Farmacologia MolecolareMer 7/4 pomeriggio dalla Prof. Curti per discussione orario

Tentativamente, inizio lezioni: Mer 14/4 ore 9-11

Canale ionico in 3D – KcsA

Famiglie di canali ionici

I canali ionici sono raggruppati in diverse famiglie

Canali della stessa famiglia tipicamente hanno:

•Stessa topologia di membrana della subunità che costituisce il poro del canale•Somiglianze significative nelle sequenze

Canali ionici voltaggio-dipendentiFamiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM)

Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunitàCiascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P)

Vi appartengono:Canali voltaggio-dipendenti del Na+, Ca2+ e K+

Canali del K+ Ca2+-attivatiCanali cationici attivati dall’iperpolarizzazione, ecc.

Questa è una delle 4 (pseudo)subunità

H5

S1 S2 S3 S4 S5 S6P++

++

OUTIN

N

S1 S2 S3 S4 S5 S6P++

++S1 S2 S3 S4 S5 S6

P++

++S1 S2 S3 S4 S5 S6

P++

++

C

Ca2+ channel

S1 S2 S3 S4 S5 S6P++

++

OUTIN

N

S1 S2 S3 S4 S5 S6P++

++S1 S2 S3 S4 S5 S6

P++

++S1 S2 S3 S4 S5 S6

P++

++

CNa+ channel

OUTIN

N C

S1 S2 S3 S4 S5 S6P++

++K+ channel X 4

Canali del K inward rectifierFamiglia di canali a 2 domini transmembrana (TM)

Il poro è delineato da 4 subunità (Kir)

Ciascuna contiene 2 segmenti TM e un loop interno

Permettono una corrente di K+ inward maggiore della outward

Questa è una delle 4 (subunità

Recettori Ionotropici per il glutammato

Sono costituiti da 4 subunità

Ciascuna ha 3 segmenti TM e un loop interno

Recettori Nicotinici e Recettori Ionotropici correlati(5HT3, GABAA, Glicina)

Sono costituiti da 5 subunità

Ciascuna subunità ha 4 segmenti TM

Il gating dei canali

Come fa il voltaggio ad aprire i canali?

Il controllo dell’attività dei canali per mezzo del voltaggio è la chiave che sta alla base dell’eccitabilità neuronale e del signalling

ovvero

I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci

Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio

Il movimento del Sensore del Voltaggio Produce una

Corrente di Gating

+50 mV-100 mV

1000 pACorrente Ionica

+50 mV-100 mV

Corr. di Gating Soluzione senza K+

1000 pA

10 pA1 ms

Corrente Ionica

Il movimento del Sensore del Voltaggio Produce una Corrente di Gating

+50 mV-100 mV

1000 pA

10 pA1 ms

Carica totale di gatingNumero dei canali = cariche e- /canale

Corr. di Gating Soluzione senza K+

Corrente Ionica

Il movimento del Sensore del Voltaggio Produce una Corrente di Gating

Nel canale del K+ “Shaker”, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici regolarmente distribuiti ogni 3 aa.

Canale chiuso: la 2a Arg di S4 è seppellita nel bilayer

Canale aperto: la 2a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4o e 5o residui basici si muovono dal citosol all’interno del bilayer

-

-

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

In

V

-

- +

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-Out

Attiva la spirale

Nel canale del K+ “Shaker” la presenza di 4 segmenti S4 che fungono da sensori del voltaggio intrinseci spiega la “ripida” dipendenza dell’attivazione del canale dal voltaggio.

Le 4 subunità identiche si muovono verso il lato extracellulare in due fasi distinte:

1) Prima indipendentemente l’una dall’altra;

2) Poi in maniera cooperativa, portando all’apertura.

This simulation shows a simplified view of the channel from the outside of the cell membrane. The S6 segments of the pore (blue) represent the conduction pathway and the voltage sensors are represented by the S4 segments (brown). The link between the S4 and the pore is simply indicated as a bar (yellow) connecting the inner end of the S4 with the inner end of the S6 segment.

Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica

ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL420

-2-4

q/n(e- charges)

1 2 3 4 5 6 7

R KR neutral AA

ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL420

-2-4

q/n(e- charges)

1 2 3 4 5 6 7

R KR neutral AA

Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica

MacKinnon_Nature01473.pdfMacKinnon_Nature01580.pdfMacKinnon_Nature01581.pdf

Struttura del Canale K+ Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix

La visione del tetramero del canale K+ è dal lato intracellulare. Ciascuna subunità è colorata separatamente e contiene 6 -eliche (etichettate S1-S6 alle loro estremità N-terminali nella subunità blu). Le eliche S5-S6 formano il poro e il filtro di selettività per il K+. Le eliche S1-S4 formano i sensori del voltaggio. Gli ioni K+ sono colorati in verde.

Struttura del Canale K+ Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix

Visione laterale. È indicato lo spessore della membrana (40 A)

Conformazioni del Sensore del VoltaggioVista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K+; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui 196-199 comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata l’ossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K+.

Chiuso: Vr=-100 mV

Conformazioni del Sensore del Voltaggio

Aperto: depolarizz.

Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K+; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui 196-199 comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata l’ossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K+.

Lo stato chiuso corrisponde al potenziale di riposo della cellula (~ -100 mV).

Lo stato aperto è favorito da una depolarizzazione della membrana.

In questo modello, S2 è assunto rimanere inalterato durante lo switch; S3a e S3b subiscono dei riarrangiamenti sostanziali; si ipotizza che anche la connessione tra S4-S5 sia rimodellata.

Ingrandimento del Sensore del Voltaggio

chiuso Una Subunità, Chiusa: Delle eliche S2-S4 è mostrata l’ossatura. Le arginine che conferiscono la sensibilità al voltaggio, sono mostrate come bastoncini colorati. Sono mostrati anche l’ossatura del filtro di selettività e gli ioni K+.

Ingrandimento del Sensore del Voltaggio

In aggiunta al movimento della “paletta sensore del voltaggio", notare nello stato aperto la formazione di un ponte salino (legame ionico) tra l’Asp 80 e l’Arg 133.

aperto

Accessibilità dei Residui

Interno

Nella conformazione chiusa, i residui evidenziati in magenta sono esposti allo spazio interno.

Accessibilità dei Residui

Nella conformazione aperta, i residui evidenziati in rosso sono vicini allo spazio esterno (10 Å) o si estendono verso di esso.

Esterno

La struttura del canale del K+ KvAP è descritta in:A. Jiang Y, Lee A, Chen J, Ruta V, Cadene M, Chait BT, & MacKinnon, R. (2003) "X-Ray Structure of a Voltage-Dependent K+ Channel". Nature 423: 33

I movimenti delle palette del voltaggio sono descritti in:B. Jiang Y, Ruta V, Chen J, Lee A, & MacKinnon, R. (2003) "The principle of gating charge movement in a voltage-dependent K+ Channel". Nature 423: 42

[1ORQ.pdb & 1ORS.pdb]

Per raggiungere un’alta selettività senza trattenere lo ione troppo a lungo, i canali ionici hanno siti di

legame multipli per lo ione permeante

La permeabilità agli ioni

Funzioni fisiologiche appropriate dei canali ionici dipendono dalla loro straordinaria selettività agli ioni

Evidenze per la presenza di siti di legame:

Una dipendenza della permeabilità allo ione dalla composizione e dalla concentrazione dello ione implica la presenza di siti di legame nel canale

Con

dutta

nza

Concentrazione del Na+ o K+

K+

Na+

]/[1max

iKFFg

aii

Evidenze per l’esistenza di più di un sito di legame:

La presenza di più ioni permeanti nel poro del canale è visualizzabile da misure di cristallografia

La selettività ionica dei canali del Na+ e del Ca2+

I canali del Na+ e Ca2+ hanno pori più ampi di quelli dei canali del K+ e tuttavia favoriscono il passaggio di ioni più piccoli del K+

Come sono disegnati questi canali per essere selettivamente permeabili a Na+ e Ca2+ ?

In soluzione acquosa tutti gli ioni sono circondati da un alone di molecole d’acqua

Raggio anidro e idrato e spessore dell’alone idrico di solvatazione (idratazione) di alcuni ioni di interesse fisiologico

Il poro dei canali del Na+ e Ca2+ è effettivamente più ampio di quello dei canali del K+, ma non sufficientemente grande da permettere la permeazione di ioni completamente idratati.

Il processo di deidratazione e l’energia coinvolta costituiscono un fattore importante nel determinare la selettività.

Probabilmente il poro di un canale approssima la conchiglia di idratazione del suo ione permeante, facilitando la perdita di molecole d’acqua durante il movimento dello ione lungo il canale.

La selettività di un canale K+ nei confronti del K+ rispetto al Na+

Gli ioni K+, idrati in soluzione, perdono le molecole di H2O quando passano attraverso il filtro di selettività e formano dei legami di coordinazione con quattro O di gruppi carbonilici C=O.

Gli ioni Na+, essendo più piccoli, non possono coordinarsi perfettamente con questi O e quindi attraversano il canale solo raramente.

K+ in H2O Na+ in H2O

K+ nel poro Na+ nel poro

Quindi:

Il canale K+ è selettivo per il K+ rispetto all’Na+ perchè gli ioni K+ formano legami più forti col filtro di selettività, compensando la perdita di energia dovuta alla deidratazione.

Però, come si concilia il legame forte con il fatto che gli ioni K+ diffondono attraverso il canale quasi altrettanto rapidamente che nel solvente?

1. Nel filtro di selettività della proteina cristallizzata si possono vedere due ioni K+.

2. I due ioni K+ sono estremamente vicini tra di loro.

La repulsione tra questi due ioni carichi positivamente deve essere piuttosto forte, e tende a spingerne uno o entrambi fuori dal filtro.

canale del potassio

canale del sodio

canale-recettore per l’Ach

canale del potassio

canale del sodio

Dimensioni del Poro