Ana C

.F. Ribeiro

2

1Departam

ento de Quím

ica Física, Universidad

deA

lcalá, 28871. Alcalá de H

enares, Madrid, España

2Departm

ent of Chem

istry, University of C

oimbra, 3004-535 C

oimbra, Portugal

Introdución: La levodopa (L-3,4-dihihroxifenilalanina) es un am

inoacidoque en el organism

o se transforma

en dopamina

ycuya deficiencia provoca la

enfermedad

de Parkinson.

Esta propriedad

transforma

la levodopa

en el

farmaco

más

utilizado en el tratamiento de

esta enfermedad

1.La levodopa se

administra por vía oral

y se absorbe

rápidamente.

Figura 1 – Fórmula y

estrutura de la levodopa

Laabsorción de un fárm

acoen el organism

ohum

anoim

plica su tránsito a través de una m

embrana celular. Para que este tránsito se

produzca, el fármaco debe penetrar en el interior

de la mem

brana, para locual éste tiene que ser

soluble en la fase lipídica de la mism

a y para que tenga lugar su salida

es necessario queel

fármaco

sea tam

bién soluble

en la

fase fisiológica acuosa de las inm

ediaciones de la m

embrana. Sin em

bargo, laextensión

dela

absorcióny de su

respuesta clínicadepende de

múltiples

factores, incluyendo

el pH

del

estómago e

intestino.

La levodopa presenta distintos valores de pKa,

lo que

significa que

su com

portamiento

estrutural va a depender del pH del m

edio en el que ésta se

encuentra.

Com

o la

absorcion de

lalevodopa

ocurre fundam

entalmente en el tracto gastrointestinal,

por medio de un proceso de difusión pasiva, ello

hace que la magnitud de tal absorción

se vea afectada por los valores del pH

local 2.

Figura 2- Disociacion de la m

olecula de levodopa

3

En esta

comunicación

presentamos

los coeficientes de difusion m

utua de lalevodopa a

pH=1,8

y pH

=3,en

disolució acuosa,

a tem

peraturas am

biente y

fisiologica. D

ichos valores

de pH

se

ajustaron con

ácido clorhídrico.

Variando

el pH

se

ha buscado

obtener información acerca de la cuantía y tipo

de las

especies protonadas

presentes en

la disolución, así com

o de su difusión, en un intento de com

prender mejor el com

portamiento

de este fármaco en el proceso de absorcion

mediante difusión pasiva.

Referencias

1. Carlsson A

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2002,109, 777.2.

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hen et all, J. Sep. Sci. 2004, 27, 1005

Agradecim

ientos:M

arisa.C.F.B

arrosagradece

ala

"Fundação para a C

iência e Tecnologia" la beca recibida SFR

H/B

D/72305/2010.

64

MIC

RO

ESFE

RA

S BIO

DE

GR

AD

AB

LES C

AR

GA

DA

S CO

N K

ETO

RO

LA

CO

PAR

A

AD

MIN

ISTR

AC

IÓN

INT

RA

OC

UL

AR

E. Rodríguez V

illagra, A. Juan Puñales, I.T. M

olina-Martínez, R

. Herrero-V

anrell, I. Bravo-O

suna

Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Facultad de Farmacia, U

niversidad Com

plutense de Madrid,

28040 Madrid.

INT

RO

DU

CC

IÓN

D

entrode

las patologías

que afectan

al segm

ento posterior del ojo se encuentranla

degeneración m

acular asociada

a la

edad (D

MA

E) ylas retinopatías diabéticas. A

mbas

cursan con inflamación. Sin em

bargo,dadoslos

importantes

efectos adversos

que presentan

(aumento de presión intraocular y form

ación de cataratas, entre otros), se está

estudiando la utilización de

antiinflamatorios no esteroideos

(AIN

Es) (1).

De

entre estos,

el ketorolaco

resulta de gran interés(2)como alternativa a los

corticoesteroides en

el tratam

iento post-

operatorio de la inflamación ocular, prevención

o alivio del edema m

acular cistoide, del edema

macular

diabético, de

la uveítis

y de

la degeneración m

acular asociada a laedad (3).La

administración

intravítrea de

sistemas

microparticulares biodegradables de liberación

controlada que

fueran capaces

de m

antener concentraciones terapéuticas de ketorolaco

en el vítreo

durante periodos prolongados de tiempo

supondría una

importante

herramienta

terapéutica para el tratamiento de inflam

aciónintraocular. La utilización de estos sistem

as dism

inuiríade form

a importante el núm

ero de adm

inistraciones.El objetivo de este trabajo ha sido

la evaluación

de la

relación fárm

aco:polímero

en la

preparación de

microesferas (M

Ps) de ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLA

GA

) cargadas con ketorolaco, por el m

étodo de emulsión-evaporación del

disolvente (O

/A),

como

pasoinicial

en la

optimización de la form

ulación.

MA

TE

RIA

LE

S Y M

ÉTO

DO

S Elaboración de m

icroesferas Para

la preparación

de las

microesferas

se preparó com

o fase interna de la emulsión una

dispersión de ketorolaco en una solución de PLA

GA

85:15

en C

H2 C

l2 : A

CN

(3:1)

(volumen=1,4 m

l). Las proporciones fármaco:

polímeros

estudiadosfueron

0,5:10, 1:10

y1,5:10. U

na vez homogenizada la dispersión se

formó

una emulsión m

ediante la adición de 5 ml

de una disolución de acuosa de PVA

(1% m

/v) y

agitación a 9500 rpm durante 2 m

in. A

continuación, se

añadieron10

ml

de una

disolución acuosa diluida de PVA

(0,1% m

/v) y se hom

ogenizó mediante agitación m

ecánica

(9500 rpm, 1 m

in). Tras3h de m

aduración en 100

ml de PV

A 0.1%

p/v, las MPs fueron

recogidas, lavadas y se seleccionó la fracción 20-40

m

para su

posterior estudio.

Las m

icroesferas fueron

liofilizadas y

se conservaron refrigeradas a 4ºC

protegidas de la hum

edad en un desecador a vacío.C

aracterización de microesferas:

Lam

orfología de las microesferas se evaluó por

microscopía electrónica de barrido (SEM

; Jeol, JSM

-6335F, Tokio, Japón). Se determ

inó la distribución del tramaño

de las partículas utilizando un equipo M

icrotrac S-3500 (M

icrotrac, Pensilvania, EEUU

) que mide

la dispersión de la luz laser al incidir sobre las m

icroesferas.El

Contenido y eficacia de encapsulación se

determinó m

ediante disolución inicial de las m

icroesferas en

diclorometano

y posterior

precipitación del

polímero

con etanol.

Lacantidad

de ketorolaco

en la

mezcla

diclorometano + etanol (5+12 m

l) se determinó

por un método espectrofotom

étrico (=314 nm

) previam

ente validado. Los estudios de liberación in vitro se realizaron con

dos replicados de una muestra de M

Ps (10 m

g) que fueron suspendidos en 1.5 ml de PBS

pH

7.4. El

ensayo se

realizó a

37 ºC

en

agitación constante (100oscilaciones/m

in) (4).La tom

a de muestras se realizó a intervalos de

tiempo pre-establecidos (1h, 24h y una vez por

semana hasta el final del estudio), m

ediante extracción del volum

en de medio de cesión y

posterior reposición del mism

ocon tam

pón recién

preparado.La

cuantificación del

principio activo

se llevó

a cabo

por espectrofotom

etría.

RE

SUL

TA

DO

S Y D

ISCU

SIÓN

Se ha calculado el valor de rendim

iento del proceso de elaboración de M

Ps para cada una de

las proporciones

fármaco:

polímero

empleadas, obteniendo los resultados recogidos

en la Figura 1.

65

45,5%52,7%

40,6%

0 10 20 30 40 50 60

0,5:101:10

1,5:10

Rendimiento (%)

Figura 1: Rendimientos m

edios del proceso de elaboración de M

Ps obtenido para cada una de las formulaciones

ensayadas. La eficacia de encapsulación obtenida en las form

ulaciones ensayadas

se encontró

comprendida entre 55 y 60%

para todas las proporciones fárm

aco: polímero. Sin em

bargo en

la observación realizada en el microscopio

electrónico,se

observaron cristales

de ketorolaco

fuera de

las m

icroesferas en

laform

ulación elaborada

con una

proporción fárm

aco:polímero 1,5:10

(Figura 2).En todos

los casos las microesferas resultaron esféricas y

con una

superficie lisa.

Junto a

las m

icrofotografíasse

muestran

las gráficas

obtenidas en el análisis granulométrico de cada

formulación,

Lostam

añosm

edios(M

v)obtenidos fueron

de 22,05± 1,36

men la

formulación 0,5:10, 49,28 ± 0,28

men la

formulación 1:10 y 26,99

± 13,46 m

en la form

ulación 1,5:10.

0 5 10 15

010

% Volumen

Size (m

)

0 5 10 15

050

% Volumen

Size (m

)

0 5 10 15

050

% Volumen

Size (m

)

Figura 2.Microfotografía de las M

Ps de PLAGA 85:15

cargadas con Ketorolaco y distribución granulométrica.

En la Figura 3 serecoge la representación

gráfica de los perfiles de cesión para las tres form

ulaciones ensayadas junto aldiagram

a de

barras de la cesión inicial (burst) a las 24 horas del ensayo. C

omo se puede observar,a m

edida que dism

inuye la relación fármaco : polím

ero, dism

inuye la cesión inicial de ketorolaco.Para

todas las formulaciones se observa una cesión

controlada de

ketorolaco durante

aproximadam

ente 2 meses.

0 20 40 60 80

100

120

020

4060

80

g de K/mg MP

Días

0,5:10

1:10

1,5:10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0,5:101:10

1,5:10

g de K/mg MP

Figura 3.(a) Representación gráfica de los perfiles de

cesión (±DE) obtenidos para las tres form

ulaciones ensayadas. (b) Representación gráfica de la cesión inicial

(Burst) a las 24 h de ensayo.

CO

NC

LU

SION

ES

El m

étodo desarrollado

permite

obtener form

ulaciones con eficacias de encapsulación de entre 55-60%

con un tamaño m

edio de partícula

idóneo para

la adm

inistración intraocular

y una

cesión m

antenida de

ketorolaco durante dos meses.

AG

RA

DE

CIM

IEN

TOS

RETICS net (RD

07/0062/2002). UC

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of 0.5%

K

etorolac Trom

ethamine

Solution and

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0,5:10

1:10

1,5:10

(a)(b)

66

EST

UD

IO D

E E

STA

BIL

IDA

D D

E FÓ

RM

UL

AS L

ÍQU

IDA

S OR

AL

ES D

E M

ET

AD

ON

A.

M. M

allandrich1,N

. Provenza1,B

. Clares 2,L.H

albaut 1, F. Fernández1,A

. Flo1, A

.C. C

alpena1

1Departm

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de B

arcelona. Barcelona, España

2Departm

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de G

ranada. Granada, España.

Introducción:

En España, las formulaciones líquidas orales de

Metadona

están únicam

ente com

ercializadas para adultos. Los neonatos expuestos durante la gestación

a ciertas

sustancias, pueden

desarrollar una

dependencia física

(1,2). La

Metadona es el fárm

aco más prescrito para

tratar este síndrome. N

o obstante, considerar al niño com

o si fuera una adulto pequeño puede llevar

a grandes

errores de

dosificación de

fármacos.

La falta

de disponibilidad

en el

mercado

farmacéutico

de productos

adaptados a

las necesidades de la población pediátrica, y en especial,

a las

del neonato,

conduce a

la elaboración

de fórm

ulas m

agistrales y

éstas presentan una gran variabilidad en

el diseño.

En nuestro entorno, son pocos los estudios que han

valorado la

utilización de

fórmulas

magistrales para el uso en pediatría. Es decir,

que el mayor inconveniente para difundir estos

fármacos es la falta de investigación no sólo a

nivel clínico sino a nivel tecnológico.

El objetivo del presente trabajo fue estudiar la estabilidad de 2 soluciones orales de M

etadona 0.2 m

g/ml, una de ellas apta para diabéticos en 3

condiciones de almacenam

iento (4, 25 y 40ºC)

durante30

días.

Materiales y M

étodos:

Materiales

La M

etadona fue

adquirida a

través de

la A

gencia Española del Medicam

ento de acuerdo con la norm

ativa vigente.

El resto de excipientes fueron proporcionadospor A

cofarma S.A

.

La composición de las soluciones orales de

Metadona estudiadas se m

uestra en la tabla 1.

Solution 1Solution 2

Metadona hidrocloruro

0.2 mg/m

L0.2 m

g/mL

Agua

50%

50%

Excipiente 150

%-

Excipiente 2 *-

50 %

Tabla 1.C

omposición de las fórm

ulas líquidas orales de M

etadona. * Excipiente 2: apto para diabéticos.

Método analítico

El método analítico fue validado a partir de 6

rectas de

calibración, preparadas

en días

diferentes (validación interdía). Com

o criterios fundam

entales de validación se utilizaron la linealidad, precisión, exactitud y los lím

ites de detección y de cuantificación (3).

La cuantificación de principio activo se llevó a cabo m

ediante cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC

): cromatógrafo W

aters 600C

acoplado A

utosampler

Waters

717 plus.

Detector Photodiode W

aters 2996 ajustado a 220nm

, columna M

editerranea Sea18, 5m

m 25

x 0.46 mm

, flujo de 1ml/m

in, la fase móvil

estaba compuesta por una m

ezcla de Acetato de

amonio 0.025M

: Acetonitrilo (20:80).

Estudio de estabilidad

Alícuotas

de 20

ml

de cada

una de

las form

ulaciones fueron almacenadas en

frascos de vidrio topacio a las diferentes condiciones de tem

peratura, 4, 25 y 40ºC. El periodo de estudio

comprendió

1 m

es. Los

ensayos fueron

realizados a 0, 7, 15 y 30 días. Se monitorizaron

los siguientes parámetros:

Características organolépticas: aspecto,

color y olor.C

uantificación de principio activo: de am

bas fórmulas.

pH: se realizó un seguim

iento de pH

mediante el pH

metro C

rison micropH

200.D

eterminación

de la

viscosidad:m

ediante H

aake R

heometer

Rheo

Stress 1, usando una geometría plato-

plato.

Análisis estadístico:

El número de determ

inaciones efectuadas por fórm

ula, tiempo y tem

peratura fueron 6. Se calcularon los valores m

edios y la desviación estándar. C

on objeto de comprobar si existen

diferencias significativas

entre las

medias

comparadas, todos los resultados se som

etieron a un tratam

iento estadístico AN

OV

A para un

nivel de confianza del 95 %.

Resultados y D

iscusión:

Método analítico:

Validación:

El m

étodo analítico

desarrollado resultó

ser lineal,

preciso y

exacto en

el rango

de

67

concentraciones deM

etadona de1.76-20

g/ml.

Los límites de detección y cuantificación fueron

0.46 y 1.38 g/m

l respectivamente.

Estudio de Estabilidad:

Características O

rganolépticas:

Al

inicio del

estudio, todas

las soluciones

resultaron transparentes, de color rosado y olor a fresa. Estas características se m

antuvieron hasta el día 30.

Cuantificación del principio activo:

En las gráficas 1y 2

se muestran

la evolución de la concentración de M

etadona determinada

para cada una de las fórmulas ensayadas

en función del tiem

po y de la tem

peratura de alm

acenamiento.

Solución 1

010

2030

4080 90

100

11042540

Tiempo (D

ías)

Conc (%)

Figura 1. C

oncentración de Metadona en la Solución

1 expresado en porcentaje respecto a la concentración inicial de día 0.

Solución 2

010

2030

4080 90

100

11042540

Tiempo (D

ías)

Conc (%)

Figura 2. C

oncentración de Metadona en la Solución

2 expresado en porcentaje respecto a la concentración inicial de día 0.

En am

bas soluciones

la concentración

de M

etadona se

mantuvo

dentro del

intervalo ±10%

durante 30 días en todas las condiciones de alm

acenamiento.

Estudio de pH:

El pH

de

ambas

soluciones no

mostró

diferencias significativas a lo largo del tiempo

en ninguna de las condiciones de temperatura de

conservación.

Estudio reológico:

En la figura 3 se muestran las curvas de flujo y

curvas de

viscosidad para

cada una

de las

formulaciones estudiadas. La gráfica m

uestra un com

portamiento N

ewtoniano para la Solución 1;

frente a un comportam

iento pseudoplástico para la

solución 2.

Desde

el punto

de vista

tecnológico este último sería m

ás adecuado para la adm

inistración deun jarabe pediátrico. Se ha

comprobado com

o un aumento de la viscosidad

tras la

adición de

modificadores

reológicos com

o gomas o carbohidratos puede reducir la

difusión de sustancias amargas de la saiva a las

papilas gustativas (4).

Los valores

de viscosidad

hallados para

la Solución 1 fueron de 7.99±0.11 a día 0 y de 7.84±0.05 a día 30. La Solución 2, a día 0 el valor de viscosidad fue de 15.12±0.02 y de 14.94±0.05 a día 30.

Figura 3. Gráficas de

viscosidad. Izquierda, Solución 1. D

erecha,Solución 2.

Conclusiones:

Los resultados

obtenidos indican

que las

soluciones de

Metadona

objeto de

estudio fueron estables durante 30 días sin cam

bios significativos por causa de la tem

peratura. Así

mism

o m

ostraron valores

constantes y

adecuados de pH y viscosidad en función del

tiempo.

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LO

GIC

AL

CH

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AC

TE

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TIO

N O

F SEV

ER

AL

SEM

ISOL

ID FO

RM

UL

AT

ION

S C

ON

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ININ

G D

IFFER

EN

T E

NH

AN

CE

RS FO

R B

UC

CA

L T

OPIC

AL

AD

MIN

ISTR

AT

ION

OF

DR

UG

S R

. Sanz1, A

. Flo1, N

. Provenza1, M

. Ronzadilla

1, L. Halbaut 1, M

. Mallandrich

1, B. C

lares 2,AC

Calpena

1. 1D

epartment ofPharm

acy and Pharmaceutical Technology, Faculty of Pharm

acy, University of B

arcelona, Barcelona, Spain.

2Departm

ent of Pharmacy and Pharm

aceutical Technology, Faculty of Pharmacy, U

niversity of Granada, G

ranada, Spain.,

Introduction:

Oral m

ucosal drug delivery is an alternative m

ethod of systemic drug delivery that offers

several advantages

over both

injectable and

enteral methods. A

s the oral mucosa is highly

vascularised, drugs absorbed through the oral m

ucosa directly enter the systemic circulation,

bypassing the gastrointestinal tract and first-pass m

etabolism in the liver (1).

Oral m

ucosa is, in general, a somew

hat leaky epithelia betw

een that of the epidermis and that

of the intestinal mucosa. It is estim

ated that the perm

eability of the buccal mucosa is 4-4000

times greater than that of the skin (2).

How

ever, one

of the

major

disadvantages associated w

ith buccal drug delivery is the low

flux which results in low

drug bioavailability.

Orabase

®has been chosen as the base for the

tested formulations due to its safety profile and

the fact that it is well reported in the literature as

a comm

on vehicle for buccal formulations.

Various com

pounds have been investigated for their use as buccal penetration enhancers in order to increase the flux of drugs through the m

ucosa. Since the buccal epithelium is sim

ilar in structure to other stratified epithelia of the body,

enhancers used

to im

prove drug

permeation in other absorptive m

ucosa have been show

n to also work in im

proving buccal drug penetration (3).Perm

eation enhancers should be safe and non-toxic, pharm

acologically and chemically inert,

non-irritant, and

non-allergenic (4).

After

a literature search, m

yristylic alcohol, menthol,

N-m

ethylpyrrolidone and

trascutol w

ere selected as candidates to help perm

eate drugs.

Different

physical properties

in sem

isolid form

ulations m

ay affect

drug release

and transm

ucosa permeation. A

lso, they are likely to result in a different feel w

hen administered (5).

As w

ell as viscosity plays an important role for

transmucosa

formulations,

viscoelasticity is

reported to be a way to assess the physical

properties of semisolids (5).

Therefore, the aim of this study is to assess,

from a rheological point of view

, the influence of

different enhancers

in a

semisolid

formulation w

hich could be used as a vehicle for topical buccal application of drugs.

Material and M

ethods:

The different

semisolid

formulations

were

prepared using

Orabase

®as

the m

ain com

ponent. One of the form

ulations did only contain O

rabase®

and was, therefore, used as

reference (O).

For the

other form

ulations, 5%

of

either m

enthol (M) or m

yristyl alcohol (A) or N

-m

ethylpyrrolidone (N

) w

as added

to the

Orabase

®. Besides, another set of sam

ples were

prepared by adding 10% transcutol (T) to the

previous formulations.

The rheological analysis was perform

ed with

the HA

AK

E rheometer R

heo Stress 1, using a plate-plate geom

etry (6 cm in diam

eter and 0.2 m

m gap betw

een plates for the rotational test).R

otational viscosimetry m

easurements at 25 ºC

were carried out at three different shear rates

(25, 50 and 100 s -1) and recorded during 60 s after the corresponding three ram

p-up periods of 60 s (from

0 to 25 s -1, 25 to 50 s -1and 50 to 100 s -1).O

scillatory tests

firstly included

a stress

amplitude

sweep

test w

hich w

as perform

ed from

0.01 to 10 Pa at a constant frequency of 1 H

z to determine the linear viscoeslastic range.

Three different gaps between plates w

ere tested (0.2, 0.5 and 1 m

m).

After

this, a

frequency sw

eep test

was

performed from

0.1 to 10 Hz at a constant shear

stress within the linear viscoelastic region in

order to determine the related variation of the

storage modulus (G

’) and loss modulus (G

’’) at 25 ºC

. Both viscoelastic m

oduli are defined as follow

s:

and (w

here 0 and

0 are the amplitude of stress and

of strain, respectively, and is the phase shift

between them

).

Rotational

viscosity m

easurements

and oscillatory tests w

ere performed by triplicate.

Results and D

iscussion:

Rotational viscosim

etry tests showed that the

different form

ulations have

a pseudoplastic

behaviour, as in all cases the viscosity decreased w

ith the increase of share stress rate (Table 1). M

oreover, the

addition of

an enhancer

to O

rabase®

significantly decreased the viscosity of the adhesive excipient. Even m

ore effect on

69

the viscosity level was observed by the addition

of transcutol

alone or

in com

bination w

ith another enhancer.

Sample

VISC

OSIT

Y at 25 ºC

(Pa.s)25 s -1

50 s -1100 s -1

O8.27 ± 0.084

6.93 ± 0.103.96 ± 0.31

OT

2.78 ± 0.0431.50 ± 0.13

0.84 ± 0.089O

M6.36 ± 1.18

4.16 ± 0.192.91 ± 0.26

OM

T1.80 ± 0.13

0.97 ± 0.0500.90 ± 0.082

OA

4.83 ± 0.204.05 ± 0.70

2.59 ± 0.32O

AT

1.63 ± 0.0050.93 ± 0.012

0.78 ± 0.012O

NT

3.09 ± 0.0541.48 ± 0.060

0.82 ± 0.013T

able 1. Results of rotational viscosim

etry (O: O

rabase ®

cream; O

T: 10%

Transcutol in Orabase ®; O

M: 5%

M

enthol in

Orabase ®;

OM

T:

5%

Menthol

+ 10%

T

ranscutol in Orabase ®; O

A: 5%

Myristyl alcohol in

Orabase ®; O

AT

: 5% M

yristyl alcohol + 10% T

ranscutol in O

rabase ®; ON

T: 5%

N-M

ethylpyrrolidone + 10%

Transcutol in O

rabase ®)

According to the results of the oscillatory stress

sweeps, a plate gap of 0.5 m

m and a constant

shear stress of 1 Pa (16.7% of the critical value

of 6 Pa) were selected to perform

the frequency sw

eep test.

Results of the oscillatory test for tw

o of the studied form

ulations are shown in Figures 1 and

2 as examples.

O

100

1000

10000

100000

0.11

10F in H

z

G' in Pa and G'' in Pa

10 100

1000

10000

100000

n in Pas

G' in Pa

G" in Pa

Fig. 1. Dynam

ic oscillatory test (plain Orabase ®)

A-T

100

1000

10000

100000

0.11

10

F in Hz

G' in Pa and G'' in Pa

10 100

1000

10000

100000

n in Pas

G' in Pa

G" in Pa

Fig. 2. Dynam

ic oscillatory test (myristyl alcohol +

transcutol in Orabase ®)

In the

whole

frequency range

studied, the

storage modulus G

’ was alw

ays greater than the loss m

odulus G’’. That indicates prevalence of

the elastic over the viscous behaviour.

Significant differences were detected betw

een the different form

ulations:V

iscosity levels decreased for all formulations

containing at least one permeation enhancer.

Neither transcutol alone or com

bined with N

-m

ethylpyrrolidone did

significatively change

the viscoelastic behaviour of the formulation

when com

pared to the reference one (plain O

rabase®). H

owever, both m

yristyl alcohol and m

enthol did show a decrease on both the elastic

and viscous behaviour of the formulations. Such

decrease being

more

pronounced w

hen com

bined with transcutol. Finally, there w

ere no relevant

differences on

the viscoelastic

behaviour observed between the form

ulations containing m

enthol and myristyl alcohol.

Conclusions:

The addition of permeation enhancers to an

adhesive excipient

for buccal

topical adm

inistration as

Orabase

®does

modify

its physical properties.

Viscosity

of the

tested form

ulations drops

whenever at least one perm

eation enhancer is used.

As

regards their

viscoelastic behaviour,

transcutol alone

and com

bined w

ith N

-m

ethylpyrrolidone failed to modify the viscosity

component of the form

ulations suggesting same

adhesiveness as Orabase

®on its ow

n. All other

semisolid

formulations

tested did

present a

different viscoelastic

behaviour w

hich could

imply different drug perm

eation and treatment

compliance by the patient.

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70

Diseño de em

ulsiones mucoadhesivasA

/S conteniendociprofloxacino

para su empleo en el tratam

iento de la enferm

edad pélvica inflamatoria

Cam

paña SeoaneM

. J., Pérez Gago A

., Otero EspinarF.J.

Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica,Facultad de Farm

acia, Universidad de Santiago de C

ompostela

INT

RO

DU

CC

ION

La enfermedad pélvica inflam

atoria es una patologíade

transmisión sexual que consiste en la infección de la

zona alta del aparato reproductor femenino (útero,

trompas de Falopio, ovarios y tejidos circundantes)

causada principalm

ente por

clamidia,

cándida o

gonococo y en menor m

edida por estafilococos y estreptococos. Es frecuente que aparezca com

o una com

plicación grave de enfermedades de transm

isión sexual

y su tratamiento consiste en la adm

inistración com

binadade antibióticos por vía oral o parenteral,

quirúrgicoen aquellos casos m

ás graves. U

no de los problem

as en

sutratam

iento es

la dificultad

para identificar a los m

icroorganismos que infectan los

órganos genitales

internos y

que para

alcanzar concentraciones eficaces en estos lugares a veces es necesario m

antener altas concentraciones plasmáticas

durante tiempos prolongados.

La vía vaginalpresenta

un interesante potencial como ruta de adm

inistración de

fármacos

a nivel

sistémico

debido a

la gran

superficie disponible

para la

absorción, alta

permeabilidad

y abundante

vascularización(1).

Adem

ás es especialmente interesantes para la fárm

acos que actúen a nivel de los órganos genitales internos

ya que se ha descrito un efecto de prim

er paso preferente hacia el útero, dando lugar a una elevada concentración a estos niveles (2). En un trabajo previo

(3)hem

os puesto de m

anifiesto el interés de las emulsiones A

/S bioadhesivas com

o sistemas de adm

inistración vaginal,estas em

ulsiones presentan gran extensibilidad, buena adherencia y perm

anenciay baja toxicidad

en las m

ucosas (4).N

uestroobjetivo es la elaboración de em

ulsiones A/S

bioadhesivosconteniendo ciprofloxacino, insensibles al aclaram

inento del

flujo vaginal.

Las em

ulsiones seleccionadas se em

plearán en un futuro trabajo paraevaluación com

o posible tratamiento de la enferm

edad pélvica inflam

atoria.

MA

TERIA

LES Y M

ETOD

OS

Elaboración de emulsiones

Las emulsiones se elaboraron m

ediante emulsificación

directa em

pleando un

homogeneizador

Unguator

2 (M

icrocaya)(3). La com

posición de las emulsiones

elaboradas figura en la tabla 1.

Tabla

1. C

omposición

de las

emulsiones

A/O

elaboradas en este trabajo.

Jeringabilidad (estudios de extrusión)

Se determina el trabajo necesario para la

descarga de las m

uestrasa través de una jeringa

de 1 ml.La jeringa

cargada se

sitúa en

eltexturóm

etro TA

.XT.plus

desplazando el émbolo 2 cm

a 2 mm

/seg, registrando la fuerza vs distancia

Efecto del fluido vaginal sobre la bioadhesion

Se determina la fuerza m

áxima y el trabajo de adhesión

requerido para separar dos discosde cuero curtidoentre

los que

se encuentra

la m

uestra, em

pleando un

texturómetro TA

-XT

(5).Se fija un disco de cuero en el punzón superior y otro sobre una placa que se fija al soporte inferior. Se

depositan 0.2 ml de m

uestra en eldisco

inferior y se adiciona fluido vaginal simulado

(FVS) a 37ºC

. Se hace descender el punzón superior a 1 m

m/seg hasta el disco entra en contacto con la

muestra y ejerce una fuerza de 0.5 N

. El punzón sem

antiene 60 seg. y se hace retornar a una velocidad de 1 m

m/seg hasta una altura de 2 cm

. Pasado 1 min se

reiniciael ciclo com

presión-extensión en las mism

as condicionesy se repite 10

veces.

El efecto de arrastre de la crema por efecto del fluido

se estudia empleando viales de fondo plano en los que

se deposita 1 g de emulsión que se cubre con 5 m

l de FV

S. A

intervalos

de tiem

po predeterm

inados se

retiran todo el FVS, se pesa para determ

inar la crema

arrastrada y se repone FVS de nuevo. Se calcula

además

la concentración de CFX

en las muestra de

FVS retiradas para estudiar su liberación. El ensayo se

realiza a 37º y con agitaciónorbital (100 rpm

).

Liberación de ciprofloxacino

Para completar la liberación se

realizóun estudio

empleando

células de

Franzverticales,

usandom

embrana

de diálisis

entrelos

compartim

entos y

tampón fosfato

como m

edioaceptor.

El ensayo se realizo

a 37º

determinando

el contenido

de

pentámeratetramera

Ciclometicona

1515

ClNa2

2Abil W

E 095

5Glicerol

33

ciprofloxacino2

2Agua

6767

71

progesterona en el aceptor espectrofotométricam

ente a 234nm

.

RESU

LTAD

OS Y

DISC

USIO

N

Todas las

emulsiones

A/S

presentaron valores

de jeringabilidad

comprendidos entres 160 y 260

N·m

m,

inferiores a los 380 N.m

m , lím

itepara form

ulaciones inyectables cuando se em

plean para su administración

agujas hipodérmicas(3).

02

46

810

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

D5

D4

Crinone

KY

JellyZidoval

Ciclo

Trabajo de adhesión N.mm

Figura 1.

Influencia del

fluido vaginal

sobre la

capacidad bioadhesiva de las formulaciones vaginales.

Las dos emulsiones O

/S de ciprofloxacino presentan valores de bioadhesión superiores a los obtenidos para tres form

ulaciones bioadhesivasvaginales com

erciales. A

demás tal com

o se observa en la figura 1 las tres

formulaciones

de referencia,

elaboradas em

pleando polím

eros derivados del ácido poliacrílico,pierdensu

capacidad bioadhesiva a medida que transcurren los

ciclos de compresión/extensión, com

o consecuencia de su

dilución conel fluido vaginal. A

partir de sexto ciclo presentan ya valores m

uy bajosreflejo de la total

pérdida de su capacidad bioadhesiva. Por el contrario las em

ulsiones A/S m

antienen los niveles de adhesión prácticam

ente constantes durante todo el experimento,

indicando que no sufren efectos negativos porarrastre

o dilucióncon

losfluidos biológicos.

Adem

ás de

la capacidad

de bioadherencia

es im

portante que las formulaciones resistan el continuo

aclaramiento al que son som

etidas por efecto del fluido vaginal. Los resultados de pérdida de m

asa causado por el arrastre del FV

S se muestran en la figura 2 y se

observa quetras 8 horas de agitación continua en

presencia del fluido no se observa una pérdida aparente de peso

enninguna de las

emulsiones, apreciándose

incluso una

pequeña ganancia

enel

tiempo

probablemente

causada por incorporación de medio

en el seno de las em

ulsiones provocando elaumento de

su peso.

La determinación del ciprofloxacino liberado durante

estos estudios se muestran en la figura 3.

060

120180

240300

360420

4800.0

0.1

0.2

0.3D

4D

5

Tiempo (m

in)

mg emulsión

Figura 2. Variación de peso de las em

ulsiones en presencia de FV

S.

Se observa una lenta liberación del CPF a partir de las

emulsiones

independientemente

del tipo

de cilom

eticona empleada en su elaboración. El perfil de

liberación se ajusta a una cinética de Higuchi con unos

coeficientes de

determinación

del 99.4

y 99.2%

indicando

que es

un proceso

controlado preferentem

ente por la difusión del fármaco.

060

120180

240300

360420

4800 20 40 60 80

100D

4D

5

Tiempo (m

in)

g CPX liberado

Figura 3. Resultados de los ensayos de liberación in

vitro

CO

NC

LUSIO

NES

Debido a sus buenas propiedades bioadhesivas, la

resistencia al aclaramiento y control de liberación

lasem

ulsiones A

/S propuestas

pueden una

buena alternativa para la adm

inistración vaginal de CPX

.

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IAS.

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72

NU

EV

AS E

VID

EN

CIA

S EX

PER

IME

NT

AL

ES D

EL

EFE

CT

O D

E L

A PO

RO

SIDA

D D

E

MA

TR

ICE

S INE

RT

ES E

N L

A L

IBE

RA

CIÓ

NÁ

. Aguilar-de-Leyva

1,C. C

ifuentes 1, A.R

. Rajabi-Siahboom

i 2,I. Caraballo

1

1Departm

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica. Universidad de Sevilla. C

/Profesor García

González, 2. 41012. Sevilla. España.

2Colorcon Inc. G

lobal Headquarters, 275 R

uth Road, H

arleysville, PA 19438, EEU

U.

Introducción: Las matrices inertes son sistem

as que consisten en una red sólida polim

érica y porosa que es insoluble e indigerible en el tracto gastrointestinal

(1). La liberación del principio activo

desde estas formas farm

acéuticas ocurre por difusión del fárm

aco a través de los poros de las m

atrices, incluyendo los poros iniciales y los poros que aparecen cuando el fárm

aco olos

excipientes solubles se han disuelto(2).

La etilcelulosa es un polímero insoluble usado

en la

fabricación de

diferentes form

as farm

acéuticas sólidas

orales, entre

ellas las

matrices

inertes de

liberación prolongada,

pudiendo actuar como excipiente form

adorde

matrices m

ediante compresión directa (3).

La teoría

de la

percolación es

una teoría

derivada de la física estadística que estudia sistem

as caóticos o desordenados. Esta teoría ha sido

ampliam

ente aplicada

al cam

po farm

acéutico desde

1987, em

pezándose a

aplicar al estudio de sistemas m

atriciales inertes de liberación prolongada (4).La teoría de la percolación estudia la existencia de

puntos críticos

que en

los com

primidos

corresponden con concentraciones críticas de uno o m

ás componentes del sistem

a, incluyendo la porosidad.

En el umbral de percolación,

un com

ponente del

sistema

experimenta

una transición geom

étrica de fases, empezando a

formar una red que recorre

todo el comprim

ido y teniendo una influencia m

ucho mayor en las

propiedades del mism

o. Por tanto es de esperar que cuando un com

ponente alcanza su umbral

de percolación, ocurran cambios repentinos en

las propiedades

del sistem

a que

estén relacionadas

con este

componente.

Nos

encontraríamos

en este

caso ante

un punto

crítico del sistema.

Enla

formulación

de m

atrices inertes

de liberación prolongada lo ideal es que am

bos, fárm

aco y excipiente se encuentren por encima

de su umbral de percolación. D

e esta forma nos

aseguramos que el fárm

aco se va a liberar por com

pleto y que el excipiente formador de m

atriz va a actuar controlando la liberación (5).El

objetivo de

este trabajo

es estim

ar la

influencia de

la porosidad

de com

primidos

matriciales

inertes m

ulticomponentes

de liberación

controlada, elaborados

conetilcelulosa com

o polímero form

ador de matriz,

en la liberación de carbamazepina.

Materiales

y M

étodos: Los

materiales

empleados

fueron: C

arbamazepina

(Fagron, España), ETH

OC

EL 7 FPy

ETHO

CEL 10 FP

(Colorcon

Ltd., U

K)

como

polímeros

formadores de m

atrices inertes, lactosa fast flow

(Foremost, EEU

U)

como diluyente y

estearato de m

agnesio (Fagron, España) y AER

OSIL 200

(Evonik, A

lemania)

como

lubrificante y

deslizante, respectivamente.

Se elaboraron

10lotes

de 60

comprim

idos m

atriciales de

300 m

g de

peso(5

lotes conteniendo

ETHO

CEL

7 FP

y 5

lotes conteniendo

ETHO

CEL

10 FP)

con un

contenido en carbamazepina del 30%

p/p, 40%

p/p de

etilcelulosa7

FP y

10 FP,

respectivamente

y 5 niveles de porosidad inicial, variando desde el 0 al 25 %

v/v mediante

compresión

directa, en

una m

áquina de

comprim

ir excéntrica (Bonals A

-300, España). La tabla 1 m

uestra la composición y los niveles

de porosidad de estos lotes.

aPorosidad inicial entre0%

y 5% v/v.

bPorosidad inicial entre5%

y 10% v/v.

cPorosidad inicial entre 10% y 15%

v/v.dPorosidad inicial entre 15%

y 20% v/v

ePorosidad inicial entre 20% y 25%

v/v

Tabla

1: C

omposición

de las

diferentes form

ulaciones preparadas.

Se realizaron estudios de disolución del fármaco

en un aparato USP Sotax A

T7 smart (Suiza). El

porcentaje de

carbamazepina

liberada en

función del

tiempo

fue m

edida en

un espectrofotóm

etro de

UV

/VIS

Agilent

8453 (EEU

U)

a una longitud de onda de 284 nm. El

análisis de los datos obtenidos se llevó a cabo utilizando los principales m

odelos cinéticos.

Resultados y D

iscusión:Independientem

ente del tipo de polím

ero empleado puede observarse

que los

perfiles de

liberación m

uestran 3

comportam

ientos diferentes

que pueden

ser relacionados con el um

bral de percolación del

CB

ZE

thocel

7 FP

Ethocel

10 FP

Lactose

SiO2

Mg

stearate

7FP CA

a30.0

40.029.0

0.50.5

7FP CB

b30.0

40.029.0

0.50.5

7FP CC

c30.0

40.029.0

0.50.5

7FP CD

d30.0

40.029.0

0.50.5

7FP CE

e30.0

40.029.0

0.50.5

10FP CA

a30.0

40.029.0

0.50.5

10FP CB

b30.0

40.029.0

0.50.5

10FP CC

c30.0

40.029.0

0.50.5

10FP CD

d30.0

40.029.0

0.50.5

10FP CE

e30.0

40.029.0

0.50.5

73

diluyente más la porosidad inicial (Figuras 1 y

2). Los lotes CA

, con menor porosidad inicial

(0-5%

v/v), m

uestran una

velocidad de

liberación del fármaco claram

ente menor que

puede atribuirse

a que

estas m

atrices se

encuentran por

debajo del

umbral

de percolación

del diluyente

soluble m

ás la

porosidad inicial (por debajo del 30% v/v en

ambos

casos). En

el extrem

o opuesto

se encuentran los lotes C

D y C

E que muestran la

mayor

velocidad de

liberación. Estos

lotes presentan una porosidad inicial superior al 15%

v/v

por lo que se espera que estén por encima

del umbral de percolación del diluyente soluble

más la porosidad inicial.Por últim

o los lotes CB

y C

C, con una porosidad inicial com

prendida entre

el 5

y el

15%

v/v, m

uestran un

comportam

iento intermedio entre los expuestos

previamente.

Basándose

en la

teoría de

la percolación,

estos lotes

muestran

un com

portamiento típico de un cluster incipiente,

que indica que estos lotes estánm

uy próximos

al umbral de percolación del diluyente soluble

más la porosidad inicial.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

030

6090

120150

180210

240270

300330

360390

420450

480

% Fármaco liberado

Tiempo (m

inutos)Lote 7FP_CA 0%

-5% Porosidad

Lote 7FP_CB 5%-10%

Porosidad

Lote 7FP_CC 10%-15%

PorosidadLote 7FP_CD 15%

-20% Porosidad

Lote 7FP_CE 20%-25%

Porosidad

Figura 1. Perfiles de liberación de los lotes que contienen

carbamazepina

y 40%

w

/w

de ETH

OC

EL 7 FP.

0 10 20 30 40 50 60 70

030

6090

120150

180210

240270

300330

360390

420450

480

% Fármaco liberado

Tiempo (minutos)Lote 10FP CA 0%-5% Porosidad

Lote 10FP CB 5%-10% PorosidadLote 10FP CC 10%-15% Porosidad

Lote 10FP CD 15%-20% PorosidadLote 10FP CE 20%-25% Porosidad

Figura 2.Perfiles de liberación de los lotes que contienen

carbamazepina

y 40%

w

/w

de ETH

OC

EL 10 FP.

Asim

ismo, el efecto de la porosidad se puede

observar como factor individual. Las Figuras 3

y 4 muestran un aum

ento en la velocidad de liberación del fárm

aco entre el 12.5 y el 17.5%

de porosidad

inicial. Estos

resultados concuerdan con las predicciones de la teoría de

la percolación. Es bien conocido que el umbral

de percolación de los poros en un sistema sólido

se encuentra en torno al 16%(6).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

05

10

15

20

25

% Fármaco liberado

% P

oro

sidad

inicial

60 m

inuto

s

180 m

inuto

s

360 m

inuto

s

Figura 3.Porcentaje de fármaco liberado frente

a la porosidad inicial en lotesque contienen

carbamazepina y ETH

OC

EL7 FP.

0

10

20

30

40

50

60

05

10

15

20

25

% Fármaco liberado

% P

oro

sidad

inicial

60 m

inuto

s

180 m

inuto

s

360 m

inuto

s

Figura 4.Porcentaje de fármaco liberado frente

a la porosidad inicial en lotes que contienen carbam

azepina y ETHO

CEL

10FP.

Referencias:

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tablets. Journal

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Agradecim

ientos:Los

autores quieren

expresar su

gratituda

Colorcon por

financiar este estudio y por el sum

inistro de ETHO

CEL™

.

74

PRO

PIED

AD

ES R

EO

LÓ

GIC

AS

DE

GE

LE

S DE

CH

ITO

SAN

MO

DIFIC

AD

O

M.C

asas 1,C. Ferris 2, M

.J.Lucero1, V

. de Paz2,M

.R.Jim

énez-Castellanos 1

1Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de Sevilla, España

2Departam

entode Q

uímica O

rgánica y Farmacéutica, U

niversidad de Sevilla, España

Introducción: El chitosan es un polisacárido natural,

biocompatible

y biodegradable

que procede de la hidrólisis de la quitina. Es una base débil que form

a hidrogeles en presencia de aniones m

ultivalentes gracias ala carga positiva

de sus grupos amino. Se utiliza am

pliamente en

el cam

po biom

édico y

farmacéutico

con m

últiples aplicaciones.

Adem

ás, el

chitosan posee

buenaspropiedades

mucoadhesivas,

considerándose un

polímero

bioadhesivo “natural” que puede adherirse

a tejidos duros y blandos. Es por ello que se ha utilizado en sistem

as de liberación de fármacos a nivel de las

mucosas. Ensayos clínicos usando biom

ateriales basados en chitosan no m

uestran reacciones inflam

atorias o alérgicas tras la implantación,

inyección, aplicación tópica o ingestión en el cuerpo hum

ano (1). Sin embargo, posee ciertas

limitaciones, com

o su naturaleza hidrofílica o su insolubilidad en algunos m

edios fisiológicos, que pueden solventarse con la m

odificación quím

ica(2).

En los

últimos

años nuestro

grupo de

investigación viene

desarrollando nuevos

hidrogeles debido

a su

gran utilidad

como

sistemas

semisólidos

tópicos de

liberación m

odificada(3-5). Teniendo en cuenta que

los geles de chitosan m

odificado han cobrado una gran im

portancia por su biocompatibilidad, baja

toxicidady degradación por enzim

as humanas,

el objetivo del presente trabajo se centra en el estudio de las propiedades reológicas de nuevos hidrogeles de chitosan m

odificado.

Materiales y M

étodos: Chitosan

(CTS)

(75%

desacetilado) fue

suministrado

por A

ldrich C

hemical C

o. Todos los reactivos utilizados para la síntesis fueron de grado analítico.La m

odificación química del chitosan se llevó a

cabo con el fin de incorporar grupos tioles al polisacárido.

A

continuación, se

generó el

sistema disperso

por contacto con un agente oxidante. C

aracterización reológicaLos

sistemas

dispersos se

mantuvieron

a tem

peratura ambiente durante 24 horas después

de su

preparación para

asegurar la

mism

a historia

mecánica

recientepara

todas las

muestras.

Los estudios se realizaron en un reómetro A

R-

2000 (TA Instrum

ents, USA

) para determinar

las propiedades

mecánicas

dinámicas

de las

muestras.

Primero,

se determ

inó la

región viscoelástica lineal a través de un barrido de

esfuerzo a

una frecuencia

de 1

Hz.

Posteriormente, se aplicó

unesfuerzo oscilatorio

de 1 Pa en un intervalode frecuencia de 0.01 a

100 rad/s. El análisis de los resultados se centró en

la determ

inación de

losm

ódulos de

almacenam

iento (G’) y de pérdida (G

’’)que

determinarán el com

portamiento m

ecánico de las m

uestras. Por otro lado y mediante cizalla

rotacional, se determinó el com

portamiento de

flujo de

los preparados.

El protocolo

experimental consistió en aplicar una velocidad

decizalla

hasta la

aproximación

al estado

estacionario o hasta un tiempo m

áximo de 300

segundos por punto. Las curvas de flujo se determ

inaron con una geometría lisa plana de 60

mm

de

diámetro.

Las determ

inaciones se

hicierona

una temperatura de 25 ºC

. Por últim

o, las distintas curvas de flujo se ajustaron a los m

odelos reológicos establecidos.

Resultados

y D

iscusión:D

e los

distintos preparados

de C

TSm

odificado, se

seleccionaron dos concentraciones, 1 y 4%, para

su estudio reológico.A

partir debarridos

de esfuerzo (figura no m

ostrada) sedeterm

inó laregión viscoeslástica lineal. A

sí, lasdispersionesacuosas al 1%

muestran un com

portamiento

independiente hasta 2 Pa, punto a partir del cual em

pieza a fluir la muestra, esfuerzo crítico. Por

el contrario, en las muestras al 4%

no se detecta un

esfuerzocrítico

en todo

el intervalo

estudiado (0-100 Pa). En la Figura 1 se muestra

el barrido de frecuencia de las dispersionesal 1

y 4%

recogiéndose

losm

ódulos de

almacenam

iento(G

’) y pérdida (G’’).

Figura 1.

Barrido

de frecuencia

paralos

sistemas

dispersos al

1 y

4%

de chitosan

modificado.

En ella

se observa

queel

aumento

de concentración

de C

TSm

odificadoen

la

75

dispersión,provoca

un cam

bio reológico

importante.

Así,

en el

preparado al

1%

predomina G

’’ sobre G’, lo que significa que

tiene un

comportam

iento m

ás viscoso

que elástico,

y presenta

un posible

punto de

reticulacióna 71 rad/s y 12 Pa. Por su parte, en

el preparado al4%

de CTS

se da la situación inversa, con predom

inio del módulo elástico

(G’) respecto al

viscoso (G’’),

indicando la presencia

de una

estructura tridim

ensional gelificada. Por

otro lado,

se aprecia

un im

portante increm

ento en las viscosidades aparentesdel

preparadoal 4%

con respecto al 1% (Figura 2),

aproximadam

ente 105veces m

ayor,lógicamente

debido a la mayor concentración de

polímero.

Figura 2.Curva de viscosidad

de los sistemas

dispersos con 1 y 4% de chitosan m

odificado.

La dispersión

al 1%

muestra

un flujo

no new

toniano concom

portamiento pseudoplástico

(shear-thinning),debido a

que la viscosidad aparente dism

inuye al aumentar la velocidad de

cizalla. Sin

embargo,

la dispersión

al 4%

m

uestra un comportam

iento característico de fluidos estructurales en los que se recoge un com

portamiento

newtoniano,

la viscosidad

aparente se

mantiene

independiente de

la velocidad de cizalla

(zona plateau), ya partir de

240 Pa

comienza

a fluir

con flujo

pseudoplástico. Finalm

ente, los datos se ajustaron a modelos

reológicos m

atemáticos,

corroborando así

lo observado en las gráficas. El m

ejor ajuste parala dispersión al 1%

correspondióal m

odelo de C

ross (6),

cuyos parám

etros obtenidos

serecogen

en la Tabla 1.

Tabla 1.Parám

etros del modelo de C

rosspara

la dispersión

acuosa al

1%

de chitosan

modificado.

0 (Pa.s)(Pa.s)

k (s)n

Cross

0.6896.328x10

-80.02864

0.4349

Enella

se refleja

la baja

viscosidad del

preparado (0 y

), así como un tiem

po de relajación m

uy pequeño (k). Adem

ás, el valor de “n” m

enor que 1 refleja su comportam

iento pseudoplástico (shear-thinning). Por su parte, la dispersión al 4%

se ajustó al m

odelo de Ostw

ald-De W

aele para velocidades de cizalla inferiores a 0.002 s -1

y 240 Pade

esfuerzoy

al modelo de C

arreau para valores superiores a éstos

(Tabla 2).A

sí, se puede observar

como

el sistem

a disperso

presenta inicialm

ente un

comportam

iento new

toniano (n

1)con

altos valores

de viscosidades

aparentesque se confirm

an con el modelo de

Carreau, ya que

0 ,viscosidad a velocidad de

cizalla 0, es del orden de 105. C

uando empieza

a fluir y dado su flujo pseudoplástico (n=0.967),va dism

inuyendo la viscosidad hasta alcanzar valores de 0.286 Pa.s (

).

Tabla

2.Parám

etros de

losm

odelos de

Ostw

ald-De W

aeley C

arreau para los sistemas

dispersosal 4% de chitosan m

odificado.

K(Pa.s)

n

Ostw

ald-De

Waele

6.58x105

1.16

0 (Pa.s)(Pa.s)

k(s)n

Carreau

1.61x105

0.2860421.2

0.967

Conclusiones:

Mediante la m

odificación química del chitosan

se consiguen dispersiones acuosas de hasta 4%

de chitosan modificado. Los fluidos obtenidos

son viscoelásticos con flujo pseudoplástico, para los m

enos concentrados, yestructurados, para

los de mayor concentración, con el consiguiente

interés en aplicaciones cosméticas,

biomédicas

yfarm

acéuticas.

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76

AN

ÁL

ISIS CA

LO

RIM

ÉT

RIC

O D

E SIST

EM

AS B

UC

OA

DH

ESIV

OS

H. C

astán1, M

.E. Morales 1, B

. Clares 1, A

.C. C

alpena2, M

.A. R

uíz1

1Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica. Universidad de G

ranada. España.2D

epartamento de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica.U

niversidad de Barcelona. España.

IntroducciónEn la actualidad, uno de los problem

as que causan una m

ayor demanda analgésica es el

dolor odontológico.

Sin em

bargo, el

uso continuado de analgésicos presentan num

erosas reacciones

adversas, las

cuales podrían

ser evitadas con el uso de form

as farmacéuticas de

administración

transbucal. En

diferentes estudios (1) se ha com

probado que algunos antidepresivos tricíclicos pueden tener efecto analgésico

gracias a

su acción

bioquímica

molecular ya que son capaces de

aumentar la

cantidad de noradrenalina y serotonina en el espacio

sináptico.En

este sentido

la adm

inistración transbucal

de clorhidrato

de doxepina

podría proveer

de una

potente actividad analgésica em

pleando bajas dosis y por

tanto evitando

los efectos

adversos asociados

a la

administración

sistémica

de dichas sustancias. Por ello, el objetivo principal de

este trabajo

es el

diseño de

un parche

bucoadhesivo para la administración transbucal

de clorhidrato de doxepina utilizando diferentes polím

eros (2) así como la caracterización de

dichos sistem

as en

cuanto al

análisis calorim

étrico y la capacidad de hinchamiento.

Materiales y m

étodosM

aterialesC

lorhidrato de doxepina fue suministrado por

Fagron Iberica S.A.U

. (Barcelona, España). Las

películas fueron

preparadas utilizando

tres polím

eros:chitosan (Sigm

a-Aldrich, V

alencia, España),

hidroxipropilmetilcelulosa

(HPM

C)

(Methocel K

15M EP, Palex S.A

., Jaén, España) y

carboximetilcelulosa

sódica (SC

MC

) (G

uinama, V

alencia, España). El plastificante ha sido glicerol (Fagron, B

arcelona, España). Polivinilpirrolidona (PV

P) fue suministrado por

Basf (B

arcelona, España) y el ácido acético por Panreac (B

arcelona, España).

Análisis calorim

étricoLa C

alorimetría D

iferencial de Barrido (D

SC)

se ha realizado en un dispositivo Mettler FP 85,

tomando m

edidas a intervalos de 5º C/ m

inuto. El

peso de

las m

uestras se

encuentra com

prendido entre 5-7 mg.

Capacidad de hincham

ientoD

espués de

la determ

inación del

peso y

diámetro

del parche

original, las

muestras

fueron som

etidasa

hinchamiento

en la

superficie de una placa de agar preparado al 2%

(m/m

) y

mantenida

en estufa

a 37º

C.

El aum

ento de peso y diámetro de los parches se

determinó

en intervalos

de tiem

po predeterm

inados. El porcentaje de hinchamiento

fue calculado utilizando la siguiente ecuación:

% de hidratación = (W

2 – W1 ) W

2 x 100

Donde W

2es el peso del parche después de

permanecer en la estufa un tiem

po determinado

y W1 es el peso del parche inicial.

Resultados y discusión

Los sistemas bucoadhesivos estudiados (tabla 1)

son sistemas m

atriciales en una sola lámina

elaborada a partir de un hidrogel, donde el m

aterial polimérico, adem

ás de constituir el reservorio del fárm

aco, también es responsable

de la fijación del sistema a la m

ucosa oral.

SCM

C

4% (p/v)

HPM

C

3% (p/v)

Chitosan

2% (p/v)

PVP 5%

(p/v)PV

P 5% (p/v)

PVP 5%

(p/v)G

licerol 5%G

licerol 5%G

licerol 5%

Agua

destiladaA

gua destilada

Solución acuosa de

ácido acético 1,5%

(v/v)C

lorhidrato de doxepina

0,05%

Clorhidrato

de doxepina 0,05%

Clorhidrato

de doxepina 0,05%

Tabla

1.C

omposición

de los

parches bucoadhesivos propuestos.

Es preciso hacer notar que los termogram

as(figuras 1-3) están evaluados tom

ando como

criterio las

transiciones exotérm

icas y

endotérmicas.

El hidrocloruro

de doxepina

(figura 2) mostró un solo pico endotérm

ico correspondiente al punto de fusión a 191,1º C

, así com

o un pico exotérmico correspondiente a

su descomposición.

Según se muestra en la figura 1, en los tres

sistemas estudiados se da una transición de tipo

endotérmico, en el intervalo de tem

peraturas entre 30 y 120º C

, lo cual se atribuye a la deshidratación por la pérdida de las uniones con las m

oléculas de agua. Al final de la curva

calorimétrica, se evidencia otro proceso térm

icoa

partir de

los 140º

C,

debido a

la descom

posición de los biopolímeros.

77

Se observan

entalpías de

deshidratación sim

ilares para

los polím

eros de

carboximetilcelulosa sódica (281 J/g) y chitosan

(281 J/g).

Sin em

bargo, la

película de

hidroxipropilmetilcelulosa

presenta una

tendencia menorrespecto a la entalpía (251 J/g),

lo que indica que se suministró una energía

menor para elim

inar el agua del sistema. Este

hecho confirm

a com

o los

soportes de

carboximetilcelulosa sódica y chitosan poseen

una m

ayor capacidad

de absorción

de la

molécula de agua en su estructura, observando

esta m

isma

tendencia en

el análisis

de hincham

iento ya que los porcentajes de la tabla 3 m

uestran que los parches elaborados con

hidroxipropilmetilcelulosa

presentan m

enor tendencia a captar agua y que esta da lugar a la disolución del sistem

a en un tiempo m

áximo de

3 m

inutos. En

cambio,

en los

sistemas

de carboxim

etilcelulosa sódica y chitosan no hay una diferencia significativa (p> 0,05) en cuanto al porcentaje de hidratación.

Figura 1.

Termogram

as de

los parches

bucoadhesivos.

Formulación

% hidratación ± D

ESC

MC

67,04 ± 2,03H

PMC

55,91 ± 2,26C

hitosan67,30 ± 2,45

Tabla 3.Porcentaje de hidratación.

De m

anera similar las m

ezclas físicas con las m

ismas

proporciones que

los parches

no m

uestran el pico característico del principio activo (figura 2), debido m

uy probablemente a

su escasa relación con el resto de excipientes.En las m

ezclas binarias del principio activo con los

excipientes evaluados

no se

detectaron desplazam

ientos significativos

de las

transiciones, ni formación de picos adicionales,

así como tam

poco se observó la desaparición de las transiciones características de cada sustancia estudiada, lo que indica que las transiciones físicas

características de

cada uno

de los

excipientes empleados no fueron m

odificadaspor la presencia del principio activo (figura 3). Sin

embargo,

la com

binación con

chitosan m

uestra un desplazamiento considerable de la

temperatura de fusión del activo lo que podría

indicar cierta interacción. No obstante, todas

estas hipótesis se deberían contrastar con otras técnicas.

Figura 2.

Termogram

as de

las m

ezclas de

polímero, polivinilpirrolidona y doxepina en las

proporciones en las que se encuentran en el parche.

Figura 3.Term

ogramas de las m

ezclas físicasde la doxepina y cada polím

ero.

Conclusión

Los análisis

calorimétricos

tanto de

los m

ateriales em

pleados com

o de

las form

ulaciones propuestas

coinciden con

los datos existentes en la bibliografía consultada, observando com

patibilidad manifiesta entre los

polímeros

seleccionados y

el clorhidrato

de doxepina, así com

o temperaturas de transición

vítrea aptas para proporcionar la flexibilidad adecuada tras su adm

inistración bucal. Adem

ás, los datos de entalpía de las diferentes películas se correlacionan con los resultados obtenidos en el ensayo de hincham

iento, mostrando al parche

de hidroxipropilmetilcelulosa com

o el soporte con m

enor capacidad de hinchamiento.

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MA

GN

ET

OL

IPOSO

MA

S PAR

A E

L T

RA

NSPO

RT

E D

E 5-FL

UO

RO

UR

AC

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A

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AR

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TR

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IEN

TO

DE

CÁ

NC

ER

DE

CO

LO

N A

VA

NZA

DO

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1Dpto. de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica, U

niversidad de Granada, España.

2Dpto. de Física A

plicada, Universidad de G

ranada, España. e-m

ail: beatrizclares@ugr.es

Introducción:Dentro de los diferentes tipos de

nanoplataformas diseñadas para el transporte

específico de fármacos

hasta el tejido o célula diana

destacan los

coloides m

agnéticos. Se

postula que las principalesventajas de estos

nanosistemas com

o sistemas transportadores de

sustancias activas frente a la farmacoterapia

convencional son

principalmente:

i)la

disminución de reacciones adversas derivadas

de una extensa biodistribucióndel fárm

aco, la cual

no existe

porque toda

la dosis

quedaacum

uladaen el lugar de acción; y, ii) una

intensa exposición del tejido y células diana a las m

oléculas de sustancia activa transportadas m

agnéticamente (1). En este sentido, el presente

trabajo de investigación pretende el desarrollode una form

ulación de magnetoliposom

as como

nanoplataformas para el transporte selectivo de

5-fluorouracilo (5-FU

) en

el tratam

iento de

cáncer de colon avanzado.

Materiales y M

étodos:Todos los reactivos

químicos

usados tenían

calidad analítica

(Panreac, España),

excepto la

L--

fosfatidilcolina y

el 5-FU

(Sigm

a-Aldrich,

Alem

ania). El

agua utilizada

en todos

los experim

entos fue

desionizada y

filtrada previam

ente (Milli-Q

,Millipore, Francia).

Los núcleos de magnetita (Fe

3 O4 )se sintetizaron

mediante

un m

étodo de

co-precipitaciónquím

ica (2, 3). Los liposomas

fueron preparados utilizando el m

étodo de hidratación del film(thin

layer evaporation

technique) (4).

La preparación de los m

agnetoliposomas se basó en

esta mism

a metodología con la única excepción

de la inclusión de los núcleos deFe

3 O4

en la fase acuosa utilizada para la rehidratación de la fina capa lipídica.La

caracterización fisicoquím

ica de

los m

agnetoliposomas com

enzó con el estudio de su

geometría

mediante

análisis de

microfotografías

electrónicas de

transmisión

(TEM)

y m

ediante espectroscopía

de correlación

de fotones

(PCS).

Estas determ

inacionesse realizaron

por triplicado a 25.0

0.5 ºC

. Las

nanopartículas fueron

caracterizadas tam

bién m

ediante análisis

electrocinético (electroforesis) y caracterización term

odinámica

superficial (balance

hidrofilia/hidrofobia, a

partir del

tratamiento

termodinám

ico de

las determ

inaciones de

ángulo de contacto con agua, formam

ida y -

bromonaftaleno).

En el primer caso, se determ

inóla evolución de

los valores

de potencial

zeta (

) de

las nanopartículas en función de la fuerza iónica del m

edio de dispersión (concentración de KN

O3 ).

La 0.1 %

(p/v). Por otro lado, y con el objetivo de analizar cualitativam

ente la degradación de los m

agnetoliposomas, se determ

inó la evolución tem

poral de

los valores

de m

ovilidad electroforética (u

e ) de éstos y de nanopartículasde

Fe3 O

4 . Estas

medidas

se realizaron

reproduciendo in

vitrolas

siguientes condiciones fisiológicas: 37.0

0.5 ºC y pH

7.4 0.1 (tam

pón NaO

H-K

H2 PO

4 ). En

la realización

de los

ensayos de

incorporación de

5-FU

en los

magnetoliposom

as, la fase acuosa contenía una concentración de este fárm

acode 3 m

g/mL.La

eficacia de atrapamiento (EE, %

) y carga de fárm

aco (DL, %

) del 5-FU, junto con el perfil de

liberación in

vitro(pH

7.4,

37 ºC

) se

caracterizaronm

ediante un método validado de

espectrofotometría

UV

-Vis

(266 nm

). Los

ensayos de liberación se realizaron mediante

diálisis.

Resultados y D

iscusión:Los núcleos de Fe

3 O4

presentaron una morfología cúbica y un tam

año m

edio de partícula de 12 2 nm

,mientras que

los liposom

as se

caracterizaron por

una m

orfología esférica y un tamaño m

edio de635

393 nm(elevada heterogeneidad de tam

año). Por

el contrario,

los m

agnetoliposomas

presentaron una

morfología

esférica y

un tam

año de partícula adecuado para la vía de adm

inistración intravenosa (12024

nm).

Laterm

odinámica

superficialy

el análisis

electrocinéticode

los diferentes

tipos de

nanopartículas pusieron de manifiesto que la

naturaleza hidrófila de las nanopartículas deFe

3 O4 (figura 1) y su

correspondiente carga eléctrica positiva (figura 2) desaparecen al ser em

bebidas en la matriz liposom

al hidrófobay

de carga

eléctrica negativa.

Am

bas caracterizaciones

fisicoquímicas

constituyen una

clara evidencia

de la

eficacia de

la m

etodología desarrollada

para la

síntesis de

magnetoliposom

as.

79

Figura 1.V

alores de incremento de energía

libre superficial

en m

edio acuoso

(G

SLS ,m

J/m2) y carácter hidrófilo/hidrófobo de los tres

tipos de nanomateriales.

Figura 2.Potencial zeta () de Fe

3 O4 , liposom

as y

magnetoliposom

as en

función de

la concentración m

olar de KN

O3 , y a pH

natural .

La degradación de los magnetoliposom

as parece transcurrir rápidam

ente, siendo completa en 12

horas. De hecho, este com

portamiento es

claro si consideram

osel ensayo electrocinético de

degradación realizado (figura 3). Los valores de u

ede

los m

agnetoliposomas

se hacen

más

negativos conform

e transcurre

el tiem

po, llegando a ser sim

ilares a los de los núcleos de Fe

3 O4

transcurridas sólo 12 horas. Otro hecho

destacable es que la evolución más acusada de

estos valores se produce durante las primeras 2

horas. Así, la degradación debe transcurrir

más

acusadamente durante este periodo de tiem

po.

Figura3.

Movilidad

electroforética (u

e )de

magnetita (Fe

3 O4

y magnetolipo

en función del tiempo (horas) (37 ºC

y pH 7.4).

En cuanto a la vehiculización de 5-FU, la

EE(%

) yla D

L (%) de los m

agnetoliposomas fue

del %

, respectivamente. C

omo

puede apreciarse en la figura 4 la liberación in vitro

del 5-FU transcurre m

ediante un proceso rápido, ya que el 70%

del fármaco vehiculizado

es liberado en 1

h. Este fenómeno podría

apoyarse en la rápida degradación descrita para la m

atriz liposomal (figura 3).

Figura 4.Liberación de 5-FU

(%)

desde los m

agnetoliposomas

en función

del tiem

po (horas) (37 ºC

y pH 7.4).

Conclusiones:

Se ha

puesto a

punto un

procedimiento reproducible para la síntesis de

magnetoliposom

as com

o sistem

as transportadores del agente quim

ioterápico 5-FU.

La caracterización

fisicoquímica

realizada refleja la eficacia de esta m

etodología. Si bien por sus características esta form

ulación tendría interés si se adm

inistra por vía intratumoral o

intraarterial, en

la actualidad

se están

desarrollando modificaciones en la form

ulación que

mejoren

la capacidad

de los

magnetoliposom

as como nanovehículos

de este agente quim

ioterápico.

Referencias:

(1)D

urán JDG

et al.Magnetic colloids as drug

vehicles.2008;97(8):2948-83.(2)

Massart

R.

Preparation of

aqueous m

agnetic liquids

in alkaline

and acidic

media.1981;17(2):1247-8.

(3)A

rias JL

et al.

Magnetoresponsive

squalenoyl gem

citabine com

posite nanoparticles for cancer

active targeting.2008;24(14):7512-9.

(4)C

lares B et al. M

ultilamellar liposom

es of triam

cinolone acetonide:

preparation, stability

and characterization.

2009;19(3):197-206.

Agradecim

ientos:Proyecto

FIS 11/02571

(Instituto de Salud Carlos III, España).

80

POT

EN

CIA

L D

E M

AG

NE

TO

LIPO

SOM

AS C

OM

O A

GE

NT

ES D

E H

IPER

TE

RM

IA E

N E

L

TR

AT

AM

IEN

TO

DE

CÁ

NC

ER

DE

CO

LO

N A

VA

NZA

DO

R. B

iedma-O

rtiz, B.C

lares, E.Sáez-Fernández, V. G

allardo, M.A

. Ruiz, J.L. A

riasD

pto. de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de G

ranada, España. e-m

ail: beatrizclares@ugr.es

Introducción:En

la actualidad,

numerosos

ensayos preclínicos han puesto de manifiesto la

excelente capacidad

que tienen

los coloides

magnéticos com

o sistemas transportadores de

fármacos

antitumorales,

ya que

mejoran

notablemente la eficacia y seguridad del agente

quimioterápico (1). M

ás recientemente, diversas

investigaciones han

postulado su

potencial utilidad

como

agentes de

contraste en

resonancia magnética de im

agen(R

MI)

y como

agentes de hipertermia. Ésta últim

a cualidad tiene un enorm

e interés en la lucha contra el cáncer. En concreto, se indica que los coloides m

agnéticos podrían serguiados magnéticam

ente hasta

la m

asa tum

oral y

allí generarían

selectivamente un calor que m

ataría las células m

alignas(hiperterm

ia).El

fenómeno

de hiperterm

ia es consecuencia de la vibración de los m

omentos m

agnéticos de estas partículas, al encontrarse bajo la acción de un gradiente de cam

po electromagnético alterno (2).

El objetivo de esta investigación es el análisis de la

capacidad como agente de hiperterm

ia que tiene

una form

ulación de

magnetoliposom

as constituida

por núcleos

de óxido

de hierro

superparamagnético

(magnetita,

Fe3 O

4 )em

bebidos en una matriz liposom

al basada en fosfatidilcolina. Este estudio prelim

inar in vitropretende

constituir un

paso previo

en la

valoración de la aplicabilidad de esta (nano)-form

ulación en el tratamiento de cáncer de

colon avanzado.

Materiales y M

étodos: Los productos químicos

utilizados tenían

calidad analítica

(Panreac, España), incluida la

L--fosfatidilcolina (Sigm

a-A

ldrich, A

lemania).

El agua

utilizada fue

previamente

desionizada y

filtrada(M

illi-Q,

Millipore, Francia).

Los magnetoliposom

as que se estudiarán en este trabajo de investigación tienen una m

orfología esférica y un tam

año medio de 120 ±

25 nm

(figura 1).

Su síntesis

se ha

basado en

la m

odificación de una metodología am

pliamente

empleada para la form

ulación de liposomas: el

método

de hidratación

del film

(thin

layer evaporation

technique) (3).

La principal

variante a

esta m

etodología consiste

en la

inclusión de núcleos de Fe3 O

4 (tamaño m

edio 10 nm

, a priorisuperparamagnéticos)en la fase

acuosa empleada en la rehidratación de la fina

capa lipídica.

Figura 1.

Microfotografía

electrónica de

transmisión de un m

agnetoliposoma. Longitud

de barra: 100 nm.

La estructura

cristalina de

estos nanocom

puestos m

agnéticosse

caracterizó m

ediante la

obtención del

difractograma

de rayos X

(método de D

ebye-Scherrer). La masa

de magnetoliposom

as empleada para ello fue

0.5 g,

habiéndose desecado

previamente

la m

uestra a

35.0 ±

0.5 ºC

en un

horno de

convección.Las

propiedades m

agnéticas de

los m

agnetoliposomas se caracterizaron m

ediante un m

agnetómetro-susceptibilím

etro a 25.0± 0.5

ºC.

Finalmente, se caracterizó la capacidad de

estos nanocompuestos m

agnéticos como agentes

de hiperterm

ia. Para

ello, se

preparó una

suspensión acuosa de m

agnetoliposomas (10

mg/m

L, 5 mL) y se determ

inó su capacidad para generar calor cuando ésta es

sometida a un

gradiente de campo electrom

agnético alterno (frecuencia e intensidad: 250 kH

z y 4 kA/m

, respectivam

ente). El registrode la tem

peratura se

realizó con

una sonda

termom

étrica conectada a un ordenador.

Resultados y D

iscusión:La figura 2 recoge el

difractograma

de rayos

X

de los

magnetoliposom

as. Es

interesante observar

cómo todos los picos característicos de la Fe

3 O4

permanecen inalterados en el difractogram

a de los

liposomas

magnéticos.

De

esta m

anera, puede afirm

arse que la estructura de los núcleos de óxido de hierro perm

anece inalterada tras su inclusión en la m

atrizdel liposom

a, siendo éste un

requisito indispensable

para que

los nanocom

puestos tengan

una adecuada

81

capacidad de respuesta a gradientes de campo

magnético.

Figura 2.D

ifractograma de rayos X

de los m

agnetoliposomas.

Figura insertada:

patrón ASTM

de difracción de rayos X de la Fe

3 O4 . La

intensidad se expresaen unidades arbitrarias (u.

a.).

El análisis de las propiedades magnéticas de los

magnetoliposom

as puso

de m

anifiesto su

adecuada capacidad de respuesta a gradientes m

agnéticos. Los

datos de

susceptibilidad m

agnética inicial

y de

magnetización

de saturación

de las

partículasconfirm

an esta

afirmación (25.0 ± 0.2 y

206 ±12 kA

/m,

respectivamente). D

e esta forma, es de esperar

que los

magnetoliposom

as sean

fácilmente

guiados al lugar de acción con la ayuda de un im

án.Finalm

ente, la

exposición de

la suspensión

acuosa de nanocompuestos a un gradiente de

campo

electromagnético

alterno parece

convertir a los magnetoliposom

asen adecuados

agentes de hipertermia (figura 3). D

e hecho, puede apreciarse en la figura cóm

o en tan sólo 22 m

inutosse alcanza la tem

peratura mínim

a de 4).A

demás, se observa

quela tem

peratura de la suspensión continúasubiendo hasta alcanzar un valor m

áximo de 45

ºC, el cual se m

antiene estable durante todo el experim

ento.

Figura 3.

Curva

de calentam

iento de

una suspensión

acuosa de m

agnetoliposomas (10

mg/m

L) bajo la influencia de un gradiente de cam

po electromagnético alterno.

Esto dem

uestra un

óptimo

control de

la tem

peratura y flujo de calor (requisito básico para

su aplicación

en hiperterm

iacontra

el cáncer).D

e hecho, debe tenerse en cuenta que si

minutos,

está puede

destruirse. A

simism

o,pueden inducirse daños en el tejido sano que rodea al tum

or si la temperatura supera los 48

ºC(5, 6).

Conclusiones:

El m

étodo de

síntesis desarrollado perm

ite obtener magnetoliposom

as con

una geom

etría adecuada

para su

administración

por vía

parenteral. Las

excelentes propiedades

magnéticas

de estos

nanocompuestos perm

itenpostular

un futuro prom

etedor en Biom

edicina parasu aplicación

en el tratamiento de tum

ores por medio de la

hipertermia.

Actualm

ente, se

encuentran en

desarrollo estudios

para valorar

la eficacia

antitumoral

de esta

(nano)-formulación

parahiperterm

ia en modelos in vitro

ein vivo

de cáncer de colon avanzado.

Referencias:

(1)D

urán JDG

et al. Magnetic colloids as drug

vehicles.2008;97(8):2948-83.(2)

Wang SY

et al. Magnetic nanoparticles and

thermally responsive polym

er for targeted hypertherm

ia and

sustained anti-cancer

drug delivery.

Adv.

Exp. M

ed. B

iol. 2013;765:315-21.

(3)C

lares B et al. M

ultilamellar liposom

es of triam

cinolone acetonide:

preparation, stability

and characterization.

2009;19(3):197-206.(4)

Johannsen M et al. C

linical hyperthermia of

prostate cancer

using m

agnetic nanoparticles:

presentation of

a new

interstitial technique. Int. J. H

yperthermia.

2005;21(7):637-47.(5)

Gonzales M

, Krishnan K

M. Synthesis of

magnetoliposom

es with m

onodisperse iron oxide nanocrystal cores for hypertherm

ia. J. M

agn. Magn. M

ater. 2005;293:265-70.(6)

Lao LL, R

amanujan

RV

. M

agnetic and hydrogel

composite

materials

for hypertherm

ia applications. J. Mater. Sci.

Mater. M

ed. 2004;15:1061-4.

Agradecim

ientos:Proyecto

FIS 11/02571

(Instituto de Salud Carlos III, España).

82

SOL

UB

ILID

AD

DE

LA

LID

OC

AÍN

A B

ASE

EN

EX

CIPIE

NT

ES E

MO

LIE

NT

ES

E. Blanca Eliche, M

. D. C

ontreras Claram

onteD

epartamento de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica, U

niversidad de Granada, España

Introducción: La

lidocaína se

presenta en

forma de derivado salino (C

lH) y en form

a de base.

El derivado

salino es

habitual en

preparaciones tópicas. Este trabajo exploralas

posibilidades de

formulaciones

tópicas con

lidocaína base. De esta m

olécula se conocesu

carácter básico débil, su lipofília y la escasa solubilidad en agua a pH

compatible con la piel

(5 -7). El objetivo del trabajo es determinar la

solubilidad de la Lidocaína base en excipienteslipofílicos, líquidos a tem

peratura ambiente y

adecuados para preparaciones dermatológicas.

Laselección de los excipientes,

se realiza en base a su probable solubilidad. Para ello, se utiliza

la Teoría de las Soluciones Regulares y

los parámetros de solubilidad de H

ansen. Los conceptos generales de am

bas,son de carácter

práctico y permiten conocer a-priori la bondad

de los

disolventes. Están

basados en

los parám

etros de solubilidad total (t ) y parám

etros de cohesión (

d ,p

yh)

del soluto y de los disolventes.

Materiales y M

étodos: 1.- Selección de los excipientes. Para aplicar los conceptos anteriores, es

necesarioconocer el

valor de t y

de d ,

p yh ,de

la lidocaína y delos excipientes.

El valor de t de la lidocaína

(Tabla 1), fue determinado por Lin y N

ash (1), el resto de los parám

etrosson determ

inados por m

étodos de contribución de grupos de Fedors (2), V

an Krevelen y H

oftyzer y Hansen y

Beerbow

er (3)Se seleccionan disolventes (Tabla 1).cuyo

tvarían de 17,44 a

20,2 MPa, cum

pliendo la prim

era prem

isa: diferencia

en t

entre la

lidocaína y disolvente menor de 5,11 M

Pa1/2.

2.- Análisis cualitativo de la solubilidad. Para

una estimación inicial de

la solubilidad dela

lidocaína en los disolventes se ha seguido la m

etodología propuesta por Teas(4)

aplicada a diagram

as triangulares y esfera de solubilidad.C

omo referencia se ha utilizado la solubilidad

de la lidocaína en etanol.

Diagram

a T

riangularde

solubilidad..Se

obtiene empleando

losparám

etros de cohesión norm

alizados (fd ): 100*

fh

pd

dd

100*

fh

pd

pp

100*

fh

pd

hh

En el diagrama triangular (Fig. 1): La distancia

entre los excipientesy la lidocaína es m

enor que la distancia entre la lidocaína y el etanol.

Es previsible que la lidocaína sea soluble en los disolventes.

Figura 1.

Diagram

a triangular

de Teas,

predicción de la solubilidad de la lidocaína en los disolventes. E

sfera de

solubilidad de

la lidocaína:

El centro de la esfera (Fig. 2) tiene los valores de

d ,p y

h de la lidocaína. El radio de la esfera (radio de interacción R

0 ) es determinado desde

los valores de d ,

p yh

del etanol.Los límites

de esta

esfera caracterizan

los “buenos“

disolventes (5). Estos deben tener una distancia desde

el centro

de la

esfera“distancia

del parám

etro de solubilidad” (Ra) m

enor que Ro.

Figura 2.Esfera de solubilidad de la lidocaína.

Es previsible

una buena

solubilidad, R

a es

menor que R

0 .

3. Estim

ación teórivade la solubilidad. La

Teoría de las Soluciones Regulares perm

ite una estim

ación cuantitativa de la solubilidadde la

lidocaínaen los disolventes

(Fig. 4), aplicandola ecuación deducida por H

ildebrand y Scott:21

2

212

22

lnln

RTV

XX

ideal

Ecuación 1

Donde: V

21 =

fracción de

volumen

del disolvente;

R:

constante de los gases; T: temperatura absoluta

0,000,25

0,500,75

1,00 0,00

0,25

0,50

0,75

1,000,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Y Axis Title

fhidrogeno

Z Axis Title

X Axis Title

Lidocaína

Etanol9

83

de la1

2= parám

etros de solubilidad,

total (o

de H

ildebrand) del

disolvente y del soluto respectivamente.

Solubilidadexperim

ental.Se

obtiene soluciones saturadas a 25

ºC . Se valoraron

por espectrofotom

etría alícuotas del sobrenadante.C

ada valor

es la

media

de dos

ensayos independientes.

Resultadosy discusión.

Los resultados obtenidos (Figura 4) demuestran

la elevada solubilidad de la lidocaína en los disolventes.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

1719

2123

2527

MPa

1/2

% (m/m)

% (m

/m) Teórico

% (m

/m) experim

ental

Figura 4.Solubilidad de la lidocaína.En todos los casos los valores de solubilidad experim

ental es superior a la estimada por la

ecuación 1, siendo esta diferencia más elevada

en los disolventes de parámetros de solubilidad

más bajos (aceite de oliva al A

dipato de di (tri polietilenglicol

éter

mirístico)

donde la

diferencia es hasta de 20 veces superior. En estos disolventes, inicialm

ente, era previsible que en función de sus parám

etros, la lidocaína form

ara soluciones

regulares, donde

solo existieran

fuerzas de

dispersióny

ambos

valores, teórico y experimental, se aproxim

aran. Estas

diferencias pueden

ser atribuidas

ainteracciones de tipo polar o de puentes de hidrógeno

entre los grupos funcionales de la lidocaína (am

ido, amino y carboxilo) y de los

disolventes(alcohol, éter, ester). A

todo ello hay que añadir que la lidocaína en solución y debido a la conform

ación espacial del grupo am

ido, puede adoptar configuración cis, trans o sim

ultáneamente am

bas (cis/trans) en equilibrio (6). Lum

ley-Jones (7)puso en

evidencia la formación de puentes de hidrógeno

intramoleculares en la lidocaína cuando esta se

encuentra en

solución en

disolventes poco

polares, originando configuración cis, estables, m

ás lipofílicas

que cuando

la lidocaína

se encuentra en disolventes de m

ayor polaridad, donde predom

ina la configuración trans (8)y

asociaciones interm

oleculares (6).

Todos los

disolventes estudiados son poco polares, su p

varíaentre 1,2 y 2,53 M

Pa1/2. Es probable que al

menos en los prim

eros disolventes de la serie, la lidocaína se encuentre en form

a cis y contribuya a explicar, al m

enos en parte, las discrepancias observadas.

Tabla 1.-D

isolventes seleccionados y parámetros de solubilidad y V

olumen M

olar

Nom

bre com

ercialT

(MPa

1/2)d(M

Pa1/2)

p(MPa

1/2h(M

Pa1/2)

V m

olar(cm

3mol)

Aceite de oliva

Aceite de oliva

17,86*15,9*

1,20*5,40*

900,000

Cetiol SN

Isononanoate de cetilo/esteárico

17,8615,16

1,069,36

482,1C

etiol LC

Coco C

aprilato/caprato17,98

16,641,10

6,72465,8

Miristato de isopropilo

18,0316,01

1,598,12

321,2C

etiol AL

aurato de hexilo18,15

16,251,51

7,94337

Eutanol G

2-octil dodecanol18,33

16,911,45

6,93352,7

Crom

oll. DP3A

Adipato de di (tri

polietilenglicol éter mirístico)

18,3816,85

2,896,73

921,4C

romadol D

OA

Adipato di(2 etil hexilo

19,0215,97

2,4610,04

414,4C

etiol BA

dipato de dibutilo19,99

15,623,57

11,96285

Croda. G

TC

CT

riglicéridos caprílicos/cápricos

20,0716,41

2,5311,27

603,6C

rodamol LL

Lactato de laurilo20,24

16,362,53

11,64284,6

Etanol

26,4212,60

11,2020,00

58,5lidocaina

22,90*20,32

4,699,48

208,500*

Bibliografía

1-.H

.M. Lin y R

.A. N

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84

GL

UT

AT

HIO

NE

-RE

SPON

SIVE

MIC

RO

PAR

TIC

LE

S FOR

DR

UG

DE

LIV

ER

YM

. Curcio

1, C. A

lvarez-Lorenzo2, B

. Blanco-Fernandez

2, F. Puoci 1, N. Picci 1, A

. Concheiro

2

1Dipartim

ento di Scienze Farmaceutiche, Edificio Polifunzionale, U

niversità della Calabria, 87036

Rende (C

S), Italy.2D

epartmento de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica, U

niversidad de Santiago de Com

postela, 15782 Santiago de C

ompostela, Spain.

Introduction: Stim

uli-responsive hydrogels

constitute a

fast-growing

area of

polymer

science because of the ability to rapidly respond to environm

ental stimuli[1,2]. A

mong polym

ers that can form

hydrogels, natural polymers are

often preferred to synthetic materials because of

their non-toxicity, low cost, ready availability,

and biocompatibility.

Chitosan (C

S),a natural

polysaccharide obtained

by deacetylation

of chitin,

has been

used extensively

as a

component

of a

varietyof

pharmaceutical

preparations.The aim

of this w

ork w

as to prepare

chitosan-based glutathione-responsive

particles containing

disulfide bonds

by an

emulsion/separation m

ethod. Glutathione (G

SH)

isan

antioxidantthat

prevents dam

age to

important

cellular com

ponents caused

by reactive oxygen species such as free radicals and peroxides. G

SHhas been show

n suitable for reduction

ofdisulfide

bonds of

polymer

nanocarriers and

polymer-drug

conjugates, enabling intracellular-specific drug release [3].G

SHis present in high concentrations in the

hypoxic regions, such as the tumor cells. The

cellsgenerally contain m

ajority ofG

SHin the

cytosol at concentrations ranging from 1 to 11

mM

, while the extracellular concentration is

about 1000-fold less [4,5]. On the basis of the

differences in the intracellular and extracellular G

SH concentrations, the chitosan m

icroparticles containing disulfide bonds can be suitable for the

development

of drug

deliverysystem

sresponsive

to GSH

levels.

Materials and M

ethods: Synthesis of C

S-SH conjugate. ED

AC

(1-ethyl-3-(3-dim

ethylaminopropyl)

carbodiimide

hydrochloride) reacted with carboxyl groups of

thiolactic acid

to form

active

ester interm

ediates, which reacted w

ith free amine

groups of chitosan (MW

250000-350000)to

form am

ide bonds[6].

Lyophilizedthiolated

chitosan (CS-SH

) appears as a white fibrous

powder easily soluble in w

ater. The structure of

CS-SH

was

confirmed by 1H

NM

R in D

MSO

-d6 and FTIR

spectroscopy. Preparation

of chitosan

microparticles

by em

ulsion-suspension polym

erization. C

S-SH

conjugate (0.2

g)dissolved

in N

aBrO

3aq.

solution (0.1M, 10 m

l) was added to sunflow

er seed oil (150 m

l) containing Span 80(3 g)under

Ultraturrax

®stirring (25000 rpm

).The emulsion

was

kept at

60°C

for 2

hours.Then,

them

icroparticlesw

ere w

ashed w

ith petroleum

ether,

ethanol and

water,

and dried

under vacuum

for 24 h at 25ºC. Scanning electron

microscopy (SEM

)im

ages were recorded in

FESEM U

LTRA

Plus(Zeiss, USA

). Sw

elling. Microparticles (20 m

g) were placed in

5-ml syringe fitted w

ith a sintered glass filter, w

eighed,and left to sw

ell by imm

ersion in phosphate buffer w

ith GSH

(0, 0.1 and 5 mM

) of G

SH. A

t a predetermined tim

e(1, 5, 8 and 24

h), the

excess of

water

was

removed

by filtration

at atmospheric pressure

andthe filter

centrifuged at 3500 rpm for 5 m

in and weighted.

The filter

tare w

as determ

ined after

centrifugation with only w

ater. The weights

recorded at the different time intervals

and the w

ater content percent was estim

ated as:

where W

s and Wd are the w

eights of swollen

and dried microparticles, respectively.

Incorporation of methotrexate (M

TX)into the

microparticles.

Microparticles (200 m

g)w

ere placed in

2 ml of drug solution (5

mg/m

l,C0 ) in

phosphate buffer pH 7.4, for 3 days under

stirring at

room

temperature.

Then, the

microparticles w

ere filtered and dried underreduced

pressure to

constant w

eight. M

TXrem

aining in the medium

(Ci ) w

as quantified by H

PLC at 302

nm. The loading efficiency

(LE)w

as estimated as:

In vitro MTX release. Loaded m

icroparticles w

ere dispersedin phosphate buffer w

ith GSH

at0, 0.1 and 5 m

M(10 m

l,37°C

). At various

times, 0.150 m

l were w

ithdrawn, analyzed by

85

HPLC

and replaced with fresh

medium

. Theexperim

ents were

donein triplicate.

Results and D

iscussion: Synthesis

of C

S-SH

conjugate. C

S–SHconjugate

was

achieved by

the covalent

attachment

of thiolactic

acidto

the am

ine groups of C

S. Com

pared with the

1H N

MR

spectrum

of CS (the N

-acetyl methyl proton

of C

S was at 1.95

ppm), a new

resonance peak at 2.93

ppm

was

assigned to

the side-chain

methylene (C

H2 SH

). FTIR spectra show

edthat

the absorption peaks of CH

-SHat 1660

cm1

(amide I band), 1570

cm1

(amide II band)

and 1386

cm1

(amide III band) w

erestronger than

those of CS, w

hich can be attributed to the additionalam

ide group of thiolactic acid. Preparation

of chitosan

microparticles.

Chitosan m

icroparticles were obtained from

anem

ulsion constituted

by a

CS-SH

oxidizing

solution (dispersed phase)in an

oily phase. N

a2 B

rO3

in the dispersed phase promoted the

oxidation of the thiolic groups to disulphide bonds.

SEMm

icrographs show

edspherical

particles (10

m) w

ith rough surface (Figure 1).

Figure 1.

SEM

micrographs

of the

CS

microparticles.

Swelling. M

icroparticles swelled the sam

e in phosphate buffer w

ithout and with G

SH 0.1m

M

(164%

).B

y contrast, a relevantincrem

ent in the sw

elling percentage was verified

in GSH

5m

Msolution (

273%). These findings suggest

that the disulfide bondsin the structure of the

microparticles can be broken w

hen the GSH

concentration is above a certain threshold. In vitro M

TX loading and release.M

TXw

as loaded in the

microparticles

with a loading

efficiency of 73.6 %. R

elease experiments w

ere conducted in

phoshate buffer at pH 7.4 w

ithout and

with

GSH

at

0.1 and

5 m

M.

These concentrations w

ere chosen to mim

ic the GSH

concentration in the extra- and intra-cellular spaces, respectively. M

TX release rate resulted

to be GSH

concentration-dependent(Figure 2). In the first 30 m

in,the amount of M

TX released

was

much higher in phosphate buffercontaining

GSH

5 mM

than that recorded in phosphate buffersolely or containing G

SH 0.1 m

M.

Figure 2.M

TX release profiles in phosphate

buffer pH

7.4

prepared w

ith different

concentrations of the reducing agent GSH

.

Conclusions:

Microparticles of chitosan w

ith disulfide bonds w

ere readily

obtained by

means

of an

emulsion/crosslinking

method

that rendered

spherical particles of homogeneous size (

10 m

) and that exhibit drug release dependent on the G

SH concentration. Further research w

ill be devoted to reduce the size of the particles in order

to achieve

intracellular-specific drug

release.

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ESF 2007/2013-IV

Axis H

uman C

apital-Operative

Objective M

2-Action D

.5. Work supported by

POC

TEP (EU

IB

ERO

MA

RE),

MIC

INN

(SA

F2011-22771) and FEDER

.

86

Adipose-derived stem

cells combined w

ith biodegradable scaffoldsfor heart tissue engineering

P. Díaz-H

erráez1,E. G

arbayo1, B

. Pelacho2, F. Prosper 2, M

.J. Blanco-Prieto

1

1Departm

ent of Pharmacy and Pharm

aceutical Technology, University

ofNavarra, Spain

2Hem

atology, Cardiology and C

ell Therapy, Clinica U

niversidad de Navarra and Foundation for A

pplied M

edical Research,U

niversityofN

avarra, Spain

Introduction:C

ardiovascular diseases

constitutes now a days

the greatest health risk. O

ne of the causesis the absence of an effective

myocardial regeneration

after ischemia. D

espite pharm

acological advances

made

in the

last years, the only real option in severe cases is transplantation.

A

therapy that

has show

nprom

ising results in myocardial regeneration is

stem cell (SC

) implantation, principally due to

the paracrine

action of

the cells

[1]. This

mechanism

consists

on the

secretionof

angiogenic and

anti-apoptotic cytokines

that favors

the form

ation of

new

vessels and

cardiomyocytes, together w

ith factors involved in progenitor recruitm

entby the cells.

Am

ong SC

, adipose tissue derived SC (A

DSC

)have

received great interestfor their easy obtention

from the strom

al vascular fraction and because they have dem

onstrated an angiogenic potential [2, 3]. H

owever, problem

s such as the low rate

of SC survival after im

plantation have limited

their effectiveness. It is generally accepted that this problem

could be solved administering the

cells into a three-dimensional structure, also

known as scaffold, that provide support to the

cells. Microparticles (M

P) made of polilactic-

co-glicolic acid (PLGA

), thatis a biocompatible

and biodegradable polymer approved by the

FDA

for human use, could be used as carriers

for cell transplantion.

Objective:

Theobjective of the present w

ork w

as todevelop PLG

A M

Pand engineered them

w

ith hA

DSC

sin

order to

facilitate cell

engraftment,

paracrine secretion

and differentiation into the required tissues.

Material and M

ethods:

MP

Formulation:

PLGA

MP

were prepared by

solvent evaporation

method

usingthe

Total R

ecirculation One-M

achine System (TR

OM

S) [4, 5]. Several device settings w

ere adjusted to obtain m

icroparticles of a certain size (10 m

). The

following

TRO

MS

parameters

were

adjusted during

microparticle

preparation: pum

ping flow, recirculation tim

es to form W

1 /O

and W1 /O

/W2 em

ulsions, and the inner diameter

of the needle used to prepare the W1 /O

/W2

emulsion. M

Psize w

ascharacterized

by laser diffractrom

etry using a Mastersizer.

hAD

SCs C

ulture:hAD

SC cells w

ere cultured incom

plete medium

containing-M

EM w

ith 10%

of fetal bovine serum and 1ng/m

L of bFGF at a

confluence of 80-90%.

Attachm

ent of AD

SCs

to particles:PLG

A M

P w

ere coated with three different am

ounts of collagen:

2. To achieve a hom

ogenous coating, MP w

ere re-suspended under agitation at 37ºC

for 2 h in the collagen solution.Finally, M

Pw

ith a biomim

etic surface of collagen

were seeded

with

two different

densitiesof

hAD

SCs

(200,000 and

100,000 cells) for the form

ation of thecom

plexes.

Results and

Discussion:

Microparticle Form

ulation:PLG

A M

P ranging from

0.9 to 24 m

were successfully prepared

usingTR

OM

S(Table 1). Particle size rem

ained unchanged

after lyophilisation.

Am

ong all

formulations, M

P with a size of 10

were

selected as scaffolds for the cells. This selection w

as made based on previous w

orks of our groupconsidering a balance betw

een having sufficient surface

for cells

adhesionand

not causing

damage to the heart tissue

[6, 7].The best

device settingsto obtain 10

-MP

were:flow

of 24 m

l/min, needles w

ith an average diameter

of 0,17m

m and recirculation tim

es of 90s and

60 s (Table 1).

Table 1: Sum

mary of form

ulations prepared using T

RO

MS.The table show

s the influence of TR

OM

S conditions on the final MP size. The

highlighted form

ulation corresponds

to the

formulation

selected for

the cell

attachment

experiments.

Needles:

N

has an

average diam

eter of 0.17m

m and A

0.5m

m.

87

The inner diameter of the needles is a critical

factor determ

ining the

final size

of m

icroparticles prepared by TRO

MS

(Table 1). A

reduction in particle size was observed using

the needle with the

smaller diam

eter.

Attachm

ent of hAD

SCsto PLG

A particles:

The concentration

of collagen

needed an

homogenous

coating was selected considering

the total

surface of

the particles

and the

adhesive properties of the cells. 0.5 mg of

collagencoated PLG

A M

Pw

ere mixed w

ith tw

o densities

of hA

DSC

cells

in com

plete m

edium.

The attached

cells w

ere observed

under the microscope after 1, 2, 3 and 4 h.The

best complex w

ere obtained seeding 200,000 2

of collagen

(Figure 1).

Figure 1: PLG

A M

P scaffold carrying AD

SCs.

Bright field m

icroscopy image of A

DSC

adhered to PLG

A-M

Ps coated with collagen after 2 hours

of adhesion.

Presently, cytokines influenced in heart tissue regeneration (i.e. neureguline), are being loaded into the developed M

P to combine the three

elements of the tissue engineering triad in the

same therapeutic approach.

Conclusion: A

biodegrable and biocompatible

PLGA

MP scaffold able to carry A

DSC

cells to the site of injury has been prepared

confirming

that PLG

A

MP

may

be exploited

in cardiovascular regenerative m

edical applications.

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igos de la U

niversidad de Navarra, FU

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, Juan de la C

ierva Program.

88

05

1015

2025

300 2 4 6 8 10

-Lap liberada (%)

tiempo (h)

-Lapliberada (%

) =0.18+0.26* tiempo (h)

r 2=0.9960, 1 and 39 f.d., F=4763.2,<0.01

LA

AD

MIN

ISTR

AC

ION

INT

RA

TU

MO

RA

L D

E B

ET

A L

APA

CH

ON

AD

IMIN

UY

E E

L

TA

MA

ÑO

TU

MO

RA

L Y

EL

IMIN

A L

A T

OX

ICID

AD

SISTE

MIC

A

P. Díaz-R

odríguez1,S. Seoane

2, J. Sendon-Lago2, R

. Gallego

3, R.

Pérez-Fernández2, M

. Landin1

1Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica,Universidad de Santiago de

Com

postela, España.2D

pto de Fisiología-Centro de Investigación en M

edicina Molecular y

Enfermedades C

rónicas (CIM

US), U

niversidad de Santiago de Com

postela,España. 3D

pto de Ciencias M

orfológicas, Universidad de Santiago de C

ompostela, España.

Introducción: La limitada efectividad de la

administración

quimioterápica

sistémica

conduce al empleo de dosiselevadasdurante los

tratamientos, ya

que solo una pequeña fracción del fárm

aco alcanza el tumor y realiza su

efecto terapéutico. A

demás, una im

portantecantidad

de fármaco

se distribuye a otros órganos y tejidos sanos generando efectos no deseados(1). La adm

inistración local en forma de sistem

as intratum

orales se

presenta pues

como

una atractiva alternativa a la hora de favorecer el éxito terapéutico y dism

inuir la toxicidad. La beta-lapachona

(Lap)

es una

naftoquinona natural

cuya actividad

antitumoral

ha sido

ampliam

ente demostrada. Sin em

bargo, no es una excepción en cuanto a la elevada toxicidad sistém

ica que se produce tras su administración

(2)por lo que el desarrollo de form

ulaciones intratum

orales que incluyan estefárm

aco está justificado.

Enun

trabajoprevio

hemos

estudiado la interacción entre los componentes

deform

ulacionesternarias

inyectables y

termosensibles

(Pluronic-Lap-R

MC

D)

capaces de generarsistemas depot en elinterior

del tumor

con perfiles de cesión de fármaco

controlados.La m

odelización mediante redes

neurales artificiales de la composición de estos

sistemas,

junto a

la optim

ización m

ediante algoritm

os genéticos ha permitido seleccionar

una formulación con las propiedades in vitro

adecuadas para administración intratum

oral (3).En este estudio hem

os evaluadola capacidad del

sistema ternario optim

izado para disminuir el

tamaño tum

oral in vivoen tum

ores de mam

a inducidos por inyección de células M

CF-7, así

como la

posible toxicidad sistémica tras

su im

plantación. M

ateriales y Métodos: La com

posición de la form

ulaciónse

obtuvo m

ediantela

modelización y posterior optim

ización de los parám

etros: tem

peratura de

gelificación,capacidad

de solubilización

defárm

acoy

constante de

liberación en

función de

la com

posición ternaria

del sistem

a utilizando

redes neuronales

artificialesy

algoritmos

genéticos (3).

El sistem

a optim

izado de

composición (19.2%

PF127 y 7% R

MC

D)

cargado y sin cargar con fármaco se caracterizó

en cuanto a capacidad de solubilización de -

Lap, propiedades reológicas y perfil de cesión

de fármaco

en PBS usando células de difusión

horizontales. La

actividadantitum

oral de

la form

ulación, así

como

el posible

efecto sinérgico

del Pluronic fueronevaluados frente a

la línea celular de cáncer de mam

a MC

F-7. Para ello se ha estudiado la proliferación celular m

ediante un kit comercial (M

TT),a los 2 y 4

días después

del tratam

iento. La

apoptosis celular

se estudióm

ediante citometría de flujo

usando el kit de detección de apoptosis Annexin

V-FITC

(BD

Biosciences)

yW

estern blot. La efectividad antitum

oral del sistema fue evaluada

in vivousando ratones hom

ocigotos para la m

utación com

binada severa

de deficiencia

inmune espontánea (SC

ID) a los que se le ha

inducido un

tumor

mam

ario m

ediante la

inyección subcutánea

de células

MC

F-7transfectadas con el vector luciferasa-pcD

NA

3, con el fin de estudiar la evolución del tam

año tum

oral por luminiscencia. Q

uincedías

después de la inducción del tum

or se administraron dosis

(14.17 Lap (

g)/peso ratón (g)) del sistema

intratumoral cada 5 días.La toxicidad hepática

y renal,

así com

o la

apoptosistum

oral se

evaluaron mediante inm

unohistoquímica.

Figura 1. Perfil de cesiónde

-Lap in vitroa

partir del sistema optim

izado

Resultados y

discusión: La formulación óptim

a es líquida a tem

peratura ambiente, presenta una

temperatura de gelificación de 29ºC

y solubiliza 1.90 ± 0.05 m

gde

-Lappor m

l, que a 37ºC se

cede de

forma

controlada(Figura

1). Estas

propiedades la hacen adecuada para una posible adm

inistración intratumoral. N

i el Pluronic ni la ciclodextrina m

odifican su actividad antitumoral

como

lo dem

uestran los

resultados de

proliferación celular y apoptosis.

89

Caspasa-3

activa(Tum

or)

PF127+

CD

-Lap+PF127+

CD

x10x10

x40x40

Figura 2.Detección inm

unohistoquímica de la expresión de caspasa-3 activa en tum

ores representativos de los ratones tratados con la form

ulación no cargada (izquierda)ycargada con fárm

aco (derecha).

La elevada hidrofobicidad del fármaco favorece

su transporte pasivo a través de la mem

brana celular lo que explica que no se observe ningún efecto

del Pluronic

sobre la

actividad antitum

oral.A

sí m

ismo,

la form

ulación optim

izada cargada

con -Lap

muestra

un elevado

nivel de

apoptosis celular,

incrementándose los valores de caspasa-3 activa

y disminuyendo los de pro-caspasa-3, m

ientras que con

el sistema sin cargar no se observa la

presencia del

factor apoptótico,

caspasa-3activa.Las

diferencias en

el tam

año tum

oral entre

tumores tratados con el sistem

a cargadode

fármaco

y el no cargado fueron estadísticamente

significativas a partir del día 15 de tratamiento.

Com

o se desprende de los cortes histoquímicos

de los

tumores

extraídospara

ambos

casos(Figura

2), la

actividad proapoptótica

del fárm

aco se mantiene in vivo

mostrándose un

marcado

incremento

de la

muerte

celular (células

teñidas de

marrón)

en los

tumores

tratados con la formulación optim

izadacargada.

Figure 3.

Tinciones hem

atoxilina y

eosina (H

&E) de tejido hepático de ratones tratados

con la formulación no cargada (izquierda) y

cargada con fármaco (derecha).

La figura

3 m

uestra los

cortes histológicos

correspondientes al

tejido hepático

de los

ratones tratadoscon la formulación no cargada y

cargada confárm

aco. Com

o puedeapreciarse,

no se

observan diferencias

en cuanto

a la

estructura del tejido, lo que implica ausencia

de toxicidad.

De

lam

isma

manera

los cortes

correspondientes al

tejido renal

tampoco

mostraron anom

alías, de lo que se deduce que la actividad del fárm

aco se realiza de forma local y

la formulación no presenta toxicidad sistém

ica.La form

ulación de -Lap diseñada y optim

izada m

ediante redes neurales artificiales y algoritmos

genéticos se

presenta com

o una

alternativa interesante

para el

tratamiento

de tum

ores sólidos ya que, es fácilm

ente inyectable, gelifica a tem

peratura corporal y es capaz de liberar una elevada dosis de fárm

aco localmente y por un

período de tiempo prolongado. Este sistem

a presenta

actividad antitum

oral in

vitro,increm

entando significativamente la m

uerte de células de cáncer de m

ama M

CF-7. Su actividad

se mantiene in vivo

disminuyendo de m

anera significativa

el tamaño tum

oral y promoviendo

la apoptosis tumoralsin que se observe síntom

as de toxicidad sistém

ica.R

eferencias:(1) E.P. G

oldberg et al. Intratumoral cancer

chemotherapy

and im

munotherapy:

opportunities for nonsystemic preoperative

drug delivery. J. Pharm.Pharm

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Rodrigues

de A

lmeida

et al.

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on organs from pregnant and non-pregnant

rats. Phytother. Res. 2009; 23: 1276-1280.

(3) P. Díaz-R

odríguez, M. Landin. Sm

art design of intratum

oral thermosensitive

-lapachone hydrogels by

Artificial N

eural Netw

orks.Int.J.Pharm

. 2012; 433: 112-118.(4)

F. W

ang,et al..

Modulating

-lapachona release

from

polymer

millrods

through cyclodextrin

complextion.

J. Pharm

. Sci.

2006;95(10): 2309-2319.A

gradecimientos:

Este estudio ha sido financiado por la Xunta de

Galicia

(PGID

IT04BTF203011PR

)y

el M

inisterio de Economía y C

ompetitividad (SA

F 2012-

39878-C02-01)

P.D-R

(A

P2010-1913) agradece al M

inisterio de Educación, Cultura y

Deporte su financiación m

ediante la becaFPU

.

H&

E(H

ígado)

PF127+CD

90

SISTE

MA

S CE

RA

MIC

OS PA

RA

LA

LIB

ER

AC

IÓN

CO

NT

RO

LA

DA

DE

VE

GF:

INFL

AM

AC

IÓN

Y D

IFER

EN

CIA

CIÓ

N C

EL

UL

AR

P. Díaz-R

odríguez1,P. G

onzález2, J. Serra

2, M. Landin

1

1Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de Santiago de

Com

postela, España.2D

epartamento de

Física Aplicada. E.T.S.E. Industriales. U

niversidad deV

igo, España.

Introducción: La vascularización es un proceso clave en la osteointegración de las prótesis

ya que facilita la llegada de nutrientes, oxígeno, factores solubles y

células al

tejido en

formación

(1). La

incorporación de

factores de

crecimiento,

adhesión y

transcripción en

sistemas

implantables y su posterior liberación de form

a controlada debe facilitar

la recuperación de la función ósea (2). U

na de las alternativas más

prometedoras a la hora de desarrolla una nueva

prótesis es

la de

incorporar factores

de crecim

iento angiogénicos

que favorezcan

la form

ación de

nuevos vasos

yfaciliten

la recuperación de un tejido funcional. Entre ellos, el factor de crecim

iento de endotelio vascular (V

EGF)

es de

los m

ás utilizados

(3). El

mecanism

o de señalización intercelular de los receptores

de V

EGF

promueve,

además,

un increm

ento de

la m

asa ósea

y facilita

la restauración de la función del tejido

debido a la correlación

existente entre

osteogénesis y

angiogénesis (4). Las cerámicas de carburo de

silicio biom

órfico(bioSiC

s)se

fabricanm

ediante un sencillo procedimiento a partir de

recursos naturales,

manteniendo

la m

icroestructura jerárquica

biológicadel

material de origen.

Presentan una porosidad y tam

año de poro dependientes de la madera de

partida yun m

ódulo de Young sim

ilar al del hueso. En este trabajo se evaluó la carga y cesión de diferentes

bioSiCs

conV

EGF.

La biocom

patibilidad y la actividad biológica de estos

sistemas se

evaluó utilizando cultivos decélulas

madre

mesenquim

aleshum

anas obtenidas a partir de m

édula ósea. M

ateriales y

Métodos:

Los bioSiC

s se

fabricaron a partir de madera de pino (Pinus

pinnaster), roble

(Quecus

robur) y

sapelli (Entandrophagm

a cylindricum). La carga de los

sistemas con 380ng de rhV

EGF (PrepoTech) se

llevo a cabo mediante la adicción volum

étrica de una solución de

proteína en PBS y 0.1%

de seroalbúm

ina bovina (BSA

).Los perfiles de

cesión de VEG

F se obtuvieron en PBS (pH

7.4) con agitación constante y en m

edio de cultivo a 37ºC

en presencia de células. La cuantificación de

VEG

Fse

realizó m

ediante ELISA

(R

ayBiotech).

Las células

madre

mesenquim

ales se

obtuvieron generando

un gradiente con Ficoll(5), a partir de m

édula ósea donada

por el

servicio de

Ortopedia

del

Com

plejo H

ospitalario U

niversitario de

Santiago de Com

postela.La respuesta celular a los bioSiC

seestudió m

ediante el análisis de laproliferación

celular (M

TT) y

apoptosis (caspasa-3). Se evaluó la inflam

ación producida y

la posible

diferenciación celular

mediante

PCR

cuantitativa en tiempo real de los genes

que codifican para el TNF-

, el receptor 1 de V

EGF,la A

LP y el GA

PDH

. R

esultados y Discusión: La figura 1 m

uestra el perfil de liberación

de VEG

F en PBS con 0.1%

de B

SAcon el fin de evitar la degradación del

factor de crecimiento. C

omo se desprende de los

resultados experim

entales, se

consigueuna

cesión prolongada del factor de crecimiento

durante los cinco primeros días de ensayo sin

que se observe una brusca liberación inicial.Tras

este tiem

po la

cantidad de

proteína cuantificada por ELISA

se reduceposiblem

ente debido

a la

degradación del

factor de

crecimiento.

Este fenóm

eno no

se observa

cuando la liberación se realiza en el medio de

cultivoen el que probablem

ente, la estabilidad de la proteína se vea favorecida.

01

23

4060

80100

0 20 40 60 80

100

VEGF liberado (%)

tiempo (h)

Pino Roble Sapelli

Figura 1.Perfil de liberación de VEG

F en PBS pH

7.4 con agitación oscilante.

Los resultados

de proliferación

celular no

muestran

diferencias significativas

entre los

BioSiC

s cargados con VEG

F y los no cargados.Lo m

ismo ocurre cuando se com

paran cultivos de células m

adre mesenquim

ales en medios con

VEG

F y

sin V

EGF,

lo que

indica que

la presencia

del factor

VEG

F no

favorece la

proliferación celular

de las

células m

adre m

esenquimales,

ni cuando

se encuentra

adsorbido en la superficie cerámica ni cuando se

incorporaen form

a de solución. La evaluación de la apoptosis se ya ha llevado a cabo cuantificando los niveles de caspasa-3, una enzim

a proteolítica,

clave en

fase final

del proceso

de apoptosis

(4). C

omo

se puede

91

observar en la figura 2, los niveles de apoptosis en las m

uestras no son significativamente m

ás elevados que los del control negativo (células cultivadas

sobre pocillo)

y control

positivo (células en presencia de la m

isma dosis de

VEG

F pero en el medio de cultivo).

Control -Control +

PinoRoble

Sapelli0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

caspasa-3 (ng/ml)

Figura 2.

Niveles de caspasa-3 obtenidos tras 48

horas de cultivo El control negativo se corresponde a células cultivadas con m

edio de cultivo solo y el control positivo a células cultivadas con m

edio de cultivo enriquecido con V

EGF.

Lapotencial diferenciación de las células m

adre a células endoteliales vasculares y su efecto sobre

una posterior

diferenciación hacia

osteoblastos se llevó a cabo mediante la técnica

de PC

R

cuantitativa en

tiempo

real. Se

seleccionó como gen control el G

AD

PH (6). La

expresión de uno de los receptores de VEG

F específicos de células endoteliales sanguíneas (receptor1

de V

EGF;

VEG

FR-1)

(4)se

cuantificó en

función del

control positivo

(expresión de VEG

FR-1 de células con 380ng

de VEG

Fen el m

edio de cultivo)a los 5 días de acuerdo con el m

étodo C

t (6). Los

resultados experim

entales (Figura

3)indican que la liberación sostenida de V

EGF a

partir de

los bioSiC

s prom

ueve de

manera

satisfactoria la

diferenciación hacia

células endoteliales. A

demás, la adicción del factor de

crecimiento en form

a de solución no favorece la diferenciación (nivel de expresión 1) m

ostrando niveles de expresión sim

ilares a los del control negativo. Los resultados de expresión de TN

F-,

cuya presencia al igual que la IL-1

favorece la resorción ósea e induce la diferenciación hacia osteoclastos,

no m

uestranvalores

estadísticamente

diferentes a

los del

control negativo, lo que indica que los discos de carburo de silicio cargados no inducen una respuesta inflam

atoria en

las células

madre

mesenquim

ales. La

inducción hacia

osteoblastos se

evaluó m

ediante la cuantificación de la expresión de un gen asociado a osteoblastos, la fosfatasa alcalina (A

LP). De acuerdo con los resultados obtenidos

la expresión de ALP tras 10 días de cultivo tanto

en las células cultivadas con VEG

F en el medio

como las cultivadas en presencia de bioSiC

presenta el mism

o nivel de expresión que el control negativo, lo que indica que no se induce la diferenciación a osteoblastos.

PinoRoble

SapelliControl -

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0

VEGFR1( Ct)

Control +

Figura 3.

Niveles

de expresión

de V

EGFR

1 norm

alizados en función de la expresión del control positivo.

Todos los

bioSiCs

producidos incorporan

y liberan

de m

anera controlada

VEG

F, con

adecuada respuesta

celular y

sin diferencias

significativas entre

ellos. Estos

materiales

cargados inducen la diferenciación de células m

adre mesenquim

ales a células vasculares, no provocan

alteración significativa

en los

marcadores

de inflam

ación pero

tampoco

facilitan su diferenciación a osteoblastos.R

eferencias:(1) E. W

ernike et al. VEG

F incorporated into calcium

phosphate ceram

ics prom

otes vascularisation

and bone form

ation in vivo, European Cells and M

aterials 19: 30-40 (2010).(2) J.R

. Porter et al., Bone tissue engineering: a

review

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biomim

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drug delivery

strategies, B

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25 (6):

1539-1560 (2009).(3)

M.

Bahram

soltani et

al., Q

uantitation of

angiogenesis in vitro induced by VEG

F-A and FG

F-2in tw

o different human endothelial cultures – an all-

in-one assay,

Clinical

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edia in the isolation of marrow

derived

human

mesenchym

al stem

cells

with

osteogenic potential, Chang G

ung Med J 32: 264-275

(2009).(6) H

.D. V

anGuilder et al., Tw

enty-five years of quantitative

PCR

for

gene expression

analysis, B

ioTechniques 44 (5): 619-626 (2008).A

gradecimientos:

Este trabajo

ha sido

financiado por

el proyecto

FEDER

PO

CTEP0330IB

EROM

AR

E1. P.D

-R(A

P2010-1913) agradece al Ministerio de

Educación, C

ultura y Deporte su financiación m

ediante la beca FPU

. Agradecem

os la colaboración deR

. Couceiro

en el suministro y m

anipulación de las células madre

mesenquim

ales.

92

APL

ICA

CIÓ

N D

E L

A IC

H Q

8 A L

A V

AL

IDA

CIÓ

N D

E L

IMPIE

ZA: E

SPAC

IO D

E D

ISEÑ

O.

W. R

ezquellah1,E. G

arcía-Montoya

1-2,P. Pérez-Lozano1,2, A

.Fàbregas 1,2,C. C

arrillo2, J.M

. Suñé -N

egre1-2, J.R

. Ticó1-2, M

. Miñarro

1-2

1Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de B

arcelona, España2Servicio de D

esarrollo del Medicam

ento, Facultad de Farmacia, U

niversidad de Barcelona, España

Introducción: La validación de la lim

pieza es un tema de

cumplim

iento im

prescindible en

el entorno

GM

P de fabricación de medicam

entosy m

ás aún en una planta piloto donde se desarrollan productos en investigación (PEI) que pudieran llegar a form

ar parte de un ensayo clínico. Los factores

particulares de

la producción

de m

edicamentos en una planta piloto (equipos

multiproducto, diferentes

principios activos con distintas

propiedades físico-quím

icas o

toxicológicas o de seguridad, fórmulas nuevas

no repetitivas, lead time de desarrollo, etc.)

hacen que la operación de limpieza en la planta

piloto se

haya tom

ado com

o una

consigna fundam

ental a cumplir para poder asegurar la

calidad de los productos elaborados, la ausencia de contam

inación cruzaday

una demostración

de la consistencia del proceso de limpieza y por

ende de fabricación (Ref. 1-3).

Materiales y M

étodos: Con el

fin de determinar el m

étodo óptimo de

limpieza

de losequipos de fabricación en la

planta piloto

SDM

, se

ensayaron varios

procedimientos

de lim

pieza utilizando

diferentes condiciones

basadas en

cuatro factores

principales: la

temperatura,

la concentración

del detergente,

tiempo

de contacto del detergente sobre la superficie y laacción m

ecánica o el frotado (tabla 1).Estos

factores se dedujeron a partir de los métodos de

limpieza utilizados en

la planta piloto. Para determ

inar las condiciones se llevó a cabo un diseño de experim

entos (DoE) para deducir las

interacciones y

factores principales

que pudieran resultar significativos en la operación.

FactorN

ivelInferior

Nivel

Su periorD

etergente (%)

0,010,0

Tiempo de contacto

(min)

0,010,0

Temperatura

(ºC)

34,070,0

Acción m

ecánica (min)

0,01,0

Tabla 1.Factores principales del procedim

iento de lim

pieza bajo estudio.

El equipo utilizado para la validación se dedujo a partir del análisis de riesgos previo realizado con

todos los

equipos de

la planta

piloto: m

áquina de compresión R

IVA

(8 punzones).

Para el análisis del equipo se escogieron 8 puntos que se consideraron críticos, incluyendo 3

accesiblesy

5 de acceso difícil. Para ello se utilizó una plantilla de 25 cm

2, para aquellos puntos

que tenían

un tam

año y

forma

adecuados, para

el resto

se m

uestreó por

completo la superficie (figuras 1 y 2).

Figura 1.

Pieza de

Figura 2.

Placa de

apertura (5,5 cm2)

protección (25 cm2)

Para cada muestreo, se utilizaron 2 sw

abstipo

Texwipe75, el prim

ero mojado

en solución y el segundo

seco, siguiendo

el patrón

que se

muestra en figura 3.

Figura 3.

Esquema

del procedim

iento de

muestreo

de residuos.

La respuesta estudiada fue el nivel de residuos del A

PI indicador que se calculó previamente

(4). La especificación se calculó utilizando el criterio del um

bral de preocupación toxicológica (5)y el resto de m

étodos habituales (6-8), con lo cual el lím

ite a cumplir fue 0,4

g/cm2.

Elanálisis se realizó porH

PLC (4).

InicioFin

Inicio

Fin

Darle la vuelta al sw

ab

93

Resultados y D

iscusión: El

grafico de

Pareto (Figura

4) obtenido

mediante el program

a estadístico Statgraphicsm

ostró que

ningún factor

afectabasignificativam

ente a

la cantidad

deresiduos

remanentes, aun así el factor m

ás importante

para retirar los residuos fuela com

binación (C

D) de tem

peratura (C) y acción m

ecánica (D)

y de los factores individuales el (B) tiem

po de contacto. Figura 4.Efectos estandarizados.

Concretam

ente el

tiempo

de contacto

(B)

influye positivamente en el resultado, es decir a

mayor

tiempo

de contacto,

más

residuo se

detecta lo cual es lógico, al resecarse el residuo resulto m

ás difícil de retirar. En el caso de tem

peratura y acción mecánica la situación es

opuesta: combinando los dos factores en su

nivel alto podemos obtener m

enos residuos.

En la Figura 5 se relacionan los dos factores, tiem

po de

contacto y

concentración del

detergente: vemos que la m

enor cantidad de residuos

se encuentra

cuando m

enor concentración de detergente y m

enor tiempo de

contacto, es decir si se limpia inm

ediatamente.

Figura 5.R

esiduo según la variación de dosfactores: la concentración del detergente y la acción m

ecánica.

Com

o conclusión, puede decirse que, aunque no haya

ningún factor

que influya

significativamente en el nivel de residuo, según

el programa de tratam

iento estadístico de datos Statgraphics, se ha podido optim

izar el método

de limpieza, y el

método óptim

o recomendado

es el mostrado a continuación:

Factor

Nivel

Detergente (%

)5,0

Tiem

po de contacto (min)

0,0

Tem

peratura (ºC)

67,0

Acción m

ecánica (min)

1,0

Estas condiciones se han probado sobre tres equipos diferentes y se han m

uestreado sus puntos críticos para los A

PI con los que se estaban

trabajando, y

se ha

obtenido un

resultadode

aptopara todos ellos. C

on lo cual queda establecido el procedim

iento general para la lim

pieza de los equipos del SDM

.

Referencias:

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uality by design for biotechnology

products –

Part 1.

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olume 22, Issue 11 (visto el día

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arcía-Montoya, E.; Pérez-

lozano, P.;

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for cleaning

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aceutical technology. (D

ec 20, 2007).

94

EFE

CT

O D

E L

OS C

OM

PON

EN

TE

S DE

LA

FOR

MU

LA

CIÓ

N E

N E

L T

AM

AÑ

O D

E

NA

NO

PAR

TÍC

UL

AS L

IPÍDIC

AS SÓ

LID

AS (SL

N™

) A

. Fàbregas 1,2,M. M

iñarro1,2, J.M

. Suñé-Negre

1,2, J.R. Ticó

1,2, E. García-M

ontoya1,2, P. Pérez-Lozano

1,2,R

. Sarrate2, N

. Sánchez2, C

. Carrillo

2

1Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de B

arcelona, España2Servicio de D

esarrollo del Medicam

ento, Facultad de Farmacia, U

niversidad de Barcelona, España

Introducción: Las

SLN™

constituyen

unsistem

a coloidal de tipo emulsión o/w

para uso com

o vectores no virales en vehiculización defárm

acos y/o

ácidos nucleicos.

Están com

puestas de

lípidos en

estado sólido

a tem

peratura fisiológica, los cuales debentener

el estatus

de lípidos

G.R

.A.S.

(Generally

Recognized As Safe).El tamaño m

áximo

para su endocitosis por células diana está alrededor de los 150 nanóm

etros de diámetro. En el caso de

vehiculización de

ácidos nucleicos,

estos pueden

quedar insertados

en el

interior del

lípido o

lípidos m

atriciales, o

unidos en

superfície, por lo que es necesario escoger el lípido

adecuado que

permita,

o bien

su liberación controlada en la célula diana

en el prim

er caso,

o evitar

la opsonización,

degradaciónenzim

ática o unión inespecífica a proteínas

plasmáticas,

en el

segundo. En

cualquier caso, es necesarioun lípido catiónico,

es decir, con carga positiva, que permita la

unión de DN

A o R

NA

, de carga negativa,m

ediante interacción electrostática. En el caso que se presenta, las SLN

™ se proponen com

o eventuales transportadores

de ácidos nucleicos. Se com

para el tamaño de partícula obtenido

usando como m

atriz lipídicaC

ompritol®

888A

TO (glicerol behenato) y Á

cido Esteárico. Se ha utilizado el

método de la m

icroemulsión en

caliente para

su obtención.

La estructura

einteracción entre

los diferentes lípidos debe evaluarse para conocer en qué grado pueden ser determ

inantes para

el tam

año de

partícula obtenido,

y por

lo tanto

en su

eventualcapacidad

para transfectar

eficientemente

células diana.

Materiales y M

étodos: C

ompritol®

888

ATO

(G

attefossé), Á

cido Esteárico

de origen

vegetal(M

erck), O

ctadecilamina

(Acros),

Lutrol®

68 (B

asf), A

gua ultrapura (Millipore).

Las SLN™

se obtienen por medio del m

étodo de

la m

icroemulsión

en caliente.

La com

posición en lípidos constituyeun 4%

del producto final.

El componente de la m

atriz lipídica

(Com

pritol®

888 A

TOo

Ácido

Esteárico)se calientaunos 10 ºC

por encima de

su punto de fusión. Se procede de forma análoga

para el

lípido catiónico

(Octadecilam

ina), m

ezclándolo con

Lutrol®

F68 (óxido

de polipropileno) com

o tensiactivono iónico,y

el

agua ultrapura.

El C

ompritol®

888

ATO

oÁ

cido Esteárico, según el caso,sevierten, una

vez fundidos,sobre el resto de componentes, y

la mezcla se agita m

ecánicamente

para formar

una emulsión. Posteriorm

ente,se vierte en agua fría (2-3ºC

) yse agita de form

a mecánica,

formándose las SLN

™.

Estasse concentran y

purifican m

ediante centrifugación

y filtrado,

respectivamente.

El tamaño de partícula

se analiza por triplicadopara

cada lote,

mediante

difracciónláser

(Mastersizer 2000, M

alvern Instruments), y se

expresacom

o diámetro

medio (D

[3,2]) en nanóm

etros (nm).

Resultados

y D

iscusión: Los

resultados de

determinación del tam

año de partícula para lasSLN

™ fabricadas con

Com

pritol® 888 A

TOy

Ácido

Esteáricocom

o m

atrices lipídicas

se m

uestran en la tabla 1.

LÍPIDOCompritol® 888 ATO

122Ácido esteárico

129

TAMAÑO DE PARTÍCULA (nm)D[3, 2]

Tabla 1. D

iámetro m

edio delas nanopartículas

obtenidas con los diferentes lípidos.

El valor de diámetro m

edio obtenido indica un m

ayor tamaño de partícula en el caso delÁ

cido Esteárico. Si se desglosa el intervalo entre 50 y 300

nm

en diferentes

tramos

se obtiene

el porcentaje de nanopartículas en cada uno de ellos, tal com

o se muestra en la tabla 2.

Su representación gráfica se m

uestra en la Figura 1.

Distribución según tam

año Com

pritol® ATO 888

Ác. Esteárico

50-100 nm27%

26%100-150 nm

26%24%

150-200 nm15%

14%200-300 nm

15%13%

T

abla 2.R

esultados para el tamaño de partícula

para los dos lípidos, representados como el

porcentaje para cada tramo respecto del total de

producto obtenido.

95

0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 9%

10%

Compritol® 888

Ácido esteárico

Figura 1.

Porcentajede

SLN™

fabricadas

utilizando C

ompritol®

888

ATO

y Á

cido Esteárico,

para intervalos

de tam

año de

partícula.

Para las

nanopartículas obtenidas

en cada

intervalo de tamaño, el m

ayor porcentaje lo form

an aquellas comprendidas entre 50 y 100

nm, ligeram

ente por encima del porcentaje de

nanopartículas entre 100 y 150 nm, tanto para el

Com

pritol® 888 com

o para el Ácido Esteárico.

El resultado es compatible con la necesidad de

conseguirSLN

™ no m

ayores de 150nm

, pues la m

ayor proporción de SLN™

se encuentra en el

rango adecuado.

Si se

representanlos

resultados de nanopartículas obtenidas entre 50-300 nm

tal como se m

uestran en la figura 2, aparece un perfil acam

panado y simétrico, a

modo de distribución gaussiana. El intervalo

que comprende nanopartículas entre 120 y 138

nm incluye

el porcentaje más elevado para los

dos lípidos(8,73%

), aunque el Com

pritol® 888

ATO

se ve ligeramente favorecido en cuanto al

porcentaje obtenido

respecto del

total de

producto.

Figura 2.Distribución del tam

año de partícula en porcentaje, dentro del intervalo de 50-300 nm

de

diámetro.

Las líneas

discontinuas

incluyen el tramo de tam

año con el mayor

porcentaje en nanopartículas.

Para com

probarsi

la diferencia

en tam

año m

edio de partícula es significativa entre ambos

lotes, se

realiza un

contraste de

hipótesis partiendo de los datos de la tabla 1.Puesto que el valor-P para la prueba (0,0128) es m

enor que el nivel de significación (0,05), se concluye que existe diferencia estadísticam

ente significativa entre un lote y

otro con un 95,0%

de nivel de confianza. A

sí, en

función de

los resultados,

es m

ás favorable

la utilización

de C

ompritol®

888

ATO

como m

atriz lipídica para la fabricación de SLN

™

en cuanto

a la

obtención de

nanopartículas de menor tam

año, puesto que posteriorm

ente se deberá tener en cuenta que el diám

etro medio aum

entará por la adición de la m

olécula de

DN

A/R

NA

, aunque

este increm

entodependerá básicam

ente del número

de bases de lasecuencia nucleotídica.

Referencias

(1) H. B

unjes. Structural properties of solid lipid based colloidal drug delivery system

s. Current

Opinion

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Interface Science.

2011:16:405-411.(2)

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Chem

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(3) D

.J. G

ary et

al. Polym

er-based siR

NA

delivery: perspectives on the fundam

ental andphenom

enological distinctions from polym

er-based

DN

A

delivery (R

eview).

Journal of

Controlled R

elease.2007:121:64-73.(4) P. Severino. C

urrent state-of-art and new

trends on lipid nanoparticles (SLN and N

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elivery. V

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lipid nanoparticles (SLNs) freeze-dried w

ithout cryoprotectors. C

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FP-plasmid. European Journal of

Pharmaceutics

and B

iopharmaceutics.

2007:67:320-328.

0%

10%

20%

30%

50-100 nm100-150 nm

150-200 nm200-300 nm

Compritol® ATO 888

Ácido esteárico

96

CARACTERÍSTICAS FARMACÉUTICAS DEEMULSIONES TÓPICAS DE

ROMERO

Beatriz C

onde Valentín

1,3,Am

alia Mª R

odríguez Bayón

1,2,Carm

ina Rodríguez Fernández

3,Mª Elvira Franco G

il 1

1. Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica.2. Grupo de B

iotransformaciones.

3. Departam

ento de Microbiología II.

Universidad C

omplutense

de Madrid.Plaza R

amón y C

ajal s/n. 28040-Madrid (España)

beatrizconde@pdi.ucm

.es; amalia@

farm.ucm

.es;carmina@

farm.ucm

.es;elvirafg@farm

.ucm.es

IntroducciónA

ctualmente, existe un interés creciente sobre el

uso de

compuestos

naturales que

muestran

actividad antioxidante

y conservante.

Los polifenoles obtenidos de diferentes plantas se encuentran entre estos com

puestos de origen natural, y m

uestran unas excelentes propiedades antioxidantes y antim

icrobianas [1]. Entre esas plantas, una de las que m

uestranm

ayor interés debido, a su elevado contenido en polifenoles, es el Rosm

arinus officinalis L.[2- 4].La

oxidación lipídica

y el

crecimiento

microbiano, en los productos farm

acéuticos y cosm

éticos, puede conllevar: a) alteraciones de sus características organolépticas, b) cam

bios en la estabilidad de los preparados, y c) pérdida de su actividad farm

acológicao cosm

ética, debido aalteraciones de

sus componentes activos.

Objetivos

1) Incorporar un extracto acuoso liofilizado de Rosm

arinus officinalis L.endos em

ulsionesO

/A

de aplicación

tópica. 2)

Com

parar las

características organolépticas

de am

bas em

ulsiones. 3) Estudiar la liberación de dicho extracto desde las dosem

ulsiones.

Materiales y

Métodos

Extracto

liofilizadode R

osmarinus officinalis

L.El extractoacuoso de Rosm

arinus officinalis L.liofilizado utilizado en este trabajo es un polvo am

arillo-anaranjado de baja densidady elevada

solubilidad acuosa, que debe protegersede la luz

debido a su carácter fotosensible. D

icho extracto de romero (ER

) fue obtenido a partir de las

hojas de Rosmarinus officinalis L.

por secado, pulverización,suspensión en agua

miliQ

estéril, calefaccióny filtración

[5]. Tras su liofilización

fuealm

acenadoa

-20ºC.,

resguardadode la luz, hasta su uso.

Form

ulaciones que contienenel extracto

de R

osmarinus officinalis L. liofilizado

El ER se form

ulóen

dos emulsiones O

/A(F1 y

F2) de aplicación tópica. La composición de la

formulación 1 (F1) es: V

aselina filante (40%),

Tefosé 1500(10%

), Tween 80

(5%), ER

(1%)

y agua destilada (c.s.p.100%). La form

ulación 2 (F2) está com

puesta por: Vaselina líquida (8%

), Labrafil 1944 cs

(3%), Tefosé 63

(15%), ER

(1%) y agua destilada (c.s.p.100%

).El extracto liofilizado (ER

), previamente reconstituido en

agua destiladahasta una concentración de 300

mg/m

L, fue incorporado enla fase acuosa de

cadaem

ulsión. Las emulsiones se elaboraron

siguiendo un

procedimiento

estandarizado de

temperatura y agitación [6].

Estudios “in vitro” de liberación del extracto de

Rosm

arinus officinalis L.Se investigó la liberación “in vitro” del extracto de rom

ero desde cada una de las emulsiones

O/A

. Para cada formulación se realizó un ensayo

a37ºC

, utilizando

tres celdas

de difusión

(superficie =

10,75 cm

2). En

cada celda

se colocaron 10 g de em

ulsión, como fase dadora.

Separando esta fase de la aceptora (150 mL de

solución amortiguadora fosfato-citrato pH

5,5) se colocó

una m

embrana

de celofán.

Sem

antuvieron las

condiciones “sink”

mediante

agitación constantea 100 rpm

. Se tomaron 18

muestras no repuestas (1

mL/m

uestra) de la solución aceptora a lo largo de

las 3 horasde

duración del ensayo. El ER liberado se cuantificó

por espectrofotometría

UV

(=279 nm

).

Resultados y D

iscusión E

studio de las características organolépticasSe estudiaron las características organolépticas de las dos form

ulaciones y se procedió a su com

paración. Form

ulación 1: La emulsión presenta un ligero

color amarillento, olor dulzón, tipo “cam

pestre”. Es bastante fluida, de fácil extensión, con cierta textura oleosa y, al aplicarla,deja

una sensación algo pegajosa. Su

aspecto es homogéneo.

Formulación

2: Ésta,

presenta ligero

color am

arillento, algo

más

brillante que

la form

ulación 1.

Mism

o olor

dulzón, tipo

“campestre”. Es ligeram

ente fluida, aunque más

consistente que la formulación 1. Se extiende

fácilmente, pero tarda bastante tiem

po en dejar de apreciarse en el lugar de aplicación, dejando un

ligero residuoblanquecino. Tam

bién presenta un aspecto hom

ogéneo.

Estudios de liberación “in vitro”

Formulación

1:El

porcentaje de

extracto liberado

desde cada

formulación,

frente al

tiempo de ensayo

(minutos) se representa en la

figura 1. Puede observarse que, al final del

97

ensayo, la formulación 1

ha liberadoel 4,57%

del ER

en ella contenido.

Figura 1:Porcentaje de liberación “in vitro”del

ERdesde am

bas formulaciones (F1 y F2)

y = 0,0227x + 0,5235 r = 0,9954

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

020

4060

80100

120140

160180

Tiempo de ensayo (m

inutos)

Liberación ER (%)

F1F2

Las ecuaciones obtenidas al ajustarlos datos de

liberación a las cinéticas de orden cero, Peppas e H

iguchi se muestran en la tabla 1. C

omo puede

apreciarse, el

mejor

ajuste corresponde

a la

cinética de orden cero(r = 0,9954)

liberándose el extracto a una velocidad constante de 23

g/min.

Tabla 1:C

inéticas de liberación del ER desde la form

ulación 1.

C

inética de orden cero(m

in; %)

Cinética de Peppas

(min; m

g)

Cinética de H

iguchi(m

in1/2;

mg/cm

2)

Ecuación

y = 0,0227x + 0,5235

y = 0,0020x0,5659

y = 0,0315x –

0,0355C

oeficiente de correlación

(r)0,9954

0,98720,9888

Formulación 2:Perm

itió la liberación de 2,35%

del extracto incorporado en la emulsión (figura

1).Los datos de liberación del extracto ER

se ajustaron a las cinéticas de orden cero, Peppas e H

iguchi.Las

ecuaciones de

estos ajustes

se m

uestran en la tabla 2. Com

o se puede observar, la cinética de Peppas perm

ite el mejor ajuste (r =

0,9951).Al cabo de las tres horas de duración del

ensayo, la

cantidad liberada

acumulada

normalizada por la cantidad inicial fue de 0,024

mg (figura 2).

Figura 2:Liberación “in vitro” del ERdesde la

formulación 2. C

inética de Peppas.

y = 0,0006x0,7070

r = 0,9951

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

030

6090

120150

180Tiem

po de difusión (minutos)

Cantidad acumulada a tiempo t/cantidad en emulsión a t=0 (mg)

Tabla 2: Cinéticas de liberación del ER desde la

formulación 2.

C

inética de orden

cero(m

in; %)

Cinética de Peppas

(min; m

g)

Cinética de H

iguchi(m

in1/2;

mg/cm

2)

Ecuación

y = 0,0126x + 0,2035

y = 0,0006x0,7070

y = 0,0190x–

0,0309C

oeficiente de correlación

(r)0,9912

0,99510,9948

Conclusiones

1. Las formulaciones y el proceso de elaboración

propuesto permiten la incorporación del extracto

acuoso liofilizado de Rosmarinus officinalis

L. en

dos em

ulsiones O

/A

de adm

inistración epicutánea. 2. El extracto dota

a la emulsión de particulares

características organolépticas,

especialmente

color (am

arillo parduzco)

y olor

(“dulzón, cam

pestre”).La form

ulación 2tarda m

ás en desaparecer del lugar de aplicación que la form

ulación 1y deja

unligero

residuoblanquecino,

pese a

tener m

enor contenido oleoso yla m

isma facilidad de

extensión que la formulación 1.

3. En

condiciones epicutáneas

de pH

y

temperatura las dos em

ulsiones muestran distinta

capacidad de liberación “in vitro” del extracto acuoso de rom

ero. La formulación 1 llega a

liberar el 4,57% del extracto en ella incorporado,

siguiendo una cinética de orden cero (velocidad de liberación = 23

g/min).

La form

ulación 2,

más

consistente que

laform

ulación 1, libera tan sólo el 2,35% del

extracto contenidoen ella siguiendo

una cinética de Peppas.

Referencias

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., Kom

aitis, M. Food

Chem

istry, Athens, 95: 44-52, (2006)

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Conde

Valentín,

B.,

Franco G

il, M

. E.,

Rodríguez Fernández, C

., Rodríguez

Bayón, A

. M.

SPLC-C

RS-Local C

hapter Meeting, Lisboa (2010)

[6] Rodríguez B

ayón, A.M

.; Franco Gil, M

.E., Paños Pérez, I.M

. V SPLC

-CR

S-Local Chapter

Meeting (2002) Sevilla.

Agradecim

ientosB

.C.V

. agradece

al M

inisterio de

Educación, cultura y deporte por

la concesión de la beca FPU

2011(A

P2010-0818).

98

HIDROG

ELES PARA LA LIBERACIÓN

COLÓ

NICA DE ACETO

NIDO

DE TRIAMCIN

OLO

NA: ESTU

DIO

IN VIVO

EN M

ODELO

DE ENFERM

EDAD INFLAM

ATORIA CO

LÓN

ICA EN RATAS

M. Gago-Guillan1, V. Merino Sanjuan

2, F. J. Otero Espinar 1. 1Departmento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Universidad de Santiago de Compostela, España.

2Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Universidad de Valencia, España.

Introducción:Son

muchas las

patologías que

afectan a laúltima porción del tracto gastrointestinal,

entre las que podemos destacar enfermedades inflamatorias, del tipo de la colitis ulcerosa o la Enfermedad de Crohn

por su creciente incidencia en la población (1). En los últimos años, con el fin de mejorar su tratamiento, se ha avanzado en los conocimientos relacionados con la liberación selectiva de fármacos en

el colon.

Se han

desarrollado diferentes

formulaciones persiguiendo

principalmente dos

objetivos: conseguir una mayor concentración del fármaco en la zona dañada, con el consiguiente aumento del efecto, y la disminución de la absorción sistémica del fármaco en las primeras porciones del tracto digestivo, reduciendo de esta manera un gran número

de efectos

secundarios. Una

posible alternativa terapéutica para conseguir estos objetivosson las formulaciones basadas en la degradación enzimática

colónica. Entre

estos sistemas

se encuentran los hidrogeles de polisacáridos naturalescomo la goma Garrofina y la goma Xantana.Estos polímeros presentan una biocompatibilidad

elevada y en presencia de los fluidos corporales forman una red polimérica con la capacidad de retener al fármaco en su

interior, consiguiendo que apenas se libere fármaco en los primeros tramos del sistema digestivo. Una vez que el hidrogel alcanza el colon, la acción de las enzimas de la flora degrada la red polimérica, liberando la totalidad del fármaco retenido en el lugar de acción, con el consiguiente aumento del efecto

(2). El fármaco ensayado es el Acetónido de

Triamcinolona, un

corticoide con

efecto antiinflamatorio que presenta los efectos adversos a nivel sistémico típicos de este grupo farmacológico.Materiales y Métodos:M

ateriales :goma Xantana y Garrofina (Inagarbe),Acetónido de Triamcinolona (Fagron), TNBS (Sigma-Aldrich), etanol y propilenglicol (Merck).M

étodos:Elaboración de los com

primidos:Para la elaboración

de los comprimidos se han mezclado la Goma Xantana y la Goma Garrofina al 50%

. Aesta mezcla

se le

ha añadido

un 1%

de

Acetónido de

Triamcinolona. Sobre porciones de 500 mg del polvo obtenido se ha aplicado una fuerza de 7,5 toneladas durante 10 minutos en un punzón de infrarrojos de 1,3 mm de diámetro y con la ayuda de una prensa hidráulica Mega B20. Los comprimidos obtenidos fueron torneados utilizando una Dremel 3000

para darle forma capsular y ajustar el peso a los 30 ± 0,3 mg.Para los comprimidos placebo se ha seguido el mismo procedimiento sin la adición del fármaco.

Inducción de la inflamación colónica:Para el estudio

se han empleado ratas Wistar de 250 - 320 g de

peso.Para la inducción de la inflamación colónica se adormecen las ratas con isofluorano. Se introduce 8 cm de

una cánula adecuada por vía rectal y a través de ella,se administran 0,5 ml de una disolución de TNBS 0,13 M

disuelto en etanol al 50% (v/v). Tras la

administración las

ratas se

separan en

jaulas individuales. La dosificación del tratamiento ha sido de una administración diaria los días 3, 4 y 5 contados a partir de la inducción del proceso inflamatorio.A los 9 días se sacrifican

los animalespor sobredosis de pentobarbitaly se procede a la evaluación del daño. Diseño del experim

ento y evaluación de la actividad:El experimento se ajusta a un modelo multifactorial aleatorizado

con 5 factores que se corresponden con el

tratamiento recibido:

comprimido placebo,

comprimido con Acetónido de Triamcinolona, 30 mg de

espuma rectal Proctosteroid®

como formulación de referencia, 0,5 ml de una disolución de Acetónido de

Triamcinolona al

0,6%

en una

mezcla de

propilenglicol y suero salinoen proporción 80:20, y

0,5 ml de una disolución placebode la misma

composición que la anterior pero sin fármaco.Se han hecho 5 replicados para cada grupo de tratamiento.La actividad deltratamiento se evaluó

respecto al edema colónico

(relación peso colon/peso corporal el día

9), a la actividad mieloperoxidasa del tejido colónico

tras el

sacrificio y

a una

puntuacióncalculada

a partir del control diario de los animales teniendo en cuenta la perdida de peso, presencia de heces y su aspecto, y presencia de sangrado.

CONTROLRANGO

PUNTOS

% PESO

PERDIDO

<1%0

1-5%1

5-10%2

10-20%3

>20%4

ASPECTO HECES

Heces abundantes y formes0

Heces blandas2

Heces líquidas o ausencia4

PRESENCIA SANGRE

Ausencia0

Sangre en heces2

Sangre abundante en heces4

Tabla 1:Correspondendia de valor de

puntuacióncon las observaciones diarias.La actividad mieloperoxidasa se ha medido por elmétodo descrito en el trabajo de C. Mura (3) con alguna modificación: la reacción se detuvo con la adición de 15

l de H2 SO

4 2N y la longitud de onda de lectura en el lector de placas ha sido de 450 nm.Para el calculo de

puntuaciónse ha tenido en cuenta

tres parámetros: el porcentaje de pérdida de peso

99

con respecto al día 0, prensencia de heces y aspecto de las mismas en la jaula, y presencia o ausencia de sangre. Se ha preestablecido unos rangos para para cada uno de los parámetros control (Tabla 1) para asignarles un valor

numérico, así se obtiee una puntuación

entre 0 y 12, indicativa del grado de la enfermedad,

correspondiendo el

valor 0

a la

ausencia de la misma y el 12 al mayor grado de inflamación.Resultados y Discusión: Tal como se observa en la figura 1 se ha obtenido una gran variabilidad en la respuesta para las diferentes formulaciones estudiadas, probablemente causado por una respuesta muy variable obtenida para

la inducción

de la

inflamación entre

los diferentes animales.

PUN

TUAC

IÓN

comp pla

comp ta

espuma

sol ta

sol pla

0 2 4 6 8 10

EDEM

A CO

LON

ICO

comp pla

comp ta

espuma

sol ta

sol pla

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

colon/peso corporal (mg/g)

MIELO

PERO

XIDASA

comp pla

comp ta

espuma

sol ta

sol pla

0

200

400

600

actividad MPO (ng/ml)/g de tejido

Figura 1.Valores de puntuación, edema colónico y de

actividad mieloperoxidasa

para los

distintos grupos de tratamiento al noveno día

de la inducción de la inflamación.

Ello no

ha permitido

obtener diferencias

estadísticamente significativas entre grupos, si bien se han observado ciertas tendencias que será necesario corroborar. Atendiendo a los resultados obtenidos para la puntuación,que se muestran en la Figura 1, podemos observar que con los hidrogeles de Xantana/Garrofina conteniendo Triamcinolona se obtiene

el valor

mas bajo,

lo que

indica una

sintomatologíamas leve en comparación con los

tratamientosespuma rectal y solución. Ocurre lo

mismo para la evaluación del edema colónico, los hidrogeles

con Acetónido de Triamcinolona son los que tienen el valormas bajo

para la relación peso de colon/peso corporal, lo que indica que la agresión de la inflamación sobre los tejidos ha sido la menor de todos

los tratamientos

ensayados. La

actividad mieloperoxidasaobtenida para todos los tratamientos ha sido reducida y

en todos los casos se han obtenido valores muy próximos al obtenido en tejido sano.Los resultado obtenidos con los hidrogeles, en los parámetros

evaluados, son

similares a

los encontrados por C. Mura et al. (3)en la evaluación de la actividad de micropartículas conteniendo 5-ASAe inferiores a los que obtiene en los animales sin tratar. Aunque es necesario analizar los resultados con cierta cautela, dada las diferencias en el tiempo de ayuno empleado durante la etapa de inducción del edema en ambos estudios, la comparación puede se

orientativa. Llama

la atención

los valores

obtenidos para

los factores

con los

hidrogeles placebo, en todos los casos bastante similara los hidrogeles con TA. Una de las causas puede ser la propia degradación de los polisacáridos naturales a nivel colónico dando lugar a derivados del ácido araquidónico que ha demostrado poseer propiedades protectoras

de la

mucosa del

colon. Estos

polisacáridos se encuentran en el grupo denominado fibra saludable.Sin embargo, para a poder confirmar y compararla actividad antiinflamatoria de estas formulaciones sería necesario ampliar el número de la población de animales empleado en el estudio.

Referencias:1. Armada, P.C., García-Mayor, R.V., Larrañaga, A., Seguín, P. “Prevalence and incidence of Crohn's disease in Galicia, Spain”. Medicina Clinica, 130 (18), pp. 715 (2008).2. Gago Guillan, M. et al. “Evaluación de hidrogeles a base de polisacáridos naturales como sistemas de liberación de fármacos”. X Congreso de la SEFIG 2011, Madrid3. C Mura et al. “N-Succinyl-chitosan systems for 5-aminosalicylic acid colon delivery: In vivo study with TNBS-induced colitis model in rats”.

International Journal of Pharmaceutics 416 (2011) 145-154.

Agradecimientos:

Programa Isabel Barreto de la Xunta de Galicia y Ayudas de movilidad del MEC para programas de Doctorado con Mención hacia la excelencia. Al Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica de la Universidad de Valencia.

100

MIC

RO

PAR

TÍC

UL

AS D

E N

EV

IRA

PINA

Y A

LG

INA

TO

CÁ

LC

ICO

:E

LA

BO

RA

CIÓ

N Y

EST

UD

IOS

IN V

ITRO

. P.G

andía, I. Usach, V

. Melis, J.E.Peris.

Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de V

alencia, España.

Introducción:La infección causada por el VIH

no

tiene cura,

pero algunos

medicam

entos retrasan

o frenan

la progresión

de la

enfermedad,

siendo el

cumplim

iento del

paciente decisivo para mantener la carga viral

plasmática

indetectable. El

tratamiento

de elección en el m

omento actual consiste en una

combinación de, al m

enos, tres fármacos, por lo

queun factor im

portante en la adherencia al tratam

iento es

la com

odidad en

la adm

inistración.La

nevirapina (N

VP)

es un

fármaco

antirretroviral empleado

en el tratamiento de la

infección por VIH

en combinación con otros

antirretrovirales. La

pauta habitual

de adm

inistración de NV

P en adultos es de un com

primido

2 veces

al día,

por lo

que la

obtención de

un preparado

de liberación

sostenida podría reducir la pauta a 1tom

a diaria y facilitar el cum

plimiento de los pacientes.

El objetivo de este trabajo ha sido la obtención, m

ediante gelificación iónica, de micropartículas

poliméricas

conteniendo N

VP,

capaces de

suministrar

una liberación

sostenida del

antirretroviral tras suadm

inistración oralcon el fin de dism

inuir la frecuencia de dosificación y favorecerla adherencia al tratam

iento.

Material y m

étodosElaboración

de las

micropartículas:

Se elaboraron diferentes lotes de m

icropartículas conteniendo N

VP m

ediante gelificación iónica de

alginato sódico concalcio, según el siguiente

esquema:

Figura 1. Esquema de elaboración de las

micropartículas.

Análisis m

orfológico y

determinación

del tam

año de

partícula:Se

observaron las

micropartículas m

ediante microscopía

óptica y electrónica, y

se determinó su tam

año mediante

unm

icrómetro.

Contenido

en nevirapina

y porcentaje

encapsulado:Se

extrajo la

NV

P de

las m

icropartículas con HC

l 0,1 N y se determ

inó su absorbancia a 315 nm

.

Perfil de liberación in vitro:Los ensayos de

liberación in vitro se efectuaron en un aparato tipo II (paletas) según U

SP, a 37 °C ± 0,5 °C

,con una

velocidad de rotación de 50 rpmy 200

mL de m

edio de disolución. Se ensayaron 35 m

g de micropartículas en 6 m

edios: pH 1,2;

tampón

de fosfatos 50m

MpH

6,8; tampón de

fosfatos 10m

MpH

6,8; tampón

TRIS

50 mM

con 0,9% de

NaC

l pH6,8;

medio de H

ank´s (H

BB

S) pH 7,4

y agua destilada.La cantidad de

NV

Pdisuelta a los tiem

pos de m

uestreo se determinó m

ediante medición de la

absorbancia a 315 nm (m

edio con pH 1,2) y 282

nm (m

edioscon pH

6,8 y 7,4).A partir de las

curvas de

disolución se

determinaron

los siguientes

parámetros:

tiempo

de disolución

50%(TD

50%),

tiempo

de disolución

70%(TD

70%)y tiem

po medio de disolución

(MD

T).M

étodos estadísticos:

Se em

pleó el

test A

NO

VA

de un factorseguido de la prueba de

Tukey. Se

consideró una

diferencia estadísticam

ente significativa cuándo el nivel de significación fue inferior a 0,05.

Resultados y discusión

Micropartículas

de alginato

cálcico y

Nevirapina:

Las m

icropartículas presentaron

una form

a ovalada,

de superficie

rugosa y

coloración blanco-amarillenta

(Figura 2).

Figuras 2a y 2b.Imágenesde las m

icropartículas obtenidas m

ediante microscopia óptica

(izqda.) y electrónica (dcha.).

El tamaño m

edio delas m

icropartículas fue698

±27

m (Figura 3).

Figura 3.Histogram

a del tamaño de 100

micropartículas.

101

En la tabla 1 se recogen los resultados de encapsulación

obtenidos para

6 lotes

representativos. Las micropartículas obtenidas

presentaron una

riqueza del

7,99%

y perm

itieron la encapsulación de una elevada proporción de la N

VP inicial, con un valor

superior al 85%. A

síde los 10 mg iniciales de

NV

P, solo 1,45 mg quedaron

sin encapsular, encontrándose una parte (0,89 m

g) en el medio

acuoso utilizado para la gelificación y el resto adherido al m

aterial empleado en la elaboración.

Tabla 1.R

esultados de los ensayos de encapsulación de N

VP en

micropartículas de alginato cálcico.

M

icropartículas

Lote M

asa Total (m

g) Riqueza (%

) N

VP encapsulada

(mg)

NVP respecto inicial (%

)

1 94,6

8,47 8,01

80,1 2

107,07,69

8,23 82,3

3116,2

7,718,96

89,64

118,17,94

9,38 93,8

5 109,1

7,58 8,27

82,7 6

98,9 8,57

8,48 84,8

Media 107,3 ±

9,3 7,99 ± 0,43

8,55 ± 0,52 85,53 ± 5,15

Ensayos de liberación in vitro:la N

VP

se disuelve rápidam

ente en los distintos medios de

disoluciónutilizados, encontrándose el 100%

disuelto antes de los 5 m

inutos. Sin embargo,

las micropartículas de N

VP presentan diferentes

velocidades de disolución según el medio de

disolución ensayado (Figura 4).

Figura 4.Curvas de disolución correspondientes a

las micropartículas de N

VP

para cada medio de

disolución ensayado.

En la tabla 2 se recogen los valores de TD50%

, TD

70% y M

DT. A

pH 1,2, la disolución fue

muy rápida, con un valor TD

70% = 0,7 h, y

también fue rápida la liberación al em

pleartam

pón fosfato 50 mM

a pH 6,8 (TD

70% = 1,9

h). Sin embargo, la liberación en agua destilada

fue muy lenta (TD

70% > 30 h). La liberación

rápida a

pH

1,2 puede

atribuirse a

la protonación

de los

grupos carboxílicos

del alginato, con lo que se im

pide la interacción iónica con los iones calcio y se favorece la desestructuración

de las

micropartículas.

Sin

embargo, a pH

6,8 el alginato se halla ionizado, por lo que debería m

antenerse la estructura de las

micropartículas

durante un

tiempo

prolongado por acción de los iones calcio. La relativam

ente rápida disolución de NV

P a partir de las m

icropartículas al emplear

tampón de

fosfatos 50

mM

puede

atribuirse al

efecto secuestrante del ion

fosfato sobre los iones calcio, que se traduce en una desestructuración de las m

icropartículas y una rápida disolución de N

VP. D

e hecho, el empleo de tam

pón de fosfatos con una m

enor concentración (10 mM

) enlentece

significativamente

la liberación

de N

VP (TD

70% = 5,4 h), obteniéndose perfiles de

liberación sem

ejantes cuando

se em

plean m

edios de disoluciónlibres de fosfato, com

o el tam

pón TRIS o H

BSS.

Tabla 2.Tiem

pos de disolución 50%

, 70%

y tiempo

medio de disolución (m

edia ± d.e., n = 4). En la últim

a columna se indica el resultado de la

comparación estadística.

Parám

etros M

edios de Disolución

TD50% (h)

TD70% (h)

MDT (h)

pH 1,2 0,4 ± 0,1

a 0,7 ± 0,2

a 0,56 ± 0,12

a pH 6,8 50m

M

Fosfatos 1,4 ± 0,2

b 1,9 ± 0,4

b 1,46 ± 0,30

b

pH 6,8 10mM

Fosfatos

3,9 ± 0,3c

5,4 ± 0,3c

4,54 ± 0,24c

pH 6,8 50mM

TRIS + N

aCl 2,6 ± 0,1

d 4,6 ± 0,3

d 3,67 ± 0,13

d

HBSS 3,1 ± 0,2

e 5,6 ± 0,3

c 4,30 ± 0,16

c AGU

A 20,7 ± 1,5

f > 30

--- Sig. estadística

p < 0,001 p < 0,001

p < 0,001

---: No se pudo determ

inar. a,b,c,d,e,f: Los valores con distinto superíndice son estadísticam

ente diferentes.

Conclusiones

Se han elaborado micropartículas de alginato

y nevirapina,con un tamaño m

edio de 698 m

y una riqueza media en nevirapina del

7,99 %, em

pleandouna m

etodología simple

y reproducible. Las

micropartículas

liberan la

nevirapina m

ás rápidamente a un pH

fuertemente ácido

(pH 1,2) que a valores de pH

próximos a 7.

No obstante, la com

posición del tampón

empleado en los ensayos de disolución in

vitrocondiciona

en gran

medida

la liberación del fárm

aco, favoreciéndose la liberación en presencia de concentraciones relativam

ente elevadas de fosfatos.

Bibliografía

Panel on antiretroviral guidelines for adult and adolescent.

Guidelines

for the

use of

antiretroviral agents in HIV

-infected adults and adolescents. D

epartment of H

ealth and Hum

an Services. M

arch27, 2012.

102

Microcápsulas E

laboradas Con A

lginato Modificado C

on RG

D: D

esarrollo D

e Materiales B

iomim

éticos Para La M

ejora Del C

omportam

iento Celular.

A.G

arate1,2,E. Santos 1,2 , G

Orive

1,2, R.M

. Hernández

1,2 , J.L. Pedraz1,2

1Grupo N

anoBioC

el, Laboratorio de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Facultad de Farmacia,

Universidad del País V

asco (UPV

/EHU

), Vitoria, 01006, España.

2CIB

ER-B

BN

, Centro de

Investigación B

iomédica en R

ed.Bioingeniería, B

iomateriales y N

anomedicina, V

itoria, 01006, España.

Introducción:D

urante muchos años, se han

utilizado polím

eros y

biomateriales

para la

encapsulación celular,

siendo el

objetivo principal generar una m

atriz con capacidad para transportar las células de una form

a segura y eficaz

(1). Sin embargo, con el uso de estos

biomateriales inertes la viabilidad de las células

encapsuladas podría estar comprom

etida debido a la falta de interacción entre

el polímero y la

célula.El alginato es un polímero m

uy utilizado en esta tecnología y en estudios anteriores se ha com

probado que

la inclusión

del tripéptido

arginina-glicina-aspartato (RG

D), derivado de la

fibronectina, en las cadenas de alginato,puede increm

entar la

viabilidad, proliferación

y diferenciación por m

edio de la adhesión celular, m

ejorando así la funcionalidad del sistema.

Apesar de que se han realizado diferentes estudios para evaluar la eficacia del R

GD

en la mejora de

la funcionalidad de las células encapsuladas(2),

se han obtenido resultados diferentes en función del

tipo de

célula que

se encapsula

y la

proporción de

RG

D

que se

incorpora al

alginato.El

objetivo de

este estudio

es determ

inar el efecto de la incorporación de distintos porcentajes de residuos R

GD

en la m

atriz de

alginato utilizada

para la

encapsulación de

dos líneas

celulares, m

ioblastos C

2C12

secretores de

EPO

y fibroblastos B

HK

secretores de VEG

F. De esta

manera se pretende am

pliar el conocimiento del

comportam

iento celular

en m

icrocápsulas elaboradas con alginato m

odificado y ver los beneficios que se pueden obtener m

ediante la elaboración de este tipo de m

icrocápsulas.

Materiales y m

étodos:El alginato de baja

viscosidad y alto contenido en ácido gulurónico (U

PLVG

) fue

modificado

químicam

ente m

ediante la química de carbodiim

ida(3).

El núm

ero total deresiduos R

GD

por cada cadena de alginato, definido com

o grado de sustitución (D

S), fue modificado variando la concentración

del péptido RG

D en la reacción.Se prepararon

tres tipos de alginatom

odificado con diferentes grados de sustitución:D

S1 (0.112 mM

),D

S5 (0.56

mM

) y

DS10

(1.12 m

M).

Los m

ioblastos C

2C12

y los

fibroblastos B

HK

m

odificados genéticamente para secretar EPO

y

VEG

F respectivamente fueron encapsulados por

separado en

microcápsulas

elaboradas con

alginatosin m

odificar (RG

D D

S0) y alginato m

odificado con RG

D D

S1, DS5 y D

S10. Para la elaboración de las m

icrocápsulas se utilizóun

generador electrostático

y se

siguióel

procedimiento

descrito por

Lim

y Sun

con algunas m

odificaciones.

Figura 1.Imágenes de M

ioblastos (A) y Fibroblastos

(B) en m

icrocápsulas elaboradas con distintos tiposde alginato m

odificado con RGD

.Las im

ágenes fueron obtenidas con el m

icroscopio ópticolos días 0

y 30 .

La viabilidad celular se determinó de form

a cualitativa

mediante

la tinción

LIVE/D

EAD

(Figura1). El núm

eroexacto

de células vivas por cápsula fue analizado m

ediante citometría

de flujo,

utilizando “Trucount

tubes” para

determinar la cantidad exacta de células vivas y

empleando

el kitLIV

E/DEA

D para diferenciar

lascélulas vivas y muertas.La determ

inación de la cantidad de EPO

o VEG

F secretada se realizó utilizando los kits de ELISA

correspondientes.Para determ

inar la proliferación celular se llevó a cabo el estudio de la B

rdU (B

romoxiuridina),

análogo de

la Tim

idina.Para

analizar la

interacción célula-m

atriz se

examinó

el citoesqueleto

de las

células encapsuladas

mediante la tinción con F-actina.

103

Resultados y D

iscusión:En el caso de los

mioblastos

(Figura2A

)se observa un descenso

de la viabilidadcon el paso del tiem

po en todos los

tiposde

microcápsulas,

siendo aquellas

elaboradas con alginato modificado con R

GD

D

S1 las que presentan mayor núm

erode células

vivas el día 30 (p<0.001). En el caso de los fibroblastos (Figura 2B

), el grupo DS5 es el que

presenta una

mayor

viabilidad a

día 30

comparándolo

con los

gruposrestantes

(p<0.001).Los

estudios de

secreción del

producto terapéutico pusieron dem

anifiesto que en el caso de los m

ioblastos

Figura 2.Núm

ero de células vivas por cápsula en el caso de los m

ioblastos(A

) y en el caso de los fibroblastos (B

).

Figura 3.(A) Producción de EPO

(B) Producción de

VEG

F.

(Figura 3A

), las

microcápsulas

con m

ayor secreción

deEPO

son

las elaboradas

con alginato m

odificado con RG

D D

S1(p<0.05).En

el caso de los fibroblastos(Figura 3B

), las m

icrocápsulascon secreción m

ás elevada de V

EGF

son las

elaboradas con

alginato m

odificado con RG

D D

S5. Los resultados del ensayo de proliferación (datos no m

ostrados) corroboran

los obtenidos

en los

ensayos anteriores.

Figura 4.Tinción F-actina de las m

icrocápsulas elaboradas

con diferentes

tipos de

alginatos inm

ovilizando mioblastos

(A) y fibroblastos (B

). Las fotos fueron realizadas con el m

icroscopio confocal el día 30.

La tinción

de F-actina

permite

detectarla

presencia de elongaciones de los filamentos

celulares de los mioblastos, siendo éstas m

ás num

erosas al incrementar los niveles de R

GD

(Figura 4A

). En los fibroblastos (Figura 4B),los

resultados no fueron tan claros, probablemente

debido a los agregados celulares.

Conclusiones:

La densidad óptima

del péptido de adhesión ha resultado ser diferente en los dos tipos celulares, obteniendo la m

ayor viabilidad y producción del factor terapéutico

con el grupo R

GD

DS1 en el caso de los m

ioblastosy el

grupo RG

D D

S5 en el caso de los fibroblastos. Estos resultados ponen de m

anifiesto que la densidad óptim

a del ligando de adhesión RG

D

varía en función del tipo de célula, por lo que se requiere una evaluación individualizada con el fin de determ

inar la densidad óptima de R

GD

a incorporar en el alginato.

Referencias:

(1) de Vos

et al., Biomaterials

18:273-278, 1997. (2) O

rive Get al., J.C

ontrol.Release135: 203-

210, 2009. (3)R

owley et al.,Biom

aterials20:45-53, 1999.

Agradecim

ientos:Este proyecto ha sido parcialm

ente financiado por la U

niversidad del País Vasco (U

PV/EH

U)

(UFI 11/32). A

. Garate agradece al “G

obierno V

asco (D

epartamento

de Educación,

Universidades e Investigación)” por su beca

predoctoral.

104

Controlled delivery of N

euregulin-1 and Fibroblast growth factor-1 from

polymeric m

icroparticles in sm

all and large animal m

odels of myocardial infarction

E. Garbayo

1,F. Rocha

1,B. Pelacho

2, P. Diaz-H

erraez1,Sim

ón-Yarza T

1,J.J.Gavira

2,G. A

bizanda2,F.

Prósper 2, M.J. B

lanco-Prieto1

1Pharmacy and Pharm

aceutical TechnologyD

epartment, U

niversityofN

avarra, Spain2H

ematology, C

ardiology and Cell Therapy, C

linica Universidad de N

avarra and Foundation for Applied

Medical R

esearch, University of N

avarra, Spain.

Introduction:M

yocardial infarction (MI) is a

major health concern w

orldwide, and therefore,

extensive research has been performed to find

new

treatments.

Neuregulin-1

(NR

G-1)

and acidic-fibroblast

growth factor (FG

F-1) have been identified as factors involved in cardiac repair after M

I(1,2). H

owever, their in vivo

therapeutic value is limited due to their short

half-life and

high instability

after system

ic adm

inistration. An alternative strategy based on

the use

of biocom

patible and

biodegradable m

icroparticles (M

P), able

to release

the cytokines in a sustained and controlled m

anner could represent a valuable therapeutic approach.O

ur group

had explored

newtherapeutic

strategies for MI treatm

ent based on the use of M

P that will release different com

binations of cytokines

and factors involved in cardiac stem

cell activation(3,4). O

ne of these strategies is the

use of

NR

G-1-M

P and

FGF-1-M

P to

promote cardiac repair. The

efficacy of NR

G-1-

MP and FG

F-1-MP in a rat M

I model has been

recently assessed

demonstrating

that M

P prom

oted cardiac repair and improved cardiac

performance (4).

Objetive

The objectives of this work w

ere (1) To

characterize the

mechanism

sby

which

NR

G-1-M

Pand FG

F-1-MP im

proved cardiac perform

ance in

a rat

myocardial

infarction m

odel (2) To test the beneficial effect of NR

G-

1-MP and FG

F-1-MP

ina preclinical large

animal m

odel of ischemia-reperfusion.

Material and M

ethods:A

ll experiments w

ere perform

ed in accordance with the guidelines

established by the Research Ethical C

omm

ittee of

the U

niversity of

Navarra.

Preparation, characterization

and efficacy

assessment

of N

RG

-1-MP

and FG

F-1-MP

were

done as

previously described (4). To analyze the effect of grow

th factor loaded MP on resident cells as

well

as on

cardiac progenitor

cells im

munofluorescence

studies w

ere done.

Cardiom

iocytes in replication 1 week and 3

months

after treatm

ent w

ere identified

with

antibodies against the proliferation marker ki67

and cardiac troponine (cTnT). Six serial sections from

each animal w

ere analyzed for thenum

ber of cells ki67+ cTnT+ cells present in the infart

and peri-infart

zone.To

identify cardiac

progenitor cells 1 w

eek and 3 m

onth after treatm

ent, heart

sections w

ere stained

with

antibodies against the stem cell antigen c-kit and

CD

45 a blood-cell lineage marker. Six serial

sections from each anim

al were analyzed for the

number

of cells

C-kit+

CD

45- and

C-kit+

CD

45+ present in the infart and peri-infart zone.

To confirm the beneficial effect of grow

th factor loaded M

P in a large animal m

odel of MI, a

scale up of the MP preparation process w

as done.

Various

MP

formulation

parameters

(polymer

quantity, drug

loading…)

were

adjustedto preserve M

P size andto m

aintain or im

prove encapsulation efficiencies. Particle size w

as m

easured by

laser difractom

etry.Encapsulation efficiencies w

ere quantified by W

estern blot. Released cytokine bioactivity

was

evaluated in vitroby determ

ining the induction of H

9C2 cellproliferation.Efficacy of N

RG

-1-M

P and

FGF-1-M

P w

ere investigated

in a

preclinical model of chronic

MI. A

total of 24 m

inipigs were enrolled in the study. M

yocardial infarction w

as created by temporary balloon

occlusion of the LAD

coronary artery followed

by reperfusion.

One

week

after infarction,

animals

were random

ized divided into3 groups:

NR

G-1-M

P,FG

F-1-MP and N

on loaded-MP.

The NO

GA

®X

P Cardiac N

avigation System

was used to im

plant the MP in the infarcted

heart. Three months later pigs w

ere sacrificed to perform

histological analysis. Cardiac function

wasassessed by echocardiography and M

RI.

Results: To characterize the m

echanisms

by w

hich the

cytokine loaded

MP

exerted its

action, tissue cardiomyocyte proliferation w

as exam

ined by double imm

unostaining for cTnT and

Ki-67+.

Asignificant

increase in

the num

ber of adult cardiomiocytes K

i-67+

was

detected in the hearts treated with N

RG

-1, 3 m

onths post-treatment (Fig. 1).The num

ber of adult cardiom

iocytes in replication 1 week after

treatment w

ith NR

G-1 M

P is currently being evaluated.

105

Fig 1:

NR

G-1-M

P treatm

ent induces

cardiomyocytes proliferation.R

epresentative image

of a proliferating Ki-67+ adult cardiom

yocyte in the N

RG

1-MP group (cTnT: green; K

i-67: pink; Nuclei:

blue) and quantification of total double positive cells in the infarcted area of the four-treated groups, 3 m

onths post-injection.A significant highernum

ber of proliferative

cardiomyocytes

was

detected in

the N

RG

-1 group.

Furthermore, c-K

it +CD

45-progenitor cells w

ere also

detected in

the m

yocardium,

although tissue quantification did not show

significant differences

among

groups, 3

months

post-injection. H

owever, a significant increase w

as detected 1 w

eek post-implantation in the N

RG

-1-M

P group in comparison w

ith the NL-M

P control group (Fig. 2). A

ntibody staining of m

yocardium revealed that these progenitor cells

could be identified as isolated or clustered cells that

were

probably recruited

towards

the ischem

ic myocardium

.

Fig 2: NR

G-1-M

P treatment induces stem

cell hom

ing.c-Kit+C

D45-progenitor cells w

ere detected in the heart tissue (cK

it: red; CD45: green; N

uclei: blue) along the infarcted area, 1 w

eek after MP-

treatment. A

significant greater number of progenitor

cells was detected in the N

RG

1-MP group than in the

NL-M

P control

group. D

ata is

represented as

mean±SEM

, *P<0.05

and **P<0.01

vs. N

L-MP

control group.

The proposedgrow

th factor loaded MP strategy

tested in asm

all animal m

odelof M

Iw

as next tried in a large M

I animal m

odel. Regarding the

scale up of the MP preparation process,M

Pw

ereprepared

by TRO

MS w

ith a compatible size for

heart injection

of 5

m.

Concerning

to the

entrapment

efficiency, grow

th factors

were

efficiently encapsulated,

reaching values

of 77.6±12.3%

for FGF-1 and 92 ±8%

for NR

G.

Variations on the M

P parameters during the

scaling up process show

ed no effect on the particle

size.The

bioactivity of

the released

cytokines was evaluated in vitro

by determining

the induction of H9C

2proliferation. A

1.3 and 2.1-fold

increase in cell density was observed

when

stimulated

with

FGF-1

and N

RG

-1, respectively. Proliferation rates of cells treated w

ith the free-cytokines were sim

ilar to the ones released by m

icroparticles, indicating that both cytokines retained its biological activity after m

icroencapsulation.

NR

G-1-M

P, FG

F-1-MP

and non-loaded

MP

were

injected into

the infarcted

myocardium

using NO

GA

®X

P Cardiac N

avigation System1

week after the infarct.The long-term

functional efficacy of grow

th factor-loaded MP

treatment is

currently being

evaluated.N

ext, histological

studies will be perform

ed to fully characterize the effectiveness of the treatm

ent with

NR

G-1-M

P and FG

F-1-MP

Conclusions:

-C

ontrolled delivery of NR

G-1 and FG

F-1 from

MP prom

oted cardiac repair through activation of endogenous regeneration in a rat m

yocardial infarction m

odel.

-G

rowth

factor loaded

MP

have been

successfully scaled-up

to be

tested in

preclinical large animal m

odel of ischemia-

reperfusion.

References:

(1) Liu Xet al., N

euregulin-1/erbB-activation

improves

cardiac function

and survival

in m

odels of

ischemic,

dilated, and

viral cardiom

yopathy. J

Am

C

oll C

ardiol. 2006,

48:1439-1447.(2) Palm

en Met al., Fibroblast grow

th factor-1im

proves cardiac

functional recovery

and enhances

cell survival

after ischem

ia and

reperfusion. J Am

Coll C

ardiol. 2004, 44:1113-1123.(3) Form

iga FRet al., Sustained release of

VEG

F through PLGA

microparticles im

proves vasculogenesis

and tissue

remodeling

in an

acute myocardial ischem

ia-reperfusion model. J

Control R

elease. 2010,147:30-37.(4) Form

iga FRet al., C

ontrolled delivery of fibroblast

growth

factor-1 and

neuregulin-1from

biodegradable

microparticles

promotes

cardiac repair in a rat myocardial infarction

model

through activation

of endogeneous

regeneration. Submitted to JA

CC

.

Acknow

ledgments: Juan de la C

ierva Program,

CA

N, FU

N.

106

EM

PLE

O D

E N

AN

OSU

SPEN

SION

ES D

E A

CE

TÓ

NID

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RIA

MC

INO

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RG

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LIB

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AC

IÓN

A PA

RT

IR D

E L

EN

TE

S DE

CO

NT

AC

TO

ME

DIC

AD

AS

García M

illán E.,Quintans C

arballo M., C

abanasMontenegro S., O

tero Espinar F.J.

Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica. Facultad de Farmacia. U

niversidad de Santiago de Com

postela.

Introducción

Las lentes de contacto han demostrado un interesante potencial

como sistemas

de liberación

controlada de

medicamentos, sobre todo para tratar afecciones oftálmicas de la zona anterior. Desde el punto de vista de los sistemas de liberación, las lentes blandas de contacto son hidrogeles y

se consideran

como insertos

oftálmicos insolubles

especiales.Habitualmente para incluir el fármaco en las lentes se incuban en una disolución acuosa de fármaco durante un período de tiempo suficiente para que se incorpore

la dosis

necesaria. Sin

embargo, dada

la naturaleza hidrofílica de los hidrogeles y de las soluciones de carga, los fármacos poco hidrosolublessólo pueden accederen dosis muy reducidas. El acetónido de triamcinolona (TA)es

un glucocorticoide

sintético con

elevada potencia

antiinflamatoria y efecto prolongadoque se emplea habitua-

menteen el tratamiento de patologías

oculares (1). Poseereducida hidrosolubilidad por lo que plantea problemas para ser incluido en lentes en dosis adecuadas. Para incrementar la

dosis y mejorarel control deliberación

de TAproponemos

el uso como medio de carga de nanosuspensiones de TA estabilizadas. Éstas permiten incrementar la solubilidad acuosa del fármaco y dado el reducido tamaño

desus

partícula puedenfacilitar su difusión a través de los poros del

hidrogelmanteniendo sus propiedades ópticas.

Materiales y métodos

Materiales

Lentes blandas de contacto desechables (Hilafilcon B, Bauch & Lomb). 2-hidroxietilmetacrilato (HEM

A, Merck), ácido metacrílico (AM, Merck), etilenglicoldimetacrilato (EGDM

A, Sigma-Aldrich). Irgacure® 2959 (CIBA), Poloxamer 407 (Pluronic F127 ®; 9.840 – 14.600 Da, Sigma-Aldrich),alcohol polivinílico (PVA; 30.000 – 70.000 Da. Sigma-Aldrich),TA (Fagron), acetona, (Panreac).

Elaboración de las lentes blandas de contacto de TA

Las lentes

blandas se

elaboraron mediante

foto-polimerización. Para ello se mezclaron los monómeros HEMA y AM con el agente reticulante EGDMA y el iniciador Irgacure 2959

en las proporciones indicadas La disolución resultante se inyectó en un molde. Los hidrogeles se forman por fotopolimerización al irradiar la disolución con luz ultravioleta durante 30 minutos. La lámina formada se introduce en agua hirviendo durante 15 min, se troquela en pequeños cilindros y se mantienen en agua limpia hasta la completa eliminación de los monómeros residuales.

Elaboración de nanosuspensionesde TA

Nos basamos en un método de precipitación controlada descrito en trabajo previo

(2)en el que se emplea se unamezcla Pluronic F127

®y PVA al 10% (p/v)como fase acuosa

y como fase organica una disolución del fármaco en acetonaal 0.1%

(p/v). Para obtener las nanosuspensiones con

diferentes contenidos en TA, se procedió a diluir las convenientemente. El contenido de principio activo

en las nanosuspensiones

se determino

mediante espectrofotometría

a 242

nm en

las muestras

convenientemente diluidas y filtradas (membranas de 0,45 m Sartorius®. El tamaño medio de partículas se determinó

utilizando el equipo Zetasizer Malvern (Nano ZS 6.0, Malvern Instruments).

Caracterización de SCLs

Transparencia óptica

Se determinó en las lentes después de ser cargadas con el principio activo. Para ello

las lentes de contacto se fijaron en la cara interna de una cubeta de cuarzo conteniendo agua milliQ

y se midió la transmitancia a una longitud de onda de 600 nm

(Espectrofotómetro UV-Visible de red de diodos Agilent 8453).

Determinación de la carga de TA en SCLs

Laslentes de contacto

fabricadas y lascomerciales se

sumergieron en las nanosuspensiones de TA durante 4 días. Pasado este tiempo, la cantidad de TA cargado por cada lente de contacto, se calculó por diferencia entre la cantidad inicial y la cantidad final de la solución de carga, determinada por espectrofotometría

UV a 242 nm. Los resultados se expresaron como la cantidad de

TA (mg) en cada SCLs entre el peso (g) de cada SCLs en su estado inicial.Cada ensayo se ha realizado por triplicado.

Ensayos de liberación de TA de SCLs cargadas

Las lentes de contacto cargadas con TA se introdujeron en un vial en el que previamente se añadieron 5 ml de fluido lacrimal simulado (6.7 g/l NaCl, 2.18 g/l NaHCO3, 1.38 g/l KCl, 0.084 g/l CaCl2•2H2O, pH 8). Los viales se colocaron en el incubador (VW

R Incubating Mini Shaker, pais) con una agitación orbital de 100 r.p.m. y una temperatura de 37°C .Se

tomaron muestras,

a intervalos

de tiempo

determinándose la

concentración de

TA mediante

espectrofotometría a 242 nm.Cada ensayo se realizó por triplicado.

Tabla 1. Composición de las lentes blandas fabricadas.

0%H20

20%H20

40%H20

HEMA6,218g

4,974g2,218g

EGDMA

0,095g0,076g

0,038gMA

0,103g0,082g

0,0412Agua

0g1,2mL

2,4mLIrgacure

0,0110,011g

0,011g

107

Resultados y discusión

050

100150

200250

0 5 10 15nanosuspensión

Disolucion

Nanosuspension

Disolución

Hilaficom

B

MA

200

g/ml

Ta mg/g lentilla

Figura 1. Cantidad de TA cargada por las lentes en función de la cantidad de fárm

aco contenido enel m

edio de carga

Enla figura 1 se muestra la capacidad de incorporación de

fármaco en las lentes de contacto en función de la cantidad presente en el líquido de carga. Los datos de carga de concentraciones menores de 20

g/ml corresponden a sistemas constituidos por disoluciones de TA, mientras que las superiores son las nanosuspensiones. Como se observa el

empleo de

nanosuspensionesmejora

de manera

significativa el fármaco incorporado en las lentes comerciales y

en las

fabricadas por

nosotros observándose

un incremento prácticamente lineal de la carga en función de la cantidad de fármaco en las soluciones/suspensiones.No se observan diferencias

en el TA cargado entre las lentes comerciales y las fabricadas por nosotros

Figura 1. Perfiles de liberación del TA a partir de las lentes com

erciales(superior)

y fabricadas

(inferior) con

las diferentes cargas.

Por otra parte todas las lentes cargadas con las disoluciones y

nanosuspensiones preservaron su transparencia óptica obteniéndose valores de trasmitancia a 600 nm para todas ellas superiores al 90%

.

En lafigura 2 se observan los perfiles de liberación

obtenidos con las diferentes lentes y cargas. La liberación a partir de las lentes comerciales se produce en su práctica totalidad en menos de 12 horas observándose diferencias significativas en función de la solución empleada para su carga, siendo mayor la liberación de las lentes cargadas a partir de nanosuspensiones de200

g/ml.

Las lentes MA 200 elaboradas son capaces de controlar la liberación de manera más efectiva y gradual observándose una liberación a las 12 muy inferior a las comerciales. En este caso a los 6 días las lentes continúan liberando principio activo.

En este

caso existe

también una

influencia significativa de la concentración empleada en el proceso de carga sobre la cantidad liberada, siendo nuevamente la cargada con nanosupensiones de

200 g/ml con la que se

consigue una mayor liberación, como consecuencia del incremento en la carga

Conclusiones

A partir de los resultados obtenidos podemos concluir que el empleo de nanosuspensiones estabilizadas de TA como medio de carga permite incrementar de manera considerable la dosis de fármaco incorporado tanto

por las lentes comerciales como por las elaboradas para el estudio. Además las lentes cagadas con las nanosuspensiones dan lugar a mayores niveles de fármaco liberado durante tiempos más prolongados.

Es posible utilizar ambas lentes, las comerciales o las elaboradas como soporte para la liberación ocular de TA, siendo las comerciales más adecuadas si se necesita una liberación más rápida y las elaboradas más prolongada.

Agradecimientos:

El trabajo fue financiado por Ministerio de Ciencia e Innovación (MAT2009-14609-C02-02).

Referencias[1]

Jermak CM, Dellacroce JT, Heffez J, Peyman GA. Triamcinolone acetonide in Ocular Therapeutics. Survey of Ophthalmology. 2007; 52 (5): 503-522.[2]García Millán, E., Blanco Méndez, J., Otero Espinar, F.J. Elaboración

de nanosuspensiones

de acetónido

de triamcinolona mediante técnicas de precipitación controlada. X Congreso SEFIG, Madrid 2011.

024

4872

96120

144168

192216

240264

288312

336360

0 50

100

150

20050100200

(Saturado) 19

tiempo (h)

g TA

024

4872

96120

1440 50

100

150

20050100200

saturado (19)

tiempo (h)

g TA

108

OPTIMIZACIÓN DE LA CARGA Y LIBERACIÓN DE CORTICOIDES A PARTIR DELENTES BLANDAS DE CONTACTO DE

pHEMA MEDIATE MODIFICACIONESEN SU

COMPOSICIÓN

García Millán E., Koprivnik S., Otero Espinar F.J.

Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica. Universidad de Santiago de Compostela

IntroducciónLos avances en el desarrollo de las lentes

blandas de contacto han permitido

la carga defármacos en dosis

terapéuticas y controlar y mantener su liberación en el tiempo con el objetivo de mejorar la eficacia del tratamiento ocular por medio de una mayor biodisponibilidad, menor absorción sistémica y un mejor cumplimiento del régimen de dosificación.

Las lentes de contacto blandas son hidrogeles, una red reticulada

de monómeros

solubles en

agua. La base de muchos tipos de lentes de contacto blandas es el polihidroxietilmetacrilato

(pHEMA) reticulado

con etilenglicoldimetacrilato (EGDMA). Los hidrogeles pHEMA se caracterizan por un contenido

relativamente alto de agua, estabilidad

térmica y

química, propiedades

mecánicas moldeables y

permeabilidad al oxígeno, muy importantespara un uso seguro diario [1, 2].

En los hidrogeles, el fármaco se

incorpora a la red polimérica por un mecanismo de absorción, pero la falta de interacciones específicas limita tanto la cantidad de fármaco cargada como la capacidad de controlar la liberación [3].

El fármaco seleccionado para su estudio ha sidoacetónido

de triamcinolona(TA),

uncorticosteroide utilizado por su

acción antiinflamatoria endiversas patologías oculares como

alergias, uveítis o inflamaciones postoperatorias.

El objetivo de este trabajo ha sidola síntesis y optimización

dehidrogeles

de pHEM

A con

el fin

de mejorar

la propiedades de carga yliberación ocular de TA por medio de la

incorporación de

diferentes proporciones

de dos

comonómeros, ácido metacrílico (AM) y N-vinil-2-pirrolidona (NVP).

Materiales y métodos

Materiales

2-hidroxietil metacrilato (pHEMA), ácido metacrílico (AM) y

N-vinil-2-pirrolidona (NVP) (Merck, Alemania); etilenglicol dimetacrilato (EGDMA), 2,2’-azo-bis(isobutironitrilo) (AIBN) (Sigma-Aldrich,

España) y

Acetónido de

Triamcinolona (Fagron, España).

Métodos

Síntesis de

hidrogeles m

ediante polim

erización term

oinducida

El agente reticulante EGDMA (80 Mm, 1%) y diferentes

cantidades de los monómeros funcionales AM y VN(0, 100 y

200 mM; 0 – 2.5%) fueron disueltos en HEM

A (6 ml; 96,5% -

99%) bajo agitación magnética constante durante 45 minutos

(Tabla 1). Se incorporó el agente iniciador AIBN (10 mM) durante 15 minutos más. Cada solución de monómero resultante fue inyectada en un molde constituido por dos placas de vidrio (10x10cm) cubiertas internamente por una lámina de propileno y separados por un marco de silicona de

1mm de ancho.Los moldes se colocaron en una estufa a 50ºC durante 12 horas seguido de 24 horas a 70ºC. Tras la polimerización,

cada hidrogel

fue sumergido

en agua

hirviendo durante 15 minutos con el objetivo de eliminar los monómeros no reaccionantes y facilitar el corte de los hidrogeles en discos de 10 mm de diámetro. Parala limpieza de estos discos se sumergieron en una solución de NaCl 10 mM durante una semana, posteriormente en HCl 10 mM durante un día y en agua un día más[3].

Tabla 1. Composición de diferentes hidrogeles sintetizados variando el tipo y proporción de monómero funcional

Estudios de carga de TA en los hidrogeles

Los estudios de carga de TA en los diferentes hidrogeles sintetizados se llevó a cabo por inmersión de los mismos en disoluciones de diferente concentración de fármaco (8 – 19

g/ml) en NaCl al 0,9%o PBS

(10 ml) durante cuatro días. El contenido en TA se determinó por espectrofotometría UV a

= 242 nm tras ser filtradas por filtros de membrana (0,45 m Sartorius ®, Alemania). Cada ensayo ha sido realizado

por triplicado [3].

Estudios de liberación de TA de los hidrogeles

Los hidrogeles cargados fueron sumergidos en un vial conteniendo 5 ml de fluido lacrimal simulado (FLS; 6.7 g/l NaCl, 2.18 g/l NaHCO

3 , 1.38 g/l KCl, 0.084 g/l CaCl2 ·2H2 O,

pH 8) bajo agitación orbital a 100 rpm y 37ºC. A intervalos de tiempo predeterminados, se tom

aron muestras de 1 ml que era reemplazado con la misma cantidad de FLS. La determinación de la concentración de TA se realizó mediante espectrofotometría a

= 242 nm. Cada ensayo ha sido realizado por triplicado [3].

Resultados y discusión A efectos de incorporación de fármacos, los hidrogeles se comportan normalmente como adsorbentes microporosos dando lugar a isotermas de clase C

(4), caracterizadaspor

untramo lineal inicial en el que el coeficiente de reparto

entre soluto y adsorbente se mantiene constante. Estas isotermas aparecen cuando el soluto penetra en el interior del adsorbentey desaparece de la superficie y, en este caso,la concentración crítica

,representa la saturación de los lugares internos y se caracteriza por la aparición de una meseta.

HidrogelMonóm

erofuncional

HEMA:EGDMA:Func.monom

ero(Volum

e ratio)0

----5910:90:0

MA100AM-100mM

5860:90:50MA200

AM-200mM5810:90:100

NVP100NVP-100mM

5845:90:75NVP200

NVP-200mM5780:90:150

109

0

810

1214

1618

200.0

0.2

0.4

0.6

0.8

R2=0,96

loading solution c (g/m

L)

QTA in lens (mg/g)

MA

100

810

1214

1618

200.0

0.2

0.4

0.6

0.8

R2=0,98

loading solution c (g/m

L)

QTA in lens (mg/g)

MA

200

810

1214

1618

200.0

0.2

0.4

0.6

0.8

R2=0,90

loading solution c (g/m

L)

QTA in lens (mg/g)

NV

P100

810

1214

1618

200.0

0.2

0.4

0.6

0.8

R2=0,87

loading solution c (g/m

L)

QTA in lens (mg/g)

NV

P200

810

1214

1618

200.0

0.2

0.4

0.6

0.8

loading solution c (g/m

L)

QTA in lens (mg/g)

R2=0,92

Fig.1. Isotermas de adsorción de TA a partir de disoluciones de NaCl 0.9%.

Soluciónde carga

HidrogelesCantidad cargada

(mg/g)

media± SD

Kpm

edia± SD

0,9% NaCl

00,449 ± 0,026

22,9 ± 0,8MA100

0,557 ± 0,03127,3 ± 2,0

MA2000,536 ± 0,042

26,0± 3,4NVP100

0,491 ± 0,04023,4 ± 2,5

NVP2000,506 ± 0,072

24,5 ± 3,0

PBS pH 7,4

00,465 ± 0,020

23,8 ± 2,5MA100

0,585 ± 0,04424,9 ± 3,1

MA2000,667 ± 0,038

27,2 ± 1,7NVP100

0,501 ± 0,06825,2 ± 4,0

NVP2000,583 ± 0,035

27,8 ± 3,5Tabla 2. Diferentes hidrogeles sintetizados con sus respectivos valores de cantidad de TA cargada y coeficientes de reparto.

Como podemos ver en la figura 1, las isotermas de adsorción obtenidas

se ajustan bien a una línea recta indicando que nos encontramos en el tramo inicial de una isoterma

tipo Cy que nos encontramos aún en la zona en la

que no existe saturación de los lugares de adsorción.Isotermas similares se obtuvieron empleando PBS comomedio de carga.Los menores valores de TA cargado se obtienen con los hidrogeles que no incluyen co-monómeros obteniéndose diferencias significativas con los elaborados con MA (

<0,05). Sin embargo, no existen diferencias de carga entre NVP yM

A por lo que podemos asumir que no se producen interacciones especiales entre TA y los co-monómeros y que la mayor carga con respecto a los que no los

incorporan pueden

deberse a

diferencias en

la hidratación de las lentes.

La tendencia del TA por la red polimérica se determinó a través del coeficiente de partición

que hemos calculado a partir de la pendiente de las isotermas y se muestran en la tabla

2. Los resultados mostrados en la tabla 2indican que

existe una elevada fracción de TA unida a la red polimérica,siendo ligeramente superior en las que incorporan M

A.Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos para otros corticoides como la dexametasona en hidrogeles de pHEM

A [5]. Por ello podemos concluir que el fármaco posee una gran afinidad por el polímero.

010

2030

4050

6070

800 20 40 60 80

100

0ma100

ma200

nvp100nvp200

tiempo (h)

% TA liberada

Fig 2. Perfiles de liberación de TA a partir de los hidrogeles cargados

Todos los hidrogeles han mostrado un perfil de liberación similar en las horas iniciales del ensayo

dondeempiezan a

liberar el fármaco de manerainmediata en cuanto se

sumergen en FLS, sin observarse efecto burst ni periodo de latencia. Sí se observan diferencias significativas

a partir de las 5 horas, donde

los hidrogeles de AM presentan mayores tasas

de liberación, siendo MA200 son los que mayorcantidad de TA liberan.Esto es debido a que a pH 8, más del 99%

de los grupos funcionales de AM se encuentran ionizados generando fuerzas de repulsión en el interior del hidrogel dando como resultado una mayor relajación e hinchamiento de la red polimérica, lo que facilita la liberación de TA.

ConclusionesLas lentes de pHEMA

se comportan como adsorbentes porosos en los procesos de carga, sin alcanzarse la saturación del proceso para las concentraciones estudiadas.Ello significa que si se consiguen concentraciones de carga superiores a la máxima empleada (saturación a 20ºC) puede favorecerse

la entrada

de dosis

mayores. Las

lentes incorporan cantidades significativas del corticoide TA en los procesos de carga, existiendo un reparto favorable hacia la red polimérica. La inclusión de los co-monómeros MA y NVP mejoran la carga de TA e incrementan ligeramente la afinidad de la red polimérica por el fármaco, sobre todo el MA. Estas lentes poseen un efectivo control de la

liberación que puede modularse en función del tipo y proporción de co-monómero empleado.

Bibliografía[1] J.-F. Rosa dos Santos, R. Couceiro, A. Concheiro, J.-J. Torres-Labandeira, C. Alvarez-Lorenzo, Poly(hydroxyethyl methacrylate-co-methacrylated-

-cyclodextrin) hydrogels:

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110

UT

ILIZA

CIÓ

N

DE

LSIST

EM

ASE

DE

M

PAR

A

OPT

IMIZA

RL

A

EL

AB

OR

AC

IÓN

D

E

FOR

MA

S FAR

MA

CÉ

UT

ICA

S OR

AL

ES PO

R C

OM

PRE

SIÓN

DIR

EC

TA

D

. PuñalPeces 1, E.García

Montoya

2,JM Suñé N

egre, P Pérez Lozano, R. Sarrate, N

Sánchez,JR Ticó,

M M

iñarro

1Desarrollo Industrial, Laboratorios R

OV

I, España/ Doctorando Program

a de Tecnología Farm

acéutica, Facultad de Farmacia, U

niversidad de Barcelona, España

2SDM

. Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de B

arcelona, España.

Introducción: El sistem

a SEDEM

es una herramienta que ha

demostrado su utilidad para desarrollar fórm

ulasde elaboración por com

presión, obteniéndose fórm

ulas que pueden ser elaboradas mediante

compresión por vía directa

y para caracterizar excipientes [1-6].

En este trabajo seha partido

de una fórmula de

comprim

idos elaboradospor granulación

vía húm

edaactualm

ente comercializada. El objetivo

es rediseñar el proceso de elaboraciónde la

fórmula,

manteniendo

la dosis

de principio

activo,de tal forma que pueda ser elaborado por

compresión

directa, con

laconsiguiente

reducción de

costes directos

(horas de

elaboración) e indirectos (consumo de energía o

limpieza de equipos de producción).

Materiales y M

étodos: Para este estudio se ha partido de un producto existente

en el

mercado

actualmente

cuyoprincipio activo es una m

olécula perteneciente a la fam

ilia de los “agonistas de serotonina”, cuya indicación principal es el tratam

iento del dolor de cabeza en los ataques de m

igraña.

Para la caracterización del API

y de los 19 excipientescandidatos a em

plear, se ha utilizado elsistem

a de experto SEDEM

.

El sistema SED

EM se basa en la evaluación

experimental y en la cuantificación de una serie

de parámetros

relacionados con las propiedades físicas

de las

sustancias pulverulentas.

Losparám

etros y

propiedades, se

encuentran detallados en diferentes publicaciones [1-6]. Tras la cuantificación, se elaboran una serie de prom

edios, a partir de los cuales se elabora un cálculo

final: el

IGC

oÍndice

de B

uena C

ompresibilidad, que cuantifica

la idoneidad de la m

ateria para ser comprim

ida(en escala de 1 a

10).

Tras la evaluación del principio activo estudiado se pretende seleccionar, desde un punto de vista teórico, el excipiente(s) que m

ejor corrige las carencias del principio activo a fin de diseñar el m

ejor comprim

ido posible mediante com

presión directa.

Resultados y D

iscusión:

Primeram

ente se ha caracterizado el API. Tras

el estudio

se com

prueba que

presenta propiedades

deficientes para

la com

presión directa. El valor de IG

C obtenido es 4.30, lo

cual indica claramente que no es una m

ateria apta

para su

compresión

directa de

forma

natural. En la tabla 1 se muestran los resultados

de dicha evaluación y en la figura 1 se muestra

la representación

gráfica de

los parám

etros SED

EM.

PAR

AM

ETRO

PRO

PIEDA

D

FÍSICA

VA

LOR

PRO

-M

EDIO

Dim

ensionalD

a5.80

7.25D

c8.70

Com

presibilidadIe

4.796.79

Ic6.67

Icd8.93

Deslizam

iento / Fluidez

IH

5.001.89

0.67t”

0.00

Lubrificación / Estabilidad

HR

0.905.43

H

9.96

Lubrificación / D

osificaciónPf

0.001.38

2.75Índice de Buena C

ompresión (IG

C)

4.30

Tabla

1:R

esultados de

los parám

etros y

promedios del A

PI.

Figura 1.

Representación

gráfica de

las propiedades físicas evaluadasdel A

PI.

111

Tras la evaluación del API, se observa que

presenta unas propiedades deficientes(m

enor a 5)

para los

parámetros

de “D

eslizamiento/Fluidez”

y “Lubrificación

/ D

osificación”.

Paracada

excipiente incluidoen el estudio, se

desarrolla una fórmula com

pleta (Alm

otriptán + Excipiente

+ Lubricantes)usando el sistem

a de experto.Todas las fórm

ulas con un IGC

mayor

a 5,

serían viables

(8) D

e las

que se

seleccionaron tres fórmulas y se hicieron lotes

piloto. Posteriormente se llevaron a cabo las

determinaciones

analíticas necesarias

para evaluar

si se

satisfacen las

mism

as especificaciones que el producto original. En la tabla

2 se

muestran

las fórm

ulas probadas

experimentalm

ente. En la figura 2 se muestra el

perfil de

disolución de

las fórm

ulas seleccionadas y elaboradas por com

presión vía directa.

MA

TERIA

FUN

CIÓ

NC

AN

TIDA

D

FÓRMULA A

API

API

37.4 %

Primogel

Lubrificante/D

eslizante5.0 %

Pruv1.0 %

Emcom

pressExcipiente de com

presión56.6%

FÓRMULA B

API

API

31.9 %

Primogel

Lubrificante/D

eslizante5.0 %

Pruv1.0 %

Lactosa Fast Flow

Excipiente de com

presión62.1 %

FÓRMULA C

API

API

30.7 %

Primogel

Lubrificante/D

eslizante5.0 %

Pruv1.0 %

Spherolac 100Excipiente de com

presión63.3 %

Tabla 2.Fórm

ulas propuestas por el diagrama

Sedem

que han

sido probadas

experimentalm

ente en este estudio.

% A

PI DISU

ELTO

0 20 40 60 80

100

120

05

1015

2025

30TIEM

PO (M

IN)

Fórmula A

-Emcom

press

Fórmula B

-Lactosa Fast Flow

Fórmula C

-Spherlac 100

Figura 2.

Perfil de

liberación de

lastres

fórmulas elaboradas

Conclusión

Com

o se ha evidenciadolas 3 fórm

ulas fueron viables,con los beneficios que ello supondría a la com

pañía

Referencias:

[1] J.M. Suñé N

egre, M. R

oig Carreras, R

. Fuster G

arcía, C. H

ernández Pérez, R. R

uhí, R

oura, E.

García

Montoya,

M.

Miñarro

Carm

ona, P. Pérez Lozano, J.R. Ticó G

rau,N

ueva metodología de preform

ulación galénica para la caracterización de

sustancias en relación a su viabilidad para la com

presión: diagrama

SeDeM

,C

ien. Tecnol. Pharm. 3 (2005) 125–

136.[2]

Pilar Pérez,

Josep M

. Suñé-N

egre, M

ontserrat Miñarro, M

anel Roig, R

oserFuster,

Encarna García-M

ontoya, Carm

en Hernández,

Ram

ón Ruhí, Josep R

.Ticó, A

new expert

systems (SeD

eM diagram

) for control batch pow

der formulation and preform

ulation drug products,

Eur. J.

Pharm.

Biopharm

. 64

(3) (2006) 351–359.[3] J.M

. Suñé Negre, P. Pérez Lozano, M

. M

iñarro Carm

ona, M. R

oig Carreras, R

.Fuster G

arcía, C. H

ernández Pérez, R. R

uhí, E. García

Montoya, J.R

. Ticó Grau,

Application of the

SeDeM

D

iagram

and new

m

athematical

equation in the design of direct compression

tablet formulation, Eur. J. Pharm

. Biopharm

. (2008) 1029–1039.[4] J.E. A

guilar-Díaz, E. G

arcía-Montoya, P.

Pérez-Lozano, J.M. Suñé-N

egre, M.

Miñarro,

J.R. Ticó, The use of the SeD

eM diagram

expert system

to determine the suitability of diluents-

disintegrants for direct compression and their

use inform

ulation of OD

T, Eur. J. Pharm.

Biopharm

. 73 (2009) 414–423.[5]

M.

Suñé N

egre, P.

Pérez Lozano,

M.

Miñarro C

armona, M

. Roig C

arreras, R.Fuster

García, C

. Hernández Pérez, R

. Ruhí, E. G

arcía M

ontoya, J.R

. Ticó

Grau,

Optim

ization of

parameters

of the

SeDeM

diagram

expert

system:

Hausner

index (IH

) and

relative hum

idity (%

RH

), European

Journal of

Pharmaceutics

and Biopharm

aceutics 2011; 79: 464-472.[6]

Aguilar-D

íaz J E, García-M

ontoya E, Suñé-N

egre J M, Pérez-Lozano P, M

iñarro M, Ticó

JR.

Predicting

orally disintegrating

tablets form

ulations of

ibuprophen tablets.

An

application of

the new

SeD

eM-O

DT

expert system

. Eur J Pharm B

iopharm, 2012; 80, 638-

648

112

SOL

UB

ILIZA

CIÓ

N D

E E

TO

XZO

LA

MID

A C

ON

POL

ÍME

RO

S DE

CIC

LO

DE

XT

RIN

A PA

RA

L

IBE

RA

CIÓ

N C

ON

TR

OL

AD

AE

N A

DM

INIST

RA

CIÓ

N O

CU

LA

RM

.J. García-Fernández

1,N. Tabary

2, B. M

artel 2,A. C

oncheiro1, C

.Alvarez-Lorenzo

1

1Departm

entoD

epartamento de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica, Facultad de Farm

acia, Universidad

de Santiago de Com

postela, 15782-Santiago de Com

postela, España2U

nité Matériaux Et Transform

ation (UM

ET), Ingénierie des Systèmes Polym

ères, Université de Lille 1,

F-59655 Villeneuve D

’Ascq, France

Introducción: El glaucom

aes una enferm

edad progresiva que, alcursar con una elevación de la presión intraocular, provoca com

presión y daño de las fibras del nervio óptico.

El tratamiento de

elección consiste en administrar

fármacos que

reducen la

presión intraocular.

La adm

inistraciónpor vía sistém

ica requieredosis

altas paraalcanzarconcentraciones eficaces en

las estructuras oculares,lo que puede

causarefectos secundarios graves. Este es el caso de los inhibidores

de la anhidrasa carbónica, un enzim

a ampliam

ente distribuidoen diversos

órganos y tejidos del cuerpo humano, por lo

que los efectos secundarios del tratamiento por

vía oral son numerosos

(1). Por otra parte, la aplicación

tópica ocular

cuenta con

importantes

limitaciones

por la

reducida biodisponibilidad oculary

la corta duración de efectos. A

demás, en el caso de los fárm

acos de elevada

permeabilidad

corneal, se

hace necesario

aplicar procedim

ientos de

hidrosolubilización adecuados. En estetrabajo

se evalúan las posibilidades que ofrecen los polím

eros de

ciclodextrina (C

D)

como

transportadores capaces de formar com

plejos de inclusión con el inhibidor de la anhidrasa carbónica etoxzolam

ida (EtOX

; solubilidad en agua 21.38 m

g/L; LogP= 2.01). Para preparar los polím

eros, se partió de -

-CD

, -C

D,

metil-

-CD

, e hidroxipropil--C

D y se utilizó

como

agente reticulante

ácido cítrico,

siguiendo un procedimiento de quím

ica verde previam

ente desarrollado (2). Com

o control, para

evaluar la

eficacia del

proceso de

complejación,

se preparó

un polím

ero de

maltrodextrina.

Una

vez sintetizados

los polím

eros, se

evaluó su

capacidad para

solubilizar EtOX

en medio salino y para ceder

de forma controlada el fárm

aco, utilizando com

o referencia las CD

s de partida.

Materiales y M

étodos: Polim

erización.Se prepararon disoluciones en agua (200 m

L) de cada una de las CD

s y de m

altrodextrina(Laisa R

oquette, France; 20 g)con ácido cítrico (Sigm

a Aldrich, Francia; 20

g)e hipofosfito sódico dihidrógeno (Sigm

a A

ldrich, Francia; 6 g).El agua se evaporó en un

rotavapor a 60ºC-80ºC

hasta obtener un

film en las paredes del balón. A

continuación se llevó a cabo la polim

erización, sumergiendo

el balón en un baño de aceitea 140ºC

y aplicando

vacío durante

30 m

inutos.El

polímero resultante (Figura 1) se redispersó en

agua (200 mL) y

el sistema se filtró a vacio

para elim

inar la

fracción insoluble.

La disolución resultante se concentró en rotavapory se dializó frente a agua (2 L) utilizando una m

embrana

de M

WC

O

6000-8000 D

a(Spectra/Por D

ialysis ®,France). El m

edio se cam

bió cada 12h. Transcurridos tres días,

la disolución se concentró de nuevo en rotavapory

se liofilizó.

Figura 1:Esquem

a de la estructura deun

polímero de C

D en el que se utilizó ácido

cítrico como reticulante (2).

HET-C

AM

test.La

biocompatibilidad

se evaluó

depositando 0.3 ml de una disolución al

10%

de los

polímeros

en la

mem

brana corioalantoidea de huevos incubados siguiendo el protocolo IC

CV

AM

(3).Solubilización.

Se prepararon disoluciones de C

D,

maltrodextrina,

polímero

de C

D

ypolím

ero de maltrodextrina en N

aCl 0.9%

,cubriendo

un am

plio intervalo

de concentraciones, y a las que se añadió EtO

X

en exceso

(1 m

g/mL).

Los sistem

as se

mantuvieron 48

hbajo agitación m

agnética,se filtraron (m

embrana de 0.45

m) y se diluyeron

con mezcla etanol:N

aCl 0.9%

(0.7:0.3) para cuantificar la cantidad de EtO

X disuelta por

espectrofotometría U

V (303nm

;Shimadzu U

V

1800, Japón).Ensayos

de difusión.

Se prepararon

disoluciones de EtOX

con cada una de las CD

(0.75 y 1.5%

) ylos polím

eros sintetizados (1.5%

y

3%)

siguiendo el

procedimiento

113

descrito en

el apartado

anterior. A

continuación, se llevaron a cabo ensayos de difusión utilizando tubos células de difusión Franz-C

hiez utilizando

unam

embrana

de diálisis de M

WC

O 500-1000 D

a (Spectra/Por ®

Cellullose Ester, Spectrum

lab, Francia)com

o separador entre los com

partimentos dador (3

ml de disolución) y receptor (7

ml de N

aCl

0.9% con SD

S 0.3%).

Resultados y D

iscusión: Polim

erización. Los

polímeros

de C

D

presentaron un contenido en CD

próximo al

50% en peso.

HET-C

AM test.

Todos los polímeros de C

D

superaron el test in vitrode referencia para

evaluar la compatibilidad con tejidos oculares

sin causar

daño en

la m

embrana

corioalantoidea.Solubilización. Las C

Ds libres en disolución

incrementaron

de m

anera m

uy notable

la solubilidad

de ETO

X

en N

aCl

0.9%,

en particular la

-CD

y la hidroxipropil--C

D(Figura 2). La m

altodextrina también m

ejoró la solubilidad,

lo que

indica que

el fárm

aco puede interaccionar hidrofóbicam

ente con los anillos de glucopiranosa.

Conc. C

D (g/l)

020

4060

80

Conc EtOX (g/l)

0.000

0.001

0.002

0.003

0.004

CD

CDCD

MaltoC

D

Crism

eb H

PC

D

Figura 2: D

iagrama de solubilidad de EtO

X en

NaC

l 0.9% en presencia de distintas C

Ds y

maltodextrina.

La polim

erización aum

entó la

capacidad solubilizante,

principalmente

la de

(Figura 3).

Conc. C

D (g/l) en P

olímeros

020

4060

80

Conc. EtOX(g/l)0.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006C

TR-bC

D

CTR

-gCD

C

TR-aC

D

CTR

-Malto

CTR

-Crysm

eb C

TR-H

PbC

D

Figura 3: D

iagrama de solubilidad de EtO

X

en NaC

l 0.9% en presencia de polím

eros dediferentes C

Ds y m

altodextrina.

Ensayos de difusión.La formulación de EtO

X

en dispersiones de CD

s y de sus polímeros

proporcionó perfiles

de cesión

sostenida durante al m

enos 24 h (Figura 4).

Tiempo (h)

05

1015

2025

30

EtOX cedido (mg/cm2)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

CTR

bCD

1.5%

CTR

bCD

3%

bCD

0.75%

bCD

1.5%

Tiempo (h)

05

1015

2025

30

EtOX cedido (mg/cm2)

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

CTR

gCD

1.5%

CTR

gCD

3%

gCD

0.75%

gCD

1.5%

Figura 4: Perfiles de cesión de EtOX

a partir de

formulaciones

conteniendo C

Ds

y sus

polímeros.

Conclusiones:

Las C

Ds

y sus

polímeros

obtenidos por

condensacióncon ácido cítrico m

ostraron una elevada capacidad para hidrosolubilizar EtO

X

y para

regular el

proceso de difusión

del fárm

aco.

Referencias:

(1)R

ibeiro A

, et

al. R

eceptor-based biom

imetic

NV

P/DM

A

contact lenses

for loading/elutiong carbonic anhydrase inhibitors. J. M

embr. Sci. 383:60-69 (2011).

(2)B

lanchemain N

, et al. Com

parative study

of vascular

prostheses coated

with

polycyclodextrins for controlled ciprofloxacin release.

Carbohyd.

Polym.

90: 1695-1703

(2012). (3)

NIC

EATM

-ICC

VA

M,

In vitro

test m

ethod for detecting ocular corrosives and severe

irritants. http://iccvam

.niehs.hih.gov/m

ethods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_hetcam.htm

2012.

Agradecim

ientosTrabajo financiado por la X

unta de Galicia

(10CSA

203013PR),

MIC

INN

(SA

F2011-22771)

y FED

ER.

M.J.G

.F. agradece

al M

inisterio de Educación, Cultura y D

eporte de España una beca para

movilidad de estudiantes

de programas de doctorado con M

ención hacia la Excelencia.

114

-CY

CL

OD

EX

TR

IN-C

ON

JUG

AT

ED

HY

DR

OG

EL

SFO

R O

CU

LA

RR

EL

EA

SE O

F A N

OV

EL

A

NT

IBA

CT

ER

IAL

N-A

LL

YL

TH

IOSE

MIC

AR

BA

ZON

E

R.J. G

lisoni 1,2, M.J. G

arcía-Fernández3, M

. Pino4, G

. Gutkind

2,4, A.G

. Moglioni 2,5,C

. Alvarez-Lorenzo

3, A.

Concheiro

3, A. Sosnik

1,2

1BIO

NIM

ED,D

epartment of Pharm

aceutical Technology,Faculty of Pharmacy and B

iochemistry,U

niversity of B

uenos Aires, A

rgentina. 2CO

NIC

ET, Argentina. 3D

epartamento de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica,

Facultad de Farmacia, U

niversidad de Santiago de Com

postela, Spain.4D

epartment of M

icrobiologyand

5Departm

ent of Pharmacology, Faculty of Pharm

acy and Biochem

istry, University of B

uenos Aires, B

uenos A

ires, Argentina.

Introduction: In the last decades, soft contact lenses (SC

Ls)have

been thoroughly

investigated as

a technology platform

for the localized sustained release of drugs in the treatm

ent of ocular pathologies

[1]. SC

Ls can

improve

the bioavailability

and prolong

the half

life of

ophtalmic drugs in the ocular m

ucosa. On the

other hand, the search for new antim

icrobial agents for the treatm

ent of ocular pathologies is under

constant developm

ent.This

work

investigated the

synthesis of

two

types of

hydrophilic networks

functionalizedw

ith -C

D

for thelocalized release of a novel antim

icrobial 5,6-dim

ethoxy-1-indanone N

4-allyl thiosem

icarbazone [2,3]; namely: i) netw

orks of pH

EMA

-co--C

D

prepared through

conventional free radical polymerization using a

polymerizable

-CD

derivative(m

ono-MA

--

CD

) [4]; and ii) networks prepared by direct

cross-linking of HP-

-CD

and HP-

-CD

/HPM

C

(1.0% w

/v) with EG

DE [5].

Materials and M

ethods: M

aterials.2-H

ydroxyethyl m

ethacrylate (H

EMA

was supplied by M

erck (Darm

stadt, G

ermany). M

ethacrylic acid anhydride (MA

A),

2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol

(BH

T), 2,2’-

azo-bis(isobutyronitrile) (A

IBN

), ethylene

glycol dim

ethacrylate (EG

DM

A,

98%),

ethylene glycol diglycidyl ether (EGD

E, 50%),

hydroxypropylmethyl cellulose K

4M (H

PMC

K

4M)

were

purchased from

Sigm

a-Aldrich

Chem

icals (Madrid, Spain). B

eta-cyclodextrin (

-CD

) and

hydroxypropyl--C

D

(HP-

-CD

) w

ere supplied

by R

oquette-Laisa (V

alencia, Spain).

5,6-Dim

ethoxy-1-indanone N

4-allyl thiosem

icarbazone (TSC) w

as synthesized and purified as reported in our previous w

ork [2].

Synthesis of

crosslinked pH

EMA-co-

-CD

networks.

Mono-M

A-

-CD

previously

synthesized (0.0, 0.6 and 1.2 g) was solubilized

in HEM

A (constant volum

e of 6.0 mL; final

concentration of mono-M

A-

-CD

was 0%

, 10%

and 20% w

/v, respectively). Two m

ethods were

employed

to incorporate

TSC:

(i) during-

copolymerization loading (D

P) and (ii) post-copolym

erization loading (PP). In the case of D

P system

s, TSC

(6.0

mg)

was

firstly solubilized in H

EMA

(6.0 mL)

and mono-M

A-

-CD

, yielding a final TSC concentration of 1.0

mg/m

L in the mixture.

Then, EGD

MA

(8.0 m

M) and A

IBN

(10.0 mM

) were added and the

mixture

injected into

a m

oldof

0.4 m

m

thickness. Then, the molds w

ere dried heated at (i) 50 ºC

(12 h) and (ii) 70 ºC (24 h). In the case

of PP systems, the sam

e production procedure w

as followed, though w

ithout the addition of TSC

. A

fter polym

erization, pH

EMA

sheets

were w

eighed and imm

ersed in boiling water (1

L) for 15 min to rem

ove unreacted monom

ers and to facilitate the cutting of 10-m

mdisks.

Synthesis of

super-hydrophilic hydrogels

(SHH

s) of HP-

-CD

and HP-

-CD

/HPM

C.H

P--C

D(4.8 g), N

aOH

solution (0.2M, 16 m

L) and

EGD

E (crosslinker

agent, 8

mL)

were

thoroughly mixed. The final reaction m

ixture (24 m

L) was divided into aliquots A

and B (12

mL each). H

PMC

K4M

(0.12 g) was added

exclusively to aliquot B (12 m

L), yielding a final concentration of 1%

w/v. Then, aliquots A

and B

were stirred (15 m

in), poured into thin-glass tubes (diam

eter of 5 mm

) and heated at 50 °C

(12 h). SHH

s were obtained by breaking

down the tubes and w

ashing the crosslinked netw

orksw

ith (i) water (12 h), (ii) 10 m

M H

Cl

(12 h) and (iii) water (24 h). Finally, SH

Hs w

ere cut into 5 m

m diam

eter disks with a scalpel and

dried in an oven at 40 °C (24 h).

In vitro release in artificial lacrimal fluid.D

isksw

ere loaded with TSC

by soakinginto a TSC

suspension in water (250

g/mL, 10 m

L), stirred at 25 ºC

for 24 hor 96 h, and then

imm

ersed into artificial lacrim

al fluid (10 mL) at 25 ºC

and the TSC

released was m

onitored by UV

-Vis

Antibacterial activity of TSC-loaded hydrogels.

The agar diffusion method of M

üller-Hinton

(pH 7.2-7.4, 25 ºC

; 4 mm

of agar height) was

used to evaluate the antimicrobial activity of (i)

free TSC (200

g of TSC in a paper disk), (ii)

TSC-free SC

Ls and SHH

s and (iii) TSC-loaded

SCLs

and SH

Hs,

against Pseudom

ona aeruginosa

(strain 9027) and Staphylococcus aureus

(strain 6538P). The turbidity standard of 0.5 in the M

cFarland scale is used to adjust the turbidity

of the

inoculum.

The incubation

temperature w

as between 35 and 37 ºC

for 24 h.

115

Results and D

iscussion:The netw

orks resultant of the application of the tw

o synthetic procedures were transparent and

showed

high affinity for water. Im

mersion

in artificial lachrym

alfluid resulted in a 93 to 43%

degree of swelling for pH

EMA

networks of low

to

high content

in m

ono-MA

--C

D.

The sw

elling of SHH

s reached 400%.

Regardless of the m

ethod used forthe drug

loading (DP or PP), pH

EMA

networks

slowly

released TSC (Figure 1A

-C).SH

Hs show

ed the sm

allest TSC loading capacity (Figure 1D

). This result w

as expected owing to the extrem

ely low

aqueous solubility of the drug and the high hydrophilicity of these hydrogels. O

n the other hand, it is im

portant to stress that pHEM

A-co-

-C

D and SH

Hs system

s sustained the release of the loaded TSC

for at least two w

eeks (Figure 1) and m

aintainedconcentrations w

ithin the antim

icrobial therapeutic window

.

Figure 1. (A-C

) TSC release kinetics from

pH

EMA

-based SCLs prepared w

ith different percentage of m

ono-MA

--C

D and (D

)SH

Hs

based on HP-

-CD

and HP-

-CD

/HPM

C. (A

) D

P method, (B

) PP method w

ith stirring of 24 h in TSC

suspension, (C)PP m

ethod with stirring

of 96 h in TSC suspension

and (D)

PP method

with stirring of 24 h in TSC

suspension. Figure insets show

the release during the first 24 h.

Finally, the microbiological evaluation show

ed the

inhibition of bacterial growth, although the

inhibition zones were not large surface at 24 h

of incubation (Figure 2).These results suggest that TSC

levels were w

ithin the therapeutic w

indow

and could

be evaluated

in anim

al m

odels with prom

ising results.

Figure 2.

Antibacterial

activity in

(A,B

)Staphylococcus aureus

and (C,D

)Pseudom

ona aeruginosa

culturesafter 24 h of incubation on

agar Müller-H

inton. (a)Paper disk loaded w

ith 200

g of

TSC

(positive control),

(b)SC

L w

ithout TSC (negative control), (c)TSC

-loaded SC

L obtained by the PP method and (d)

TSC-

loaded SCL obtained by the D

P method.

Conclusions.

Incorporation of

the safe

pharmaceutical

excipient C

D

to hydrophilic

networks

can open

novel possibilities

of developm

ent netw

orks suitable

as ocular

bandages or SCLs that can host therapeutic

amounts of a novel TSC

that displays a broad antibiotic

spectrum.

The system

s engineered

provided a well-controlled sustained release for

at least two w

eeks. Moreover, they inhibited the

growth of tw

o prominent bacteria associated

with ocular infections.

References

[1] Alvarez-Lorenzo C

., et al. J. Drug D

el. Sci. Tech., 20, 237–248

(2010). [2] G

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.J, et al.Pharm. R

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., et al. Eur. J. Pharm.

Biopharm

., 66, 55-62(2007).

Acknow

ledgments:

R.

Glisoni

thanks the

doctoral scholarship

of C

ON

ICET.

Work

supported by

the Iberoam

erican Them

atic N

etwork

“Red

iberoamericana

de nuevos

materiales para el diseño de sistem

as avanzados de liberación de fárm

acos en enfermedades de

alto impacto socioeconóm

ico (RIM

AD

EL)” of the C

YTED

Program, and by FED

ER, X

unta de G

alicia (10C

SA203013PR

) and

MIC

INN

(SA

F2011-22771), Spain. B

ab

cd

ACD

ac

bd

bb

AB

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

040

80120

160200

240280

320360

Time (h)

TSC released (mg/g dry hydrogel)

0% w/v10% w/v

20% w/v

0

200

400

600

800

05

1015

2025

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

040

80120

160200

240280

320360

Time (h)

TSC released (mg/g dry hydrogel)

0% w/v10% w/v

20% w/v

D C0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

040

80120

160200

240280

320360

Time (h)

TSC released ( g/g hydrogel)

0% w/v10% w/v

20% w/v

0200400600800

1000

05

1015

2025

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000040

80120

160200

240280

320360

Time (h)

TSC released (mg/g dry hydrogel)

HPbeta-CD/HPMC HPbeta-CD

0 501001502002503003500

510

1520

25

116

PEL

ET

S DE

LIB

ER

AC

IÓN

CO

NT

RO

LA

DA

DE

PRO

PRA

NO

LO

L A

BA

SE D

E

CO

PRE

CIPIT

AD

OS D

EL

FÁR

MA

CO

CO

N E

UD

RA

GIT

L100 O

S100L.C

.L. Sá-Barreto

1, R. M

artínez-Pacheco1,2,J.L. G

ómez-A

moza

1,2

1Departm

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de Santiago de C

ompostela, España

2Instituto de Farmacia Industrial. U

niversidad de Santiago de Com

postela, España

Introducción: Las

formas

orales m

ultiparticulares de

liberación controlada cuentan con numerosas e

importantes

ventajas sobre

las de

tipo m

onolítico (1). Sinem

bargo, para conseguir un control eficaz y duradero del proceso de cesión requieren, en especial si contienen fárm

acos hidrosolubles, el recubrim

iento con materiales

adecuados de las pequeñas unidades que las com

ponen, lo que supone un claro incremento

de complejidad tecnológica en su elaboración

(2). Partiendo de estos hechos, el objetivo de este estudio es evaluar la utilidad de pelets de estructura m

atricial elaborados por extrusión-esferonización, en los que un fárm

aco catiónico de m

arcada hidrosolubilidad (propranolol) se incorpora

coprecipitado con

un copolím

ero aniónico

(Eudragit L100

o Eudragit

S100), com

o sistemas de liberación controlada.

Materiales y M

étodos: M

ateriales:Eudragit

L100 y Eudragit

S100 (cedidos

por Evonik),

Trietilcitrato (M

erck),Propranolol C

lH (R

oig Farm

a S.A.),

Avicel

PH101 (G

uinama).

Preparación y

caracterización de

los coprecipitados:

Disolución

secuencial del

copolímero, el agente plastificante (trietilcitrato)

y el

fármaco

en m

ezcla de

2-propanol:acetona:agua

73:24:3a

50ºC

con agitación m

ecánica. Eliminación del disolvente

en estufa con circulación forzada de aire a 40ºC durante 4 días. Pulverización del coprecipitado form

ado y

selección de

la fracción

granulométrica 50-140

m. La com

posición de los coprecipitados objeto de estudio se presenta en

la Tabla

1. La

caracterización de

los coprecipitados se llevó a cabo por calorim

etría diferencial de barrido (D

SC) (TA

Instruments

Q100, m

uestras de 3-4 mg, cápsulas cerradas en

atmósfera de nitrógeno con flujo 50 m

L min

-1yvelocidad de calefacción 10ºC

min

-1) y por

difracción de

rayos X

(Siem

ens D

5005, m

onocromador

de grafito

y ánodo

de C

u, intervalo 3-60º2

, velocidad de barrido 0.01º2s -1).Preparación y caracterización de los pelets:Para la preparación de las form

ulaciones, cuya com

posición se detalla en la Tabla 1, se aplicó el siguiente procedim

iento: mezclado de los

componentes sólidos (Turbula T2C

, 30 rpm, 10

min), hum

ectación de las mezclas con agua

(malaxadora K

enwood, 10 m

in), extrusión de las m

asas humectadas (C

aleva 25, malla 1 m

m,

60 rpm), esferonización de los pelets (C

aleva

120, plato de 12 cm con hendiduras de 1 m

m,

10 min a 1200 rpm

) y desecación en estufa con circulación forzada de aire (40ºC

, 24 h). La caracterización de los pelets incluyó tam

año y form

a (Microscopía óptica, O

lympus SZ-C

TV,

625 pelets, diámetro de Feret y circularidad),

friabilidad (Friabilómetro U

SP, 25 rpm 15 m

in, 100 perlas de vidrio de 4 m

m de diám

etro), m

icroestructura (porosimetría de intrusión de

mercurio, M

icromeritics A

utopore II 9215) yvelocidad de disolución de propranolol (Turu G

rau USP29, tam

pón pH 1.2 0-1.5 h y tam

pón pH

6.8 1.5-12 h, 900 mL, 50 rpm

).

Código

Com

ponentes de los coprecipitadosA

vicel PH

101(%

)

Agua

(mL/

100g) Prop.

ClH

(%)

TEC

(%

)L100 (%

)S100(%

)

L6P35,0

0,930

-64,1

72L9P3

3,30,9

30-

65,874

L12P32,5

0,930

-66,6

75S6P3

5,00,9

-30

64,167

S9P33,3

0,9-

3065,8

67S12P3

2,50,9

-30

66,668

Tabla 1.Com

posición de las formulaciones en

pelets objeto de estudio.

Resultados

y D

iscusión: Los

termogram

as D

SC obtenidos con los coprecipitados (Figura

1) m

uestran la

desaparición del

pico endotérm

ico de fusión del fármaco, claram

ente visible

para las

mezclas

físicas copolím

ero-fárm

aco de igual composición, que sugiere que

el propranolol

en los

coprecipitados se

encuentra predominantem

ente en estado amorfo.

Los resultados de los estudios de difracción de rayos X

ratifican esta afirmación. Para todas las

formulaciones objeto de estudio, se obtuvieron

pelets de

características m

orfológicas y

de resistencia

mecánica

adecuadas, sin

que se

observasen fenóm

enos de

erosión o

aglomeración significativos (Tabla 2).

Las curvas acumuladas de intrusión de m

ercurio (Figura 2) m

uestran aspectos comunes para las

distintas formulaciones evaluadas, con un fuerte

predominio de poros de tam

año comprendido

entre1 y 0,1

m. N

o obstante, hay que destacar que la porosidad de los pelets elaborados con la variedad

Eudragit S100

resulta claram

ente m

ayor quela de sus equivalentes obtenidos con

la variedad L100.

117

Figura 1.-

Termogram

asD

SC

de los

coprecipitados (C) y de las m

ezclas físicas (M).

(A) Eudragit L100; (B

) Eudragit S100.

Tabla 2.-

Características

granulométricas,

morfológicas y de resistencia m

ecánica de las form

ulaciones objeto de estudio.

0.0010.01

0.11

10100

10000.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25L6P3L9P3L12P3S6P3S9P3S12P3

Diám

etro poro,m

Volumen, cm3 g-1

Figura 2.- C

urvas acumuladas de intrusión de

mercurio correspondientes a las form

ulaciones objeto de estudio.

En la Figura 3 se han condensado las curvas m

edias acum

uladas de

disolución de

propranolol. En

medio

ácido, todas

las form

ulaciones muestran un claro efecto burst

cuya magnitud es fuertem

ente dependiente de la variedad polim

érica y, en menor m

edida, de la proporción

de fárm

aco incorporado.

La diferente

intensidad de

las interacciones

fármaco-polím

ero (derivada

de la

distinta proporción de grupos carboxilo/ester de las dos variedades de Eudragit) podría justificar este com

portamiento.

En medio de disolución pH

6.8, se observan diferencias m

uy marcadas en los perfiles de

disolución de

propranolol en

función de

la variedad polim

érica incorporada a los pelets. A

sí, las formulaciones elaboradas con Eudragit

L100 ceden el fármaco de acuerdo con una

cinética de orden 1, sin que existan diferencias im

portantes atribuibles

a

la proporción

fármaco/polím

ero. En cambio, con la variedad

S100 se

obtienen cinéticas

orden 0

con velocidades de disolución com

prendidas entre 2.5 y 4.5%

de la dosis de propranolol/hora. Estas diferencias en el com

portamiento de los

dos Eudragit

deben atribuirse

a un

efecto com

binado del diferente perfil pH-solubilidad y

de la diferente capacidad viscosizante de las dos variedades (3) y de la, ya com

entada, diferente porosidad de los pelets que originan.La form

ulación que contiene Eudragit S100 con la m

enor proporción fármaco/polím

ero permite

minim

izar el efecto burst(<10%

) y mantener,

durante períodos

de tiem

po sucientem

ente prolongados, una liberación de propranolol a velocidad constante.

0.000.75

1.500.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

36

912

L6P3L9P3L12P3S6P3S9P3S12P3

Tiempo, h

Propranolol disuelto

Figura

3.- C

urvas m

edias acum

uladas de

disolución de propranolol de las formulaciones

objeto de estudio.

Referencias:

(1) Góm

ez-Carracedo y col.,

Eur. J. Pharm.

Biopharm

., 67 (2007) 236-245.(2) A

sghar L.F.A. y col.,J. Pharm

. Pharm. Sci.,

9 (2006) 327-338.(3) Evonik Technical Inform

ation. Info 7.3/E (O

ctober 2011).

Agradecim

ientos:- A

Evonik por el suministro desinteresado de

las muestras de Eudragit.

- Este estudio se ha desarrollado dentro del proyecto 07C

SA006203PR

(Xunta de G

alicia).

Código

Diám

etro deF

eret (m

)C

ircularidadF

riabilidad (%

)

L6P3

893,45 (110,87)0,97(0,02)

0,09L

9P3865,34 (87,96)

0,98(0,02)0

L12P3

710,57 (199,48)0,97(0,03)

0S6P3

645,60 (152,00)0,97(0,04)

0,06S9P3

670,45 (130,64)0,95(0,04)

0,02S12P3

560,95 (164,83)0,88(0,07)

0,08

118

NA

NO

PAR

TÍC

UL

AS D

E SÍL

ICE

ME

SOPO

RO

SA PA

RA

MO

DU

LA

R E

L PA

SO D

E

SUST

AN

CIA

S A T

RA

VÉ

S DE

LA

BA

RR

ER

A H

EM

AT

OE

NC

EFÁ

LIC

A

M. G

onzález-Alvarez

1, I. Gonzalez-A

lvarez1,C

. Coll 2, E. A

znar 2, F. Sancenón2, R

. Martínez-M

áñez2,

M.B

ermejo

1

1Depto. de Ingeniería. Á

rea Farmacia y Tecnología Farm

acéutica. Universidad M

iguel Hernández, Elche.

2Centro de R

econocimiento M

olecular y Desarrollo Tecnológico (ID

M), U

niversitat Politècnica de V

alència3C

IBER

en Biotecnología, B

iomateriales y N

anomedicina (C

IBER

_BB

N)

Introducción: Las

nanopartículas de

sílice m

esoporosahan dem

ostrado desde hace unos años un gran potencial com

o componentes de

formas

farmacéuticas por su capacidad para

albergar en su interior gran cantidad de fármaco,

versatilidady

su biocom

patibilidad.En

un sistem

abásico, el fárm

aco se almacena en los

poros y la liberación de la especie encapsulada se produce por difusión. A

este sistema

se le puede añadir una

funcionalización externa con distintas m

oléculas que actúan como puertas

moleculares

lo cual

permite

una liberación

controlada de la cargaen respuesta a diferentes

estímulos

externos. En este sentido, el objetivo de este trabajo es la obtención de dispositivos nanoscópicos

con función de puerta molecular

que sean capaces de internalizarse en la célula y cuya apertura esté controlada por un proceso enzim

ático. Estos materiales híbridos

deben ser capaces de incluir la carga en el interior de los m

esoporos hasta que estén en presencia de las enzim

as en el interior de la célula. De esta

manera se pretende conseguir m

odular el paso de

sustancias a

través de

la barrera

hematoencefálica que está m

uy limitado para

gran núm

ero de

fármacos

entre los

que se

incluyen fárm

acos hidrófilos

y fárm

acos sustrato

de transportadores

efflux com

o la

glicoproteína P

Materiales y M

étodos: Para la preparación de estos m

ateriales se selecciona como soporte las

nanopartículas de sílice mesoporosa M

CM

-41por sus características de porosidad hom

ogénea, biocom

patibilidad y

facilidad de

funcionalización. Este

material

se sintetiza

mediante

la polim

erización del

tetraetil ortosilicate

sobre m

oléculas de

bromuro

de hexadeciltrim

etilamonio que

es un surfactante que actúa com

o agente director de la estructura. Posteriorm

ente, se

elimina

el tensioactivo

mediante calcinación en aire a tem

peraturasde

550ºC lo cual da lugar a la form

ación de los poros del sólido. En esas cavidades se introduce el colorante control (Safranina) o los fárm

acos elegidos

(Metoprolol,

Atenolol,

Celiprolol

oC

ortisol). La carga del material se lleva a cabo

realizando una suspensión de nanopartículas en una

disolución acuosa

del com

puesto a

introducir. Esta mezcla se m

antiene en agitación

a temperatura am

biente durante 24 horas. De

esta manera el fárm

aco difunde hacia el interior de

los poros.

El últim

o paso

consiste en

funcionalizar la superficie externa del material

con las moléculas orgánicas seleccionadas para

que actúen como puertas m

oleculares. En este caso se ha elegido el G

lucidex® 47 que es un

hidrolizado de

almidón

disponible com

ercialmente que contiene 5%

glucosa50%

m

altosa, 45% oligosacáridos y polisacáridos.

Estos derivados

de alm

idón se

hidrolizan específicam

ente con

amilasas

que están

presentes, entre otros sitios, en los lisosomas

celulares. C

omo

técnica de

anclaje de

los derivados

de alm

idón se

ha em

pleado la

sililación.

La caracterización

de los

materiales

se ha

llevado a cabo mediante técnicas estandard en la

química del estado sólido: difracción de R

ayos-X

de

polvo y

microscopia

electrónica de

transmisión (TEM

)

Figura 1. Mecanism

o de liberación del fármaco

en presencia de amilasas

Los ensayos de liberación in vitrose realizaron

resuspendiendo 5 mg de sólido en 12.5 m

L de H

2O y 5 m

L de sólido en una disolución de -am

ilasa. Se determina el perfil de

liberación recogiendo

alícuotasde

las suspensiones

a los

tiempos

prefijados, filtrándolas con filtros de teflón y determ

inando la

cantidad de

fármaco

mediante

la técnica

analítica necesaria.

La figura

1 m

uestra un

esquema de cóm

o se produciría la liberación del fárm

aco contenido

en el

interior de

las nanopartículas.

Para los estudios de permeabilidad a través de la

barrera hemtoencefálica se ha utilizado la línea

celular MD

CK

. Las célulasfueron sem

bradas y crecidas en form

a de monocapas celulares en

mem

branas de

policarbonato, hasta

su

119

confluencia durante 7-9 días. La integridad de la m

onocapa se evaluó midiendo la resistencia

eléctrica transepitelial

antes y

después del

experimento. U

na vez se administró

el fármaco

encapsulado en las nanopartículas se mantuvo

en incubación 2.5 h con agitación, pasadas las cuales, se tom

aron cuatro muestras durante 90

minutos,

y posteriorm

ente se

analizaron m

ediante CLA

R. Los estudios de transporte se

realizaron en

ambas

direcciones: desde

la cám

ara apical hacia la basolateral y desde la cám

ara basolateral hacia laapical.

Resultados y D

iscusión: Las nanopartículas

obtenidas fueron caracterizadas por difracción de R

ayos-X de polvo y m

icroscopía electrónica de transm

isión. Los difractogramas de

polvo de los sólicos M

CM

-41, MC

M-41 calcinada y los

sólidos finalesm

uestra los picos de reflexión a los valores esperados

(figura 2). Las imágenes

de TEM de la M

CM

-41 calcinada y de los sólidos

finales m

uestran que

el m

aterial sintetizado corresponde a partículas esféricas con diám

etros de 100 a 200 nm que m

uestran la típica porosidad de la m

atriz MC

M-41. Los

datos de los difractogramas de rayos X

de polvo y de TEM

demuestran que tanto el cargado de

los poros como la posterior funcionalización

externa no

modifican

la estructura

tridimensional inicial del m

aterial mesoporoso.

Figura 2.Difractogram

a de RX

de MC

M-41(a),

MC

M41 calcinado (b) y el sólido híbrido(c).

Los ensayos

de liberación

se iniciaron

estudiando la liberación del material híbrido

cargado con el fármaco en ausencia de enzim

a a pH

= 7.5. Los resultados obtenidos para todos los

sólidos indicaron

que la

liberación del

compuesto

es prácticam

ente nula

incluso después de 24 horas. Ensayos de idénticas características

realizados en

presencia de

la -am

ilasa a pH= 7.5 revelaron que se

producía la liberación continua de los distintos fárm

acos durante un período de varias horas. La

figura 3m

uestra los resultados obtenidos para el m

aterial híbrido cargado con Metoprolol

Figura 3.C

inética de liberación de Metoprolol

desde una suspensión de nanopartículas de sílice m

esoporosa funcionalizada con Glucidex®

47en

ausencia y presencia de enzima.

Los ensayos de permeabilidad en m

onocapas M

DC

K revelaron que el encapsulam

iento de los fárm

acos daba

lugar a

diferencias en

su perm

eabilidad respecto al fármaco libre. Los

resultados más prom

etedores se han obtenido con

el celiprolol

el cual

cuando está

encapsulado en la nanopartícula permite el paso

al compartim

ento receptor de cantidades de fárm

aco significativamente superiores

En conclusión,

se han

preparado con

éxito nanoparticulas

porosas de

metoprolol,

celiprolol, atenolol y cortisol, se ha comprobado

la funcionalidad del mecanism

o de activación de la cesión y se ha determ

inadosu capacidad

de internalizarse en la barrera hematoencefálica.

Lo que

demuestra

que esta

estrategia es

prometedora

para increm

entar el

paso de

sustancias a

través de

la barrera

hematoencefalica

Referencias:

(1) Bernardos, A

.; Aznar, E.; M

arcos,M

. D.;

Martínez-M

áñez, R.; Sancenón, F.; Soto, J.;

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ontrolled R

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ngew. C

hem., Int. Ed. 2009, 48,

5884–5887. 73. Park, C.; K

im, H

.; Kim

, S.;(2) B

ernardos,A.; M

ondragón, L.; Aznar, E.;

Marcos,

M.

D.;

Martínez-M

áñez, R

.; �

-�

Enzyme-R

esponsive Intracellular Controlled

Release

Using

Nanom

etric Silica

Mesoporous

Supports C

apped w

ith “Saccharides”. A

CS N

ano, 2010, 4 (11), 6353-6368

(3) Mangas-Sanjuán, V

.; González-A

lvarez, M.;

González-A

lvarez, I.; Berm

ejo,M

.V.

Drug

penetration across the blood¿brain barrier: an overview

. Therapeutic delivery, 2011

120

SÍNT

ESIS Y

CA

RA

CT

ER

IZAC

IÓN

DE

CO

POL

ÍME

RO

S BL

OQ

UE

(PLG

A-PE

G-PL

GA

) T

ER

MO

SEN

SIBL

ES PA

RA

EL

DISE

ÑO

DE

PRE

PAR

AD

OS IN

YE

CT

AB

LE

S IN

TR

AO

CU

LA

RE

S DE

LIB

ER

AC

IÓN

PRO

LO

NG

AD

A.

JB. Fariña, A

. González, C

. Monzón, A

., V. V

aleron, A. Santoveña, A

. Oliva y M

. Llabrés. D

epartmento de Ingeniería Q

uímica y Tecnología Farm

acéutica. Facultad de Farmacia. U

niversidad de La Laguna, España

Introducción. La

necesidad de

administrar

medicam

entos biotecnológicos en preparados inyectables de liberación m

odificada, ha llevado al desarrollo de ha llevado al desarrollo y optim

ización de sistem

as polim

éricos term

osensibles que

responden a

pequeños cam

bios en

la tem

peratura de

su entorno

con transiciones

reversibles sol-gel.

Este tipo

de sistem

as perm

iten preparar

dispersiones acuosas

que fluyen com

o líquidos a temperatura am

biente y gelifican

a la

temperatura

corporal (~37ºC

) form

ando un deposito de cuyas propiedades físico-quím

icas depende

la velocidad

y el

tiempo al que se cede el principio activo. Son

varios los

polímeros,

copolimeros

y com

binaciones de estos que se han utilizado con estos

fines y

que perm

iten prolongar

la liberación desde días hasta m

eses, cabe resaltar por

su baja

toxicidad los

hidrogeles de

poloxameros

y sus

mezclas

con el

ácido hialurónico (1) o los copolím

eros bloque de polietilenglicol

(PEG)

y poli(D

,L-lactida-co-glicolida)

(PLGA

) que

se ensam

blan en

copolímeros tribloque tipo A

-B-A

(PEG-PLA

-PEG

o PEG-PLG

A-PEG

) o B-A

-B (PLG

A-

PEG-PLG

A (2). Estos últim

os aparte de su baja toxicidad, son biodegradables y si se adecúan las

condiciones de

preparación y

su com

posición, permiten ajustar la liberación a los

requisitos específicos deseados. El objetivo del presente trabajo es la síntesis y caracterización de copolím

eros tribloque de PLGA

-PEG-PLG

A

con com

posición m

onomérica,

PM

y biocom

patibilidad

adecuados para

preparar hidrogeles

termosensibles,

con propiedades

reológicas aptos

para la

administración

parenteral y

el control

de la

liberación de

fármacos de diferente naturaleza.

Materiales y M

étodos. R

eactivos: Polietilenglicol 1000 y 1500 (Fluka), D

,L Lactida y Glicolida (A

ldrch), etilhexanoato de estaño (Sigm

a). Síntesis del PLGA

-PEG-

PLGA

: Se

utilizo el

método

propuesto por

Zentner y cols (2), utilizando un mini reactor

que permitió un control preciso del tiem

po y tem

peratura de proceso, vacío y agitación. Las variables

utilizadas para

modificar

las propiedades del copolím

ero fueron el PM del

PEG

de partida,

el tiem

po de

vacío. C

aracterización de

los copolím

eros: Los

monóm

eros residuales

en el

polímero

se

analizaron por UPLC

, en fase inversa y detector U

V-V

IS. El PM y la distribución de PM

de los copolím

eros por cromatografía de perm

eación en gel (G

PC) en tetrahidrofurano utilizando 4

columnas

en serie

y

con doble

detección (R

efractometro diferencial y D

ifracción de Luz Laser M

ultiángulo (MA

LLS). La proporciones de láctico/glicólico/PEG

de los polímeros se

determinaron

por 1H

-RM

N

en cloroform

o deuterado. Preparación de los H

idrogeles: Con

el objetivo de preparar hidrogeles que presenten transiciones reversibles sol-gel en el entorno de los 37ºC

se prepararon dispersiones acuosas con los copolím

eros obtenidos con concentraciones entre el 10%

y el 25% (p/p). C

aracterización de los hidrogeles: Las propiedades de gelificación de

los hidrogeles

preparados a

diferentes concentraciones se estudiaron determ

inando las tem

peraturas críticas mínim

as de gelificación (LC

GT) y de disolución (LC

ST) y máxim

a de disolución

(UC

ST) y

construyendo los

diagramas

de fase.

Las propiedades

viscoelásticas se estudiaron con un reómetro

Bholin de geom

etría plato-plato. La estabilidad se estudio por G

PC. La biocom

patibilidad de los polím

eros se evaluó de acuerdo al test HET-

CA

M

(Hen’s

Egg Test-C

horioallantoic M

embrane) siguiendo el protocolo N

ICEA

TM-

ICC

VA

M

(3). La

bioadhesividad de

los polím

eros se

evaluó con

un analizador

de textura TA

-TX Plus de acuerdo con el m

étodo propuesto por B

lanco y cols (4)R

esultados y Discusión.

Los resultados del análisis de los polímeros por

la técnica

de U

PLC

utilizada nos

permiten

afirmar que el contenido residual de estos en

lactida es < 0,5% (p/p). Las propiedades de los

copolímeros obtenidos, PM

, polidispersividad y com

posición, en función de las condiciones de síntesis recogen en la Tabla 1. El copolím

ero A

se preparó partiendo de PEG de PM

1000 y m

anteniendo la conexión del vacío en el reactor abierta

durante las

ocho horas

de síntesis,

mientras que el copolím

ero B se preparó con

PEG de PM

1500 y una vez alcanzado el vacío deseado se cerro la conexión del reactor. En la tabla 2 se recogen los resultados de bioadhesión de los copolím

eros determinados por triplicado,

sobre piel curtida de cabra paquistaní (4). Com

o puede

observarse la

bioadhesividad del

copolímero B

es muy superior a la del A

y se m

antiene cuando se diluye hasta cuatro veces.

121

Tabla 1: PM

relativos a patrones de poliestireno determ

inados por

GPC

, polidispersividad

y com

posición monom

érica de los copolímeros

sintetizados. LA (Láctico). G

A (glicólico)

Tabla 2: Trabajos de bioadhesión evaluados por

triplicado con un analizador de textura TA-TX

Plus,

para los

copolimeros

concentrados y

diluidos y diluidos (1:4) *. La

biocompatibilidad

de los

copolímeros

se determ

inó de acuerdo al test HET-C

AM

que nos da una idea de la iritación ocular potencial, m

ientras que

el copolím

ero B

no

indujo hem

orragia, lisis ni coagulación, el A indujo

coagulación cuando se comparó con controles

negativos de

suero salino

isotónico. En

la Figuras 1 y 2 se recogen los diagram

as de fase de

los hidrogeles

A

y B

. C

omo

puede observarse,

el hidrogel

A

no presenta

transiciones sol-gel

en los

intervalos de

temperatura estudiados

Figura 1. Diagram

a de fase de las soluciones acuosas del copolím

ero A.

Figura 2. Diagram

a de fase de las soluciones acuosas del copolím

ero B.

En la Figura 3 se recoge la evolución de los m

ódulos elástico y viscoso (G’ y G

’’) con la Tª para el hidrogel B

al 25%(p/p). Se observa

igualdad entre

ambos

a la

temperatura

de gelificación (entre 23,4 y 23,9ºC

)

Las condiciones

de síntesis

universalmente

aceptadas para obtener este tipo de copolímeros

(2) deberían permitir obtener lotes reproducibles

al menos en lo se refiere a su PM

y propiedades reológicas. C

uando se controlan los parámetros

Figura 3. Evolución de G’ y G

’’con la Tª para el hidrogel B

al 25% (p/p).

que intervienen en el proceso a través de un m

ini reactor químico y se cam

bia el PM del

bloque de PEG (de 1 a 1,5 kD

a) las propiedades del copolím

ero obtenido cambian sensiblem

ente en

lo referido

a su

PM

relativo y

a su

composición final en láctico y glicólico. C

uanto m

ayor es el contenido en LA y el tam

año de las cadenas de PLG

A m

ayores son las interacciones hidrofóbicas y m

ás bajas son las temperaturas

de gelificación (2). El copolímero A

es apto para

elaborar geles

termosensibles

para adm

inistración intraocular

por su

biocompatibilidad

y por

los valores

de las

temperaturas

a las

que se

producen las

transiciones de sol a gel de sus dispersiones acuosas aunque siendo posible aún optim

izar sus propiedades para elevar sus LC

GTs.

Referencias:

(1) Lee Y, C

hung H, Y

eo S, Ahn C

, Lee H,

Messersm

ith P, Park T. Thermo-sensitive,

injectable……

., The

Royal

Society of

Chem

istry. 2010; 6:977-983. (2) C

hien S, Pieper, R, W

ebster, DC

, Sing J.. Triblock

copolymers:

synthesis, characterization, and delivery of a m

odel protein. Int. J. Pharm

2005; 288: 207-218. (3) N

ICEA

TM-IC

CV

AM

. In vitro……

., http: //iccvam

.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivoc

utox/ocu_brd_hetcam.htm

, accessed

June 2011

(4) H.

Blanco-Fuente,

B.

Vila-D

orrio, S.

Anguiano-Igea,

F.J. O

tero-Espinar, J.

Blanco-M

endez, Tanned

leather: A

good

model f…

Int. J. Pharm. 1996; 138, 103-112

Agradecim

ientos: Este

trabajo ha

sido financiado por el M

inisterio de Economía y

Com

petitividad (SA

F2010-17083). N

uestro agradecim

iento al Departam

ento de Tecnología Farm

acéutica de la Universidad de Santiago por

su colaboración

en la

evaluación de

la biadhesividad

y biocom

patibilidad de

los copolím

eros.

23,5 2424,5 2525,5 2626,5

010

2030

40

T (ºC)

C (%

) Hidrogel A

0 10 20 30 40

010

2030

40

T (ºC)

C (%

)

Hidrogel B

PRO

PIEDA

DES

CO

POLÍM

ERO

A

B

PM

Mn

Mw

M

z

3086 3307 3582

4356 4908 5473

Polidispersividad 1.07

1.13

1H-RM

N

LA

GA

PEG

33,1%

12,8%

54,1%

15,7%

14,8%

69,5%

CO

POLIM

ERO

A

B

Trabajo de biadhesión

(N·m

m)

0.600 (0.100) 0.004 (0.001)*

2.050 (1.060) 1.207 (0.485)*

122

LIB

ER

AC

IÓN

DE

KE

TO

PRO

FEN

O Y

DE

XK

ET

OPR

OFE

NO

TR

OM

ET

AM

OL

EN

C

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PRIM

IDO

S MA

TR

ICIA

LE

S DE

PAD

AS Y

MA

NIT

OL

M

argarit Bellver M

.V. 1,R

odríguez Galán I.C

. 1,García Izquierdo M

.L1, L

ópez Navarro A

., R

odríguez Galán A

. 2

1 Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica. Facultad Farmacia. U

niversidad de Granada.

2Departam

ento de Ingeniería Quím

ica, ETSEIB. U

niversidad Politécnica de Cataluña. España.

Introducción:Estudios

precedentes de

la poliesteram

ida biodegradable y biocompatible

poli-(L-alanina-dodecanodioll-L-alanina-sebácico)

(PAD

AS)

ponen de manifiesto sus

características farm

acotécnicas apropiadas

(capacidad de flujo y compresibilidad del polvo;

resistencia a la rotura y a la erosión del polímero

comprim

ido y resistencia a la disgregación)para form

ar com

primidos

matriciales

inertes con

cualidades para el control de la liberación(1).

Aspecto

estudiado en

formulaciones

de com

primidos de diclofenaco sódico

(2).En

este trabajo,

se evalúa

la aplicación

dePA

DA

S como soporte m

atricial insoluble, para controlar

la liberación

de ketoprofeno

y dexketoprofeno

trometam

ol,analizando

la influencia

de los

fármacos

modelo

y del

diluyente m

anitol, sustituyente

parcial del

soporte polimérico en los com

primidos.

Materiales y M

étodos: Los comprim

idos seform

ulan con ketoprofeno(K

)(Fagron Ibercia),

dexketoprofeno trom

etamol

(DK

-T), poli-(L-

alanina-dodecanodiol-L-alanina-sebácico) (P)

preparadopor polim

erización interfacial, segúnm

étodo descrito por Paredes etal. (3), con un

tamaño

medio

de partícula

de 60-125

m,

manitol

(M) y estearato m

agnésico(G

uinama,

Valencia). M

ezclados y homogeneizandos los

componentes de las form

ulaciones indicadas en la tabla

1 se comprim

en en prensa hidráulica (Specac) a 5 tons de presión durante 1 m

inuto.obteniendo

comprim

idos cilíndricos de caras planas y 10 m

m de diám

etro.

Tabla 1.Formulaciones de com

primidos con

ketoprofeno o dexketoprofeno trometam

ol.

También se elaboran cápsulas gelatinosas duras

con 100 mg de K

o DK

-T para determinar el

perfil de

disolución de

los fárm

acosy

comprim

idos sin polímero (fórm

ula 0 PMF)

que permiten apreciar

la influencia del manitol

en la disolución de los fármacos.

Los ensayos de disolución se realizan en el aparato

II de

paletas en

un dispositivo

semiautom

ático (Sotax AT 7 Sm

art). Con

1000m

l de tampón de fosfato pH

6,8 a37ºC

como

medio de disolución;

velocidad de rotación de las

paletas de 50 rpm. C

ada formulación se

analiza por

sextuplicado durante

24 h.

La concentración de K

y DK

-T se determina por

espectrofotometría U

V (Perkin Elm

er Lambda

2) a una longitud de onda de 259,1 nm y 260

nm

respectivamente.

Los resultados

de disolución-liberación

se ajustan a las ecuaciones cinéticas de orden cero, prim

er orden, Higuchi y

Korsm

eyer-Peppas.

Resultados

y D

iscusión: Las

curvas de

porcentaje de ketoprofenoliberado/tiem

po(fig

1) y DK

-T/tiempo (fig.3) ponen de m

anifiesto la influencia del tipo de fárm

aco y la presencia de m

anitol en el comportam

iento matricial de la

poliesteramida.PA

DA

S retiene al K y prolonga

su liberación, cediendoal

medio

de disoluciónel 81,36 (%

) de la dosisla fórm

ula 200P K, es

decir solo poliesteramida. La sustitución parcial

delpolím

ero por manitol increm

enta de forma

moderada la liberación

de K, detectando al final

del ensayo el 97,36 %y 100 %

de la dosis para las fórm

ulas con 100 y 50 mg de PA

DA

S respectivam

ente.

Figura 1.Perfiles de liberación de ketoprofeno

La menor

cantidad de manitol incorporada (47

mg/com

primido)

en la formulación 150 PM

Korigina una liberación lenta y gradual de K

siendo

el 66,89 (%) de la dosis a las 24 h. Tras

el ensayo de liberación, los comprim

idos con 150 m

g de polímero m

antienen su morfología

yuna

superficie ligeram

ente erosionada.

Ladism

inución del contenido en polímero m

atricial (100 PM

K) increm

enta la erosiónen superficie

sin llegar a romperse la estructura m

atricial(fotografías de la fig. 2).

123

Figura 2. Com

primidos de ketoprofeno con

PAD

AS después de 24 de ensayo.

El estudio cinético (tabla 2) indica queen

las form

ulaciones con PAD

AS la liberación de K

se ajusta m

ejor a la cinética de Higuchi y el valor

del exponente

n sugiere

que el

mecanism

o principal de liberación de ketoprofeno es la difusión controlada.

Tabla 2 . Parámetros

de liberación comprim

idosketoprofeno.

PAR

ÁM

ETRO

S CIN

ÉTICO

S

CIN

ÉTICA

S200 PK

150 PMK

100 PMK

50 PMK

0 PMK

Caps.K

OR

DEN

CER

OK

03,13

2,644,03

4,46---

---

r 20,866

0,943 0,967

0,932---

---

OR

DEN

UN

OK

1-0,06

-0,04-0,13

-0,14-0,64

-21,65

r 2 0,973

0,9880,940

0,9880,931

0,963

HIG

UC

HI

KH

17,11413,963

20,97823,702

------

r 2 0,979

0,9980,990

0,994---

---

KO

RSM

EYER-

PEPPAS

KK

P16,25

12,59 13,26

3,27---

---

r 20,961

0,997 0,997

0,991---

---

n0,55

0,53 0,64

0,65---

---

PAR

ÁM

ETRO

S IN VITR

O

AB

C in Vitro (%

· h)1380,12

± 166,321065,76± 23,04

1477,93± 50,62

1732,06± 39,45

446,82±47,44

93,55±1,60

ED (%

)57,51

± 6,93

44,41±

0,9661,58

± 2,11

72,17± 1,64

74,47±

7,9193,55±1,57

TMD

(h)10,20

±1,66

13,34±

0,239,22

± 0,516,68

± 0,401,53

± 0,470,064±0,016

Los comprim

idos con DK

-T sin manitol

(200 PD

K-T),

y los de formulación 150 PM

DK

-T alcanzan el C

max a las 6 h del ensayo.

Sin em

bargo, los comprim

idos mantienen su form

a hasta el final del ensayo (24 h) com

o muestra

las fotografías de la figura 3.

Figura 3. Com

primidos de dexketoprofeno

trometam

ol tras 24 h de ensayo.

Aun

siendo de

liberación convencional,

la velocidad es algo m

ás lenta que en fórmulas con

menor

cantidad de

PAD

AS

(fig. 3).

Lapoliesteram

ida no consigue retener el DK

-T ajustándose los datos de liberación al m

odelo cinético de prim

er orden (r 2=0,992).

Figura 4.Perfiles de liberación de

dexketoprofeno trom

etamol

La incorporación de manitol en la form

ulaciónincrem

enta la

velocidad de

liberación, encontrando en el

medio de disolución la

totalidad de la dosis (100 %) entre la 1 y 4 h de

ensayo y la liberación se origina según una cinética de prim

er orden (tabla 3).

Tabla 3. Parámetros de liberación de

dexketoprofeno trometam

ol.PA

RÁ

METR

OS C

INÉTIC

OS

CIN

ÉTICA

S200

PDK

-T

150

PMD

K-T

100

PMD

K-T

50

PMD

K-T

0

PMD

K-T

Caps.

DK

-T

OR

DEN

CER

OK

013,85

14,08 ---

--- ---

---

r 2 0,854

0,735 ---

--- ---

---

OR

DEN

UN

OK

1-0,36

-0,53 -1,79

-3,33-8,60

-5,17

r 2 0,992

0,965 0,983

0,999 0,972

0,877

HIG

UC

HI

KH

38,4341,10

--- ---

------

r 20,987

0,941 ---

--- ---

---

KO

RSM

EYER-

PEPPAS

KK

H38,67

5,60 ---

--- ---

---

r 20,969

0,968 ---

--- ---

---

n0,49

0,41 ---

--- ---

---

PAR

ÁM

ETRO

S IN VITR

O

AB

C in Vitro (%

· h)2026,27±

17,152199,12±

56,402290,27±

91,162301,05± 22,23

561,96±10,36

90,17± 1,73

ED (%

)84,43

± 0,7291,63

± 2,3595,43

± 3,8095,88

± 0,9393,66±1,73

90,17±1,73

TMD

(h)3,74

± 0,172,01

± 0,561,10

± 0,910,99

± 0,220,38

± 0,100,098± 0,02

Conclusiones:

El polím

ero PA

DA

S puede

considerarse un

excipiente soporte

matricial

adecuado para la elaboración de comprim

idos. C

ontrolay prolonga

la liberación de ketoprofe-no y el m

anitolpermite m

odular esa liberación.M

uestra m

uy poca

eficaciapara

retener el

dexketoprofeno trometam

olen la matriz.

Referencias:

(1)R

odríguez et al. XX

IX C

ong Int. SFML,

Granada 2010.

(2)M

orales Jerez M. L. Tésis de licenciatura.

Granada 2010.

(3) Paredes N et al., J. A

ppl. Polymer Sci., 69

:1547-1549, 1998.

Agradecim

ientos: Trabajo financiado por la Junta de A

ndalucía (Proyecto Excelencia 2006 FQM

1370) y por la C

ICY

T (Proyecto MA

T 2006-02406).

124

DE

SAR

RO

LL

O Y

CA

RA

CT

ER

IZAC

IÓN

DE

TR

AN

SFER

SOM

AS

®D

E A

CE

TA

ZO

LA

MID

A

PAR

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L T

RA

TA

MIE

NT

O D

EL

GL

AU

CO

MA

M.J. C

ózar-Bernal, A

.M. R

abasco, N. A

bad, M.L. G

onzález-Rodríguez

Departam

entode Farm

acia y Tecnología Farmacéutica, U

niversidad de Sevilla, España

IntroducciónA

ctualmente

el fárm

aco de

elección en

el tratam

iento del

glaucoma

agudoes

acetazolamida (A

CZ)

por su efectividaden el

control de la presión intraocular. Para facilitar su adm

inistración tópica, debidoa

su baja solubilidad y permeabilidad (clase IV

,B

CS) y ante la dificultad de los liposom

as convencionales

para atravesar

intactos determ

inadas capas

de la

piel o

mucosas

quedandoacum

ulado el fármaco

en el lugar de aplicación, C

evc y Blum

e propusieron, en1992,

el diseño de vesículas elásticas, Transfersomas ®,

que poseen

una m

embrana

altamente

deformable,

y son

capaces de

atravesar el

estrato córneo sin ser destruidas, accediendoasí

a estructuras más internas.

Para ello, seincluyen en su com

posición los denom

inados “activadores del borde o margen”

en el interior de la matriz fosfolipídica, con el

fin de

incrementar

la elasticidad

ydeform

abilidad de la vesícula(El Zaafarany y

cols., 2010).

Este tipo

de sustancias

son habitualm

ente tensioactivos de cadena única, capaces

de ofrecer

un elevado

radio de

curvatura que

desestabilicen las

bicapas lipídicas

de las

vesículas e

incrementen

su deform

abilidad (H

oneywell-N

guyen y

Bouw

stra, 2005).En

el presente

trabajo se

desarrollan Transfersom

as ®de A

CZ y posteriorm

ente se caracterizarán

en cuanto

a eficacia

de encapsulación,

tamaño

vesicular, índice

de polidispersión y potencial zeta, evaluando la influencia de la adición de tensioactivos de distinta naturaleza, así com

o la adición de un agente portador de carga positiva a las vesículas y de colesterol.

Materiales y M

étodosM

aterialesA

CZ

(Acofarm

a, España),colato, desoxicolato

y taurocolatosódico, 1,2-dipalm

itoil-sn-glicero-3-fosfocolina

semisintética,

estearilamina

ycolesterol (Sigm

a Aldrich, A

lemania), H

epes, acetato de sodio, lauril sulfato sódico y dem

ás disolventes(Panreac Q

uímica S.A

., España).Estudios de solubilidadC

on el fin de obtener una formulación capaz de

incorporar la máxim

a cantidad de fármaco, A

CZ

se repartirá

entre la

bicapa lipídica

y el

compartim

ento acuoso de las vesículas. En prim

er lugar se llevará a cabo unestudio en

placas de solubilidad (Solvinert, Millipore)

en presencia

deH

epes, adicionándole

distintos

tensioactivos: colato sódico, desoxicolato sódico y taurocolato sódico, que form

arán parte de la bicapa y que van a conferir a

los liposomas la

deformabilidad deseada.

La incorporación de fármacos poco solubles en

medio acuoso, com

o es el caso de AC

Z, en form

ulaciones de liposomas, resulta un tanto

compleja.

Norm

almente,

este tipo

de com

puestos forman parte de la bicapa lipídica

de las vesículas. Sin embargo, la adición de una

fracción de la dosis en el compartim

ento acuoso puede ser beneficiosa en térm

inos de estabilidad e increm

ento de la encapsulación del fármaco.

Para ello

se ha

recurrido a

un estudio

decosolvencia con PEG

400y glicerina, con el fin

defavorecer la incorporación del fárm

acoen el

espacio acuoso. Elaboración de vesículas m

ultilaminares

Los Transfersomas ®

se elaboraron utilizando la técnica de evaporación en capa fina o B

angham

(TLE, Thin Layer Evaporation). La m

ezcla de lípidos (fosfolípidos y colesterol), el activador del borde

yla A

CZ

se disolvieron en una m

ezcla de cloroformo: m

etanol (3:2 v/v) El disolvente orgánico se evaporó bajo presión a 58 ºC

hasta obtener una fina película. Éstase

hidrató con

una solución

de H

epes/PEG400

(70:30) mediante cinco ciclos interm

itentes de vortex y calor

a 50 ºC.Tras su elaboración, se

sometieron al proceso de extrusión con el fin de

obtener poblaciones

unilaminares

más

homogéneas.Las

vesículas se almacenaron a 4

ºC hasta su uso.

Caracterización de los sistem

asPara

caracterizar correctam

ente los

sistemas

elaborados se

procedió secuencialm

ente al

estudio de

tamaño

por espectroscopía

de correlación

fotónica.Se

determinó

la carga

superficial utilizando un Zetasizer Nano

ZS.La eficacia

de encapsulación se determinó

por dos m

étodos, extracción en fase sóliday

extracción por centrífuga.Para cuantificar de form

a precisa laA

CZ, se

desarrolló un método analítico isocrático de fase

reversapor

HPLC

, cuya

fase m

óvil está

compuesta por acetonitrilo y solución de acetato

sódico 0.05 Majustada

a pH 4.1 (10:90 v/v),

utilizando un flujo de 0.8 mL/m

in. R

esultados y Discusión

Tras el estudio de solubilidad de AC

Z en los tensioactivos seleccionados, se puede observar en la figura 1,que en los tres casos, conform

e aum

enta la concentración de tensioactivo, se increm

entala solubilidad de la A

CZ en H

epes.

125

No

obstante, dicho

incremento

no es

tan considerable en presencia de taurocolato sódico debido

a la

diferente capacidad

de estos

tensioactivos para autoasociarse en estructuras agregadas

(Mithani

y cols.,

1996). Se

ha obtenido una m

ayor solubilización del fármaco

en el caso de desoxicolatosódico

debido a quese encuentra en una concentración superior al intervalo

de C

MC

, adquiriendo

una conform

ación de hélice, a diferencia de los otros tensioactivos,

que poseen

estructura m

icelarm

ayoritariamente

(Cross y cols., 2011).

Figura 1. C

antidad de ACZ solubilizada en función

dela

concentración de tensioactivos.

Para increm

entar la

cantidad de

fármaco

solubilizado en el compartim

ento acuoso, se estudió la solubilidad de A

CZ en disolventes no

polares (PEG 400 y glicerina), obteniéndose que

unadisolución

al 10%

p/v

de PEG

400

solubiliza 1.77 veces mejor que la disolución al

10% p/v de

glicerina(K

awakam

i y cols., 2006). Por ello, seleccionam

osla disolución al 10% p/v

de PEG 400 com

o codisolvente.Posteriormente,

se estableció el porcentaje de éste en la mezcla

PEG 400/H

epes.Com

o se observa en la figura 2, a m

edida que aumenta la proporción de PEG

400,

se increm

enta la

cantidad de

AC

Z solubilizada. Tam

bién se apreciaque con este

cosolvente al

40%

y al

80%,

se consigue

aumentar m

ucho más la solubilidad del fárm

aco. En relación a este hecho, hay que valorar, ante todo, que la form

ulación deestas

vesículas estará destinada a la adm

inistración oftálmica y,

por consiguiente,

no debe

superar una

proporción del 40% por lo que establecerem

os la proporción 60/40

(Row

e, 2009).

Figura 2. C

antidad de ACZ solubilizada

en función de la proporción de PEG

400.

Con respecto a la caracterización física

de los sistem

as vesiculares (tabla 1) podemos observar

una clara

diferencia entre

Transfersomas ®

extruidos y sin extruir (302nm

vs1343

nm)

mostrando un índice de polidispersión m

ucho m

ás homogéneo

las formulaciones extruidas.

En cuanto a los valores de potencial zeta,no se ven m

odificados por el proceso de la extrusión.

Tam

año (nm) IP Potencial zeta (m

V)

Cargados

SE E SE E SE E

1343 ± 381.1 302 ± 0.47 1 ± 0 0.09 ± 0.02

14.6 ± 0.9 16.7 ± 0.65

Blancos

SE E SE E SE E

1139 ± 0.23 339.2 ± 9.46 1 ± 0 0.05 ± 0.004 15.6 ± 0.9 17.7 ± 0.65

Tabla1. D

atos de tamaño, índice de polidispersión

ypotencial zeta

para lotes sin extruir(SE) y extruidos(E).

Para cuantificar la AC

Z encapsulada se han desarrollado

y com

parado dos

métodos

de extracción. C

omo se observa en la tabla 2, la

eficacia de encapsulación obtenida tras tratar las m

uestras con

ambos

métodos,

tienevalores

similares en vesículas sin extruir. Sin em

bargo, en

las m

uestras extruidas,

la eficacia

de encapsulación se ve aum

entada más de un 200%

cuando la extracción se hace con centrífuga.

EE (x ± sd)

Extracción

Fase sólidaE

xtracciónC

entrífugaSE

E

18.1 ± 10.5 10.5 ± 4.7

SE E

16.1 ± 5.3 26.8 ± 3.6

Tabla 2. Datos de eficacia de encapsulación para lotes sin

extruir(SE) y extruidos (E).

Conclusiones

A

través de

los resultados

obtenidos puede

concluirse que

los sistem

as elaborados

presentan buenas

características físicas

para atravesar intactos la barrera corneal, pudiendopresentarse

como alternativa al tratam

iento del glaucom

a por vía tópica.

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Este trabajo

se ha

desarrollado bajo la cofinanciación del Consejo

Andaluz

de C

olegios O

ficiales de

Farmacéuticos.

126

CY

CL

OSPO

RIN

E A

-LIPID

NA

NO

SYST

EM

SFO

R O

RA

L A

DM

INIST

RA

TIO

NM

. Guada, E. Im

buluzqueta, A. Estella-H

ermoso de M

endoza, M.C

. Dios-V

iéitez, M.J. B

lanco-PrietoD

epartment of Pharm

acy and Pharmaceutical Technology,

University of N

avarra, 31080 Pamplona, Spain.

IntroductionC

yclosporine A

(C

yA)

is a

neutral cyclic

peptide consisting of 11 aminoacid residues,

widely used for the prevention of transplant

organ rejection and also for the treatment of

several autoimm

une disorders. The molecule

was

first isolated fromthe fungal extract of

Tolypocladium inflatum

(1).Itsstructure and its

high molecular w

eight (1203 Da) confer

poor biopharm

aceutical properties on this substance such

as low

w

ater solubility

and low

perm

eability trough

biological barriers

(2).Therefore, it is a challenge to form

ulate an appropriate delivery system

that improves its

bioavalaibility and thus drug efficacy. To date,lipid nanosystem

s (LN) seem

to be a very

promising strategy to

overcome the lim

itationsassociated

with

certain drug

characteristics including

low

solubility, poor

permeability,

instability in the gastrointestinal medium

, P-glycoprotein

efflux and

presystemic

drug m

etabolism(3).

Based

on this,

the m

ain objective w

as to develop and characterize lipid nanocarriers for C

yA oral adm

inistration. These novel nanosystem

s areaim

edto m

odify the biodistribution of the drug, and thus prevent renal

toxicity and

enhance its

oral bioavailability.

In order

to evaluate

the encapsulation efficiency of the new

delivery system

s obtained, it was necessary to develop

and validate an analytical method

to quantifyC

yA in lipid m

atrices and also in biological sam

plesfor future in vivo

studies. The method

was based on ultra high perform

ance liquid chrom

atography combined w

ith tandem m

ass spectrom

etry (UH

PLC–M

S/MS).

Material and m

ethodsD

evelopment and validation of the U

HPLC

–M

S/MS

method

The UH

PLC system

consistedof an A

cquity U

PLCTM

system (W

aters Corp., M

ilford, MA

, U

SA).

Chrom

atography was perform

edon an

Acquity U

PLC®

BEH

C18 colum

n (50 mm

x 2.1 m

m, 1.7

m;

Waters, U

SA) w

ith am

obile phase system

consistingof a gradient elution

program of a 2 m

M am

monium

acetate solutionw

ith 0.1% form

ic acid and methanol and w

ith a flow

rate of 0.6 mL/m

in. Colum

n temperature

was m

aintained at 50oC

. The mass spectrom

eterdetection w

as performed on an A

cquityTM

TQD

(Triple Q

uadrupole Detector) m

ass spectrometer

(Waters C

orp., Milford, M

A,

USA

) with an

electrospray ionization (ESI) interfaceoperated

in positive mode. The apparatus w

as set up for

multiple reaction m

onitoring (MR

M) to m

onitor the transition of m

/zfor C

yA

and the

transition of

m/z

amiodarone, used as

internal standard(IS). The

method

was validated in term

s of linearity, accuracy and betw

een- and within-day precision

for both lipid matrices and biological sam

ples.

Application of the U

HPLC

–MS/M

Sm

ethod todeterm

inate CyA

in blood samples

This study was perform

ed in two groups of

BA

LB/c m

ice(n=6). A

nimals w

ere given a single dose of 10 m

g/kg of CyA

as comm

ercial form

ulations either orally (p.o.) (Sandimm

un N

eoral ®) or intravenously (i.v.) (Sandimm

un®).

Whole blood sam

ples were w

ithdrawn at 0 h

(only after i.v. administration), 1 h, 2 h, 5 h, 8 h,

24 h and 48 h. Finally, samples w

ere pretreated w

ith a protein precipitation method and C

yA

was quantified by the U

HPLC

-MS/M

S method.

Preparation and

characterization of

the LN

form

ulationsLN

w

ere prepared

by hot

homogenization

followed by ultrasonication m

ethod(4). B

riefly, 200 m

g of lipid (Precirol ®A

TO 5) and 5 m

g ofC

yA w

ere melted at 70 °C

(slightlyabove

of the lipid m

elting point). Then, 10 mL of a surfactant

aqueous solution (mixtures of

2% polyvinyl

alcohol (PVA

) and 2% sodium

taurocholate (TC

)) (table

1), preheated

at the

same

temperature

were

addedand hom

ogeneously dispersed by

ultrasonicationfor 4

min. Finally,

the formed em

ulsion was cooled in an ice bath

inorder to obtain a nanoparticle

suspension, w

ashed three times

and lyophilized. Particlesize,

polydispersity index

(PDI)

and zeta

potentialof the LNw

ere evaluated by dynamic

light scattering

technique and

laser D

oppler electrophoresis, respectively, using a Zetasizer N

ano(M

alvern Instrum

ents, U

K).

Encapsulation efficiency (EE) was determ

ined by

the U

HPLC

-MS/M

S m

ethod described

above.

Results and discussion

Validation of the U

HPLC

–MS/M

Sm

ethodThe m

ethod was linear in the range of 0.001

g/mL-2.

whole blood. A

ccuracy and precision expressed in coefficient of variation w

ere below 15%

. R

ecoveries in the case of whole blood sam

ples w

ere above 98.72%. This analytical m

ethod proved to be suitable and sensitive enough to allow

a complete pharm

acokineticstudy of C

yA

127

in mice and to evaluate the contained drug in the

new LN

formulations.

Blood

concentration-time

profile of

CyA

in

comm

ercial formulations

CyA

blood

concentration w

as quantified

in order

to determ

ine the

pharmacokinetic

behaviorof

the drug

when

administered

as Sandim

mun

®or Sandim

mun N

eoral ®. Figure 1 depicts the concentration-tim

e courseof C

yAafter its oral and intravenous adm

inistration. The

drug follow

edthe

typical blood

concentration-time

profile of

these adm

inistration routes.

This study

will

be a

benchmark

for com

parison w

ith the

pharmacokinetic behavior

of CyA

administered

as new nanocarrier system

s, and confirmed the

suitability of

the U

HPLC

–MS/M

S m

ethoddeveloped.

Figure 1. CyA

concentration-time profiles after i.v

and p.o

administration

of Sandim

mun

®and

Sandimm

un Neoral ®, respectively, in B

ALB

/c mice

(n=6).

Characterization of LN

formulations

Table 1 summ

arizes the characteristics of the LN

form

ulationsdeveloped.

Nanoparticles

containing PVA

in the formulation presented

mean diam

eters below 250 nm

, which m

ake them

suitable for oral administration H

owever,

LN form

ulated with 100%

of TC (LN

(0:100))show

ed a larger particle size, probably due to the inadequate surfactant effect of TC

in this condition.

Therefore, this

formulation

was

discarded for further studies. PDI w

ere below

0.2 in all the cases, indicating that LN w

ith a narrow

size

distribution w

ere obtained.

Moreover, zeta potential w

as negative in all LN

formulations,

decreasing w

henthe

TCconcentration in the form

ulation was increased

(-23.0m

V for LN

with 0%

of TCto -37.5 m

V

for LN w

ith 100%of it, table 1). Finally, all

formulations achieved a high drug encapsulation

close to 100%.

Table 1.

Physico-chemical

characteristicsof

LN

formulations loaded w

ith CyA

LN

Form

ulation(PV

A:TC

)

Size (nm

)

ZetaPotential

(mV

)

EE(%

)

LN (100:0)

241.8-23.0

99.99LN

(75:25)223.0

-26.899.99

LN (50:50)

227.9-27.5

97.17LN

(25:75)220.1

-30.599.99

LN (0:100)

537.7-37.5

91.55PV

A: polyvinyl alcohol, TC

: sodium taurocholate, EE:

encapsulation efficiency

These LN form

ulations will be evaluated in

future in vivostudies, designed to

reduce the variability

in bioavailability

observed w

ith com

mercially available oral C

yA form

ulationsand to avoid

toxicity due to high concentrations.

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E FO

RM

UL

AC

ION

ES L

IPOSO

MA

LE

S OFT

ÁL

MIC

AS C

ON

V

ITA

MIN

A C

PAR

A E

L T

RA

TA

MIE

NT

O D

EL

SÍND

RO

ME

DE

OJO

SEC

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acia, Universidad de A

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adrid, España.4U

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cular (USIO

), Hospital C

línico San Carlos, U

niversidad Com

plutense de Madrid, España.

Introducción

El Síndrom

e de

Ojo

Seco (SO

S) es

una enferm

edad multifactorial de la lágrim

a y de la superficie ocular que cursa con síntom

as de disconfort, alteraciones visuales e inestabilidad en la película lagrim

al con riesgo de dañarla

superficie ocular 1.A

ctualmente no existe ningún tratam

ientoeficaz

para el SOS debido a la com

pleja composición y

carácter dinámico de la película

lagrimal. Las

lágrimas artificiales

constituyen el tratamiento

de elección

en cualquier

estadio de

la enferm

edad.Los

sustitutoslagrim

ales com

ercializados no incluyen la totalidad de los com

ponentes dela lágrim

a natural. No obstante,

haincrem

entadoel núm

ero de formulaciones

oftálmicas

con sustancias

para m

ejorar la

película lagrimal desestabilizada, com

o es el caso

de la

vitamina

C.

El ácido

ascórbico presenta propiedades antioxidantes protegiendo la

superficie ocular

del daño

oxidativo y

favorecela producción de lágrim

anatural 2.En

solución acuosa es altamente inestable por lo

que se recurre al empleo de derivados com

o son el ascorbato sódico, el palm

itoil-L-ascórbico y la sal trisódica 2-fosfo-ascórbica

(SAP).

Debido a la im

portancia de la película lipídica se han desarrollado

formulaciones con lípidos

en forma de liposom

as, capaces de incorporar los dos derivados de la vitam

ina C, palm

itoil-L-ascórbico y SA

P, incluidos en la bicapa lipídica o

en el

núcleo acuoso

de las

vesículas respectivam

ente. El objetivo de este estudio es

el desarrollo de form

ulacionesde adm

inistración tópica ocular con una

composición sem

ejante a la lágrima

natural capaces de estabilizar el filmlipídico

mejorando la calidad de la lágrim

a.

Materialesy M

étodos

Materiales

Fosfatidilcolina(PC

) obtenida de lecitina de soja

(Phospholipon

90G®

, Phospholipid

Gm

bH). C

olesterol (Cht),

-tocopherol (Vit. E),

ácido ascórbico, ascorbato sódico, palmitoil-L-

ascórbico y sal trisódica 2-fosfo-L-ascórbico (Sigm

a Chem

ical Co.).

Estudios prelim

inares de

estabilidad de

soluciones con ácido ascórbico y derivados

Determ

inación del

%

remanente

de ácido

ascórbico, ascorbato

sódico y

SAP

en soluciones acuosas (PB

S isotónico pH 7,2) por

espectrofotometría

UV

-Vis

respectivamente.

Muestras protegidas de la luz y alm

acenadas a tem

peratura ambiente (25°C

) y nevera (2-7°C).

Método de preparación de las form

ulacionesliposom

alesSe

han elaborado

dosform

ulaciones liposom

ales(F-1 y F-2) de acuerdo con la

técnica deevaporación del solvente orgánico

3

modificada por B

enitez et al 4.Los com

ponentes de la bicapa lipídica de laform

ulación liposom

al F-1

son PC

:Cht:V

it E:palm

itoil-L-ascórbico8:1:0,8:0,9

(ratio m

g/mL).

Com

o m

edio de

dispersión se

ha em

pleado PBS isotónico (280 m

Osm

/L). La bicapa lipídica de la form

ulación liposomal

F-2contiene

PC:C

ht:Vit

E 8:1:0,8

(ratio m

g/mL) utilizándose com

o medio de dispersión

una solución de SAP en PB

S isotónico. A

fin de homogeneizar el tam

año y la estructura de las vesículas form

adas, se ha procedido a lasonicación y posterior extrusión (Extruder ®)

en cascada a través de

filtros de policarbonato (N

ucleopore Lipex Biom

embrane

TM),10 ciclos a través de m

embranas con tam

año de poro de 0,8

m y 10 ciclos a través de m

embranas con

tamaño de poro de 0,22

m.

La concentración de PC y vitam

ina C expresada

como ácido ascórbico en F-1 y F-2

ha sido de 40 m

g/ml y 300

g/ml respectivam

ente.C

aracterizaciónde

las form

ulaciones liposom

alesSe ha analizado el tam

año de las vesículas lipídicas

por espectroscopia

de correlación

fotónica em

pleándose un

equipo Zetasizer

3000HR

(Microtrac Inc).

Del m

ismo m

odo se ha estudiado elpH (C

risonG

LP 21)a tem

peratura ambiente

y osmolaridad

(Knauer K

-7000) a una temperatura de 33ºC

5.Estudios de tolerancia in vitroLa tolerancia in vitro

de las formulaciones se ha

determinado

a través de medidas de viabilidad

celular en

dos líneas

celulares:conjuntiva

humana

(IOB

A-N

HC

) y

córnea hum

ana (H

uman C

orneal-Limbal Epithelial C

ells).La evaluación de la tolerancia se ha basado

en la técnica delM

TT a tiempos de exposición cortos

129

(15 minutos) para sim

ular tratamientos breves y

largos (1 y 4 horas)para sim

ular tratamientos

crónicos. Com

ocontrol positivo de viabilidad se

ha empleado

células tratadas con una solución de cloruro de bezalconio (B

AC

) al 0,005% y

como control negativo (viabilidad del 100%

) células sin tratar 6.

Resultadosy D

iscusión

Estudios prelim

inares de

estabilidad de

soluciones con ácido ascórbico y derivadosEl SA

P presenta una estabilidad en solución acuosa durante al m

enos 7 días, sin presentar diferencias significativas con la concentración inicial (p>0,05) tanto a tem

peratura ambiente

como a 2-7°C

. Sin embargo, las soluciones de

ácido ascórbico y ascorbato sódico muestran

una reducida estabilidaden am

bas condiciones de alm

acenamiento

(Fig. 1 y Fig. 2).

Figura 1. Estabilidad de las soluciones de ácido ascórbico, ascorbato sódico y SAP en PBS isotónico alm

acenadas a tem

peratura ambiente

(25°C).

Figura2. Estabilidad de las soluciones de ácido ascórbico,

ascorbato sódico y SAP en PBS isotónico almacenadas en

nevera (2-7°C).

Caracterización

de las

formulaciones

liposomales

Las form

ulaciones liposom

ales F-1

y F-2

presentan una

distribución de

tamaño

de partícula

unimodal

(Fig.3)

con valor

de diám

etro medio volum

en 149,6±9,6nm

para F-1 y de 169,7±5,5

nm para F-2.

Figura 3. Distribución de tam

año de partícula de las form

ulaciones liposomales F-1 y F-2 (n=

3).

El valor de pHde am

bas formulaciones resultó

ser próximo a la neutralidad y una

tonicidad fisiológica (Tabla 1).

Formulación liposom

alpH

Osm

olaridad (m

Osm

/L)

F-17,03 ± 0,04

289,1 ± 4,4F-2

7,09 ± 0,13285,7 ± 3,0

Tabla 1. Valores de pH y osm

olaridad F-1 y F-2 (promedio

±D

E) (n=3).

Estudios de tolerancia in vitroLos valores de viabilidad celular m

edios son superiores al 80%

en ambas líneas celulares

ensayadas (cornea

y conjuntiva)

para los

distintos tiempos de exposición ensayados (Fig.

4 y Fig. 5).

Figura 4.Valoresde viabilidad celular de las formulaciones

F-1 y F-2 en la línea celular de córnea humana.

Figura 5.Valoresde viabilidad celular de las formulaciones

F-1 y F-2 en la línea celular de conjuntiva humana.

Conclusiones

Las form

ulaciones liposom

ales F-1

y F-2

desarrolladas en el presente trabajo presentan propiedades óptim

as para su aplicación por vía tópica

oftálmica.

Los estudios

de viabilidad

celular confirman una tolerancia adecuada en

células que conforman la superficie ocular.

Am

bas formulaciones presentan características

apropiadas para el tratamiento de los síntom

as del Síndrom

e de Ojo Seco.

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rupo de Investigación U

CM

920415(G

R35/10-A

). D

r. Ilene K. G

ipson (Schepens Eye Research Institute,

Harvard M

edical School, Boston, M

A-EEU

U) por la línea

celular de córnea humana.

0 20 40 60 80100

02

46

824

168

% Remanente

Tiempo (horas)

Ácido

Ascórbico

Ascorbato

sódicoSA

P

0 20 40 60 80100

02

46

824

168

% Remanente

Tiempo (horas)

Ácido

Ascórbico

Ascorbato

SódicoSA

P

0 5 10 15 20 25

110

1001000

10000

Frecuencia (%)D

iámetro (nm

)

F-1

F-2

0 20 40 60 80

100

Control

negativoF-1

F-2C

ontrolpositivo

% Viabilidad celular

15minutos

1 hora

4 horas

0 20 40 60 80100120

Control

negativoF-1

F-2C

ontrolpositivo

% Viabilidad celular

15minutos

1 hora

4 horas

130

DE

VE

LO

PME

NT

AN

D C

HA

RA

CT

ER

IZAT

ION

OF SU

RFA

CE

-MO

DIFIE

D PL

GA

N

AN

OPA

RT

ICL

ES FO

R C

AN

NA

BIN

OID

S OR

AL

DE

LIV

ER

YI.M

uñoz-Rubio,L. M

artín-Banderas, J. Á

lvarez-Fuentes,M. Fernández-A

révalo, M.A

. Holgado

Departm

ent of Pharmacy and Pharm

aceutical Technology, Faculty ofPharmacy, U

niversity of Seville,c/ Profesor G

arcía González, nº 2, 41012 Seville, Spain

holgado@us.es

Introduction: PLG

A

nanoparticles (PLG

A-

NPs)

haveproved

to be

very efficient

in im

proving drug

absorption after

oral adm

inistration. H

owever,

PLGA

-NPs

have som

e difficulties

which

tendsto

limit

their intracellular

uptake leading

a low

er bioavailability, such as a slight negative surface charge

or the

recognition on

the reticulo-

endothelial system

(R

ES)of

hydrophobic particles

as foreign

(1). To

solve these

limitations,

modification

of N

Psurface

properties can be achieved either by coating NP

surface with hydrophilic stabilizing, bioadhesive

polymers and

surfactants or by incorporating biodegradable

copolymers

containing a

hydrophilic moiety

(2). In the present w

ork CB

13, 1-Naphthalenyl[4-

(pentyloxy)-1-naphthalenyl] m

ethanonehave

been em

ployed as

a m

odel drug.

It is

a C

B1/C

B2 dual agonist w

hich displays potent antihyperalgesic activity in anim

al models and

limited brain penetration. O

n the other hand, C

B13

is a

cannnabinoid derivate

highly lipophilic w

hich belongs to class II compounds,

and as a consequence of its poor solubility and dissolution

in the

gastrointestinal fluids,

is incom

pletely absorbed (3).The objective of our w

ork is to elaborate CB

13-loaded-PLGA

NPs

and to modify their surface in order to im

prove C

B13 oral bioavailability.

Materials

and M

ethods: 1-N

aphthalenyl[4-(pentyloxy)-1-naphthalenyl]m

ethanone (CB

13) (Tocris, G

reat Britain), R

esomer®

RG

502H

(PLGA

) (B

oehringer Ingelheim

, G

ermany),

Chitosan low

MW

, Span® 60, Tw

een® 80,

Pluronic® F-68 and C

oumarin-6 and N

ile-red as fluorochrom

es (Sigm

a-Aldrich,

Germ

any). Eudragit

RSPO

(Mw

: 32,000 g/mol)

was a

generous gift

from

EvonikR

öhm

Gm

bH

(Germ

any). A

cetone PR

S, H

PLC-grade

acetonitrile, acetic

acid and

DM

SO

were

purchased from Panreac (Spain); threalose and

HC

l were obtained from

VW

R (Spain). V

itamin

E (BA

SF Chem

Trade Gm

bH, G

ermany)

and lecithin (C

argill Texturizing Solutions, Spain). Form

ulation of the PLGA particles:

The NPs w

ere prepared by a nanoprecipitation m

ethod (4). Briefly, a co-solution of PLG

A

(1.5% w

/v) and Span®60 (0.5%

w/v) in acetone

was added dropw

ise at 5 mL/h using a syringe

pump

into 15

mL

Pluronic®

F68 aqueous

solution (0.5% w

/v) under magnetic stirring.

After acetone evaporation,

the suspension was

centrifuged to collect the NPs. A

fter washing

twice, the N

Ps were re-suspended in a threalose

aqueous solution

(5%

w/v)

used as

cryoprotectant and then, the NPs w

ere freeze-dried.

For C

B13-PLG

A

loaded N

Ps, the

polymer and drug w

ere co-dissolved in acetone. N

Ps surface modification:

To produce surface modified-PLG

A N

Ps, four m

ucoadhesive additives were assayed: C

hitosan, Eudragit

RSPO

, Lecithin,

and V

itamin

E. A

dditives, at different concentrations, were co-

dissolved in the polymer solution, except for

chitosan, which w

as added in an additional step (after N

P formation).

Characterization

methods:

the m

ean particle

size and

particle size

distributions w

ere m

easured at

room

temperature

by laser

scattering (Partica

LA-950

V2,

Horiba).

Geom

etry and

surface m

orphology w

ere determ

ined by scanning electron microscopy

(SEM) (Philips X

L-30, Philips Electron Optics)

and transmission electron m

icroscopy (TEM)

(Philips CM

-10, USA

).NPs surface

chargew

asevaluated by m

easuringzeta potential values

(ZP) at r.t. (Malvern M

astersizer 2000). CB

13 content

was

determined

by H

PLC

(Hitachi

LaChrom

(D-7000) Series) and expressed in

terms of entrapm

ent efficiency (EE %).

For in vitrodrug release, N

Ps samples

were

suspended in

phosphate buffer

(pH=7.4)

containing 0.1%w

/v of Tween®

80, maintained

at37 ºC and stirred m

echanically.Aliquots w

ere w

ithdrawn at fixed tim

e intervals and filtered upon centrifugation at 10000 rpm

. The filtered sam

ple was injected into

the HPLC

apparatus for the evaluation of C

B13

(5). Ex vivo

assays were also carried out in order to

evaluate the mucoadhesion properties of each

sample. For this purpose

the falling liquid film

technique was carried out (6).

Results

andD

iscussion: The

main

physicochemical characteristics of PLG

A-N

Ps surface-m

odified (CB

13-loaded or non-CB

13-loaded) w

ere listed in Table 1 in terms of

particle size (nm), drug encapsulation efficiency

(%) and ZP

(mV

).Related to particle size,N

PP m

ethod allow

ed obtaining

particles in

the nanoscale range w

ith almost narrow

particle size distribution in all form

ulations. Studying each form

ulation in deep, there are obtained expected

results. For

PLGA

-Eu-NPs,

was

obtained the smallest particle size. H

owever,

when N

Ps were incubated in C

S (PLGA

-CS-

131

NPs)

mean

diameter

of the

nanoparticles increased up to 45

%.

Different values for ZP w

ere obtainedas a

function of the additive employed. ZP values for

plainPLG

A-N

Ps were

used as control.PLGA

-Tc-N

Ps and

PLGA

-Lc-NPs

showed

slighter negative value. H

owever, the PLG

A-Eu-N

Ps and PLG

A-C

S-NPs ZP values w

ere stronglypositive. So, these tw

o formulations are a priori

the most suitable

for an oral administration.

PLG

A-N

PsSize ± SD

(nm)

ZP ± SD(m

V)

EE

± SD (%

)

Control N

Ps Blank

289,65 ± 97,90 -32,70 ± 0,50-

ControlN

Ps CB

13322,34 ± 113,55

-35,60 ± 1,1071,04

± 2,33E

u-NPs B

lank309,65 ± 113,33

16,10 ± 1,40-

Eu-N

Ps CB

13325,31 ± 131,80

11,80 ± 0,6085,45 ± 3,09

CS-N

Ps Blank

337,75 ± 116,3357,70 ± 2,90

-C

S-NPs C

B13

420,07 ± 193,0059,00 ± 1,10

91,59 ± 0,87L

c-NPs B

lank296,65 ± 103,50

-21,00 ± 1,70-

Lc-N

Ps CB

13337,79 ± 125,10

-16,10 ± 0,4080,85 ± 1,98

Tc-N

Ps Blank

320,97 ± 119,70-18,80 ± 0,40

-T

c-NPs C

B13

343,71 ± 173,20-17,10 ± 0,50

77,78 ± 2,82

Table 1. Physicochem

icalcharacteristics

and drug loading

of PLGA

-NPs surface-m

odified.

SEM and TEM

micrographs for C

B13-PLG

A-

NPs surface-m

odifiedN

Ps showed in all cases

spherical and smooth particles (data not show

n).R

esults obtained

for drug

contentare

summ

arized in Table 1.In terms of entrapm

ent efficiency (EE %

), high values were achieved

for all formulations of N

Ps developed, due to the poor solubility of C

B13 in the external

aqueous phase. In all cases EE was superior to

70%, reaching a higher value to 90%

forPLGA

-C

S-NPs.

The representative CB

13 in vitrorelease profile

from PLG

A-N

Ps surface modified show

ed the typical

drug release

mechanism

s in

PLGA

-based

delivery system

s. M

oreover, after

conducting the

test during

15 days,

no hydrolysis

products w

ere detected

CB

13 or

degradation, indicating that the system keeps the

CB

13 in

the structure

of the

developed nanocarrier(data not show

n).Finally, the results of m

ucoadhesion properties for

PLGA

-Eu-NPs

and PLG

A-C

S-NPs

are show

n in figure 3. Forthis assay, NPs w

ere died w

ithnile red. A

freshly excised porcine small

intestine 15

cm

pieces w

ere cut

fromthe

intestine (duodenum

, jejunum

and

ileum

sections) and washed w

ith physiological saline (37°C

). Then, 600 L of N

Ps suspension in PBS

(or dye

solution, as

control) w

ere added

dropwise, this step w

as repeated ten times. The

fluorescence intensity

of the

final residual

solution was m

easured with a plate reader

=380/40 nm

460/40 nm). A

s it can be seen in figure 1, C

S-PLGA

NPs show

ed the higher

mucoadhesion

strength.These

results w

ere in accordance with ZP values obtained.

Figure 1. Mucoadhesion

strength of PLGA

NPs

containing CB

13 (error bar: SD)

Conclusions: D

ifferent additives to modify the

surface of CB

13 loaded-PLGA

nanoparticles have been em

ployed in order to improve C

B13

oral bioavailability. After in vitro

and in vivoevaluation,

NPs

containing chitosan

and Eudragit

RSPO

w

ere the

most

suitableform

ulations. For these additives, NPs

were

300-420 nm in diam

eter and presented positive ZP values w

hich improved the

mucoadhesion

strength to the intestinal mucosa as ex vivo

assays demonstrated.

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potent, orally

bioavailablehum

an C

B1/C

B2

dual agonist with antihyperalgesic properties

and restricted

central nervous

system

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support from

Junta de A

ndalucía, Spain, Project P09-CTS-

5029, is gratefully acknowledged. I. M

-R. is

specially grateful for the financial support fromC

onsejo A

ndaluz de

Colegios

Oficiales

de Farm

acéuticos, Spain.

132

EST

UD

IO C

OM

PAR

AT

IVO

DE

FOR

MU

LA

CIO

NE

S DE

GEM

CIT

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N-E

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POR

AC

IÓN

DE

DISO

LV

EN

TE

S Y FL

OW

FOC

USIN

G®

J.L. Arias 1, L. M

artín-Banderas 2, M

.M. D

urán-Lobato2, J.Á

lvarez-Fuentes 2, M. Fernández-A

révalo2,

M.A

.Holgado

2

1Dpto.de Farm

aciay Tecnología Farm

acéutica, Universidad de G

ranada, España. 2D

pto. de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de Sevilla, España.

e-mail: holgado@

us.es

Introducción: U

no de

los principales

problemas relacionados con la quim

ioterapia em

pleada en clínica actualmente es

la reducida acum

ulación que el agente antitumoral alcanza

en la

masa

de células

malignas.

Diversos

factores contribuyen

a esta

situación, por

ejemplo,

una intensa

metabolización

(y aclaram

iento presistémico), junto a una extensa

distribución de

la sustancia

activa en

el organism

o. A

demás,

los antineoplásicos

utilizados suelen caracterizarse por una escasa especificidad de acción (1).U

n claro ejemplo de

esta situación

lo constituye

la gem

citabina: m

olécula que

tiene una

muy

rápida m

etabolización sistémica

(t1/2< 17 m

in) (2). R

ecientemente,

se ha

propuesto su

incorporación en

coloides biodegradables

de naturaleza polim

érica para optimizar su eficacia

y seguridad en el tratamiento de diversos tipos

de cáncer (2, 3).Su vehiculización en estos

sistemas intenta asegurar la concentración de la

dosis de este quimioterápico en la m

asa tumoral,

a la

vez que

pretendeuna

mínim

a biodistribución.

En este sentido, la poli( D,L-lactida-co-glicolida)

(PLGA

) puede

presentar interesantes

posibilidades com

o m

atriz biocom

patible y

biodegradable, am

pliamente

utilizada en el diseño de nanopartículas (NPs)

para el transporte de fármacos (4).

El objetivo

dela

presente contribución

es diseñar y optim

izarN

Ps de PLGA

conteniendo clorhidrato de gem

citabina, como nanocarriers

de este antineoplásico. Para ello, se compararon

dos técnicas

de síntesis

mediante

diversas caracterizaciones fisicoquím

icas: el método de

doble emulsión con evaporación de disolventes

(DE/SEV

) y

la novedosa

técnica de

Flow

Focusing®

(FF).

Materiales y M

étodos:El agua utilizada en

todos los

experimentos

fue desionizada

y filtrada antes de su uso (M

illi-Q,

Millipore,

Francia). Todos los reactivos utilizados tenían calidad analítica (Sigm

a-Aldrich, A

lemania).

En los dos métodos de síntesis de N

Ps de PLGA

se utilizó idéntica cantidad polím

ero (2.5%, p/v)

disuelto en

etilacetato.Se

desarrollaron 2

formulaciones (sin carga de fárm

aco y cargadas)para cada m

étodo de elaboración empleado.La

síntesis de NPs de

PLGA

mediante D

E/SEV y

FFha sido previam

ente puesta a punto por

nuestro grupo de investigación (5), siendo las únicas variantes introducidas en este trabajo: (a) la velocidad de agitación (8000 rpm

)en el

método

DE/SEV

,y

(b)las

velocidades del

fluido enfocante

(mezcla

agua:etanol 1:1,

2 m

L/min) y del fluido enfocado (em

ulsión A/O

,fase

acuosa: solución

de gem

citabina, fase

oleosa: PLGA

en etilacetato, 0.1 mL/h), para el

método de FF.

La caracterización fisicoquímica de las N

Psobtenidas

se realizó

mediante

SEM

y PC

S (geom

etría), y electroforesis (potencial zeta, ,

en función del pH del m

edio de dispersión). La incorporación de gem

citabina en las partículas de PLG

A y su posterior liberación in vitro (37

ºC y pH

7.4, método de diálisis) se cuantificó

mediante

un m

étodo validado

de espectrofotom

etríaU

V-V

is(269

nm).

La vehiculización de este principio activo se indicó en térm

inos de entrapment efficiency (EE

%).

Todos los

experimentos

se realizaron

por triplicado.

Resultados y D

iscusión:El m

étodo de síntesis basado en la técnica FF perm

itió obtener NPs

con una distribución de tamaños notablem

ente hom

ogénea (655

± 79

nm,

índice de

polidispersión: 0.054). Sin embargo, la técnica

de D

E/SEV

condujo a

la preparación

de m

icropartículas con

una heterogénea

distribución de

tamaños

(3800 ±

1300 nm

, índice

de polidispersión:

0.257). En

ambos

casos, la incorporación de gemcitabina en las

partículas no tuvo una clara influencia en la geom

etríade

éstas,m

ostrandosiem

pre una

morfología esférica.

Por otro lado, en comparación con el m

étodo D

E/SEV, se lograron valores de EE

(%) de

gemcitabina m

uy superiores mediante el m

étodo FF

(figura 1).

Por ejem

plo, cuando

la concentración utilizada de fárm

acoera 1 m

M,

este parámetro pasó de 57.5 ± 5.2 %

(DE/SEV

) a 97.3 ± 0.1 %

(FF).Com

o puede apreciarse en la

figura, existe

un efecto

positivo de

la concentración de agente antitum

oral utilizada sobre

la incorporación

alcanzada en

las partículas de PLG

A.D

e forma com

plementaria,

las determinaciones de los valores de potencial

zeta de las partículas de PLGA

(cargadas con gem

citabina y sin carga) tuvieron como objetivo

principal la estimación cualitativa del tipo de

133

vehiculización obtenida en los dos tipos de síntesis: adsorción superficial o absorción en m

atriz.

Figura 1.Valores de

EE(%

) de gemcitabina en

las partículas de PLGA

en función del método

de elaboración: y

.

Com

o puede

apreciarse en

la figura

2, los

perfiles electrocinéticos

de las

partículas cargadas con fárm

aco coinciden con aquéllos correspondientes a las partículas sin carga. Estos resultados

ponen de manifiesto que el tipo de

incorporación lograda ha sido la absorción en m

atriz. Por otro lado, queda patente que el tipo de

síntesis utilizada

no influye

en las

propiedades electrocinéticasen función del pH

() de las partículas de PLG

A.

Figura 2.

Potencial zeta

(,

mV

) de

las partículas

de PLG

A

sin fárm

aco (m

étodo

del pH y a fuerza iónica constante (K

NO

310

-3

M).

Por último, la preparación de las partículas de

PLGA

m

ediante la

técnica FF

asegura una

liberación de gemcitabina m

ucho más sostenida

en el

tiempo,

lo cuál

unido al

tamaño

nanométrico

del sistem

a, hace

que esta

estrategia de formulación sea a priori

la más

idóneapara

fines terapéuticos.

La figura

3 m

uestra cómo en am

bos casos el perfil de liberación es bifásico, si bien m

ás rápido en el caso de las m

icropartículas (DE/SEV

, completo

en 72 h). La liberación de gemcitabina desde las

nanopartículas preparadas

mediante

FF

transcurre con una primera fase de liberación

rápida del fármaco situado

más externam

ente en la m

atriz ( 30 %

en 6 h), seguida de una fase lenta (com

pleta en 102 h)debida a

la difusión de este agente y a la degradación polim

érica.

Figura 3.Perfiles de liberación de gemcitabina

(%) desde las partículas de PLG

A preparadas

en una solución tam

pón NaO

H-K

H2 PO

4 (pH 7.4 ± 0.1) a 37.0 ±

0.5 ºC.

Conclusiones:

Se han

comparado

dos estrategias de síntesis

de partículas de PLGA

cargadas

con gem

citabina. Este

estudio ha

demostrado

que el método FF es claram

ente m

ejor que el DE/SEV

: se obtienen partículas m

ás pequeñas, con una mayor capacidad de

carga del

antitumoral

y con

un perfil

de liberación m

ucho más sostenido en el tiem

po. La utilidad de estas nanopartículas en

la mejora

de la actividad de gemcitabina se encuentra

en evaluación in vitro

ein vivo.

Referencias:

(1)D

avis ME et al. N

anoparticle therapeutics: an em

erging treatment m

odality for cancer. N

at. Rev. D

rug Dicov. 2008;7:771-82.

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to deliver gemcitabine to cancers. C

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gemcitabine

developed as

chitosan nanoparticulate

system.

Biom

acromolecules. 2011;12:97-104.

(4)H

olgado M

A

et al.

Possibilities of

poly( D,L-lactide-co-glycolide) in

the form

ulation of

nanomedicines

against cancer. C

urr. Drug Targets. 2011;12:1096-

111.(5)

Cózar-B

ernal M

J et

al. Insulin-loaded

PLGA

microparticles: flow

focusing versus double

emulsion/solvent

evaporation. J.

Microencapsul. 2011;28:430-41.

Agradecim

ientos:Ingeniatrics

Tecnologías S.L., Sevilla, España; Proyecto FIS 11/02571 (Instituto de Salud C

arlos III, España).

134

CY

CL

OD

EX

TR

IN-PO

LY

(AN

HY

DR

IDE

) NA

NO

PAR

TIC

LE

S FOR

TH

E O

RA

L

DE

LIV

ER

Y O

F CA

MPT

OT

HE

CIN

J. Huarte, S. Espuelas, J.M

. Irache

Departm

ent of Pharmacy and Pharm

aceutical Technology;University of N

avarra,

Pamplona, Spain

Introduction:

Cam

ptothecin (C

PT) is

a topoisom

erase I

inhibitor that was first isolated from

the bark of C

amptotheca acum

inatain 1966. A

though it show

s powerful anticancer activity, it has great

limitations such as poor solubility and stability

[1].

Figure 1. Cam

ptothecin. Chem

icalstructure.

When adm

inistered orally, camptothecin and its

analogues display a high variability and a low

bioavalability due

to their

physicochemical

characteristics and their presystemic m

etabolismw

ich has been related with the fact that they are

substrates of both the intestinal P-glycoprotein (P-gp)

and the

cytochrome

P450 enzym

e com

plex (CY

P 450)[2].

Recently,

the com

bination betw

een cyclodextrins and poly(anhydride) nanoparticles have been found to be effective to increase the ex

vivoperm

eability [3]

and the

oral bioavailability

[4] of

paclitaxel. These

cyclodextrin-poly(anhydride) nanoparticles

would conduct the loaded drug to the surface of

the enterocyte in which their cargo w

ould be released.

Then, the

presence of

the oligosaccharide w

ould inhibit the activity of both P-gp and C

YP450 allow

ing the absorption of the anticancer drug.

The aim

of

this w

ork w

as to

prepare and

characterizeC

PT-loaded nanoparticles. For this purpose, three different cyclodextrins have been studied:

sulfopropylated--cyclodextrin

(SP-N

P), hydroxypropyl-

-cyclodextrin (H

P-NP)

and methyl-

-cyclodextrin (M-N

P).

Materials and M

ethods:

Materials

Poly(methyl vinyl ether-co-m

aleic anhydride) or poly(anhydride)

(Gantrez®

A

N

119; M

W200,000) w

as kindly gifted by ISP (Barcelona,

Spain). Sulfopropylated-

-cyclodextrin w

as provided

by C

yclolab (H

ungary), hydroxypropyl-

-cyclodextrin and

methyl-

-cyclodextrin

were provided by Sigm

a (Spain).C

PT was purchased from

21CEC

PX PH

AR

M

Ltd (UK

). Acetone w

as obtained from V

WR

Prolabo

(Fontenay-sous-Bois,

France).

prepared by

a w

ater purification

system

(Wasserlab,

Pamplona,

Spain). A

ll other

chemicals and solvents used w

ere of analytical grade.

CPT-C

D-PVM

/MA nanoparticles preparation

Nanoparticles containing C

PT were prepared by

a solvent

displacement

method

previously described [3] w

ith some m

odifications. Briefly,

100m

g of

poly(anhydride), 18

mg

of cyclodextrin and a 4.5m

g of CPT (1:1 m

olar ratio of C

D:C

PT) were dispersed in 5 m

l of acetone.

Inmediately,

the nanoparticles

were

formed by the addition of ethanol and w

ater.A

fter elimination of the organic solvents, the

resulting suspensions were filtered through a

0.45 m

m

embrane

andpurified

twice

by centrifugation. The supernatants w

ere removed

and the pellets resuspended in water. Finally,

the formulations w

ere frozen and freeze-dried (G

enesis 12EL, Virtis, U

SA) using sucrose (5%

, w

/w) as cryoprotector.

Characterization ofnanoparticles

The particle

size and

the zeta

potential of

nanoparticles were determ

ined ina Zeta Plus

apparatus (B

rookhaven Instrum

ents C

orporation). The morphological exam

ination

135

of the nanoparticles was perform

ed by SEM.

The amount of C

PT loaded was quantified by

HPLC

from digested nanoparticles.

In vitro release studies

In vitrorelease studies w

ere carried out under sink

conditions after

the dispersion

of the

nanoparticles in simulated gastric (SG

F) and intestinal fluids (SIF) containing 1%

(w/v) of

Tween 80 as surfactant.

At different tim

es, sam

ples were taken and centrifuged through

Vivaspin

tubes at

3000xg for

20 m

in. Supernatants w

ere recovered and analyzed by H

PLC.

Results and D

iscussion:

The main physicochem

ical characteristics of the nanoparticles

are sum

marized

in Table

1.N

anoparticles displayed spherical shape with a

slightly rough surface, sizes between 130 and

170 nm and a negative surface of around -40

mV

. The amount of C

PT incorporated in the nanoparticles

ranged from

34

to 50

g/mg

depending on

the cyclodextrin

used. The

encapsulation efficiency ranged between 40 and

63%

.

Table 1.

Physico-chemical characteristics of

CPT-C

D

nanoparticles. D

ata expressed

as m

eanSD

(n=3).

Figure 2.Scanning Electron Microscopy (SEM

) of freeze-dried nanoparticles. A: SP-N

P; B: HP-

NP; C

: M-N

P.

Figure 3 shows the release profile of C

PTfrom

SP-N

P, HP-N

P and M-N

P. The in vitrorelease

profile of the three formulations exhibited a

biphasic pattern, characterized by an initial non

release period

when

the nanoparticles

were

incubated in

the SG

F follow

ed by

a rapid

release of about 50-60% of the loaded drug

when the nanoparticles w

ere dispersed in the SIF. The release then is m

antained and complete

after 18 hours of incubation.

Figure3.In vitro release profile of C

PT from

SP-NP, H

P-NP and M

-NP. D

ata expressed as m

eanSD

(n=3).

Conclusions:

SP-NP, H

P-NP and M

-NP

are able to load cam

ptothecin. The three types of nanoparticles show

gastroresistantproperties and they only

release the

loaded anticancer

drug under

simulated intestinal conditions.

References:

[1]W

all, M.E.W

., et al., J. Am

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. Soc., 1966. 88: p. 3888–3890.

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[3] M. A

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(4) (2009), pp. 405–413.

[4] M. A

güeros, et al., J. Con. R

el., 145 (1) (2010), pp. 2–8.

Acknow

ledgements:

This work w

as supported bythe A

sociación de A

migos of the U

niversity of Navarra and the

Spanish Ministry of Science and Innovation

(Project SAF2008-02538).

136

PRE

PAR

AC

ION

Y C

AR

AC

TE

RIZA

CIO

N D

E N

AN

OPA

RT

ÍCU

LA

S DE

PLG

A Y

QU

ITO

SAN

O C

ON

N

IME

SUL

IDA

C

. Huerta,M

.J. Peñas, L. Ludeña, M.R

. Aberturas,J. M

olpeceres

Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Facultad de Farmacia, U

niversidad de Alcalá, 28871 A

lcalá de H

enares, Madrid.

Introducción

La nimesulida (N

S) (4-nitro-2-fenoxi-metano-sulfon-

anilida) es un inhibidor selectivo de CO

X-2 clasificado

como

fármaco

clase II

dentro del

Sistema

de C

lasificación B

iofarmacéutico

(1). Su

perfil toxicológico a nivel

gastrointestinal es comparable

al que presentan

otros AIN

Es pero su riesgo hepatotóxico es m

ayor. La EMA

publicó en el 2012 un documento

en el que se establece la eficacia clínica de la NS para

uso sistém

ico en

tratamientos

a corto

plazo (2).

Algunos

autores han

puesto de

manifiesto

la sobreexpresión de C

OX

-2 encélulas tum

orales (3). Existen

trabajos publicados

que sugieren

quela

incorporación de la NS en nanopartículas (N

P) puederepresentar una alternativa para obtener una liberación controlada

del fárm

aco y

reducirasí

los efectos

adversos del mism

o cuando es administrado (4).

La finalidad de este trabajoes m

ejorar el potencial terapéutico de la N

S para el tratamiento coadyuvante y

prevención del

cáncer de

próstata, m

ediante su

incorporación en NP

capaces de actuar como depósitos

del fármaco y

de prolongar sus efectos sobre las células tum

orales de la próstata.

Materiales y m

étodos

Preparación de las NP

Las NP de

ácido poliláctico glicólico (PLGA

,RG

-504)y quitosano (C

S) cargadas con NS

(NPC

S)fueron

obtenidas mediante el m

étodo de evaporación del disolvente.La fase orgánica

que contiene PLGA

yN

S se dispersa utilizando ultrasonidos en una fase acuosa con PV

A.

Posteriormente se elim

ina el disolvente orgánico de la em

ulsión utilizando un rotavapory las NP obtenidas se

centrifugan a 12000g durante 15 min para elim

inar el PV

A en exceso de la fase acuosa. El residuo obtenido

se resuspende con una disolución de CS en ácido

acético. Tras incubar las NPC

S15 m

in en un baño a 37°C

, se vuelven a centrifugar a 20000g durante 15 m

in. Com

o formulaciones control se prepararon N

PCS

sin N

S (N

PBC

S) siguiendo

el m

ismo

esquema

experimental.

Caracterización de las N

PEl

porcentaje de

fármaco

encapsulado se

obtuvo m

ediante espectrofotometría U

V-V

is a 230 nm. El

rendimiento del proceso de elaboración de las N

PCS

se determinó a partir del peso de los residuos secos

obtenidos tras centrifugar las NPC

S a 20000g durante 15 m

in.Para realizar el análisis m

orfológicode las partículas

se emplearon técnicas de

microscopía electrónica de

barrido(SEM

; Philips XL-20). El tam

año de partícula y

el potencial

zeta fueron

medidos

en equipos

Microtrac

UPA

y

Zetatrac, respectivam

ente. La

capacidad de retención y la cinética de liberación de la N

Sa partir de lasN

PCS se determ

inarona tem

peratura am

biente (37ºC)

y utilizando un tampón PB

Sde

pH

7.4.Los estudios de perm

eabilidad se llevaron a cabo utilizando

el m

odelo PA

MPA

con

diferentes concentraciones de N

S(control)

y NPC

S. El sistema

se incuba durante 6 ha tem

peratura ambiente.

Acontinuación se m

iden mediante espectrofotom

etría U

V-V

is las cantidades de NS encontradas en los

compartim

entos donador y receptor en el rango de 600-190 nm

. La

viabilidad celular

y la

eficacia de

la N

S se

valoraron mediante un ensayo M

TT realizado concultivos de células de cáncer de próstata (PC

-3).

Resultados y discusión

Las NPC

Sobtenidas son esféricas y de superficie lisa.

PresentanPV

A residual asociado a su superficie

(Fig. 1).El tam

año de partícula obtenido para las NPC

S y N

PBC

S fue de 393nmy 374nm

y el potencial zeta, 10.07±4.45 m

V y 7.56±2.24 m

V, respectivam

ente.

F

igura1.-

Fotografía electrónica

de barrido

de N

PCS.

137

Las NPC

S encapsulan un 82.71±6.79% del fárm

aco añadido inicialm

ente. Con respecto a la cantidad de

fármaco

presente en

el producto

final, las

NPC

S presentan

un porcentaje

de captación

del 98.75±0.85%

. El porcentaje de recuperación de la NS

fue de un 84.07±11.72%.

En cuanto al rendimiento

del proceso de obtención de las NPC

S y NPB

CS

el valor

obtenido fue

de un

68.57±16.36%y

70.04±8.04%, respectivam

ente. En condiciones sink

las NPC

S liberaron la práctica totalidad

del fárm

aco tras

la prim

era hora

de incubación.(Fig. 2).

0 20 40 60 80

100

120

140

05

1015

2025

30

%NS liberado

tiempo (h)

Figura

2.-NS liberada por las N

PCS.

Los resultados obtenidos en el estudio de liberación inm

ediata ponen de manifiesto la afinidad de la

NS por

el polímero

(Fig. 3).

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

9990

500

% retenido

% dilución

Figura

3.-N

S retenida por NPC

S en los estudios de liberación inm

ediatacon agua m

illiQ (barras blancas)

o pH 7.4 PBS (barras negras) (n=

3).

Los estudios deperm

eabilidad demuestran que

la NS

pasa a través de barreras lipídicas de forma rápida

(Pe =1-1.5x10

-5cm/s) aunque dism

inuye ligeramente en

los estudios realizados con las NPC

S (Fig. 4). Tal y com

o recoge la figura 5, la NS y

las NPC

Sm

uestran un

marcado

efecto citotóxico

sobre las

células de cáncer de próstata (PC-3).Sin em

bargo, las N

PCS dem

ostraron ser más eficaces

que el fármaco

libre. En

los cultivos

realizados, las

NPB

CS

no presentaron un efecto citotóxico significativo

lo que

demuestra el potencial terapéutico de la form

ulación estudiada.

0,0E+00

2,0E-06

4,0E-06

6,0E-06

8,0E-06

1,0E-05

1,2E-05

1,4E-05

1,6E-05

1,8E-05

NPNSCS7,5

NPNSCS15

NPNSCS25

NS100M

NS200M

NS400M

Pe (cm/s)

Figura

4.-C

oeficiente de permeabilidad de la N

S en form

a libre o unido a NPC

S (n=4).

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,000,00100,00

200,00300,00

400,00500,00

% control

NS

(M

)

Figura

5.-Viabilidad celular a las 48 h en presencia

de NPBC

S (círculo negro), NS (triángulos) y N

PCS

(círculo blanco) (n>6).

Conclusiones

Se han

obtenido N

P esféricas

con tam

años de

particular inferiores a 0,5 m

. La NS se incorpora de

forma eficaz en las N

P y muestra una liberación

dependiente de la dilución realizada. La permeabilidad

del fármaco

cuando está incluido en las NPC

Sse ve

ligeramente dism

inuida. Los estudios realizados con células

PC-3

demostraron

quela

formulación

desarrolladapodría

constituir una contribucióneficaz

en el tratamiento del cáncer de próstata.

Referencias

(1)B

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138

DE

LIV

ER

ING

GSE

24.2 PEPT

IDE

FRO

M B

IOD

EG

RA

DA

BL

E

NA

NO

PAR

TIC

LE

S FOR

APPL

ICA

TIO

N IN

DE

FEC

TIV

E T

EL

OM

ER

ASE

D

ISOR

DE

RS

S.P. Egusquiaguirre1,2,C

. Manguán-G

arcía3, L. Pintado-B

erninches3,R

. Hernández

1,2, J.L. Pedraz1,2,

R. Perona

3,M. Igartua

1,2

1NanoB

ioCel G

roup, Laboratory of Pharmaceutics, U

niversity of the Basque C

ountry, School of Pharmacy, V

itoria, 01006, Spain2B

iomedical R

esearch Netw

orking Center in B

ioengineering, Biom

aterials and Nanom

edicine (CIB

ER-BB

N), V

itoria, 01006, Spain 3Instituto de Investigaciones B

iomédicas C

SIC/U

AM

C/A

rturo Duperier, 4 M

adrid 28029, IDIPaz and C

IBER

de Enfermedades

RarasC

IBER

ER,V

alencia Spain.

INT

RO

DU

CT

ION

Defective telom

erase disorders are rare inherited diseases characterized by defects in telom

ere m

aintenance, caused by mutations in different

components of the telom

erase complex (1). It

has been described that the peptide GSE 24.2,

corresponding to an internal domain of D

CK

1 gene

(encoding dyskerin,

a com

ponent of

telomerase

complex),

is able

to induce

telomerase reactivation (2). H

owever, peptides

are unstable and prone to degradation when

administered,

and so,

lose their

activity. M

oreover, GSE 24.2 site of action is localized

inside the

nucleus, and

thus it

must

be appropriately internalized inside cells and

reach the nucleus. Therefore, in this study a m

ethod to overcom

e these

shortcomings

has been

proposed, by the encapsulation of GSE 24.2 into

biodegradable nanoparticles,

elaborated w

ith poly-lactic-co-glycolic acid (PLG

A N

Ps) and the addition of differentpolycations.

EX

PER

IME

NT

AL

ME

TH

OD

S

Nanoparticle elaboration:

PLGA

NPs containing G

SE 24.2 were prepared

by the solvent extraction technique using a W

/O/W

double emulsion system

(3). Briefly,

the NPs w

ere developed emulsifying 0.5%

(w/v)

GSE 24.2 aqueous solution containing PEG

400 w

ith 2 ml of a 5%

(w/v) PLG

A (R

esomer ®

RG

503) solution in dichloromethane by 30 s

sonication at 50W (B

ranson Sonifier ®). This prim

ary emulsion w

as then added to 10 ml of a

5% (w

/v) polyvinyl alcohol aqueous solution and sonicated 60 s at 50W

to obtain the W/O

/W

emulsion. Finally, this second em

ulsion was

poured into a 2% (v/v) isopropanol aqueous

solution and left under magnetic stirring for 2 h

to allow the evaporation of the organic solvent.

The resulting

NPs

were

recovered by

centrifugation, washed three

times in distilled

water

and lyophilized

after the

addition of

trehalose. For the preparation ofthe cationic

NPs, different coating polym

ers were used:

polyethyleneimine

(PEI), chitosan

(CS)

and dextran (D

X). D

ifferent concentrations of CS

and DX

were dissolved in the PV

Aaqueous

solution, w

hilst PEI

was

dissolved in

dichloromethane.

Nanoparticles characterization:

PLGA

NPs w

ere characterized in terms of size

and potential by D

ynamic Light Scattering and

Laser D

oppler M

icro-Electroforesis, respectively. Particle m

orphology and surface characteristics

were

analyzed by

scanning electron

microscopy

(SEM).

GSE

24.2 encapsulation

efficiency, surface

adsorbed peptide

and in

vitro release

profile w

ere evaluated

by m

icro-BC

A

assay kit.

The structural integrity of G

SE 24.2 extracted from

NPs

was

assessed w

ith polyacrylam

ide gel

electrophoresis (SDS-PA

GE). The cytotoxicity

of N

Ps w

as assayed

in H

eLa and

murine

embryonic

fibroblasts (M

EF) cell

lines. Intracellular uptake w

as performed in F9 cell

line and in vitro biological activity of GSE 24.2

using F9

A353V

cells

harbouring a

DK

C1

mutation.

RE

SUL

TS A

ND

DISC

USSIO

N

As exposed in table 1, PLG

A N

Ps size was

around 220 nm w

ith a narrow size distribution

(polydispersity index (PDI) <0.1).

potential values confirm

ed the presence of polycation chains shielding a positive charge at the N

Ps surface, resulting in cationic PLG

A N

Ps, with

the exceptionof C

S, which acquires positive

charge in acidic media.

Formulation

Size (nm

)PD

IPotential

EE

(%)

SAP

(%)

PLG

A231.2

0.126-20.1

60.2728.64

PLG

A-C

S243.9

0.151-3.05

18.899.36

PLG

A-PE

I221.9

0.144+30.4

86.4223.33

PLG

A-D

X226.2

0.095+24.4

30.484.32

Table 1: Characteristics of G

SE 24.2 PLGA

NPs.

139

0 20 40 60 80

100

120

010

2030

4050

6070

% release

Time (days)

As observed in SEM

images (Figure 1), sm

all spherical particles in the nanom

eter size range w

ith smooth surface w

ere obtained.

According to the G

SE 24.2 structural integrity study

with

SDS-PA

GE

(Figure 2),

no configuration or conform

ational damage of the

peptide occurred

during the

encapsulationprocess. Therefore, the biological activity of G

SE 24.2 incorporated into PLGA

NPs should

be maintained.

The cytotoxicity test (Figure 3) displayed an acceptable viability for PLG

A N

Ps and CS

PLGA

NPs, and greater toxicity for PEI and D

X

PLGA

NPs.

0 20 40 60 80

100

120

140

00,625

1,251,875

2,5

Viability (%)

NP concentration (m

g/ml)

PLGA

PLGA-CS

PLGA-PEI

PLGA-DX

A

s demonstrated by the in vitro

release studies (Figure 4), a biphasic G

SE 24.2 release profile w

ith an initial burst effect of 20% w

as observed. This first phase is follow

ed by a second constant slow

release phase, until nearly 100% of the

loaded GSE 24.2 is released.

To check if GSE 24.2 PLG

A N

Ps were able to

be internalized

in F9

cells, intracellular

localization was assayed

(Figure 5). During the

first 48hours of incubation, results illustrated an

important confocal internalization of N

Ps inside cells and nucleus.

Finally, the

bioactivity of

GSE

24.2 encapsulated into PLG

A N

Ps was assessed in

vitroby the incubation of 15

g of the peptide w

ith F9 A353V

cells. As exposed in figure 6,

GSE

24.2 incorporated

into PLG

A

NPs

preserves the

in vitro

biologicalactivity,

rescuing DN

A dam

age. Moreover, the

addition of PEI seem

s to, slightly;enhance the D

NA

rescue, probably due to the positive charge on the

surface of

NPs

which

could increase

internalization.

Formulation

% D

NA

rescuedPL

GA

20,09 ± 0.07PL

GA

-PEI

38,21 ± 0.11

CO

NC

LU

SION

From the data obtained, w

e can conclude that G

SE 24.2

peptide has

been successfully

encapsulated into

biodegradable N

Ps. In

addition, structural

integrity and

biological activity of G

SE 24.2 are maintained after the

encapsulation, and also an acceptable viability w

as obtained. Finally, PLGA

NPs are efficiently

uptaken by

F9 cells

and are

able to

be internalized w

ithin the nucleus.

AC

KN

OW

LE

DG

ME

NT

S

This project was partially supported by the U

niversity of the B

asque Country (U

PV/EH

U) (U

FI 11/32),FISP11-00949

and F.

Ram

ón A

reces. S.P.

Egusquiaguirre thanks

the Basque

Governm

ent (G

obierno Vasco,

Departam

ento de

Educación, U

niversidades e Investigación)for the fellow

ship research grantand C

.Manguan-G

arcía is supported by C

IBER

ER.

RE

FER

EN

CE

S(1) W

alne A.J. et al. Br J H

aematol.145(2):164-172, 2009

(2) Machado-Pinilla R

. et al., Blood. 111(5):2606-2614, 2008 (3) G

utierro I et al., Vaccine.22;21(1-2):67-77, 2002

Figure 1: Morphology of G

SE 24.2 PLGA

NPs.

Figure 6:In vitro biological activity of GSE 24.2 PLG

A N

Ps.

Figure 5:Intracellular localization of GSE 24.2 PLG

A N

Ps.

Figure 2:SDS-PA

GE

of GSE 24.2 PLG

A N

Ps.

Figure 3:In vitrocytotoxicity of G

SE 24.2PLG

A N

Ps in MEF

cells.

Figure 4:In vitro release profile of GSE 24.2 -PLG

A N

Ps.

140

NO

VE

L T

HE

RM

OR

EV

ER

SIBL

E A

ND

pH-D

EPE

ND

EN

T H

YD

RO

GE

LS FO

R C

ON

TR

OL

LE

D

DR

UG

RE

LE

ASE

E. Moreno

1,2,3and J. Schwartz

1,2, J.M. Irache

1,E. Larrañeta

1,P.A. N

guewa

2,C. Sanm

artín2,3,S.

Espuelas 1,2

1Pharmacy and Pharm

aceutical Technology Departm

ent, University of N

avarra, Spain2Tropical H

ealth Institute, University of N

avarra, Spain3O

rganic and Pharmaceutical C

hemistry D

epartment,U

niversity of Navarra, Spain

Introduction:

Thermosensitive hydrogels are aqueous polym

er solutions that are transform

ed into gels throughtem

peraturechanges.

Under

physiological conditions, gels are form

ed upon heating to body

temperature

and can

maintain

their integrity for a period of tim

e. Thesehydrogels

may

provide the

advantage of

easier adm

inistration and

could have

several biom

edical applications such as drug controlled release,

cell im

movilization

and tissue

regeneration(1-2).

In this work,

we synthesized a new

serie of random

X

—Y

copolym

ers that

form

thermosensitive

and pH

-dependent hydrogels

whose

gelation tem

perature and

mechanical

properties can

be controlled

by the

molar

relationshipof

X

and Y

polymers

and copolym

er concentration in water.

Materialand M

ethods: Synthesis of the X

—Y

colopymer

Briefly, 2.0 g of Y

were added into a one-

necked glass flask and dissolved in 150 mL of

anhydrous THF

with a m

echanical stirrer. Then, different

amounts

of X

w

ere added

to the

solution(X

m/Y

molar ratios: 1,2, 5, 10 and 20;

Xm

=X m

onomer) and they reacted for 48 hours

at room tem

perature under magnetic stirring.

The organic

solvent w

as elim

inated by

evaporation and the residue was m

ixed with

cold ethyl

ether to

precipitate the

polymer.

Later, the polymer precipitate w

as filtered and dried at room

temperature under vacuum

.

FT-IR

analysisThe IR

spectra were obtained on a Therm

o N

icolet FT-IR N

exus spectrophotometer.

Preparation of

the X

—Y

hydrogels

and phase diagram

s measurem

entsThe copolym

ers were prepared in 10 m

L glass vials at concentrations of 0.5, 1, 2, 2.5, 3, 5, 7.5 and 10 w

t.% in deionized w

ater to a final volum

e of

2 m

L. The

vials w

ere kept

in continuous stirring at room

temperature until

complete

dissolution (24-72

hours).Then,

NaO

H w

as added carefully in order to adjust the pH

(6-7.5). Finally, the solutions were kept in a

water bath at different tem

peratures toallow

gel form

ation. The

temperature

at w

hich the

polymer solution stopped flow

ing upon the vialinversion

(during at

least 30

seconds)w

as visually observed and recorded as the gelation tem

perature.

Viscosity analysis

Viscosity m

easurements of the X

—Y

hydrogels w

ere carried out at different temperatures using

a Haake V

iscotester 550 rotational viscometer

with

a SV

2 rotor

and equipped

with

a therm

ostatic bath Thermo Phoenix II.

In vitro cytotoxicity of X—

Y copolym

erM

TT assay was used to test the cytotoxicity of

X—

Y hydrogels on J774.2 m

acrophages after 20 hours of treatm

ent in Transwell m

icroplates.The solution w

ith the copolymer w

as placed in the apical side

whereas the m

acrophages were

located inthe

basolateral side.

Resultsand D

iscussion:

All

synthesized copolym

ers show

ed pH

-dependent

(6-7.5) gelation

behaviour. Therefore, their

sol-gel transition temperatures

couldbe m

odulatedby m

anipulation of the X

m/Y

molar ratios and concentrations of the

copolymers

(Figures 1 and 2).The gelation

temperature tended to decrease w

hen the Xm

/Y

ratio increased

till X

m/Y

of 20,

when

the gelation occurred

at room tem

perature. At a

fixed X

m/Y

value,

the sol-gel

temperature

decreasedat higher copolym

er concentrations (Figure 2). In all cases, gels reverted to solution upon cooling.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

05

1015

2025

% w/v

Xm/Y m

olar ratio

Figure 1:Influence of X

m/Y

molar ratios and

concentrations in sol-gel transition phases (indicates sol. and

indicates gel).

141

20 25 30 35 40

05

1015

T (°C)

% w

/v

Xm/Y 251020

Figure 2:Influence of X

m/Y

molar ratios and

concentrations in the gelation temperature.

The gelation

temperature

was

confirmed

by viscosity

measurem

ents (Figure

3).The

viscosity is an important param

eter that could affect

the drug

release. A

s expected,

the viscosity

sharply increased

around gelation

temperature, reaching higher values and faster at

high polymer concentrations (i.e.

3.5 Pa.s for the X

m/Y

=5 copolymer at 10%

vs. 1.2Pa.s at

3%,

Figure 3a)

and low

er X

m/Y

ratios

(Xm

/Y=5 in Figure 3a vs. X

m/Y

=10 in Figure 3b).B

oth,viscosity

values and

gel transition

temperature w

ill determine w

hichcopolym

er concentration and X

m/Y

ratiow

ill be chosen according

totheir use.

a

0 1 2 3 4

2030

4050

Viscosity (Pa·s)

T (°C)

Xm/Y=5

3%5%10%

10% w

/o reaction

b

0 1 2 3 4

2030

4050

Viscosity (Pa·s)

T (°C)

Xm/Y=10

2,50%

5%

Figure 3:V

iscosities vs. temperature profile at

different concentration

of hydrogel

prepared w

ith X

m/Y

=5 (a)

and X

m/Y

=10 (b)

copolymers.

Biocom

patibility of new polym

ersis a requisite

for biomedical application. Thus, cytotoxicity of

the hydrogels was

evaluated by an MTT assay

using J774.2 macrophages (Figure 4). For X

—Y

hydrogels with a m

olar ratio of 5, cell viability w

as slightly higher than hydrogels with a m

olar ratio of 10, although in all the experim

ents cell viability w

as > 70%.

0 20 40 60 80

100

120

140

Cell viability (%)

Control

Xm/Y=5

3%Xm

/Y=5 5%

Xm/Y=10

3%

Figure 4:In vitro cytotoxicity of synthesized

X—

Y

copolymer.

The results

represent the

means ± SD

for n = 4.

Overall, w

e have synthesized a new series of

random X

—Y

copolymers that are able to form

non-toxic,

pH-sensitive

and therm

osensitive hydrogels.

The gelation

temperature

can be

manipulated as a function of the X

m/Y

molar

ratio between 30 and 37

ºC. The viscosity can

be controlled bythe copolym

er concentration.Thus,

they could

be used

as vehicles

for controlled

topical, ocular

or subcutaneous

delivery of drugs.

References:

(1) Liu, C., G

ong, C.Y

., Pan, Y.F., Zhang, Y

.D.,

Wang,

J.W.,

Huang,

M.J.,

Wang,

Y.S.,

Wang, K

.., Gou, M

.L., Tu, M.J., W

ei, Y.Q

., Q

uian, Z.Y. Synthesis and characterization

of a

thermosensitive

hydrogel based

on biodegradable

amphiphilic

PCL-Pluronic

(L35)-PLC block copolym

ers. Colloids and

Surfaces; 302: 430-438 (2007).

(2) Garripelli,

V.K

., Kim

, V.K

.,N

amgung R

., K

im, W

.J.,R

epka, M.A

., Joa, S. A novel

thermosensitive polym

er with pH

-dependent degradation

for drug

delivery.A

cta B

iomaterialia; 6: 477-485 (2010).

142

SKIN

PEN

ET

RA

TIO

N ST

UD

IES O

F CH

ITO

SAN

HY

DR

OG

EL

S CO

NT

AIN

ING

NO

VE

L

DISE

LE

NID

E D

RU

G A

GA

INST

CU

TA

NE

OU

S LE

ISHM

AN

IASIS

1,2J Schwartz &

1,2E Moreno, 1JM

Irache, 2,3CSanm

artín,2P

Nguew

a, 1,2SEspuelas.

1Departm

ent of Pharmacy and Pharm

aceutical Technology, 2Tropical Health Institute, 3D

epartment of

Organic

and PharmaceuticalC

hemistry, U

niversity of Navarra, Spain

Introduction:Leishm

aniasis is

a zoonotic

infection caused by parasitic protozoans from

the genus Leishmania and transm

itted by means

of sandfly bite to vertebrate hosts including m

an. Chem

otherapy remains the prim

ary tool for treatm

ent of human leishm

aniasis. How

ever, currently

available drugs

present serious

problems

regarding side-effects,

variable efficacy, and cost (1). Local therapy can be of value in nondissem

inated disease(C

L)because

it offerssignificant advantages over system

ic therapy such as few

er adverse effects andease

of adm

inistration (2).

The diselenide

(diSe) com

pound 2a

(4-bis-aminophenyl-diselenide)

showed stronger in vitro

antileishmanial activity

than m

iltefosine, w

hile show

ing negligible

toxicity against mam

malian cells

(3).The aim

of this work w

as to develop topical formulations

that areable to carry the 2a drug into the skin

dermis, w

here parasites arem

ainly located in C

L (2).C

hitosan was selected as the m

ain com

ponent of

the hydrogels

because of

its biodegradability and bioadhesive properties(4),w

hich make it suitable for the treatm

ent of ulcerative lesions. Furtherm

ore, this polymer

has shown antim

icrobial activity, which could

boost the drug effect. In this work

we optim

ised hydrogels

based on

chitosan- -C

Ds-

cyclodextrins (CD

s) networks that are suitable

to load hydrophobic drugs (i.e. diSe compound).

Including the diSe drug in the hydrogels was

-CD

s within the

hydrogel network.

Materials and M

ethods:C

hitosan hydrogels containing the diSe drug (3, 4 and 5 m

g/ml) and

PM (15 and 30 m

g/ml) w

ere prepared by adding -

-GP) solution (5 and

15%), as w

ell as methyl-

-cyclodextrin (M-

-C

D, 5.74%

) or a hydroxipropyl--cyclodextrin

(HP-

-CD

, 6.4 and 19.8%) solution in different

concentrations to

several concentrations

of chitosan

(1 and

1.5%),

which

had been

previously dissolved

in 2%

of

lactic acid.

Chitosans

of different

molecular

weights

(95/100 and 95/200) were used. The am

ount of C

Ds introduced w

as adjusted to maintain a 3:1

molar

ratio w

ith the

diSe drug.

The skin

permeation experim

ents across intactpig

earskin w

ere performed in Franz diffusion cells

(Hanson R

esearch Microette, m

embrane surface

of 4.909 cm2 and volum

e of the receptor fluid of 4 m

l). Thestratum

corneum (SC

,

separated using the microtom

e cryostat Leica C

M 1900 (Leica M

icrosystems). The different

skin layers

were

pretreated w

ith nitric

acid before determ

ining the diSe drug concentration in each layer.

Results and

Discusion:

In order to optimize

formulations

forthe

treatment

of C

L, the

influence of several parameters

on skin drug perm

eation(drug

concentration, chitosan

molecular w

eight and CD

concentration and type), w

as assessed. The formulations that w

e evaluated in the Franz cells w

ith the diSe drug (3, 4 or 5 m

g/ml) w

ere composed of chitosan

--

-CD

s (6.4

or 12.8%

and

5.74%,

respectively) (see figs. 1to 5).

As expected,

formulations containing a higher am

ount of the diSe drug (4 m

g/ml) led to higher levels of this

compound in the D

and in the E, where the

amount of drug w

as around 2 times higherin the

E than in the D (fig. 1).

Effect of diSe concentration

SCE

D0

200400600800

1000PBS3 m

g4 m

g

Drug concentration(nmoles/g tissue)

Fig. 1:Effect of drug concentration on

the penetration of D

iSe across the skin.

Higher levels of the diSe drug w

ere found in the SC

and in the D at higher concentrations of H

P--C

D

(nearly 2

and 1.5

times

more,

respectively) (fig. 2).O

ur data for permeation

across intact skin are consistent with several

studies previously published, in that dermal and

transdermal

delivery of

hydrophilic drugs

entrapped in

the H

P--C

D

structure w

ere greater

than that

observed for

conventional form

ulations (6).

Effect of C

D concentration

SC

ED

0500

1000150020002500

PB

S6.4%12.8%

nmoles DiSe/g tissue

143

Fig. 2:

Effect of

CD

concentration

onthe

penetration of DiSe across the skin.

Entrapment of the diSe drug in the structure of

the M

--C

D

resulted in

improved

topical delivery

into and

across intact

skin w

hen com

pared with form

ulations that contained HP-

-CD

. Se levels were 1.7 tim

es higher in the D

when

the hydrogel

contained M

--C

D

thanw

hen it contained HP-

-CD

(fig. 3).

Effect of CD type

SCE

D0

500

1000

1500PBSH

P--C

DM

--C

D

Fig. 3:Effect of C

D type on

the penetration of D

iSe across the skin.

Formulations

containing chitosan

95/200 (higher

molecular

weight)

resulted in

an im

proved topical delivery of the drug across theskin. The levels of Se in the E

were 1 tim

e higher w

hen the hydrogel contained chitosan 95/200 (fig. 4).

Effect of chitosan MW

SCE

D0

200

400

600

800PBS95/10095/200

Fig. 4:Effect of form

ulation onthe penetration

of DiSe across the skin.

Finally, the

effect of

the form

ulation w

as studied. For this purpose, a solution containing only H

P--

-GP 5%

and the diSe drug (5 m

g/ml), w

as compared w

ith a hydrogel that contained chitosan 95/100 1.5%

, HP-

-CD

-G

P 5% and the diSe drug (5 m

g/ml).

The levels of the diSe compound from

the hydrogel

were

higher in

the different

skin layers, especially in the SC

(1.7 times higher),

but also in the D (1.35 tim

es higher) (fig. 1e).

Effect of formulation

SCE

D0

200

400

600

800P

BS

Solution

Gel

Fig. 5:Effect of C

D type on

the penetration of D

iSe across the skin.

DiSe drug levels in the receptor com

partment

were very low

or under the limit of detection

within the first hours. They peaked at 24h, but

levels were still very low

(data not shown). This

is of great importance because it proves that the

formulation enters the D

, but it does not reach substantial levels in the receptor com

partment,

which sim

ulates the blood circulation under the skin. Therefore, the drug does not enter the blood circulation and this prevents system

ic side effects.D

rugs topically applied for the treatment

of CL m

ust be able to target the Leishmania

parasites w

ithin the

phagolysosome

of the

infected macrophages in the deep derm

al layer of the skin (7). O

ur topicalform

ulations based on chitosan-

-GP hydrogels led to the delivery

of the diSe drug to the dermis of the skin in the

in vitroassay (see figs. 1 to 5).Therefore, the

diSe drug

is a

good candidate

for topical

treatment of C

L.

References:

(1) Gupta S et al. D

rug delivery strategies for therapy

of visceral

leishmaniasis.

Expert opinion on drug delivery 2010;7(3):371.

(2) Carneiro G

et al.Drug delivery system

s for the

topical treatm

ent of

cutaneous leishm

aniasis. Expert

opinion on

drug delivery 2012;9(9):1083

(3) Plano

D

et al.

Selenocyanates and

diselenides: a

new

class of

potent antileishm

anial agents. Eur J Med C

hem

2011;46(8):3315. (4) Sezer A

et al. Topical drug delivery using chitosan nano- and m

icroparticles. Expert opinion on drug delivery 2012;9(9):1129

(5)Larrucea E

et al. Interaction of tenoxicam

with cyclodextrins and its influence on the in

vitro percutaneous penetration of the drug. D

rug Dev Ind Pharm

2001;27(3):251.

Acknow

ledgements:

-The first author of this work is supported by the

AD

A grant (A

sociación de Am

igos, University

of Navarra).

144

ESTUD

IO D

E LA A

BSO

RC

IÓN

TRA

NSD

ÉRM

ICA

DE PIZO

TIFENO

MA

LATO

DESD

E SISTEMA

S M

ATR

ICIA

LESC

.E. Serna Jim

énez1, S. del R

io Sancho1, M

.A. C

alatayud Pascual 1,C

. Balaguer Fernández

1, A. Fem

enía Font 1, V. M

erino2,A

. López C

astellano1

1Instituto de Ciencias B

iomédicas.D

pto. de Farmacia, Facultad de C

iencias de la Salud. Universidad

CEU

Cardenal H

errera, Valencia, España.

2Instituto de Reconocim

iento Molecular y D

esarrollo Tecnológico, Centro M

ixto Universidad Politécnica

de Valencia-U

niversidad de Valencia. D

epartamento de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica,

Universidad de V

alencia, Valencia, España.

Introducción: El

pizotifeno m

alato es

un principio activo utilizado para la prevención de m

igraña así como para aum

entar el apetito. Por su

seguridad se

utiliza habitualm

ente en

pacientes de corta edad. Este

estudio form

a parte

del desarrollo

de nuevas form

as de administración del pizotifeno,

en concreto de parches transdérmicos.

Objetivos: Evaluar la absorción transdérm

ica del

pizotifeno incorporado

en parches

transdérmicos, form

ulados con los promotores

químicos ácido decenoico o ácido oleico.

Materiales y M

étodos: El estudio de absorción transdérm

ica se llevó a cabo con tres parches: control

(sin prom

otor quím

ico), con

ácido decenoico y con ácido oleico. La com

posición de los m

ismos se m

uestra en la Tabla 1.

Parche C

ontrolParche A

c. O

leico

ParcheA

c. D

ecenoicoPV

P K90

17.017.0

17.0Plastoid E

35H10.0

10.0 10.0

Propilenglicol51.7

51.751.7

Etanol

20.015.0

15.0Á

cido oleico-

5.00-

Ácido

decenoico-

- 5.00

Pizotifeno m

alato1.34

1.341.34

Tabla 1:Com

posición en % (p/p) de los parches

de pizotifeno utilizados en el estudio.

Los experimentos de absorción transdérm

ica se realizaron en células de Franz utilizando com

o m

odelo de piel oreja de cerdo, a 37 ± 1 ºC y

durante 56 horas. Las muestras se analizaron

mediante

un m

étodo H

PLC

previamente

validado [1].

Los parám

etros cinéticos

se obtuvieron por m

edio del ajustado de la segunda ley de Fick. El fárm

aco retenido en piel se determ

inó al

finalizar los

experimentos.

Asim

ismo se realizó la caracterización física de

los parches determinando la elongación hasta

rotura, la resistencia máxim

a, la bioadhesión, hum

ectación y desecación [2]. R

esultados y Discusión:

A partir de los datos

obtenidos del

análisis de

las m

uestras se

representaron lascurvas de

las cantidades de fárm

acoacum

uladasen el com

partimento frente

al tiem

po, representativas

del proceso

de absorción

(Figura 1).

Tiempo (h)

010

2030

4050

60

Cantidad acumulada en compartimento receptor ( g/cm2)

0 50

100

150

200Parche Á

c. decenoicoParche Á

c. oleico Parche control

Figura 1.Cantidades acum

uladas de pizotifeno (

g/cm2) en el com

partimento receptor frente al

tiempo (h).

El flujo en el estado estacionario de pizotifeno a través de la piel con el parche control fue de 0.60

± 0.18

g/(cm2h).

Los parches

que contenían

ácido decenoico

y ácido

oleico proporcionaron unos flujos de 3.41 ± 0.44 y 1.81 ±

1.20 g/(cm

2h), respectivamente.

La caracterización física de los parches puede observarse en la figura 2.

Control BackingControl

Ác. oleico Backing

Ác. oleico

Ác. decenoico Backing

Ác. decenoico

Elongación hasta rotura (%)

0 50

100

150300

350

400

**

*

**

**

(a)

145

Control BackingControl

Ác. oleico Backing

Ác. oleico

Ác. decenoico Backing

Ác. decenoico

Resistencia máxima (N/mm2)

0 2 4 6 8 10 12

*

**

**

**

**

Parche control

Parche Ác. oleico

Parche Ác. decenoico

Trabajo de Adhesión (mJ)

0 50

100

150

200

250

Fuerza Máxima de Adhesión (N)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Trabajo de A

dhesión (mJ)

Fuerza Máxim

a de Adhesión

*

******

Parche Ác. decenoico

Parche Ác. oleico

Parche control

% (p/p)

0 5 10 25 30 35 40H

umectación (%

) D

esecación (%)

**

*

Figura 2.Caracterización física de los parches

de pizotifeno formulados: (a) Elongación hasta

rotura; (b) Resistencia m

áxima; (c) Trabajo y

fuerza máxim

a de adhesión; y (d) Hum

ectación y desecación.

“*” y “**” presentan diferencias estadísticam

ente significativas entre sí mism

os (p<0.05; A

NO

VA

; Dunnet T3).

De los 3 parches form

ulados, el que contenía ácido decenoico presentó los m

ayores valores

de elongación hasta rotura y bioadhesión, y el valor m

ás bajo de resistenciam

áxima. N

o se apreciaron

diferencias estadísticam

ente significativas en cuanto a la hum

ectación de los parches,

no obstante

los porcentajes

de desecación

sí que

resultaron diferentes,

obteniendoel

parche control

el valor

de desecación m

ás bajo, seguido por el parche de ácido decenoico.C

onclusiones:Se

desarrollaron 3

parches transdérm

icos de

pizotifeno. El

parche que

contiene ácido decenoico parece óptimo para

administrar

el fárm

aco, tanto

por sus

características físicas,

como

por el

efecto observado sobre la absorción transdérm

ica del fárm

aco. R

eferencias:(1)

Serna-Jiménez,

C.E.

et al.

HPLC

-UV

analytical

method

for determ

ination of

pizotifen after in vitro transdermal diffusion

studies. B

iomedical

Chrom

atography 26:

769-774 (2012). (2)

Balaguer-Fernández, C

. et al. Developm

ent and

evaluation of

occlusive system

s em

ploying polyvinyl

alcohol for

transdermal

delivery of

sumatriptan

succinate.D

rug D

elivery17

(2): 83-91

(2010). A

gradecimientos:

- Ministerio de Sanidad y C

onsumo

(PI060108).- U

niversidad CEU

Cardenal H

errera(beca

FPDI).

- U

niversidad C

EU

Cardenal

Herrera

(PRC

EU-U

CH

34/10)

(b)

(c) (d)

146

DE

SAR

RO

LL

O FISIC

OQ

UÍM

ICO

DE

NA

NO

CO

MPU

EST

OS M

AG

HE

MIT

A/PO

LI(D,L-

LA

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IDA

-CO

-GL

ICO

LID

A)PA

RA

FINE

S FAR

MA

CO

TE

RA

PÉU

TIC

OS

B. Pérez-A

rtacho1, A

.V. D

elgado2, A

. Fini 3,M.López-V

iota1, J.L. A

rias 1 1D

pto.de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Universidad de G

ranada, España. 2D

pto.de FísicaA

plicada,Universidad de G

ranada, España.3D

pto. Scienza dei Metalli, Elettrochim

ica e Tecniche Chim

iche, Università degli Studi di B

ologna,Italia.

Introducción: Num

erosos estudios se centran actualm

ente en

el uso

de coloides

para la

formulación de nanosistem

as transportadores de fárm

acos (1).

Así,

sepretende

lograr la

acumulación m

asiva y específica de la dosis de principio activo en el lugar de acción, junto con una

minim

ización de

los problem

as de

estabilidad y seguridad asociados a su uso (2).En

este trabajo

se describe

una técnica

reproducible para la síntesis de nanocompuestos

de maghem

ita (-Fe

2 O3 ) y

poli(D,L-lactida-co-glicolida) (PLG

A) com

o sistema transportador

de fárm

acos. La

-Fe2 O

3se

eligió por

su carácter no tóxico y superparam

agnético que confiere

al sistema sus propiedades m

agnéticas, m

ientras el PLGA

se seleccionócom

o matriz

biocompatible y biodegradable, con capacidad

para el transporte de principios activos.

Materiales

y M

étodos: El

procedimiento

seguido en la síntesis de las nanopartículas de -

Fe2 O

3 se fundamentó en la síntesis m

ediante co-precipitación

química

y oxidación

denanopartículas de m

agnetita (3). La síntesis de los nanocom

puestos se basó en unm

étodo de em

ulsión con evaporación de disolvente puesto a punto por nuestro grupo de investigación (4). Las nanopartículas de PLG

A se sintetizaron de

igual form

a.B

revemente,

se añadió

bajo agitación m

ecánica, una solución de PLGA

(250 m

g) en acetato de etilo, a una solución acuosa de polivinilalcohol (3%

, p/v) que contiene los núcleos m

agnéticos (125 mg). Posteriorm

ente, se redujo

la velocidad de agitación, dejando evaporar com

pletamente

el disolvente.En cuanto a la caracterización fisicoquím

ica de los nanocom

puestos, su geometría

se determinó

mediante m

icrofotografías FeSEM y H

RTEM

ym

ediante PC

S. A

demás,

Se utilizó

la difractom

etríade rayos X

para determinar la

estructuracristalina

de las nanopartículas

-Fe

2 O3 /PLG

A.

Las propiedades

eléctricas superficiales

de los

nanocompuestos

se analizaron m

ediante electroforesis en función del

pH.

Por otro

lado, las

propiedades term

odinámicas superficiales se estudiaron a

partir de determinaciones de ángulo de contacto

con agua, formam

ida y -brom

onaftaleno, junto con un adecuado tratam

iento termodinám

ico.Las

propiedades m

agnéticas de

lasnanopartículas

-Fe2 O

3 /PLGA

se investigaronm

ediante la obtención yanálisis de

suciclo de

histéresis. Finalm

ente, se

investigó la

estabilidad térm

ica de

los nanom

ateriales m

ediante DSC

y TGA

.

Resultados

y D

iscusión: G

racias a

la m

etodología de

síntesis desarrollada,

se obtuvieron

partículas completam

ente esféricas con un tam

año medio de 135 ± 50 nm

, muy

adecuado para

la vía

de adm

inistración parenteral. La eficacia del recubrim

ientopolim

éricode los

núcleos magnéticos se dem

ostró comparando el

potencial zeta () de los nanocom

puestos conel

de los nanomateriales que los constituyen. En

efecto, la

figura 1

muestra

valores de

prácticamente iguales para los nanocom

puestos y el polím

ero puro.

Figura 1.Valores de potencial zeta (

, mV

)de

las nanopartículas

de -Fe

2 O3 ,

PLGA

y-

Fe2 O

3 /PLGA

en función del pHy

a fuerza iónica constante.

El estudio de las propiedades termodinám

icas de las nanopartículas confirm

ólos resultados

obtenidos en la caracterización electroforéticacon respecto a la eficacia del recubrim

iento polim

érico de los núcleos magnéticos.La figura

2 muestra nuevam

ente la similitud entre los

nanocompuestos

y las

nanopartículas de

polímero puro, así com

o las diferencias con los núcleos m

agnéticos. De hecho, en esta figura

puede apreciarse cómo el carácter hidrófilo de

los núcleosde óxido de hierro

se pierde al quedar

englobados en

la m

atriz polim

érica hidrófoba.

147

Figura 4.C

arácter hidrófilo/hidrófobode

-Fe

2 O3 ,

PLGA

y

nanocompuestos

-Fe

2 O3 /PLG

A.

La difractom

etría de

rayos X

nos

permite

afirmar

que la

estructura cristalina

de los

núcleos m

agnéticos se

mantiene

tras su

inclusión en la matriz de PLG

A (figura 3). Este

es un

aspecto m

uy im

portante ya

que las

propiedades magnéticas de las nanopartículas

-Fe

2 O3 /PLG

A

dependen fundam

entalmente

de esta estructura cristalina.

Figura 3.

Difractogram

a de rayos X de los

nanocompuestos

-Fe2 O

3 /PLGA

. Figura

insertada: difractograma de rayos X

de-Fe

2 O3.

En cuantoa las propiedades

magnéticas, la

figura 4 muestra el ciclo de histéresis de los

nanocompuestos. Los valores de susceptibilidad

inicial (i

= 2.51 ± 0.11) ym

agnetización de saturación

(206±

12 kA

/m)

demuestran

la elevada capacidad de respuesta a gradientes decam

po m

agnético que

exhiben las

nanopartículas -Fe2 O

3 /PLGA

.

Figura 4.

Ciclo

de histéresis

de las

nanopartículas -Fe2 O

3 /PLGA

.

Finalmente, se llevó a cabo una evaluación

preliminar

de la

estabilidad térm

ica de

las nanopartículas

-Fe2 O

3 /PLGA

(figura 5).Com

o puede

apreciarse en

esta figura,

los nanocom

puestosse caracterizan por un perfil

térmico

muy

estable hasta

temperaturas

próximas a 330 ºC

. De esta m

anera, podría postularse

la posibilidad

de som

eter las

formulaciones basadas en estas

nanopartículas aprocedim

ientos de esterilización mediante calor.

Figura 1.Termogram

a DSC

(a) y TGA

(b) de los nanocom

puestos -Fe2 O

3 /PLGA

.

Conclusiones:

Se ha

desarrollado una

metodología reproducible para la síntesis de

nanocompuestos

-Fe2 O

3 /PLGA

.La

extensacaracterización

química,

electrocinética y

termodinám

ica ha demostrado la eficacia de la

metodología

de form

ulación desarrollada.

El estudio

de las

propiedades m

agnéticas dem

uestra la excelente capacidad de respuesta a gradientes de cam

po magnético que presenta

este tipo de nanopartículas. Por lo tanto,puede señalarse que estos nanocom

puestosdeben ser

útiles en el diseño de sistemas transportadores

de fármacos.

Referencias:

(1)A

rias JL. Drug targeting strategies in cancer

treatment: an overview

. Mini R

ev. Med.

Chem

. 2011;11:1-17.(2)

Couvreur P, V

authier C. N

anotechnology: intelligent design to treat com

plex disease.Pharm

. Res. 2006;23:1417-50.

(3)B

ee A

et

al. Synthesis

of very

fine m

aghemite

particles. J.

Magn.

Magn.

Mater. 1995;149:6-9.

(4)Pérez-A

rtacho B

et al.

Maghem

ite/poly( D,L-lactide-co-glycolyde)com

posite nanoplatform

for

therapeutic applications.

J. N

anopart. R

es. 2012;14:768(10 págs.).

Agradecim

ientos:Proyecto

FIS 11/02571

(Instituto de Salud Carlos III, España).

148

NA

NO

TU

BO

S DE

CA

RB

ON

O FU

NC

ION

AL

IZAD

OS M

AG

NÉ

TIC

AM

EN

TE

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A E

L

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NT

ITU

MO

RA

LE

S EN

CÉ

LU

LA

S DE

CÁ

NC

ER

DE

CO

LO

NM

. López-Viota

1, A. G

onzalez2, K

. Rudzka

2, J.A. M

uñoz-Gam

ez3, A

. Carazo

3, J.L. Arias 1, J.L.V

iota3,

A.V

. Delgado

2

1Dpto.de Farm

aciay Tecnología Farm

acéutica, Universidad de G

ranada, España2D

pto. de Física Aplicada, U

niversidad de Granada,España.

3Unidad de A

poyo a la Investigación, Hospital U

niversitario San Cecilio, G

ranada, España.

Introducción: Los nanotubos de carbono son nanopartículas cilíndricas com

puestas por una o varias capas de grafeno enrrolladas, form

adas por

varios anillos

de átom

os de

carbono perfectam

ente estructurados. Su tamaño varía

desde un diámetro de pocos nanóm

etros hasta varios m

ilímetros de longitud. D

ebido a la baja solubilidad

que presentan

este tipo

de nanopartículas en cualquier solvente com

ún, es necesario

funcionalizarlas, bien

con polielectrolitos o bien con nanopartículas. D

e este m

odo se consigue aumentar su solubilidad

y su biocompatibilidad.

Siguiendo los resultados descritos por Yang y

cols. [1],

en este

trabajo estudiam

os la

posibilidad de

combinar

ambos

tipos de

funcionalización: con polímeros (PEG

) y con nanopartículas

magnéticas.

Estudiaremos

la capacidad

que tienen

estas nanopartículas

compuestas de vehiculizar un fárm

aco como la

doxorubicina, y

comprobarem

os su

eficacia com

o vehículos transportadores de fármacos in

vitro, en cultivos celulares de cáncer de colon. A

demás analizarem

os la capacidad de liberar fárm

acos recubriendo

los com

puestos con

receptores específicos

sobre expresados

por células tum

orales como es el ácido fólico.

Materiales

y M

étodos: La

síntesis y

funcionalización de partículas se realizaron en agua

Milli

Q.

Los productos

químicos

necesarios para la síntesis de nanopartículas fueron

adquiridos a

Sigma

Aldrich,

y los

nanotubos de

carbono fueron

comprados

en cheaptubes.com

. Síntesis

de nanopartículas

magnéticas:

Las nanopartículas de m

agnetita fueron obtenidas de acuerdo

con el

método

de coprecipitación

descrito por

Massart

[2]. B

revemente,

a tem

peratura ambiente se prepara una solución 1

M de C

l3Fe en un volumen de 40 m

L y otra solución de H

Cl 2 M

de Cl2FE 2M

. Am

abas soluciones se m

ezclan bajo agitación mecánica

en una solución acousa 0.7 Mde am

onia. El resultado es un precipitado de color negro. El proceso

de lim

pieza consiste

en decantar

magnéticam

ente este

precipitado, redispersándolo

en m

edio acuoso,

hasta conseguir que la conductividad del sobrenadante sea inferior a 2

S/cm.

Los nanotubos de carbono fueron dispersados con la ayuda de un ultrasonidos en una solución acuosa a pH

2 de ácido nítrico. La funcionalización de los nanotubos con las nanopartículas

magnéticas

fue efectuada

añadiendo gota a gota, una suspensión acousa de

nanopartículas m

agnéticas al

1 %

en

volumen, sobre una suspensión acousa a pH

natural de nanotubos de carbono, con la ayuda de un vortex. La m

ezcla se dejó reposar en contacto toda la noche. La funcionalización con PEG

se realizó suspendiendo los nanotubos de carbono en una solución de PEG

, a pH natural.

Caracterización

eléctrica superficial.

Las m

edidas de la carga eléctrica superficial se realizaron en un dispositivo M

alvern NanoZS.

Las suspensiones fueron preparadas añadiendo una gota de la suspensión sobre la solución al pH

determinado y m

edidas 24 h después de preparar la suspensión.

Cantidad

de doxorrubicina

y ácido

fólico adsorbida/absorbida por las nanopartículas. La concentración de doxorubicina retenida por las partículas fue determ

inada mediante m

edidas de absorbancia

óptica en

un espectrofotóm

etro Perkin-Elm

er Lam

bda 11

UV

-vis spectrophotom

eter (Perkin-Elm

er, U

SA).

Las medidas fueron realizadas a la longitud de

onda de máxim

a absorbancia.

Microscopía confocal.La liberación de fárm

aco antitum

oral en

las células

de colon

fueron evaluadas

por m

icroscopia confocal

en un

dispositivoLeica

Fluorescence M

icroscope (B

ensheim, G

ermany) utilizando un objetivo de

inmersión 63X

.

Experimentos in vivo. El estudio de liberación

de doxorubicina

en cultivos

in vivo

fue realizado sobre células de cáncer de colon D

LD-

1, mantenidas en m

onocapa en medio de cultivo

RPM

I, suplementada con un 10 %

de serum

bovino, 100 U/m

L de penicilina y 100 de estreptom

icina, incubados a 37 º C bajo

una atmósfera del 5 %

de CO2 .

Resultadosy

Discusión:

La eficiencia

del recubrim

iento de los nanotubos de carbono con nanopartículas m

agnéticas fue seguida mediante

microscopía de transm

isión de alta resolución. com

o se puede observar en la Fig. 1.

149

Figura 1.Figura de Microscopia de Transm

ision de

nanotubos de

carbono recubierto

de nanopartículas m

agnéticas.

La funcionalización superficial de los nanotubos con PEG

y con nanopartículas magnéticas fue

evaluado en términos de la m

odificación de su carga superficial, com

o se puede ver en la Fig, 2.

Figura 2.M

ovilidad electroforética

de suspensiones

de nanotubos

de carbono

Transmision

de nanotubos

de carbono

recubierto de nanopartículas magnéticas.

La Fig. 3 muestra la adsorción del fárm

aco doxorrubicina, claram

ente se observa a partir de las

medidas

de m

ovilidad electroforética

en función de la concentración de fárm

aco y esta es tanto

más

positiva cuanto

mayor

es la

concentración de

fármaco.

Por

último,

la incorporación

de uno

de los

receptores específicos sobre expresado en líneas celulares de cáncer, com

o el ácido fólico ha sido seguida en

términos

de m

edidas de

movilidad

electrocinética (ver

Fig. 4).

Com

o puede

apreciarse, las partículas funcionalizadas con PEG

y sin PEG m

uestran punto isoeléctrico, en las

proximidades

de pH

4

y pH

5.5

respectivamente.Finalm

ente la

liberación de

doxorrubicina por los nanotubos decarbono in

vitro en cultivos celulares de células DLD

-1, se m

uestran en la Fig. 4. Com

o puede apreciarse, la liberación de fárm

aco es mayor en presencia

de ácido

fólico com

parada con

la m

isma

formulación de nanopartículas sin funcionalizar

con ácido fólico.

Figura 3.M

ovilidad electroforética

de suspensiones

de nanotubos

de carbón

recubiertos con

nanopartículas m

agnéticas, doxorubicina, y ácido fólico, con y sin PEG

.

Figura 4.Imagen confocal de la liberación de

doxorrubicina por

nanotubos de

carbono recubiertos

de PEG

y

funcionalizados con

nanopartículas m

agnéticas, doxorubicina,

recubiertos y sin recubrir con ácido fólico.

Referencias:

(1) YangF.,

y cols. Magnetic functionalized

carbon nanotubes as drug vehicles for cancer lym

ph node

metastasic

treatment.Eur

J C

ancer;4, 7. (2011)(2)

R.

Massart,

Preparation of

aqueous m

agnetic liquids in alkaline and acidic m

edia, IEEE

Trans. M

agn.17: 1247-

1248 (1981)

Aradecim

ientos:Proyectos

FIS 11/02571

y FIS2010-19493

(Instituto de Salud Carlos III,

España).

150

CO

MPA

RA

TIV

E ST

UD

Y O

F CA

NN

AB

INO

IDS PL

GA

NA

NO

PAR

TIC

LE

S FOR

OR

AL

D

EL

IVE

RY

I.Muñoz-R

ubio,L. Martín-B

anderas, J. Álvarez-Fuentes, M

. Fernández-Arévalo, M

.A. H

olgado

Departm

ent of Pharmacy and Pharm

aceutical Technology, Faculty ofPharmacy, U

niversity of Seville,c/ Profesor G

arcía González, nº 2, 41012 Seville, Spain

luciamartin@

us.es

Introduction: The International Association for

the Study of Pain (IASP) defines neuropathic

pain(N

P) as thatresulting from

diseaseor

damage of the peripheral or central nervous

systems, and from

dysfunction of the nervous system

(1). Drug treatm

ents currently available, norm

ally opioids and anti-inflamm

atory drugs, are not effective in m

any clinical situations. C

annabinoids have

different antinociceptive

mechanism

, providing

a new

line

for the

treatment of N

P that is unresponsive to actual treatm

ents.The problem

is that these actives present

unfavourable characteristicsfor their

oral adm

inistration: not

adequate physicochem

ical properties,

stability or

solubility problem

s (2).

In this

work,

acom

parativestudy

of physicochem

icalcharacteristics

and in

vitro behaviour

of different

poly(D,L-lactide-co-glycolide)

(PLGA

) nanoparticles

(NPs)

containing tw

o cannabinoids is described. The

selected cannabinoids

are 1-

Naphthalenyl[4-(pentyloxy)-1-naphthalenyl]

methanone (C

B13), a C

B1/C

B2 dual agonist

(the selective

activation of

peripheral cannabinoid C

B1 receptors has the potential to

become a valuable therapy for chronic pain)

which displays potent antihyperalgesic activity

in animal m

odels, and limited brain penetration

(3)9-

9-THC

or TH

C), w

hich is the cannabinoid with m

ajor psychoactive activity

(4).

Materials

and M

ethods: 1-N

aphthalenyl[4-(pentyloxy)-1-naphthalenyl]m

ethanone (CB

13)9-tetrahydrocannabinol

(Tocris, G

reat B

ritain), poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLG

A

50:50) R

esomer®

R

G

502 (M

w:

12,000; inherent viscosity: 0.24 dl/g), R

esomer®

RG

502H

(M

w:12,000;

inherent viscosity:

0.19 dl/g), R

esomer®

RG

504 (Mw

:48,000; inherent viscosity: 0.5 dl/g), R

esomer®

RG

504H (M

w:

48,000; inherent viscosity: 0.53 dl/g) and PLGA

75:25,

Resom

er®

RG

752S

(Mw

: 15.000;

inherent viscosity: 0.24 dl/g), were obtained

from B

oehringer Ingelheim (G

ermany),Span®

60,

Tween®

80, Pluronic®

F-68

(Sigma-

Aldrich,G

ermany). A

cetone PRS, H

PLC-grade

acetonitrileand

HPLC

-grade m

ethanol w

ere purchased from

Panreac (Spain); threalose and H

Cl w

ere obtained from V

WR

(Spain).

Formulation of the PLG

A particles:

The NPs w

ere prepared by the nanoprecipitation m

ethod (NPP) (5) in w

hich aco-solution of

PLGA

(1.5% w

/v) and Span® 60 (0.5%

w/v) in

acetone was added dropw

ise at a constant rateinto 15 m

L Pluronic® F68 aqueous solution (0.5

% w

/v) under magnetic stirring. A

fter acetone evaporation,

the particle

suspension w

as centrifuged to collect the N

Ps. Then, the NPs

were

re-suspended in

a threalose

aqueous solution (5%

w/v) used as cryoprotectant and

they were freeze-dried.

For CB

13and TH

C-PLG

A loaded N

Ps, the polym

er and drug were co-dissolved in acetone.

Characterization m

ethods:

The particle size was calculated by a laser

scattering method (Partica LA

-950 V2, H

oriba). The

study of

the geom

etry and

surface m

orphology w

as perform

ed by

scanning electron

microscopy

(SEM)

(Philips X

L-30, Philips

Electron O

ptics). The

electrical characteristics,

zeta potential

(ZP), of

the particle surface w

ere measured w

ith a Malvern-

Mastersizer 2000. C

B13 and TH

C content w

as determ

ined by HPLC

(Hitachi LaC

hrom(D

-7000)

Series) and

expressed in

terms

of entrapm

ent efficiency (EE %).

In order

to show

if

there are

significant differences betw

een the formulations developed,

AN

OV

A statistics studies

were realised in term

s of size and zeta potential. A

value of p< 0.001 w

as considered to be significant.For in vitro drug release, N

Ps samples w

ere suspended

in phosphate

buffer (pH

=7.4) containing 0.1%

w/v of Tw

een® 80, m

aintained at37 ºC

and stirred mechanically.A

liquots were

withdraw

n at fixed time intervals and filtered

upon centrifugation at 10000 rpm. The filtered

sample w

as injected into the HPLC

apparatus for quantifying of drugs (6).

Results and

Discussion: The physicochem

ical characteristics of PLG

A-N

Ps (CB

13-loaded andTH

C-loaded) w

ere listed in Table 1. R

elated toparticle size, it w

as obtained particles in

the nanoscale

rangefor

all form

ulationsassayed.

No statistical differences in size w

ere obtained

(p= 0.0017).

This result

could be

explaineddue to the m

ethod preparation of the PLG

A-N

Ps, nanoprecipitation (NPP). In spite of

151

the differences in theform

ulations, NPP allow

s to

obtain N

Psw

ith narrow

particle

size distribution

(7). M

oreover, the

NPs

surface charge

(zeta potential-ZP)

was

negative for

all sam

plesassayed.

The A

NO

VA

test

shows

statistical differences betw

een the formulations developed

(p= 0,0006) because the different PLGA

used (R

esomer ®

) confer to PLGA

-NPs different

surface charges.B

esides, results obtained for drug content show

high values of EE % for all form

ulations of NPs

developed.

Resom

erD

rugTh. drug

%

w/w

Size (nm) ±

SDPotencial Zeta (m

V) ± SD

EE (%)

R502

THC

1,5 308,34 ± 127,30

33,40 ± 0,3077,7648

R502

THC

3,3 330,74 ± 110,40

28,90 ± 0,4079,1469

R502

CB

1315

319,60 ± 111,30

19,48 ± 0,4083,1356

R502

CB

1333

352,39 ± 161,20

20,23 ± 0,2081,7009

R502H

TH

C1,5

215,71 ± 115,80

42,90 ± 0,4088,8813

R502H

TH

C3,3

259,76 ± 63,80

42,20 ± 1,0094,6954

R502H

C

B13

15236,08 ±

96,2040,19 ± 0,20

89,9016

R502H

C

B13

33279,82 ± 105,60

38,49 ± 0,1084,9772

R504

THC

1,5 313,58 ± 109,40

38,50 ± 0,4070,3875

R504

THC

3,3 359,64 ± 140,70

34,50 ± 0,2064,0488

R504

CB

1315

368,24±

138,1042,29 ± 0,30

77,7050

R504

CB

1333

426,08 ± 194,80

41,30 ± 0,4069,6371

R504H

TH

C1,5

304,59 ± 121,60

40,58 ± 0,2063,9855

R504H

TH

C3,3

310,54 ± 115,30

34,80 ± 0,2070,5174

R504H

C

B13

15385,74 ± 128,40

45,28 ± 0,8056,7229

R504H

C

B13

33410,84 ± 132,10

41,49 ± 0,6053,5276

R752S

THC

1,5 438,49 ± 156,20

39,48 ± 0,5065,7645

R752S

THC

3,3 576,74 ± 228,90

34,40 ± 0,4073,3286

R752S

CB

1315

336,35 ± 114,50

38,49 ± 0,5064,8486

R752S

CB

1333

530,40 ± 184,20

35,39 ± 0,5062,9563

Table 1. Physicochem

ical characteristics and drug loading of C

B13 and TH

C PLG

A-N

Ps.

In Figures 1a and 1bare show

n, as examples,

SEM and TEM

micrographs, for C

B13

and TH

C-PLG

AN

Ps,respectively. A

s it can be seen,

spherical and

smooth

particles w

ere obtained

in all cases with a sim

ilar size.

Figure 1.M

icrophotographiesof PLG

A-N

Ps obtained by (a) SEM

and (b) TEM

Finally, the CB

13and TH

Cin vitro

release profiles from

PLGA

-NPs show

ed the typical drug

release m

echanisms

in PLG

A-based

delivery systems(D

ata not shown).

After

2 h

of assay,

hydrolysis degradation

products ofC

B13

and THC

were not detected

and only a well-defined peak appeared

onits

respectivechrom

atograms,

indicating that

developed PLG

AN

Ps allow

s to

retain cannabinoids

in theirstructures,

reaching the proposed objectives.

Conclusions:

Results obtained allow

to concludethat the

proposed m

ethod(N

PP)has

been able

to produce

cannabinoid-PLGA

-NPs

in a

nanometer

range,w

ith appropriate

surface characteristics

and adequate

EE %

values.

Furthermore, the in vitro

dissolution studies of the assayed form

ulations show adequate and

controlled releaseprofiles of the PLG

A-N

Ps.

References:

(1) J.

Scadding.N

europhatic pain.

AC

NR

, 2003;3: 8-12.(2)N

. Attal et al. A

re oral cannabinoids safe and effective in refractory neuropathic pain?

Eur. J.Pain, 2003;8: 173-177.(3) E.K

. Dziadulew

icz et al. Naphthalen-1-yl-

(4-pentyloxynaphthalen-1-yl)methanone:

A

potent, orally

bioavailable hum

an C

B1/C

B2

dual agonist with antihyperalgesic properties

and restricted

central nervous

system

penetration. J. Med. C

hem., 2007;

50:3851-

3856.(4)

R.

Mechoulam

et

al. The

absolute configuration

of delta-1-tetrahydrocannabinol,

the m

ajor active

constituent of

hashish. Tetrahedron Lett. 12 (1967) 1109-1111.(5) H

. Fessiet al.

Nanocapsule form

ation by interfacial polym

er deposition following solvent

displacement, Int. J. Pharm

., 1989;55: R1–R

4.(6) M

. Hom

breiro-Perez et al. Non-degradable

microparticles containing a hydrophilic and/or a

lipophilic drug:

preparation, characterization

and drug release modeling J. C

ontrol. Release,

2003;88: 413-428.(7)

H.

Xie

et al.

Fabrication of

PLGA

system. J. N

anobiotechnology, 2010;8: article

18.

Acknow

ledgments:

Financial support

from

Junta de

Andalucía,

Spain, Project

P09-CTS-5029,

is gratefully

acknowledged.

152

IN V

ITR

O A

ND

IN V

IVO

EV

AL

UA

TIO

N O

F SUR

FAC

E-M

OD

IFIED

PLG

A N

AN

OPA

RT

ICL

ES

FOR

OR

AL

AD

MIN

ISTR

AT

ION

CO

NT

AIN

ING

A SY

NT

HE

TIC

CA

NN

AB

INO

IDM

.M. D

urán-Lobato, I. Muñoz-R

ubio, M.A

.Holgado, J. Á

lvarez-Fuentes, M. Fernández-A

révalo, L. M

artín-Banderas

Dpto. de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica, U

niversidad de Sevilla, Españaluciam

artin@us.es

Introduction:CB

13, a cannabinoiddrug w

hich produces

high antihyperalgesic

activity is

a highly

lipophilic com

pound w

ith low

w

ater solubility

(~0.001–0.002 m

g/mL).

As

a consequence, this com

pound is incompletely

absorbed when adm

inistered orally (1). Particles com

prised of

poly(lactic-co-glycolic acid)

(PLGA

) have been widely studied as therapeutic

delivery vehiclesto im

prove bioavailability of lipophilic

compounds

and present

special interest

in oral

delivery. H

owever,

PLGA

nanoparticles

(PLGA

N

Ps) present

some

drawbacks e.g.

their limited ability to interact

with

the mucosa. Strategies to im

prove this interaction and escape clearance m

echanisms,

thus improving in vivo biodistribution of PLG

A

nanoparticles, have been developed.M

ost of them

are based

on nanoparticle

surface engineering w

hich can be achieved by surface coating

or incorporating

biodegradable copolym

ers in the formulation (2). In this w

ork, chitosan, vitam

in E, lecithin and Eudragit have been

evaluated in vitro and in vivo as additives to

improve

CB

13-loaded PLG

A

NPs

bioavailability by

means

of particle

surface m

odification.

Materials

and M

ethods:The

NPs

were

prepared by the nanoprecipitation method (N

PP) (3). For C

B13-PLG

A loaded N

Ps, the polymer

and drug were co-dissolved in acetone at a 20 %

w

/w

concentration. To

produce surface

modified PLG

A N

Ps:chitosan, Eudragit RSPO

, Lecithin, and vitam

in E were co-dissolved in the

polymer solution except for chitosan w

hich was

added in an additional step (after NP form

ation). For this purpose, N

Ps w

ereincubated in a

chitosan solution

overnight (0.25

%

w/v

chitosan in

acetic acid

1%

v/v) and

then collected by centrifugation.

Cell viability C

B13

loaded-PLGA

nanoparticles

and surface

modified

nanoparticles were

measured by M

TT assay in H

uman colon adenocarcinom

a cells, C

aco-2 cells

(Am

erican Type

Culture

Collection)

as described previously (4). The cells w

ere incubated with the C

B13-loaded N

P suspensions or C

B13 at concentrations ranging

from 0.025 to 25

mg/m

L for 24 and48h.C

ells w

ithout particles were used as a negative control

and cells incubated with D

MSO

asa positive

control.C

ell viability was calculated

as the percentage of absorbance referred to the control m

ean value of absorbance. To quantitatively

measure

in vitro

cellular uptake

of nanoparticles, C

aco-2 cells were cultivated in

culture flasks until 80% confluence. Then, the

medium

was changed w

ith nile red-loaded NPs

suspension in culture medium

(500, 250 and 100

mg/m

L).A

fter2

hof

incubation, the

suspension was rem

oved and the flasks were

washed w

ith medium

. The cells were rem

oved w

ith a trypsinsolution (1x) and the am

ount of fluorescence

present in

each w

ell w

as then

500 MPL). A

s a qualitative cellular uptake study, cells w

ere seeded in a chamber

(250 uL of a 4 m

g/mL N

Ps suspension) (Ibidi, Germ

any) until 80 %

of confluence. After that, cells w

ere incubated w

ith a medium

suspension containing nile red N

Ps for 2 h. Then, cells were w

ashed w

ith PBS and then fixed w

ith paraformaldehyde

(PFA) The nuclei w

ere counter stained with

Hoescht 33258

andobserved by confocal laser

scanning microscope (C

LSM) (Zeiss LSM

410). To

determine

the N

Ps biodistribution,

fluorescently labeled

particles w

ere orally

administered

to unchallenged

twelve

weeks

CD

/57 male m

ice (25- 30 g).Seven groups of

three mice per group

were treated w

ith 4 mg of

labeled NPs in 0.2 m

L sterile saline by oral gavage.

After

1 and

4 days,

organs w

ere collected and hom

ogenized on ice in PBS and

analyzed for fluorescent particles on a plate reader

(Biotek,

Winooski,

Verm

ont) at

excitation and emission

wavelengths of 488 nm

and 525 nm

, respectively.

Results and discussion:

After N

PP synthesis PLG

A N

Ps resulted in 320-420 nm w

ith almost

narrow

size distribution.

NPs

treated w

ith chitosan

and Eudragit

showed

positive zeta

potential (ZP) values. On the other hand, plain

PLGA

NPs and those elaborated w

ith lecithin and vitam

in E resulting in negative ZP. In order to

increase the

mucoadhesion

properties to

retain drugs at a site of action positively charged N

Ps are required. In this sense, CS-PLG

A and

Eud-PLGA

are a priorithe m

ost suitable NPs

for CB

13 oral drug delivery.M

TT assays after 24 and 48 h demonstrated that

formulations assayed w

ere non cytotoxic.

153

Figure 1.

Caco2

cell viability

after 48h

of incubation w

ith surface-modified PLG

A N

Ps containing C

B13

Cellular uptake of N

Ps was

studied qualitatively and

quantitatively by

CLSM

andflow

cytom

etry (figure

3), respectively.

Figure 2

showC

LSM

microphotographs

where

it is

possible to observe the internalization of NPs

into Caco2 cell, used as

gastrointestinal mucosa

model.

Figure 2. CLSM

images of C

aco2 cells after 2h exposure w

ith plain PLGA

NPs

(red: nile red N

Ps; green: nuclei)

Figure 3.

Quantitative

analysis by

flow

cytometry of uptake rate in C

aco-2 cells after 30 and 120 m

in incubation of CB

13 loaded-PLGA

nanoparticles.

NPs biodistribution w

as evaluated after 1 and 4 days after oral adm

inistration into mice. N

Ps accum

ulation into heart, liver, kidney, lung, spleen

and brain

were

quantified by

fluorescence m

easurements.

Results

obtained are

summ

arized in

figure 3.

NPs

were

accumulated

mainly

in spleen

and liver

followed by brain, kidney, lungs and heart.

Nevertheless, chitosan-PLG

A N

Ps showed the

lower accum

ulation in all the analyzed organs.

Figure 3.

Tissue distribution

graphicallyrepresented

as a

measure

of percentage

of particles detected of the total particles

(n=3) (error bars indicate SD

): (a) 24 hoursand

(b) 4 day

Successful in

vivodrug

delivery for

oral adm

inistration m

ay require

not just

a w

ell-defined

nanostructure but

also a

low

cytotoxicity, cellular

uptake efficacy

by the

gastrointestinal gut

and long

circulating efficacy. In present w

ork, various PLGA

NPs

coated w

ith C

S, Eudragit

RSPO

and

other additives

were

successfully elaborated.

CS-

PLGA

and Eu-PLGA

NPs resulted positively

charged and were effectively uptaken by C

aco2 cell. In vivo distribution assays dem

onstrated a low

er amount of C

S-PLGA

NPs sequestered in

spleen, liver and kidney. Based in the above

results, these polymeric N

Ps are presented as good candidate for oral delivery of C

B13.

References:

(1) G

ardin, A

. et

al. C

annabinoid R

eceptor A

gonist 13, a Novel C

annabinoid Agonist: First in

Hum

an Pharm

acokinetics and

Safety. D

rug M

etab. Dispos. 2009; 37: 827-833. (2) des R

ieux, A

. et al. Nanoparticles as potential oral delivery

systems of proteins and vaccines: A

mechanistic

approach. J. Control. R

elease, 2006, 116, 1-27. (3) Fessi

H.

et al.

Nanocapsule

formation

by interfacial polym

er deposition following solvent

displacement. Int. J. Pharm

. 1989; 55: R1–R

4. (4) V

ihola, H

. C

ytotoxicity of

thermosensitive

polymers

poly(N-isopropylacrylam

ide), poly(N

-

poly(N-vinylcaprolactam

), Biom

aterials 26 (2005) 3055–3064A

cknowledgm

ents: L. M

.-B. and M

. D. L. are especially grateful to

the Junta de Andalucía (Spain) (Project N

r. P09-C

TS-5029) and IVPlan Propio (U

niversidadde

Sevilla). We thank also M

icroscopy and NM

R

services of CITIU

S (University of Seville) for

technical assistance.

Fi3

Qtit

til

ib

f

154

INC

OR

POR

AC

IÓN

DE

FLA

VO

NO

IDE

S EN

LIPO

SOM

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A E

STR

UC

TU

RA

, VE

HÍC

UL

O Y

EFIC

IEN

CIA

AN

TIO

XID

AN

TE.

J.Morales 1, P. B

ustos 1,E Lem

p2,A

. Zanocco2, G

. Günther 2.

1Departam

ento de Ciencias y Tecnología Farm

acéuticas, Universidad de C

hile.2D

epartamento de Q

uímica O

rgánica y Fisicoquímica, U

niversidad de Chile.

Introducción: Los flavonoides son compuestos

polifenólicos am

pliamente

distribuidos en

el reino

vegetal. En

muchos

estudios se

han descrito sus

propiedades beneficiosas para la salud, destacando el rol que cum

plen en la prevención de enferm

edades cardíacas y cáncer. Las

propiedades farm

acológicas de

los flavonoides

están relacionadas

a su

efecto antioxidante,

protegiendo a

los organism

os vivos que sufren estrés oxidativo, del daño que producen

radicales libres

y otras

especies reactivas, incluyendo al oxígeno excitado. El oxígeno

molecular

singulete (O

2 ( 1g ))

es el

estado de mayor energía del oxígeno m

olecular, norm

almente presente en sistem

as en los cuales hay un desbalance entre el sistem

a antioxidante y

la producción

deespecies

oxidantes. Las

reacciones del O2 ( 1

g ) son importantes en los

sistemas biológicos, en los cuales puede ejercer

un papel

nocivo (dañando

valiosas biom

oléculas) y/o

un papel

benéfico, principalm

ente debido a su uso en la terapia fotodinám

ica del cáncer. Los

flavonoides se

han propuesto

como

antioxidantes en formulaciones para productos

farmacéuticos y de alim

entos funcionales. Sin em

bargo, el uso de estos compuestos es lim

itado por

restricciones de

solubilidad en

agua e

inestabilidad

bajo ciertas

condiciones

de tem

peratura, luz y pH.

El objetivo

de este

trabajo fue

estudiary

caracterizar la incorporación de flavonoides en sistem

as m

icroheterogéneos de

interés farm

acéutico (liposom

as, fantasm

as de

eritrocitos y nanopartículas de sílice) y evaluar sus propiedades antioxidantes frente al oxígeno m

olecular singulete.

Materiales y M

étodos:Q

uercetina (QU

ER),

canferol (C

AN

F) y

morina

(MO

R)

fueron seleccionados

como

flavonoides de

estudio. Liposom

as unilam

elares de

DPPC

, PO

PCy

mezcla de am

bos, obtenidos por extrusión y sonicación, fueron preparados en el laboratorio. Las m

embranas de eritrocitos

(gosth)fueron

obtenidas por

hemólisis

de sangre

de voluntarios

sanos. N

anopartículas de

sílice fueron sintetizadas por hidrólisis de TEO

S y posterior m

odificación superficial con grupos N

H2 .

Se evaluó la incorporación de flavonoides en liposom

as y mem

branas de eritrocitos mediante

la determinación del coeficiente de reparto y

modulación

de la

fluidez de

la m

embrana,

utilizando pruebas

fluorescentes (laurdan

y D

PH) que se ubican a distintas profundidades en

la bicapa.En las nanopartículas de sílice se determ

inó la eficiencia

de incorporación

de estos

antioxidantes, dependiendo

del tam

año, potencial

superficial por

modificaciones

estructurales y pH del m

edio de dispersión.En todos los sistem

as propuestos se estimó

la capacidad

antioxidante frente

a oxígeno

molecular

singulete, generado

por fotosensibilización, m

ediante determinación de

la reactividad

química

bajo condiciones

experimentales de estado estacionario.

Resultados y D

iscusión:La Tabla 1 m

uestra los resultados del reparto

de los flavonoides estudiados en sistem

as hidrofílico / lipofílico (sistem

a octanol / medio

tamponado; liposom

a / fase acuosa externa. Los hidroxilos

de estos com

puestos tienen

una fracción

ionizada dependiendo del pK

a del grupo sustituyente y delpH

del medio. Los resultados m

uestran que en un m

edio tamponado a pH

7,4, sólo el hidroxilo

ubicado en posición 3 del anillo C de

morina

se encontraría

ionizado, y

el de

quercetina y

canferol, se

encontrarían parcialm

ente desprotonados. Al aum

entar el pH

del medio, aum

entaríamos

la ionización de este hidroxilo en C

-3 y también del O

H ubicado en

la posición 5 del anillo A. A

pHfisiológico, este

hidroxilo que se encuentra ionizado, favorecería su interacción con la superficie de

liposomas

con carga positiva (DO

DA

C). Los liposom

as de PO

PC / D

PPC sintetizados, poseen un

potencial zeta

negativo, interacción

mem

brana –

flavonoide m

odulada por

el efecto

de la

densidadelectrónica de los grupos hidroxilos

que no se encuentran ionizados a este pH.

Tabla 1: Valores obtenidos para el coeficiente

de reparto de los flavonoides

FLAV

log D (distribución) o log P (partición)

Octanol /

tampón

pH 7.4

Liposomas

POPC

/DPPC

(7:3)

Liposomas

DO

DA

C

QU

ER2.8

3.84.5

MO

R1.9

5.05.4

CA

NF

3.54.5

5.2

155

2025

3035

4045

50-0,5-0,4-0,3-0,2-0,10,00,10,20,30,40,5

Liposomas blancos

Liposomas con flavonoide

G P

T / oC

0,02,0x10

-54,0x10

-56,0x10

-58,0x10

-51,0x10

-41,2x10

-40,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

quercetina m

orina canferol

Anisotropia

Flavonoide / molar

En cuanto al efecto de flavonoides sobre la m

odulación de la fluidez de mem

branas(Figura

1 y Figura 2), se observa que para liposomas

con los antioxidantes incorporados, existe un decrem

ento de losvalores de la polarización

generalizada de Laurdan (GP),

en comparación

a los datos obtenidos en liposomas blancos

(Figura 1). Esto se debe al cambio en el acceso

del agua enel m

icroentorno donde está ubicada esta

prueba fluorescente

por presencia

del flavonoide.

Así,

los

flavonoides y

laurdan com

partirían una

ubicación sim

ilar en

la m

embrana. Sin em

bargo, no se aprecia cambio

en la temperatura crítica por presencia de los

tres flavonoides en la bicapa, resultado que es corroborado con los datos de la anisotropía de D

PH en eritrocitos (Figura 2). La anisotropía es

utilizada para obtener datos sobre la estructura y dinám

ica de la porción hidrocarbonada (zona hidrofóbica) de las m

embranas, evaluando la

microviscosidad.

Figura 1:

Variaciones de

GP de laurdan en

liposomas

POPC

/DPPC

. Efecto

de la

incorporación de flavonoide morina.

Figura 2: Cam

bios de la anisotropía (DPH

) en m

embranas de eritrocitosV

alores obtenidos para el coeficiente de reparto de los flavonoides.

Respecto a la reactividad de estos antioxidantes

con oxígeno excitado (Tabla 2), los valores obtenidos

en m

edio m

icroorganizados presentan diferencias de m

agnitudes conlos de

medio hom

ogéneo, sin embargo, el orden de

reactividad es similar:

morina>quercetina>canferol.

La inhom

ogeneidad característica

de las

bicapas lipídicas propicia un medio

de óptimo

para la reacción de flavonoides con oxígeno m

olecular singulete con similitudes a un

medio

con menor polaridad que el etanol, otorgado por

la presencia

de grupos

gliceroles en

lasm

embranas

fosfolípidicas. Los

valoresobtenidos

en m

embranas

de eritrocitos

mantienen

latendencia

a los

resultados obtenidos para liposom

as. La mem

brana de los eritrocitos

contiene –al

igual que

todas las

mem

branas naturales-

una gran

cantidad de

proteínas, las cuales otorgan unm

edio ambiente

distinto.

Tabla 2:

Constantes

experimentales

de reactividad

química

en m

edios m

icroheterogéneos.

La incorporación

de los

flavonoides en

nanopartículas de sílice se incrementa (90-95%

) cuando se m

odifica la superficie del vehículo con

grupo N

H2 ,

en com

paración con

las nanopartículas porosas con grupos O

H, donde el

porcentaje de

antioxidante adsorbido

se encuentra por debajo del 10%

. Sin embargo, las

nanopartículas con

grupos N

H2

tienen problem

as de dispersión en medio acuoso, lo

cual puede ser mejorado con la adición de PEG

, agente que tam

bién favorece la cesión de los com

puestos antioxidantes.

Referencias:

Javier Morales, G

ermán G

ünther, Antonio L

Zanocco, Else Lemp.Singlet O

xygen Reactions w

ith Flavonoids. A

Theoretical -Experimental Study.

Plos one (ISI). Julio 2012. Volum

e 7. Issue 7. e40548

Agradecim

ientos:Proyecto V

ID I09/05-2 U

niversidad de Chile.

Proyecto Fondecyt de Iniciación No11121172.

FLAV

Constante experim

ental( kEX

P ) / s -1

Liposomas

POPC

Liposomas

POPC

/DPPC

(7:3)

Mem

branaEritrocitos

QU

ER4.3 x 10

-4

(1.6 x 10-5)

3.6 x 10-4

(9.5 x 10-6)

6.3 x 10-4

(7.8 x 10-5)

MO

R5.4 x 10

-3

(1.6 x 10-4)

3.6 x 10-3

(1.5 x 10-4)

2.6 x 10-3

(9.4 x 10-5)

CA

NF

1.3 x 10-4

(5.9 x 10-6)

1.7 x 10-4

(8.1 x 10-6)

1.6 x10-4

(1.7 x 10-5)

156

OPT

IMIZA

TIO

N O

F O/W

NA

NO

-EM

UL

SION

S SUIT

AB

LE

FOR

DR

UG

DE

LIV

ER

YB

Y A

CE

NT

RA

L C

OM

POSIT

E FA

CT

OR

IAL

DE

SIGN

G. M

orral Ruíz

1*,P. Melgar-Lesm

es 1,M.L. G

arcía2, C

. Solans 3*, M.J. G

arcía-Celm

a1*

1Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Unidad I+D

asociada al CSIC

, Facultad de Farm

acia, Universidad de B

arcelona, Spain.2D

epartamento de Fisicoquím

ica, Facultad de Farmacia, U

niversidad de Barcelona, Spain.

3Departam

ento de Nanotecnología Q

uímica y B

iomolecular, IQ

AC

-CSIC

, Barcelona, Spain.

*Centro de Investigación de B

iomedicina en R

ed en Bioingeniería, B

iomateriales y N

anomedicina

(CIB

ER-B

BN

).

Introduction:N

ano-emulsions are

aclass of

emulsions w

itha uniform

and very small droplet

size ranging between 20 and 200 nm

1. Ow

ing to their

small

size, som

e nano-em

ulsions are

optically transparent or translucent appearingm

icroemulsions but they are non-equilibrium

system

s and therefore require energy input for their form

ation. Nevertheless, in spite of being

thermodynam

ically unstable dispersions, they m

ayexhibit a long kinetic stability. A

ll of these characteristic properties m

akenano-em

ulsionsidoneous system

s for different applications in chem

ical, cosm

eticaland

pharmaceutical

fields 2,3. The choice of composition variables as

well as the suitable preparation m

ethod plays a key role in the form

ation of nano-emulsions

with a sm

all droplet size and low polydispersity

index. In this context, experimental design is a

useful tool to evaluate the influence of differentcom

positionvariables collectively, contrasting

to the conventional method in w

hich one only variable

is studied

while

the others

remain

constantand the combined effect of all variables

is not taken into consideration4.T

he aimof this

research has been to study the formation of O

/W

nano-emulsions

in w

ater(W

)/ nonionic

surfactant(S)/ nonionic cosurfactant

(coS)/ oil system

s w

ith biocom

patible com

ponents suitable for drug delivery and to optim

ize these nano-em

ulsions through

the study

of com

position parameters by

a central composite

factorial design.M

aterials and methods: The phase diagram

s of

water/

Crem

ophor ®EL:

Poloxamer

188/ saturated

medium

chain

triglyceride system

s w

ere determined visually

at 25ºC by stepw

ise addition of one com

ponent to the mixture of the

other com

ponents.A

fter each

addition the

samples w

ere stirred, homogenized

and kept at 25ºC

. N

ano-emulsions w

ere preparedat 50ºC

by the Phase

Inversion C

omposition

(PIC)

emulsification m

ethod5

through the addition of w

ater to oil/surfactant/cosurfactant

mixtures

under mechanical stirring at 2500 rpm

using a vibrom

ixer. The m

ean droplet sizesand polydispersity index

of nano-emulsions w

ere determined at 25ºC

just

after preparation by Dynam

ic Light Scattering (D

LS) using

a Zetasizer

nano Zs

(Malvern

Instruments, U

K).

Nano-em

ulsionsform

ulationsw

ere optimized

by a central composite factorial design

which

allows generating a specific response surface

through the statistical analysis of the selected variables.In this study, w

e selected the droplet size

and polydispersity

index as

dependent variables

andthree com

positionparam

eters (S, C

oSand

water

concentration)w

hich w

ere studied at five different levels

as independent variables. Therefore, a m

atrix with a total of 16

experiments

was designed using Statgraphics

Centurion

software.

Response

surfaces w

ere represented

by a

second-order polynom

ial regression m

odelas show

n in the following

equation:y=b

0 +b1 (x

1 )+b2 (x

2 )+b3 (x

3 )+b12 (x

1 x2 )+b

13 (x1 x

3 )+b

23 (x2 x

3 )+b11 (x

1 ) 2+b22 (x

2 ) 2+b33 (x

3 ) 2

where y corresponds to the m

easured response, x

i to the influence ofindependent variable iand b

ii to the effect derived of interaction between

different independent

variables.The

significance of

the effects

and interactions

between variables w

ere performed through the

analysis of variance (AN

OV

A).

Results

and D

iscussion:A

liquid

isotropic region

corresponding to

nano-emulsions

and m

icroemulsions

was identified in the

water/

Crem

ophor ®EL:

poloxamer

188/ saturated

medium

chain triglyceride systems

as shown in

Fig.1.

Figu re 1:Liquid isotropic region (shadow

ed areas) determ

ined visually at 25ºC in the w

ater/C

remophor ®

EL: poloxam

er 188/

saturated m

edium chain triglyceride system

s.

gy

yg.1.

157

In order

to optim

ize the

nano-emulsion

formulations,

a central

composite

factorial designed

was

developed. Surfactant

concentration (corresponding

to O

/S ratio

expressed in %S), cosurfactant

concentration (corresponding to S/C

oS ratio and expressed in %

CoS) and w

ater concentrationw

ere selected as the m

ost influencing factors that might affect

the physicochem

ical properties

of nano-

emulsions.

Droplet

size and

polydispersity index

were

selectedas

main

nano-emulsion

properties to evaluate. Experimental m

atrix with

droplet size and polydispersity index values obtained

by DLS for each experim

ent is plotted in table 1.

Table

1:Experim

ental field

for a

central com

posite design matrix: Form

ulation variables and m

easured response (mean droplet size and

polydispersity index) in nano-emulsion system

s.

To evaluate the statistical significance of the effects and their interactions derived of the influence

of independent

variables in

nano-em

ulsion properties,

AN

OV

A

statistical test

were perform

ed for each factor by Pareto charts (Fig.2).

Figure 2:

Pareto chart

of the

standardized effects on the m

eandroplet size of O

/W nano-

emulsions.

Factorial design

showed

five statistically

significant effects in the nano-emulsion droplet

size with a p

value lower than 0.05. Thereby,

the concentration

of surfactant

and w

ater provided a negative effect

in the mean

droplet

contrasting to

the cosurfactant

concentrationw

hichshow

ed a positive effect.To establish the relationship

between the factors

and the response, quadratic polynomial equation

was

calculated and

the three-dim

ensional response surface w

as plotted (Fig 3).

Figure 3: Response surface of nano-em

ulsion droplet diam

eter as a function of surfactant and co-surfactant concentration. A

s shown in Fig 3, for a constantconcentration

of water (90w

t%),the form

ation of O/W

nano-em

ulsions w

ith a

small

droplet diam

eter is

achieved with low

concentration of CoS but

high concentration of surfactant. Moreover, a

lineal correlation between surfactant and co-

surfactant concentration with the droplet size

was observed.

Therefore, w

e can

conclude that

low

concentrations of

poloxamer

188 and

high concentrations

of surfactant

are required

to obtain O

/W nano-em

ulsions with the sm

allest droplet size and low

polydispersity index.

References:

(1)Solans C

. et al. Nano-em

ulsions.C

ur Op

Colloid Inter Sci. 10: 102-110 (2005).

(2) Sadurní N. et al.Studies on the form

ation of O

/W

nano-emulsions,

by low

-energy em

ulsification m

ethods, suitable

for pharm

aceutical applicationsJ. Pharm

. Sci. 26: 438-445

(2005).(3) M

orral G. et al. Form

ation of Pegylated polyurethane

and Lysine-coated

polyurea nanoparticles

obtained from

O

/W

nano-em

ulsions. Langmuir28: 6256-6264

(2012). (4) M

ontgomery D

.D

esign and Analysis of Experim

ents,7th

Edition. W

hiley and

Sons eds., N

ew Y

ork, 2010.(5) Solè I.

Nano-em

ulsions prepared by the phase

inversion com

position m

ethod: preparation variables and scale up.

J Colloid

Interface Sci.344:417-23(2010).

Aknow

legments:

The authors acknowledge the sponsorship of the

Spanish Ministry of Education and Science,

DG

I (CTQ

2011- 29336 - C03 - 03 / PPQ

),“G

eneralitat de Catalunya” D

UR

SI (Grant 2009

SGR

-961) and CIB

ER-B

BN

.

158

CA

RA

CT

ER

IZAC

IÓN

DE

L PR

OC

ESO

DE

FRA

CC

ION

AM

IEN

TO

DE

L A

CID

O

HIA

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RÓ

NIC

O PO

R U

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S PAR

A SU

EM

PLE

O E

N L

A E

LA

BO

RA

CIÓ

N D

E

HID

RO

GE

LE

S DE

HA

/PLU

RO

NIC

F-127 A

. Oliva

1, C. M

onzón,A. Santoveña, M

. Llabrés, J. Fariña 1D

epartmento de Ingeniería Q

uímica y Tecnología Farm

acéutica, Facultad de Farmacia,

Universidad de La Laguna, 38200, Tenerife, España

Introducción El

ácido hialurónico

(HA

) es

un polím

ero natural com

puesto de cadenas lineales de -1,3-

N-acetilglucosam

ina y -1,4 ácido glucurónico

con un peso molecular de hasta 6 m

illones de D

alton. El

HA

es

un im

portante com

ponente de

la m

atriz extracelular

en el

tejido conectivo te y particularmente abundante

en el humor vítreo y fluidos sinoviales. D

ebido a su im

munoneutralidad ha sido am

pliamente

utilizado com

o m

aterial biocom

patible y

biodegradable para

la adm

inistración de

fármacos,

en procesos

de regeneración

de tejidos, sutura de heridas y com

o promotor de la

absorción de fármacos y proteínas (C

ho et al, 2003).

Sin em

bargo, los

hidrogeles de

HA

m

uestran unas pobres propiedades mecánicas

con una rápida degradación in vivo debido a su elevada capacidad de adsorción de agua y a la degradación

enzimática

por la

hialuronidasa (Lee

et al,

2010). Los

hidrogeles

de H

A/Pluronic-F127

representan un

tipo de

hidrogeles con

una transición

sol-gel dependiente

de la

temperatura,

con unas

excelentes propiedades de adhesión a los tejidos y

podrían ser

una alternativa

para la

administración de fárm

acos (Lee et al, 2010). Para la síntesis de este tipo de hidrogeles se requiere H

A de bajo peso m

olecular (~130kDa).

En este

punto,

los ultrasonidos

han sido

aplicados en

procesos de

degradación de

polímeros,

reacciones de

copolimerización,

reacciones quím

icas de

diferente naturaleza,

purificación de

polímeros

dado que perm

ite elim

inar las

fracciones de

elevado peso

molecular y en el fraccionam

iento de HA

. En este tipo de estudios, el peso m

olecular es uno de los factores determ

inantes de la eficacia del proceso que puede ser controlado durante la degradación por ultrasonidos. A

diferencia de la degradación física o quím

ica, la degradación por ultrasonidos

es un

proceso no

aleatorio y

reproducible si

se m

antienen constantes

las condiciones del proceso y adem

ás, sus efectos son perm

anentes (Mahalik et al. 2005, G

rönroos et al. 2008). La velocidad y extensión de la degradación dependen de la concentración de polím

ero, duración y potencia del ultrasonido y de la naturaleza quím

ica del disolvente y del polím

ero. Hay varios m

odelos que describen la evolución

del peso

molecular

durante la

sonicación, la mayoría de ellos basados en la

cinética de distribución continua (Madrás y col.

2003). El objetivo de este trabajo fue obtener H

A de bajo peso m

olecular a partir de un proceso

de fraccionam

iento por

ultrasonidos para utilizarlo posteriorm

ente como producto de

partida en

la síntesis

de hidrogeles

de H

A/Pluronic. En segundo lugar, com

probar si el proceso de degradación del H

A por ultrasonidos

sigue un

proceso no

aleatorio aplicando

el m

odelo de Madras y col. (2003) basado en

cinéticas de distribución continua.M

ateriales y Métodos

Fraccionamiento del ácido hialurónico (H

A)

comercial

Se utilizó una solución al 1% de H

A (Fluka) en

tampón fosfato (PB

S) sumergida en un baño de

agua-hielo a una temperatura entre 0-4ºC

que fue

sonicada utilizando

una sonda

de ultrasonidos

(SON

IFIERTM

150) a

una frecuencia de 35kH

z y una densidad de potencia de 0,2 W

/mL. Se tom

aron alícuotas a intervalos de

tiempo

regulares durante

3 horas

y se

analizaron inmediatam

ente por duplicado. D

eterminación del peso m

olecular absoluto Se utilizó un crom

atógrafo Waters com

puesto por una bom

ba (modelo 600E), un inyector

automático

(Wisp

700), una

columna

Ultrahydrogel

lineal (W

aters), y

un refractóm

etro diferencial

(Modelo

410) conectado en línea a un detector de dispersión de

luz laser

multiángulo

(Treos ®

, W

yatt Technology).

Am

bos detectores

fueron calibrados previam

ente. Se asignó un valor de dn/dc de 0,155 m

L/g para el ácido hialurónico y sus derivados. La adquisición y análisis de los datos se realizó a través del program

a ASTR

A®

(W

yatt Technology). M

odelo teórico C

onsiderando que la rotura de la cadena del polím

ero (Px) se produce en el punto medio

dando lugar

a dos

cadenas hijas

de pesos

moleculares

similares,

el proceso

puede ser

descrito como:

Ec. 1 A

sumiendo que la constante de degradación K

(M) viene dada por:

KEc. 2

Esta expresión indica que la degradación no progresa cuando se alcanza un peso m

olecular lím

ite (MLim ) y la velocidad de degradación k,

es independiente del peso molecular.

Aplicando una cinética de distribución continua,

considerando los mom

entos de la distribución de los pesos m

oleculares y asumiendo unas

159

condiciones iniciales

adecuadas (para

más

detalles ver

Konaganti

y M

adras 2010),

obtenemos:

Ec. 3

Donde

Mt

representa la

variación del

peso m

olecular (en

número)

con el

tiempo

de sonicado t, en función de un peso m

olecular inicial (M

o ) y un peso molecular lím

ite que corresponde a la cadena m

ás pequeña que se puede obtener en el proceso de degradación (M

Lim ). R

esultados y Discusión

La Figura 1 muestra el ajuste de la variación del

peso molecular (en núm

ero) con el tiempo,

considerando el modelo de M

adras y col (2003).

Figura 1. Variación del peso

molecular en

número con el tiem

po de sonicado de acuerdo con el m

odelo de Madras y col.

Com

o puede verse, el peso molecular desciende

rápidamente en una prim

era fase, antes de 30 m

inutos, pasando

de 6700kD

a a

menos

de 1000kD

a y posteriormente progresa lentam

ente hasta alcanzar un peso m

olecular límite.

Figura 2. Variación de la polidispersidad del

HA

con el tiempo de sonicado.

Por el

contrario, la

polidispersidad (pd)

se aproxim

a a la unidad (pd media de 1,055) lo que

pone de manifiesto que el fraccionam

iento de

HA

por ultrasonidos permite obtener polím

eros m

onodispersos (Figura 2).

La representación del Ln (H1 ) vs tiem

po permite

obtener la constante de velocidad del proceso 4,47·10

-8 (mol·g

-1·min

-1), mientras que el peso

molecular lím

ite fue de 257kDa (Figura 3). Este

resultado confirma que la rotura del H

A por

ultrasonidos sigue

un proceso

no aleatorio,

donde la cadena inicial se fragmenta en dos

cadenas hijas y así sucesivamente, hasta un peso

molecular lím

ite.

Figura 3. Representación del ln (H

1) frente al tiem

po de sonicado de acuerdo con el m

odelo de Madras y col.

Los resultados obtenidos indican que bajo las condiciones de trabajo del ultrasonido es posible obtener H

A de bajo peso m

olecular (en peso), ~270kD

a, prácticamente m

onodisperso, aunque lejos del objetivo inicial, ~130kD

a. Dado que la

velocidad y extensión de la degradación del HA

depende

de varios

factores, es

necesario optim

izar las

condiciones de

trabajo por

ultrasonido para obtener HA

de peso molecular

inferior a 150kDa.

Referencias:

1) Cho, K

et al., Int. J. Pharm. 260:83-91

(2003). 2) Lee, Y

et al., Soft Matter 6:977-983 (2010).

3) Mahalik JP, M

adras G, Ind. Eng. C

hem. R

es. 44:6572-6577 (2005) 4) G

rönroos A et al., U

ltrason. Sonochem.15:

644-648 (2008) 5) C

hattopadhyay S, Madras G

, J. Appl. Polym

. Sci. 88:2812-2822 (2003) 6) K

onaganti VK

, Madras G

, Ultrason.

Sonochem.17: 403-408 (2010)

Agradecim

ientos: -

Este trabajo

ha sido

financiado por

el M

inisterio de Economía y C

ompetitivdad de

España (Proyecto SAF2010-17083)

160

DE

VE

LO

PME

NT

OF N

AN

OC

ON

JUG

AT

ES FO

R E

NZY

ME

RE

PLAC

EME

NT

THE

RA

PY:

DE

FINIT

ION

OF A

N A

DEQ

UA

TE

FRE

EZE

-DR

YIN

G PR

OT

OC

OL

M O

liva1,2,3, M

Enjuanes 2,3, F Andrade

4, MI G

iannotti 1,2,5, F Sanz1,2,5

1 Biomedical Research Center on Bioengineering, Biom

aterials and Nanom

edicine (CIBER-BBN), Zaragoza.

2 Nanoprobes &

Nanosw

itches Group, Institute for B

ioengineering of Catalonia (IB

EC), B

arcelona. 3 Pharm

aceutical Technology Departm

ent, Universitat de B

arcelona, Barcelona.

4Laboratory of Pharmaceutical Technology, LTF/C

ICF. U

niversity of Porto, Porto, Portugal.5 Physical C

hemistry D

epartment, U

niversitat de Barcelona, B

arcelona.

moliva@

ibecbarcelona.eu

Introduction:

Fabry disease is an X-linked recessive disorder

caused by a deficiency of lysosomal hydrolase

-galactosidase A

(G

LA).

Current

enzyme

replacement therapy (ER

T), with exogenously

administered recom

binant enzyme, has a lim

ited treatm

ent efficacy because the enzyme m

ay be opsonized, due to the lack of effective protein delivery

systems

that allow

the

controlled release of G

LA into the lysosom

es. In that respect, w

e have recently developed functional trim

ethyl chitosan (TMC

)-based polyelectrolyte com

plexes (PECs) through self-assem

bly and ionotropic gelation, able to release the enzym

e at acidic pH

[1]. These PEC nanoparticles w

ere stable

and active

under physiological

conditions, and were efficiently internalized by

human endothelial cells and m

ostly accumulated

in lysosom

al com

partments.

The superior

physicochemical characteristics of these PEC

s together

with

their excellent

cellular uptake

properties indicate their enormous potential as

advanced protein

delivery system

s for

the treatm

ent of Fabry disease. How

ever, stability in liquid m

edium during storage w

as found to be a m

ajor limitation for these system

s. To overcom

e this problem, lyophilization should be

an appropriate method for isolating PEC

s in solid state. The aim

of this work w

as therefore to establish the adequate conditions for freeze-drying (FD

) TM

C/G

LA PEC

s. To this end, dynamic light

scattering (DLS) and atom

ic force microscopy

(AFM

) analyses were perform

ed in a routine w

ay to all samples in order to evaluate the

suitability of the assayed methods.

Experim

ental:

Polyelectrolyte complexes form

ation :R

ecombinant G

LA (obtained by transient gene

expression in

the H

EK

293F cell

line and

purified by affinity chromatography [2]) w

as kindly supplied by D

r. J.L. Corchero and Prof.

A.

Villaverde

from

the Institute

for B

iotechnology and Biom

edicine, Autonom

ous U

niversity of Barcelona (IB

B, U

AB

). TM

C

was

synthesized in

our lab

from

comm

ercially available middle-viscous chitosan

(Fluka) with a deacetylation degree of 87%

(as determ

ined by 1H N

MR

), following a tw

o-step m

ethod described in the literature [3]. For PECs preparation, penta-sodium

triphosphate (TPP, Fluka), used to induce ionotropic gelation, w

as first dissolved in a GLA

solution (100 g/m

L in 10 m

M H

EPES buffer pH 7.4) to a concentration

of 23 g/m

L. Afterw

ards, a solution of TMC

at a concentration of 35

g/mL (in 10 m

M H

EPES buffer pH

7.4) was added in a volum

e ratio 70:30 for PEC

s formation, follow

ed by vortex mixing

for 5" and incubation at room tem

perature for at least 60 m

in [1].

Freeze drying

of PEC

s : H

ere w

e use

a LyoM

ega-30 freeze-dryer

(Telstar, Terrassa),

equipped with product tem

perature probes. FD

vials (12 mL) w

ere filled with 6m

L sample.

In a previous study [4], different freeze-drying protocols

were

tried, defining

a constant

condenser temperature of -80ºC

and a vacuum

limit of 300

mH

g. The eutectic point was

found to be -27.4 ± 0.8ºC, so that freezing at

-35ºC

seemed

a reasonable

safety lim

it. C

onditions of the most suitable protocol are

listed in Table 1.

Freezing Slow

, -35ºC

Sublimation

+20ºC, 8 h

Secondary drying +30ºC

, 10 h

Tem

perature holds N

o

Table 1. Freeze-drying conditions.

In this

work

the convenience

of using

a cryoprotector is studied. A

5% (w

/v) mannitol

solution w

as prepared,

and added

to PEC

suspensions at a 0%

, 30%, 50%

and 70% (v/v).

PECs characterization :

In order to characterize FD-PEC

s, 5 mL of

ultrapure water w

ere injected inside the vials for resuspension. W

henever further dilution was

needed, 10mM

HEPES buffer (pH

7.4) was

used to this end, in order to maintain the pH

conditions. -

Size and -potential: The average size (D

), polydispersity index (PD

I), and -potential values

for the PEC suspensions w

ere determined by

161

dynamic light scattering (D

LS) with a Zetasizer

Nano ZS (M

alvern Instruments) equipped w

ith a H

e-Ne laser (

= 633 nm) as the incident beam

, using folded capillary cells.

-M

orphology: Imaging of PEC

s was done

with a M

ultimode

® VIII A

FM (N

anoscope® V

controller), operated in the PeakForce Q

NM

®

(Quantitative N

anomechanical Property M

apping) m

ode. Nanoscope

® and PeakForce QN

M® are

trademarks

from

Bruker.

V-shaped

Si3N4

cantilevers with a pyram

idal SiO2 tip (nom

inal spring constant 0.58 N

/m, nom

inal tip radius 5 nm

) w

ere used

for im

aging. Scanning

was

performed at 1 H

z frequency with a resolution

of 512x512 pixels. A drop (35

L) of the suspension sam

ple was placed on top of freshly

cleaved highly

oriented pyrolytic

graphite (H

OPG

) and left for 30 min. Then, the solution

was rem

oved and replaced with 10 m

M H

EPES buffer pH

7.4 for imaging under a controlled

liquid environment.

Results and D

iscussion:

The results obtained from the D

LS analysis of FD

-PECs after redispersion are sum

marized in

Table 2.

Sample

Size(d, nm

)Size

(3 weeks)

PdIZeta (m

V)

PEC

s 238,1

+18,7%

0,154 17,6

FD-PE

Cs (0%

) 158,1

+7,9%

0,299 16,0

FD-PE

Cs (30%

) 425,5

-51,9%

0,458 22,6

FD-PE

Cs (50%

) 331,7

-47,2%

0,429 23,2

FD-PE

Cs (70%

) 274,2

-7,3%

0,465 23,0

Table 2. Mean values resulting from

DLS analysis of

freeze-dryed samples at different cryoprotector %

. Size (3 w

eeks) column show

s the diameter increase

after 3 weeks in suspension, storage at 4ºC

.

A notable diam

eter increase after freeze-drying is observed in PEC

s with cryoprotector. Even if

this effect decreases by increasing mannitol

concentration, no higher percentages were used,

since it would reduce excessively PEC

s amount

in the final drug presentation. Moreover, a PdI

around 0,5 was found w

hen using cryoprotector, despite

Zeta potential

was

>20 m

V,

which

excludes particle aggregation. O

n the other hand, when m

annitol solution was

employed, PEC

s diameter w

as reduced after 3 w

eeks storage at 4ºC (particularly those w

ith low

er %), w

hereas PECs and FD

-PECs diam

eter increased.

Moreover,

resuspended FD

-PECs

without cryoprotector, seem

to be more stable in

terms of particle size than freshly prepared

PECs. A

comparison of D

LS results between

PECs and FD

-PECs w

ithout cryoprotector is show

n in Figure 1.

Figure 1. a) Size and b)

-Potential distributions of PEC

s and redispersed FD-PEC

s (0%) resulting from

D

LS analysis.

AFM

characterization confirmed som

e of the assum

ptions made from

DLS results. W

hen no cryoprotector

was

used, FD

-PECs

exhibited sim

ilar morphology to freshly prepared PEC

s, as show

n in Figure 2, confirming the suitability

of freeze-drying

without

cryoprotectors. C

onversely, when PEC

s were free-dried using

50% and 70%

(v/v) mannitol 5%

(w/v) solution,

big particles

were

observed, rather

than aggregate of sm

aller particles. No im

ages were

obtained from FD

-PECs (30%

), probably due to tip-sam

ple interactions,

which

hindered continuous scanning.

Figure 2. AFM

images of a) Freshly prepared PEC

s, and b) FD

-PECs w

ithout cryoprotector. Scan area w

as 10x10 m

in both cases.

References:

1. G

iannottiM

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aceutics, Biopharm

aceutics and Pharmaceutical Technology.

Istambul (Turkey), 19-22 M

arch 2012.

Acknow

ledgements:

Financial support

from

CIB

ER-B

BN

(FA

BR

Y

project) and

Fundació La

Marató de TV

3 (NanoFabry project) is gratefully

acknowledged.

162

EST

IMA

TIN

G T

HE

NU

MB

ER

OF C

APSU

LE

S PER

MIL

LIL

ITE

R A

ND

TH

E N

UM

BE

R O

F C

EL

LS PE

R C

APSU

LE

E. Santos 1,2,J.L. Pedraz1,2,R

.M. H

ernandez1,2,G

. Orive

1,2

1NanoB

ioCel, U

PV/EH

U, V

itoria-Gasteiz, Spain, 2B

iomedical R

esearch Netw

orking Center in

Bioengineering, B

iomaterials and N

anomedicine (C

IBER

-BB

N)

Corresponding em

ail (G. O

rive):gorka.orive@ehu.es

Introduction:C

ell m

icroencapsulationhas

been studied

over the

3 last

decades as

a potential treatm

ent for several diseases such as type

I diabetes,

Parkinson, A

lzheimer

and genetic disorders am

ong others (1,2).The num

ber of microcapsules adm

inistered with

each dose or the number of cells per capsule are

two

often om

itted param

eters that

add uncertainty

to all studies carried out in the field of cell m

icroencapsulation. Current

strategiesfor

capsule and

cell-counting provide

meaningful

intra- and

inter-individual variability, as w

ell as tedious procedures that result exhausting for researchers.The

possibility to

estimate

the num

ber of

capsules within a specific volum

e (p.e. number

of capsules/m

L) according

to the

capsule diam

eter, m

akes m

uch easier,

for exam

ple, designing in vitro assay protocols w

here certain num

ber of capsules per well are required

or identifying the m

inimum

number of capsules

that results

effectivein

agiven

treatment.

Moreover, estim

ating the average number of

encapsulated cells

per capsule

represents a

valuable and

useful tool

when

it com

es to

working w

ith microcapsules. This w

ould enable us

to exert

more

accurate and

standardized relations betw

een the capsule doses and the num

ber of cells employed in both plate assays

and the animal practice.

The present study aims to establish a w

ell define m

athematical m

odel to estimate the num

ber of capsules per m

illiliter and the number of cells

per capsule according to the particle diameter

and the initial cell load. This is intended to becom

e a general standard guide in the field of cell m

icroencapsulation. M

aterial and

Methods:

C2 C

12m

yoblasts derived from

the skeletal muscle of a C

3H

mouse w

ere encapsulated into alginate-poly-L-lysine-alginate

(low-viscosity

high guluronic

acid alginate,

FMC

B

iopolymer,

Norw

ay) m

icrocapsules (A

PA)

using an

electrostatic droplet generator follow

ing a brief modification

of Lim &

Sun’s procedure (3).M

icrocapsule counting

was

performed

fromm

icrocapsule pellets of 100L in 1.5 m

L tubes. A

ccording toparticle diam

eter, capsules were

resuspended in the minim

um volum

e of PBS

required to achieve analyzable aliquots. These aliquots

were

subsequently exam

ined using

inverted optical microscopy (N

ikon TSM). For

cell-counting, enclosed cells from m

icrocapsule pellets of 100

L were firstly de-encapsulated

using 500 g/m

L of alginate lyase (Sigma-

Aldrich) and filtered through a 40

m m

esh filter.

Resulting cell suspensions w

ere countedby using a neubauer cham

ber.A

ll statistical

computations

were

performed

using SPSS 19.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Observed

values w

ere tested

for potential

regression.

Results and D

iscussion: Taking into account that alginate gel beads are deform

able bodies, it m

ay be assumed that no voids are left w

ithin certain volum

e of sedimented m

icrocapsules. Thus, know

ing thevolum

e of a single sphere,the num

ber of capsules per milliliter

may be

easily calculated. From this value,if w

e assume

that a specific volume of pre-gelled solution

results in

the sam

e volum

e of

sedimented

microcapsules,

it is

possible to

deduce the

number of cells per capsule by just know

ing the initial cell load in the pre-gelled cell suspension. Thus, the follow

ing table is built with calculated

values for some of the m

ost widely em

ployed capsule diam

eter and cell loads:

cells/cap

DIA

MET

ER

caps/mL

2x106

cells/mL

5x106

cells/mL

10x106

cells/mL

10001910

10472618

5236

7005568

359898

1796

45020959

95239

477

35044545

45112

224

200238732

8 21

42

1001909859

1 3

5

Table 1.Estim

ated number of m

icrocapsules per m

illiliter and cells per microcapsule depending

on the microcapsule diam

eter and initial cell load.

163

Since all empirical procedures for cell-counting

entail an

intrinsic variability,

the error

accumulated

through serial

procedures m

ay distort the real num

ber of cells per capsule. In fact, taking the theoretical values proposed in Table 1 into account, below

are shown the

equations to obtain the maxim

um and m

inimum

expectable values (M

MEV

) of cells per capsule for

a typical

cell-counting routine

with

3 procedures:

z

y xT

MM

EV1

1 1

Equation 1.

Where,

x= variability of the 1

st

procedure (%) (p.e. counting of cells to prepare

pre-gelled alginate suspensión),y

= variability of the 2

ndprocedure (%

) (p.e. measuring of

capsule pellet

to be

de-encapsulated),z

=variability

of the

3rd

procedure (%

) (p.e.

counting of

de-encapsulated cells),

T=

Theoretical value (see the table)and M

MEV

=M

aximum

and minim

um expectable values.

Therefore, the estimated num

ber of cells per capsule represents a reliable central point to set as reference.O

n the other hand, from calculated values of

Table 1, it ispossible to draw

a well defined

mathem

atical function to describe the relation betw

een the number of capsules contained in a

specific volume of sedim

ented particlesand the

capsule diameter. Such relation is show

n in Eq. 2:

312

1091

.1/m

LC

apsules

Equation 2. W

here, = capsule diam

eter.

Following

the same principle explained above,

simple

mathem

atical functions

may

be attributed to each cell load

to estimate the

number

of cells

per capsule.

Correction

coefficient (), nam

ely the quotient of the difference betw

een the volume of the initial pre-

gelled solution

and the

resulted volum

e of

particles, m

ust be

applied w

hen these

two

volumes do not m

atch up with each other.In

the follow

ing example, Eq. 3

defines the curve for the load of 5 x 10

6cells/mL:

36

10595

.3/C

apsuleC

ells

Equation 3. W

here, = capsule diam

eter, and = correction coefficient.

In order to validate our mathem

atical model, w

e counted

manually

the num

ber of

capsules

sedimented in know

n volumes and com

pared against the proposed m

athematical function for

several particle diameters. A

s seen in Figure 1A,

empirical results fitted perfectly the equation

(p<0.001). Figure 1B show

s that, when the

number

of cells

per capsule

was

manually

counted, observed values were adjusted to the

proposed equation(p<0.001).

Figure 1. Validation of the m

athematical m

odel for the num

ber of capsules per milliliter (A

) and the num

ber of cells per capsule (B).

Conclusion:

This w

ork proposes

am

athematical m

odel to establish well defined

estimations

of the

number

of capsules

per m

illiliter and the number of cells per capsule.

This may be a valuable and useful tool for the

handling of microcapsules in the lab routine.

References:

(1) Acarregui A

et al. Biodrugs 2012; 26 (5):

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, F, Sun A. Science

210: 908-909, 1980

Acknow

ledgments:

Authors w

ould like to thank the Departm

ent of M

athematics of the U

niversity of the Basque

Country (U

PV-EH

U) for their invaluable help

and advice.

A B

164

EASY TO

HA

ND

LE, POW

DER

FOR

M M

ICR

OPAR

TICLES A

S A C

HO

LERA

VAC

CIN

EA

PPRO

AC

HM

Pastor a,b, I. M

arquíneza,b, A

Talaverac, JL Pedraz

a,b,A E

squisabel a,b

aNanoB

ioCel G

roup, Laboratory of Pharm

aceutics, University of the B

asque Country, School of P

harmacy,

Vitoria-G

asteiz, Spain

.

bBiom

edical Research N

etworking C

enter in Bioengineering, Biom

aterials and Nanom

edicine (CIB

ER

-B

BN

), Vitoria-G

asteiz, Spain

cInstituto Finlay. Centro de Investigación – P

roducción de Vacunas. C

iudad de la Habana,C

uba.

Introduction

Now

adays, cholera

remains

to be

a huge

problem, causing 100

000-120000

deaths per year (1). R

ecent outbreaks in Sierra Leone, H

aiti and D

emocratic R

epublic of Congo have

pointed out

the urge

for a

massive

oral cholera

vaccination cam

paign. B

earing in

mind

the econom

ical situation of the developing countries, the

requirement

for a

low

cost vaccine

is im

perative. H

ence, the

development

of a

powdered

vaccine such

as spray

dried m

icroparticles would be

a step forward

towards

a cheap vaccine due to its easy transport and feasibility

to adm

inister as

asuspension,

especiallyfor elderly population and children.

The goals of this study have been, i)to apply the spray drying technology for m

icroparticle (MP

) elaboration,

ii) to

characterize the

MP

elaborated, iii) toperform

in vivoassays in order

to analyse

whether

the exerted

imm

une response is com

parable to the heat killed Vibrio

cholerae (VC

) protection.

Materialand M

ethodsM

icroparticle preparation:

A

spray drying

technique w

as chosen

for the

elaboration of

microparticles

(MP

s). B

riefly, spray

drying conditions w

ere set as following, 60 or 80ºC

as inlet tem

perature, pump perform

ance at 5% and

600 L/h of spray flow rate.

Cellulose acetate

phthalate (Aquacoat ®)

7.5% (w

/V) suspension

was prepared and 1.5%

(w/w

) of triethyl citrate w

as added

as polym

er plasticizer.

When

required, 0.1%

of

low

viscosity alginate

was

poured into

the form

ulation. The

resulting suspension w

as fed into the system in order to

obtain the microparticles. Four different M

P w

ere elaborated, A

quacoat ®M

P prepared at 60ºC

as inlet

temperature,

Aquacoat ®

MP

at

80ºC,

Aquacoat ®

alginate M

P

at 60ºC

, A

quacoat ®

alginate MP

at 80ºC.

The MP

s obtained were characterized in term

s of

size, surface

morphology,

encapsulation efficiency

(EE

), antigenicity

and gastro-

resistance, as previously described(2).

In vivoassays:based on the in vitro

results, theM

Ps elaborated at 80ºC

were selected

for the follow

ing rat experiments.

Two

different doses w

ere assayed in the study, 30 and 60m

g for the follow

ing batches:

Aquacoat ®

MP

and

Aquacoat ®

alginate MP

or VC

.

Sprague D

awley rats w

ere administered per os

with M

Ps or V

C at w

eeks 0 and 2. At w

eeks 0, 2, 4, 8, 12, 15, 20

and22

blood samples w

ere

collected from the fem

oral vein. Total IgG and

IgM

were

determined

by ELIS

A

for all

the sam

pling times.

Results and D

iscussion

A

spray drying

technique w

as successfully

applied for the elaboration of MP

as previously reported by our

research group (2).The m

ain properties of M

P are sum

marized in Table 1. A

ll M

Ps displayed a particle size around 6

m and

high encapsulation efficiency values (>90%). In

this regard, it is postulated that particle sizes below

10m

are the most adequate ones in

orderto ensure gut residence and slow

release of

the antigen

thatw

ill finally

triggerIgA

secretion (3).

Table 1.Main characteristics of M

P elaborated (n=3), w

here d m

eans diam

eter, E

E

encapsulation efficiency

and E

Yencapsulation yield.

Formulation

d (m

)EE (%

)EY(%

)

Aquacoat ®M

P, 60ºC6.4 ± 0.2

89.8 ± 9.656.8 ± 5.6

Aquacoat ®alginate M

P, 60ºC

6.5 ± 0.590.2 ± 5.3

47.6 ± 5.7

Aquacoat ®M

P, 80ºC6.1 ± 0.2

94.9 ± 6.061.4 ± 7.5

Aquacoat ®alginate M

P, 80ºC6.3 ± 0.3

95.1 ± 4.357.9 ± 6.2

Antigenicity preservation is believed to be the

most

important

property in

order to

studyw

hetherantigen capability rem

ains unchanged after encapsulation. As show

n in Fig. 1,upon

encapsulation, VC

kept its antigenicity values w

hen compared to the

standard VC

suspension (100%

). M

oreover, 60

and 80ºC

inlet

temperature groups show

ed similar values.

Antigenicity (%)

Fig.1.A

ntigenicity value

in com

parison to

VC

cellular

suspension.

In order to verify that Aquacoat ®

led to gastro-resistant

formulation, M

Ps w

ere mixed

for 2h

with H

Cland

replaced with neutral m

edium.

As displayed

in Fig.2, all formulations ratified their

gastro-resistance, as MP

s did not releasem

ore than

the 10%

of

the V

C

content in

acidic m

edium, w

hereasV

C w

as liberated in neutral

Aquacoat ®MP, 60ºC

Aquacoat ®MP, 80ºC

Aquacoat ®alginate MP, 60ºC

Aquacoat ®alginate MP, 80ºC

165

environment,

reaching around

30%

after 24

hours of the study.

Cumulative release, (%)

Time , (h)

Aquacoat ®MP, 60ºC

Aquacoat ®MP, 80ºC

Aquacoat ®alginateMP,60ºC

Aquacoat ®alginate

MP,80ºC

Fig. 2. Gastro resistance assay for Aquacoat ®

MP

s with and

without alginate, prepared either at 60ºC

or 80ºC.

The in vivoassay dem

onstrated that Aquacoat ®

MP

s were capable of evoking a suitable im

mune

responsethat

would

protect against

cholera infection

as shown in

the total IgG secretion

represented in

Fig. 3.

Antibody

production increased after

the administration of the first

dose of the vaccine. At weeks 4 and 8, the rats

receiving 60

mg

of Aquacoat ®

MP

s and

Aquacoat ®

alginate M

Ps

displayed low

er antibody levels than the groups

receiving theequivalent

dose of

VC

. N

evertheless, this

difference was not detected for serum

samples

at the following w

eeks. At the 12

thw

eek, 30m

g of

Aquacoat ®

alginate M

P

exerted higher

antibody titres than 60m

g of Aquacoat ®

MP

s or A

quacoat ®alginate M

Ps.

0 2 4 6 8 10 12

24

812

1520

22

Specific anti-VC IgG (log10)

Time (weeks)

60 mg Aquacoat MP

60 mg Aquacoat alginate MP

30 mg Aquacoat MP

30 mg Aquacoat alginate MP

free VC (60 mg)

free VC (30 mg)

*

§

§

Fig.3. Serum

total Anti-V

C IgG

levels expressed as log10 of the

last reciprocal dilution above pre-imm

une OD

492 plus 2 S.D

.*and § represents statistically significant differences betw

een groups (p<0.05).

At

the 15

thw

eek, this

difference w

as only

detectable for rats receiving 60m

g of Aquacoat ®

MP

s. At the end of the study, no difference could

be achieved forany group. Thus, as far as IgG is

concerned, spray

driedcholera

vaccinedeveloped the sam

e antibody response as VC

suspension.

Sim

ilar results

were

reported by

Borde and co-w

orkers (4); as they administered

freeze dried VC

, the exerted imm

une response w

as very similar to the com

mercially available

heat killed VC

along with toxin B

subunit.

Regarding

IgM

production, at

the 4

thw

eek groups receiving 60 and 30

mg of A

quacoat ®

MP

s evoked lower IgM

production than 30m

g A

quacoat ®alginate

MP

s and

the low

estV

C

dose. As the assay w

ent on, this difference was

no longer

observable. A

t the

end of

the experim

ent, 60m

g of Aquacoat ®

alginate MP

s show

ed lower protection values than the low

er

dose of

VC

. It

could be

concluded that,

especially 30

mg

of A

quacoat ®alginate

MP

s w

ere able to mim

icthe

IgM production

ofV

C.

Yeh et al.described in an earlier w

ork that VC

P

LGA

microparticles w

ere able to induce IgM

andIgG

response against VC. H

owever, they

achieved higher imm

unoglobulin levels than VC

w

hen adding amphotericin B

to the formulation.

0 2 4 6 8 10 12

24

812

1520

22

Specific anti-VC IgG (log10)

Time (weeks)

60 mg Aquacoat MP

60 mg Aquacoat alginate MP

30 mg Aquacoat MP

30 mg Aquacoat alginate MP

free VC (60 mg)

free VC (30 mg)

*

§

§

Fig.4. Serum

Anti-V

C IgM

levels. * and § pointsout the

statistically significant

differences detected

in the

study(p<0.05).

Conclusions

Spray drying w

as found to be an appropriate technique for M

P elaboration

in terms of size,

high encapsulation

efficiency, V

C

loading, antigenicity

and gastro-resistance.

The subsequentin vivo study dem

onstrated that MP

w

ith or without alginate w

ere able to induce asuitable im

mune response, com

parable to that of V

C alone. B

esides that, groups administered

with 30

mg of A

quacoat ®alginate M

Ps w

ere especially capable of exerting the sam

e imm

une response as the heat killed V

C. A

ltogether, it m

ight be concluded that spray drying of VC

along w

ith Aquacoat ®

and alginate leads to an easy to handle and transport pow

derproduct

that is able to mim

ic VC

imm

une response.

References

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Acknow

ledgements

M.

Pastor

thanks the

Basque

Governm

ent (D

epartment

of E

ducation, U

niversities and

Research) for the fellow

ship grant. The authors w

ould like to thank FMC

Biopolym

er for kindly provide A

quacoat ®. This project was partially

supported by

the B

asque G

overnment

(Consolidated G

roups, IT-407-07). The authors gratefully acknow

ledge the support of University

of the Basque Country U

PV

/EHU

(UFI11/32).

pH 6.8pH1.2

*

166

HIDROGELES pHEMA/CICLODEXTRINAS PARA LA LIBERACIÓN CONTROLADA DE ACETÓNIDO DE TRIAMCINOLONA

Pourantru P.,García Millán E.,Sobarzo Sánchez E., Otero Espinar F.J.

Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica. Facultad de Farmacia. Universidad de Santiago de Compostela.

IntroducciónLas

lentes blandas de contactode

poli-(hidroxietil-metacrilato) han demostrado un interesante potencial como sistemas de liberaciónocular

controlada de

medicamentospara

tratar afecciones

oftálmicas de la zona anterior. Para ello, es necesario incorporar el fármaco en la dosis adecuada y que éste se libere a una velocidad adaptada para obtener dosis terapéuticas durante tiempos más o menos prolongados(1).El acetónido de triamcinolona (TA)es

un glucocorticoide sintético con elevada potencia antiinflamatoria

y efecto prolongadoque se

emplea habitualmenteen el tratamiento de patologías

oculares. Pero debido a su reducida hidrosolubilidad, plantea problemas para ser formuladoa dosis elevadas enformulaciones acuosas(2). Una aproximación interesante para

mejorar las prestaciones de las lentes de pHEMA

como sistemas de liberaciónes la incorporación

de ciclodextrinas (CD) en la estructura de los hidrogeles durante la fase de polimerización, bien en

mezcla física o unida químicamente a los monómeros formadores del hidrogel. La formación de complejos de inclusión CD-fármaco

en el interior del hidrogel debe favorecer la afinidad del fármaco y la estructura del hidrogel lo que redundaría enmejorarlas propiedades decarga y/oliberación (1).La

elaboración de

los hidrogeles

con ciclodextrina

unída -CD

modificadas químicamente que se unen covalentemente a los monómeros de 2- hidroxietil-metacrilato (HEMA) en relación estequimétrica 1:1. El objetivo de este estudio ha sido optimizar la carga y la liberación de TA de los hidrogeles mediante la variación de su composición en cuanto a la cantidad de agua incorporada, la ausencia o presencia de CDs y el empleo de CDs

unidas químicamente a la red del hidrogel.

Materiales y métodos

Materiales

2-polihidroxietilmetacrilato (pHEMA),

ácido metacrílico

(AM)(Merck); Etilenglicoldimetacrilato (EGDMA) (Aldrich), Irgacure ®2959 (BASF), Acetónido de triamcinolona

(Fagron)y Kleptose HPCD

(Roquette).

Hemosutilizado dos monómeros de HEMA a los

que se unen covalentemente las CDs, para lo que hemos empleado dos tipos de espaciadores, uno de ello un

cromóforo (HEMA-CD(2)) que actúacomo marcador (Fig 2).

La síntesis de HEMA-CDs se realizó usando derivados monosubstituidos de ácido, ester

y amida y halometil CDs e hidroxil derivados de HEMA en condiciones básicas, (N(CH

3 )3 ) o Cs2 CO3 , en DMF a temperature ambiente. La

formación de los derivados de CDs-HEMA se caracterizó mediante RMN y masas.

Fig1. Estructuras de las CDs modificadas quimicamente, R1 representa la CD y R2 el HEMA.

Elaboración de los hidrogelesmediante fotopolim

erización

El agente reticulante EGDMA (80 mM,1%), el monómero funcional

AM (200 mM, 2.5%)y las disoluciones

acuosas (en función de la cantidad de agua)

delas diferentes CDs

estudiadasfueron

disueltos en HEMA (6 ml; 96.5%) bajo agitación magnética

constante durante 45 min(Tabla 1 y 2).

Posteriormente seincorporó el iniciador Irgacure ®2959 (10 mM) durante 15 min

más. La solución de monómeros resultante fue inyectada en un molde constituido por dos placas de vidrio (10x10 cm) impregnadas internamente con diclorodimetilxilano y separados por un marco de silicona de 1 mm de ancho.Los moldes se irradiaron con una lámpara UV

durante 30minutos. Tras la polimerización, los

hidrogeles fueron lavados hasta eliminación de los monómerosno

reaccionantes.

La superficie

de las

lentes se

caracterizo mediante

un PERFILÓMETRO ÓPTICO 3D Z-20(Zeta instruments).

Tabla 1.Composición de los

hidrogeles sintetizados en función de la cantidad de agua incorporada, con el fin

de modificar la

microestructura de las lentes.

Tabla 2. Composición de los hidrogeles sintetizados conteniendo

CDsy HEMA-CD..

Estudios de cargade

TA enlos hidrogeles

Los estudios de carga de TA en los diferentes hidrogeles sintetizados

se llevó a cabo por inmersión de los mismos en una disolución suturada del fármaco (10 ml)en Nacl al 0,9%

durante cuatro

días. El

contenido en

TAse

determinópor

espectrofotometría UV a = 242 nm tras ser filtradas por filtros de

membrana (0,45 m Sartorius ®, Alemania).Cada ensayo ha sido

realizado por triplicado.

Estudios de liberación de TA de los hidrogeles

Los hidrogeles cargados fueron sumergidos en un vial conteniendo 5 ml de fluido lacrimal simulado (FLS; 6.7 g/l NaCl, 2.18 g/l NaHCO

3 , 1.38 g/l KCl, 0.084 g/l CaCl2 ·2H2 O, pH 8) bajo agitación

orbital a 100 rpm y 37ºC. A intervalos de tiempo predeterminados, se tomaron muestras de 1 ml del medio de liberación y este volumen extraído era reemplazado con la misma cantidad de FLS. La determinación de la concentración de TA se realizó mediante espectrofotometría a

242nm. Cada ensayo ha sido realizado

por triplicado.

0%H

2 020%

H2 0

40%H

2 0HEMA (g)

6,2184,974

2,218EGDMA (g)

0,0950,076

0,038AM (g)

0,1030,082

0,0412Agua (m

l)--

1,22,4

Irgacure (g)0,011

0,0110,011

0%H

2 05%

CD20%

H2 0

5% CD

40%H

2 0+5%

CD

40%H

2 0HEMA-CD

HEMA (g)6,218

4,9683,73

1,865 (5%

HEMA-CD / 95%

HEMA)EGDMA (g)

0,0950,076

0,0570,0285

AM (g)0,103

0,08240,0618

0,0309AGUA (ml)

--1,2

2,41,2

CD (g)0,3

0,240,18

Irgacure (g)0,011

0,0110,011

0,0055

ddasasqquiuimimicacamementntee

opolimerización

, el monómero func

167

Resultados y discusión

En la imagen obtenida en los estudios de perfilometría (figura 3) se observa que la incorporación de agua en el proceso de síntesis de las lentes de pHEMA dan lugar a la formación de poros superficiales que se adentran profundamente en el hidrogel. Dichos poros presentan un diámetro medio de 1.74±0.69 y 4.29±9.36 para AM200 40%

agua y AM200 20% de agua, ocupando un 3.5%

de la superficie del hidrogel(figura 4). La formación de porosesdebido a que durante la etapa de polimerización

aumenta la hidrofobicidad del polímero por lo que el agua deja de ser miscible formándosegotas que dan lugar a la formación de

pequeños poros en el hidrogelque alcanzan a la superficie.

Figura 3. Imágenes topográficas de la superficie de los hidrogeles

ma200_p

20

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 5 10 15 20 25

Fe

ret d

iam

ete

r (m

)

size distribution (%)

ma200_p

40

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 10 20 30 40

Feret diam

eter (m

)

size distribution (%)

Figura 4. Distribución de tamaño de poro superficial estimado mediante análisis de imagen.

Fig 2.Velocidad de liberación de TA a partir de los hidrogels

elabarados con y sin CD..

Los hidrogeles que contienen mayor proporción de agua son los que más cantidad de TA incorporan (datos no mostrados) y liberan probablemente debido a que la formación de poros facilita la difusión delfármaco tanto

durante el proceso de carga como en la liberación. Por otra parte no se observó una influencia significativa de la presencia de CD en la incorporación de TA en el hidrogelaunque sí que da lugar a perfiles

de cesiónmás lentos y

controlados, lo que sugiere que aunque no incremente la afinidad por el polímero la posible formación de complejos CD-TA

de gran tamaño

molecular, dificulta la difusión del fármaco a través del hidrogel.

Fig 4.Liiberación de TA a partir de los hidrogelesfabricados con un 40%

de agua,sintetizados empleando CDen mezcla física o unida

mediante enlaces covalentes.

El análisis estadístico de los resultados ha demostrado que no hay diferencias significativas, en cuanto a la carga de TA,

entre hidrogeles contenido

-CD-1. En cambio, sí se han encontrado diferencias entre éstos y HEMA-CD-2, que carga menos cantidad de

fármacoque los anteriores. Esto podría

deberse a la presencia del grupo cromóforo empleado como espaciador ya que debido al alto tamaño molecular de la TA podría dificultar el intercambio del fármaco entre el medio y la cavidad de la ciclodextrina.En cuanto a la liberación (fig. 4) apenas existen diferencias entre los tres hidrogeles con idénticos perfíles hasta las 10 horas. A

partir de este período los elaborados conHEMA-CD-1

liberancantidades ligeramente superiores.

Conclusiones

A partir de los resultados mostrados podemos concluir quela

incorporación de aguapermite modular la microestructura de

los hidrogeles

y de esa manera modificar los procesos de carga y difusión de la TA.

La incorporación deCDs

en mezcla física o unida al HEMA no modifica significativamente el proceso de carga, salvo la que incluye el grupo cromóforo si bien permiten ejercer un mayor contol sobre la liberación del fármaco

Referencias

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020

4060

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

AM

200 0% H

20A

M 200 20%

H2O

AM

200 40% H

20

AM

200 0% H

20 5%C

DA

M 200 20%

H20 5%

CD

AM

200 40% H

20 5%C

D

tiempo (h)

mg TA liberados

024

4872

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

40%H

20 5% C

D 40%

H20 H

EM

A-C

D(1)

40% H

20 HE

MA

-CD

(2)

tiemp

o (h)

mg TA liberados

168

TH

E E

FFEC

T O

FPL

GA

MIC

RO

PAR

TIC

LE

S CO

NT

AIN

ING

EPID

ER

MA

L G

RO

WT

H

FAC

TO

R (E

GF) O

NT

HE

HE

AL

ING

OF FU

LL

-TH

ICK

NE

SS EX

CISIO

NA

L W

OU

ND

S IN

DIA

BE

TIZE

D W

ISTA

R R

AT

S

G. G

ainza1,2, F.B

. Gutierrez, J.J. A

guirre,M. Igartua

1,2, R.M

. Hernández

1,2, J.L. Pedraz1,2

1NanoB

ioCel

Group, Laboratory of Pharm

aceutics, University of the B

asque Country, School of

Pharmacy, V

itoria, 01006, Spain2B

iomedical R

esearch Netw

orking Center in B

ioengineering, Biom

aterials and Nanom

edicine (CIB

ER-

BB

N), V

itoria, 01006, Spain.

INT

RO

DU

CT

ION

Non-healing

diabetic foot

ulcer (D

FU),

a chronic

ulceration com

monly

suffered by

diabetic patients,

has becom

e a

problem

tohealth

care system

s. The

ulcers are

characterized by an atypical extracellular matrix

(ECM

) synthesis

and rem

odelation, re-

epithelization disturbance

and a

recurrent inflam

matory

response(1).

The Epiderm

al G

rowth Factor (EG

F) is essentialfor a correct

dermal

and epithelial

regeneration(2).

How

ever, the short half-life of rhEGF in vivo

requires m

ultiple adm

inistrations and

this restricts

its clinical

application.The

encapsulation of

rhEGF

into polym

eric m

icrospheres (M

S) represents

a prom

ising strategy to overcom

e this limitation (3).

In the

current w

ork, rhEG

F Poly-Lactic-co-

Glycolic-A

cid (PLGA

) MS w

ere optimized and

evaluated for the treatment of a

full-thicknessw

oundm

odelin diabetized Wistar rats.

MA

TE

RIA

LS A

ND

ME

TH

OD

SM

icrospheres preparationEG

F-MS

were prepared using a w

/o/w double

emulsion/solvent evaporation m

ethod. Briefly, a

dichloromethane:acetone

(3:1) solution

containing 5%

(w

/v) of

PLGA

(R

esomer

RG

503) was em

ulsified by sonication for 15 s at 50 W

with an 1%

(w/v) rhEG

F aqueous solution containing H

uman Serum

Album

in (HSA

),polyetilenglycol 400

and sodium alginate (v/v).

The resulting emulsion (w

/o) was poured into

15 mL of 5%

polyvinyl alcohol (PVA

) and 5%

NaC

laqueous solution and em

ulsified by apaddle

stirrer during 60 s to perform the double

emulsion

(w/o/w

). Finally,

800 m

l of

an aqueous solution of 5%

NaC

l and 0.6 mM

of C

alcium chloride w

asadded and stirred for 30

min. The

MS w

ere thencollected by filtration

and lyophilized.Lastly, the rhEG

F-MS w

ere -

irradiation (rhEGF-M

S-and the influence of

the sterilization process was studied.

Microspherescharacterization

After M

S preparation the following param

eters w

ere m

easured: size

distribution,surface

morphology,

zeta potential,

encapsulation efficiency

(EE) and

in vitro

rhEGF

releaseestim

ated byELISA

. The in vitrobiological

activity and

wound

healing assay

were

performed

using BA

LB/C

3T3 fibroblasts.

In vivow

ound healing studyW

istar rats were diabetized by a single i.p.

administration of 0.5%

streptozocin.One w

eek after,

2 full-thicknessexcisional w

ounds were

made in the dorsum

of each rat. Anim

als were

sacrificedon days 7, 11 and 17 after w

ounding. Lastly,

wound

closure (%

), re-epithelization

grade and

restoration of

the inflam

matory

processw

ere analyzed.

The experim

ental groups w

ere set as,(i) blank control, (ii) vehicle control, (iii) blank M

S control, (iv)75

g of non-encapsulated rhEG

F twice a w

eek and (v) 75

g rhEG

F-MS.

All

the treatm

ents w

ere applied in the w

ound by injection.

RE

SUL

TS A

ND

DISC

USSIO

NM

icrospheres characterizationTable 1 show

thatrhEGF-M

S, before and after -sterilization, presented sim

ilar size and zeta potentialvalues. N

evertheless, the EE decreased after the sterilization process. Som

e authors attribute this decrease to a degradation of thedrug during the sterilization process(4).

Table1: Characteristics of the M

S.Form

ulationSize (

m)

EE (%)

rhEGF-M

S12.18

-25.5068.82

rhEGF-M

S-14.94

-28.5060.01

SEM photographs show

ed regular and smooth

surfaces in both cases (Figure1).

Figure 1:SEM photographs of M

S x1000 enlargement. (A

) rhEG

F-MS. (B

) rhEGF-M

S-

AB

169

No

difference w

as found

between

both accum

ulative released

profiles (Figure

2).

Figure 2: rhEGF released from

MS.

In vitroC

ell culture assaysB

ioactivity of released EG

F

As show

nin Figure 3 the biological activity of

EGF w

as not significantly affected during them

icroencapsulation or

thesterilization

processes.

Figure 3: ED50 of the

rhEGF released from

MS.

Wound healing assay

In the

presence of

rhEGF,

Balb/c

3T3 fibroblasts closed the w

ound faster than control group.

No differences w

ere detectedbetw

een rhEG

F released from M

S and non-encapsulated rhEG

F (Figure 4).

Figure 4:W

ound healing assay. (A)

freshserum

free m

edium, (B

) rhEG

F released from the M

S (C) non-

encapsulated rhEGF.

In vivostudiesW

ound closureFigure

5show

s that

7 and

11 days

after w

ounding, rhEG

F-MS

group show

ed a

statistically significant decrease of the wound

areain com

parison with the other experim

ental groups. B

y days 14 and 17 all the groups closed.

Figure 5: Wound closure during the experim

ent. (A) B

lank control, (B

) Vehicle control, (C

) Blank M

S control, (D)

Non-encapsulated EG

F group and (E) EGF M

S group.

Re-epithelization grade

For rhEGF-M

S and Blank control group there

was a com

plete re-epithelization on the11

thday. For the other

groups the re-epithelization was

not complete until the end of the study.

Resolution of the inflam

matory

processEG

F-MS

treated groups

leftthe

acute-inflam

matory phase on the 7

thday. B

y the 11th

day after wounding EG

F-MS and B

lank control show

ed a complete recovery and healing. A

t the end of the study, all the experim

ental groups show

ed a complete recovery (Figure 6).

Figure 6: Inflamm

atory recovery of the experimental groups

on days 7, 11 and 17after w

ounding.

CO

NC

LU

SION

In this study EGF containing m

icrospheres have been optim

ized. Neither the m

icroencapsulation nor

the -sterilization

processesaffected

significantly the activity of the rhEGF.

The in vivo

results demonstrate the potential use of

rhEGF-loaded m

icrospheres to promote a faster

wound healing on the excision region of rats

than control groups.

RE

FER

EN

CE

S (1)

Cook H

, Davies K

J, Harding K

G, Thom

as D

W.

J Invest

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lubayram K

, Cakar A

N, K

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C,

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AC

KN

OW

LE

DG

ME

NT

SG

. Gainza thanks the “U

niversidad del País V

asco- UPV

-EHU

” for the Fellowship G

rant.

171

AC

CIÓ

N C

OD

ISOL

VE

NT

E D

EL

ME

TA

MIZO

L M

AG

NÉ

SICO

EN

ME

ZCL

AS A

CU

OSA

S Y N

O

AC

UO

SAS

MA

. Peña,B. Escalera, A

BSánchez, A

. Reíllo

Departam

entode Farm

acia y Tecnología Farmacéutica, U

niversidad de Alcalá de H

enares, España

Introducción:En

la solubilización

de los

principios activos sondiversos los factores que

influyen, durante

la prim

era fase

de este

proceso, el sólido sufre una desestructuración de su

red cristalina, y en la segunda, las moléculas

del soluto seseparan superando sus fuerzas

cohesivas, en el disolvente se crean cavidades para

acomodar

al soluto.

En esta

etapa se

absorbe calor, por lo que su contribución a la solubilidad es desfavorable, por otro lado, las m

oléculas de

soluto se

introducen en

las cavidades creadas en el disolvente. Se produce la solvatación, es decir, la interacción entre el soluto y el disolvente m

ediante fuerzas de van der

Waals

y/o enlaces

de hidrógeno.

Esta segunda etapa contribuye favorablem

ente a la solubilidad porque el proceso es exotérm

ico (1). La solubilidad se relaciona directam

ente con las

magnitudes

termodinám

icas del modo

(ec. 1): G

S=H

S- TS

S=- RT lnX

2 (ec.1)

G, es la energía libre,

H, la entalpía,

S, la entropía, X

2la fracción m

olar del soluto, que representa la solubilidad.

Esas magnitudes term

odinámicas sirven para

interpretar el mecanism

o de acción codisolvente y

para com

probar si

existen relaciones

de com

pensación entalpía-entropía (H

-G

).

Materiales y M

étodos:En este trabajo se ha

utilizado el

metam

izol M

g (Fagron),

antiinflamatorio no esteroideo (pirazolonas), y

dos m

ezclas binarias

que contienen

un codisovente com

ún. Acetato de etilo, etanol

(grado espectrofotométrico. Panreac, M

onplet &

Esteban, España), y agua destilada.

Métodos:

Las disoluciones

saturadas se

preparan a

15º-35ºCy

se sitúan

en baños

provistos de agitación (Heto SH

02/100, AT

110) hasta alcanzar el equilibrio de solubilidad. La fase sólida se separa por filtración (0,2

m).

La concentración

disuelta se

mide

en un

espectrofotómetro (Shim

adzu UV

-2001PC) a la

longitud de

onda de

máxim

a absorción

seleccionada. Se determina la

entalpía (F)

ytem

peratura de

fusión(T

F)por

calorimetría

diferencial de barrido (Mettler TA

4000).

Para realizar

el análisis

de com

pensación entalpía-entropía, se determ

inan las magnitudes

termodinám

icas de

disolución utilizando

el

método de K

rug et al. (2,3). Se representa lnX2

frente a(1/T-1/T

mh ), donde T es la tem

peratura experim

ental y

Tm

hla

media

armónica

del intervalo de tem

peratura empleado. Las gráficas

obtenidas son lineales, a partir de la pendiente y ordenada en el origen se obtienen la entalpía (

S)y la energía libre de disolución (G

S): S=

-R pendiente

(ec. 2) S=

-R T

mh pendiente

(ec. 3)

Los valores de las entalpías y entropías de m

ezclase

calculan con

las ecs.

4 y

5,(T

F=152,59ºC,

HF= 260,83 J/g):

MS -

F

(ec.4) M

S – F

(ec. 5)

El porcentaje

de contribución

entálpico-entrópico

H y

TS respectivamente) para cada

fase del proceso de solubilidad se calcula (4): H

/100

(ec.6) TS

/100

(ec.7)

Resultados

y D

iscusión:Las

magnitudes

termodinám

icasde

disolución y

mezcla

se m

uestran en esta tabla.

Tabla

I.Funciones

termodinám

icas del

proceso aparente de disolución y m

ezcla(K

J/mol)

% Et.

SS

SM

HTS

049,34

42,36-26,4

-23,483,67

16,33

3032,65

25,80-24,3

-39,977,33

22,67

6031,34

23,75-25,4

-42,275,76

24,24

8030,08

21,36-27,8

-44,472,44

27,56

9024,87

15,63-30,9

-50.162,43

37,57

10052,11

40,72-38,4

-25,177,8

22,2

9052,64

40,38-41,2

-25,476,44

23,56

8052,35

39,57-42,9

-26,275,33

24,67

7040,87

27,50-44,7

-38,267,1

32,9

5042,07

27,12-49,9

-38,764,34

35,66

3028,47

13,52-49,9

-52,247,4

52,6

028,35

13,84-48,7

-5248,78

51,22

172

HS

GS

No-acuosa

El cam

bio entálpico

(ec. 6)

involucra los

requerimientos energéticos del proceso global

de disolución.

La entropía

aumenta

por la

ubicación del soluto en el seno del disolvente, tam

bién debe

considerarse la

posible organización por asociación de las m

oléculas del disolvente alrededor de las partículas del soluto, lo cual dism

inuye la entalpía.

Para el

proceso de

mezcla,

los valores

de entalpía y de entropía son negativos, la entalpía soluto-disolvente es exotérm

ica, ésta magnitud

es superior a la de formación de cavidades. La

estructuración de las moléculas alrededor de los

grupos no

polares del

soluto(hidratación

hidrofóbica) contribuye a disminuir el calor neto

de m

ezcla (

HF)

en solución

acuosa hasta

valores negativos (Tabla I).

La Figura 1m

uestra el perfil de solubilidad se observa un único m

áximo de solubilidad situado

en el segmento m

ás polar de la mezcla de

solventes. D

icho m

áximo

alcanza su

mayor

valor en el porcentaje 40% etanol-agua, aunque

se trata de un máxim

o muy am

plio . La Figura 2 representa

la variación

de la

entalpía de

disolución con

la proporción

de etanol.

El descenso de la

entalpía en etanol-agua, se relaciona

con el

incremento

de solubilidad

observado (Tabla I).

Las fuerzas

que dirigen

el proceso

de solubilidad durante la fase de disolución son de naturaleza predom

inantemente entálpica (T

abla I, Figura 2).

La Figura

3 representa

la com

pensación entalpía-entropía. En las dos m

ezclas se obtiene una relación lineal. Esta relación indica que existe un único m

ecanismo responsable

de la variación de solubilidad, la

entalpía, cuando se añade el codisolvente.

El m

ecanismo

de disolución

depende de

la naturaleza de la m

ezcla disolvente, y de la proporción de codisolvente en la m

ezcla.Los

resultados apoyan

la hipótesis

de que

la com

pensación entalpía-entropíaes característica

de la

solubilidad de

fármacos

en m

ezclas

disolventes, tanto acuosos como no acuosos. Los

resultados tam

bién perm

iten identificar

mecanism

os com

unes que

explican la

acción codisolvente.

En anteriores

trabajos

en las

mezclas acuosas se observaron dos m

ecanismos,

entalpía y entropía, cada uno de ellos dominante a

una cierta

proporción de

codisolvente que

depende de la hidrofobicidad del fármaco

(5-7).

Figura 3.Com

pensación entalpía-entropía

Referencias:

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es KC

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aceutical sciences. Marcel

Dekker. N

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rug et al. Enthalpy-entropy compensation

1.Some

fundamental

statistical problem

s associated w

ith the analysis of Van´t H

off and A

rrhenius data. J Phys Chem

.80(21):2341-2351 (1976). (3)

Krug et al. Enthalpy-entropy com

pensation 2.Separation of the chem

ical from the statistical

effect. J Phys Chem

. 80(21):2341-2351 (1976). (4)

Perlovich et

al.Therm

odynamics

of solutions III. C

omparison of the solvation of

naproxen with other N

SAID

S. Eur J Pharm.

Biopharm

.57:411-420 (2004). (5)

Bustam

ante et

al. Therm

odynamics

in am

phiprotic and

amphiprotic-aprotic

solvent m

ixtures. Pharm &

Pharmacology. 1:505:507

(1995).(6)

Bustam

ante et

al. Enthalpy-entropy

compensationfor the solubility of drus in solvent

mixtures: paracetam

ol, acetanilde and nalidix acid in dioxane-w

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1596 (1998).(7) Peña et al. Therm

odynamics of cosolvent

action: Phenacetin,

salicylic acid

and probenecid.J.Pharm

.Sci. 98:1129-1135 (2009).

Acuosa

No-acuosa

10 19 28 36 45 6000 8500

11000 13500

16000

Figura 1. Solubilidad metam

izol Mg,

enfunción de la polaridad y de la T

Acuosa

HS

etanol10 19 28 36 45 0

25 50

75 100

Figura 2.Calor de disolución frente a

proporciónde etanol de am

bas mezclas

0,000 0,018 0,037 0,055 0,073 15,0

23,3 31,5

39,848,0

delta

X

173

BIO

AV

AIL

AB

ILITY

OF Q

UE

RC

ET

IN E

NC

APSU

LA

TE

D IN

POLY

ME

RIC

N

AN

OPA

RT

ICL

ES.

R. Peñalva, I. Esparza, E. R

incón, M. A

güeros, JM Irache

Departm

ent of Pharmacy and Pharm

aceutical Technology; University of N

avarra,31008 Pam

plona (Spain)

Introduction:Q

uercetin, 3,3’,4’,5’-7-

pentahydroxy flavone,

is one

of the

most

abundant flavonoids

in plants.

It has

been dem

onstrateda w

idevariety of pharm

acological effects,

such as

dilating coronary

arteries, decreasing

blood lipids,

anti-platelet aggregation,

anti-oxidation,anti-anaem

iaand

anti-inflamm

ative activity[1]. In spite of the

potentially beneficial effects of quercetin, it show

s a

very low

absorption

in the

gastrointestinal tract,

andthus,

its oral

bioavailability is lowerthan 10%

[2]. Quercetin

hasaffinity for

drug transporters, including P-glycoprotein,

multidrug

resistance-associated protein2

(MR

P2) and

cytochrome

P450 (C

YP3A

); all of themhighly expressed in the

gut epithelium[1], [3].In addition, quercetin

is easily degraded in the presence of factors suchas light and oxygen. [1], [3]. In order to overcom

e these problems, the aim

of this w

orkw

as to study the encapsulation of this flavone in nanoparticles in order to im

prove its stability and increase its oralbioavailability.

Material and M

ethods:Two different types of

quercetin-loaded polymeric nanoparticles (N

P-A

and

NP-B

) w

ere prepared

following

a patented procedure (PC

T/ES2011/070118).For the characterization, the size, zeta potential, m

orphology and

shape of

the resulting

nanoparticles w

ere evaluated.

The size

and surface charge of nanoparticles w

ere determined

by Laser

Doppler

Electrophoresis using

a ZetaPlus,

(zeta potential

and size

analyzer B

rookhaven Instrum

ents C

orporation). The

morphology of nanoparticles w

as observed by scanning

electron m

icroscopy (Zeiss

DSM

940A

, G

ermany).

The am

ount of

quercetinencapsulated in nanoparticles w

as quantified by H

PLC [4].

In vitro release studies“In vitro”

release studies were carried out under

sinkconditions after dispersant ofnanoparticles

in simulated gastric

(SGF)

and intestinal fluids(SIF)

containing 1%

(p/v)

Tween

80 as

surfactant.A

t different

times,

samples

were

taken and

centrifuged in

a M

ikro 220R

centrifugefor

15 m

in at

10000 rpm

. Supernatants w

ere recovered and analyzed by H

PLC[4].

Pharmacokinetic studies in rats

The oral

bioavailability of

quercetinw

as determ

ined in male W

istar rats. The animals

were

fasted overnight before experiment w

ith free access

to water.The study w

as conducted after adm

inistration of a single dose of 25

mg/kg

quercetin to

rats in

the follow

ingform

ulations: (i)

Solution, (quercetin-PEG

400:w

ater (40:60

by vol)),

(ii) Suspension

(quercetin-water

suspension),(iii)

NP-A

(quercetin loaded nanoparticles in pol A) and

(vi) NP-B

.(quercetin loaded nanoparticles in

polB

)In

addition, the

flavonoid w

as also

administered

i.v. at the same dose. A

t different tim

es, 250 L of blood sam

ples were extracted.

The am

ountof

quercetinin

plasma

was

determined by H

PLC.

The pharmacokinetic analysis of concentration–

time data, obtained after the adm

inistration of the

different flavonoid

formulations,

was

analyzed using

a noncom

partimental

model

using W

inNonlin

6.0 softw

are (Pharsight

Corporation, M

ountain View

, USA

).

Results and discussion:

The main physico-

chemical characteristics of the nanoparticles are

summ

arized in Table 1. Nanoparticles displayed

spherical shape with sizes around 300

nm and

anegative

surface charge.

The am

ount of

quercetin incorporated in these nanoparticles w

as dependent on the polymer used and ranged

from 24

g/mg N

P-A to 80

g/mg N

P-B. The

encapsulation efficiency

in both

cases w

as closed to 80 %

.

Table

1Physico-chem

ical characteristics

of quercetin-loaded nanoparticles. D

ata expressed as m

ean ± SD (n=

3).

Formulation

Size (nm

)

Zeta potential

(mV

)

QU

loading (

g/mgN

P.)EE (%

)

NP-A

251 ±9 -29.5 ±0.9

23.9 ±0.879.4±0.9

NP-B

352 ±4 -45.5 ±0.7

79.1 ±6.992.4±1.2

Regarding

the in

vitrorelease

studies of

quercetin, Figure 1 shows the release profile of

this component w

hen loadedin

NP-A

and NP-

B. The in vitro

release profile of NP-A

and NP-

B exhibited a biphasic pattern, characterized by

an initial

non release

period w

hen the

nanoparticles w

ere incubated

in the

SGF

174

followed

by a

rapid release

when

the nanoparticles w

ere dispersed in SIF .

0 20 40 60 80

100

120

02

46

810

1214

1618

2022

2426

2830

3234

Quercetin released (%)

Time (h)

NP-B

NP-ASIF, pH 6.8

SGF, pH 1.2

Figure 1In vitro release profile of quercetin

from N

P-A and NP-B. D

ata expressed as mean

± SD (n=

3)

Figure 2 shows the plasm

a concentration of quercetin

(ng/mL)

vs. tim

e (hour)

for the

different form

ulations tested.

When

the form

ulations loaded

on nanoparticles

were

evaluated, the curves were characterized

by a rapid

increase in

quercetinplasm

a concentrations till the C

max w

as reached.Then, constant levels w

ere maintained until 8 hours

and finally the quercetin plasma concentration

declined slow

ly w

ith tim

e. The

flavonoidplasm

a levels

when

loaded in

nanoparticles (N

P-A and N

P-B) w

ere significant higher than those

observed for

either the

solution or

suspension of the flavonoid (p<0.05)

Figure 2. Quercetin plasm

a levels after the oral adm

inistration of a single dose of 25 mg/kg.

in different form

ulations: (i) Solution (quercetin after their dissolution in a m

ixture PEG 400-H

2 O (40:60

by vol.))

(ii) Suspension

(quercetin dispersed

in w

ater) (iii) NP-A (quercetin-loaded nanoparticles in

pol A) and (iv) NP-B (quercetin-loaded nanoparticles

in pol B). Data expressed as m

ean±SD (n=

6).

Table 2

summ

arizes the

pharmacokinetic

parameters. Significant differences w

ere found by com

paring AU

Cs. In fact, A

UC

s obtained for both

nanoparticle form

ulations w

ere significantly higher than for both the solution and the suspension of quercetin used as control(p<0.05). O

n the other hand, the oral bioavailability of quercetin form

ulated as solution was calculated

to be about 2% w

hichis in line w

ith previously

reporting data [2]. For the quercetin suspension, this param

eter was significantly reduced. O

n the contrary,

the relative

oral bioavailability

of quercetin

when

loaded in

nanoparticles w

as betw

een 3 and 6 times higher than the value

observed for the PEG:w

atersolution of the

flavonoid. In

any case,

the highest

bioavailability was found for N

P-B.

Table 2.

Pharmacokinetic param

eters of QU

Ein

rats for the different formulations tested. (i)

I.V. (i.v adm

inistration of quercetin after their dissolution in a m

ixture PEG 400-H

2 O (40:60 by vol.))

(ii) Solution(oral

administration

of quercetin

after their

dissolution in a mixture PEG

400-H2 O

(40:60 by vol.))

(iii) Suspension

(oral adm

inistration of

quercetin dispersed in water) (iv) N

P-A (QU

E-loaded nanoparticles

inpol A) and (v) N

P-B (QU

E-loaded nanoparticlesin pol B).

Formulation

T max (h)

C m

ax (g/m

L) AUC

[(g/m

L)h] Fr (%

)

I.V.0 ± 0

59.1 ± 14.8 633.8 ± 152.0

Solution 1.5 ± 1

1.7± 0.7 8.5 ± 4.6

100

Suspension6.8 ± 1.7

0.4 ± 0.08 3.9 ± 1.8

45.3

NP-A

3.6 ± 1.9 3.0 ± 1.4*

25.1 ± 18.5* 296.6*

NP-B

6.3 ± 2.3 3.1 ± 1.2*

51.1 ± 20.6* 603.7*

* p<0.05all groups vs Solution

(U-M

ann Whitney test)

Conclusions:

NP-A

and NP-B

are able to load quercetin. B

oth types of nanoparticles show

gastro-retentive properties

and they

only released the loaded flavonoid under sim

ulated intestinal

conditions. B

oth types

of nanoparticles increased the oral bioavailability of quercetin in com

parison with the traditional

approaches of formulation based on solutions or

conventionalsuspensions of the flavonoid.

References:

[1]B

ootsA

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PLC M

arcel D

ekker, cop. 2000; 14(24)575-620

Acknow

ledgements

This w

ork is

supported by

AD

ICA

P(IN

NPA

CTO

Project, IPT-2011-1717) from the

Ministry

of Science and Innovation and by the G

overnment

ofN

avarra in

Spain.R

ebeca Peñalva

is financially

supported by

the “A

sociación de Am

igos de la Universidad de

Navarra” (A

DA

).

175

EN

TR

AM

AD

OS

IMPR

INT

ED

PAR

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ESIÓ

N SO

STE

NID

A D

E H

IDR

OX

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L E

N

LE

NT

ES D

E C

ON

TA

CT

OY

EN

EN

VA

SES A

CT

IVO

S

L.Pereiro Expósito,C. A

lvarez-Lorenzo, A. C

oncheiro

Departam

ento de Farmacia y Tecnología Farm

acéutica, Facultad de Farmacia, U

niversidad de Santiagode C

ompostela, 15782-Santiago de C

ompostela,España.

Introducción: Los agentes antioxidantes tienen un gran interés en la prevención y tratam

iento de patologías de la piel y del globo ocular

(1). Adem

ás, se utilizan

habitualmente

como

aditivos alim

entarios para prolongar la vida útil de los alim

entos, previniendo

la alteración

de sus

propiedades organolépticas. Cualquiera de estas

aplicaciones plantea problemas de form

ulación, dado que los agentes antioxidantes presentan, en general,

una baja

hidrosolubilidad y

son quím

icamente

lábiles. U

na m

olécula todavía

pocoestudiada

pero que

encierra notables

posibilidades debido

a su

elevada actividad

antioxidante (considerado

como

el segundo

agente m

ás potente)

y reconocida

biocompatibilidad

e inocuidad

es el

hidroxitirosol, que se extrae del aceite de oliva(2). Se pretende sintetizar hidrogeles acrílicos, diseñados

con los

grupos quím

icos m

ás adecuados

para interaccionar

con el

hidroxitirosol, que

cuenten con

elevada capacidad

de carga

de antioxidante

y que

puedan controlar la cesión durante periodos de tiem

po prolongados,

con vistas

a dos

aplicaciones: a)

confección de

lentes de

contacto blandas

medicadas

potencialmente

útiles para

la prevención

de retinopatías

y cataratas,

y b)

confección de

películas adecuadas

para ser incorporadas a estructuras lam

inares que puedan servir como m

ateriales de envases activos. Para optim

izar la afinidad del entram

ado por hidroxitirosol se aplicó latécnica

de im

printing m

olecular, que

consiste en

incorporar el

fármaco

a la

disolución m

onomérica, de m

anera que los monóm

eros se reordenen

espacialmente

y que,

tras la

polimerización

y la

eliminación

de las

moléculas que han actuado com

o molde, se

formen cavidades con afinidad por el fárm

aco.

Materiales y M

étodos: Síntesis

de los

hidrogeles: Se

prepararon m

ezclas de 2-hidroxietil metacrilato (H

EMA

): 2-butoxietilm

etacrilato (BEM

)40:60 vol/vol, y

se les

incorporó ácido

acrílico(A

Ac)

en distintas proporciones (Tabla 1). C

omo agente

reticulante se utilizó etilenglicol dimetacrilato

(EGD

MA

)y

como

iniciador de

la polim

erizaciónazoisobutironitrilo

(AIB

N).

A

alícuotas de

estas m

ezclas se

les añadió

hidroxitirosol acetato (Seprox Biotech, M

adrid) para preparar entram

ados imprinted (Tabla 1).

La composición de los entram

adosno im

printed fue

la mism

a, salvo que no se incorporó fármaco

durante la

síntesis.La

polimerización

transcurrióa

70ºCdurante 48 horas. Todos los

entramados

selavaron

en agua en ebullicióndurante 30 m

inutos,se cortaron

en piezasde

10x10m

my

se secaron a 40ºC durante 24h.

Finalmente, los entram

ados se acondicionaronen bolsas de plástico herm

éticamente cerradas y

protegidas de la luz.C

aracterización de los hidrogeles:Se registró la tem

peratura de transición vítrea (Tg )

de los hidrogeles

secos en

unD

SC

Q100

(TA

Instruments, U

K) y la transm

itanciaa 600 nm

de

los hidrogeles

húmedos

en un

espectrofotómetro A

gilent 8453 (Alem

ania).La biocom

patibilidad se evaluó mediante

el ensayo de

HET-C

AM

[3]. El grado de hinchamiento en

agua a temperatura am

biente se obtuvo pordiferencia entre los

pesos húmedo (W

s)y seco

(Wd) de los hidrogeles, aplicando la ecuación:

Wd

xW

dW

sQ

/100

)(

Cesión a partir de entram

ados imprinted recién

preparados: Piezas

de entram

ado se

sumergieron

en 30m

l de aguay se conservaron

en viales topacio a temperatura am

biente, bajo agitación m

agnética y protegidos de la luz. A

distintos tiempos, se tom

aron muestras de 3 m

l de cada vial y se registró su absorbancia a 280nm

(Agilent 8453, A

lemania). Las m

uestrasse

devolvieron a loscorrespondientes viales. El

ensayo se

prolongó durante

23días,

y transcurrido este tiem

po, las piezas se pesaron y se

lavaron exhaustivam

ente con

mezcla

etanol:agua 50:50 para completar la extracción

dehidroxitirosol.

Com

o controles se utilizaron piezas de entram

ados no imprinted.

Carga y cesión a partir de entram

ados no im

printed e imprinted recargados:

Piezas de entram

ados no imprinted e im

printed una vez extraído

el hidroxitirosol,

se incubaron

en disoluciones

de agente

antioxidante de

concentración (0.2 g/l, 10 ml) y se m

onitorizó la concentración de hidroxitirosol rem

anente en el m

edio de carga durante 1 semana a tem

peratura am

biente. Una vez cargados, se evaluó la cesión

a partir de los entramados en las condiciones

indicadas.

176

Tabla 1.C

omposición quím

ica de los hidrogeles.

Hidrogel

12

34

2-HEM

A

2.2 ml

2.2 ml

2.2 ml

2.2 ml

BEM

3.3 ml

3.3 ml

3.3 ml

3.3 ml

Ac. A

crílico 0.5 m

l0.5 m

l0

0EG

DM

A

0.5 ml

0.5 ml

0.5 ml

0.5 ml

AIB

N

16 mg

16 mg

16 mg

16 mg

Hidroxitirosol acetato

0100 m

g0

100 mg

Resultados y D

iscusión:C

aracterización de

los hidrogeles:

Latem

peratura de transición vítrea (Tg ) de todos

los entram

ados, tanto

imprinted

como

no im

printed, se situó en el intervalo 54-57 ºC.

En agua, los entramados m

ostraron un grado de hincham

iento de 1-2%. U

na vez hidratados, presentaron una elevada transparencia óptica con

valores de

transmitancia

a 600

nm

superiores al 90%.

El proceso de lavado tras la polimerización,

mediante

inmersión

en agua

en ebullición

durante 30 minutos, resultó ser suficiente para la

eliminación de m

onómeros residuales, com

o se confirm

ó al registrar la absorbancia UV

-vis del m

edio en la región 190-220 nm durante el

ensayo de cesión de los entramados im

printed y no

imprinted

recién lavados.

Es interesante

destacar que

tras este

procedimiento

de lim

pieza, los

entramados

imprinted

todavía retienen

más

del 50%

del

hidroxitirosol incorporado durante la síntesis. Por lo tanto, el procedim

iento es

adecuado para

extraer los

monóm

eros residuales,

permitiendo

el uso

directo de

los entram

ados im

printed. En

la Figura 1 se m

uestra el perfil de cesión de hidroxitirosola partir de estos entram

ados.

Tiempo (días)

05

1015

2025

Hidroxitirosol cedido (mg/g)

0 1 2 3 4 5 6

Figura1.Perfiles de cesión de hidroxitirosol en

agua a partir del entramado im

printed tipo 2 (Tabla 1).

Los entramados m

ostraron una elevada afinidad por el hidroxitirosol acetato, que puede unirse alos

componentes

poliméricos

a través

de interacciones hidrofóbicas tipo

-(con B

EM)

y puentes de hidrógeno (con ácido acrílico). Enagua

a tem

peratura am

biente, la

cesión se

sostuvo durante más de un m

es.Los ensayos

preliminares de carga de los entram

ados no im

printed y de recarga de los imprinted ponen

de manifiesto que pueden incorporar cantidades

suficientesdel agente antioxidante. A

demás, los

entramados

mostraron

una elevada

biocoimpatibilidad

elensayoH

ET-CA

M.

Conclusiones:

La incorporación de monóm

eros funcionales a entram

ados de HEM

A perm

ite m

odular el

grado de

hinchamiento

y la

incorporación de

olopatadina sin

alterar las

propiedades m

ecánicas. La

presencia del

fármaco en la m

ezcla de polimerización no

causó cambios en las propiedades m

ecánicas, ópticas

nide

biocompatibilidad

de los

entramados,

que presentan

características adecuadas com

o lentes de contacto medicadas.

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gro. Food Industry Hi-Tech.,

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(3) NIC

EATM

-ICC

VA

M, In vitro test m

ethod for detecting ocular corrosives and severe irritants. http://iccvam

.niehs.hih.gov/methods/ocutox/

ivocutox/ocu_brd_hetcam.htm

, 2012.

Agradecim

ientos:Trabajo financiado por la X

unta de Galicia

(10CSA

203013PR),

FEDER

y

MIC

INN

(SA

F2011-22771; IN

NPA

CTO

IPT-060000-

2010-14, MIPFO

OD

project).

177

DISE

ÑO

Y D

ESA

RR

OL

LO

TE

CN

OL

ÓG

ICO

DE

NA

NO

CÁ

PSUL

AS L

IPÍDIC

AS D

E U

N

CA

NN

AB

INO

IDE

. L. Prieto

1,A. I. Torres-Suárez

1,2

1Departam

entode Farm

acia y Tecnología Farmacéutica; 2Instituto

de Farmacia Industrial.U

niversidad C

omplutense de M

adrid, España.

Introducción:Los cannabinoides son un grupo

de com

puestos que

derivan de

la planta

Cannabis sativa, siendo los m

á9-tetrahidrocannabinol

(THC

)y

cannabidiol (C

BD

). La investigación en cannabinoides ha

experimentado

en los últimos años un gran

auge, planteándose su posible utilización en el tratam

iento de diferentes patologías como las

nauseas y vómitos asociados a la quim

ioterapia, la anorexia en

pacientes con SIDA

, el dolor neuropático, la esclerosis m

últiple, el glaucoma

y el cáncer. Estos efectos son consecuencia de la estim

ulación de receptoresC

B1 (localizados

preferentemente

a nivel

del SC

N)

y C

B2

(asociados preferentemente al sistem

a inmune).

Nuestro equipo de investigación ha com

probado el elevado efecto citotóxico de TH

C y C

BD

en un

modelo

xenográfico de

glioma

humano

inducido en ratones 1, y ha desarrolladocon

ambas m

oléculas nanopartículas poliméricas 2y

micropartículas

biodegradables para

su liberación prolongada durante 3 sem

anas tras su adm

inistración subcutánea3.

El objetivo del presente trabajoes el diseño y

desarrollo de nanocápsulas lipídicas (LN

Cs)

como un sistem

a eficaz de vehiculización de cannabidiol.

EstasLN

Cs

facilitarían la

dosificación del principio activo y, su acceso a biofase potenciando los efectos

antitumorales

de esta molécula.

Materiales y M

étodos: 1.- Elaboración de

LCN

s: para la elaboración de las nanoparticulas

lípidicasse ha utilizado el

método

de inversión de fases 4, realizándose

tres ciclos de temperatura. C

omo com

ponentes lipídicos

se utiliza

Labrafac W

L 1349

(triglicéridos de ácido cáprico-caprílico), Lipoid S75-3

(lecitina de

soja con

un 69%

de

fosfatidilcolina)y Solutol H

S 15 (mezcla de

polietilenglicol 660

e hidroxiestearato

de polietilenglicol 660). La tem

peratura de inversión se fases seha

determinado

por conductimetría, realizándose

medidas cada 2ºC

, entre 45ºC y 95ºC

, bajo agitación m

agnética.Se

elaboran tres

lotes de

LNC

s blancas

y cargadas con C

BD

según las fórmulas de la

tabla 1,con el fin de evaluar la influencia de la com

posición lipídica sobre el tamaño de las

LNC

s. Una vez obtenidas, las nanocápsulas se

esterilizan mediante filtración utilizando una

mem

brana de 0,22m

y se conservan a 4ºC en

forma de suspensión acuosa.

Para la elaboración de las LNC

s cargadas, se incorpora entre un 4%

y un 9% de C

BD

a la fase lipídica.

% Fase lipídica

Com

ponenteL

-1L

-2L

-3Solutol

65.741.5

26.1Labrafac

28.850.4

65.1Lipoid

5.58.1

8.8Tabla 1. C

omposición lipídica de los tres lotes

de LNC

s.

2.C

aracterización de las LNC

s: se determina el

tamaño m

edio y la distribución de tamaños de la

suspensión de

nanopápsulas, por

dispersión dinám

ica de luz láser, utilizando un equipo Zetatrac N

PA152, con el que tam

bién se mide el

potencialZ

de las

nanocápsulas blancas

y cargadas con activo. El aspecto de las LN

Cs se

observa por

microscopía

electrónica de

trasmisión

(TEM), tiñendo previam

ente las m

uestras con

acetato de

uranilo al

2%

y utilizando

un

microscopio

Jeol 100C

X.

Resultados y D

iscusión: C

on las tres fórmulas ensayadas se obtuvieron

suspensiones acuosas

de nanopartículas

blancas, con apariencia turbia azulada al incidir sobre ellas la luz.

Formulaciones

Tamaño

medio (nm

) Potencial Z

(mv)

L-1 B

lanca22.25

20.89 C

BD

24.73 12.84

L-2 B

lanca40.80

21.59C

BD

42.2021.49

L-3 B

lanca108.9

1.77C

BD

119.7-3.71

Tabla 2:Tam

año medio y potencial Z de las

distintas form

ulaciones de

nanoparticulas blancas y cargadas con C

BD

.

Según se recoge en la tabla 2, al disminuir el

porcentaje de

Solutol y

aumentar,

en consecuencia,

el porcentaje

de Labrafac,

aumenta el tam

año de las LNC

s; de manera que

la modificación de las proporciones de estos

dos componentes resulta una form

a eficaz de controlar

el tam

año de

las nanocápsulas

obtenidas. Mientras que Labrafac constituye el

núcleo de las nanocapsulas, Solutol actúaen la

formulación com

o agente surfactante hidrófilo

178

y quedaría localizado en la superficie exterior de las nanocápsulas, aportándolas estabilidad física

ya que

presenta una

temperatura

de solidificación de 35ºC

. En concreto, con las fórm

ulas estudiadas, se obtienen nanocápsulas con un tam

año medio de

22.25nm, 50.80nm

y 108.9nm

, y una muy estrecha distribución de

tamaños, com

o puede observarse en las gráficas A

y C de la figura 1.

Figura 1:

distribución de

tamaños

de las

nanopartículas: L-1 blancas (A) y con C

BD

(B);

L-2 blancas (C) y con C

BD

(D)

Esta estrecha distribución de tamaños tam

bién queda

patente por

microscopía

electrónica (figura 2 A

), observándose esferoides lipídicos con una elevada uniform

idad de tamaño.

Figura 2.

Aspecto

de las

nanocápsulas al

microcopio

electrónico: L-1 blancas (A) y L-1

con CB

D (B

).

La figura

3 representa

la

variación de

la conductividad en función de la tem

peratura para la m

ezcla de fase lipídica y CB

D. C

omo se

puede observar la TIF se encuentra alrededor de los 76.4C

, valor sólo ligeramente

superior alque, según la bibliografía, presenta la m

ezcla de lípidos

sin principio

activo(TIF

=74.3ºC) 4.

Teniendo en cuenta este valor se elaboraron los tres lotes de nanocápsulas cargadas de C

BD

.C

on las tres fórmulas estudiadas se obtuvieron

suspensiones de

nanocápsulasde

CB

D,

verificado visualmente por presentar un claro

efecto Tyndall y una tonalidad azulada debido a la

dispersión

de R

ayleigh, especialm

ente m

arcado en el caso del Lote 2.

Figura 3. Resultados de la determ

inación de la TIF de la m

ezcla lipídica-CB

D.

Las LC

Ns

cargadas con

CB

D

presentan características sim

ilares a las LNC

s blancas. A

unque se obtuvieron valores de tamaño m

edio ligeram

ente superiores, las diferencias no fueron significativas

(figura 1.B y D

). Tampoco se

observaron diferencias

por m

icroscopía electrónica

(figura 2.B

)de

manera

que la

presencia del principio activo no afecta a las características de las nanocápsulas obtenidas.C

onclusión:Se

han puesto

a punto

tres protocolos para la obtención de LN

Cs de C

BD

que perm

iten obtener nanocápsulas contam

años m

edios de 20nm, 50nm

y 100nm. Estudios

posteriores permitirán determ

inar la influencia del tam

año de partícula en la eficacia de las nanocápsulas

desarrolladas

como

vehículos para la adm

inistración de cannabidiol.R

eferencias:(1)

D.

Hernán

et al.

Microspheres

of cannabinoids:

a tool

for im

proving their

administration in pharm

acological studies. C

annabinoids in

biology and

Medicine.

Jerusalem, 2010.

(2) M.R

. Aberturas et al. Preparation and cha-

racterization of

polymeric

nanoparticles loaded w

ith a cannabinoid model drug. 1st

Conference on Innovation in D

rug Delivery:

from biom

aterials to devices. Nápoles, 2007.

(3) D

. H

ernán et

al. Poly-

-caprolactone m

icrospheres as a drug delivery system for

cannabinoid adm

inistration: D

evelopment,

characterization and in vitro evaluation of their

antitumoral

efficacy. J

Controlled

Release, 161 (3) 927–932, 2012.

(4) B.H

eurtault et al. A N

ovel Phase Inversión-B

ased Process for the Preparation of Lipid N

anocarriers.Pharm

. Research, 19 (6)875-

879, 2002

Agradecim

ientos:al

Centro

Nacional

de M

icroscopía Electrónica,por su ayuda en la

realización de las fotografías.

179

APL

ICA

CIÓ

N D

EL

DISE

ÑO

EX

PER

IME

NT

AL

A L

A O

PTIM

IZAC

IÓN

DE

UN

PRO

CE

SO D

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EX

TR

AC

CIÓ

ND

E A

CE

TA

ZOL

AM

IDA

A PA

RT

IR D

E T

RA

NSFE

RSO

MA

S®

M.J. C

ózar-Bernal, A

.M. R

abasco, N. A

bad, M.L. G

onzález-Rodríguez

Departam

entode Farm

acia y Tecnología Farmacéutica, U

niversidad de Sevilla, España

IntroducciónA

cetazolamida (A

CZ) es elfárm

acode elección

empleado en el tratam

iento de ataques agudos de glaucom

a y para el control de la presión intraocular (PIO

) post-quirúrgica.A

ctualmente se está investigando la vía tópica

como alternativa a la vía oral.

Este fármaco

presenta tanto baja solubilidad(0.7 m

g/mL)

como

permeabilidad (clase IV

, BC

S). Para solventar estas

dificultades, con el fin de que pueda atravesar intacto determ

inadas capas de

la m

ucosa, se

han diseñado

vesículaselásticas

o Transfersomas ®, capaces de cruzarel

estrato córneo sin ser destruidas, accediendoasí

a estructurasmás internas.

LosTransfersom

as ®son liposom

as modificados

que incluyen

en su

composición

los denom

inados “activadores del borde o margen”

en el interior de la matriz fosfolipídica, con el

fin de

incrementar

la elasticidad

ydeform

abilidad de la vesícula(El Zaafarany y

cols., 2010).

Este tipo

de sustancias

son habitualm

ente tensioactivos de cadena única, capaces

de ofrecer

un elevado

radiode

curvatura que desestabilizalas bicapas lipídicas

de las vesículas e incrementa

sudeform

abilidad (H

oneywell-N

guyen y Bouw

stra, 2005).El diseño experim

ental (DO

E)es una estrategia

que im

plica la

utilización de

elementos

matem

áticos y

estadísticos (G

onzález-R

odríguez y cols.) con objeto de obtener la m

áxima

información

a través

de datos

experimentales

y encontrar

las condiciones

óptimas para la ejecución de un determ

inado proceso experim

ental(Lewis y cols., 1999).

En el presente trabajo se pretende optimizar las

condiciones del método de extracción de

AC

Z de las vesículas

formuladas por centrifugación

con el

fin de

evaluar la

eficacia de

encapsulación de los Transfersomas ®.Para ello,

se ha llevado a cabo un estudio de cribado de distintos factores, con el objetivo

de conocer aquellos que influyen significativam

ente en las respuestas seleccionadas.

Materiales y M

étodosM

aterialesA

CZ

(Acofarm

a, España),desoxicolato sódico, colesterol

y1,2-dipalm

itoil-sn-glicero-3-fosfocolina

semisintética

(Sigma

Aldrich,

Alem

ania), H

epes, acetato

de sodio,

lauril sulfato sódico y dem

ás disolventes(Panreac

Quím

ica S.A., España).

Elaboración de vesículas multilam

inaresLos Transfersom

as ®se elaboraron utilizando la

técnica de evaporación en capa fina o Bangham

(TLE, Thin

Layer Evaporation).La m

ezcla de lípidos (fosfolípidos y colesterol), el desoxicolato (activador del borde)

yla A

CZ

se disolvieron en una mezcla de cloroform

o:m

etanol (3:2 v/v) El disolvente orgánico se evaporó bajo presión a 58 ºC

hasta obtener una fina

película. Éstase hidrató con

una solución de H

epes/PEG400 (60:40) m

ediante cinco ciclos interm

itentes de vortex y calora 50 ºC

. Lasvesículas se alm

acenarona 4 ºC

hasta su uso. O

ptimización de la eficacia de encapsulación

Se ha desarrollado y optimizado

un método de

separación de

fracciones (encapsulada

y no

encapsulada) y su posterior cuantificación.Este

método

consiste en

centrifugar la

dispersión liposom

al (Eppendorf

Centrifuge

5804R) a

una velocidad

apropiada (8000

- 12000 r.p.m

), durante un tiempo y tem

peratura adecuados (C

himanuka y cols., 2002; Fang y

cols., 2008).Tras

someter

las m

uestras a

las distintas

condiciones, se

separa el

sobrenadante del

precipitado y se realizandistintos tratam

ientos previos a su cuantificación por H

PLC:

1)El sobrenadante se filtra y se cuantifica directam

ente por HPLC

, determinando

así la

cantidad de

fármaco

no encapsulado.

2)A

l precipitado se le añade una solución de lauril sulfato sódico (LSS) 0.5%

p/v para

facilitar la

destrucción de

las vesículas (B

hardwaj y cols.,2010) y se

determina

la cantidad

de fárm

aco encapsulado por H

PLC.

En la tabla 1 se recogen las variables estudiadas en el proceso de optim

ización.Para cuantificar de form

a precisa laA

CZ, se

desarrolló un método

analíticode fase reversa

por HPLC

, utilizando uncrom

atógrafo Hitachi

HPLC

Elite Lachrom.

FactoresN

iveles

Tiempo (m

inutos)V

olumen de m

uestra (mL)

T de centrifugación (ºC)

Velocidad

centrifugación(rpm

)

-1 0 +1

60 90 1200.4 0.7 1 2 4 6

8000 10000 12000

Tabla 1.Factores seleccionados para el estudio, con sus niveles correspondientes.

180

Resultados y D

iscusión La

determinación

de la

cantidad de

AC

Z encapsulada

en las

vesículas requiere

la destrucción de las m

ismas con una solución de

LSS una vez sedimentadas tras el proceso de

centrifugación. C

on el fin de establecer las condiciones óptimas

del proceso de centrifugación, se procedió al estudio m

ediante la aplicación del DO

E. En la tabla 2 se recogen las condiciones fijadas para cada uno de los experim

entos, así como los

resultados obtenidos de porcentaje de fármaco

encapsulado.C

omo

se aprecia,

se obtienen

porcentajes de

encapsulacióncom

prendidos entre un 26.5 y 52.4%

.

Exp

r.p.m.

ºCm

inm

Lx (%

) ± sd12 3

800080008000

24 6

6090120

0.40.71.0

38.5 ± 2.1752.4 ± 3.7935.5 ± 6.86

45 6

100001000010000

24 6

9012060

1.00.40.7

32.5 ± 1.2241.7 ± 1.8943.5 ± 0.60

78 9

120001200012000

24 6

1206090

0.71.00.4

39.7 ± 4.8426.5

± 3.4634.5 ± 4.05

Tabla 2.M

atriz ortogonal L9 de Taguchi yresultados de eficacia de encapsulación (x) de AC

Z (sd: desviación estándar).

En primer lugar, se llevó a cabo un

análisis de las

medias

(AN

OM

), obteniéndose

como

resultados más concluyentes que únicam

entedos

de los

factores (velocidad

y volum

en) ejercen significación estadística en la eficacia de encapsulación, ya que los valores obtenidos se encuentran

fuera de

los lím

ites de

error establecidos

en el

diseño. Por

tanto, la

temperatura y el tiem

po de centrifugación no influyen en la eficacia de encapsulación del fárm

aco, puesto que los valores se encuentran dentro del intervalo, lo que significa que esas diferencias

son debidas

a errores

experimentales.

En lo que respecta a la velocidad, se obtiene una relación

inversamente

proporcional con

la respuesta analizada, es decir, los valores de atrapam

ientoaum

entan conforme dism

inuye la velocidad. Este hecho podría atribuirse a la destrucción de los liposom

as cuando se utilizan velocidades de centrifugación m

uy elevadas.En relación al volum

en de muestra, existe un

valor máxim

o de eficacia de encapsulación, que se corresponde con la utilización de 0.7 m

L.Este

estudio ha

sido corroborado

con un

AN

OV

A.

Una vez analizados los distintos factores de la

matriz experim

ental en cuanto a su significación estadística respecto a las distintas respuestas, se

procedió al estudio de la optimización de dichos

parámetros, con el fin de conseguir una m

ayoreficacia de encapsulación del fárm

aco.C

on el

fin de

determinar

las condiciones

óptimas bajo las cuales se debe realizar el

proceso de

centrifugación para

obtener una

eficacia de

encapsulación elevada

en las

muestras, es estudian

las medias m

arginales (figura 2)donde

se representan secuencialmente

los factores de la matriz con sus respectivos

valores de eficacia de encapsulación. Dado que

lo que se pretende es maxim

izar la respuesta, es decir, obtener valores m

áximos de atrapam

iento del fárm

aco, se seleccionan los datos mayores

de los distintos factores. F

igura 2.Representación gráfica de las medias

marginales de los parám

etros estudiados para la respuesta “eficacia de encapsulación”.

Conclusiones

Las condiciones

de centrifugación

que se

aplicarán a

partir de

este m

omento

para sucesivos estudios serán:

oV

elocidad de centrifugación: 8000 rpmo

Temperatura: 4 ºC

oTiem

po de centrifugación: 60 minutos

oV

olumen de m

uestra: 0.7 mL

Bibliografía

Bhardw

aj y cols., Int J Pharm388: 181-189

(2010).C

himanuka y cols., J Pharm

Biomed Anal

28: 13-22 (2002).El Zaafarany y cols., Int J Pharm

397: 164-172 (2010).Fang y cols., Int J Pharm

356: 144-152 (2008).G

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Sci101:

3845-3863 (2012).H

oneywell-N

guyen y Bouw

stra, Drug D

iscov Today: Technol2: 67-74 (2005).Lew

is y

cols., M

arcel D

ekker, N

ew

York

(1999). A

gradecimientos:

Este trabajo

se ha

desarrollado bajo la cofinanciación del Consejo

Andaluz

de C

olegios O

ficiales de

Farmacéuticos.

181

Evaluación de la utilidad

deun polím

ero hiperramificado (H

ybraneH

1500)para la elaboración de pelets de liberación controlada por extrusión por fusión.

Elena Raviña Eirín, José Luis G

ómez A

moza, R

amón M

artínez PachecoD

epartamento de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica, Facultad de Farm

acia, Universidad de Santiago

de Com

postela, Santiago de Com

postela, España

Introducción

La extrusión por fusión es unatécnica am

pliamente

utilizada en el sector alimentario y en la industria de

plásticos (1),que

sólo en los últimos años ha sido

objeto de atención en el ámbito farm

acéutico. Por ello, hoy se dispone de un núm

ero reducido de excipientes adecuados para esta finalidad. Los polím

eros hiperramificados han sido objeto de

estudiosm

uy recientes, centradosmayoritariam

enteen

su uso como m

ateriales de recubrimiento en form

as de liberación controlada (2,3). Tom

ando estos hechos como punto de partida, en este

trabajo se han evaluado las posibilidades que ofrece un

polímero

hiperramificado

con estructura

de poliesteram

ida (H

ybrane H

1500) com

o excipiente

base para

la elaboración

de pelets

de estructura

matricial

de liberación

controlada, elaborados

por extrusión por fusión, conteniendo cafeína (C

AF) com

o fárm

aco modelo de elevada hidrosolubilidad.

Materiales y m

étodos

Materiales:

Principio activo:Cafeína (G

uinama), lote: 0012939

Excipiente:

Hybrane

H1500

(DSM

N

ew

Jersey, U

SA),

insoluble en

agua y

con tem

peratura de

transición vítrea de 78ºC, lote: H

vH

Métodos

Formulaciones objeto de estudio. Se han elaborado y

evaluado 12form

ulacionesde pelets,

en las que se com

binan 3 proporciones de CA

F/H1500 y

4 tamaños

de partícula, cuyas características se detallan en la tabla 1.E

laboración de las formulaciones. La m

ezcla de excipiente y principio activo (Turbula

® T2C

15m

in., 30

rpm)

se introdujo en un extrusor Randcastle R

CP

0375 equipado con tornillo sin fin girando a 30rpm y

con temperaturas

de 105, 110, 115y 115ºC

en las zonas de control. Los pelets se obtuvieron m

ediante corte m

anual del extruido. Lasfracciones

con tamaño

inferior a 1mm

se obtuvieron por pulverización del extruido

en m

ortero y

posterior separación

por tam

ización.

Tabla 1.Com

posición y propiedades de las formulaciones objeto de

estudio.

Caracterización de las form

ulaciones:D

ifractometría

de rayos

X.La

cristalinidad de

muestras

de fárm

aco, polím

ero, form

ulaciones y

mezclas físicas equivalentes se evaluó en un equipo

Philips PW1710 en el intervalo 0-

Tamaño de partícula.Se determ

inó por microscopía

óptica (Estereom

icroscopio O

lympusSZ-C

TV

conectado a

una videocám

ara JV

C

TK-S350),

el diám

etro medio de Feret de, al m

enos, 600 peletsde

cada formulación.

Velocidad de disolución.Los perfiles de disolución de

CA

Fa partir de m

uestras de 200 mg de pelets

seobtuvieron en aparato tipo II, U

SP 29(Turu G

rau DT-

6, Barcelona, España). Los ensayos se llevaron a cabo

en 900 ml de agua destilada, a 37ºC

, con las paletas girando a 50 rpm

. La cantidad de CA

F disuelta a cada tiem

po de

muestreo

se determ

inó por

espectrofotometría U

Vdirecta (A

gilent 8453) a 273nm

. Los perfiles de disolución se caracterizaron a través de la eficacia de la disolución 0-24 horas (ED

24h ).A

nálisis de los resultados. Para la evaluación de los efectos de las variables bajo estudio sobre

ED24h

se acudió a la regresión m

últiple secuencial (SPSS, v.15) y a la construcción de la correspondiente superficie de respuesta.

%H

1500%CA

FTam

año medio

(m

±SD)

ED 24h

9010

168±3714,56

9010

373±729,89

9010

763±1326,08

9010

1609±3432,80

8020

170±3713,33

8020

403±659,98

8020

825±1095,59

8020

1912±2992,33

7030

168±3811,99

7030

361±668,21

7030

806±1224,12

7030

1978±3691,54

182

Resultados y discusión

En la tabla 1 se recogen los resultados obtenidos en la caracterización de las form

ulaciones objeto de estudio. C

abe destacar que, para cualquiera de las proporciones fárm

aco-polímero

ensayadas, no

fue necesaria

la incorporación de un agente plastificante para obtener pelets

de hom

ogeneidad y

de propiedades

morfológicas adecuadas.

Los difractogramas de rayos X

(Figura 1) indican que el proceso de extrusión provoca

una m

oderada dispersión del fárm

aco en el seno del polímero, siendo

menor la cantidad de fárm

aco dispersada a medida

que aum

enta la

proporciónde

fármaco

en la

formulación.0

1000020000

3000040000

5000060000

70000

2-Theta

abcdefgh

9000counts

Figura

1. Difractogram

as de Rayos X

de las formulaciones indicadas: (a)

Cafeína, (b) H

ybrane H1500 (c) m

ezcla física 10% C

AF-90%

H1500, (d)

10% C

AF-90%

H1500 pelet, (e) m

ezcla física 20% C

AF-80%

H1500, (f)

20% C

AF-80%

H1500 pelet, (g) m

ezcla física 30%C

AF-70%

H1500, (h)

30% C

AF-70%

H1500 pelet.

a)b)0

2001400

14400 20 40 60 80

100

% Cafeína disuelta

Tiempo (m

in)

c)0

2001400

14500 20 40 60 80

100

% Cafeína liberada

Tiempo (m

in)

0200

14001450

0 20 40 60 80

100

% Cafeína disuelta

Tiempo (m

in)

Figura 2. Curvas acum

uladas de disolución de CA

F para las form

ulaciones indicadas.(a) 10% C

AF-90%

H1500, (b) 20%

CA

F-80%

H1500, (c) 30%

CA

F-70%H

1500. Pelets: -

-250

En la Figura 2se recogen las curvas acum

uladas de disolución de C

AF a partir de

cada una delas 12

formulaciones analizadas.

Cabe

destacar la

amplia

variedad de

perfiles de

disolución de fármaco que se obtienen con este tipo de

formulaciones. C

omo reflejo de la velocidad global de

disolución se tomó el parám

etro ED24h cuya superficie

de respuesta muestra

la clara incidencia del tamaño de

los peletssobre la velocidad dedisolución de cafeína y

la ligera influencia del porcentaje del fármaco sobre

el valor de este parám

etro (Figura 3).

0 2 4 6 8

10

12

14

16

500

1000

1500

200010

15

2025

30

ED 24h

Tamaño(m

cm)

% C

afeína

ED

24h =17.10-2E-2xT

amaño+5.78E

-6xTam

año2-3E

-3x%C

af 2

R2=0.988

Figura3. Superficies de respuesta para el parám

etro ED24h .

La observación de los diferentes perfiles de disolución sugiere que hay un m

ecanismo com

ún de liberación del fárm

aco en todas las formulaciones.

El polímero

portador experim

enta, en

medio

acuoso, una

progresiva gelificación/hidratación

provocando la

liberación del

fármaco

a través

de la

estructura m

atricial que se origina, aspecto que ratifica el ajuste, m

ás que aceptable, de los perfiles de disolución a la cinética de raíz cuadrada de H

iguchi. Adem

ás, las partículas de m

ayor tamaño perm

iten una importante

prolongación del proceso de disolución de un fármaco

tan marcadam

ente hidrosoluble (22 mg/m

l) como la

cafeína.

Conclusiones

El Hybrane H

1500 permite una fácil extrusión por

fusión sin

necesidad de

incorporar agentes

plastificantes y utilizando temperaturas relativam

ente bajas .Las form

ulaciones de pelets de cafeína/ Hybrane

H1500 obtenidas por EF perm

iten obtener una amplia

variedad de velocidades de disolución del fármaco,

controladas por difusión del fármaco a través de la

estructura hidratada/gelificada del polímero portador

en el medio de disolución y fuertem

ente dependientes del tam

año de los pelets.

Referencias

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ientosTrabajo

financiado por

la X

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Galicia

(07CSA

006203PR).

183

IMPL

AN

TE

SIN

YE

CT

AB

LE

S DE

POL

OX

AM

INA

, HE

PAR

INA

Y Á

CID

O H

IAL

UR

ÓN

ICO

PA

RA

CE

SIÓN

CO

NT

RO

LA

DA

DE

PRO

TE

ÍNA

S

M.I. R

ial-Herm

ida, S. Blanco-D

orado, A. C

oncheiro, C. A

lvarez-LorenzoD

epartamento de Farm

acia y Tecnología Farmacéutica. Facultad de Farm

acia. Universidad de Santiago de

Com

postela. 15782-Santiago de Com

postela, España.

Introducción:La

elevada incidencia

de las

enfermedades

degenerativasque

afectan al

sistema m

usculoesquético dotade gran interés a

la preparación de andamiajes o scaffolds

que prom

uevan la

regeneración del

tejidoo

elórgano afectado. Las poloxam

inas (Tetronic®)

soncopolím

eros tribloque

ramificados

que cuentan

con un grupo central etilendiamina

del que

parten cuatro

cadenas con

bloques hidrofílicos de poli(óxido de etileno) (PEO

) ehidrofóbicos de poli(óxido de propileno)

(PPO)

(Figura 1).

Esta arquitectura

hace que

sus dispersiones

acuosas se

comporten

como

sistemas sensibles al pH

y ala tem

peratura (1)y experim

enten transiciones de sol a gel a la tem

peratura corporal

formando

depotsútiles

para cesión controladade proteínas

(2). Por otra parte, se ha observado que la conjugación conheparina (glucosam

inoglucano aniónico)mejora

la capacidad

de diversos

polímeros

para interaccionar

con proteínas

morfogénicas,

lo que resulta en un control m

ás preciso de sucesión y de la actividad osteogénica (3).

Figura 1.Estructura de una poloxamina

El objetivo de este trabajo fue prepararsistemas

inyectablesutilizando

poloxamina

Tetronic®

908 y heparinaen form

a de mezcla física y de

conjugados químicam

ente unidos y evaluar in vitro su utilidad para liberación sostenida de proteínas.

También

se prepararon

sistemas

ternarios poloxamina/heparina/ácido hialurónico

y se evaluaron las posibilidades que ofrece la incorporación

de este

último

glucosamino-

glucanopara

modular

las propiedades

mecánicas y de cesión de los geles. El ácido

hialurónico actúa

como

promotor

de la

organización estructural de tejidos y aumenta la

expresión de marcadores de diferenciación de

células mesenquim

ales a osteoblastos (4), pero form

a hidrogeles de baja resistencia mecanica in

vivo. La combinación de los tres polím

eros podría

dar lugar

a geles

con propiedades

mejoradas com

o scaffolds óseos.

Materiales y M

étodos:M

ateriales:Tetronic

®908

(T908)de B

ASF

(Alem

ania); hialuronato

sódico(A

H)

de

Guinam

a(España);

heparina sódica

de la

mucosa intestinal porcina

(HEP)de C

albiochem

(Alem

ania); anhídrido

succínico, 4-

dimetilam

inopiridina, dioxano, MES (ácido 4-

morfoniloetanosulfónico),

N-

hidroxisuccinimida

(NH

S) y

1-etil-3-(3-dim

etilaminopropil)-carbodiim

ida (ED

C)

de Sigm

a-Aldrich

(Alem

ania); trietilam

ina y

n-hexano de B

DH

(Inglaterra); HC

l 37 % y azul

de toluidina de Panreac (España); mem

brana de diálisis

Spectra/Por (M

WC

O=3500)

de laboratorios Spectrum

(Holanda), seroalbúm

ina B

ovina (BSA

) de Acros (B

élgica); BC

A Protein

Assay K

it de Thermo Scientific (EE.U

U.); agua

purificada por

ósmosis

inversa (M

illiQ®

,M

illipore,España).

Todos los

restantes reactivos fueron de calidad analítica.Preparación de los geles:

Se prepararongeles,

en tampón fosfato de pH

7.4,a partir de mezclas

físicas y conjugados con las composiciones que

se recogen en la Tabla 1.

Tabla 1.C

omposición de los hidrogeles

Hidrogel

Com

posición1

T908 20%2

AH

1%3

HEP 12%

4C

onjugado T908-HEP 32%

5C

onjugado T908-HEP 32%

+ AH

0,5%

6M

ezcla física T908 20% + H

EP 12%

7M

ezcla física T908 20% + H

EP 12%

+ AH

0,5 %

La conjugación se llevó a cabo en dos pasos. Enprim

er lugar

se carboxiló

la poloxam

ina disolviendo 0,46 m

moles

de T908, 2,49 mm

olesde

anhídrido succínico,

1,99 m

moles

de 4-

dimetilam

inopiridina y 2 mm

olesde trietilamina

en 300 ml de 1,4 dioxano anhidro

agitando durante 24 horas a tem

peratura ambiente. A

continuación, se

evaporó el

dioxano en

rotavapor y

el residuo

se redisolvió

en cloroform

o. La conjugación con la heparinase

llevó a cabo porel método ED

C/N

HS, haciendo

reaccionar0,24 m

moles de T908 carboxilado,

0,27 mm

oles de heparina, 1,0935 mm

oles de ED

C y 0,5535 m

moles de N

HS

en 200 ml de

tampón M

ES pH5,6 durante 24 h, Finalm

ente, se dializó durante 3 días y

el producto resultantese

liofilizó.El

contenido en

heparina del

conjugado se

determinó

colorimétricam

ente

184

utilizando, como reactivo crom

ogénico, el azul de toluidina. FTIR análisis:

Se registraron los espectros de infrarrojos (FTIR

) del T908, la heparina,el

conjugado y la mezcla física, en com

primidos

de KB

r,enun espectrofotóm

etro Bruker m

odelo IFS-66v (U

SA).

Incorporación y cesión de BSA: Se dispersaron 50 m

g de seroalbúmina en 8 g de gel m

ediante agitación a 4ºC

.Porcionesde 2 g de cada gelse

llevaron a

un baño

a 37ºC

, en

el que

se m

antuvieron bajoagitación oscilante a 50 rpm

y se tom

aron muestras durante 7 días. La cantidad

de BSA

cedidase determ

inó utilizando el kitB

CA

. R

esultados y Discusión:

Preparación y caracterización de los geles: Las dispersiones de poloxam

ina sin y con HEP y de

conjugado T908-HEP, sin

y con AH

, dieron lugar a geles hom

ogéneos y semitransparentes

cuando la temperatura se increm

entó hasta37º

C. La H

EP sola no dio lugar a geles ni a tem

peratura ambiente ni a 37ºC

.El porcentaje

de heparina conjugadadetectado por el m

étodo colorim

étricofue próxim

o al 100%

, lo que indica que el conjugado está constituido por T908:H

EP 60:40 p/p.En

el espectro

FTIRdel

conjugado T908-

heparina(Figura 2),

se observóuna banda a

1625 cm-1

atribuible al enlace carbonilo o al grupo am

ida monosustituído de

la heparinay

otra a 1735 cm-1

correspondiente a la vibración del

enlace carbonilo

de la

poloxamina

conjugada. También se aprecia una banda a

3421 cm

-1, que

puede corresponder

a la

vibración de los grupos hidroxilo de la heparina conjugada.

Núm

ero de onda (cm-1)

10002000

30004000

Transmitancia0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0