Fermentación Alcohólica

Introducción:

Los organismos han desarrollado otro proceso que le sigue a la glicólisis, el cuál es más eficiente, no produce sustancias finales tóxicas y produce CO2 como producto final. Este proceso es la respiración celular aeróbica. La respiración celular tiene en adición, la ventaja de aprovechar el oxígeno producido en la fotosíntesis, con lo cual fotosíntesis, glicólisis y respiración celular forman un ciclo, en el cual los átomos de carbono circulan por los seres vivos y atmósfera. Cuando el aceptor final de electrones es el oxígeno molecular el proceso se denomina respiración aeróbica.

Sin embargo en la respiración anaeróbica la energía se obtiene de las moléculas orgánicas sin utilizar oxígeno. En este proceso la degradación de la glucosa es incompleta y se producen compuestos intermedios, algunos fragmentos de moléculas quedan oxidados o reducidos.

La fermentación es una forma de respiración anaeróbica, llamada también respiración intramolecular. Es un proceso que genera ATP, en el cual las sustancias orgánicas actúan como dadores y aceptores de electrones. La fermentación también puede darse en ausencia de CO2.

El término fermentación generalmente se reserva para la actividad de algunos microorganismos, como ciertos hongos y bacterias. Los productos de fermentación son muy variados, según el sustrato, el microorganismo y los factores que gobiernan el proceso.

La fermentación alcohólica se efectúa en ausencia de oxígeno molecular; es un proceso muy conocido. El primer paso en el proceso de fermentación, la glucólisis, tiene lugar en igual forma que en la respiración aeróbica. En vez de que el ácido pirúvico formado entre en el ciclo de Krebs y sea oxidado completamente, en la fermentación alcohólica ocurre una descarboxilación de ese ácido, formándose acetaldehído; esta sustancia sirve luego, el lugar del oxígeno gaseoso del aire como aceptor del hidrógeno y se forma alcohol etílico, como ejemplo la levadura Saccharomyces Cerevisiae es un hongo ascomiceto que ha sido ampliamente estudiado dado su importancia en la industria panadera y vitivinícola, así como por su amplia capacidad de producir alcohol. Este Microorganismo muestra cinco fases de crecimiento bien definidos cuando es cultivado en medios líquidos con glucosa. Utiliza monosacáridos, como la glucosa, fructosa y manosa, disacáridos como la maltosa y sacarosa, y trisacáridos como la rafinosa.

Además de la fermentación alcohólica, existe la fermentación láctica la cual consiste en la formación de lactato a partir de glucosa. En primer lugar la lactosa se hidroliza en glucosa y galactosa y ésta última se isomeriza a glucosa; se produce la glucólisis y se forman dos piruvatos por cada glucosa, finalmente el piruvato se reduce a lactato, un ejemplo de esta fermentación son las bacterias Streptococcus y Lactobacillus .También existe la fermentación butírica.

ObjetivosLlevar a cabo la fermentación alcohólica de diferentes carbohidratos por medio de la levadura Saccharomyces cerevisiae para analizar el efecto que tiene la misma a diferentes condiciones experimentales.

Metodología"La indicada en el manual de Bioquímica Metabólica, correspondiente a la práctica 3, página 39".

ResultadosTABLA 1.0 Fermentación de glucosa y demostración con la prueba de Benedict

MUESTRA PRUEBA DE BENEDICTGlucosa PositivaLevadura Negativa30 min Positiva60 min Positiva90 min Positiva120 min Negativa

Imagen 1.0 fermentación de glucosa con prueba de Benedict a diferentes tiempos

TABLA 2.0 Fermentación con diferentes carbohidratos

Tiempo (min) Agua Glucosa Fructuosa Sacarosa Galactosa5 0.3 cm x 0.1 cm x 0.5 cm10 X x x x x15 X x x x x20 X x x x x25 X x x x x30 X x x x 0.3 cm

Imagen 2.0 fermentación de la Saccharomyces cerevisiae con agua, glucosa, sacarosa, fructosa y galactosa.

TABLA 3.0 Fermentación a diferentes temperaturas

Tiempo (min) A (0°C) Volumen desplazado B (37°C) Volumen desplazado5 x 0.2 cm10 x 0.5 cm15 x 0.5 cm20 x 0.7 cm25 x 0.7 cm30 x 0.7 cm

TABLA 4.0 Efecto del NaF sobre la fermentación

Tiempo (min) C (sin NaF) Volumen desplazado

D(con NaF) Volumen desplazado

5 0.2 cm x10 0.5 cm x15 0.5 cm x20 1.0 cm x25 1.0 cm x30 1.0 cm x

Notación: x= Sin cambio

Imagen 3.0 levadura utilizada para la realización de la práctica.

Análisis de resultadosLas pruebas, Benedict y el volumen generado de CO2 en la experimentación pueden ser utilizadas para el seguimiento de la fermentación. La prueba de Benedict sirve para caracterizar carbohidratos, estos tienen en su estructura el grupo funcional carbonilo, en su forma ceto o aldehído. El reactivo de Benedict ([Cu(C3H5O(COO)3)2]4- en medio alcalino se emplea para detectar sustancias reductoras, como los aldehídos, que reducen al Cu+2 a Cu+1 en forma de óxido cuproso; el color del precipitado puede ser amarillo o rojo dependiendo de la naturaleza y cantidad del agente reductor (Miranda Ruvalcaba et al. 2008); en una prueba negaiva el color azul del reactivo permanece.

En la primera sección "fermentación de glucosa y demostración con la prueba de Benedict" se puso de manifiesto el carácter reductor de la glucosa, pues dio positivo a la prueba, mostrando un precipitado rojo ladrillo luego de ser calentado en agua hirviendo (imagen 1). La misma prueba se realizó a la levadura dando un resultado negativo descartándose así la presencia de cualquier azúcar reductor en la levadura que pudiese interferir con los posteriores experimentos, asegurando sólo la presencia del hongo ascomiceto. La prueba de Benedict se utilizó para seguir el proceso de fermentación realizado por Saccaromyces cerevisiae sobre la solución de glucosa al 2%, el fundamento de este procedimiento es que como ya se mencionó anteriormente la glucosa es un azúcar reductor y por tanto da positivo a la prueba con el reactivo de Benedict, por lo tanto es de esperarse que conforme avance el proceso de fermentación el poder reductor de la solución de glucosa al 2% vaya decreciendo hasta desaparecer en el momento en que toda o la mayoría de la glucosa sea transformada en etanol y CO2. Así pues la prueba de Benedict se realizó en a tres tiempos (30, 60 y 90 minutos) incubando a 37°C,en ningún momento se obtuvo una prueba negativa que confirmara que el proceso de fermentación hubiera llegado a término, pero como el color del precipitado puede ser amarillo o rojo dependiendo de la naturaleza y cantidad del agente reductor (Miranda Ruvalcaba et al. 2008) si puede apreciarse una disminución en la tonalidad roja que tiende hacía el color amarillo que es indicativo de la que la fermentación se esta llevando a cabo, si bien no a una buena velocidad,utilizándose dicha temperatura debido a que el metabolismo del microorganismo estudiado se lleva a cabo de manera óptima. Siendo un resultado desfavorable, debido a que se esperaba la desaparición gradual de glucosa conforme avanzara el tiempo, es

probable que la levadura utilizada (imagen 3.0), se encontraba inhibida por la presencia de algún aditivo empleado en su fabricación como monoesterato de sorbitán mencionado en el marbete,coadyuvantes a la fermentación (amilasas,proteasas,glucoxidasas) o por que la levadura utilizada se encontraba resguardada (vieja) no nueva.

En cuanto a la fermentación con diferentes carbohidratos, se prepararon sistemas en los que el volumen producido de CO2 era medido cada 5 minutos para, determinar qué carbohidrato podía ser metabolizado con mayor eficacia por la levadura (saccaromyces cerevisiae) de esta forma puede ser medida cuantitativamente la actividad de fermentación de la levadura, y puede hacerse un comparativo también de como varía la velocidad del proceso con cada diferente carbohidrato. Sin embargo, no se obtuvo ningún resultado, pues en ningún sistema se observó la producción de CO2

(imagen 2.0). El problema pudo haberse debido, a la presencia de los aditivos ya mencionados en la levadura, por lo cual se realizara de manera teórica el análisis. Se utilizaron los siguientes carbohidratos: glucosa, fructosa, sacarosa y galactosa. Donde el que se metabolizaría más rápido, sería la glucosa por ser el sustrato preferido por Saccharomyces Cerevisiae debido a que la glucosa entra directamente a glucólisis para dar piruvato y seguir por la vía de la fermentación hasta dar etanol y CO2 , le sigue la fructosa, la fructosa está presente como azúcar libre en muchas frutas, y se obtiene también de la hidrólisis de la sacarosa, la fosforilación de la fructuosa en la mayor parte de los tejidos da lugar a fructosa-6-fosfaton un intermediario gucolítico, (Mathews & K. E., 2002) de esta forma la fructosa puede también ser aprovechada por Saccharomyces cerevisiae. Luego sigue la sacarosa, la sacarosa es un disacárido formado por una molécula de glucosa y una molécula de fructosa por lo tanto no es raro que la sacarosa pueda ser metabolizada por Saccharomyces cerevisiae y finalmente la galactosa, esta última ni siquiera sería metabolizada por la levadura. El rendimiento teórico estequiométrico para la transformación de glucosa en etanol es de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO 2 por 1 g de glucosa. Este valor fue cuantificado por Gay Lussac. En la realidad es difícil lograr este rendimiento, porque como se señaló anteriormente, la levadura utiliza la glucosa para la producción de otros metabolitos. El rendimiento experimental varía entre 90% y 95% del teórico, es decir, de 0.469 a 0.485 g/g. Los rendimientos en la industria varían entre 87 y 93% del rendimiento teórico (Boudarel, 1984). Otro parámetro importante es la productividad (g/h/l), la cual se define como la cantidad de etanol producido por unidad de tiempo y de volumen. (Vázquez & Dacosta, 2007)

En cuanto a la parte experimental de la fermentación con diferentes carbohidratos, podemos decir que los resultados no fueron favorables ya que lo que se esperaba era un desplazamiento de la solución contenida en cada pipeta debido a la formación de CO2 como producto de la fermentación; dependiendo del tipo de carbohidrato utilizado el volumen de líquido desplazado sería diferente, así para la glucosa se esperaba un mayor desplazamiento de líquido en la pipeta debido a que la glucosa es como ya se mencionó antes la glucosa es el sustrato preferido por Saccharomyces cerevisiae.

De manera paralela también se llevó a cabo la fermentación en presencia y ausencia de NaF en el sistema para analizar y observar el efecto que tiene sobre la fermentación (vease tabla 4.0). En el tubo que contenía NaF la fermentación no se llevó a cabo el proceso de fermentación, esto se debe a que el ión fluoruro actúa como inhibidor de la enolasa (2-fosfo-D-gliceratohdirolasa; EC: 4.2.1.11) (UniProtKB, 2013). La enolasa está formada por 2 subunidades iguales y requiere al catión Mg+2 como cofactor debido a que este estabiliza al homodimero además de que ayuda en la catálisis (UniProtKB, 2013) de la reacción2-fosfo-D-glicerato= fosfoenolpiruvato + H2O. El papel que juega la enolasa es fundamental en el proceso de la glucolisis, pues es por medio de esa ruta metabólica que se obtiene el piruvato que es el sustrato de partida para llevar a cabo el proceso de fermentación alcohólica. Por lo tanto al inhibir a la 2-fosfo-D-gliceratohdirolasa se impide que se forme el

fosfoenolpiruvato en el paso número 9 de la glucolisis y por lo tanto ya no se forma piruvato. La forma en que el NaF inhibe a la enzima es por la formación de un complejo del ión F- con el Mg+2 de esta forma el homodímero de la enzima pierde estabilidad, su conformación y por lo tanto su acción catalítica. Debido a esto no hay fermentación.

Conclusión

Debido a la mala calidad de la levadura los datos experimentales no se obtuvieron de forma completa o confiable. De todas formas se realizó el análisis de los resultados proporcionados por la profesora y de los que se obtuvieron de manera parcial. Se llevó a cabo el proceso de fermentación en glucosa de manera parcial por acción de Saccharomyces cerevisiae, se probó también que la levadura actúa sobre fructosa y sacarosa, pero no así sobre galactosa. Quedo demostrado que NaF funciona como inhibidor en el proceso de fermentación debido a la formación de un complejo F-Mg que impide se lleve a cabo el noveno paso de glucolisis. No pudo demostrarse experimentalmente el final de la fermentación por medio de la prueba de Benedict pero se hizo un estudio y análisis teórico de ello.

ReferenciasHorton, R. (2008). Principios de bioquímica (4ta ed.). D.F., México: Perarson.

Koolman, J. (2004). Bioquímica Texto y Atlas. D.F.: Panamericana.

Mathews, C., & K. E., van Holden. (2002). Bioquímica (3ra ed.). Marid: Pearson Educación, S.A.

Miranda Ruvalcaba, R., Godínez Hernández, E., García Arellanes, J., & Aguilera Fuentes, J. L. (2008). Técnicas básicas para la experimentación en química orgánica. Cuautitlán Izcalli, Estado de México, México: Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán.

UniProtKB. (24 de juio de 2013). UniProt. Obtenido de http://www.uniprot.org/uniprot/P00924

Vázquez, H., & Dacosta, O. (Oct/Dic de 2007). Fermentación alcohólica: Una opción para la producción de energía renovable a partir de desechos agrícolas. Ingenierría, Investigación Y tecnología, 8(4).