成像毛细管等电聚焦电泳测定单抗等电点的若干影响因素ywfxzz.yywkt.com/Admin/UploadFile/r4uqvgyj.pdf · 电泳以及等电聚焦等。等电聚焦技术按发明时间顺

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药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2018,38(10) ·1727·

成像毛细管等电聚焦电泳测定单抗等电点的若干影响因素 *

武刚，于传飞，王文波，王兰 **

（中国食品药品检定研究院，卫生部生物技术产品检定及标准化重点实验室，北京 102629）

摘要　目的：评价尿素、聚焦时间、pI 标记物 3 个因素对成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF）测定抗 HER2单抗、抗 VEGF 单抗主峰等电点结果的影响。方法：应用 iCIEF 技术，通过添加尿素（2 mol·L-1），改变聚

焦时间（6、8、10 min）和 pI 标记物的数量（2 个 /6 个），对 2 种单抗制品主峰等电点进行测定。结果：抗

HER2 单抗使用 6 个 pI 标记物，添加终浓度 2 mol·L-1 的尿素，聚焦时间 6、8、10 min，主峰等电点分别为

9.01±0.00、9.02±0.01、9.06±0.01；使用 6 个 pI 标记物，不添加尿素，聚焦时间 6、8、10 min，主峰等电点

分别为 9.07±0.01、9.08±0.01、9.09±0.01；使用 2 个 pI 标记物，主峰等电点范围为 9.00~9.14（含尿素）、

9.04~9.17（不含尿素）。抗 VEGF 单抗使用 6 个 pI 标记物，添加终浓度 2 mol·L-1 的尿素，聚焦时间 6、8、10 min，主峰等电点分别为 8.32±0.00、8.35±0.00、8.35±0.07；使用 6 个 pI 标记物，不添加尿素，聚焦时间

6、8、10 min，主峰等电点分别为 8.39±0.01、8.39±0.02、8.41±0.01；使用 2 个 pI 标记物，主峰等电点范围

为 8.26~8.48（含尿素）、8.34~8.49（不含尿素）。结论：使用 iCIEF 评价所选单抗等电点时，尿素、聚焦时间

两因素对等电点的计算结果影响较小，pI 标记物的选择对等电点的计算结果影响明显。

关键词：单抗；聚焦时间；尿素；pI 标记物；等电点；成像毛细管等电聚焦电泳

中图分类号：R 917　　　文献标识码：A　　　文章编号：0254-1793（2018）10-1727-06doi：10.16155/j.0254-1793.2018.10.09

Several factors on isoelectric point determination of monoclonal antibody by imaging capillary isoelectric

focusing electrophoresis（iCIEF）*

WU Gang，YU Chuan-fei，WANG Wen-bo，WANG Lan**

（National Institutes for Food and Drug Control，Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on

Quality and Standardization of Biotech Products，Beijing 102629，China）

Abstract　Objective：To evaluate the effects of the three factors（urea，focusing time and pI marker） on the determination of the isoelectric points of anti-HER2 and anti-VEGF monoclonal antibody electrophoresis by imaging capillary isoelectric focusing electrophoresis（iCIEF）．Methods：By adding urea（2 mol·L-1），changing the focus

　　 *　国家“重点研发计划”生物安全关键技术研发专项资助项目（2016YFC1200904）

　　**　通信作者　Tel：（010）53852159；E-mail：[email protected]　　　　第一作者　武　刚　Tel：（010）53852178；E-mail：[email protected]　　　　　　　　　于传飞　Tel：（010）53852177；E-mail：[email protected]

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单抗高度的特异性优势使其成为发展最为迅速

的治疗性蛋白药物。单抗类制品的多种翻译后修饰

可导致其电荷异质性，而某些电荷异质性由于对单抗

稳定性及其生物学功能的发挥具有重要影响而成为

关键质量属性（CQA）［1-5］。

单抗电荷异质性的检测技术包括离子色谱、区带

电泳以及等电聚焦等。等电聚焦技术按发明时间顺

序包括平板等电聚焦电泳（Isoelectric focusing，IEF）、

毛细管等电聚焦电泳（capillary isoelectric focusing，

CIEF）和成像毛细管等电聚焦电泳（imaging capillary isoelectric focusing electrophoresis，iCIEF）。IEF、

CIEF、iCIEF 都可以作为表征蛋白质电荷异质性的工

具。最早出现的 IEF 由于存在操作复杂，时间长以

及分辨率相对较低等缺点，已逐渐被新技术所替代；

CIEF 在聚焦完成后需要 1 个额外的移动过程来把毛

细管内聚焦完成的蛋白推到检测器窗口，对于电荷

异质性较为复杂的样品类型，这个移动过程可能造

成样品谱带展宽，变型，出现裂峰，从而影响到样品

的重现性；iCIEF 可对整个毛细管柱进行实时扫描，

克服了常规毛细管聚焦电泳技术谱带展宽变形的问

题。该技术使等电聚焦时间显著缩短，分析结果重

复性改善，已成为蛋白质药物开发领域中产品鉴别、

稳定性监测和表征的工具方法［6-9］，该技术也是治疗

性单抗电荷异质性方面主要的分析方法之一［10-14］。

单抗的主峰、酸性变异体、碱性变异体的等电点不同，

iCIEF 可通过测定不同变异体的等电点来评价其电荷

异质性。

单抗的实测等电点一般与理论值有一定的差异，

单抗等电点的测定值是基于所使用等电点标记物的

回归计算；另外尿素为常用的添加剂，可增加蛋白溶

解性，以避免聚焦过程中蛋白的凝聚沉淀；聚焦时间

也为本技术的重要参数。

本研究利用 iCIEF 技术分析了常用添加剂（尿

素）、聚焦时间对所选单抗等电点赋值结果，并比较了

采用 2 个 /6 个 pI 标记物对抗 HER2 单抗、抗 VEGF单抗主峰等电点赋值结果差异情况，为生物药研发企

业对单抗等电点的标准制定及质量控制提供参考。

1　仪器与试剂

1.1　仪器

配备有自动进样器的毛细管等电点聚焦分析仪

（iCE280 Analyzer），购自 Protein Simple；FC 涂层 cIEF柱（5 cm×100 μm，货号 101701）购自 ProteinSimple；

自动进样玻璃瓶（250 μL）和自动进样瓶（4 mL）购

自 ProteinSimple。

1.2　单抗及主要试剂

单抗为抗 HER2 单抗、抗 VEGF 单抗，实验室留

样；尿素（货号 JT4206-1）购自 JT Baker；载体两性电解

质 Pharmalyte 3-10（货号 17-0456-01）购自 GE Healthcare；pI 标记物 4.22（货号 102350）、5.12（货号 102224）、6.14

（货号 102220）、7.05（货号 102226）、9.50（货号 101996）、

9.77（货号 102219），1% 甲基纤维素（MC）溶液（货号

101876），0.5% 甲基纤维素（MC）溶液（货号 102505），

time（6，8，10 min），and the number of pI markers（2/6），the iCIEF technique was applied to determine the isoelectric points of two monoclonal antibody products. Results：The anti-HER2 monoclonal antibody used 6 pI markers，and added urea with a final concentration of 2 mol·L-1. The focusing time was 6，8 and 10 min，and the isoelectric points of the main peak were 9.01±0.00，9.02±0.01，9.06±0.01，respectively. Six pI markers were used without urea，the focusing time was 6，8，10 minutes，and the main peak isoelectric points were 9.07±0.01，9.08±0.01，9.09±0.01，

respectively. Using two pI markers，the pI ranges were 9.00-9.14 （with urea） and 9.04-9.17 （without urea）. The anti-VEGF antibody used 6 pI markers，and added urea with a final concentration of 2 mol·L-1. The focusing time was 6，

8 and 10 min，the main peak isoelectric points were 8.32±0.00，8.35±0.00，8.35±0.07. Six pI markers were used and no urea was added. The focusing time was 6，8，and 10 min，and the main peak isoelectric points were 8.39±0.01，

8.39±0.02，8.41±0.01，respectively. Using two pI markers，the pI ranges were 8.26-8.48 （with urea） and 8.34-8.49 （without urea ）. Conclusion：When iCIEF is used to evaluate the isoelectric point of the monoclonal antibody，the two factors，urea and focusing time have little influence on the calculation of isoelectric point，and the selection of pI markers has obvious influence on the calculation results of isoelectric point..Keywords：monoclonal antibody；urea；pI marker；focusing time；isoelectric point；iCIEF



电解液套件（货号 102506），iCE 系统适用性套件（货号

102093），均购自 Protein Simple。

2　实验方法

2.1　抗 HER2 单抗等电点影响因素分析

2.1.1　单抗处理

将单抗用超纯水稀释至 1 mg·mL-1。

2.1.2　供试品溶液制备

2.1.2.1　含尿素的供试品溶液　将 50 μL 抗体与

70 μL 的 1% 甲基纤维素，各 1 μL 的 pI 标记物 4.22、pI标记物 5.12、pI 标记物 6.14、pI 标记物 7.05、pI 标记物

9.50、pI 标记物 9.77，8 μL 的 Pharmalytes 3-10，50 μL的 8 mol·L-1 尿素和 16 μL 超纯水混匀，12 000 r·min-1

离心 5 min，即得。

2.1.2.2　不含尿素的供试品溶液　将 50 μL 抗体与

70 μL 的 1% 甲基纤维素，各 1 μL 的 pI 标记物 4.22、

pI 标记物 5.12、pI 标记物 6.14、pI 标记物 7.05、pI 标

记物 9.50、pI 标记物 9.77，8 μL 的 Pharmalytes 3-10，

66 μL 超纯水混匀，12 000 r·min-1 离心 5 min，即得。

2.2　抗 VEGF 单抗等电点影响因素分析

2.2.1　单抗处理

同“2.1.1”项。

2.2.2　供试品溶液制备

同“2.1.2”项。

2.3　成像毛细管等电聚焦电泳分析条件

预聚焦电压 1.5 kV，持续 1 min；聚焦电压 3 kV，

持续 6 min/8 min/10 min，样品管理器温度设置为 8 ℃。

3　结果

3.1　抗 HER2 单抗等电点影响因素分析结果

3.1.1　聚焦时间对等电点赋值的影响

利用 6 个 pI 标记物像素值做线性回归（R2≥ 0.990），

计算不同聚焦时间对单抗主峰 pI 的影响，结果见表

1，聚焦时间分别为 6、8、10 min，等电点测定结果差

异≤ 0.05 pI 单位，对等电点最终赋值结果影响较小。

表 1　不同聚焦时间的抗 HER2 单抗主峰 pI 值（n=3）

Tab. 1　Main peak pI value of anti-HER2 mab by

different focusing timepI

聚焦时间

（focusing time）/min含尿素单抗主峰

（mab main peak with urea ）不含尿素单抗主峰

（mab main peak without urea）6 9.01±0.00 9.07±0.01

8 9.02±0.01 9.08±0.01

10 9.06±0.01 9.09±0.01

以 280 nm 下吸收值为纵坐标，以像素值为横

坐标，抗 HER2 单抗叠加含尿素 / 不含尿素，聚焦 10 min 的成像毛细管等电聚焦图谱见图 1，谱图基本

一致。

A. 含尿素（with urea，2 mol·L-1），6 个 pI 标记物（six pI markers），聚焦电压（focusing voltage） 3 kV，聚焦时间（focusing time ）10 min B. 无尿素（without urea），6 个 pI 标记物（six pI markers），聚焦电压（focusing voltage） 3 kV，聚焦时间（focusing time） 10 min 图 1　抗 HER2 单抗添加尿素 / 不添加尿素 , 在聚焦 10 min 时的成像毛细管等电聚焦叠加图谱

Fig. 1　Anti-HER2 mab with/without urea，iCIEF overlapping map focusing on 10 min



3.1.2　利用 2 个 pI 标记物计算单抗主峰 pI 值

添加 2 mol·L-1 尿素，10 min 聚焦，不同的 pI标记物组合所测得的抗 HER2 单抗的等电点最小

为 9.00，最大为 9.14，差异达到 0.14；无尿素添加，

10 min 聚焦，不同的 pI 标记物组合所测得的抗 HER2单抗的等电点最小为 9.04，最大为 9.17，差异达到

0.13。见表 2。表 2　不同 pI 标记物组合计算抗 HER2 单抗主峰 pI 值（n=3）

Tab. 2　Calculate pI value of anti-HER2 mab main

peak by combination of different pI markerspI

pI 标记物组合

（combination of pI markers）

含尿素单抗主峰

（mab main peak with urea）

不含尿素单抗主峰

（mab main peak without urea）

4.22，9.50 9.04±0.04 9.06±0.00

5.12，9.50 9.03±0.05 9.07±0.02

6.14，9.50 9.04±0.05 9.08±0.01

7.05，9.50 9.00±0.06 9.04±0.00

4.22，9.77 9.14±0.04 9.14±0.00

5.12，9.77 9.13±0.04 9.14±0.01

6.14，9.77 9.13±0.05 9.17±0.01

7.05，9.77 9.07±0.06 9.10±0.01

3.2　抗 VEGF 单抗等电点影响因素分析结果

3.2.1　聚焦时间对等电点赋值的影响

利用 6 个 pI 标记物像素值做线性回归（R2≥ 0.990），

计算不同聚焦时间对单抗主峰 pI 的影响，结果见表

3，聚焦时间分别为 6、8、10 min，等电点测定结果差

异≤ 0.05 pI 单位，对等电点最终赋值结果影响较小。

表 3　不同聚焦时间的抗 VEGF 单抗主峰 pI 值（n=3）

Tab. 3　Main peak pI value of anti-VEGF mab at

different focusing time

pI

聚焦时间

（focusing time）/min

含尿素单抗主峰




6 8.32±0.00 8.39±0.01

8 8.35±0.00 8.39±0.02

10 8.37±0.01 8.41±0.01

以 280 nm 下吸收值为纵坐标，以像素值为横坐

标，抗 VEGF 单抗叠加含尿素 / 不含尿素，聚焦 10 min的成像毛细管等电聚焦图谱见图 2，可见谱图峰形基

本一致。

A. 含尿素（with urea，2 mol·L-1），6 个 pI 标记物（six pI markers），聚焦电压（focusing voltage） 3 kV，聚焦时间（focusing time ）10 min B. 无尿素（without urea），6 个 pI 标记物（six pI markers），聚焦电压（focusing voltage） 3 kV，聚焦时间（focusing time） 10 min 图 2　抗 VEGF 单抗添加尿素 / 不添加尿素，在聚焦 10 min 时的成像毛细管等电聚焦叠加图谱

Fig. 2　Anti-VEGF mab with/without urea，iCIEF overlapping map focusing on 10 min



3.2.2　利用 2 pI 标记物计算单抗主峰 pI 值

添加 2 mol·L-1 尿素，10 min 聚焦，不同的 pI标记物组合所测得的抗 VEGF 单抗的等电点最小

为 8.26，最大为 8.48，差异达到 0.22；无尿素添加，

10 min 聚焦，不同的 pI 标记物组合所测得的抗 VEGF单抗的等电点最小为 8.34，最大为 8.49，差异达到

0.15。见表 4。

表 4　不同 pI 标记物组合计算抗 VEGF 单抗主峰 pI 值（n=3）

Tab. 4　Calculate pI value of anti-VEGF mab main

peak by combination of different pI markers

pI

聚焦时间

（focusing time）/min含尿素单抗主峰




4.22，9.50 8.39±0.01 8.39±0.02

5.12，9.50 8.36±0.01 8.40±0.02

6.14，9.50 8.37±0.00 8.43±0.02

7.05，9.50 8.26±0.01 8.34±0.02

4.22，9.77 8.48±0.02 8.46±0.02

5.12，9.77 8.45±0.01 8.47±0.03

6.14，9.77 8.45±0.01 8.49±0.03

7.05，9.77 8.32±0.00 8.39±0.03

4　讨论

蛋白质的等电点是其内在属性之一，其定义为

蛋白质带电荷为零时的 pH。一级序列的各氨基酸的

pKa 值为蛋白质理论等电点的计算基础，所以要计算

其理论等电点，应知晓其氨基酸序列。由于蛋白质理

论计算的等电点首先假设蛋白质为无规则卷曲结构，

不能反映氨基酸间的空间结构关系，同时，氨基酸的

pKa 值也取决于其周围环境，如疏水性等，所以实测

的等电点与理论计算值是有差异的。

蛋白质绝对等电点的实测方法有多种，如利用

阳离子去垢剂可沉淀带负电荷的蛋白质，但是这些方

法操作烦琐，而且不能反映蛋白质的电荷异质性全

景图。质控中所应用的 IEF、CIEF、iCIEF 方法，蛋白

质等电点的计算依赖于 2 个或多个 pI 标记物的回归

计算，所以所测得的等电点依赖于所用的 pI 标记物

所标注等电点的准确性，在本研究中，2 个不同的 pI标记物组合所测得的抗 HER2 单抗的等电点差异最

大为 0.14，而对于抗 VEGF 单抗，其差异达到最大为

0.22。虽然针对文中所用的 6 个 pI 标记物组合所做

的回归曲线相关系数良好，但是不同的 2 个 pI 标记

物组合所测得的等电点相差还是比较大，可见所实测

的蛋白质等电点仍为相对于 pI 标记物的 pI 值。因

此，应用 iCIEF 评价同一个抗体制品的等电点，在方

法开发、批间一致性评价、放行等阶段应采用相同的

pI 标记物组合。

在等电聚焦过程中蛋白质的沉淀为常见现象，这

是由于在蛋白质等电聚焦过程中蛋白质的高度浓缩

易使蛋白质发生聚集，可导致谱图异常和不可重复。

尿素为常见的非离子型去垢剂，在≤ 4 mol·L-1 的浓

度下，可有效解离蛋白质的非共价键连接，从而防止

蛋白质的聚集和沉淀。本文中所研究的 2 个单抗对

象在未加尿素的情况下并未产生聚集和谱图异常，所

以是研究尿素添加对等电点影响的良好实例。本研

究结果表明，对于文中所述的 2 个单抗研究对象，添

加尿素对实测的等电点数值影响并不大。

聚焦时间也是 iCIEF 实验过程中的重要参数之

一，聚焦为动态过程，理论上蛋白质到达其等电点位

置不再移动，谱图表现为峰形固定。本研究中比较

了 6 min（峰形已固定）、8 min、10 min 对于等电点测

定的影响，结果表明三者相差很小，证明对文中的抗

HER2 单抗与抗 VEGF 单抗来说，6 min 即已完成异

构体的聚焦分离，延长聚焦时间对等电点计算并没有

显著影响。同时需要注意，因聚焦过程是在高电压条

件下，过度延长聚焦时间将加大样品凝聚沉淀的可能

性。因此，聚焦时间的确定以峰形不再发生变化为

准，峰形固定后可判定完成了电荷异构体的分离并可

进行相对等电点的计算。

综上所述，利用 iCIEF 所测得的单抗等电点为

相对值，依赖于所采用的实验系统（iCIEF 检测仪器；

pI 标记物组合的选择；两性电解质等其他试剂），尤

其是所采用的 pI 标记物，并不能十分准确地反映其

理论值或者真实值，所以应充分理解通过 iCIEF 所测

得 pI 值的含义。在单抗的放行检测中，由于参比品

经过充分的表征，作者认为在同一体系和序列中，用

iCIEF 所测得的样品与参比品等电点差值评价二者

的差异更合理，若二者差异在所制定的合理范围内，

并且谱图一致，可认为样品与参比品一致。生物类似

药的等电点鉴别也是如此，因并不知道原研药采用的

实验系统，所以更不能直接使用其质量标准中的等电

点值。

由于单抗制品高度复杂的异质性，其质控需要组



合多种理化分析技术对其进行检测。iCIEF 为单抗制

品的电荷异质性分析提供了一个快速、灵敏的选择，对

保证单抗类生物技术药物生产工艺的稳定性及控制其

质量和提高质量标准均具有重要意义［15］。对于其结果

的判定应认识到，其等电点的测定为相对值，对质量标

准的设定和判定标准应有科学理性的认识。

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（本文于 2017 年 12 月 1 日收到）

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