こんにゃく飛粉糖化液による新たな生産培養技術 - …...(Amano Enzyme, 32,000 units/g) 60oC, 18 hr inactivated at 70oC Tobiko hydrolyzate コンニャク（蒟蒻芋）

新技術説明会 JST 本部別館ホール

平成30（2018）年 2 月6日（火） 13：00 ～ 16：00

群馬工業高等専門学校

一般教科（自然科学）教授宮越俊一

こんにゃく飛粉糖化液による新たな生産培養技術

こんにゃく飛粉の糖化液と培養資源としての検討

1. 飛粉とは?

2. 飛粉の発酵生産への応用

3. 飛粉糖化液の調製

4. 飛粉糖化液の乳酸生産への応用

5. 飛粉糖化液のダプトマイシン生産への応用

6. まとめ

Amorphophallus konjac

Seiko

精粉Tobiko

飛粉

Arako 荒粉

O

HH

H

O

OH

H OH

H

OH

O

H

OHH

H

OHOH

H H

OH

O

H

HH

H

O

OH

H CH2OCOCH3

OH

O

H

OHH

H

OOH

H H

OH

O

H

HH

H

OOH

H OH

OH

O

H

HH

H

OOH

H OH

OH

O

H

OHH

H

O

O

H H

OH

O

H

OHH

H

OOH

H H

OH

O

H

OHH

H

OOH

H H

OH

OO

H

OHH

H

OOH

H H

OHGlc Glc

GlcMan

Man Man Man Man ManAcGlc

Typical partial structure of

glucomannan

１．飛粉とは？

sliced and dried

Composition of Tobiko powder

starch

31%

unknown

sugars

13%

cellulose

7%

glucomannan

14%

others

35%

Cupriavidus necator

NBRC 102504

二槽式培養器による培養

有機酸生産

飛粉

PHB

酵素や微生物による処理

発酵

L−乳酸

これまでの取り組み

Minerals

1 g of culture broth

↓ treated at 150oC for 16 hr

ash (mg)

SugarsHPLC analysis using Alliance HPLC

system (Waters)

Column: ULTRON PS-80N

(Shimazu GLC)

Solvent: water

Temp. : 60oC

Flow rate: 0.6 mL/min

Detector: RI

Protein

sample

↓ Macro Kjeldahl method

with Kjeltec (Foss Japan)

Lipid

Sample

↓ Soxhlet extractor

with Soxtec 2055 (Foss Japan)

各種分析方法

Cell weight



dried cell weight (mg)

Brix (soluble sugar conc.)

sample

↓ measurement of refractive

index

↓ determined by ICUMSA

concentrarion (%)

Minerals



ash (mg)

SugarsHPLC analysis using Alliance HPLC system

(Waters)

Column: ULTRON PS-80N

(Shimazu GLC)

Solvent: water

Temp. : 60oC


Detector: RI

Total sugar amount (g)

= solid weight ― (protein* ＋ lipid**)

* protein：modified Macro Kjeldahl method with Kjeltec (Foss Japan)

** lipid ： Soxhlet extraction with Soxtec 2055 (Foss Japan)

各種分析方法

Cell weight



dried cell weight (mg)

Brix (soluble sugar conc.)

sample

↓ measurement of refractive

index

↓ determined by ICUMSA

concentrarion (%)

２．飛粉糖化液のアミノ酸組成(mg/100mL)

0

100

200

300

400

500

Arg Lys His Phe Tyr Leu Ile Met Val Ala Gly Pro Glu Ser Thr Asp Trp Cys

Lot131202

Lot 151221

Lot 160107

0

5

10

15

20

25

Arg Lys His Phe Tyr Leu Ile Met Val Ala Gly Pro Glu Ser Thr Asp Trp Cys

Tobiko

Casein

Soy bean

(%)

Cupriavidus necator

NBRC 102504

3days

Cupriavidus nacator を用いた飛粉からの生分解ポリマー (PHB) の生産例

poly 3-hydroxybutyrate

(PHB)

セルロース・飛粉cellulase and/or amylase

C. necator

glucose

celluloce, starchC.necator

accumulating PHB


1. 飛粉とは?





6. まとめ

Konjac

Dried konjac slice

Seiko

turbine mixer

turbo mill

roller mill

sliced

dried

cyclone separator

Tobiko

Tobiko 250 g

← 6 x vol. waterpH 6.3 adjusted with Ca(OH)2

39 units/g KLEISTASE T10S(Amano Enzyme, 13,100 units/g)

90oC, 60 min

121oC, 15 min

180 units/g SUMIZYME LP50D

(Shin Nippon Biomedical Laboratories,

90,000 units/g)

pH 4.0, 40oC, 30 min

96 units/g DIZYME GPK(Amano Enzyme, 32,000 units/g)

60oC, 18 hr

inactivated at 70oC

Tobiko hydrolyzate

コンニャク（蒟蒻芋）Amorphophallus konjac

３．飛粉糖化液の調製法

予備検討項目

飛粉糖化液の発酵生産への応用検討

酵母 (Saccharomyces)

枯草菌・納豆菌 (Bacillus )

乳酸発酵 (Lactococcus, Lactobacillus )

クエン酸発酵 (Aspergillus, Yarrowia )

リポペプチド系抗生物質 (Streptomyces )


1. 飛粉とは?





6. まとめ

Lactococcus lactis subsp.lactis NBRC12007

Precultured

37oC, 220 rpm, 1 dayBasal medium

Ingredient (%)

Yeast extract (Bacto) 0.5

KH2PO4 0.025

K2HPO4 0.025

MgSO4・7H2O 0.002

FeSO4・7H2O 0.02

3% seed

Production culture

37oC, 220 rpm, 3 days

2 % glucose

1 % Tobiko hydrolyzate

0.25 % CaCO3

Culture broth

Diluted with 9 x vol. water

Centrifuged at 3,000～8,000 x g

for 5 min

HPLC analysis

４-１．乳酸生産性に対する飛粉糖化液の添加効果

HPLC conditions

Chromaster series (Hitachi)

Column: Aminex HPX-87H

(Bio-Rad)

Solvent: 4 mM H2SO4

Temp. : 40oC


Detector: UV(220nm)

Lactococcus lactis

subsp. lactis NBRC 12007

４-２．乳酸生産における飛粉糖化液の添加効果

0

2

4

6

8

10lactic acid (%)

0

2

4

6

8

lactic acid (%)

４-3．乳酸生産における飛粉の添加効果

0

2

4

6

8

lactic acid (%)


1. 飛粉とは?





6. まとめ

5．S. roseosporus によるダプトマイシン生産に及ぼす飛粉糖化液の添加効果

Strepromyces roseosporus

ATCC 31568

Daptomycins

・lipopeptide 系抗生物質 CUBICINTM

・MRSA を含む多剤耐性菌に有効

Structure of daptomycins

Streptomyces roseosporus ATCC 31568

Seed culture

at 28oC, 220 rpm, for 3 days

Seed cultue medium

Ingredient (%)

soytone (Bacto) 3.0

corn starch 2.5

5% seed

Production culture


0.3 % Tobiko hydrolyzate

0.25 % CaCO3

Culture broth

washed with water

eluted with 80% acetone

redissolved in MeOH

HPLC analysis

Production medium

Ingredient (%)

corn starch 3.0

KCl 0.15

Na2SO4 0.14

aspartic acid 0.13

Sep-pak C18 cartridge (Waters)

５-1．ダプトマイシン生産における飛粉糖化液の効果

Streptomyces roseosporus ATCC 31568

Seed culture


5% seed

Production culture


0.3 % Tobiko hydrolyzate

0.25 % CaCO3

Culture broth

washed with water

eluted with 80% acetone

redissolved in MeOH

HPLC analysis

Production medium

Ingredient (%)

corn starch 3.0

KCl 0.15

Na2SO4 0.14

aspartic acid 0.13

Sep-pak C18 cartridge (Waters)

５-２．ダプトマイシン生産における飛粉糖化液の効果

HPLC conditions

Chromaster 5000 series (Hitachi)Column: ODS-120T (4.6 x 150

mm , Tosoh)

Solvent: water : CH3CN :

(NH4)3PO4 (65 : 35 : 1)

Temp. : 40oC


Detector: UV(280nm)

0

20

40

60

80

100

daptomycin (μg/ml)515

５-３.S. roseosporus によるダプトマイシン生産に対する飛粉糖化液の効果

まとめ

1. 飛粉糖化液の調製方法を確立した。.

2. 飛粉糖化液の乳酸生産，ダプトマイシン生産に対する添加効果を確認した。

3. ダプトマイシン生産性は飛粉糖化液およびトリプトファンの添加により，相乗的高まり 515 μg / mL に達した。

4. 飛粉糖化液の微生物培養への応用の可能性が示された。

※ 本発表内容につきましては，２件の特許出願済みです。

本技術に関する知的財産権

発明の名称：①乳酸菌生育促進剤、その製造方法、及びそれを用いた

乳酸の製造方法

②ペプチド系抗生物質の生産用培地、及びそれを用いた

ペプチド系抗生物質の製造方法

出願番号：①特願 2017-036653

②特願 2017-036650

出願人：独立行政法人国立高等専門学校機構

群栄化学工業株式会社

雪国アグリ株式会社

発明者：宮越俊一

お問い合わせ先


一般教科（自然科学）教授

宮越俊一

ＴＥＬ 027-254-9122

ＦＡＸ 027-254-9115

e-mail [email protected]


総務課研究推進・地域連携係

ＴＥＬ 027-254-9009

ＦＡＸ 027-254-9045

e-mail [email protected]

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こんにゃく飛粉糖化液による 新たな生産培養技術 - …...(Amano Enzyme, 32,000 units/g) 60oC, 18 hr inactivated at 70oC Tobiko hydrolyzate コンニャク（蒟蒻芋）

こんにゃく飛粉糖化液による新たな生産培養技術 - …...(Amano Enzyme, 32,000 units/g) 60oC, 18 hr inactivated at 70oC Tobiko hydrolyzate コンニャク（蒟蒻芋）