2011-09-26

1

Podstawy farmakogenetyki

i farmakogenomiki

w praktyce klinicznejJak leczyć skuteczniej i bardziej bezpiecznie

prof. Marek MirowskiPracownia Biologii Molekularnej i FarmakogenomikiZakład Biochemii Farmaceutycznej UM w Łodzi

Farmakogenetyka- interdyscyplinarna dziedzina medycyny ł ącząca

farmakologi ę i genetyk ę

- badanie wpływu zmian w pojedynczym genie na odpowied ź organizmu na lek

bada skuteczność, bezpieczeństwo oraz interakcje między innymi lekami

Farmakogenomikabadanie wpływu ekspresji wielu genów w komórkach

poszczególnych tkanek na uwarunkowane dziedzicznie osobnicze ró Ŝnice w reakcjach

organizmu na leki

FarmakogenetykaONE SIZE DOESN’T FIT ALL

Leczenie tym samym lekiem w tej samej dawce róŜnych pacjentów moŜe spowodować róŜne efekty

Czynniki środowiskowe, dieta, wiek, styl Ŝycia, stan zdrowia i przyjmowane leki wpływają na odpowiedź organizmu na lek, jednak kluczowe dla stworzenia

bezpiecznej i skutecznej farmakoterapii jest poznanie indywidualnych róŜnic w genotypie

pacjenta

Projekt Genomu Człowieka – róŜnice międzyosobnicze 0,1% DNA

+ ���� = ☺☺☺☺

+ ���� = ����

????

+ ���� = ����pacjent nie odpowiada na leczenie !!!

silna reakcja toksyczna !!!

����

☺☺☺☺ ����

2011-09-26

2

Polimorfizm genetyczny – to regularne i jednoczesnewystępowanie w tej samej populacji dwóch lub więcejgenotypów bez form przejściowych z częstością, która nie jestwytłumaczalna powtarzającymi się mutacjami (a więc zczęstotliwościąwiększą niŜ 1%).

Najczęstsze typy polimorfizmy:SNP – (ang. single nucleotide polymorphism)

polimorfizm pojedynczych nukleotydówD/I – (ang. deletion/insertion)

delecja-utrata/insercja-wtrącenieVNTR – (ang. variable number of tandem repeats)

zmienna liczba tandemowych powtórzeń

Przyczyny odmiennego działania leków:

• przejściowe - hamowanie, indukcja

• stałe - polimorfizm, mutacje

Struktura genu koduj ącego białko Konwencja zapisu polimorfizmu SNP

C3435Tw pozycji 3435 doszło do zamianycytozyny (C) na tyminę (T) w sekwencjidanego genu

– G85Aw pozycji 85 doszło do zamianyguaniny (G) na adeninę (A) wsekwencji promotorowej danego genu

DNA zawiera ~ 1,000,000 SNPs

Haplotyp jest

kombinacją SNPs single-nucleotide polymorphism

polimorfizm pojedynczych nukleotydów

Nadekspresja MDR1 genu kodującegoglikoproteinę-P

2011-09-26

3

Nadekspresja MDR1 genu kodującegoglikoproteinę-P Multidrug resistance of tumor cell

1. Genetic variants of drug transporters2. Genetic variants of drug targets 3. Genetic variants of DNA reapring system enzymes 4. Genetic variants of apoptosis and cell cycle regulators

Metabolizm = biotransformacja� REAKCJE I FAZY – unieczynniają (lek) lub teŜ uczynniają (prolek)

wprowadzoną do organizmu substancję leczniczą.Reakcje I fazy mają na celu taką zmianę struktury chemicznej związkuaby mogły zajść reakcje II fazy.

Utworzenie grup funkcyjnych w reakcjach I fazy metabolizmu:• utworzenie grupy –OH (reakcja hydroksylacji):

Metabolizm = biotransformacja

� REAKCJE II FAZY – są to reakcja sprzęgania w wyniku którychpowstają związki nieaktywne farmakologicznie, dobrze rozpuszczalnew wodzie, a tym samym łatwo wydalane przez nerki wraz z moczem.

Najczęstszymi substratami do reakcje sprzęgania są:• kwas glukuronowy (UDP-glukuronylotransferaza (UGT))• kwas siarkowy• glicyna• glutation (transferaza S-glutationowa (GST))

Rodzina genów Cytochromu P450

CYP450

Człowiek 14+

Rośliny 22

Owady 3

Grzyby 11 DroŜdŜe 2 Nicienie 3

Bakterie 18

Mięczaki 1

Nazewnictwo: CYP 3 A 4

Rodzina>40% homolgiiw sekwencji Podrodzina

>55% homologii w sekwencji

Izoenzym

*15 A-B

Allel

CYP 2D6*1ACYP 2D6*1B

CYP 2D6*2ACYP 2D6*2B

2011-09-26

4

Spektrum substratowe CYP 450Specyficzność substratowa izoform CYP450

na podstawie http://medicine.iupui.edu/flockhart/

CYP 2A6 nikotyna

CYP 2C9 diklofenak, naproksen, warfaryna

CYP 2C19 diazepam, omeprazol, propranolol

CYP 2D6 amitryptilina, captopril, kodeina, mianseryna, chlorpromazina

CYP 2E1 etanol, halotan, paracetamol

CYP 2B6 cyklofosfamid

CYP 3A4 alprazolam

CYP 1A2 werapamil, imipramina, amitryptilina, kofeina

homozygota zmutowana

heterozygota

homozygota „dzika”

zwielokrotnienie liczby alleli

Cytochrom P-450 2D6 (CYP 2D6)

� katalizuje oksydację 40 klinicznie waŜnych leków(leki nasercowe, psychotropowe, pochodne morfiny i inne)

� w obrębie genu kodującego CYP 2D6 zidentyfikowano48 mutacjipunktowych(SNP)

� 16 genotypów prowadzi do fenotypu„słabo metabolizującego”(poor metabolizer), dla rasy białej fenotyp ten występujez częstością 7%

� zwielokrotnienie liczby funkcjonalnych genów CYP 2D6 prowadzido fenotypu„ultraszybko metabolizującego”(ultrarapid metabolizer)

CYP2D6 polimorfizm i fenotyp

Mario Stefanovic, Univ. Hosp. Clincal Institue of Chemistry, Hr

6-Merkaptopuryny

6-merkaptopurynaazatiopryna(Imuran®)tioguanina

są stosowane w leczeniu ostrych (AML) i przewlekłych białaczek(CML) oraz chłoniakach oraz jako leki immunosupresyjne

2011-09-26

5

S-metylotransferaza tiopurynowa (TPMT)

TPMT bierze udział w metabolizmie tiopuryn:6-merkaptopuryna,azatiopryna, tioguanina,które są stosowane w leczeniu raka,białaczki limfoblastycznej i jako leki immunosupresyjne.

TPMT

cięŜka supresja szpiku

6-MP – 6-merkaptopuryna6-TGN – nukleotyd 6-tioguaniny6-MMP – 6-metylomerkaptopuryna

S-metylotransferaza tiopurynowa (TPMT)

Częstość występowania reakcji toksycznych po zastosowaniu tiopuryn:

EM (efficient metabolizer) –osoba prawidłowo metabolizującaPM (poor metabolizer) –osoba powoli metabolizująca

S-metylotransferaza tiopurynowa (TPMT)

Zapobieganie skutkom nieprawidłowego metabolizmu tiopuryn:

• u osóbszybko metabolizujących (UM) naleŜy zwiększyć dawkęstandardową w celu uzyskania poŜądanych efektówterapeutycznych (szczególnie u dzieci z ALL i u osób poprzeszczepach narządowych)

• u osóbwolno metabolizujących (PM) naleŜy zmniejszyć dawkęstandardową w celu uniknięcia wystąpienia cięŜkiej supresji szpiku,wystarczy 10-15% standardowej dawki terapeutycznej

• u osób z brakiem aktywnej TPMT stosowanieazatiopryny, którajest prolekiem, nie daje Ŝadnych efektów terapeutycznychniezaleŜnie od zastosowanej dawki

Glukuronylotransferaza-UDP (UGT)

UGT bierze udział w sprzęganiu bilirubiny, steroidów, hormonówtarczycy oraz pochodnych fenoli z resztą kwasu glukuronowego.

WyróŜniono dwie rodziny tych enzymów:UGT1 (znacznie kliniczne)UGT2

Irinotecan (CPT-11) (Campto®)

� półsyntetycznym analogiem naturalnegoalkaloidu kamptotecyny

� leczenie zaawansowanych stadiów raka jelita grubego

� najczęstszą przyczyna ograniczenia w stosowaniumaksymalnych dawek jest pojawiająca się neutropenia(3 i 4 stopnia) oraz odległe w czasiecięŜkie biegunki

� w zaleŜności od schematu dawkowania zwykle blisko 1/3wszystkich pacjentów wykazuje działania niepoŜądane

Irinotecan (CPT-11)

APC (7-etylo-10-[4-N-(5-aminopentanowy kwas)-1-piperydyno]karbonyloksykamtotecyna), NPC (7-etylo-10-(4-amino-1-piperydyno)karbonyloksykamptotecyna), SN-38(7-etylo-10-hydroksykamptotecyna), CE (carboksyloesterase), UGT1A1 (glukuronylotransferaza-UDP1A1)

2011-09-26

6

Glucuronylotranspherase-UDP (UGT)

Enzym UGT1A1 odpowiada za sprzęganie bilirubiny, estradiolu,estriolu oraz czynnego metabolitu Irinotecanu w wątrobie.

-T-A-T-A - -T-A-T-A-T-A-T-A-.........

7 i więcej powtórzeńT-A

• w raku jelita grubego, cięŜka toksyczność po podaniu Irinotecanu (Camptosar®)

• zespół Gilberta (hiperbilirubinemia prowadząca do łagodnej Ŝółtaczki)

• estrogenne efekty uboczne po zastosowaniu środków antykoncepcyjnych

spadek poziomu enzymu!

Glucuronylotranspherase-UDP (UGT)

Dependence between activity of liver UGT1A1and type of promotor genotype for geneUGT1A1

genotype of promotor

UG

T1A

1 ac

tivity

Glucuronylotranspherase-UDP (UGT)

Nagromadzenie w wątrobie aktywnego metabolituIrinotecanu SN-38, powoduje wystąpienie cięŜkichbiegunek trudnych do opanowania

severediarrhea !

Cetuksimab (Erbitux®)

� cetuksimab jest rekombinowanym, humanizowanymprzeciwciałem monoklonalnym klasy IgG1 skierowanymprzeciwko EGFR (receptor naskórkowego czynnikawzrostu)

cetuksimab (Erbitux®)

Cetuksimab (Erbitux®) przypadek kliniczny

� 52-letnia biała kobieta

� IV stadium zaawansowania raka jelita grubego(T4+N1+M1)

� po resekcji chirurgicznej guza zastosowano terapię trzemacytostatykami: 5-FU+LV+Irinotecan

� pomimo terapii choroba nowotworowa uległa dalszejprogresji

� zdecydowano się na terapię II rzutu schematemIrinotecan+Cetuksimab

Cetuksimab(Erbitux®)

Cetuksimab

progresja nowotworu

2011-09-26

7

Cetuksimab (Erbitux®) przypadek kliniczny

Immunohistochemiczne ustalenie stopnia ekspresji EGFR u pacjenta

FDA zaleca doidentyfikacjipacjentów z rakiemjelita grubegooznaczenie IHCobecności ekspresjiEGFR przedpodjęciem leczeniacetuksimabem

EGFR PharmDx®

(DAKOcytomation)

Cetuksimab (Erbitux®) przypadek kliniczny

� u pacjentki wykonano za pomocą zestawu EGFR PharmDx® (DAKOcytomation) test IHC

� wykazano wysoki poziom ekspresji receptora EGFR

� wdroŜono leczenie schematem Irinotecan+Cetuksimab

Badania IHC wskazują, Ŝe około 70% przypadkówraka jelita grubego wykazuje ekspresję EGFR

Rodziny białek biorących udział w transporcie leków (drug transporters)

� rodzina ABC (ATP-binding cassette family)

� rodzina OAT (organic anion transporter family)

� rodzina OCT (organic cation transporter family)

� rodzina OATP (organic anion transporting polypeptide family)

� rodzina PepT (peptide transporter family)

Podrodzina Dawna nazwa

Nowe nazewnictwo

Liczba genów

Geny związane z opornością

podrodzina A ABC1 ABCA 12 genów

podrodzina B MDR/TAP ABCB 11 genówMDR1 (ABCB1)

TAP1 (ABCB2)

TAP2 (ABCB3)

podrodzina C CFTR

MRPABCC 12 genów

MRP1 (ABCC1)

MRP2 (ABCC2)

MRP4 (ABCC4)

MRP5 (ABCC5)

podrodzina D ALD ABCD 4 geny

podrodzina E OABP ABCE 1 gen

podrodzina F GCN20 ABCF 3 geny

podrodzina G WHITE ABCG 5 genów BCRP (ABCG2)

Podział genów kodujących transportery ABC wedługnowego nazewnictwa HUGO Genome Nomenclature Committee

Schemat budowy transporterów ABC

}Wybrane cytostatyki będące substratami dla P-gp

Alkaloidy Vinca:- winblastyna- winkrystyna- windezyna

Epipodofyloksyny:- etopozyd- tenipozyd

Antracykliny i pochodne:- doksorubicyna- daunorubicyna- mitoksantron

Inne:- amsakryna- mitomycyna C- mitramycyna- aktynomycyna D- kolchicyna- tamoksifen- puromycyna

Kampotecyny:- topotekan- irinotekan

2011-09-26

8

Subfamily Previousname

NewNomenclature

The number of genes

Genes associated with drug resistance

subfamily A ABC1 ABCA 12 genes

subfamily B MDR/TAP ABCB 11 genes MDR1 (ABCB1)TAP1 (ABCB2)TAP2 (ABCB3)

subfamily C CFTR

MRPABCC 12 genes

MRP1 (ABCC1)MRP2 (ABCC2)MRP4 (ABCC4)MRP5 (ABCC5)

subfamily D ALD ABCD 4 genes

subfamily E OABP ABCE 1 gene

subfamily F GCN20 ABCF 3 genes

subfamily G WHITE ABCG 5 genes BCRP (ABCG2)

Classification of genes encoding ABC transportersaccording to HUGO Genome Nomenclature Committee Glycoprotein P (ABCB1/MDR1)

environment

nucleus

cytoplasm

membranecytoplasmatic

Glycoproteine-P structure P-gp mechanisms of work

molecular vacuum flipase

P-gp in pharmacotherapyand cancerogenesis

drug

P-gp P-gp

efectivness ofpharmacotheraphy↓

risk of cancerogenesis↓

carinogen

nucleus

ABCB1 transports various substrates across the cell membrane include:

-Drugs such as colchicine and tacrolimus-Chemotherapeutic agents such as etoposide, doxorubicin and

vinblastine-Lipids-Steroids -Xenobiotics -Peptides-Bilirubin-Cardiac glycosides like digoxin -Immunosuppressive agents -Glucocorticoids like dexamethasone-HIV-type 1 antiretroviral therapy agents like protease inhibitors and -nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors.

2011-09-26

9

Causes that can modify ABCB1 expression

� environmental:

- cytostatics

- thermic shock

- heavy metals

- UV and X rays

�molecular:

- methylation in promotor region

- genetic polymorphism

Polymorphisms (SNPs) of ABCB1 gene

?SNP – (ang. single nucleotide polymorphism)

exon

nucleotide

amino acid

Polymorphic sites in sequence of ABCB1

Localisation Position Polymorphism Efect

Exon 1a Exon 1a/–145 C/G non codingExon 1b Exon 1b/–129 T/C non codingExon 2 Exon 2/61 A/G Asn21AspExon 5 Exon 5/307 T/C Phe103LeuExon 7 Exon 7/548 A/G Asn183SerExon 11 Exon 11/1199 G/A Ser400AsnExon 12 Exon 12/1236 C/T SilentExon 13 Exon 13/1474 C/T Arg492CysExon 21 Exon 21/2650 C/T silentExon 21 Exon 21/2677 G/T Ala893Ser

G/A Ala893ThrExon 24 Exon 24/2956 A/G Met986ValExon 24 Exon 24/2995 G/A Ala999ThrExon 26 Exon 26/3320 A/C Gln1107ProExon 26 Exon 26/3396 C/T silentExon 26 Exon 26/3421 T/A Ser1141ThrExon 26 Exon 26/3435 C/T SilentExon 28 Exon 28/4030 G/CExon 28 Exon 28/4036 A/G

Polymorphic sites in sequence of ABCB1that can change amino acids sequence

environment

membrane

cytosol

Consequences of functional polymorphism of ABCB1 in position

G2677T/A

pharmacokinetics of fexofenadine

time

Wskazania do badania profilu farmakogenetyczego

• Polimorficzny metabolizm leku

• Długotrwałe leczenie

• Mały współczynnik terapeutyczny

• Objawy toksyczne

• Niespodziewany wynik leczenia

• Zbyt niskie lub wysokie stęŜenie leku w surowicy

• Interakcja leków

2011-09-26

10

Problemy w farmakogenetyce

1. DuŜa liczba wariantów allelicznych

2. Wiele nieznanych enzymów i polimorfizmów

3. DuŜa ilość informacji trudnych do interpretacji

4. Konieczność potwierdzenia wyników laboratoryjnych klinicznie

Czy farmakogenetyka jest juŜ stosowana w praktyce?

w ograniczonym zakresie

• badania wariantów polimorficznych enzymów cytochromu P450 przed zastosowaniem leczenia

• polimorfizm metylotransferazy tiopuryny w leczeniu białaczek u dzieci

• Badanie polimorfizmu syntazy leukotrienu C4 u chorych z nadwraŜliwością na NLPZ

Cele farmakogenetyki

• stworzenie skutecznej i bezpiecznej farmakoterapii

• zdobycie wiedzy umoŜliwiającej przewidzenie indywidualnej odpowiedzi na leki

• właściwe dobranie leków

• indywidualizacja terapii - leki „na miarę”

• obniŜenie kosztów leczenia

Znaczenie farmakogenetyki

Firm farmaceutycznych - badania populacji- tworzenie nowych leków o najmniejszych efektach

uboczny i najlepszych efektach terapeutycznych

- poznanie moŜliwych skutków ubocznych działania leku

Lekarza - moŜliwość właściwego wyboru leku

Społeczeństwa - ograniczenie uŜywania „złych” leków

Pacjenta - właściwa terapia

Cel końcowy - stworzenie genetycznego profilu metabolizmu leków, indywidualnie dla kaŜdego pacjenta

Oporno ść bakterii

Geny oporno ści mog ą być zlokalizowane w:

1. chromosomach

2. plazmidach

3. transpozonach

4. integronach

2011-09-26

11

Oporno ść bakterii

Oporno ść chromosomowa

powstaje na skutek mutacji spontanicznych albo indukowanych mutagenami (UV, promienie X, azotyny)

istotna dla transferu pionowego

Przykłady:E. coli – na chromosomie wykryto geny: eryC (oporność

na erytromycynę), linB (na linkomycynę)

Gronkowiec złocisty – gen bla (na penicylinę)

Oporno ść bakterii

Oporno ść plazmidowa

� najbardziej istotna z punktu widzenia medycyny

� plazmid niekoniugacyjny moŜe zostać ‘przemycony’ razem z koniugacyjnym lub ulec z nim rekombinacji

� pewne plazmidy nie mogą współistnieć w jednej komórce i na tej podstawie zalicza się je do tzw. grup niezgodności (transfer horyzontalny)

� wiele kopii jednego plazmidu w jednej komórce moŜe determinować stopień oporności na dany antybiotyk

transpozaza oporno ść - Tet

transpozaza oporno ść - Amp

Oporno ść bakterii

Oporno ść warunkowana przez transpozony – mobilne fragmenty DNA

� zdolności mutagenne (integracja do chromosomu lub plazmidu)

� waŜne źródło zmienności i nabywania oporności w tym oporności wielolekowej

Oporno ść bakterii

Integrony– mobilne fragmenty DNA

� podobnie jak transpozony są mobilne� stanowią naturalne systemy klonowania i ekspresji

kaset genowych� występują w chromosomach, plazmidach i

transpozonach� super-integrony i integrony oporności wielorakiej –

zawierają kilka kaset

Oporno ść bakterii

kaseta oporność aktywność (enzym)

blaP1, P2, P3oxa1, oxa2 itd.

β-laktamy β-laktamaza

aadA 1a, 1baadA2aadBaacA1aacA4aacC

aminoglikozydy adenylotransferaza aminoglikozydowa

acetylotransferaza aminoglikozydowa

catB2, B3, B5clmA

chloramfenikol acetylotransferaza chloramfenikolowa

dfrA1, A5, A7....dfrB1, B2, B3

trimetoprim redukataza dihydrofolianowa

sat streptotrycyna acetylotransferaza streptotrycynowa

Kasety genowe występujące najczęściej:

β-laktamaza (penicylinaza) – rozkłada wi ązania β-laktamowe penicylinacetylotransferaza aminoglikozydowa (AAC) – modyfikacj a grupy aminowejadenylotransferaza aminoglikozydowa (ANT) – modyfikacj a grupy hydroksylowejfosfotransferaza aminoglikozydowa (APH) – modyfikacja grupy hydroksylowej

Oporno ść bakterii

PODSTAWOWE MECHANIZMY OPORNOŚCI:

1. modyfikacja miejsca działania (uchwytu), np. zmiana w białkach rybosomalnych, prekursorach mureiny, gyrazie)

2. inaktywacja enzymatyczna leku, np. β-laktamaza w β-laktamowych, acetylo-, adenylo- i fosfotransferazy w aminoglikozydach, esteraza w erytromycynie

3. hamowanie transportu do komórki, np. zmiany w budowie błony, pogrubienie mureiny

4. wytwarzanie alternatywnego metabolizmu omijającego hamowany przez antybiotyk proces

5. zwiększenie stęŜenia enzymu hamowanego przez lek, np. reduktaza dihydrofolianowa

6. pompy aktywnie usuwające leki z komórki

7. zmniejszenie aktywności enzymu przeprowadzającego aktywację leku

2011-09-26

12