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Farmaforesi elettrodica: innovazione nei sistemi di veicolazione transdermica di farmaci

A cura del Dott. Antonino d’Africa

INDICE L’UTILIZZO DELLA CORRENTE ELETTRICA IN MEDICINA pag.1

CONSIDERAZIONI GENERALI pag.1

BIOFISICA DELL’ENERGIA ELETTRICA pag.2

BASI FISICHE DEI POTENZIALI DI MEMBRANA pag.8

CIRCUITO ELETTRICO EQUIVALENTE DI MEMBRANA pag13

CIRCUITO ELETTRICO EQUIVALENTE DI UNA MEMBRANA REALE pag15

PASSAGGIO DI IONI pag16

LASCIAPASSARE ALL’INGRESSO DELLE MOLECOLE ATTRAVERSO I RECETTORI E CANALI IONICI DI MEMBRANA pag17

I RECETTORI: STRUTTURE DI MEDIAZIONE TRA I PRIMI ED I SECONDI MESSAGGERI pag17

LA NATURA DEI RECETTORI. pag17

RECETTORI CITOPLASMATICI. pag18

RECETTORI DELLA MEMBRANA PLASMATICA. pag19

LE VARIAZIONI QUANTITATIVE DEI RECETTORI pag22

SEGNALI INTRACELLULARI: SECONDI MESSAGGERI pag23

ECCITABILITÀ DELLA MEMBRANA. pag26

COME VENGONO GENERATI I POTENZIALI D’AZIONE pag29

MODELLI IN FISIOLOGIA Flusso di massa e di calore pag30

LE PROTEINE DEI CANALI IONICI ED IL LORO GATING. pag33

IL PASSAGGIO DI FARMACO ATTRAVERSO LO STRATO CORNEO:

VIA TRANS-EPIDERMICA – TRANSDERMICA pag34

VANTAGGI DEL PASSAGGIO TRANSDERMICO DEI FARMACI:

FARMAFORESI ELETTRODICA PER “BIO-ELECTRODIC REPTATION”

RICERCA MEDICA-TECNOLOGICA 2°parte pag43

SEGNALE SELEZIONATO PER DURATA, TASSO DI RIPETIZIONE, FORMA E CONTENUTO ARMONICO pag44

SISTEMA DI ABBATTIMENTO DELLE BARRIERE NATURALI A BASSO POTERE ENERGETICO pag45

SISTEMA DI VALUTAZIONE DELLO STATO DELLA CUTE pag45

SISTEMA DI SICUREZZA CON MONITORAGGIO pag46

RECETTORI LEGATI AD ENZIMI. pag46

LA RIMOZIONE DEI SECONDI MESSAGGER pag47

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RECETTORE ESPRESSO SULLE CELLULE BERSAGLIO DELLA SOSTANZA ATTIVA pag49

L'ASPETTO PIÙ IMPORTANTE E VANTAGGIOSO DEL SISTEMA TERAPEUTICO pag52

BIBLIOGRAFIA pag53

L’UTILIZZO DELLA CORRENTE ELETTRICA IN MEDICINA

Ben conosciute fin dall’inizio del ‘900 sono le influenze fisiche, chimiche e

biologiche che la corrente elettrica può esercitare sui tessuti viventi. Questi

fenomeni sono basati su meccanismi notevolmente complessi dato il loro

legame con modificazioni del metabolismo cellulare e modificazioni nella

ripartizione delle cariche elettriche sulla superficie delle membrane cellulari.

Il sistema di segnali di origine elettrochimica, detti potenziali d'azione, con

cui gli organismi superiori scambiano informazione con i propri organi di

comunicazione verso l'esterno, sono veri e propri segnali elettrici e chimici

che si propagano. Nell'ultimo decennio il loro studio è andato crescendo,

assumendo negli ultimi anni un ritmo vertiginoso.

Le applicazioni cliniche realizzate in campo ortopedico e quelle che si

profilano in altri campi sono sufficienti a giustificare la dinamica espansione

del settore e le grandi speranze in esso riposte. Prima di entrare nel vivo del

problema, conviene esaminare gli aspetti elementari dei fondamenti fisici su

cui si basano le interazioni menzionate. Essi consentiranno di valutare nella

giusta luce i fatti sperimentali esposti nel seguito, chiarendo il ruolo

fondamentale che hanno le forze elettriche in molti processi cellulari.

La densità di flusso di una popolazione molecolare, cioè il flusso di molecole

per unità di superficie, è dovuto alla somma di due contributi. Il primo è il

prodotto della concentrazione delle molecole per la velocità (elettroforetica o

dielettroforetica) raggiunta sotto l'azione di trascinamento della forza

elettrica. Il secondo è la diffusione dovuta al gradiente spaziale di

concentrazione. Risulta così evidente che il movimento delle molecole in

soluzione può dipendere da variabili di tipo elettrico e di tipo chimico.

Se le molecole sono cariche, il prodotto della densità di flusso per la loro

carica fornisce la corrispondente densità di corrente. La densità di corrente

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risultante in soluzione, J, è la somma delle densità di corrente di tutte le

specie molecolari cariche. Un esempio elementare è fornito dalla interazione

tra campo elettrico e alcuni tipi di recettori della membrana cellulare. Tali

recettori sono costituiti da glicoproteine immerse nella membrana, che

protrudono nel mezzo esterno catene molecolari dotate di carica, ad esempio,

negativa. I recettori possono diffondere lateralmente. scorrendo sulla

membrana, in risposta alle forze esercitate su di essi. Se due o più

glicoproteine si avvicinano a sufficienza, formano un complesso proteico che

può costituire un canale preferenziale per lo scambio di particolari ioni tra

cellula e ambiente esterno. Le variazioni di tali flussi ionici possono costituire

il segnale che innesca profonde alterazioni nella cellula.

Ciò premesso, si consideri la cellula in sospensione in un mezzo, ove un

opportuno generatore esterno induce un campo elettrico costante nel tempo.

Dato che il mezzo presenta di solito una resistività elettrica relativamente

bassa, la corrente elettrica tende a scorrere, in buona parte, intorno alla

cellula. In altre parole, la frazione di corrente elettrica che interessa

direttamente la cellula è piccola, poiché la membrana cellulare offre una

resistenza abbastanza elevata rispetto al mezzo circostante.

I recettori di membrana, se la loro carica è negativa, tendono ad accumularsi

all'anodo, formando vasti aggregati, sotto l'azione di trascinamento del

campo elettrico. La probabilità di incontro tra due recettori e la conseguente

formazione di aggregati risultano così notevolmente aumentate per l'azione

elettroforetica del campo elettrico e potrebbero dar luogo all'innesco di quei

processi cellulari che dipendono dall'esistenza dei suddetti aggregati.

Nell'ultimo decennio il loro studio è andato crescendo, assumendo negli

ultimi anni un ritmo vertiginoso.

Le applicazioni cliniche realizzate soprattutto in campo ortopedico e quelle

che si profilano in altri campi (genetica,oncologia) sono sufficienti a

giustificare la dinamica espansione del settore e le grandi speranze in esso

riposte.

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CONSIDERAZIONI GENERALI

Prima di entrare nel vivo del problema, conviene esaminare gli aspetti

elementari dei fondamenti fisici su cui si basano le interazioni menzionate.

Essi chiariranno il ruolo fondamentale che hanno le forze elettriche in molti

processi cellulari.

I tessuti del corpo umano sono in condizione di condurre una corrente

elettrica in quanto i fluidi di cui sono per lo più composti contengono ioni che

quindi si comportano da elettroliti. Come in una soluzione salina, gli effetti

sui tessuti viventi sono molto simili, essendo il corpo umano un perfetto

conduttore o “un grande elettrolita”, cioè un corpo imbevuto in acqua salata.

Così, quando un corpo umano viene inserito in un circuito in cui passa

corrente elettrica, anioni e cationi che saturano i liquidi del corpo, si spostano

rispettivamente verso l’anodo o verso il catodo. Questo flusso ionico

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comporta alterazioni nella normale omeostasi fisico-chimica dei tessuti, con

notevoli ripercussioni sullo stato biologico e fisiologico dell’organismo.

L’acquisizione di nozioni sulle strutture cellulari e sui meccanismi preposti

ad un adeguato equilibrio elettrico, sono il presupposto per ogni ulteriore

approfondimento sull’uso dell’energia elettrica a scopo terapeutico.

BIOFISICA DELL’ENERGIA ELETTRICA

Il tessuto umano può essere quindi considerato un dielettrico in cui

l’incremento della frequenza elettrica comporta un decremento

dell’impedenza,

ed essere rappresentato come un condensatore con capacità C con una

conduttanza G in parallelo

C= ε0 εr A/x capacità

G= σA/x conduttanza

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ε=permittività

σ=conduttività

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In questo dielettrico, se la frequenza è ω, la caduta di impedenza è espressa da : σ=conduttività

permittività ε” =--------------------

ωε0

Quando la frequenza è bassa, il tessuto subisce una dispersione elettrica da polarizzazione dei contro-ioni in prossimità della superficie carica e da polarizzazione delle membrane come evidenziato dai valori di conduttività.

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La correlazione tra σ=conduttività, ε=permittività e ω=frequenza, viene rappresentata da diversi modelli che portano ai medesimi risultati, tra cui si La barriera principale al passaggio transdermico è rappresentata dallo strato

corneo (S.C.) della pelle che misura 10-15 micrometri di spessore e consiste in

diversi strati di cellule non attraversabili.

I costituenti strutturali della membrana danno origine alle proprietà elettriche

che generano POTENZIALI ELETTRICI.

Le cellule nervose e muscolari, sono particolarmente "eccitabili", cioè capaci

di trasmettere impulsi elettrochimici lungo la loro membrana. Anche nelle

cellule ghiandolari, nei macrofagi e nelle cellule ciliate, le variazioni del

potenziale di membrana giocano un ruolo significativo nel controllo di molte

funzioni cellulari.

Innanzitutto si deve considerare che i liquidi che si trovano all'interno ed

all'esterno delle cellule sono soluzioni di elettroliti contenenti circa 155 mEq

litro di anioni ed una uguale quantità di cationi.

In genere, lungo la superficie interna della membrana cellulare, si accumula

un lievissimo eccesso di ioni negativi (anioni) mentre ioni positivi (cationi) si

accumulano all'esterno della membrana. Conseguentemente si instaura

attraverso la membrana un potenziale denominato “potenziale di

membrana”.

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BASI FISICHE DEI POTENZIALI DI MEMBRANA

I due meccanismi fondamentali mediante i quali i potenziali di membrana

possono essere generati sono: trasporto attivo di ioni, attraverso la

membrana, che provoca uno sbilanciamento tra cariche negative e positive

presenti ai due lati della membrana e la diffusione di ioni attraverso la

membrana stessa, per differenza di concentrazione tra le due facce della

membrana che contribuisce allo squilibrio delle cariche.

Questa differenza di potenziale elettrico possiede una densità di carica

negativa dal lato citosolico ed ha valori variabili che raggiungono i 100 mV

che possono essere misurati inserendo un elettrodo all’interno e uno

all’esterno della cellula.

La corrente fluisce nel circuito costituito da:fili, soluzione salina del bagno, elettrodi e membrana cellulare;la resistenza inserita

sull’elettrodo portatore di corrente ha un valore molto elevato, relativamente alla resistenza degli altri componenti del circuito

stimolatore, così da mantenere costante la corrente stimolante.L’amplificatore del circuito di registrazione ha una resistenza d’ingresso

molto alta, in modo da evitare che anche una minima corrente possa sfuggire dalla cellula attraverso l’elettrodo registratore.

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Potenziale di riposo delle cellule

Alla base del potenziale di riposo, è possibile individuare altri tre tipi di

potenziali :

• Potenziale di equilibrio

• Potenziale di diffusione

• Equilibrio di Gibbs-Donnan

Il potenziale di equilibrio

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E’ dovuto, come già visto, ad un potenziale elettrochimico creato da gradienti

di concentrazione di una sostanza carica elettricamente, attraverso una

membrana: un gradiente chimico spinge in una direzione e l’altro gradiente

nell’altra; quando le due forze si equivalgono, si instaura un POTENZIALE

DI EQUILIBRIO (PER QUELLO IONE).

I potenziali di equilibrio non tendono ad estinguersi ma si mantengono nel

tempo.

E’ sufficiente considerare una vaschetta divisa in due compartimenti, da una

membrana permeabile solo al K+, contenenti una soluzione salina di KCl

differentemente concentrata tra i due lati.

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Questo flusso esisterà fino a quando i valori dell’intensità delle forze chimica

ed elettrica non saranno equivalenti.

Il potenziale di equilibrio può essere calcolato grazie all’equazione di Nerst

RT [i]2

E= ln

Zi F [i]1

Dove: R=costante dei gas ; T=temperatura;

F=costante di Faraday ; Z= valenza ione

(RT/ZF)ln= 61 log

Siccome Z=1, F,T e R sono delle costanti, l’equazione di Nerst può anche

essere scritta come:

Ei= 61 log ([i]2/[i]1)

L’equazione di Nerst esprime il potenziale di equilibrio di uno ione e

stabilisce “quale deve essere la differenza di potenziale ai lati di una

membrana, permeabile ad un solo ione concentrato in modo differente ai lati

di essa, affinchè quello ione, con quella differenza di concentrazione, sia

all’equilibrio”.

Potenziale di diffusione:

Ai lati di una membrana, permeabile a tutte le specie ioniche ma in maniera

diversa, esiste un potenziale di diffusione. Il flusso generato dalla forza

chimica non è uguale a quello generato dalla forza elettrica per cui esistono

dei flussi netti.

Questi potenziali sono anche detti “equilibranti” in quanto tendono ad

annullare tutti i gradienti che li hanno generati, quindi non si mantengono

nel tempo poiché tendono ad estinguersi!

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La membrana, per l’“equilibrio di Gibbs-Donnan” è permeabile a più specie

ioniche ma impermeabile almeno ad una delle specie ioniche presenti. Ciò ha

importanti conseguenze a livello fisiologico: gli anioni proteici spostano gli

anioni diffusibili fuori dalla membrana e trattengono ioni di segno opposto

come, ad esempio, K+ o anche H+.

Questa differente concentrazione degli ioni crea una pressione osmotica

maggiore nell’ambiente intracellulare.

Lo spostamento degli ioni diffusibili provoca, appunto, quel po-tenziale

elettrico di equilibrio espresso dall’equazione di Nerst.

Equazione di Goldman

Esperimento su un assone:

il potenziale di equilibrio dello ione, registrato mediante elettrodi, a

concentrazioni esterne del K+ maggiori di 10 mM, era uguale a quello

calcolato con l’equazione di Nerst, mentre a concentrazioni esterne di K+

minori di 10 mM, ciò non si verificava. Quindi, il rapporto di proporzionalità

diretta veniva a mancare proprio dove la [K+] era vicina a quella fisiologica (4

mM).

Ciò confutava che si potesse trattare di un potenziale di equilibrio. Per cui,

supponendo che la membrana sia diversamente permeabile alle diverse

specie ioniche, si è formulata una relazione, evoluzione dell’ equazione di

Nerst.

L’ equazione di Goldman, tiene conto anche del “fattore di permeabilità”:

PK+[K+]0+PNa+[Na+]0+PCl-[Cl-]i

Em=61 log

PK+[K+]i+Pna+[Na+]i+PCl-[Cl-]0

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in cui il Cloro è invertito perché ha carica negativa.

Posto che il Cl- si distribuisce in base al potenziale determinato dagli

spostamenti degli ioni Na+ e K+, ai quali la membrana è più permeabile, il suo

apporto è da considerare trascurabile.

Ponendo PK+>100 PNa+ si può dividere ciascun termine dell’equazione per PK+

ottenendo così:

[K+]0 + ß [Na+]0 Pna+

Em= 61log dove ß= =0,01

[K+]i + ß [Na+]i PK+

Ad elevate concentrazioni di K+ diminuisce il valore di β per cui è un fattore

irrilevante.

Il potenziale di riposo è, quindi, un potenziale di diffusione spiegabile con

l’equazione di Goldman e mantenuto stabile mediante un meccanismo

attivo, detto “POMPA SODIO-POTASSIO”.

Non si tratta, pertanto, di un potenziale di equilibrio ma di uno “stato

stazionario”, come tutte le condizioni fisiologiche.

CIRCUITO ELETTRICO EQUIVALENTE DI MEMBRANA

Serve a comprendere cosa succede quando stimoliamo una membrana con un

generatore di forza elettromotrice.

Il circuito è costituito da:

-un condensatore (separare cariche);

-generatore di forza elettromotrice (caricare la membrana);

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-resistenza o conduttanza (=1/R) perché esiste un flusso di elettroni. (La

conduttanza è l’analogo elettrico della permeabilità, cioè la facilità con cui gli

ioni possono attraversare un canale ed è in relazione inversa alla resistenza di

membrana: la conduttanza è il reciproco della resistenza g=1/R)

→Più è elevata R, più piccola è la conduttanza.

Poniamo, per esempio che questo circuito sia costituito da un condensatore

(membrana) permeabile solo al potassio.

Quando il circuito viene chiuso, il condensatore (la membrana) comincia a

caricarsi perché Em= Eb: le cariche positive e negative si dispongono ai lati del

condensatore ma non lo attraversano mai in quanto le piastre che lo

costituiscono sono separate da un “dielettrico”.

Il flusso di elettroni continuerà ad esserci fino a quando non si avrà che Em =

Eb.

Quindi, tenendo presente la legge di Ohm (per la quale, il flusso di uno ione

attraverso un canale è direttamente proporzionale alla conduttanza del canale

e all’ampiezza del potenziale elettrico:I=gxE. Più grandi sono il potenziale

elettrico e la conduttanza,maggiore è il flusso di ioni attraverso la membrana,

analogamente al flusso d’acqua in un tubo: più elevata è la pressione e più il

tubo è grosso, maggiore è la quantità di acqua che passa).

( “L’intensità di corrente è direttamente proporzionale alla differenza di

potenziale esistente tra i capi di un conduttore”), si deduce che la corrente nel

circuito, carica il condensatore in quanto esiste una differenza di potenziale

lungo il circuito.

La batteria presente nel circuito non è altro che la differenza di potenziale

chimico esistente ai lati di una membrana.

Per rappresentare, però, un circuito elettrico che si riferisca ad una membrana

reale, bisogna aggiungere:

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-la resistenza al sodio in quanto in una membrana reale non è presente solo

una specie ionica;

-le diverse concentrazioni delle diverse specie ioniche;

-le relative forze spingenti;

-i relativi potenziali chimici;

Un concetto è fondamentale:

“Quando ci sono più ioni a cui la membrana è permeabile, essa tende a

caricarsi ad un valore più prossimo al potenziale di equilibrio dello ione a cui

è più permeabile”.

In un circuito elettrico ciò significa che il valore del potenziale del

condensatore sarà più prossimo al valore del potenziale di equilibrio dello

ione che presenta minore resistenza.

Quindi, il condensatore si caricherà come lo carica la batteria presente nel

circuito, con potenziale EK+.

CIRCUITO ELETTRICO EQUIVALENTE DI UNA MEMBRANA REALE

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Na+/K+

In virtù dell’esistenza di questi potenziali elettrici ai due lati della membrana

e, in alcune cellule, la capacità di modificare questi potenziali, alcune cellule

nervose e muscolari, generando impulsi elettrici, inviano messaggi biologici.

Difatti, se da un lato della membrana la concentrazione degli ioni aumenta,

anche il loro flusso passivo attraverso il canale specifico aumenta fino a una

velocità massima su cui si livella (il flusso si satura). L’afflusso passivo di ioni

attraverso i canali ionici viene continuamente contrastato dall’espulsione

attiva e specifica di ioni attraverso le pompe ioniche che funzionano grazie

all’energia cellulare.

Il numero delle cariche elettriche positive in entrata, infatti va bilanciato con

l’espulsione di un eguale numero di cariche elettriche. L’ineguale

distribuzione degli ioni sui due lati della membrana, equivale a una

differenza di concentrazione ionica fra dentro e fuori la cellula, manifesta la

forza elettrica che tende a far entrare ioni K+ nella cellula, e il suo valore di

equilibrio può essere calcolato, dall’intensità del gradiente di concentrazione

degli ioni K+.

La conduttanza della membrana per ciascuna specie ionica dipende dal

numero di canali specifici presenti sulla membrana.

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ricordano quelli di Debye e Cole-Cole.

PASSAGGIO DI IONI

Nel modello di membrana sopra riprodotto, un gruppo di sostanze in

soluzione (ioni, zuccheri, aminoacidi) si trovano in concentrazioni diverse

all’esterno e all’interno della cellula :

A. L’esterno a sinistra, ha una concentrazione maggiore.

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B. Legandosi a specifici siti dei canali ionici alcune molecole (chiodini)

attivano la pompa di scambio del sodio e del potassio : gli ioni Na sono

attivamente pompati fuori dalla cellula mentre contemporaneamente gli ioni

potassio K

sono pompati all’interno.

LASCIAPASSARE ALL’INGRESSO DELLE MOLECOLE ATTRAVERSO I

RECETTORI E CANALI IONICI DI MEMBRANA

I RECETTORI: STRUTTURE DI MEDIAZIONE TRA I PRIMI ED I SECONDI

MESSAGGERI

Quando un segnale chimico perviene a una cellula bersaglio, modifica diversi

processi: reazioni catalizzate da enzimi, trasporto di ìoni, trascrizione di geni.

Questa interazione con i recettori specifici localizzati sulla superficie della

cellula bersaglio o dentro il suo citoplasma, è l’espressione di come la cellula

bersaglio risponde o meno al segnale chimico.

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LA NATURA DEI RECETTORI.

Il recettore è una proteina alla quale la molecola può legarsi con elevata

specificità data dalla conformazione peculiare della molecola segnaletica.

E’ciò che facilita il legame con il suo recettore. Le altre molecole, anche solo

leggermente diverse, possono non essere in grado di occupare i siti di legame

del recettore.

Segnale chimico A---- Segnale chimico B----Segnale chimico C

Le molecole dei recettori hanno configurazioni specifiche destinate a selezionare i diversi segnali chimici. Sebbene i segnali chimici A,B e C abbiano

configurazioni molto affini tra di loro, B calza esattamente la conformazione del recettore, per cui solo B si lega al recettore e influenza la cellula

bersaglio.

La molecola si lega al suo recettore anche con elevata affinità, cioè con un

legame forte.

Quindi solo la molecola segnaletica si può legare e restare adesa al recettore.

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Ciò riguarda sopratutto i recettori ormonali, perché gli ormoni che

pervengono alle cellule bersaglio attraverso il flusso sanguigno sono per lo

più presenti in concentrazioni ridotte (10 nmol/L o meno).

L’instaurarsi di un legame tra un ormone ed il suo recettore su una cellula

bersaglio provoca una sequenza di eventi, che induce un insieme di

mutamenti che sono la risposta cellulare all’ormone .

RECETTORI CITOPLASMATICI.

I recettori per tutti gli ormoni steroidei, per la vitamina D (uno sterolo) e per

gli ormoni tiroidei sono proteine localizzate all’interno delle cellule bersaglio.

recettore per molecole idrosolubili (ad es.polipeptidi) posto sulla

membrana plasmatica

recettore citoplasmatico per molecole liposolubili (ad es. steroidi) di una cellula bersaglio

Gli ormoni devono diffondere attraverso la membrana cellulare per accedere

ai loro recettori, facilitati dalla propria liposolubilità.

Al legame tra steroidi o vitamina D e i loro recettori presenti nel citosol fa

seguito lo spostamento del complesso recettore-ormone (HR) nel nucleo,

dove si lega ai siti accettori specifici del DNA regolando in tal modo la

trascrizione di geni specifici. Anche gli ormoni tiroidei esercitano i loro effetti

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tramite un meccanismo simile, ma i recettori di questi ormoni sono

concentrati nel nucleo anche in assenza degli ormoni stessi.

RECETTORI DELLA MEMBRANA PLASMATICA.

Gli ormoni polipeptidici e le catecolamine, quando si legano ai recettori della

membrana plasmatica delle cellule bersaglio provocano una serie di eventi

all’interno della cellula senza penetrarvi.

Quando gli ormoni si legano ai loro recettori, gli effetti sono mediati da

secondi messaggeri generati dentro la cellula.

I recettori disposti sulla membrana plasmatica sono costituiti da proteine (l%

della massa totale delle proteine presenti).

Il recettore opera in modo simile a un trasduttore, cioè converte un evento

extra cellulare — il legame con la molecola segnaletica — in una risposta

intracellulare che modifica il comportamento della cellula bersaglio.

La famiglia più numerosa di recettori della membrana è quella dei recettori

legati a proteine G, cioè proteine legate ad un nucleotide guaninico, il GTP o

il GDP. Le proteine G sono situati sulla superficie interna della membrana

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plasmatica e stabiliscono un collegamento tra il recettore e la sua proteina

effettrice.

Lo stabilirsi di un legame tra un primo messaggero ed il suo recettore

modifica la forma del recettore stesso, cosicché esso può interagire con una

proteina G specifica. Questa interazione porta alla perdita del GDP dalla

subunità a e all’attacco di un GTP. Il legame con il GTP attiva la subunità a in

modo da farla staccare dal complesso beta-y per farla muovere lungo la

superficie interna della membrana plasmatica finchè non raggiunge la

proteina effettrice.

Quando un primo messaggero si lega ad un recettore accoppiato ad una proteina G, il recettore modifica la sua conformazione e attiva

diverse sub unità alfa della proteina G e attiva una singola proteina effettrice che, a sua volta, genera molte molecole intracellulari di

secondi messaggeri, ciascuno dei quali attiva molti enzimi, i quali possono regolare molte proteine bersaglio.

L’effettore è un enzima o un canale ionico.

L’interazione con la subunità a attiva o inibisce un enzima specifico oppure

apre o chiude uno specifico canale ionico. Il risultato dipende dal primo

messaggero.

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Sono un migliaio circa i recettori accoppiati alle proteine G: comprendono i

recettori per ormoni peptidici, neurotrasmettitori e neuropeptidi.

Questo grande numero di recettori diversi enfatizza la circostanza che il

recettore sulla cellula bersaglio ed i meccanismi con questo associati

determinano la risposta specifica della cellula all’ormone.

Ligandi: agonisti ed antagonisti.

Qualsiasi molecola segnaletica, che si lega con elevata specificità a un

recettore, viene denominato ligando. Ogni ligando in grado di legarsi ad un

recettore sulla membrana plasmatica e di indurre una risposta fisiologica

viene definito agonista.

I ligandi che si legano con un’elevata affinità ad un recettore ma non evocano

alcuna risposta vengono denominati antagonisti perché, occupando i

recettori, interferiscono con l’azione di un agonista o vi “si oppongono”.

Gli antagonisti dei recettori ormonali possono avere una grande importanza

terapeutica in medicina. Le catecolammine circolanti aumentano molto la

frequenza dei battiti e il volume di sangue con ciascuna contrazione cardiaca,

attività che può elevare la pressione arteriosa. Un antagonista delle

catecolammine: propranololo, viene impiegato per bloccare questi effetti

indesiderati delle catecolammine.Così lo spironolattone, antagonista del

recettore dell’aldosterone che è un ormone steroideo che accresce la

ritenzione renale del Na+ e anche una ritenzione di acqua. Il trattamento con

spironolattone blocca l’azione dell’aldosterone e produce un aumento

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dell’escrezione d’acqua, molto importante nei casi di grave ritenzione idrica

e di edemi.

LE VARIAZIONI QUANTITATIVE DEI RECETTORI

Gli studi quantitativi sul numero dei recettori, effettuati mediante ligandi

radiomarcati hanno rivelato che la concentrazione endocellulare di molti

recettori può essere regolata. Per esempio, l’incremento della concentrazione

di un agonista in circolo, può portare ad una diminuzione del numero dei

recettori presenti nelle cellule bersaglio.

Questo fenomeno è definito col termine regolazione verso il basso (o down-

regulation) del numero dei recettori e si accompagna con una attenuazione

della risposta fisiologica (desensibilizzazione delle cellule all’agonista

circolante). Quando la concentrazione dell’agonista si riduce, il numero dei

recettori aumenta di nuovo. Questo fenomeno rende molte cellule

particolarmente sensibili ad un cambiamento della normale concentrazione di

un segnale chimico, in contrapposizione alla sua concentrazione assoluta.

Sovente il numero dei recettori sulla membrana plasmatica diminuisce perché

il legame con molecole agoniste provoca l’internalizzazione nella cellula di

complessi recettori-agonisti per opera di processi endocitosici, seguita dal

loro trasferimento ai lisosomi e dalla loro degradazione.

Il meccanismo down-regulation non è molto chiaro per i recettori

citoplasmatici: potrebbero essere coinvolti numerosi eventi: inattivazione dei

recettori, modificazioni della velocità di sintesi o della velocità di

degradazione delle proteine recettoriali.

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SEGNALI INTRACELLULARI: SECONDI MESSAGGERI

Ruolo dei secondi messaggeri nel determinare la risposta cellulare ad un

segnale extracellulare (interazione tra ligando e recettore)

La conformazione (forma tridimensionale) di una molecola recettoriale viene

modificata quando una molecola segnaletica extracellulare (primo

messaggero) si lega ad essa.

Tale cambiamento della conformazione del recettore genera un secondo

messaggero, ma serve ad aumentare o amplificare il segnale.

L’amplificazione ha luogo perché molte proteine G (fino a 100) vengono

attivate per ciascuna molecola segnaletica extracellulare che si lega ad un

recettore. Sebbene ciascuna proteina G attivata mette in azione una sola

proteina effettrice, ogni effettore genera molte molecole di secondi

messaggeri.

Un’amplificazione aggiuntiva avviene in ciascuna delle fasi lungo tutto il

percorso segnaletico.

Per esempio:

• ogni molecola del secondo messaggero può attivare molte molecole

enzimatiche, ogni enzima attivato può regolare molte proteine bersaglio,

• i vari bersagli collaborano per mediare la risposta cellulare specifica.

Questa cascata di eventi intracellulari amplifica molto il segnale extracellulare

originario.

L’AMP CICLICO (cAMP).

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Una proteina effettrice della membrana è l’enzima adenilato ciclasi.

• Questo enzima catalizza una reazione che sfrutta l’ATP per generare

molte molecole di un secondo messaggero conosciuto come AMPciclico

(cAMP).

• L’adenilato ciclasi viene stimolata dalla subunità a della proteina G che

viene attivata dalla molecola che si è legata al recettore.

• L’AMP ciclico modifica il comportamento della cellula tramite

l’attivazione dell’enzima protein chinasi A (o chinasi A o PKA).

• Questa chinasi attivata catalizza la fosforilazione (l’aggiunta di gruppi

fosforici) di specifiche molecole proteiche che di solito, modificano l’attività

biologica. Se tale proteina è un enzima, potrebbe risultare attivata o inattivata

la propria capacità enzimatica.

INOSITOL TRIFOSFATO, DIACILGLICEROLO E IONI CALCIO.

Un’altra proteina effettrice nella membrana plasmatica è la fosfolipasi C,

forma fosforilata di un fosfolipide di membrana: fosfatidilinositolo bisfosfato

(PIP2).

Quando è attivata dalla subunità a della proteina G, la fosfolipasi C catalizza

la demolizione del PIP2 a inositol trifosfato e diacilglicerolo, due secondi

messaggeri intracellulari.

L’inositol trifosfato (IP3) libera ioni Ca2 dai depositi intracellulari, come

quelli del reticolo endoplasmatico (ER).

28

Tale effetto è transitorio, ma attiva un aumento più sostenuto del livello di

tali ioni per afflusso di ioni Ca2± extracellulari attraverso i canali per il Ca2+

della membrana plasmatica.

Quando i canali sono aperti si stabilisce un gradiente elettrochimico molto

favorevole ad un afflusso passivo di ioni Ca2+ extracellulari con incremento

della concentrazione citosolica di ioni Ca2+ liberi.

L’aumentato livello degli ioni Ca2 disponibili consente a tale catione di

legarsi con un’elevata affinità a proteine calcioleganti e di produrre dei

cambiamenti della conformazione di queste proteine e, pertanto, delle

modificazioni delle loro funzioni.

Alcune proteine calcioleganti non possiedono alcuna attività enzimatica ma,

appena si legano agli ioni Ca2+, modificano altre proteine.

Esempi di proteine Ca2- leganti sono: troponina C, rinvenibile nelle cellule

muscolari scheletriche e cardiache, e calmodulina (CaM), che si ritrova in

quasi tutte le cellule.

Lo stabilirsi di un legame tra un complesso Ca2+caImodulina ed una protein

chinasi calmodulino-dipendente (CaM Chinasi) attiverà la chinasi e porterà

alla fosforilazione di altre proteine con meccanismo simile a quello

determinato dall’attivazione della protein chinasi A (PKA).

Il sistema Ca2- calmodulina è più versatile del sistema del cAMP perché, oltre

a produrre delle modificazioni fisiologiche per il tramite della fosforilazione

di proteine, il complesso Ca2+calmodulina può attivare direttamente enzimi

29

come l’adenilato ciclasi e la fosfodiesterasi delI’AMP ciclico, cioè gli enzimi

che producono e demoliscono l’AMP ciclico.

Chiaramente, questo permette delle interazioni tra le vie segnaletiche

intracellulari mediate dal cAMP e dal Ca2.

Il diacilglicerolo (DAG), insieme con il Ca2, attiva le protein chinasi C (o

chinasi C o PKC). La protein chinasi C citosolica non viene influenzata dal

Ca2+,ma in presenza di diacilglicerolo, si lega alla membrana, dove viene

attivata dai fosfolipidi.

Attivata, la PKC è estremamente sensibile alla stimolazione da parte degli

ioni Ca2±che aumenta la sua concentrazione citosolica.

La PKC attivata fosforila proteine specifiche tra cui le proteine coinvolte nel

controllo della divisione cellulare.

ECCITABILITÀ DELLA MEMBRANA.

In certi tipi di cellule, i recettori accoppiati alle proteine G regolano una

proteina effettrice che è un CANALE IONICO DELLA MEMBRANA

PLASMATICA

Canale ionico chiuso Canale ionico aperto

30

c)Canali ligando

Tipi di canale ionico (a) I canali passivi sono specifici per singoli ioni (b) I canali voltaggio-dipendenti si aprono o si chiudono quando

avvertono una variazione specifica del potenziale di membrana (c).I canali attivati chimicamente sono regolati da un trasmettitore

chimico.

Ciò modifica la permeabilità ionica e quindi l’eccitabilità elettrica della

membrana.

Un esempio è l’acetilcolina che riduce sia la velocità che la forza contrattile

del muscolo cardiaco. Da ciò l’azione inibitoria dell’acetilcolina sul cuore.

Alcuni recettori di membrana plasmatica sono anche dei canali ionici, e la

modificazione della loro conformazione che si verifica nel recettore quando

ad esso si lega il ligando determina l’apertura del canale ionico. Molti

neurotrasmettitori operano in tal modo.

Il recettore per l’acetilcolina situato in corrispondenza delle giunzioni

neuromuscolari (sinapsi o placche motrici) è un esempio.

L’acetilcolina, rilasciata dalla cellula nervosa, attraversa l’intervallo sinaptico

per legarsi al proprio recettore sulla cellula muscolare scheletrica.

Tale recettore forma un canale ionico che si apre in modo transitorio quando

ad esso si lega l’acetilcolina.

Il Na+ penetra nella cellula muscolare attraverso questo canale, rendendo

meno negativo il potenziale della membrana e quest’ultima più eccitabile in

un’area localizzata. Questo attiva un potenziale d’azione, che si diffonde

rapidamente a tutta la membrana della cellula muscolare scheletrica e segnala

al muscolo di contrarsi.

31

Differenti risposte all’acetilcolina:

Il recettore del miocardio è connesso con una proteina G, mentre quello del

muscolo scheletrico è un canale ionico regolato dal ligando.

Recettori differenti mediano risposte diverse allo stesso ligando

extracellulare.

IL GMP CICLICO (cGMP). Un altro secondo messaggero di grande

importanza per le cellule animali è il GMP ciclico (cGMP) formato dal GTP

grazie alla guanilato ciclasi.

Pare che il suo ruolo nella dilatazione dei vasi sanguigni, coinvolga

l’attivazione di specifiche protein chinasi cGMP-dipendenti. Il ruolo meglio

caratterizzato del GMP ciclico si svolge nell’occhio dei vertebrati, dove esso è

il secondo messaggero responsabile della conversione dei segnali visivi

ricevuti come input luminosi in impulsi nervosi.

32

COME VENGONO GENERATI I POTENZIALI D’AZIONE

33

Una differenza di potenziale si forma per squilibrio di cariche elettriche fra citosol e il liquido extracellulare, dovuto a movimenti ionici

secondo gradienti di concentrazione. (a) Gli ioni K+ escono dalla cellula seguendo il proprio gradiente di concentrazione, mentre gli

anioni sono trattenuti all’interno perché la membrana cellulare non li fa passare. Iniziano ad accumularsi cariche negative sulla

superficie interna della membrana. Gli ioni K+ usciti vengono attratti dalle cariche negative all’interno della cellula e iniziano ad

accumularsi sulla superficie esterna, ma in parte rientrano nella cellula perché sono attratti dalla carica negativa del citosol, mentre altri

ioni K+ continuano ad uscire per gradiente di concentrazione. (b) Raggiunto l’equilibrio elettrochimico, la forza chimica (gradiente di

concentrazione) che favorisce la fuoriuscita del K+ è uguale alla forza elettrica (potenziale di membrana) che favorisce l’ingresso. Dato

che (in questo esempio) l’unico ione che attraversa la membrana è il K+ , il potenziale di membrana all’equilibrio elettrochimico è uguale

al potenziale d’equilibrio per il K+.

34

MODELLI IN FISIOLOGIA

Flusso di massa e di calore

Le variazioni durante il potenziale d’azione sono dovute a movimenti ionici,

cioè all’apertura e alla chiusura di canali voltaggio-dipendenti che

controllano l’ingresso del Na+ e l’uscita del K+.

Le alterazioni del potenziale di membrana provocano modificazioni della

conformazione dei canali proteici, nei quali si aprono le porte che controllano

il passaggio degli ioni attraverso i canali.

Il canale Na+ ha due porte: una di attivazione e una di inattivazione. Queste

porte, secondo il loro stato di apertura o chiusura, determinano tre

condizioni: (1)di riposo, (2) di attivazione e (3) di inattivazione.

Canale ionico voltaggio dipendente per il sodio

Canale ionico voltaggio dipendente per il potassio

35

Il canale K ha una sola porta, e consente quindi due stati: apertura e chiusura.

Quando la cellula nervosa è a riposo, i canali Na+ dell’assone sono nello stato

di riposo;

le porte di inattivazione sono aperte,

quelle di attivazione sono chiuse e impediscono il passaggio degli ioni Na+.

Le fasi del potenziale d’azione, corrispondenti ai diversi stati funzionali dei canali voltaggio-dipendenti per il Na+ e per il K+.

Applicando uno stimolo positivo all’assone,

36

i canali Na+ di attivazione si aprono e passano dallo stato di riposo a quello

di attivazione.

Gli ioni sodio, attraverso i canali aperti, depolarizzano gradualmente la

membrana verso il valore soglia, quindi si attivano molti canali Na+

voltaggio-dipendenti e l’ingresso di sodio diventa molto rapido. Ciò

depolarizza ulteriormente la membrana e apre sempre più canali di

attivazione di sodio e quindi maggiore depolarizzazione per aumento locale

della conduttanza al sodio (gNa).

Alla fine della depolarizzazione, tuttavia, non viene raggiunto ENa, perché le

porte di inattivazione chiudono i canali Na+, limitando l’uscita di questo

ione.

Anche il gradiente elettrico diventato opposto, limita l’afflusso di sodio,

mentre l’aumento della corrente in uscita di K+, impedisce ulteriori

spostamenti del potenziale di membrana verso ENa.

Le porte di inattivazione rimangono chiuse per un certo tempo, dopodiché

entrambe le porte tornano allo stato di riposo.

Nella fase di depolarizzazione rapida, la conduttanza al potassio (gK)

aumenta gradualmente, per l’apertura canali K+ lenti, voltaggio-dipendenti:

l’uscita del po tassio accelera quando lo spostamento verso l’interno di Na+

inverte il potenziale di membrana.

L’uscita del K+ è dovuta alla stessa ragione che provoca l’ingresso del Na+;

gradienti elettrico e chimico favorevoli, insieme con un aumento della

permeabilità di membrana.

37

L’uscita più rapida del K+ provoca una perdita netta di rispetto al valore di

riposo: questo fenomeno si chiama iperpolarizzazione postuma.

Finita questa fase, si ristabilisce il potenziale di riposo della membrana, le

conduttanze ioniche ritornano ai valori di riposo e la pompa Na+/K+

mantiene i normali rapporti di concentrazione di questi ioni fra l’interno e

l’esterno.

L’insieme dei meccanismi che riportano la membrana al potenziale di riposo

dopo la depolarizzazione costituisce il fenomeno della ripolarizzazione. La

prima causa della ripolarizzazione è l’aumento della conduttanza al potassio

(gK) verso l’esterno.

LE PROTEINE DEI CANALI IONICI ED IL LORO GATING.

I meccanismi a canale sono particolarmente importanti per il rapido

spostamento transmembrana di ioni come l'Na+ ed il K+. Molte differenti

strutture a canale e disposizioni delle subunità relative sono state

caratterizzate per quanto attiene alle proteine canale. I canali per il K+

consistono in quattro subunità identiche, ciascuna delle quali contiene sei

segmenti transmembrana. I canali per il Na+ consistono di una singola catena

polipeptidica che contiene quattro "domini" ripetuti che corrispondono alle

quattro subunità del canale per il K+. In generale un canale idrofilo od un

poro attraversante la membrana viene formato quando i segmenti o le

subunità della proteina che attraversano da parte a parte la membrana si

raggruppano, in modo generalmente simile a quello discusso

precedentemente per i canali per l'acqua formati dalle acquaporine. Il canale

permette, se aperto, una velocità di trasporto maggiore di quella consentita

da un vettore. Per esempio, alcuni canali consentono agli ioni di transitare

attraverso di essi ad una velocità di 108 ioni/sec, mentre i vettori più veloci

38

spostano i soluti attraverso le membrane a velocità non maggiori di 105

molecole/sec.

Lo ione va incontro ad interazioni specifiche con gruppi dotati di cariche,

posti lungo i lati del canale. Queste reazioni favoriscono il transito degli ioni

attraverso il canale. I tipi di gruppi con cariche elettriche presenti entro il

canale potrebbero essere importanti anche per la determinazione della

specificità di quel canale per un dato tipo di ione. Per esempio, i canali per il

K+ sono 100 volte più permeabili al K+ che non al Na+.

Ciò che differenzia i canali dai vettori, oltre alla velocità globale di trasporto,

è che un canale può essere tenuto chiuso da parte di un "cancello". Un canale

chiuso non permetterà alcuno spostamento di ioni, anche se il gradiente

elettrochimico potrebbe favorirlo. Tra i meccanismi adoperati per regolare

l'apertura e la chiusura ("gating") dei canali ionici si includono sia i

cambiamenti del potenziale di membrana (canali regolati dal voltaggio) che i

legami tra molecole specifiche e la proteina dei canali (canali regolati dal

ligando).

E’ grazie al Nobel Peter Agre della Johns Hopkins University che oggi

sappiamo del lasciapassare all’ingresso delle molecole attraverso questo filtro

particolarmente selettivo (canale ionico di membrana),costituito da proteine

che formano la membrana cellulare, che rappresenta l’ultimo baluardo

(fenomeno del gating cioè apertura e chiusura delle molecole) e che funge da

cancello dopo opportuna identificazione (tra lo spazio intra ed extra-

cellulare) per mantenere la cellula in equilibrio con l’ambiente. Per catturare

gli “ioni giusti”la cellula crea all’interno del canale una struttura uguale alla

molecola in cui si trova quel determinato ione nell’ambiente esterno. Lo ione

va incontro ad interazioni specifiche con gruppi dotati di cariche, posti lungo

i lati del canale, che ne favoriscono il transito. I tipi di gruppi con cariche

elettriche presenti entro il canale potrebbero essere importanti anche per la

determinazione della specificità di quel canale per un dato tipo di ione (per

esempio, i canali per il K+ sono 100 volte più permeabili al K+ che non al

39

Na+). Un canale può essere tenuto chiuso da parte di un "cancello". Ciò non

permetterà alcuno spostamento di ioni, anche se il gradiente elettrochimico

potrebbe favorirlo. Con la cristallografia ai raggi X, oggi è possibile studiare i

dettagli atomici di una molecola. E’ stata identificata come una sorta di tubo

molecolare altamente selettivo, un filtro le cui pareti presentano atomi di

ossigeno disposti in modo simile a quello degli ossigeni delle molecole di

acqua che normalmente coordinano il potassio. Il lasciapassare è dato solo

allo ione potassio poiché esso è l’unico che si trova alla stessa distanza dagli

ossigeni della proteina, dopo aver subito un processo di deidratazione

all’entrata del canale. In questa fase di identificazione, il sodio, essendo più

piccolo, non viene quindi riconosciuto.

IL PASSAGGIO DI FARMACO ATTRAVERSO LO STRATO CORNEO:

VIA TRANS-EPIDERMICA-TRANSDERMICA

Lo S.C. consiste di corneociti morti, ricchi di cheratina e permeati in una

matrice extracellulare; gli interspazi tra corneociti sono riempiti da diversi

strati lipidici il cui complesso di elementi è simile ad una struttura a mattoni.

Questa barriera è interrotta da dotti ghiandolari e follicoli piliferi.

40

Strutture della pelle coinvolte nell’assorbimento percutaneo.

Siti di assorbimento percutaneo:A,trans cellulare;B,diffusione attraverso le giunzioni intercellulari;C,attraverso i dotti sebacei;D,trans

follicolare;E,attraverso i dotti sudoriferi

41

Il passaggio di farmaco attraverso lo strato corneo può avvenire attraverso tre

vie: 1) intracellulare attraverso i corneociti, 2) intercellulare attraverso la

matrice extracellulare, 3) annessiale attraverso i follicoli piliferi e i dotti delle

ghiandole sudoripare e sebacee. La via annessiale è la via d’elezione per i

farmaci idrofili avendo i pori caratteristiche polari.

Solo in alcune condizioni specifiche, come l’applicazione della ionoforesi,

diventa predominante la via annessiale. Quindi la via transepidermica,

comprendente le vie intra e intercellulari, è quella che offre le maggiori

42

possibilità di penetrazione e il passaggio si svolge con un processo di

diffusione passiva. La via intracellulare prevede il passaggio attraverso la

matrice extracellulare ed è da preferire per i farmaci lipofili. L’importanza

della via di penetrazione intracellulare è confermata dall’esistenza di una

relazione tra lipofilia di un composto e il suo coefficiente di permeabilità

attraverso la pelle. Quindi, la fase limitante la permeazione di una sostanza è

rappresentata da una barriera di natura idrofobica, come la matrice lipidica

extracellulare. Una eccessiva lipofilia del farmaco però, da un lato favorisce il

suo accumulo nello strato corneo, dall’altro ne ostacola la penetrazione negli

strati più profondi di natura più polare. Infine la via intracellulare,

presuppone il passaggio della molecola attraverso la parete cellulare del

corneocita e poi, superata la membrana, le molecole polari si orientano verso

le zone acquose del corneocita, mentre quelle lipofile si dispongono verso le

zone a maggior contenuto lipidico. Superato lo strato corneo le molecole

diffondono rapidamente attraverso gli strati dell’epidermide e nel derma

dove possono avvenire fenomeni di metabolizzazione, di inattivazione e, nel

caso di profarmaci, di attivazione.

Modificazioni nella permeabilità dello strato corneo si riflettono sulla

capacità di penetrazione delle sostanze applicate sulla pelle.

Il disordine nello strato lipidico aumenta il passaggio transdermico.

L’applicazione di un campo elettrico aumenta il trasferimento molecolare

attraverso la pelle. A basso voltaggio < 1 V le molecole vengono guidate

attraverso la barriera costituita dalla pelle (Oh et al. 1993 ; Cullander 1992)

La differenza di concentrazione ionica provoca, come già visto, una

diffusione attraverso una membrana, determinata dalla differente tendenza

che gli ioni hanno a diffondere da un lato all'altro, e viceversa.

Cosi, quando la concentrazione degli ioni da un lato della membrana è 10

volte più alta di quella del lato opposto, essendo il logaritmo di 10 uguale a 1,

la differenza di potenziale può essere calcolata come uguale a 61 millivolts.

43

Il potenziale di membrana, viene determinato quasi interamente dalla

differenza di concentrazione del potassio ai due lati della membrana, cioè tra

dentro e fuori la cellula, secondo la nota equazione di Nerst :

Questo potenziale viene determinato mediante la seguente formula (alla

temperatura corporea di 38°C):

FEM (in millivolts) = 61 log C1Conc. interna

C2Conc. esterna

Dove FEM rappresenta la d.d.p. esiste tra i due lati della membrana e C1 e

C2, rispettivamente la concentrazione del potassio-ione all’interno e

all’esterno della cellula. Il valore della d.d.p. trans-membrana a riposo varia

notevolmente, in un ambito compreso tra -40 e – 100 mV, con negatività

all’interno.

In ogni caso, due condizioni devono verificarsi perché si possa generare un

potenziale di membrana per effetto di una diffusione:

l) la membrana deve essere semi-permeabile, in modo da consentire agli ioni

di un segno di diffondere attraverso i pori più rapidamente degli ioni di se-

gno opposto; e 2) la concentrazione degli ioni diffusibili, da un lato della

membrana, deve essere maggiore che nel lato opposto.

In assenza di gradiente di concentrazione la dipendenza corrente-voltaggio

della pelle è lineare (potenziale stazionario o di riposo).

Con un voltaggio più alto la dipendenza corrente-voltaggio non è più lineare

(Kastin, Bowman 1990-Inada 1994) ed il comportamento non può più essere

espresso dalla teoria dell’elettrodiffusione.

Lo S.C. che rappresenta la barriera più importante al trasporto, consiste in

una matrice corneocito-lipidica attraversata da follicoli piliferi e dotti

ghiandolari.

La matrice lipidica è formata da 70-100 doppi strati in sequenza, per cui un

voltaggio transdermico di 1 volt provoca una caduta della differenza di

potenziale (d.d.p.) attraverso ogni singolo doppio strato di circa 10 mV.

44

Cullander (1992) e Scott (1993) hanno dimostrato che dotti e bulbi piliferi

sono regioni dotate di alta densità di corrente.

I bordi dei dotti sono in linea con i due strati di cellule epiteliali. (Odland

1983).

Voltaggi di circa 1 V provocano una caduta della d.d.p attraverso ogni

membrana delle cellule epiteliali allineate al dotto o al bulbo di circa 250 mV.

Il campo elettrico crea pertanto nuove vie nelle pareti dei canali dei bulbi e

dei dotti.

Un potenziale di diverse centinaia di volts applicato alla pelle provoca, in un

breve intervallo di tempo, una diminuizione di 1000 volte della d.d.p.

(Prausnitz1993, Pliquett 1995).

La caduta della resistenza (depolarizzazione) avviene inizialmente a voltaggi

inferiori a 70 V per variazioni del doppio strato lamellare dello S.C.

La Farmaforesi elettrodica utilizza una corrente pulsata modulata a bassa

frequenza e moderato voltaggio per veicolare per via transdermica le

molecole dei farmaci.

Con l’uso di questi voltaggi, fondamentale è la via di veicolazione

rappresentata dai dotti e dai follicoli.

Chidmadzhev (2000), per spiegare i dati sperimentali, ha corredato una

propria teoria quantitativa del passaggio transdermico attraverso dotti e

bulbi piliferi: se viene immerso un campione di pelle in una soluzione di

elettroliti, dopo l’applicazione di un voltaggio pulsato rettangolare tra due

elettrodi posti sui due lati della pelle, la corrente elettrica fluisce

attraversando la matrice corneocito-lipidica dello S.C. e degli annessi.

Lo schema elettrico dello strato più esterno della pelle viene così descritto:

Rm e Cm rappresentano la resistenza e le capacità dello strato di matrice

corneocito-lipidica.

45

Resistori in parallelo e capacitori in serie nello S.C. rappresentano il campo

lipidico.

In media 15-20 strati di corneociti si trovano nello S.C. e ciascuno è separato

da uno strato di lipidi dello spessore di 0.05 micrometri.

Lo strato ha un effettivo spessore di 1 micrometro con una costante dielettrica

di 15-20.

Si può osservare che questo valore è intermedio tra i lipidi (2-3) e l’acqua

(circa 80).

Le fluttuazioni termiche laterali prodotte dalla corrente negli strati lipidici,

provocano nella pelle la formazione naturale di canali idrofobici.

Per trasferire molecole deve essere superato lo sbarramento di energia

esistente in un canale con raggio circa 0.4 nm.

La via più importante per il trasporto di molecole, mediante il sistema della

Farmaforesi, è rappresentata dai dotti e dai bulbi piliferi.

46

Kuzmin (1996) ha dimostrato che la permeabilità subisce un incremento,

durante l’applicazione di una corrente elettrica, prodotta dalle deformazioni

indotte nei bulbi piliferi e nei dotti.

Da un punto di vista fisico, i dotti possono essere considerati come dei tubi

lungo la lunghezza dei quali sono distribuiti parametri elettrici.

L’ aspetto che caratterizza i dotti è che la conduttività dispersa delle loro

pareti non è costante ma è in funzione della densità del campo elettrico che

induce i canali nella membrana plasmatica.

Questo modello può essere rappresentato da un sistema di equazioni

differenziali non lineari che mettono in relazione campo elettrico e parete

conducente, col tempo e con le coordinate lungo il tubo.(Chizmadzhev 1999)

Vicino alla zona di ingresso di un canale e particolarmente in caso di follicoli

piliferi, lo strato lipidico oscilla lungo l’asse x.

La lunghezza della regione di ingresso può essere calcolata in 40-100

micrometri circa.

Chizmadzhev et al.(1997), mediante un semplice modello geometrico degli

annessi cutanei con circuito elettrico equivalente, hanno calcolato la d.d.p.

lungo il tubo in un data frazione di tempo dall’inizio dell’impulso elettrico,

dimostrando una diminuizione della resistenza elettrica a cui corrisponde un

aumento della permeabilità. I calcoli e i dati sperimentali forniti

rappresentano il valido supporto al sistema.

47

Quando la corrente elettrica entra nell’ambiente acquoso dei dotti, si osserva

una fusione dei doppi strati lipidici di membrane, come dimostrato da

V.S.Markin e J.Albanesi (2002) mediante l’utilizzazione del cosiddetto “Stalk

model”.

Tale teoria chiarirebbe il perché della fusione e della dilatazione dei canali.

La Farmaforesi elettrodica utilizza questo effetto per il trasferimento di

molecole terapeutiche.

Il campo elettrico e la fusione dei canali non rappresentano comunque l’unico

mezzo per la veicolazione delle molecole, il calore e la presenza di composti

chimici possono influirne il passaggio.

Pliquett (2002) ha dimostrato che il calore struttura localmente i dotti ed i

corneociti.

Il flusso di corrente, attraversando la pelle, provoca un aumento di

temperatura che può influenzare le cellule, i lipidi e perfino le molecole

terapeutiche.

L’aumento di temperatura dipende dal voltaggio e dalla durata dell’impulso.

Con la Farmaforesi elettrodica e con il tipo di campo elettrico utilizzato,

queste modifiche sono sempre e costantemente reversibili.

Diversi dati sperimentali dimostrano che i campi elettrici e i composti chimici

(eparina per esempio) assieme, creano un ampliamento del cammino acquoso

che consente a un grosso numero di macromolecole di essere veicolate

attraverso la pelle. (Zewert and Vanbever-1999)

T. Kotnik et al. ( febbraio 2003 ) mediante l’uso di vari tipi di onde:

monopolari, bipolari pulsate, bipolari continue e modulate pulsate dimostra

il ruolo dell’ampiezza, della durata e della forma dell’onda elettrica

sull’elettro-permeabilizzazione.

48

La figura documenta la comparazione dell’efficienza della

permeabilizzazione cellulare in funzione del potenziale in volts/cm di un

impulso mono-polare che subisce un incremento da 2 a 100 microsecondi,

facendo osservare che non esiste differenza significativa in termini statistici.

La Farmaforesi elettrodica in effetti usa particolari forma d’onda modulate

per aumentare il flusso di molecole come è dimostrato dalle ricerche di

Kotnik.

B.R.Loke (2003) ha dimostrato mediante risonanza magnetica, che la mobilità

dell’acqua nei follicoli piliferi, sotto campo elettrico pulsato, è più alta che nel

resto della pelle.

Loke ha dimostrato inoltre che i pori idrogelizzati aumentano maggiormente

il passaggio transdermico.

In linea generale, la permeabilizzazione ad un farmaco può essere valutata in

base al campo elettrico applicato, ma assume un aspetto determinante anche

la forma dell’elettrodo.

In conclusione, la Farmaforesi elettronica fa uso di una caratteristica corrente

pulsata modulata che agisce non soltanto a livello della pelle, ma anche sulla

49

polarizzabilità delle molecole, per cui è possibile trasferire anche molecole

non ionizzate

VANTAGGI DEL PASSAGGIO TRANSDERMICO DEI FARMACI:

• effettuare terapie con farmaci con breve emivita biologica

• evitare condizioni di aggressività chimica nei confronti del

tratto intestinale

• evitare l’effetto del primo passo epatico

• minore quantità di farmaco necessario alla terapia;

• maggiore concentrazione locale;

• assoluta certezza che il farmaco arrivi alla zona d'interesse

• maggiore rapidità d'azione;

• assenza di rischio per le parti non interessate dall'evento

morboso;

• assoluta assenza di controindicazioni;

• assoluta assenza di effetti collaterali.

FARMAFORESI ELETTRODICA PER “BIO-ELECTRODIC REPTATION”

RICERCA MEDICA-TECNOLOGICA 2°parte

50

I dispositivi transdermici di manifattura precedente e il loro metodo di

veicolazione, mediante l’uso di corrente elettrica per condurre farmaci

attraverso la pelle, hanno un’efficacia insufficiente nella durata, per cui il

tasso di trasporto del farmaco e l’effetto terapeutico diminuisce quando la

corrente viene continuamente applicata per periodi estesi di tempo.

Il sistema della farmaforesi elettrodica per “bioelectrodic reptation”, utilizza

una componentistica elettronica innovativa in termini di potenza e

affidabilità ed una gestione software avanzata per la sicurezza durante

l’impiego.

Particolare attenzione è stata prestata all’applicazione dell’impulso elettrico.

SEGNALE SELEZIONATO PER DURATA, TASSO DI RIPETIZIONE,

FORMA E CONTENUTO ARMONICO, CON FORME D’ONDA VALUTATE

PER TIPO DI PATOLOGIA E FARMACO. LETTURA IN SEQUENZA

SOTTO CONTROLLO DI MICROPROCESSORE. TRASFORMAZIONE IN

SEGNALI ANALOGHI POI APPLICATI AI TERMINALI.

Selezionati i segnali per ogni tipo di patologia e di farmaco prescelto e

conferita una speciale “armonia”, specie in caso di protocollo terapeutico

complesso, questi vengono letti in sequenza sotto il controllo di un

microprocessore e trasformati in segnali analoghi poi applicati ai terminali.

Il lavoro sperimentale nell’ ”adattare” i farmaci per l’uso transdermico è stato

determinante per ottenere prestazioni ottimali.

Ciò è reso possibile da varie sequenze di segnali generati e gestiti dal

dispositivo in funzione delle sostanze medicamentose in protocollo, delle

specifiche di trattamento impostate e delle condizioni di salute del paziente

in esame, in modo che ogni trattamento sia specifico e mirato alla risoluzione

del problema da trattare.

I diversi farmaci possono essere veicolati uno per volta o essere trasportati

simultaneamente ( con effetti anche validi di minore importanza).

51

Il nuovo dispositivo ha la capacità di attuare più trattamenti terapeutici

contemporaneamente e di diverso genere confermando così la sua

molteplicità d’uso in diversi campi, non attuabile con altri apparecchi.

Ciascun segnale deve quindi essere selezionato per durata, tasso di

ripetizione, forma e contenuto armonico, applicando forme d’onda valutate

con particolare attenzione anche per frequenza e durata.

SISTEMA DI ABBATTIMENTO DELLE BARRIERE NATURALI A BASSO

POTERE ENERGETICO

La farmaforesi elettrodica adotta un sistema di generazione e polarizzazione

dei principi attivi che consente l’abbattimento delle barriere naturali alla

veicolazione trans-dermica a basso potere energetico in modo da non eccitare

eccessivamente le parti trattate e permettere così una modalità di

applicazione idonea, a favore dei risultati ottenibili.

SISTEMA DI VALUTAZIONE DELLO STATO DELLA CUTE

Un sistema di monitoraggio valuta lo stato della cute : raggiunta una

condizione di polarizzazione momentanea del derma e delle parti lese,

permette il trasferimento delle sostanze attive.

Un ciclo di depolarizzazione della parte trattata abbatte le cariche formatesi

durante il trasporto e resetta lo stato energetico del derma, eliminando così

anche il principio dell’arrossamento indotto dalle altre metodiche .

I segnali generati dall’unità logica e di processo digitale del dispositivo sono

segnali che, seguendo alcune regole tratte per via sperimentale, e studiate in

corso di progettazione, attribuiscono al dispositivo l’unicita’ nel suo genere.

SISTEMA DI SICUREZZA CON MONITORAGGIO

Si è prestata molta attenzione alla progettazione della sezione di sicurezza

affinché Farma t.e.b.® potesse essere definito un dispositivo sicuro sotto

aspetto. Infatti è equipaggiato con un sistema di monitoraggio di tutti i

52

parametri funzionali, terapeutici, elettrici e di sistema. Ciò consente il

controllo continuo dello stato dei trattamenti, bloccando o editando gli stessi

in caso di riscontro di errore o pericolo e il monitoraggio dello stato del

sistema, avvisando l’utente in caso di problemi o pericolo e intervenendo in

maniera autonoma alla gestione dell’energia, come ad esempio l’accesso

all’unità di backup interna, qualora si riscontri un’anomalia nel sistema di

alimentazione e la continua analisi dello stato dei trattamenti in atto, al fine di

verificare che gli stessi avvengano secondo quanto prefissato dal dispositivo e

dal team di sviluppo.

RECETTORI LEGATI AD ENZIMI.

A differenza dei recettori legati alle proteine G, che regolano indirettamente

l’attività di una proteina bersaglio della membrana plasmatica, i recettori

legati ad enzimi funzionano direttamente come enzimi o sono congiunti ad

enzimi senza intermediari.

Il dominio che lega il ligando è posto sulla superficie extracellulare della

membrana plasmatica. Il dominio citosolico o possiede un’attività enzimatica

intrinseca o si associa direttamente con una proteina enzimatica piuttosto che

con una proteina G.

La maggioranza di questi recettori ha un’attività protein chinasica e fosforila

specifiche proteine intracellulari.

Il gruppo più rilevante è composto dalle tirosin chinasi recettoriali, che

costituiscono vie segnaletiche chiave nelle risposte cellulari agli stimoli

portati dai fattori di crescita. Il ligando che si lega al recettore attiva la sua

attività tirosin chinasica, per cui il recettore fosforila le catene laterali delle

tirosine situate su proteine cellulari specifiche.

Tra i fattori di crescita che operano per mezzo delle tirosin chinasi recettoriali

si elencano l’insulina, il fattore di crescita epidermico e il fattore di crescita

nervoso.

LA RIMOZIONE DEI SECONDI MESSAGGERI

53

Nel citosol di una cellula non stimolata le concentrazioni dei secondi

messaggeri sono di solito molto basse perché queste molecole vengono di

continuo rapidamente distrutte o rimosse dal citosol. Tale concentrazione

viene modificata sopratutto dalle variazioni della loro velocità di sintesi o

d’entrata all’interno della cellula. Ciò accresce la concentrazione citosolica del

messaggero, permettendo alla cellula bersaglio di rispondere sollecitamente

al segnale extracellulare.

54

Quando una molecola del primo messaggero (segnale extracellulare) si lega al suo recettore, viene

sintetizzato un secondo messaggero. Se il segnale extracellulare viene rimosso, il secondo messaggero va

incontro a rapida distruzione o rimozione dalla cellula, quindi deve essere risintetizzato quando un nuovo

segnale si lega al recettore.

La concentrazione di AMP ciclico si può quintuplicare in qualche secondo

quando un ormone si lega al suo recettore sulla membrana plasmatica e

stimola l’adenilato ciclasi.

La sintesi o l’entrata del secondo messaggero cade a zero quando il segnale

extracellulare viene “spento”.

Il messaggero distrutto o rimosso, fa declinare celermente la concentrazione

citosolica delle molecole portatrici di messaggi sino al punto in cui la cellula

cesserà di rispondere.

L’AMP ciclico, per esempio, viene degradato molto rapidamente ad

adenosina 5’-monofosfato (5’-AMP) grazie ad una reazione catalizzata dalla

fosfodiesterasi dell’AMP ciclico. Il GMP ciclico è degradato a GMP dalla

fosfodiesterasi del cGMP. In modo consimile, l’inositol trifosfato ed il

diacilglicerolo vengono subito degradati da enzimi specifici.

Altro esempio: il Ca2+ viene rimosso dal citosol grazie a vari meccanismi che

agiscono contemporaneamente.

Ca2+extracellulare=1000 micromol/L

55

Un secondo messaggero viene rimosso da una cellula. Gli ioni calcio che operano nel citosol come secondi

messaggeri possono essere rimossi mediante meccanismi di trasporto attivo, di antiport, di sequestrazione

all’interno di certi organuli citoplastici,e/o di legame con speciali molecole. Questi meccanismi riducono il

livello del Ca2+intracellulare nelle cellule non stimolate a 0,1 micro mol/L

Un meccanismo pompa il Ca2+ fuori dalla cellula, spostando lo ione contro il

suo gradiente elettrochimico mediante un trasporto attivo primario. Ciò,

grazie alla Ca2+ATPasi che utilizza energia chimica (come quella dell’ATP)

per pompare il Ca2 fuori della cellula.

Un altro meccanismo coinvolge un trasporto attivo secondario: l’entrata nella

cellula dell’Na, che diffonde lungo un gradiente favorevole, contribuisce a

spingere il Ca2+ all’esterno della cellula.

Il Ca2+ libero viene rimosso anche grazie ai legami con le proteine ed altre

molecole citosoliche calcioleganti e mediante sequestro all’interno dei

mitocondri e del reticolo endoplasmatico (ER). Il numero rilevante di

meccanismi vari che regolano i livelli citosolici del Ca2+, potrebbe costituire,

un sistema di difesa contro i possibili effetti tossici di concentrazioni non

controllate di questo ione.

56

RECETTORE ESPRESSO SULLE CELLULE BERSAGLIO DELLA

SOSTANZA ATTIVA (CELLULE ENDOTELIALI, FIBROCELLULE

MUSCOLARI LISCE VASCOLARI, MONOCITI, MACROFAGI, CELLULE

DENDRITICHE ECC.)

Rappresentazione schematica della dinamica molecolare del recettore H1

Rappresentazione schematica della dinamica molecolare del concetto di

occupazione recettoriale (OR)

Il recettore H1 espresso sulle cellule bersaglio della sostanza attiva (cellule

endoteliali, fibrocellule muscolari lisce vascolari, monociti, macrofagi, cellule

dendritiche ecc.) può essere up-regolato da diverse citochine o fattori di

crescita e dalla differenziazione e maturazione cellulare.

57

Ogni sostanza attiva medicamentosa è in grado di modulare, (direttamente o

indirettamente), il recettore specifico del tessuto sede di lesione. Tale

recettore, up-regolato può essere a sua volta coinvolto nella modulazione di

altre strutture attraverso la normalizzazione del release dei fattori trofici

alterati a seguito del danno prodotto alle cellule del tessuto interessato

dall’evento lesivo.

Un principio attivo con elevata capacità di occupazione recettoriale, è in

grado di bloccare il recettore H1 up-regolato con maggiore efficacia rispetto

ad un altro a bassa occupazione recettoriale.

Il dispositivo medico per veicolare farmaci (farma t.e.b.), tramite le frequenze

elettriche descritte, crea le condizioni che provocano l’apertura e la chiusura

delle molecole (gating) per cui la cellula può anche aprire e chiudere il canale

secondo le esigenze.

Rappresentazione semplificata del meccanismo di gating per la regolazione del trasporto degli ioni

attraverso una proteina canale di membrana.

Il supporto tecnologico mediante somministrazione per via transdermica

fornisce la soluzione poichè consente che le molecole, polarizzate

dall’impulso (ricoperte virtualmente da una sfera di elettroni), sotto l'azione

di trascinamento della forza elettrica, possono essere trasportate dal flusso di

corrente e veicolate fino a raggiungere istantaneamente i recettori specifici

delle cellule dei tessuti sede del danno: partendo dalla pelle, il principio

attivo raggiunge, infatti, attraverso i vari strati di tessuto,“a bolo” (per

58

rendere l’idea, comparabile con la somministrazione endovenosa) il bersaglio

cellulare deputato a modulare localmente i vari fenomeni .

Lunghi cavi molecolari si snodano, dunque, a loro modo attraverso i pori

(con molecole che seguono lo stesso cammino in “fila indiana” di larghi

complessi (molecolari) la cui mobilità diventa indipendente dalla misura.

Il Medico può indurre quindi tempestivamente la modulazione

farmacologica delle cellule dei tessuti lesi.

Questo corrisponde a ridurre drasticamente il ritardo temporale tra la

risposta ad una noxa patogena e l’intervento terapeutico prescelto.

Il farmaco veicolato con la tecnica della farmaforesi ellettrodica sfugge alla

tappa digestiva e plasmatica e ciò permette di evitare le biotrasformazioni

dovute all’idrolisi gastrointestinale, alle azioni enzimatiche della parete

intestinale e del fegato per presentarsi quasi esclusivamente in forma libera

all’organo bersaglio. Inoltre si evita così la saturazione medicamentosa

dell’intero organismo con gli effetti secondari che ne risulterebbero.

Nuove conferme sulla capacità di queste straordinarie molecole determinano

effetti farmacologici ( per es. anti-edema) comparabili, come intensità e come

tempo di insorgenza, sia con quelli ottenibili con un corticosteroide come il

desametasone, che con un FANS non selettivo (media selettività per COX-2)

come il diclofenac, senza, peraltro, determinare alcuna intolleranza nè alcun

danno a livello sistemico.

L'ASPETTO PIÙ IMPORTANTE E VANTAGGIOSO DEL SISTEMA

TERAPEUTICO

Una dose terapeutica minima ma efficace, trasportata sul focolaio della

lesione, può svolgere la propria azione, piuttosto che una massiccia dose

di farmaci per le vie classiche lontano dalla sede del danno e talora privi

di effetti terapeutici in presenza di turbe microvasculo-tissutali (sindrome

59

post-flebitica , adiposità circoscritta , lesioni traumatiche ) o di processi

fibro-sclerotici (aterosclerosi, esiti cicatriziali).

Ciò comporterebbe un impiego notevole di volume e di concentrazione del

farmaco, perché arrivi alla zona alterata in modo utile e sufficiente per

esplicare la sua attività terapeutica.

L’utilizzo di una corrente pulsante permette alla cute di depolarizzarsi, prima

che cominci di nuovo il ciclo. In tal modo, inoltre, a parità di efficacia

terapeutica rispetto all’utilizzo di una corrente continua, se ne eroga una

quantità inferiore, riducendo il rischio di ustioni. La presenza del picco

negativo della corrente serve ad evitare la formazione dell’acido cloridrico e

dell’idrossido di sodio, o meglio, si formano durante la fase positiva ma si

decompongono immediatamente.

I processi di rilassamento della pelle osservati sono associati al rilassamento

dei contro-ioni e all’acqua legata alle proteine della pelle con modalità del

tutto “simili al ghiaccio”.

La frequenza impiegata dipende dal peso molecolare del farmaco da

veicolare e dalla profondità alla quale è necessario che penetri. Gli ioni o le

molecole del farmaco o del principio attivo, non incontrando ostacoli nel loro

percorso guidato dagli elettroni, all’interno dell’organismo, che possano

rallentare o interrompere il flusso, raggiungono l’organo-bersaglio

prestabilito, sede di lesione e, penetrano all’interno delle cellule che li

utilizzano senza alcun fenomeno allergico, nè effetti collaterali.

E’ un modo di pensare nuovo, un approccio scientifico per un significativo

cambiamento nel modo di affrontare le patologie.

E’ il primo ed unico sistema terapeutico non invasivo che può somministrare

selettivamente farmaci e cosmeceutici anche di alto peso molecolare

(ac.nucleici, elastina, ac. jaluronico, collagene)e in grado di dimostrare la

propria efficacia in medicina estetica, in medicina umana e veterinaria e di

supporto alla radiologia, determinante soprattutto nel ringiovanire le cellule

60

riportando indietro l’orologio biologico, o nel rigenerare qualsiasi tessuto leso

o degenerato (medicina rigenerativa).

Il sistema, modificando i processi di invecchiamento e delle malattie

associate, risolve definitivamente tutte le forme loco-regionalizzate

aggredibili dall’esterno: inestetismi: smagliature, cicatrici, invecchiamento

viso, ma anche le patologie degenerative o lesioni parziali dei tessuti

cartilaginei, ossei e muscolari (per es.: artrosi, dolore cronico, lesioni di

menisco, dito a scatto, tunnel carpale, osteoporosi, fratture, stenosi vertebrali,

lussazioni), aprendo delle prospettive del tutto nuove nel modo di trattare

patologie senza cura, estendendo la durata della vita in buona salute.

I diversi protocolli sviluppati, di farmaci della farmacopea ufficiale,

attraverso catene di reazioni e trasmissione di segnali chimici dalla superficie

cellulare verso i bersagli intracellulari, regolano i processi metabolici

responsabili, integrandosi perfettamente all’interno delle cellule e del suo

DNA, fino alla completa risoluzione del processo patologico.

Il Sistema, quindi, mediante la somministrazione di piccole dosi di farmaco

che attiva direttamente i recettori specifici del tessuto leso, dimostra

un’efficacia terapeutica in grado di produrre effetti notevolmente maggiori

rispetto alla somministrazione sistemica, con un impatto quasi nullo (0,04%)

sul circolo, quindi senza controindicazioni o effetti collaterali e con un

notevole contenimento della spesa sanitaria.

61

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90)Univ. Degli Studi di Catania U.O. di Ch. Plastica Az.Ospedaliera

Cannizzaro- Catania Lavoro sulle smagliature con tecnica di

hydroelettroforesi S.Cominiti M.S. Tarico , P.Siragò

91) Università di Catania “Valutazione dell’efficacia d’uso della

Hydroelettroforesi in cosmetica e nella terapia topica.” Francesco Paolo

Bonina

92)Induratio penis plastica

Esperienze e metodi terapeutici

V international congress Pisa 24-270marzo 2003

“Therapy in andrology “felice editore medicina “

93)Università degli Studi di Pisa Scuola di Specializzazione in endocrinologia

e malattie andrologiche “Nuove possibilità terapeutiche nel trattamento

della Induratio penis plastica” P.F.Palego ,A.Bertozzi , P.Rossi A.Ponzano,

S.Voliani, G. Todeschini , e F.Menchini

94) XXXII Congresso nazionale simfer Chieti settembre 2004 Vantaggi di un

approccio riabilitativo integrato di hydroelettroforesi e ginnastica vertebrale

nella lombalgia acuta

95)Atti Congresso Nazionale ANaSMeS Ud’A “Attività fisico-sportiva e

patologia neuromuscolare”, Chieti, 19-22 giugno 2005, Abstracts Book, pp.

387-391

96)Hamill O. P., Marty A., Neher E., Sakmann B. e Sigworth F. J., Improved

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97)Penner Reinhold E Neher Erwin, The Patch-Clamp Technique in the Study

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72

Dott.Antonino d’Africa