Ferdinanda Aguilera Molinaproductividad.cimav.edu.mx/productividad/adjuntos... · Tabla 4. Concentraciones microbianas de los inóculos. .....66 Tabla 5. Concentraciones Mínimas

Santiago de Querétaro, Qro., México, marzo del 2018.

CENTRO DE INVESTIGACION Y DESARROLLO TECNOLÓGICO EN ELECTROQUÍMICA, S.C.

EFECTO DEL AGENTE ESTABILIZANTE EN LAS PROPIEDADES

MORFOLÓGICAS, ANTIMICROBIANAS Y CITOTÓXICAS DE

NANOPARTICULAS DE AgBr

Tesis

QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADEMICO DE

Maestro en Ciencia y Tecnología

en la Especialidad de Ingeniería Ambiental

PRESENTA

Ferdinanda Aguilera Molina

Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico en

Electroquímica

REALIZADO POR:

ING. FERDINANDA AGUILERA MOLINA

DIRIGIDO POR:

DR. WALTER NOÉ VELÁZQUEZ ARJONA

Y CO-DIRIGIDO POR:

DRA. LORENA ÁLVAREZ CONTRERAS (CIMAV)

SINODALES

Dr. Francisco Javier Rodríguez Valadez

Presidente Firma

Dr. Abraham Ulises Chávez Ramírez

Secretario Firma

Dr. Ernesto Alonso Beltrán Partida

Vocal Firma

Dr. Francisco M. Cuevas Muñiz

Suplente Firma

Este trabajo se realizó en el Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico en Electroquímica

(CIDETEQ) bajo la dirección del Dr. Walter Noé Velázquez Arjona con financiamiento otorgado para

el desarrollo de esta investigación a través del proyecto CONACYT-SENER-Sustentabilidad

Energética INNOVATE UK proyecto 269546.

ÍNDICE GENERAL

RESUMEN ................................................................................................................................. 1

ABSTRACT ............................................................................................................................... 2

AGRADECIMIENTOS............................................................................................................. 3

INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 6

JUSTIFICACIÓN ...................................................................................................................... 7

HIPÓTESIS ................................................................................................................................ 8

OBJETIVOS .............................................................................................................................. 9

A. Objetivo general ............................................................................................................... 9

B. Objetivos específicos ....................................................................................................... 9

CAPÍTULO I. ANTECEDENTES ......................................................................................... 11

SECCIÓN 1. Resistencia microbiana ................................................................................... 13

1. Agentes antimicrobianos ............................................................................................. 13

2. Resistencia microbiana ............................................................................................... 13

3. Nanopartículas de AgBr como alternativa .................................................................. 14

SECCIÓN 2. Nanopartículas ................................................................................................ 16

1. Definición ................................................................................................................... 16

2. Método de reducción química para la síntesis ............................................................ 16

3. Técnicas de caracterización ........................................................................................ 24

SECCIÓN 3. Microbiología y biología celular..................................................................... 29

1. Microbiología .............................................................................................................. 29

2. Biología celular ........................................................................................................... 33

CAPÍTULO II. METODOLOGÍA ........................................................................................ 35

1. Síntesis de las nanopartículas de AgBr .......................................................................... 38

2. Caracterización de las nanopartículas de AgBr ............................................................. 41

a. Difracción de Rayos-X ............................................................................................... 41

b. Microscopía de Transmisión Electrónica .................................................................... 42

c. Microscopía de Barrido de Electrones de Emisión de Campo ................................... 42

d. Espectrometría de Dispersión de Energía ................................................................... 43

e. Análisis Termogravimétrico ˗ Calorimetría Diferencial de Barrido ........................... 43

f. Potencial Zeta.............................................................................................................. 44

g. Espectrometría de Absorbancia de Luz UV˗Vis ......................................................... 44

3. Actividad antimicrobiana ............................................................................................... 45

a. Determinación de la CMI ............................................................................................ 45

b. Determinación de la CMB .......................................................................................... 48

c. Observación microfotográfica .................................................................................... 48

4. Evaluación de la citotoxicidad ....................................................................................... 49

CAPÍTULO III. RESULTADOS ........................................................................................... 51

1. Caracterización de las nanopartículas de AgBr ............................................................. 53

a. Difracción de Rayos˗X ............................................................................................... 53

b. Microscopía de Transmisión Electrónica .................................................................... 54

c. Microscopía de Barrido de Electrones de Emisión de Campo ................................... 58

d. Espectrometría de Dispersión de Energía ................................................................... 60

e. Análisis Termogravimétrico ˗ Calorimetría Diferencial de Barrido ........................... 62

f. Potencial Zeta.............................................................................................................. 64

g. Espectrofotometría de Absorbancia de Luz UV˗Vis .................................................. 65

2. Actividad antimicrobiana ............................................................................................... 66

a. Determinación de la CMI ............................................................................................ 66

b. Determinación de la Concentración Mínima Biocida ................................................. 69

c. Observación microfotográfica .................................................................................... 70

3. Evaluación de la citotoxicidad ....................................................................................... 74

CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES ....................................................................................... 75

SECCIÓN I. Sobre el efecto del agente estabilizante en la síntesis de las AgBr NPs ......... 76

SECCIÓN II. Sobre el efecto del agente estabilizante de las AgBr NPs en su actividad

antimicrobiana ................................................................................................................ 76

SECCIÓN III. Sobre el efecto del agente estabilizante de las AgBr NPs en su citotoxicidad

76

CAPÍTULO V. APÉNDICE ................................................................................................... 77

CAPÍTULO VI. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................... 83

ÍNDICE DE FIGURAS

CAPÍTULO I. ANTECEDENTES

Fig. 1 Diagrama de LaMer: Grado de saturación en relación al tiempo. .................................. 18

Fig. 2 Tipo de estabilidad de los agentes estabilizantes: a) PVP, estérica; b) CTAB,

electroestática positiva; c) SDS, electrostática negativa. .......................................................... 22

Fig. 3 Molécula de PVP, polímero no iónico. ........................................................................... 23

Fig. 4 Molécula de CTAB, surfactante catiónico. ..................................................................... 23

Fig. 5 Molécula de SDS, surfactante aniónico. ......................................................................... 24

Fig. 6 Diferencias estructurales en la pared celular de bacterias Gram positivas y Gram

negativas. ................................................................................................................................... 30

Fig. 7 Esquema de la pared celular de una levadura. ................................................................ 31

Fig. 8 Metodología del proyecto................................................................................................ 37

Fig. 9 Reactivos empleados en la síntesis de las AgBr NPs ...................................................... 38

Fig. 10 Esquema del sistema de síntesis. ................................................................................... 39

Fig. 11 Coloraciones de las soluciones de síntesis con PVP, CTAB y SDS. ............................ 40

Fig. 12 Instalaciones de CIMAV y CIDETEQ-Tijuana. ........................................................... 41

Fig. 13 Equipo de XRD, Bruker, D8 Advance .......................................................................... 41

Fig. 14 Equipo TEM, HITACHI, HT7700. ............................................................................... 42

Fig. 15 FE-SEM, JEOL JSM-7401F ........................................................................................ 42

Fig. 16 SEM, ZEISS EVO-MA15 ............................................................................................. 43

Fig. 17 Equipo de TGA˗DSC, TA Instruments, SDT˗Q600 ..................................................... 43

Fig. 18 Equipo para medir Potencial Zeta, Horiba Scientific, SZ˗100 ...................................... 44

Fig. 19 Espectrofotómetro Thermo Scientific, Varioskan Lux ................................................. 44

Fig. 20 Metodología de diluciones seriadas. ............................................................................. 46

Fig. 21 Inoculación de las dispersiones de los agentes antimicrobianos. .................................. 47

Fig. 22 Resiembra en medio de cultivo libre de agente antimicrobiano. .................................. 48

Fig. 23 Difractogramas de las AgBr NPs sintetizadas con PVP, SDS y CTAB. ...................... 53

Fig. 24 Micrografía TEM de AgBr NPs sintetizadas con CTAB. ............................................. 55

Fig. 25 Micrografía TEM de AgBr NPs sintetizadas con SDS. ................................................ 56

Fig. 26 TEM de AgBr NPs sintetizadas con PVP. .................................................................... 57

Fig. 27 Micrografía FE-SEM de AgBr NPs sintetizadas con CTAB. ....................................... 58

Fig. 28 Micrografía FE-SEM de AgBr NPs sintetizadas con SDS. .......................................... 59

Fig. 29. Micrografía FE-SEM de AgBr NPs sintetizadas con PVP. ......................................... 59

Fig. 30 Espectro EDS elemental de AgBr NPs sintetizadas con CTAB, en el inserto se indican

las zonas analizadas. .................................................................................................................. 60

Fig. 31 Espectro EDS elemental de AgBr NPs sintetizadas con SDS, en el inserto se indican


Fig. 32 Espectro EDS elemental de AgBr NPs sintetizadas con PVP, en el inserto se indican


Fig. 33 Termograma de AgBr NPs sintetizadas con PVP. ........................................................ 62

Fig. 34 Termograma de AgBr NPs sintetizadas con SDS. ........................................................ 63

Fig. 35 Termograma de AgBr NPs syntetizadas con CTAB. .................................................... 63

Fig. 36 Potencial ζ de las AgBr NPs sintetizadas con PVP, CTAB y SDS. .............................. 64

Fig. 37 Espectros de absorbancia de luz UV˗Vis de AgBr NPs sintetizadas con PVP, CTAB y

SDS. ........................................................................................................................................... 65

Fig. 38 Instalaciones UABC, Facultad de Odontología.. .......................................................... 66

Fig. 39 Gráficas de la concentración microbiana de a) E. coli, b) S. aureus y c) C. albicans

después de un ciclo de incubación en presencia de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB ...... 67


después de un ciclo de incubación en presencia de las AgBr NPs sintetizadas con SDS ......... 68


después de un ciclo de incubación en presencia de las AgBr NPs sintetizadas con PVP. ........ 68

Fig. 42 Crecimiento microbiano después de un ciclo de incubación en medio de cultivo libre

de AgBr NPs. ............................................................................................................................. 69

Fig. 43 Micrografías FE-SEM de E. coli a) sin exposición a NPs y en presencia de AgBr NPs

sintetizadas con b) CTAB, c) PVP y d) SDS. ............................................................................ 71

Fig. 44 Micrografías FE-SEM de S. aureus a) sin exposición a NPs y en presencia de AgBr

NPs sintetizadas con b) CTAB, c) PVP y d) SDS. .................................................................... 72

Fig. 45 Micrografías FE-SEM de C. albicans a) sin exposición a NPs y en presencia de AgBr

NPs sintetizadas con b) CTAB, c) PVP y d) SDS. .................................................................... 73

Fig. 46 Gráfica de concentraciones ascendentes de AgBr NPs sintetizadas con CTAB contra

viabilidad celular. ...................................................................................................................... 74

Fig. 47 Gráfica de concentraciones ascendentes de AgBr NPs sintetizadas con SDS contra


Fig. 48 Gráfica de concentraciones ascendentes de AgBr NPs sintetizadas con PVP contra


CAPÍTULO IV. APÉNDICE

Fig. 49 Esquema de una celda unitaria. ..................................................................................... 78

ÍNDICE DE TABLAS


Tabla 1. Resumen de trabajos relacionados a nanomateriales de AgBr, con distintas variables y

efectos evaluados. ...................................................................................................................... 20

CAPÍTULO II. METODOLOGÍA

Tabla 2. Concentraciones microbianas de los inóculos. ............................................................ 47

CAPÍTULO III. RESULTADOS

Tabla 3. Composición atómica de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB, SDS y PVP como

agentes estabilizantes. ................................................................................................................ 61

Tabla 4. Concentraciones microbianas de los inóculos. ............................................................ 66

Tabla 5. Concentraciones Mínimas Inhibitorias de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB, SDS

y PVP evaluadas contra E. coli, S. aureus y C. albicans........................................................... 67

Tabla 6. Concentraciones Mínimas Biocidas de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB, SDS y

PVP evaluadas contra E. coli, S. aureus y C. albicans.............................................................. 69

CAPÍTULO IV. APÉNDICE

Tabla 7. Sistemas cristalinos y redes de Bravais. ...................................................................... 78

Tabla 8. Ecuaciones de distancia interplanar para siete sistemas cristalinos. ........................... 82

1

RESUMEN

En este trabajo se sintetizaron nanopartículas de AgBr (AgBr NPs) mediante un método de

reducción química evaluando el efecto de difertentes agentes estabilizantes:

Polivinilpirrolidona (PVP), Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB) y Dodecilsulfato de

Sodio (SDS). Las nanopartículas sintetizadas se caracterizaron mediante Difracción de Rayos-

X (XRD), Microscopía de Transmisión Electrónica (TEM), Microscopía de Barrido de

Electrones de Emisión de Campo (FE-SEM), Espectrometría de Dispersión de Energía (EDS),

Análisis Termogravimétrico-Calorimetría Diferencial de Barrido (TGA-DSC), Potencial Zeta

y Espectrofotometría de Absorbancia de Luz UV-Vis. El efecto de la variación del agente

estabilizante se analizó no sólo en las características morfológicas de las AgBr NPs, sino

también a través de los cambios en la actividad antimicrobiana probada sobre Escherichia coli

(bacteria Gram negativa), Staphylococcus aureus (bacteria Gram positiva) y Candida albicans

(levadura). A partir de este estudio se determinó que, las nanopartículas sintetizadas con

CTAB manifestaron mayor actividad, resultando su Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)

en 62 μg/mL, 4 μg/mL y 4 μg/mL, respectivamente, y su Concentración Mínima Biocida

(CMB) en 125 μg/mL, 4 μg/mL y 31 μg/mL, respectivamente. De la misma manera, la

citotoxicidad consecuente de la variación de agente estabilizante empleado en la síntesis de las

nanopartículas se evaluó sobre líneas celulares de fibroblastos gingivales mediante ensayos

MTT, donde se encontró que ésta no es significativamente nociva en relación a ninguno de los

materiales.

2

ABSTRACT

In this work, AgBr nanoparticles (AgBr NPs) were synthesized through an aqueous chemical

reduction method varying the capping agent: Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB),

Sodium dodecyl sulfate (SDS), and Polyvinylpyrrolidone (PVP). The as synthesized

nanoparticles were characterized through X-Ray Diffraction (XRD), Transmission Electron

Microscopy (TEM), Field-Emission Scanning Electron Microscopy (FE-SEM), Energy-

Dispersive Spectroscopy (EDS), Thermogravimetric Analysis-Differential Scanning

Calorimetry (TGA-DSC), Zeta Potential, and UV-Vis Light Spectrophotometry. The effect of

the capping agent variation was investigated not only through the morphological

characteristics of the AgBr NPs, but also through changes in their antimicrobial activity, which

were essayed against Escherichia coli (Gram negative bacteria), Staphylococcus aureus (Gram

positive bacteria), and Candida albicans (yeast). From this work, it was found that the

nanoparticles synthesized with CTAB manifested the highest activity, with Minimal Inhibitory

Concentrations (MIC) of 62 μg/mL, 4 μg/mL, and 4 μg/mL, respectively, and Minimal

Biocidal Concentrations (MBC) of 125 μg/mL, 4 μg/mL, and 31 μg/mL, correspondingly.

Likewise, the consequential cytotoxicity yielded by the variation of the capping agent during

the syntheses of the nanoparticles was valued on cell lines of gingival fibroblasts through

MTT essays, where no considerable damage was caused by any of the materials.

3

AGRADECIMIENTOS

Después de haber pasado por el momento de tomar una decisión sería en un momento de

comodidad e inseguridad (si las dos pueden ser posibles juntas), pero con objetividad y

enfoque puesto sobre un mejor futuro; y de haberla ejecutado. Con ejecutarla, me refiero a

incorporarme (como pude, con esfuerzo, pero con el flujo de la vida a mi favor) a una

institución muy bonita dedicada a la ciencia y a provocar admiración de los que saben y más

de los que no sabemos. Y después de haberme sumergido en un proyecto sobre un tema

totalmente desconocido. Los nanomateriales.

Después de haber tardado mucho en comprender siquiera la nanopunta del iceberg de la

nanociencia. Y con tardar, me refiero a muchísimo tiempo, una infinidad, leer mucho, de

muchos temas, de muchos autores, en muchos espacios y otros tiempos.

Después de haber trabajado con mis manos en el laboratorio con mucha paciencia, dedicación,

pericia y delicadeza, y otras veces como desquiciada perdida en la esfera del tiempo, y en otras

tantas en la del espacio también.

Porque después de haber viajado mucho a varios laboratorios del país igualmente dignos de

admiración y respeto.

Y después de haber pasado por todos los obstáculos inherentes a la vida.

Y después de haber sido casi pulverizada por la famosa tesis. No es exageración, nunca había

vivido semejante miedo, ansiedad, desolación, tribulación, jamás había sido tan abrumada sin

posibilidad de escape, casi sola o prácticamente sola. Perseguida por la perfección, por el

miedo al fracaso, ante todos, ante mí. Pero sin renunciar en el suicidio (por no encontrar mejor

analogía), por el aprecio a la vida como más digna contrincante que la muerte. Después de caer

lo más bajo posible, de haber estado a punto de darme por vencida, de renunciar y tirar todo

por la borda.

Después de todo el vía crucis (con sus dos interpretaciones), lo más difícil es ser agradecidos

abiertamente y con sinceridad.

Agradezco a las circunstancias que me condujeron a tomar ciertas decisiones.

4

Agradezco a mi hermana Nora Liz por el apoyo económico para emprender esta tarea.

Agradezco a las personas que me recibieron en CIDETEQ como si ya nos conociéramos o con

la sospecha de que llegaríamos a coexistir, a estas personas que viven con la ciencia y con

consciencia, y aún con espíritu suficiente para ser amables y generosos. Agradezco a la Dra.

Teresita Oropeza, quien fue la primera en recibirme y de quien siempre conservaré una imagen

de líder moral, al Dr. Alejandro Medel, que me hizo creer en la realidad de una posibilidad, a

Abigail de Jesús y a Claudia Nava por su atención conmigo siempre, a los profesores que tuve

en CIDETEQ-Querétaro por compartir su tiempo y conocimientos: Dr. Francisco Rodríguez,

Dra. María Yolanda Reyes Vidal, Dr. Adrián Rodríguez García, Dr. Ricardo Picos, Dr.

Fabricio Espejel y Dra. Irma Robles y en CIDETEQ-Tijuana: Dra. Ana Bertha Castro, Dr.

Eduardo Maldonado, Dr. Ricardo Valdez por saber responder a absolutamente todas mis dudas

y de tener la paciencia de explicarme, a mi asesor externo en la UABC en la Facultad de

Odontología el Dr. Ernesto Beltrán Partida por su inconmensurable apoyo durante tiempo de

vacaciones, a mi asesora externa en CIMAV-Chihuahua la Dra. Lorena Álvarez de quién

siempre conservaré la imagen de una mujer con autoridad y seguridad, al Dr. Erasmo Orrantia

por permitirme hacer uso de su laboratorio con total libertad y de enseñarme lo que es ser

eficiente y disciplinado, a la Dra. Hilda Piñón por haberme concedido algo de su tiempo tan

saturado.

También quiero agradecer profundamente y con la totalidad de mi ser a todos los expertos (no

quiero a llamarlos técnicos) que hicieron su parte en este proyecto y que también me tuvieron

mucha paciencia: a Ernesto G. Lestarget con XRD, a Raúl en TEM, a Wilber en FE-SEM, a

Manuel Román por compartir su laboratorio y deliciosos postres, en TGA-DSC y por hacerme

sentir en casa y una amistad lejos de casa a César Leyva.

Lamentablemente no cuento con una memoria perfecta y muy seguramente estoy olvidando

mencionar a otros tantos, pero sepan que, en momentos difíciles, siempre se agradece hasta su

sola presencia.

Quiero agradecer a todos los que han compartido este camino conmigo, a mis amigos del

curso propedéutico y después amigos de CIDETEQ, Mayorela, Valeria, Reyna, Rosario,

5

Andrés, Ana Karen, Marlon (no supe si incluirte en Querétaro o Tijuana). En Tijuana a Gil y

todos sus co-trabajadores, a los Impetuosos y otros amigos.

Obviamente también quiero agradecer a mi familia, a mi mamá Nora Liz Molina Vélez por su

apoyo invaluable en la culminación de este proyecto, a mi hermana Ana Victoria por su

sentida compañía en los momentos más difíciles de desesperación y por comprarme cositas

para satisfacer mi ansiedad, a mi hermano Víctor Manuel por ser el único de mi familia con

quien puedo compartir el tema ambiental, a mis hermanas Yari y Lissette por darme mi

espacio, y sobre todo a mi sobrino favorito del mundo, Ares, por ser lo que más feliz me hace

en todo el universo y lo que mayor motivación me da para ser un buen ejemplo.

También quiero agradecer a mis amigos de Tecate (a Fernando por el diseño de la portada) y a

todos los demás amigos que hice en mi paso por Tijuana, Mexicali, Querétaro y Chihuahua, a

Sandra y Paola, mis roomies/hermanas, que me recibieron en sus casas, no sé qué hubiera sido

de mí sin ustedes dos, gracias. A Isaac y Danny por su amistad tan sincera y apreciable, e igual

por recibirme en su hogar.

También quiero reiterar mi agradecimiento al Dr. Ricardo, que como ya mencioné siempre ha

estado para aclarar mis dudas, pero sobre todo por haber atendido a mi llamado de auxilio

cuando estaba a punto de renunciar, gracias.

Por último, pero no menos meritorio, parecía que lo estaba omitiendo con deliberación, quiero

agradecer intensa y abismalmente (es imposible encontrar el adjetivo más expresivo) al Dr.

Walter Arjona, mi asesor, por haber mantenido la integridad de este proyecto, por haberme

comprendido y tenido paciencia, por haber creído e invertido en mí, por haber sabido cómo

tratarme para no rendirme y mejor aún por la sutileza con la que evitó que me tornara en

contra de este proyecto y terminado peleando con todos, salvándome de la desilusión a mí

misma y a los que tienen expectativas buenas de mí. Gracias, Dr. Walter por guiarme en este

camino para subir un peldaño más adelante. Gracias nuevamente por tu paciencia y firmeza en

el objetivo, gracias.

He invertido mucho de mí en este proyecto, a mis posibilidades, pero lo dedico a todas estas

personas con las que estaré eternamente agradecida.

6

INTRODUCCIÓN

Los antibióticos y otros agentes antimicrobianos han salvado un sinfín de vidas a partir de su

descubrimiento, incluso contribuyeron al éxito de las cirugías. Sin embargo, el uso excesivo e

indiscriminado de ellos, ha inducido a los microorganismos a desarrollar resistencia ante su

efecto, resultando en la pérdida de susceptibilidad a su actividad inhibitoria o biocida. Esto ha

conducido a una grave situación donde cada vez es más difícil tratar ciertas infecciones

resultando en enfermedades más prolongadas y de costos de tratamiento más elevados. De

aquí que resulte imperativo buscar alternativas para tratar dichas infecciones [1].

Desde antes del descubrimiento de los antibióticos, la Plata fue utilizada como agente

antimicrobiano desde la desinfección y preservación del agua y alimentos hasta como

tratamiento de ciertos padecimientos [2].

En la actualidad, con el surgimiento de la nanotecnología, se ha retomado el uso de la Plata y

sus derivados para atender los problemas infecciosos. Se han realizado estudios para lograr

implementar los nanomateriales de compuestos de Plata como agentes antimicrobianos.

En este trabajo se pretende contribuir a tal finalidad al proponerse una metodología de síntesis

de nanopartículas de AgBr basado en un método de reducción química en fase acuosa donde

se varía el agente estabilizante (CTAB, SDS y PVP) para evaluar el efecto que éste tiene en

sus características morfológicas finales y consecuentemente su actividad antimicrobiana y

citotóxica. De esta manera, en la presente tesis se muestran los resultados fisicoquímicos y

antimicrobianos de nanopartículas de AgBr sintetizadas a través de una estabilización

electrostática (CTAB, SDS) y una estabilización estérica (PVP).

7

JUSTIFICACIÓN

El empleo de nanomateriales como alternativas de agentes antimicrobianos es limitado debido

a que es un área novedosa que no ha sido dilucidada en su totalidad. A pesar de ello, los

nanomateriales se han perfilado como una opción viable a los antibióticos y agentes

antimicrobianos clásicos. Aún queda mucho que explorar para sintetizar nanomateriales con

propiedades idóneas para esta aplicación.

En literatura se encuentra reportado el uso de nanopartículas de AgBr y su efecto

antibacteriano, sin embargo, no existen estudios formales del efecto del control que ejercen

durante la síntesis los agentes estabilizantes sobre las características morfológicas de las

nanopartículas de AgBr que se reflejan en las propiedades intrínsecas de éstas. De esta manera,

en este trabajo se explora una ruta de síntesis de nanopartículas de AgBr que permite obtener

materiales con características morfológicas (de cristalinidad y tamaño de cristal y de partícula)

con actividad antimicrobiana significativa y baja citotoxicidad a células mamíferas.

8

HIPÓTESIS

La obtención de nanopartículas de AgBr a través del uso de CTAB como surfactante resultará

en el material con mayor actividad antimicrobiana hacia E. coli (bacteria Gram negativa), S.

aureus (bacteria Gram positiva) y C. albicans (levadura), debido a un efecto sinérgico CTAB-

AgBr NPs.

9

OBJETIVOS

A. Objetivo general

Evaluar el efecto del agente estabilizante (CTAB, SDS y PVP) en la morfología, actividad

antimicrobiana y citotoxicidad de nanopartículas de AgBr.

B. Objetivos específicos

1. Sintetizar nanopartículas de AgBr variando el agente estabilizante (CTAB, SDS y PVP).

2. Realizar la caracterización fisicoquímica de las nanopartículas obtenidas mediante

difracción de rayos-X (XRD), microscopía (TEM y FE-SEM), espectroscopía de

dispersión de energía (EDS), análisis termogravimétricos (TGA-DSC), análisis de

potencial-Zeta y espectrofotometría UV-Vis.

3. Evaluar la actividad antimicrobiana de las nanopartículas mediante la determinación de la

Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) sobre E. coli, S. aureus y C. albicans.

4. Realizar mediante FE-SEM un estudio del efecto de las AgBr NPs sobre la estructura

celular de los microorganismos evaluados en la actividad antimicrobiana.

5. Evaluar la citotoxicidad de las AgBr NPs sobre fibroblastos gingivales.

10

11


12

13

SECCIÓN 1. Resistencia microbiana

1. Agentes antimicrobianos

Pasteur (1877) fue el primero en observar y mostrar que la infección ántrax causada por

Bacillus anthracis en animales susceptibles era suprimida por la presencia de otros

microorganismos, y que a su vez éste presentaba antagonismo hacia otros microorganismos

[3].

Otros investigadores trataron de aclarar este fenómeno, encontrándose que no solamente se

inhibía el crecimiento de los microorganismos objetivo, sino que también era posible provocar

su muerte.

Sin embargo, no fue hasta 1914 que el Dr. Selman A. Waksman utilizó por primera vez la

palabra “antibiótico” para describir sustancias producidas por microorganismos, que

manifestaban la capacidad de antagonizar el crecimiento de otros microorganismos y/o de

poder provocar su destrucción [4]. Siguiendo la lógica de que los microorganismos patógenos

para los seres humanos y animales deberían de estar presentes en el suelo vía excretas o sus

cuerpos en descomposición, él y su grupo de investigación realizaron estudios para dilucidar la

razón de porqué esto no era así. Observaron que, al llegar al suelo, el crecimiento de los

patógenos era inhibido o que éstos eran “consumidos” por la microbiota viviente en el suelo.

Fue así como aislaron a los microorganismos antagonistas y de ahí la subsiguiente purificación

de las sustancias antibióticas producidas. Hoy en día se conocen distintos agentes

antimicrobianos: antibióticos para combatir bacterias (comenzando desde la penicilina hasta

los antibióticos de última generación), antifúngicos contra hongos, o antisépticos y

desinfectantes empleados para inhibir o destruir microorganismos sobre superficies.

2. Resistencia microbiana

La teoría de evolución presentada por Rosenberg et al., [5] considera en conjunto a los

animales o plantas y sus microorganismos asociados como una sola unidad evolutiva. “Esta

teoría está basada en cuatro generalizaciones: (1) todos los animales y plantas establecen

relaciones simbióticas con microorganismos, (2) los microorganismos simbióticos son

transmitidos entre generaciones, (3) la asociación entre hospedero y los simbiontes afecta el

14

estado de la unidad evolutiva dentro de su ambiente y (4) una variación en la suma genética

del hospedero y su microbiota puede ser causada por cambios ya sean en los genomas del

hospedero o de la microbiota; la comunidad microbiana simbiótica puede cambiar rápidamente

bajo estrés ambiental [5].” La variación genética es la base fundamental de la evolución. La

evolución del genoma del hospedero se lleva a cabo mediante la reproducción sexual,

reacomodos de cromosomas y por mutación. El genoma de la microbiota cambia por

recombinación, mutación y otros tres procesos: amplificación microbiana, adquisición de

nuevas cepas y transferencia genética horizontal entre diferentes especies. En respuesta a la

demanda ambiental, estos últimos tres procesos pueden ocurrir muy rápidamente debido al

hecho de que el ciclo de vida de los microorganismos es mucho más veloz, manifestando una

rápida adaptación y subsecuente herencia a las generaciones posteriores.

Esta evolución se puede manifestar a través de varios mecanismos: inactivando los

medicamentos por hidrólisis o su modificación, alterando sus receptores o evitando el acceso a

ellos [6].

Los microorganismos (patógenos y no) pertenecientes a la unidad evolutiva del ser humano,

han sido expuestos al estrés ambiental constante de antibióticos empleados por las personas y

el uso excesivo e indiscriminado de antisépticos y desinfectantes en superficies, hospitales,

geles de higiene personal, etc. Algunos de ellos, patógenos, han respondido manifestando

resistencia ante los agentes antimicrobianos, resultando en un grave problema cuando éstos

provocan infecciones que implican una amenaza a la salud difícil de combatir. Esta frágil

situación ha impulsado y obligado a los investigadores de varias áreas de la ciencia a

empeñarse en el camino de la búsqueda de agentes antimicrobianos más potentes, más

específicos o innovadores que logren darse a la tarea de luchar contra los microorganismos

resistentes y multirresistentes.

3. Nanopartículas de AgBr como alternativa

Los mecanismos de acción de los antibióticos convencionales aprovechan las rutas

metabólicas de los microorganismos o actúan sobre su estructura biológicamente, induciendo

así la evolución de los microorganismos para resistir y adaptarse ante el antagonismo. Es por

esto que los nanomateriales (materiales con medida de 1 a 100 nm por lo menos en alguna de

sus dimensiones) muestran ser una alternativa atractiva que, aunque no se ha dilucidado

15

totalmente su mecanismo de acción, se ha observado que su principal característica o la que,

en dado caso, sucede en primer instancia, es el daño que causa a la integridad de la pared

celular de los microorganismos y por lo tanto, su muerte; evitando así la trayectoria

subsiguiente metabólica incluida la adquisición o desarrollo de resistencia [7].

Además, otra característica atractiva de los nanomateriales es su gran área superficial relativa a

su tamaño, y en consecuencia una alta actividad en relación a la dosis empleada.

De aquí que el siguiente paso lógico sea implementar la Plata con dimensiones nanométricas,

dado que la Plata ha sido utilizada tradicionalmente como agente antimicrobiano desde

tiempos remotos. Inicialmente, se empleaba como ayuda para mantener el agua y alimentos

libres de contaminantes microbianos (vasijas y utensilios de Plata), así como era utilizada con

aplicación médica como ungüento para los ojos de los bebés recién nacidos para evitar

infecciones transmitidas por la madre, en amalgamas dentales y como tratamiento para

quemaduras (estas últimas aplicaciones siguen estando en uso hoy en día) [2]. A pesar de ser

la Plata un agente antimicrobiano efectivo, su uso se vio opacado por el surgimiento y

atención que se dio a los antibióticos propiamente definidos como tales; sin embargo, se han

retomado las investigaciones y trabajos con este material aunado a los conocimientos de

nanociencia presentes en la actualidad.

Se ha planteado que la actividad antimicrobiana de los nanomateriales de Plata se debe

principalmente a la acción de los iones Ag+ que son liberados a través de un proceso de

oxidación de dos pasos siguiendo las ecuaciones que se presentan a continuación:

4Ag + O2 = 2Ag2O (1)

2Ag2O + 4H+ = 4Ag+ + 2H2O (2)

La cinética de disolución del ión Ag+ es dependiente del tamaño de partícula, funcionalización

de superficie, concentración de oxígeno, temperatura, pH y composición química del medio

circundante resultando en un proceso muy lento si las condiciones no son las adecuadas, pero

teniendo a su favor una efectividad a largo plazo [8].

Por otro lado, las sales de Plata como el AgNO3 presentan una alta solubilidad alcanzando una

alta concentración de Ag+, pero con la desventaja de ser altamente tóxicas para las células del

tejido donde son aplicadas.

16

Consecuentemente, en este trabajo se buscó sacar provecho de los beneficios de cada escenario

y trabajar con nanopartículas de AgBr con solubilidad más baja que las sales de Plata y la

disponibilidad de una alta concentración de iones Ag+ a mayor plazo.

SECCIÓN 2. Nanopartículas

1. Definición

La nanociencia engloba varias disciplinas tales como química, física, biología, ciencia de

materiales, entre otras, para estudiar la materia a escala nanométrica. Un material nanométrico

se considera como tal cuando por lo menos una de sus dimensiones es menor de 100 nm. Esta

ciencia ha atraído la atención de investigadores y desarrolladores industriales debido a las

posibilidades prometedoras que ofrecen las características que manifiestan estos materiales.

Los nanomateriales exhiben actividades físicas, químicas, electrónicas, biológicas y otras más

pronunciadas o novedosas que sus contrapartes masivas (orden de micrómetros), favoreciendo

aplicaciones en catálisis química, electrónica, fotografía, almacenamiento de información,

energía, imagenología, medicina y otras. En el rango menor a 1 nm se encuentran las

moléculas, átomos, partículas elementales y demás (con su propia rama científica) que al

encontrarse individualmente dispuestas presentan diferentes comportamientos de colisión con

otras moléculas. Otra diferencia importante relativa a su análogo másico en misma dosis y

composición es el aumento en proporción de átomos disponibles o la relación área

superficial:volumen que se presenta cuando los materiales comienzan a reducir su tamaño por

debajo de los 100 nm [9] [10]. Los nanomateriales se emplearon empíricamente desde la

antigüedad en tinciones para cristales, como agentes curativos chinos y tinturas medievales,

por nombrar algunos; pero fue hasta 1857 que Michael Faraday realizó el primer estudio

científico documentado sobre nanopartículas metálicas, donde se sintetizaron nanopartículas

de Oro a partir de la reducción química de sales de Au. En este trabajo él concluyó que estos

materiales debían de ser de un tamaño menor a la longitud de onda de luz visible, ya que

mostraban colores diferentes a los incididos sobre ellos [11].

2. Método de reducción química para la síntesis

Existe una diversidad de metodologías para la síntesis de nanomateriales debido a la existente

necesidad e interés por obtener productos de composición específica, con morfologías

17

definidas y tamaños de partícula con baja dispersión mediante metodologías fácilmente

escalables y de buena eficiencia y productividad económica. La síntesis de los nanomateriales

se puede generalizar en dos categorías principales: top-down y bottom-up, es decir, de arriba

hacia abajo y de abajo hacia arriba.

Las metodologías top-down consisten principalmente en reducir el tamaño de la materia prima

bulk o másica ya sea a través de molienda, desgaste o volatilización del sólido para su

posterior condensación. Los métodos más representativos de este último incluyen: depósito

físico en fase vapor (physical vapor deposition, PVD, por sus siglas en inglés), depósito

químico en fase vapor (chemical vapor deposition, CVD), depósito por capas atómicas

(atomic layer deposition, ALD) y depósito por láser pulsado (pulsed layer deposition, PLD)

mediante laser pulsado de alta potencia [9] [12].

Las técnicas dentro de la categoría bottom-up son las más utilizada por ofrecer un mayor

control sobre los factores de síntesis y así una producción de nanomateriales más apegados a

lo planeado; además de que ofrecen el beneficio de utilizar equipos menos costosos y

sofisticados que los empleados en tecnologías de arriba hacia abajo.

Dentro de los métodos de abajo hacia arriba los más empleados son los que utilizan

procedimientos químicos; algunos de ellos son: reducción fotoquímica y radioquímica,

irradiación con microondas, utilización de dendrímeros, método sol-gel, síntesis solvotermal y

método coloidal o método de reducción química en fase líquida.

En este trabajo se siguió el método de reducción química en fase líquida para la síntesis de

nanopartículas de AgBr. En él los parámetros de reacción: precursor (sales metálicas por lo

general), agente reductor (donador de electrones para reducir las sales metálicas en átomos

metálicos), agente estabilizante (para evitar la agregación de los nanomateriales, pueden ser

surfactantes o polímeros), agente direccionador (pueden coadyuvar en la obtención de ciertas

morfologías) y temperatura de síntesis (sin exceder el punto de fusión del solvente), pueden

ser manipulados independientemente para controlar la forma, tamaño y composición de los

productos. En este caso, se decidió variar solamente los agentes estabilizantes, mientras que se

mantienen constantes los demás factores durante la síntesis.

El mecanismo de síntesis generalizado para todos los nanomateriales no ha sido elucidado por

completo, pero se han logrado avances significativos. En los años 1940’s LaMer y sus colegas

18

incursionaron en la investigación para tratar de establecer la teoría que explica la preparación

de soluciones coloidales monodispersas. En su trabajo publicado en 1950, se propuso el

concepto de “nucleación espontánea” [13]. En este proceso, se generan núcleos que

posteriormente comienzan a crecer sin nucleación adicional. Debido a que todas las partículas

forman núcleos simultáneamente, sus historiales de crecimiento son similares, permitiendo así

un control sobre la distribución de tamaño de partículas en la solución. Por otro lado, si los

núcleos siguieran formándose a destiempo, resultarían crecimientos desiguales.

En el diagrama de la Fig. 1. se visualiza la barrera energética que existe para inducir el

cambio espontáneo del sistema de una fase homogénea a una heterogénea. La concentración

del monómero, la subunidad mínima del cristal, aumenta constantemente con el tiempo hasta

que el grado de supersaturación es suficientemente alto como para que la barrera energética

sea superada dando lugar a la formación y acumulación de núcleos estables. Dado que es un

sistema cerrado donde no están siendo suministrados más precursores de monómeros y que

éstos están siendo consumidos para la nucleación y crecimiento, la concentración del

monómero disminuye hasta que la velocidad neta de nucleación es cero. Una vez alcanzado

este nivel, la nucleación se detiene y el sistema entra en una etapa de crecimiento mientras que

la solución siga permaneciendo sobresaturada [14].

Fig. 1 Diagrama de LaMer: Grado de saturación en relación al tiempo.

El mecanismo de síntesis se puede dividir en tres fases definidas: nucleación, evolución del

núcleo a semillas y crecimiento de las semillas en cristales; al momento que las reacciones

químicas resultan ser bastante sencillas [15]. Implicando así que la nucleación (incorporación

del material soluto a la red cristalina por integración superficial) y la difusión (de los

19

monómeros y núcleos o material soluto de la solución bulk supersaturada) son los elementos

clave en la formación de las partículas [10].

a. Precursores

Los precursores utilizados en este trabajo son las sales de nitrato de Plata (AgNO3) y bromuro

de sodio (NaBr). A continuación, en la siguiente Tabla 1. se presentan algunos trabajos de

relevancia publicados en relación a la síntesis de nanomateriales de AgBr a partir de distintos

precursores, agentes estabilizantes, agentes reductores y cuya actividad es útil para diferentes

finalidades.

El agente reductor suave empleado para la síntesis en este trabajo es el ácido ascórbico o

simplemente ascorbato (el anión del ácido ascórbico), su química redox es bien conocida en la

nutrición humana y otras especies por sus propiedades antioxidantes, asimismo en la síntesis

de nanomateriales avanzados [16]. El motivo de emplear este reductor está asociado con la

necesidad de obtener nanopartículas de AgBr con baja citotoxicidad.

20

Tabla 1. Resumen de trabajos relacionados a nanomateriales de AgBr, con distintas variables y efectos evaluados.

Nanomaterial Metodología Precursor Agente Reductor Agente Estabilizante

Variables Actividad Referencia

AgBr NPs Reducción química en microemulsión

AgNO3 Contraión de bromuro de dioctildimetilamonio en sistema de

Tiofenol Concentración de surfactante y cosurfactante, Cantidad AgNO3, Proporción molar agua:surfactante

_ Juan Vera et al., 2004 [17]


AgBr en bulk Contraión de CTAB Tiofenol Agitación, temperatura, Concentraciones de CTAB y n-butanol y Proporción agua:surfactante



AgNO3 Contraión de CTAB en sistema de n-butanol, isooctano y agua

Tiofenol Concentración de surfactante y cosurfactante, Moles de AgNO3, Proporción molar agua:surfactante



Complejo CTASB

Contraión de CTAB CTAB Concentración de CTAB y Proporción molar CTAB:AgNO3

_ Xian-Hao Liu et al., 2007 [20]

Composito AgBr NP/polímero

Precipitación en sitio

Para-toluensulfonato de Plata (AgPTS)

Aniones Br- del polímero

Poli(4-vinilpiridina)-co-poli(bromuro

% de alquilación del polímero y Proporción iones de

Antibacterial contra B. cereus y S. aureus (Gram

Varun Sambhy et al., 2006 [21]

21

de 4- vinil-N-hexilpiridina), NPVP

Plata:iones bromuro del polímero

positivas) y E.coli y P. aeruginosa (Gram negativas)

AgBr NPs Reducción química AgNO3 Ión bromuro de CTAB CTAB Concentración de CTAB y Lavado de NPs con agua y cloroformo

_ Moumita Chakraborty et al., 2012 [22]

Composito AgBr NPs/PVP

Sol-gel y electrospinning

AgNO3 HBr PVP Cantidades AgNO3

_ Jie Ba et al., 2012 [23]

AgBr NPs Single jet AgNO3 KBr PVP Peso molecular de PVP, Proporción PVP:precursor y tiempo de adición de PVP

_ Marijana Jukić et al., 2012 [24]

AgBr nanocubos y Ag@AgBr NPs

Reducción química AgNO3 y NaBr NaBH4 para las Ag@AgBr NPs

PVP Obscuridad e irradiación de luz visible

Antibacterial contra E. coli

Zhouzhou Liu et al., 2015 [8]

AgBr y Ag NPs Reducción química AgNO3 KBr y NaBH4,

respectivamente

PEG, PVP, PVA y HEC

Polímeros Antimicrobiana contra 5 bacterias Gram +, 4 bacterias Gram – y 4 hongos

Petr Suchomel et al., 2015 [25]

AgBr-AgBr/CTAB nanomaterial

Deposición en fase líquida

Reactivo de Tollen y AgNO3

NH4OH CTAB Precursores: Reactivo de Tollen y AgNO3

Adsorción de colorantes orgánicos

Liang Tang et al., 2016 [26]

AgBr nanorods decorados con AgBr NPs

Reducción química AgNO3 NaBH4 CTAB Orden de adición de reactivos

_ Micheal Jose et al., 2016 [27]

http://pubs.acs.org/author/Chakraborty%2C+Moumita

http://pubs.acs.org/author/Chakraborty%2C+Moumita

http://pubs.rsc.org/en/results?searchtext=Author%3AZhouzhou%20Liu

22

b. Agentes estabilizantes

Los agentes estabilizantes actúan por medio de varios mecanismos, ya sea proveyendo

estabilidad electrostática (positiva y negativa), estérica, por fuerzas de hidratación, estabilidad

por reducción o por fuerzas van der Waals [28]. La elección del agente estabilizante utilizado

durante la síntesis de las nanopartículas es crucial, ya que puede influir en varias de sus

características como el tamaño, morfología, y demás propiedades que afectan la interacción

con su medio circundante [29]. En este trabajo, se realizó el estudio del efecto que manifiestan

tres de los tipos de estabilidades conferidas a las nanopartículas durante la síntesis. Los

agentes estabilizantes que en este trabajo se utilizaron fueron Polivinilpirrolidona (PVP),

Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB) y Dodecilsulfato de Sodio (SDS) y se estudió el

efecto que tuvieron sobre la morfología de las nanopartículas, su actividad antimicrobiana y

citotoxicidad que se evaluó sobre fibroblastos gingivales (un tipo de células dentales). En la

Fig. 2 se esquematiza la estabilidad que manifiesta cada uno de ellos. En los siguientes

incisos, se profundiza en algunas propiedades de cada uno de ellos.

Fig. 2 Tipo de estabilidad de los agentes estabilizantes: a) PVP, estérica; b) CTAB, electroestática positiva; c)

SDS, electrostática negativa.

i. PVP

El PVP es comúnmente utilizado como agente estabilizante y en algunas ocasiones como

agente direccionador en el crecimiento de nanoestructuras metálicas [9].

El PVP es un polímero voluminoso, no tóxico y no iónico con grupos funcionales: C=O, C–N

y CH2. La molécula contiene un grupo altamente hidrofílico (la parte pirrolidona) y uno

considerablemente hidrofóbico (el grupo alquilo) como se muestra en la Fig.3. Como

resultado de su grupo altamente polar y el grupo no polar, el PVP es fácilmente soluble en

agua y otros líquidos no acuosos. El PVP es buen agente estabilizador que previene la

agregación de las nanopartículas gracias a las fuerzas repulsivas que surgen de sus cadenas de

b) a) c)

23

carbono hidrofóbicas que se extienden hacia los solventes dándole un efecto de repulsión

estérica Fig.2 inciso a) [30].

Fig. 3 Molécula de PVP, polímero no iónico.

ii. CTAB

Una sustancia anfifílica exhibe doble afinidad, que desde el punto de vista fisicoquímico

puede verse como una dualidad polar/no polar. Una molécula anfifílica típicamente consiste de

dos partes: un grupo polar con grupos funcionales que contiene átomos como N, O, P o S y un

grupo esencialmente no polar que por lo general es una cadena de hidrocarburos del tipo

alquilo o alquilbenceno conteniendo en algunas ocasiones átomos de halógenos u átomos de

oxígeno no ionizados [31].

El CTAB es un surfactante catiónico que se disocian en el agua en un catión anfifílico y un

anión del tipo halógeno, Br-, su estructura molecular se esquematiza en la Fig. 4.

Fig. 4 Molécula de CTAB, surfactante catiónico.

Ha sido establecido que CTAB es el surfactante catiónico más común como agente

estabilizante/direccionador, responsable del crecimiento anisotrópico de algunos

nanomateriales en solución acuosa [16], ofreciendo estabilidad electroestática positiva, como

también se puede observar en la Fig. 2 inciso b).

24

iii. SDS

Por otro lado, el SDS es un surfactante aniónico que se disocia en un anión anfifílico y un

catión, siendo en este caso del grupo amonio, NH4+ como se puede ver en la Fig.5 [16],

confiriendo estabilidad electrostática negativa controlando así el crecimiento de las

nanopartículas durante su síntesis, como se puede observar en la Fig.2 inciso c).

Fig. 5 Molécula de SDS, surfactante aniónico.

3. Técnicas de caracterización

Como se mencionó anteriormente, las propiedades de superficie, fisicoquímicas, electrónicas,

mecánicas, magnéticas, termodinámicas, micro y biológicas de los nanomateriales son reflejo

de las características intrínsecas de composición química, física y eléctrica, por ejemplo,

cristalinidad (planos cristalográficos, etc.), tamaño, morfología, composición, características

eléctricas, conductividad eléctrica, térmica, etc. De aquí la importancia de caracterizar

cabalmente los materiales sintetizados para lograr dilucidar más claramente las relaciones

entre sus características y sus propiedades facilitando su diseño y método de síntesis. A

continuación, se describen brevemente las técnicas de caracterización utilizadas en este trabajo

para conocer las nanopartículas de AgBr sintetizadas.

a. Difracción de Rayos-X

La difracción de rayos-X (XRD, por sus siglas en inglés) es una técnica no destructiva

utilizada para analizar las características cristalinas de los materiales tales como cristales,

metales, cerámicas, minerales, nanomateriales y otros, para identificar su estructura.

Las características cristalinas de los nanomateriales como el sistema cristalino, los parámetros

de la red cristalina, fase cristalina, tamaño y distribución de cristal, planos cristalinos

preferenciales, disponibilidad de sitios activos, entre otras, y su combinación específica son

propios de cada material, y pueden conferir propiedades muy específicas o aumentadas

(catalíticas, electrónicas, fotónicas, de imagenología, biológicas y demás).

25

El principio de esta técnica se basa en la observación de la intensidad dispersada de un haz de

rayos-X que inciden sobre una muestra, en función del ángulo de incidencia y de dispersión,

polarización y longitud de onda o energía.

Las intensidades del haz de rayos-X difractado son detectadas, procesadas y contadas para

obtener el espectro de difracción. El difractograma provee dos tipos de información única para

cada material cristalino: las posiciones de los picos (correspondiente a la distancia interplanar

de acuerdo a la ley de Bragg) y la intensidad relativa de los picos. El grosor de los picos se

relaciona al tamaño de los cristales submicrométricos a través de la ecuación de Scherrer. Las

reflexiones también se pueden comparar con las fichas cristalográficas de los parámetros de

materiales conocidos [65–68].

b. Microscopía de Transmisión Electrónica

La Microscopía de Transmisión Electrónica (TEM, por las siglas derivadas de Transmission

Electron Microscopy en inglés) es otra técnica que se utiliza para la caracterización de

materiales, que posee un alcance desde atómico, pasando por nanométrico (1~100 nm), hasta

micrométrico y más. Los microscopios de transmisión de electrones utilizan un haz de

electrones para la penetración y observación de muestras delgadas, a diferencia de los

microscopios ópticos que utilizan luz visible, cuya resolución está limitada por su longitud de

onda. La resolución de un TEM se puede aproximar con la ecuación dada por ~1.22 λ/β

(donde λ es la longitud de onda de la radiación y β el semiángulo de colección del lente de

magnificación). La utilización de electrones permite el análisis de su difracción para dilucidar

las características cristalográficas de los nanomateriales, cuya modificación puede resultar en

cambios fenomenológicos de éstos y por ende afectar su actividad y aplicación real.

Asimismo, TEM es utilizado para visualizar la forma, tamaño, estructura y dispersión de los

nanomateriales [9] [32], pero a diferencia de XRD, con resolución a nivel atómico [33].

Lograr una caracterización tan detallada de los nanomateriales, no solo nos permite conocer

sus propiedades morfológicas, sino también nos guía para perfeccionar las técnicas de síntesis.

26

c. Microscopía de Barrido de Electrones de Emisión de Campo

En Microscopía de Barrido de Electrones de Emisión de Campo (FE-SEM, derivado de sus

siglas en inglés) el haz de electrones de barrido es más angosto con baja y alta energía de

electrón, por lo que provee una mejor resolución espacial mientras que minimiza el daño a las

muestras (en comparación con SEM). Su lente provee información topográfica con 250–

1,000,000 magnificaciones. FE-SEM se emplea en la caracterización física de las

nanopartículas para determinar dispersión y agregación, morfología, tamaño y distribución de

tamaño de partícula [34].

Además, el cañón de electrones de emisión de campo es la fuente de partícula más brillante en

toda el área de la física, por lo que la microdifracción de electrones produce la señal más

intensa a partir del volumen más pequeño de materia en todas las ciencias [33].

d. Espectroscopía de Dispersión de Energía

En Microscopía de Barrido de Electrones (SEM) se hace uso de un haz enfocado de electrones

de alta energía para generar distintas señales en la superficie de las muestras sólidas como las

nanopartículas. Los electrones incidentes también expulsan electrones fuera de la muestra,

resultando en la formación de “huecos” cargados positivamente en las bandas ocupadas. Estos

“huecos” atraen electrones desde niveles más elevados. Este movimiento de electrones hacia

los “huecos” resulta en la emisión de rayos-X. La energía de estos rayos-X es característica y

única para los átomos, en este caso, constituyentes de las nanopartículas. La Espectroscopía de

Dispersión de Energía de rayos-X (EDS o EDX) detecta los rayos-X emitidos desde la muestra

para realizar una caracterización de su composición elemental [34].

e. Análisis Termogravimétrico - Calorimetría Diferencial de Barrido

El Análisis Termogravimétrico es una técnica que mide los cambios de masa (de pérdida o

ganancia) de una muestra sometida a un proceso programado de inducción de temperatura en

ascenso con una velocidad de calor (heat rate) de, por lo general, 1-20 °C/min dentro de un

rango de temperatura también establecido. Este análisis se puede correr bajo una atmósfera

gaseosa controlada, ya sea de gas inerte como nitrógeno, argón o helio o de gas reactivo

(oxígeno, hidrógeno, bióxido de carbono, entre otros) o aire. Las pérdidas de masa se pueden

27

deber a la degradación y/o descomposición, vaporización de líquidos adsorbidos, sublimación,

reducción de óxidos metálicos en metales o la desorción de gases. Las ganancias de masa se

pueden adjudicar a la adsorción de gases o a reacciones de los sólidos con los gases como el

oxígeno, cloro o monóxido de carbono, incluida la combustión [35].

Los termogramas obtenidos son característicos de compuestos específicos dadas las reacciones

fisicoquímicas únicas que ocurren para ellos a lo largo de ciertos rangos de temperatura

específicos, siempre y cuando se tenga una idea de la composición aproximada de la muestra

(cuando este análisis no está acoplado a ninguna otra técnica de caracterización).

En Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC, de Differential Scanning Calorimetry), el calor

liberado de un proceso químico, ya sea de una reacción química o alguna alteración

conformacional, es registrado a partir de la muestra y del control colocados en cámaras

separadas. A partir de aquí se determina el calor de reacción o ΔrH [34]. Siendo esto válido

para equipos con configuración de doble cámara u horno. Sin embargo, existen equipos con

una sola cámara que operan bajo el diseño de Boersma, donde las diferencias de temperatura

se miden directamente de la muestra y no de la compensación de calor que el equipo realiza en

la doble cámara para igualar la temperatura con la referencia.

Por convención, de acuerdo a la técnica del instrumento en uso, se ha establecido que en los

DSC derivados de equipos con doble cámara (heat flow), los picos endotérmicos (para los

fenómenos que requieren energía) apuntan hacia arriba porque el equipo necesita suplir

energía para mantener el equilibrio de temperatura entre las dos cámaras; y en los DSC de una

sola cámara (heat flux), estos mismos fenómenos provocan que la muestra absorba calor o se

enfríe en relación al horno, entonces los picos apuntan hacia abajo. E igual para los picos

exotérmicos cuando se libera energía [36].

f. Potencial Zeta

Las partículas (sólidos con tamaño de 1 nm-1000 nm) en solución coloidal (heterogénea de

dos fases inmiscibles), coloides, tienen una carga eléctrica negativa o positiva que producen

fuerzas de repulsión electrostática con otros coloides vecinos y con los iones de la solución

(medio de dispersión). Dada la alta proporción área superficial:volumen característica de las

nanopartículas dispersas, el área interfacial total resulta muy grande, y en consecuencia, la

28

interacción entre las dos fases es muy importante porque esto afecta las propiedades físicas del

coloide, las reacciones químicas del sistema y su estabilidad [37]. De aquí se deriva la

necesidad de conocer en relación a la solución el potencial eléctrico que se produce entre el

coloide y su atmósfera cargada contrariamente. El Potencial Zeta (ζ) indica cambios en el

potencial de la superficie y en las fuerzas de repulsión entre los coloides donde se unen la capa

Stern (capa adyacente al coloide) y la capa difusa (capa de contra iones aún repelidos por la

capa Stern) [38].

g. Espectroscopía de Absorbancia de Luz UV-Vis

Los electrones exhiben una frecuencia de vibración natural de acuerdo a su energía de orbital.

Cuando los electrones se encuentran con una frecuencia de onda de luz igual a la suya,

absorben energía y adquieren un movimiento vibratorio. Los electrones en movimiento

interactúan con sus electrones vecinos y convierten la vibración en calor de energía. De aquí

que la espectroscopia de absorción se refiere a la medición de la absorción de luz en función

de la longitud de onda de luz UV-Vis [34].

Sin embargo, para los nanomateriales es necesario tomar ciertas consideraciones, ya que como

es sabido, su proporción área superficial/átomos disponibles:volumen es mayor a su

contraparte en bulk, por lo que la absorbancia es variable dependiendo del tamaño, morfología,

agregación, etc. de partícula u otras características como las que manifiestan algunos

nanomateriales metálicos con plasmón superficial.

29

SECCIÓN 3. Microbiología y biología celular

Las propiedades de las nanopartículas de AgBr probadas en este trabajo se encuentran en las

áreas de microbiología y biología celular, se realizó la observación del efecto en su actividad

antimicrobiana y citotóxica, respectivamente, en relación al agente estabilizante empleado

durante su síntesis.

La superficie celular micro y macro-biológica cumple dos funciones esenciales: mantener la

integridad de la célula y ser el punto primordial de contacto con el entorno. Es el punto de

contacto entre huésped-hospedero (patógeno o no), con los anticuerpos, con los antibióticos,

con las superficies de su ambiente circundante, etc. [39] y en nuestro caso, también es el

principal punto de contacto con las nanopartículas. Derivándose de aquí la importancia de

comprender las estructuras celulares.

1. Microbiología

Tal como es importante conocer las características de las nanopartículas para entender sus

propiedades, también lo es el conocer la estructura celular de los microorganismos sobre los

que se probaron las propiedades de las AgBr NPs para así comprender su interacción, causas y

efectos.

A continuación, se presenta una breve reseña sobre la biología de estos microorganismos.

a. Bacterias Gram positivas y Gram negativas

Todas las células están formadas por cuatro tipos de componentes químicos o

macromoléculas: proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y polisacáridos. La naturaleza química y

la disposición de las macromoléculas de una célula de un organismo es lo que las diferencia de

una célula de otro organismo. A grandes rasgos, la diferencia entre una bacteria Gram positiva

y una Gram negativa es su pared celular; en el primer caso, ésta está constituida por una

membrana citoplasmática (bicapa lipídica) y una capa relativamente gruesa de peptidoglicano,

en el segundo caso, la pared celular está conformada por una membrana citoplasmática, una

capa relativamente delgada de peptidoglicano ubicada en el periplasma y una membrana

externa de lipopolisacáridos y proteínas, como se observa en la Fig. 6.

30

Fig. 6 Diferencias estructurales en la pared celular de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

La distinción entre las bacterias Gram positivas y las Gram negativas se deriva de una técnica

de tinción realizada en laboratorio que consta del seguimiento una metodología de coloración

y decoloración con colorantes orgánicos que presentan afinidad por determinados

componentes celulares, algunos están cargados positivamente y se combinan fuertemente con

los constituyentes celulares cargados negativamente como los polisacáridos ácidos. Estos

colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Después de

terminada la tinción diferencial, las bacterias Gram positivas aparecen de color morado

mientras que las negativas presentan color rojo debido a que el alcohol utilizado en un paso de

la técnica es capaz de decolorar las células Gram negativas, pero no las positivas [40].

En este trabajo se eligió una bacteria representativa de cada tipo, Escherichia coli como

bacteria Gram negativa y Staphylococcus aureus como bacteria Gram positiva, ambas

patógenas en condiciones propicias para su proliferación.

b. Levaduras

Además de las bacterias, también se trabajó con Candida albicans, una levadura. Las

levaduras son hongos unicelulares mucho más grandes que las bacterias [40]. La composición

química de la pared celular fúngica, al igual que la pared celular bacteriana que también son de

superficie aniónica está conformada de polisacáridos. Las paredes están compuestas

mayormente por manoproteínas y glucano, como se muestra en la Fig.7. La quitina es un

carbohidrato polímero que también se encuentra en menor proporción, pero contribuye a la

insolubilidad de las fibras. En la superficie externa de la pared se encuentran las

manoproteínas que están altamente glicosiladas con O y N [41].

31

Fig. 7 Esquema de la pared celular de una levadura.

c. Mecanismo de acción antimicrobiana

De acuerdo a la literatura, las AgBr NPs liberan iones de Ag+ que interactúan con las células

induciendo perturbaciones en su función biológica y daño celular [8].

Existen varias propuestas para esclarecer el mecanismo acción que los nanomateriales de Plata

dirigen para ejercer su actividad antimicrobiana, entre todas ellas y a grandes rasgos, se

sugiere que los iones de Plata interaccionan con las proteínas de la membrana, afectan su

permeabilidad, bloquean la cadena respiratoria y transferencia de electrones y, cuando los

cationes logran penetrar dentro de las células, éstos tienen afinidad por el ADN, proteínas

intracelulares, producen ROS e incitan apoptosis (muerte celular programada) [42] [34] [43]

[44] [45].

d. Técnicas para la evaluación de actividad antimicrobiana

Siendo la nanociencia relativamente joven, sobre todo la aplicación biológica de los

nanomateriales, las técnicas para la evaluación de su actividad antimicrobiana aún no han sido

estandarizadas en su totalidad; sin embargo, el instituto internacional Clinical and Laboratory

Standards Institute y al European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing

(EUCAST) of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases

(ESCMID) han estandarizado la metodología para determinar in vitro la susceptibilidad de

microorganismos a antibióticos convencionales y para confirmar el desarrollo de resistencia a

ellos, estos mismos protocolos son los más comúnmente utilizados para la determinación de la

Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Bactericida (CMB), mismos que también son

aplicados en nanomateriales. La magnitud de ellas determina la dosis requerida para el efecto

32

inhibitorio/biocida de las AgBr NPs, en los siguientes incisos se presentan sus definiciones

[46] [47].

i. Concentración Mínima Inhibitoria

La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) es una herramienta de investigación para

determinar la susceptibilidad in-vitro de los microorganismos ante los agentes antimicrobianos

nuevos; y, por definición, se describe como la concentración más baja a la cual se inhibe el

crecimiento microbiano visible (en relación a turbiedad) después de un ciclo de incubación

[46] [47] [48].

ii. Concentración Mínima Biocida

La Concentración Mínima Biocida (CMB) es la concentración mínima que, no solamente

inhibe el crecimiento microbiano, sino que provoca la muerte del 99.9% de la población

microbiana inicial. Se determina a partir de una adaptación de la metodología para determinar

la CMI; en este caso, después de seguir dicho protocolo, se recultivan las muestras en un

medio libre de agente antimicrobiano, se vuelve a incubar durante otro ciclo y se debe cumplir

que no haya crecimiento microbiano en lo absoluto medido en presencia o ausencia [48] [49].

iii. Observación microscópica

La obtención de imágenes micrográficas claras es difícil por el gran contenido de agua de las

células. Al tratar de deshidratar las muestras para que sea posible su observación por FE-SEM,

las fuerzas de tensión superficial causan daño estructural a las células, por lo que es importante

tomar esto en cuenta para lograr una preparación adecuada. Existen varios métodos de

preparación y los más comunes son secado al aire, secado al punto crítico y por liofilización.

En este trabajo, se implementó la técnica de secado al aire utilizando cultivos frescos en fase

de crecimiento, evitando las fases de muerte y muestras sobre cultivadas.

La técnica de secado al aire se basa en el uso de Hexametildisilazane (HMDS), un compuesto

orgánico altamente volátil, seguido de deshidrataciones con etanol mediante concentraciones

aumentadas gradualmente para remover el agua de las células hasta que ésta sea reemplazada

33

totalmente por el alcohol. Previo al uso de HMDS, se realiza una fijación primaria de las

muestras con Glutaraldehído. El Glutaraldehído posee grupos aldehído los cuales se

entrecruzan molecularmente, ayudando a la preservación estructural de las muestras para ser

observadas por microscopía [50] [51] [52].

En las micrografías tomadas de las muestras se puede observar el daño ocasionado a la

integridad de las células y la liberación de polisacáridos u otros componentes intracelulares, o

en caso contrario, se observa la conservación estructural sin rotura alguna.

2. Biología celular

Tal como resulta importante conocer la estructura celular de los microorganismos, también lo

es la estructura de las células animales utilizadas para probar la toxicidad de las nanopartículas

de AgBr en este trabajo.

a. Fibroblastos gingivales

Una de las aplicaciones propuestas para las nanopartículas de AgBr es en medicina oral como

agente antimicrobiano para microorganismos causantes de infecciones, sin embargo, la co-

exposición a células y tejidos adyacentes debe tenerse en cuenta y estudiarse su efecto en ellos.

Los fibroblastos gingivales son células mesenquimales (células estromales o madre con

funciones específicas con la habilidad de auto-regeneración) de tejidos periodontales. Son

responsables de gran parte de la síntesis de la matriz extracelular en tejidos conectivos y

desempeñan un papel importante en la cura de heridas. Los fibroblastos son de las células

mamíferas de mayor acceso y uno de los tipos más fáciles de cultivar. Los fibroblastos

dentales son los principales constituyentes del tejido gingival y son importantes para su

mantenimiento [53] [54].

b. Citotoxicidad

La citotoxicidad (capacidad de resultar tóxico para las células) de los reactivos químicos y

partículas depende de sus propiedades fisicoquímicas y de sus interacciones con los sistemas

biológicos; sin embargo, reiterando que la actividad de los nanomateriales no es como la de

34

sus contrapartes másicas, no se puede comparar entre ellos. De hecho, existen resultados

contradictorios donde algunos nanomateriales son altamente tóxicos, otros poco tóxicos, otros

inertes y otros que incluso manifiestan hormesis (fenómeno biológico donde a bajas dosis un

agente puede resultar benéfico cuando de lo contrario, a altas dosis se puede considerar tóxico

o letal). Además, tampoco existen índices comunes para medir toxicidad provocada por

nanomateriales. Por esta razón, la toxicidad de cada nanomaterial debe ser probado en las

células que serán expuestas a las dosis concordantes con las concentraciones mínimas

inhibitorias de los microorganismos causantes de infecciones sobre esas mismas células.

Debido a la infinidad de nanopartículas, sus mecanismos de citotoxicidad pueden igualmente

ser muy variables, pero dependiendo de su modo de exposición, se pueden englobar en

toxicidad localizada o sistémica posiblemente debido al estrés oxidativo que induce

inflamación, una respuesta inmunológica, fibrogénesis y remodelación de tejido, coagulación

sanguínea, daño vascular, neurotoxicidad y genotixicidad.

En el caso de las nanopartículas de AgBr sintetizadas en este trabajo, únicamente se estudió su

citotoxicidad bajo el enfoque de viabilidad en relación al agente estabilizante empleado para

su síntesis.

c. Ensayo del MTT

Para lograr evaluar la citotoxicidad de cualquier agente (antibiótico, químico, nanomaterial,

etc.) sobre líneas celulares, se recurre al Ensayo del MTT que es una técnica utilizada para

medir la viabilidad y proliferación celular. Esta técnica se basa en la reducción enzimática del

colorante salino Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) a través de

una enzima deshidrogenasa que genera equivalentes reductores como el NADH y NADPH. El

MTT inicial tiene una coloración amarilla que después de ser reducido a formazán se torna

púrpura que puede ser medido por espectrofotometría.

Por otro lado, cuando las células han sufrido daño, apoptosis, necrosis u algún fenómeno que

impida su proliferación normal, no se conservan las células sanas o vivas para llevar a cabo la

reducción del MTT. La relación número de células:señal producida (absorbancia) es lineal, por

lo que resulta en una cuantificación acertada sobre la viabilidad celular y por ende, la

citotoxicidad del material evaluado [55] [56].

35

CAPÍTULO II. METODOLOGÍA

36

37

Metodología general

La metodología general de este proyecto se esquematiza en la Fig. 8 En primera instancia, se

realizaron las síntesis de las nanopartículas de AgBr considerando al agente estabilizante como

el único factor variable. Posteriormente, se llevó a cabo su caracterización mediante XRD,

TEM, FE-SEM, EDS, TGA-DSC, Potencial ζ y UV-Vis. Una vez preparados los materiales, se

procedió a evaluar su actividad antimicrobiana sobre Escherichia coli (Gram negativa),

Staphylococcus aureus (Gram positiva) y Candida albicans (levadura) mediante la

determinación de su CMI, así como a través de la observación visual del daño celular

manifestado mediante micrografías FE-SEM; simultáneamente se realizó la evaluación de

citotoxicidad sobre fibroblastos gingivales.

Fig. 8 Metodología del proyecto.

Síntesis de Nanopartículas

Caracterización

Evaluación Actividad

Antimicrobiana

Observación Microfotográfica

Evaluación Citotoxicidad

38

1. Síntesis de las nanopartículas de AgBr

La síntesis de las nanopartículas de AgBr se llevó a cabo en las instalaciones del Centro de

Investigación y Desarrollo Tecnológico (CIDETEQ), subsede Tijuana. En este trabajo se

siguió un método de reducción química en fase acuosa basado en una adaptación de la

metodología de síntesis de nanopartículas cúbicas de Pd [57]. La metodología modificada se

basa en la reducción de la sal metálica AgNO3 y NaBr mediante ácido ascórbico en fase

acuosa a temperatura fija de 80 °C mantenida a reflujo constante y agitación durante 4 h

seguida de un periodo de maduración durante la noche sin calor aplicado; la nucleación y

agregación y crecimiento de las nanopartículas se controló por los agentes estabilizantes PVP,

CTAB y SDS. El efecto de estos agentes estabilizantes como variables sobre la morfología,

actividad antimicrobiana y citotoxicidad sobre fibroblastos fue el objetivo de investigación de

este trabajo. En el diagrama que se muestra en la Fig. 9, se indican los reactivos empleados en

el proceso de síntesis de las nanopartículas de AgBr.

La estructura química y demás información relativa a los agentes estabilizantes se presentó

anteriormente en la Sección II.

Fig. 9 Reactivos empleados en la síntesis de las AgBr NPs

Precursores:

AgNO3

NaBr

Medio:

Agua

Agente reductor suave:

Ácido ascórbico

Agentes

estabilizantes:

PVP

CTAB

SDS

39

REACTIVOS

• Nitrato de Plata (AgNO3), JT Baker, pureza al 99%,

• Bromuro de sodio (NaBr), JT Baker, pureza al 99.5%,

• Ácido ascórbico, Faga Lab, pureza al 99%,

• Dodecil sulfato de sodio (SDS), ACTOS, pureza al 85%,

• Polivinilpirrolidona (PVP), Sigma Aldrich 40,000 PM y

• Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB), FLUKA, pureza al 96%.

Todos los reactivos se utilizaron como se recibieron sin purificación adicional. El nitrato de

Plata se mantuvo protegido de la luz en un frasco ámbar cubierto por aluminio debido a su

fotosensibilidad. Se utilizó agua desionizada obtenida por un sistema Milli-Q (Millipore

Corporation®) para todas las reacciones de síntesis y lavados subsecuentes. Para este último

propósito también se utilizó alcohol isopropílico y etanol puro. Los agentes estabilizantes se

manejaron con cuidado resguardándolos de la humedad lo más posible dada su propiedad

higroscópica.

No se prepararon soluciones stock, todos los reactivos se prepararon al momento y utilizados

en una sola corrida. La metodología de síntesis se describe en los siguientes pasos:

• Paso 1. Se pesan 0.1000 g (sin exceder ± 0.0004 g) del agente estabilizante y se disuelven

en 5 mL de agua desionizada; y 0.0230 g (sin exceder ± 0.0004 g) de ácido ascórbico en 3

mL de agua; se someten a baño ultrasónico para su efectiva solubilización y,

posteriormente se mezclan entre sí e incorporan al sistema de síntesis que se visualiza en la

Fig. 10 donde se muestra un esquema. Para su calentamiento a 80 °C con agitación

magnética constante.

Fig. 10 Esquema del sistema de síntesis.

40

• Paso 2. Durante el tiempo necesario para que la solución del paso anterior alcance la

temperatura adecuada y estable, se pesan 0.2500 g NaBr (sin exceder ± 0.0004 g) y se

disuelven en 2 mL de agua desionizada; al igual que 0.0500 g de AgNO3 (sin exceder ±

0.0004 g) en 1 mL y se solubilizan en baño ultrasónico.

• Paso 3. Una vez alcanzados los 80 °C de la solución del Paso 1, se mezclan las dos

soluciones del Paso 2 e instantáneamente se adicionan al sistema de síntesis del Paso 1.

para su incorporación a la solución bajo calentamiento.

• Paso 4. La reacción es mantenida durante 4 horas, vigilando que la temperatura no fluctúe

y que la agitación no sea interrumpida. Una vez cumplido el tiempo establecido, se

eliminan la inducción de calor y agitación y se permite un periodo de reposo durante la

noche. Las muestras de síntesis (SDS, PVP y CTAB, respectivamente) obtuvieron las

coloraciones que se muestran en la Fig. 11; sin embargo, ésta no hace justicia a las

coloraciones observadas en vivo, siendo las observadas en la realidad de izquierda a

derecha: gris claro lechosa, morado lavanda lechosa y amarillo pardo lechosa.

Fig. 11 Coloraciones de las soluciones de síntesis con PVP, CTAB y SDS.

• Paso 5. Al día siguiente, se retira la solución del sistema y se realizan los lavados de las

nanopartículas. Se someten a un proceso de centrifugación a 4,000 rpm durante 20 minutos

y se descarta el sobrenadante. Se repite esta operación por lo menos 6 veces con agua y

alcohol isopropílico (también con etanol para la síntesis con CTAB ya que a simple vista

resulta mucho más turbio que con los demás agentes estabilizantes) re-dispersando las

muestras en baño ultrasónico entre un lavado y otro.

• Paso 6. Se secan las muestras en horno de convección a la misma temperatura de síntesis,

80 °C, hasta obtener polvos secos. Posteriormente, se pulverizan en mortero de ágata para

posterior caracterización.

41

2. Caracterización de las nanopartículas de AgBr

La caracterización mediante XRD, TEM, FE-SEM, TGA-DSC y UV-Vis de los

nanomateriales sintetizados se realizó en las instalaciones del Centro de Investigación de

Materiales Avanzados (CIMAV), sede Chihuahua, mientras que el EDS y Potencial ζ se

determinaron en el Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico en Electroquímica

(CIDETEQ), subsede Tijuana, Fig 12.

Fig. 12 Instalaciones de CIMAV y CIDETEQ-Tijuana.

a. Difracción de Rayos-X

La fase cristalina de las nanopartículas se determinó mediante la interpretación de los

espectros de Difracción de Rayos-X, los cuales se obtuvieron a través del equipo Bruker, D8

Advance mostrado en la Fig. 13. Las muestras en polvo sin previa preparación se colocaron

directamente sobre su portamuestras. El difractómetro se operó con radiación de Cu-Kα1 (λ =

1.541874 Å) de 2θ = 20.000° a 99.950° a intervalos de 0.050°, a 40 kV y 200 mA.

Fig. 13 Equipo de XRD, Bruker, D8 Advance

42


Las muestras de nanopartículas se dispersaron en alcohol isopropílico; una gota se colocó en

rejillas convencionales de cobre recubiertas de carbón y se dejaron secar bajo el calor de un

foco incandescente. Las micrografías se tomaron mediante el microscopio electrónico de

transmisión TEM, HITACHI, HT7700 (Fig. 14) para observar las morfologías y medir los

tamaños de partícula.

Fig. 14 Equipo TEM, HITACHI, HT7700.


Para observar la morfología de las nanopartículas de AgBr sintetizadas con los tres distintos

agentes estabilizantes, CTAB, SDS y PVP, se utilizaron las mismas muestras que se

prepararon sobre rejillas para la caracterización mediante TEM. Las muestras se observaron

por microscopía electrónica de barrido de emisión de campo, FE-SEM con un equipo JEOL

JSM-7401F operado a 5Kv, Fig. 15.

Fig. 15 FE-SEM, JEOL JSM-7401F

43

d. Espectrometría de Dispersión de Energía

Para realizar el análisis de la composición elemental de las nanopartículas, se recurrió a la

espectrometría de dispersión de energía (EDS, por sus siglas en inglés). Las muestras se

analizaron en polvo directamente sin previa preparación en un equipo SEM, ZEISS EVO-

MA15, Fig.16.

Fig. 16 SEM, ZEISS EVO-MA15

e. Análisis Termogravimétrico ˗ Calorimetría Diferencial de Barrido

El Análisis Termogravimétrico ˗ Calorimetría Diferencial de Barrido se realizó con un equipo

TA Instruments, SDT˗Q600 (Fig. 17) que se corrió dentro de un intervalo de temperatura de

200 a 1400 °C a una tasa de calentamiento de 10 °C/min con flujo de aire de 100 cc/min. Las

muestras no se sometieron a una preparación previa, los polvos se analizaron como tal.

Fig. 17 Equipo de TGA˗DSC, TA Instruments, SDT˗Q600

44

f. Potencial Zeta

El potencial Zeta de cada material, AgBr NPs (CTAB, SDS y PVP), se midió a las mismas

concentraciones que se probaron para determinar la concentración mínima inhibitoria, cuya

preparación se indica más detalladamente en el apartado correspondiente 3: Actividad

antimicrobiana que se presenta más adelante en este capítulo de metodología. Se utilizó un

equipo Horiba Scientific, SZ˗100, Fig. 18. para medir potencial Zeta.

Fig. 18 Equipo para medir Potencial Zeta, Horiba Scientific, SZ˗100

g. Espectrometría de Absorbancia de Luz UV˗Vis

Se dispersaron 3 mg/mL de cada muestra de nanopartículas de AgBr sintetizadas con los

agentes estabilizantes variables (CTAB, SDS y PVP) empleando baño ultrasónico durante 3 h

para obtener los espectros de absorbancia a través de un espectrofotómetro Thermo Scientific,

Varioskan Lux (Fig. 19) corrido dentro de un rango de longitud de onda de 200 a 700 nm.

Fig. 19 Espectrofotómetro Thermo Scientific, Varioskan Lux

45

3. Actividad antimicrobiana

Posterior a la caracterización fisicoquímica de las nanopartículas de AgBr sintetizadas con

agente estabilizante variable, se procedió a evaluar sus propiedades micro y biológicas.

REACTIVOS

• Soya Tripticaseína, caldo, BD BBL, lote 0238269

• Soya Tripticaseína, agar, MCD LAB, lote 717215C004

• Papa Dextrosa, caldo, HIMEDIA, lote 0000242827

• Papa Dextrosa, agar, MCD LAB, lote 704215D001

• Glutaraldehído 25% peso en H2O, SIGMA-ALDRICH

• Hexametildisilazane, HMDS ((CH3)3SiNHSi(CH3)3), SIGMA-ALDRICH, pureza ≥ 99%

a. Determinación de la CMI

La concentración mínima inhibitoria (CMI) es una herramienta de investigación para

determinar la susceptibilidad in-vitro de los microorganismos ante los agentes antimicrobianos

nuevos; y, por definición, se describe como la concentración más baja a la cual se inhibe el

crecimiento microbiano visible después de un ciclo de incubación. Esta metodología consiste

en preparar tubos seriados, con medio de cultivo inoculado con una suspensión estandarizada

del microorganismo bajo prueba, a los que se les añaden concentraciones descendentes de la

dispersión de las NPs y se incuban durante la noche a 35 ± 2 °C [12]. Para tal propósito, se

siguió la metodología estándar de macrodilución en caldo de cultivo publicada por la

organización internacional Clinical and Laboratory Standards Institute y el estándar ISO

20776-1:2006. Los pasos que se siguieron son los que se presentan a continuación:

46

• Paso 1. Preparación de dispersiones stock del agente antimicrobiano

El rango de dispersión que se preparó fue de 500 – 3.9 μg/mL para evaluar el rango final de

250 – 2 μg/mL de AgBr NPs. Se pesaron 1000 μg (sin exceder ± 100 μg) de nanopartículas de

AgBr y se dispersaron en 1 mL de solución salina al 9% estéril (Baxter, grado uso médico); a

partir de esta dispersión se realizaron 8 diluciones seriadas o geométricas, traspasando 0.5 mL

al siguiente tubo que ya contenía 0.5 mL de solución salina pura y así sucesivamente para

obtener las concentraciones finales de: 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8 y 3.9 μg/mL, como

se ejemplifica en la Fig. 20.

Fig. 20 Metodología de diluciones seriadas.

• Paso 2. Preparación del inóculo

Se utilizaron los microorganismos Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus

ATCC 25923 y Candida albicans aislada de paciente con estomatitis subplaca previamente

diagnosticada clínicamente para probar la actividad antimicrobiana de las AgNPs. Donde el

acrónimo ATCC representa la American Type Culture Collection, la colección americana de

cultivos tipo. Las bacterias se crecieron en medio de cultivo Soya Tripticaseína caldo;

mientras que, la levadura en Papa Dextrosa caldo, durante un ciclo de 16 h a 35 ± 2 °C para

posteriormente realizar el ajuste de concentración de inóculo con caldo estéril. Las

concentraciones de los inóculos se obtuvieron en relación a la Densidad Óptica (D.O.) medida

por espectrofotometría a una longitud de onda de λ = 600 nm para las bacterias y λ = 520 nm

para la levadura, haciendo uso de un equipo Spectronic Instruments, SPECTRONIC 20D+.

Las concentraciones iniciales de los inóculos se muestran en la Tabla 2. en relación a cada

material de AgBr NPs sintetizado con agente estabilizante CTAB, SDS o PVP,

respectivamente, y a cada microorganismo probado.

47

Tabla 2. Concentraciones microbianas de los inóculos.

Microorganismo

Escherichia coli Staphylococcus aureus Candida albicans

Agente

Estabilizante

Conc.

[UFC/mL]

D.O.

[ua]

Conc.

[UFC/mL]

D.O.

[ua]

Conc.

[UFC/mL]

D.O.

[ua]

CTAB 1.4 × 106 0.129 9.4 × 106 0.046 7.2 × 105 0.207

SDS 1.7 × 109 0.051 2.7 × 107 0.046 1.7 × 106 0.045

PVP 1.7 × 107 0.050 1.3 × 107 0.046 2.1 × 106 0.051

UFC = Unidades formadoras de colonias

ua= unidades arbitrarias.

• Paso 3. Inoculación e incubación

Dentro de los próximos 15 minutos después de ajustar la concentración del inóculo en el Paso

2., se procedió a mezclar 1 mL de éste con 1 mL de cada una de las 8 diluciones seriadas del

Paso 1., como se muestra en la Fig. 21, llegando así a un rango final de concentración de

suspensión de AgBr NPs de 250 – 2 μg/mL y una dilución 1:2 de la concentración del inóculo

final. Para el control de calidad negativo, se sustituyó el mililitro de suspensión de

nanopartículas por 1 mL de caldo de cultivo estéril (la concentración del inóculo resultó en

una dilución de 1:2 también); mientras que, para el control de calidad positivo, se utilizaron

solamente 2 mL de caldo cultivo estéril sin exposición a nanopartículas ni a microorganismos.

Las muestras se incubaron durante 24 h a 35 ± 2 °C. Todas las pruebas se realizaron por

triplicado.

Fig. 21 Inoculación de las dispersiones de los agentes antimicrobianos.

48

b. Determinación de la CMB

Continuando con la metodología para la determinación de la CMI, se prosigue

ininterrumpidamente al proceso para la determinación de la CMB. Una vez finalizado el

período de incubación del Paso 3., se siembra de nuevo cada muestra en medio de cultivo agar

estéril de Soya Tripticaseína o Papa Dextrosa libre de agente antimicrobiano, según sea el

caso, en cajas Petri, como se muestra en la Fig. 22, y se incuba nuevamente para determinar la

concentración donde no hay crecimiento microbiano; incluidos los controles correspondientes.

Fig. 22 Resiembra en medio de cultivo libre de agente antimicrobiano.

c. Observación microfotográfica

Para observar las muestras bajo el microscopio FE-SEM, las muestras se fijaron a través de la

siguiente metodología:

• Paso 1. Se siguió la metodología para la determinación de la CMI delineada anteriormente,

pero con tres excepciones. 1) Dado que ya se conocen las CMIs, no se trabajó con las 8

diluciones seriadas, sino con la concentración anterior a la CMI determinada, esto con la

finalidad de permitir la suficiente colonización (crecimiento) de los microorganismos hasta el

grado de ser posible observarlos, pero que al mismo tiempo presenten cierto grado de daño

ocasionado por las AgBr NPs. 2) Otra excepción fue el volumen de trabajo, escalándose éste

hasta los 50 mL para lograr tener un pellet suficientemente grande. 3) La última excepción fue

el tiempo de incubación, siendo éste solamente durante la noche y no de 24 h.

• Paso 2. Posteriormente, se centrifugaron las muestras a 7,000 rpm durante 10 min, se

descartó el sobrenadante y el pellet formado se re-suspendió con 100 μL de glutaraldehído al

5% preparado con solución amortiguadora de fosfato 0.025 M, pH = 7.2. Después de un

periodo de contacto de 30 min, se centrifugó nuevamente y se descartó el sobrenadante.

49

• Paso 3. A continuación, se realizaron dos lavados re-suspendiendo el pellet con la solución

amortiguadora de fosfato, permaneciendo en contacto durante 10 min a baño de hielo en cada

ocasión, se centrifugó y descartó el sobrenadante nuevamente.

• Paso 4. En seguida, se realizó la deshidratación de las muestras realizando lavados con

alcohol etílico a concentraciones ascendentes de 10, 30, 50, 70, 80, 90 y 95% hasta llegar al

grado absoluto, permaneciendo en contacto con cada concentración durante 10 min a baño de

hielo, después se centrifugó y descartó el sobrenadante. Los lavados con 95% y alcohol

absoluto se realizaron por duplicado.

• Paso 5. Subsecuentemente, las muestras deshidratadas se pusieron en contacto con

proporciones ascendentes de HMDS (1:1, 1:2 y 1:3) diluido con alcohol etílico hasta llegar al

HMDS concentrado; con las centrifugaciones y descartado de los sobrenadantes

correspondientes. Al llegar al HMDS concentrado, el tiempo de contacto aumenta a un

mínimo de 30 min y no se centrifuga. A todo momento, se trabajó bajo campana de extracción

dada la alta toxicidad del HMDS.

• Paso 6. En este punto las muestras están listas para montarse directamente sobre

portamuestras de FE-SEM previa y adecuadamente lavados con alcohol y acetona. Se colocó

una gota de cada muestra con el cuidado de no exponerlas demasiado al aire para evitar su

rehidratación, se permitió el secado natural y se resguardaron en un desecador hasta ser

observadas por microscopía.

4. Evaluación de la citotoxicidad

Paralelo a las pruebas de actividad antimicrobiana, se realizó la evaluación de la citotoxicidad

de las AgBr NPs sobre fibroblastos gingivales siguiendo los siguientes pasos:

• Paso 1. Se procedió a sembrar 10,000 células por mL de fibroblastos en el interior de una

caja de 96 pozos estéril para cultivo celular y se dejaron incubar por 24 h a 37 ˚C bajo

condiciones atmosféricas de 95% de humedad y 5% de CO2.

• Paso 2. A continuación, se retiró todo el medio de cultivo y se colocó medio nuevo, y en

los tres primeros pozos se colocó un volumen inicial de NPs y se diluyó para dar una

concentración final de 1,000 µg/mL (en el interior de los pozos) con medio de cultivo

Dubelco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), enriquecido con un 10% v/v de suero

bovino fetal y 1% v/v de una mezcla de antibiótico/antimicótico. Esta mezcla a

continuación se diluyó de forma seriada hasta llegar a una concentración de 2 µg/mL y se

50

dejaron incubar por 24 h. Como control, se utilizó únicamente el medio de cultivo

enriquecido sin NPs.

• Paso 3. Al término de la incubación, se retiró el medio de cultivo, se lavó dos veces con

solución amortiguadora de fosfatos pH = 7.2 y se procedió a realizar el procedimiento

espectrofotométrico de MTT.

51

CAPÍTULO III. RESULTADOS

52

53

1. Caracterización de las nanopartículas de AgBr

Después de realizada la síntesis de las nanopartículas de AgBr, se prosiguió a llevar a cabo su

caracterización bajo el enfoque y consideración del cambio de agente estabilizante (CTAB,

SDS y PVP) como variable del diseño experimental.

a. Difracción de Rayos˗X

Se identificó la composición, cristalinidad y tamaños cristalinos de las AgBr NPs, los picos 2θ

= 30.961°, 44.347°, 55.044°, 64.478°, 71.092°, 73.263° y 81.615° de los difractogramas

obtenidos y mostrados en la Fig. 23 se indexaron a los planos cristalinos: (200), (220), (222),

(400), (331), (420) y (422), respectivamente; resultando en buena congruencia con la carta

cristalográfica JCPDS No. 79-0149 del AgBr.

Fig. 23 Difractogramas de las AgBr NPs sintetizadas con PVP, SDS y CTAB.

54

Además, los patrones de difracción revelaron la misma geometría cristalina cúbica centrada en

las caras (fcc, por sus siglas en inglés) para las nanopartículas sintetizadas con los tres agentes

estabilizantes.

Los índices de Miller (hkl) correspondientes a los planos cristalográficos obtenidos se

dedujeron a partir de la relación con la Ley de Bragg mediante las siguientes ecuaciones:

𝑑ℎ𝑘𝑙 =𝑎

√ℎ2 + 𝑘2 + 𝑙2

donde d es la longitud del espacio interplanar [nm], la celda unitaria es 𝑎 = 2𝑟√2 = 5.775 Å

(en este caso), 𝑟 el radio atómico (que se puede encontrar también en la carta cristalográfica) y

𝐿𝑒𝑦 𝑑𝑒 𝐵𝑟𝑎𝑔𝑔: 𝜆 = 2𝑑 𝑠𝑒𝑛𝜃,

donde λ es la longitud de onda de la radiación de Cu-Kα1 equivalente a 1.541874 Å y θ es el

promedio de los ángulos difractados correspondientes a la faceta seleccionada para el análisis.

Los tamaños de cristal promedio se obtuvieron mediante la Ecuación Debye-Scherrer

resultando en 9.24, 47.21, and 10.0 nm para las nanopartículas de AgBr utilizando CTAB,

SDS y PVP, respectivamente.

𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒𝑏𝑦𝑒 − 𝑆𝑐ℎ𝑒𝑟𝑟𝑒𝑟: 𝐷 = 𝐾𝜆

𝛽𝑐𝑜𝑠𝜃 ,

donde 𝐾 es el factor de proporcionalidad o Constante de Scherrer equivalente a 0.94 y 𝛽 es la

Anchura a Media Altura o FWHM por sus siglas en inglés (Full Width at Half Maximum)

calculadas a partir de los picos de los espectros de difracción.


Para definir los tamaños de las nanopartículas, se midieron por lo menos 50 partículas cuyas

morfologías es tipo semiesféricas, y se obtuvieron tamaños promedio de 12.5, 49.4 y 10.9 nm,

en relación a los agentes estabilizantes PVP, CTAB y SDS, respectivamente. Las micrografías

se muestran en las Figs. 24–26 con sus respectivos recuadros (insets) donde se muestran los

histogramas de distribución de tamaño de partícula.

55

Fig. 24 Micrografía TEM de AgBr NPs sintetizadas con CTAB.

56

Fig. 25 Micrografía TEM de AgBr NPs sintetizadas con SDS.

57

Fig. 26 TEM de AgBr NPs sintetizadas con PVP.

58


La morfología de los clústeres de las AgBr NPs sintetizadas con los tres distintos agentes

estabilizantes se observan en las micrografías obtenidas a través de FESEM, Fig. 27–29. Se

puede observar que el nanomaterial obtenido con PVP resultó de menor tamaño en

comparación con el uso de los otros dos agentes estabilizantes, lo cual puede atribuirse a la

permanencia de este estabilizante, aún después de su purificación. Además, se observa que,

debido a la ausencia de algún material soporte, dichas nanopartículas se aglomeraron en

escalas micrométricas. Sin embargo, a partir de las imágenes TEM, se demuestra que, estas

mantienen su tamaño nanométrico.

Fig. 27 Micrografía FE-SEM de AgBr NPs sintetizadas con CTAB.

59

Fig. 28 Micrografía FE-SEM de AgBr NPs sintetizadas con SDS.

Fig. 29. Micrografía FE-SEM de AgBr NPs sintetizadas con PVP.

60

d. Espectrometría de Dispersión de Energía

El análisis elemental se estudió mediante los Espectros de Dispersión de Energía que se

tomaron con un Microscopio Electrónico de Barrido ZEISS, EVO MA15. Para confirmar la

presencia y cuantificación de Plata y bromo, para tal efecto, se analizaron 5 zonas de cada

muestra y los resultados se muestran a continuación en las Fig. 30–32.

Fig. 30 Espectro EDS elemental de AgBr NPs sintetizadas con CTAB, en el inserto se indican las zonas

analizadas.

Fig. 31 Espectro EDS elemental de AgBr NPs sintetizadas con SDS, en el inserto se indican las zonas analizadas.

61

Fig. 32 Espectro EDS elemental de AgBr NPs sintetizadas con PVP, en el inserto se indican las zonas

analizadas.

Tabla 3. Composición atómica de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB, SDS y PVP como agentes estabilizantes.

Composición Atómica

[at.%]

Elemento AgBr, CTAB AgBr, SDS AgBr, PVP

Plata 24.89 40.98 40.91

Oxígeno 45.57 18.67 19.17

Bromo 29.54 40.36 39.92

De la Tabla 3 se determina que, la composición atómica entre Ag y Br en las nanopartículas

sintetizadas empleando SDS y PVP es similar, indicando la formación y existencia de

nanopartículas AgBr en una relación atómica 1:1. En el caso del CTAB, la composición

atómica de Br es superior a la de la Ag (4%), este fenómeno puede atribuirse a la presencia

CTAB como impureza en el polvo de nanopartículas de AgBr.

62

e. Análisis Termogravimétrico ˗ Calorimetría Diferencial de Barrido

Las AgBr NPs sintetizadas con PVP y SDS no mostraron pérdidas de peso significativas

debidas a evaporación de agua o pérdida de compuestos volátiles a <200 °C, mostrando una

mínima disminución porcentual de 0.72% y 0.23%, respectivamente alrededor de ~300-350

°C, comprobando de esta manera una alta pureza de nanopartículas de AgBr, sin residuos

debidos al uso de dichos agentes estabilizantes (Fig. 33–35). Se ha reportado que el PVP puro

se descompone alrededor de 400 °C en aire, pero cuando se encuentra unido a nanopartículas

de Plata las temperaturas de descomposición varían entre 200 y 400 °C [30] y el SDS puro a

~180 °C [58].

Las AgBr NPs sintetizadas con CTAB mostraron una pérdida de peso de 8.948% a ~240–285

°C (Fig. 35) que puede ser atribuida a la descomposición térmica del surfactante que ocurre a

~276–310°C [22] [26] [59]. Por lo tanto, a través de EDX y TGA se comprueba la existencia

de CTAB en el polvo de AgBr, correspondiente a un 9% del total de masa del material.

Además, las tres curvas de TGA mostraron una pérdida de peso pronunciada alrededor de 820

°C debida a la descomposición o a una transición vítrea de acuerdo al DSC de las AgBr NPs.

Fig. 33 Termograma de AgBr NPs sintetizadas con PVP.

63

Fig. 34 Termograma de AgBr NPs sintetizadas con SDS.

Fig. 35 Termograma de AgBr NPs syntetizadas con CTAB.

64

f. Potencial Zeta

El Potencial Zeta se evaluó con ayuda del equipo Horiba Scientific, SZ-100. Los promedios de

los Potenciales ζ de las NPs estabilizadas con PVP, CTAB y SDS se establecieron como -

28.74, 27.46 y -19.18 mV, respectivamente. La Fig. 36 ilustra el Potencial ζ en relación a la

concentración de los nanomateriales. Las concentraciones que se utilizaron en los ensayos

fueron las mismas que se emplearon para la determinación de la actividad antimicrobiana que

se describe en su debida sección; las concentraciones fueron 1000, 500, 250, 125, 62, 32, 16, 8

y 4 μg de nanopartículas/mL de agua desionizada. En general, las nanopartículas de AgBr

sintetizadas empleando CTAB muestran un potencial zeta positivo en prácticamente todo el

rango de concentraciones. Mientras que, las nanopartículas de AgBr sintetizadas utilizando

SDS y PVP muestran mayoritariamente un potencial zeta negativo. Estas cargas superficiales

son importantes debido a la interacción de la nanopartícula con el microorganismo. Se ha

reportado que, la interacción entre potenciales zeta de la nanopartícula y del microorganismo

altera la estructura de la membrana y como resultado su permeabilidad y desempeño global y

viabilidad [60].

Fig. 36 Potencial ζ de las AgBr NPs sintetizadas con PVP, CTAB y SDS.

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

1000 500 250 125 64 32 16 8 4Po

ten

cial

ζ[m

V]

Concentration [μg/mL]

AgBr, PVP AgBr, CTAB AgBr, SDS

65

La interacción inicial entre los microorganismos y los agentes antimicrobianos es

electrostática, y de ser catiónica, resulta en una interacción fuerte con las membranas celulares

cargadas negativamente [61]. Es así como se deduce que la densidad de carga positiva es un

parámetro clave para definir la eficacia de un agente antimicrobiano [62]. Por lo que, la

cantidad reducida de peptidoglicano cargado negativamente hace que las bacterias Gram

negativas sean menos propensas ante ciertos agentes antimicrobianos cargados positivamente

[63]. En literatura, se han reportado los potencial zeta promedio para E. coli y S. aureus sin

ningún tratamiento, siendo estos de -44.2 y -35.6 mV, respectivamente [60].

g. Espectrofotometría de Absorbancia de Luz UV˗Vis

Las absorbancias de luz UV˗Vis por las muestras de AgBr nanopartículas se obtuvieron

mediante el espectrofotómetro Thermo Scientific, Varioskan Lux.

Las dispersiones acuosas de las nanopartículas mostraron diferentes coloraciones como se

mencionó en la sección 6.1 Síntesis y se observó en la Foto. 2. y como se muestra nuevamente

en el recuadro dentro de la gráfica de la Fig. 37. de izquierda a derecha las soluciones

representan muestras de los nanomateriales estabilizados durante su síntesis con PVP, CTAB y

SDS; sus espectros se muestran en la Figura. Esto se relaciona con la banda plasmón de la

Plata. Los picos a 295, 250 y 245 nm se encuentran en conformidad con la absorbancia de

AgBr NPs reportada en la literatura encontrándose en el rango entre 250 and 320 nm [22] [18].

Fig. 37 Espectros de absorbancia de luz UV˗Vis de AgBr NPs sintetizadas con PVP, CTAB y SDS.

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

234 284 334 384 434 484 534 584 634 684 734

Ab

sorb

anci

a [a

.u.]

Longitud de onda [nm]

AgBr-PVP AgBr-CTAB AgBr-SDS

66

2. Actividad antimicrobiana

Posterior a la caracterización de las AgBr NPs, se procedió a realizar la evaluación de la

actividad antimicrobiana y la toxicidad como efectos del cambio en la variable (agente

estabilizante) en el diseño experimental.

Las pruebas microbiológicas, a excepción de las micrografías FE-SEM, se realizaron en la

Universidad Autónoma de Baja California (UABC), Campus Mexicali (Fig. 38.). Los modelos

celulares con los que se trabajaron fueron: fibroblastos gingivales, Escherichia coli ATCC

25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Candida albicans, aislada de un paciente

diagnosticado con estomatitis protésica (para la determinación de las CMI) y ATCC 10231

(para las micrografías).

Fig. 38 Instalaciones UABC, Facultad de Odontología..

a. Determinación de la CMI

Las concentraciones iniciales de los inóculos microbianos fueron las que se indican en la

siguiente Tabla 4. para los tres microorganismos probados bajo el efecto de las nanopartículas

de AgBr sintetizadas con los tres distintos agentes estabilizantes, CTAB, SDS y PVP.

Tabla 4. Concentraciones microbianas de los inóculos.

Microorganismo

Escherichia coli Staphylococcus aureus Candida albicans

Agente

Estabilizante

Conc.

[UFC/mL]

D.O.

[ua]

Conc.

[UFC/mL]

D.O.

[ua]

Conc.

[UFC/mL]

D.O.

[ua]

CTAB 1.4 × 106 0.129 9.4 × 106 0.046 7.2 × 105 0.207

SDS 1.7 × 109 0.051 2.7 × 107 0.046 1.7 × 106 0.045

PVP 1.7 × 107 0.050 1.3 × 107 0.046 2.1 × 106 0.051

UFC = Unidades formadoras de colonias

ua= unidades arbitrarias.

67

Posterior a un ciclo de incubación, y de acuerdo a la definición de CMI, la cual dice que ésta

se determina en el punto donde hay una disminución visual evidente en la turbiedad de las

muestras, los resultados se muestran en la Tabla 5:

Tabla 5. Concentraciones Mínimas Inhibitorias de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB, SDS y PVP evaluadas

contra E. coli, S. aureus y C. albicans.

CMI Agente Estabilizante

Microorganismo CTAB SDS PVP

E. coli (Gram -) 62 μg/mL – 62 μg/mL

S. aureus (Gram +) 4 μg/mL – –

C. albicans (Levadura) 4 μg/mL – –

– No hubo disminución visual evidente de turbiedad.

Para corroborar los resultados de disminución visual de crecimiento microbiano, también se

midieron las concentraciones reales, aunque no siempre coincidieron; los resultados se

muestran en las siguientes gráficas Fig. 39–41 donde las concentraciones de las AgBr NPs se

muestran en el eje de la abscisa y el log10 de las UFC/mL en el eje de la ordenada.

Fig. 39 Gráficas de la concentración microbiana de a) E. coli, b) S. aureus y c) C. albicans después de un ciclo

de incubación en presencia de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB

a) b) c)

68


de incubación en presencia de las AgBr NPs sintetizadas con SDS


de incubación en presencia de las AgBr NPs sintetizadas con PVP.

Los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA y Tukey de

comparaciones múltiples con un nivel de significancia de a = 0.05.

a) b) c)

a) b) c)

69

b. Determinación de la Concentración Mínima Biocida

De acuerdo a la definición de Concentración Mínima Biocida, se establece que ésta se

determina cuando después de cumplido el proceso para la evaluación de la CMI, se resiembra

la muestra en medio libre del agente antimicrobiano y se mide presencia / ausencia (o

disminución del 99.9%) de crecimiento microbiano. Los resultados que se obtuvieron son los

siguientes, Tabla 6.:

Tabla 6. Concentraciones Mínimas Biocidas de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB, SDS y PVP evaluadas

contra E. coli, S. aureus y C. albicans.

CMB Agente Estabilizante

Microorganismo CTAB SDS PVP

E. coli (Gram -) 125 μg/mL – 62 μg/mL

S. aureus (Gram +) 4 μg/mL – –

C. albicans (Levadura) 31 μg/mL – –

– No hubo disminución visual evidente de crecimiento microbiano.

En las siguientes fotografías se muestra la evidencia visual de las CMB, Fig. 42.

Fig. 42 Crecimiento microbiano después de un ciclo de incubación en medio de cultivo libre de AgBr NPs.

Controles Negativos

AgBr NPs

(CTAB)

AgBr NPs

(SDS)

AgBr NPs

(PVP)

Controles Positivos

E. coli

C. albicans

S. aureus

70

c. Observación microfotográfica

Se tomaron micrografías a través de FE-SEM para visualizar el efecto que las nanopartículas

de AgBr sintetizadas con CTAB, SDS y PVP como agentes estabilizantes causaron sobre la

integridad estructural de los microorganismos bajo estudio, E. coli, S. aureus y C. albicans,

asimismo, se logra apreciar la presencia de los nanomateriales en algunas muestras y la

preservación morfológica de los tres microorganismos sin exposición a las NPs (los controles).

Los resultados se muestran en las siguientes imágenes micrográficas Fig. 43–45:

Como se mencionó en la sección de Metodología para la Observación Visual del efecto de las

AgBr NPs sobre los microorganismos, se trabajó con concentraciones inferiores a las CMI

determinadas y con tiempos de incubación más cortos. Esto con la finalidad de obtener un

crecimiento suficiente para la obtención de muestra necesaria para su manejo y preparación.

Es decir, se trabajó con concentraciones distintas a las que provocan la inhibición de

crecimiento microbiano o a las biocidas, por lo que esta prueba no se realizó con el propósito

de cuantificar la viabilidad o muerte celular.

Reiterando, esta prueba se realizó únicamente con fines de observación cualitativa, no

cuantitativa debido a que las CMI no resultaron con comportamiento lineal extrapolable, ni las

condiciones fueron exactamente las mismas Sin embargo, a pesar de estos cambios en las

metodologías, se logra apreciar la diferencia del efecto sobre la estructura celular que

manifiesta la utilización de los diferentes agentes estabilizantes durante la síntesis de las

nanopartículas de AgBr .

• Efecto sobre E. coli:

En la Figura 43 Se visualiza una mayor deformación estructural en las células de E. coli

(mayor rugosidad) ocasionada por las AgBr NPs sintetizadas con CTAB a diferencia de SDS y

PVP. Y, por otro lado, se observa una conservación estructural mayor cuando las células se

expusieron a las NPs sintetizadas con PVP, lo cual no es totalmente congruente con las CMI

reales (no las utilizadas en esta prueba), lo cual se puede asociar a limitada zona de análisis.

71

Fig. 43 Micrografías FE-SEM de E. coli a) sin exposición a NPs y en presencia de AgBr NPs sintetizadas con b)

CTAB, c) PVP y d) SDS.

• Efecto sobre S. aureus:

En las micrografías de la Figura 44 de Staphylococcus aureus expuestas a las AgBr NPs

sintetizadas con CTAB, se observa contenido intracelular derramado (indicado con un

recuadro rojo); y en los incisos b) y c) se observan huecos en algunas células. Nuevamente, la

utilización de CTAB resulta en mayor efecto sobre las bacterias en comparación con SDS y

PVP.

a) b)

c) d)

72

Fig. 44 Micrografías FE-SEM de S. aureus a) sin exposición a NPs y en presencia de AgBr NPs sintetizadas con

b) CTAB, c) PVP y d) SDS.

• Efecto sobre C. albicans:

Las levaduras sometidas a contacto con las nanopartículas de AgBr sintetizadas con los tres

agentes estabilizantes, CTAB, SDS y PVP, presentaron formación de huecos (flechas rojas) y

rugosidad (flechas verdes) en las células como se muestra en las micrografías de la Figura 45;

sin embargo, en este caso, no se logra hacer una comparación de magnitud contundente del

efecto entre un agente estabilizante y otro.

a) b)

c) d) c)

73

Fig. 45 Micrografías FE-SEM de C. albivcans a) sin exposición a NPs y en presencia de AgBr NPs sintetizadas

con b) CTAB, c) PVP y d) SDS.

a) b)

c) d)

74

3. Evaluación de la citotoxicidad

Las pruebas de citotoxicidad a través del ensayo del MTT corrido en líneas celulares de

fibroblastos gingivales se realizaron en colaboración con la UABC y los resultados obtenidos

son los siguientes, Fig. 46–48:

Fig. 46 Gráfica de concentraciones ascendentes de AgBr NPs sintetizadas con CTAB contra viabilidad celular.

Fig. 47 Gráfica de concentraciones ascendentes de AgBr NPs sintetizadas con SDS contra viabilidad celular.

Fig. 48 Gráfica de concentraciones ascendentes de AgBr NPs sintetizadas con PVP contra viabilidad celular.

75

CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES

76

SECCIÓN I. Sobre el efecto del agente estabilizante en la síntesis de las AgBr NPs

Con el uso de distintos agentes estabilizantes (CTAB, SDS y PVP) durante la síntesis de

nanopartículas de AgBr es posible sintetizar nanopartículas de AgBr de composición química,

cristalinidad, pureza y estabilidad térmica similares (EDS, UV-Vis, XRD, TGA-DSC), pero

con tamaño cristalino y de partícula distintos, así como el potencial ζ resulta con carga positiva

para las AgBr NPs sintetizadas con PVP y CTAB en oposición a la negativa resultante

empleando SDS.

SECCIÓN II. Sobre el efecto del agente estabilizante de las AgBr NPs en su actividad

antimicrobiana

El uso de agentes estabilizantes variables (CTAB, SDS y PVP) empleados durante la síntesis

de nanopartículas de AgBr juega un papel importante en el efecto que se manifiesta a través de

su actividad antimicrobiana, resultando el empleo de CTAB más efectivo y de amplio espectro

contra bacterias Gram positivas, Gram negativas y levaduras.

SECCIÓN III. Sobre el efecto del agente estabilizante de las AgBr NPs en su

citotoxicidad

Es posible que las nanopartículas de AgBr sintetizadas con distintos agentes estabilizantes

presenten baja citotoxicidad sobre líneas celulares mamíferas (fibroblastos dentales) a las

concentraciones necesarias para que éstas manifiesten actividad antimicrobiana significativa.

77

CAPÍTULO V. APÉNDICE

78

Difracción de Rayos-X, Fundamentos

Los materiales cristalinos se caracterizan por componerse de la repetición de un patrón de

átomos ordenados. La celda unitaria se describe como el patrón repetitivo básico que define al

cristal [64] y puede clasificarse en uno de los 7 sistemas cristalinos con 14 tipos de redes de

Bravais (la clasificación puede profundizarse aún más en torno a 8 tipos de elementos de

simetría). Los vectores (o longitudes) de la celda y sus ángulos interaxiales se definen como

los parámetros de la red cristalina. En la Fig. 49., que se presenta a continuación, se puede

observar una celda unitaria esquematizada y en la Tabla 7. se presenta la clasificación de los

sistemas cristalinos. Los átomos de los cristales se encuentran alineados formando planos

cristalográficos, que se indican con los índices de Miller (h k l) y se definen como los

recíprocos de los interceptos fraccionales que los planos hacen con los ejes cristalográficos

[65].

Fig. 49 Esquema de una celda unitaria.

Tabla 7. Sistemas cristalinos y redes de Bravais.

Sistema Longitudes axiales y ángulos Redes de Bravais Símbolo de red

Cúbico Tres ejes iguales con ángulos rectos

a = b = c, α = β = ᵞ = 90°

Simple Centrado en el cuerpo Centrado en las caras

P I F

Tetragonal Dos ejes con ángulos rectos, dos iguales

a = b ≠ c, α = β = ᵞ = 90°

Simple Centrado en el cuerpo

P I

Ortorrómbico Tres ejes desiguales con ángulos rectos

a ≠ b ≠ c, α = β = ᵞ = 90°

Simple Centrado en el cuerpo

Centrado en la base Centrado en las caras

P I C F

Trigonal Tres ejes iguales, con misma inclinación

a = b = c, α = β = ᵞ ≠ 90°

Simple R

Hexagonal Dos ejes iguales coplanares a 120° con ángulos rectos

a = b ≠ c, α = β = 90°, ᵞ= 120°

Simple P

Monoclínico Tres ejes desiguales, un par sin ángulos rectos

a ≠ b ≠ c, α ≠ ᵞ = 90° ≠ β

Simple Centrado en la base

P C

Triclínico Tres ejes desiguales, desigualmente inclinados y ninguno con ángulos rectos

a ≠ b ≠ c, α ≠ β ≠ ᵞ ≠ 90°

Simple P

79

Las características cristalinas de los nanomateriales como el sistema cristalino, los parámetros

de la red cristalina, fase cristalina, tamaño y distribución de cristal, planos cristalinos

preferenciales, disponibilidad de sitios activos, entre otras, y su combinación específica son

propios de cada material, y pueden conferir propiedades muy específicas o aumentadas

(catalíticas, electrónicas, fotónicas, de imagenología, biológicas y demás). Como es el ejemplo

referente a catálisis, donde las nanopartículas de platino con superficies delimitadas por la

familia de planos {100} catalizan reacciones de hidrógeno, mientras que la reactividad del

monóxido de carbono es aumentada por la familia de planos {210} de nanopartículas tipo

buckyball [66] y el caso en que la actividad fotocatalítica de las nanopartículas de TiO2 es más

dependiente de la disponibilidad de los sitios activos que del área superficial total y su

actividad generativa de ROS (del inglés reactive oxygen species) es igualmente más

dependiente de la disponibilidad de sitios defectuosos superficiales (o planos cristalinos

discontinuos) y de su sistema cristalino, anatasa o rutilio [67].

La difracción de rayos-X (XRD, por sus siglas en inglés) es una técnica no destructiva

utilizada para analizar las características cristalinas de los materiales tales como cristales,

metales, cerámicas, minerales, nanomateriales y otros, para identificar su estructura (si el

espacio interplanar, d, es función de la química del material) y para caracterizar mezclas

heterogéneas de sólidos mediante la cuantificación relativa de sus componentes.

El principio de esta técnica se basa en la observación de la intensidad dispersada de un haz de

rayos-X que inciden sobre una muestra, en función del ángulo de incidencia y de dispersión,

polarización y longitud de onda o energía.

Los rayos-X son generados por un tubo de rayo catódico al calentar un filamento para producir

electrones; posteriormente son filtrados para obtener un haz monocromático que es colimado

para concentrar y dirigir el haz hacia la muestra. Las intensidades del haz de rayos-X

difractado son detectadas, procesadas y contadas para obtener el espectro de difracción. El

difractograma provee dos tipos de información única para cada material cristalino: las

posiciones de los picos (correspondiente a la distancia interplanar de acuerdo a la ley de

Bragg) y la intensidad relativa de los picos. El grosor de los picos se relaciona al tamaño de los

cristales submicrométricos a través de la ecuación de Scherrer. Las reflexiones también se

pueden comparar con las fichas cristalográficas de los parámetros de materiales conocidos.

80

Los rayos-X se clasifican como ondas electromagnéticas, como las ondas de radio, luz visible,

rayos gamma y demás, excepto que su longitud de onda y energía varía de entre 100 eV y

10MeV. En su consideración como onda, presentan longitudes de onda de 10 a 10-3 nm; y de

acuerdo a la teoría cuántica, en su consideración como partícula, se le llama fotón o cuanto de

luz con todas sus características esenciales de energía, momentum y otras [65]. Los rayos-X

utilizados para analizar cristales tiene λ de 1–2 Å, como por ejemplo, cobre Kα = 1.5428 Å

[68].

“El haz de rayos-X es una onda electromagnética caracterizada por un campo eléctrico que

está vibrando a una frecuencia constante, perpendicular a la dirección de movimiento. Esta

variación del campo eléctrico da a los electrones (partículas cargadas) un cambio sinusoidal

con el tiempo a la misma frecuencia. Como resultado de la aceleración y desaceleración

periódica del electrón, se genera una nueva onda electromagnética como los rayos-X. En este

sentido, los rayos-X son dispersados por los electrones. Este fenómeno es llamado dispersión

Thomson. Por otro lado, el fenómeno físico llamado “difracción como función de la posición

atómica” también se encuentra cuando un haz de rayos-X encuentra un cristal cuyo orden

atómico muestra periodicidad de largo rango. La intensidad de los rayos-X difractados

depende no solo del arreglo atómico sino también de la especie atómica. Cuando se considera

la difracción de los rayos-X de un cristal, se necesita información acerca de los “factores de

dispersión atómica”, los cuales proveen una medida de la habilidad de dispersión de los rayos-

X por átomo. Debido a que el núcleo de un átomo es relativamente pesado en comparación

con un fotón de rayos-X, no dispersa rayos-X. La habilidad de dispersión de un átomo

depende solamente de los electrones, su número y distribución [65].”

El fenómeno de dispersión de rayos-X por cristales es atribuido a ciertas relaciones de fases

entre dos o más ondas, tales como las diferencias de fase producidas por las diferencias en la

longitud de trayectoria de las ondas y un cambio en la amplitud relacionado a la diferencia de

fase. Dos ondas se encuentran totalmente en fase si la diferencia entre las longitudes de

trayectoria es cero o un múltiplo entero de la longitud de onda. El propósito principal de la

difracción de rayos-X por cristales es conocer la condición particular en la cual los rayos-X

dispersados de los átomos y los rayos-X de incidencia están en fase completamente y se

refuerzan mutuamente para producir un haz de difracción detectable [65]. Explicado de otra

81

forma, se basa en la interferencia constructiva (misma fase) de rayos-X monocromáticos (una

sola longitud de onda) y la muestra cristalina.

Si los rayos-X con longitud de onda (λ) inciden un cristal donde los átomos se encuentran

arreglados periódicamente con un espacio interplanar (d´), la difracción del haz con suficiente

intensidad es detectado solamente cuando se cumple la Ley de Bragg

𝑛𝜆 = 2𝑑´𝑠𝑖𝑛𝜃

donde n es llamada el orden de reflexión y es equivalente al número de longitudes de onda en

la diferencia de trayectoria entre rayos-X difractados de planos adyacentes y donde θ es el

ángulo del haz de rayos-X de incidencia; 2θ es el ángulo entre el haz de rayos-X difractado y

el haz transmitido, llamado el ángulo de difracción. La ecuación puede ser reescrita como

𝜆 = 2𝑑 𝑠𝑖𝑛𝜃

donde d = d’/n. [65]

Los índices de Miller que se mencionaron al principio de esta sección se deducen a partir de la

relación entre la ecuación de distancia interplanar correspondiente a cada uno de los sistemas

cristalinos y la ley de Bragg, y se consideran tres mínimos números enteros (h k l) que

satisfagan dicha relación y la igualdad con la distancia interplanar, d. En la Tabla 8. se

presentan las ecuaciones para calcular la distancia interplanar de acuerdo a cada sistema

cristalino.

82

Tabla 8. Ecuaciones de distancia interplanar para siete sistemas cristalinos.

Sistema Ecuación

Cúbico 1

𝑑2=

ℎ2 + 𝑘2 + 𝑙2

𝑎2

Tetragonal 1

𝑑2=

ℎ2 + 𝑘2

𝑎2+

𝑙2

𝑐2

Hexagonal 1

𝑑2=

4

3(

ℎ2 + ℎ𝑘 + 𝑘2

𝑎2) +

𝑙2

𝑐2

Trigonal 1

𝑑2=

(ℎ2 + 𝑘2 + 𝑙2) sin2 𝛼 + 2(ℎ𝑘 + 𝑘𝑙 + ℎ𝑙)(cos2 𝛼 − cos 𝛼)

𝑎2(1 − 3 cos2 𝛼 + 2 cos3 𝛼)

Ortorrómbico 1

𝑑2=

ℎ2

𝑎2+

𝑘2

𝑏2+

𝑙2

𝑐2

Monoclínico 1

𝑑2=

1

sin2 𝛽(

ℎ2

𝑎2+

𝑘2 sin2 𝛽

𝑏2+

𝑙2

𝑐2−

2ℎ𝑙 cos 𝛽

𝑎𝑐)

Triclínico 1

𝑑2=

1

𝑉2(𝑆11ℎ2 + 𝑆22𝑘2 + 𝑆23𝑙2+2𝑆12ℎ𝑘+2𝑆23𝑘𝑙+2𝑆13ℎ𝑙)

En el sistema triclínico, V es el volumen de la celda unitaria y los coeficientes se dan a continuación:

𝑺𝟏𝟏 = 𝒃𝟐𝒄𝟐 𝐬𝐢𝐧𝟐 𝜶, 𝑆12 = 𝑎𝑏𝑐2(cos 𝛼 cos 𝛽 − cos 𝛾),

𝑺𝟐𝟐 = 𝒂𝟐𝒄𝟐 𝐬𝐢𝐧𝟐 𝜷, 𝑆23 = 𝑎2𝑏𝑐(cos 𝛽 cos 𝛾 − cos 𝛼),

𝑺𝟑𝟑 = 𝒂𝟐𝒃𝟐 𝐬𝐢𝐧𝟐 𝜸, 𝑆13 = 𝑎𝑏2𝑐(cos 𝛾 cos 𝛼 − cos 𝛽).

83

CAPÍTULO VI. BIBLIOGRAFÍA

84

[1] World Health Organization, “Antibacterial agents in clinical development: an analysis

of the antibacterial clinical development pipeline,” Who/Emp/Iau/2017.12, p. 48, 2017.

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Sci., no. 85, pp. 101–105, 1877.

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