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ブ ドウ球菌 の産生す るSlimeの 生物学的活性に関す る研究

京都薬科大学微生物学教室

尾 花 芳 樹 西 野 武 志

(平成1年2月6日 受付)

(平成1年3月2日 受理)

Key words: Staphylococci, Slime, Virulence factor

要 旨

Stophylococcus aureusNo.71お よ びStaphylococcus epidermidisNo.2の 産 生す る粘 液 性物 質

(slime)を 分離 し,そ の生物 学的 性状 と活 性 につ いて検 討 を行 なった.い ずれ の菌株 のslimeも 多量 の蛋

白,RNA(オ ル シ ノール反 応陽 性物 質)お よび糖 を含 む物 質 であ った.こ れ らのslimeの マ ウス に対す

る致 死活 性 は非 常 に低 い こ とが 分か った.し か しなが らマ ウス好 中球 に対 しては,ex vivoお よびin vivo

で細 胞 毒性 を示す こ とが認 め られ た.ま た この抗 白血 球 作用 に よ り大 腸菌 感染 が助長 され る こ とが 分

か った.

以上 の結 果 よ り,S.aureusお よびSepi6ermi4isの 産生 す るslimeは 弱 い なが らもvirulence factor

とな り うるもの と推 論 した.

序 文

細 菌 の産 生 す る粘 液 性 物 質slimeに つ い て は,

Pseudomonas aeruginosaやStaphylococcus

epidermidisな ど で よ く知 ら れ て い る.ま たS

epidermidisは 主 要 な 皮 膚 常 在 菌 で あ り,元 来 非

病 原 性 細 菌 と考 え られ て きた.し か しな が ら近 年

は 人 工 器 官 移 植 あ る い はimmunocompromised

hostに お い て 本 菌 に よ る尿 路 感i染 症 や 心 内 膜 炎

な どが 多 発 し,い わ ゆ る院 内感 染 と して 注 目され

て い る.本 菌 感 染 症 の 発 症 機構 は 未 だ 充 分 解 明 さ

れ て い な い が,菌 体 外 に存 在 し,,主 に多 糖 か ら成

るslimeが 感 染 に 大 き く関 与 し て い る と言 わ れ て

い る1)～3).一 方 同 属 の 病 原 性 細 菌 で あ るsnphy-

lococcus aureusに お い て も,slimeを 産 生 す る菌

株 の 存 在 が 知 られ て お り,こ れ らのslimeの 感 染

に お よ ぼ す 影 響 に つ い て 調 べ る こ とは,ブ ドウ球

菌 の 病 原 性 を 解 析 す るた め に意 義 深 い も の と思 わ

れ る.

す で に私 た ち はPaeruginosaや 、4cinetobacter

calcoaceticusの 産 生 す るslimeは 貧 食 細 胞 に対 し

て細 胞 毒 性 を示 し,さ ら に マ ウス に 対 して 致 死 活

性 を 有 す る こ とを 報 告 して きた4)～6).本 論 文 で は

Saureusお よ びS.epidermidisよ り分 離 した

Slimeの 生 物 学 的 性 状 お よび 活 性 に つ い て 調 べ,

そ の病 原 性 の 解 析 を 行 な った.

材 料 と方 法

1)使 用 菌 株

臨 床 分 離 のSaureus No.71,S6pidermidis

No.2お よ びA.calcoaceticus TMS266(東 邦 大

学 医 学 部 五 島瑳 智 子 教 授 分 与)を 用 い た.

2)使 用 培 地

主 と してBrain heart infusion broth(BHIB:

Difco)お よびBrain heart infusion agar(BHIA:

Difco)を 用 いた.

3)使 用 動 物

Std-ddY系 雄 マ ウス(18～20g)を 用 いた.

4)Slimeの 調 製

そ れ ぞ れ の 菌 株 をBHIAを 用 い,Johnsonら7)

が報 告 して い る方 法 に よ り培 養(37℃,48時 間)

後,菌 体 お よ び菌 体 外 物 質 を生 理 的 食 塩 水(生 食

別刷請求先:(〒607)京 都市山科区御陵中内町5番 地

京都薬科大学微生物学教室 尾花 芳樹

平成元年9月20日

992 尾花 芳樹 他

水)を 用 い て集 め,遠 心 操 作 に よ り菌 体 を 分 離 し

た.得 られ た上 清 を 約3倍 容 の エ タ ノー ル 中 に注

ぎ,粗slimeを 分 離 した.さ らに來 雑 物 を 除 くた

め,slimeを 生 食 水 で溶 解 し,再 び エ タ ノ ール 中 に

注 ぐ操 作 を3回 繰 り返 し粗slilneを 得,実 験 に供

試 した.

5)化 学 組 成 お よび 粘 度 測 定

粗slimeの 化 学 組 成 に っ い て,DNA量 は ジ

フ ェニ ル ァ ミン法,RNA量 は オ ル シ ノ ー ル 法,蛋

白量 はLowry法,総 糖 量 は フ ェ ノー ル硫 酸 法,ア

ミ ノ糖 量 はEISQn-Morgan法 で そ れ ぞ れ 定 量 し

た.ま た 粘 度 測 定 はB型 粘 度 計(東 京 計 器)を 用

い て,15℃ に お け る1mg/ml溶 液 に つ い て 行 な っ

た.

6)Slimeの 致 死 活 性

マ ウ ス に対 す るslimeの 致 死 活 性 は ,生 食 水 に

溶 解 し たslimeを 静 脈 内 あ る い は 腹 腔 内 に 投 与

し,そ の 後3日 間 生 死 を 観 察 す る こ と に よ り行

な った.

7)マ ウ ス好 中 球 に 対 す るslimeの 作 用

マ ウス腹 腔 内 に1%グ リ コー ゲ ン溶 液1mlを 注

入 し,4時 間 後 に腹 腔 浸 出 液 を無 菌 的 に採 取 し,

好 中 球 を得 た.細 胞 毒 性 試 験 は20%マ ウス血 清 を

含 むEagle'sMEM(日 水 製 薬)に 好 中 球 を 培 養

し,slime添 加2時 間 後 に トリパ ン ブ ル-液 で 染

色 を行 な い,細 胞100個 につ い て 鏡 検 し,染 色細 胞

(死 細 胞)数 を測 定 した.ま た貧 食 能 は試 験 菌 と し

てEscherichia coli K-12を 用 い,細 菌 と好 中 球 の

割 合 を10:1で 混 合 し,slime添 加 後37℃ で1時

間 培 養 した.そ の 後 培 養 液 の塗 抹 標 本 を 作 製 し,

ギ ムザ 染 色 を 行 な い,鏡 検 に よ り貧 食 細 菌 数 を測

定 した.さ らに マ ウ ス末 梢 白血 球 数 に 及 ぼ す 影 響

に つ い て 観 察 す る た め,slimeを 腹 腔 内 に投 与 し

4時 間 後 に そ れ ぞ れ の マ ウ ス か ら末 梢 血 を 採 取

し,チ ュル ク染 色 後,血 球 計 算 盤 を 用 い て 白血 球

数 を 測 定 した.

8)大 腸 菌 感 染 に及 ぼ すslimeの 影 響

マ ウ ス腹 腔 内 にEcolisTo198とLD,。 値 の 半

量 以 下 の 濃 度 のslimeを 同 時 に接 種 し,そ の 後5

日間 生 死 の 観 察 を 行 な った.

成 績

1)Slimeの 化 学 組 成 お よ び粘 度 測 定

S.mrensNo.71お よび Ｓ.epidermidis No.2

か ら分 離 した粗slimeの 化 学 組 成 お よ び粘 度 測 定

の 結 果 をTable1に 示 した.両 菌 株 のslimeは 蛋

白,RNA(オ ル シ ノ ール 反 応 陽 性物 質)お よ び 総

糖 量 が20～38%と い う高 い 値 を示 して お り,ま た

両slimeは 成 分 的 に近 似 し て い る も の と思 わ れ

た.さ らに そ れ ぞ れ のslimeの 粘 度 を 測 定 した と

こ ろ,2.0～2-4cPで あ り,結 果 を 示 して い な い が

A.calcoaceticus TMS266の6.8cPに 比 べ て 粘 性

が 低 い もの で あ った.

2)Slimeの 致 死 活 性

各 菌 株 よ り得 られ たslimeの マ ウ スに 対 す る致

死 活 性 につ い て 検 討 し た 結 果 をTable2に 示 し

た.ブ ドウ球 菌 のslimeは 静脈 内 投 与 で は1.Omg/

mouse,腹 腔 内 投 与 で は3.0mg/mouseと い う今

回 の 実 験 条 件 下 で は 全 く致 死 活 性(LD,。 値)は 認

め られ なか った.一 方,A.calcoaceticusのslime

のLD5。 値 は 静 脈 内 投 与 で は0.025mg/mouse,腹

腔 内 投 与 で は0.082mg/mouseで あ った.こ れ ら

の 結 果 よ り,ブ ドウ球 菌 のslimeの マ ウス に対 す

る致 死 性 はA.calcoacetic粥 に比 べ て き わ め て低

い もの と推 察 さ れ た.

3)マ ウス好 中 球 に対 す るslimeの 作 用

マ ウス好 中 球 に対 す るslimeの 作 用 に つ い て 検

Table 1 Chemical composition of slime isolated from staphylococci

a) Orcinol reaction-positive substances .b) 1 mg/ml.

感染症学雑誌 第63巻 第9号

ブ ドウ球菌のSlimeの 生物学的活性 993

討 した 結 果 をTable3～5に 示 した.Table3は

slimeの 細 胞 毒 性 の 成 績 で あ る が,い ず れ の 菌 株

のslimeも 作 用 濃度 に 応 じ た細 胞 毒 性 が観 察 さ れ

た.す な わ ち,Saureusで は 好 中球 の 生 存 率 は

58～74%,Sepidermidisで は61～76%で あ り,ブ

ドウ球 菌 のslimeはA.calcoaceticusよ り若 干 毒

性 が 低 い値 が 得 られ た.Table4は 好 中 球1個 あ

た りの 貧 食 菌 数 を 示 した も の で あ る が,slime無

添 加 時 の貧 食 菌 数 が5.08個 で あ る の に 対 し て,ブ

ドウ球 菌 のslimeを 添 加 した 群 で は2.92～4.02個

と 若 干 低 値 を 示 し た.し か し な が らA.caム

coaceticusの 場 合 に 比 べ 減 少 数 は 比 較 的 小 さい も

Table 2 Lethal activity of slime isolated from

various organisms against mice

の で あ った.さ らにTable5は マ ウ ス 腹 腔 内 に

slimeを 投 与 し,末 梢 白血 球 数 に 及 ぼ す 影 響 を 調

べ た もの で あ る が,slime無 添 加 群 に 比 べ,ブ ドウ

球 菌 のslime0.3mg/mouse投 与 で は約50%,1.0

mg/mouseで は約30%に 減 少 し,明 らか に 白血 球

減 少 作 用 を示 す こ とが 認 め られ た.ま たLD5。 値 の

約 半 量 のslimeを 投 与 した 、4.calcoaceticusに お

い て も同 様 の作 用 が 認 め られ た.

4)大 腸 菌 感 染 に及 ぼすslimeの 影 響

Table 3 Cytotoxicity of slime isolated from

various organisms against polymorphonuclear

leukocytes of mice ex vivo

*All culture were incubated at 37t for 2h .

Table 4 Effect of slime isolated from various organisms on phagocytosis

of E. coli K-12 by polymorphonuclear leukocytes of mice ex vivo

*All culture were incubated at 37t for 1h .

Table 5 Leukopenia in the peripheral circulation of mice after 4 hours of

intraperitoneal injection of slime isolated from various organisms

平成元年9月20日

994 尾花 芳樹 他

Table 6 Effect of slime isolated from various organism on virulence of

E. coli ST0198 in mice

a) Slime were simultaneously injected .

b) Bacterial suspension without mucin were challenged intraperitoneally .

EcoliSTO198感 染 に及 ぼ すslimeの 影 響 に つ

い て 検 討 した 結 果 をTable6に 示 した .Saunus

のslime投 与 群 で は1.Omg/mouse投 与 に お け る

EcoliのLD5。 値 は 無 投 与 群 の 約1/10で あ る

4.6×104cells/mouseに 低 下 した が,こ れ よ り も

低 い濃 度 のslimeで は ほ と ん どLD5。 値 の 変 動 は

認 め られ ず,slime無 投 与 群 とほ ぼ 同 様 の 数 値 を

示 した.S. epidermidisで は3.Omg/mouse投 与 に

お い て 約1/10にLD 50値 が 低 下 した が,こ れ 以 下 の

濃1度で は,Saureusの 場 合 と同様 に ほ とん ど影 響

が 認 め られ なか った.一 方,A. calcoaceticusで は,

ブ ドウ球 菌 のslimeよ り,さ ら に低 い投 与 量 に お

い て 約1/30のLD 50値 の低 下 が 認 め られ た.こ の結

果 ブ ド ウ 球 菌 のslimeはA. calcoaceticusに 比

べ,大 腸 菌 感 染 を 助 長 しに くい も の と思 わ れ た .

考 察

ブ ドウ球 菌 属 の 中 で 化 膿 性 疾 患 の原 因 菌 で あ る

S aureusは 菌 体 外 にcoagulase, enterotoxin,

leukocidinな どの 活 性 物 質 を 多 量 に産 生 し,こ れ

ら の毒 素 や 酵 素 がS aureusの 病 原 性 の 本 質 で あ

る と考 え らて い る.ま たcoagulase産 生 性 の な い

S. epidermidisはS. areusの よ うな毒 素 や 酵 素

を 産 生 し な い が,phosphatase, gelatinase,

hemolysinな ど の菌 体 外 活 性 物 質 を 産 生 す る こ と

が よ く知 られ て お り,こ れ らのvirulence factor

が 本 菌 の 病 原 性 に 深 い関 係 を 有 す る と考 え られ て

い る.さ ら に両 一菌 種 に は菌 体 外 に粘 液 性 物 質 で あ

るslimeを 産 生 す る菌 株 が 存 在 し,こ の よ うな 菌

株 は マ ク ロ フ ァ ー ジや 多 核 白血 球 な どの 貧 食 細 胞

に抵 抗 す る こ とな どか らvirulenceが 強 い と考 え

られ て い る3)7)8).ま たslime産 生 性 のSepide処

midisは 医 療 用 プ ラ ス チ ック な ど の 非 生 物(カ

テ ー テ ル な ど)へ の 付 着,定 着 性 が 高 く,カ テ ー

テル 留 置 患 者 に お け る,い わ ゆ る"line sepsis"の

起 炎 菌 と して 重 要 で あ るが,そ の 発 症 機購 は 未 だ

充 分 に解 明 され て い な い.

今 回 私 た ち は,こ れ ら ブ ド ウ球 菌 の 産 生 す る

slimeを 分離 し,そ の 病 原 的 意 義 を 解 析 す るた め,

主 と して 白血 球 に 対 す る作 用 の 面 か ら検 討 した .

S. aureus No.71お よ びSepidermidisNo.2か

ら分 離 した 粗slimeは い ず れ も蛋 白,RNA(オ ル

シ ノ ール 反 応 陽 性 物 質),糖 を 多 量 に 含 む 二複 合 物

質 で あ り,ま た これ らの 粘 性 は/1。CalCOaCetiCuS

TMS266の も の よ り低 か った.ブ ド ウ 球 菌 の

slimeは マ ウス に対 して,静 脈 内 お よ び 腹 腔 内 投

与 に お い て 致 死 活 性 が 認 め られ ず,今 回 対 照 と し

て 使 用 したA. caJcoaoeticus TMS 266のslimeよ

り明 ら か に致 死 性 が 低 い こ とが 分 か った.ま たex

vivoお よ びin vivoに お い て,白 血 球 に 対 す る 影

響 を検 討 し た と こ ろ,殺 細 胞 作 用 や 貧 食 抑 制 作 用

な ど が 認 め られ た が,そ の 作 用 は,A. calooa-

ceticusよ り低 い こ とが 分 か った.さ らに 大 腸 菌 感

染 時 にslimeを 投 与 し,そ の 感 染 増 強 性 を 調 べ た

と ころ,あ ま り顕 著 な 増 強 効 果 を 示 さ な か った.

これ は急 性感 染 症 に お い て 重 要 な役 割 を担 う白血

球 に 対 す るslimeの 機 能 阻 害 作 用 が あ ま り強 く な

感染症学雑誌 第63巻 第9号

ブ ドウ球菌 のSlimeの 生物学的活性 995

い た め で あ る と推 論 して い る.S. epidermidisよ

り分 離 され たslimeの 白血 球 に対 す る作 用 に つ い

て は若 干 の報 告 が あ り,Nobelら8)は 本 菌 の 産 生

す るslimeは ヒ ト好 中 球 の 殺 菌 能 を 低 下 さ せ る

が,貧 食 能 に は 何 ん ら影 響 を 与 え な い と報 告 し,

ま たJohnsonら7)は 同 じ く ヒ ト好 中球 数 の 減 少 や

走 化 能 の 低 下 作 用 を 示 唆 して い る.こ れ らの 事 実

は今 回 私 た ち が 行 な った 実 験 結 果 とほ ぼ一 致 す る

も の で あ る.し か しSaunusに つ い て は ほ と ん

ど報 告 が な い.一 方 細 菌 の産 生 す るslimeの 生 物

学 的 活 性 に つ い て は,P. aeruginosaに お い て 非

常 に よ く研 究 さ れ て お り,Schwarzmannら9),

Dimitracopoulosら10),Nadaud11),Laharrague

ら12)の報 告 が あ り,い ず れ も マ ク ロ フ ァ ー ジや 好

中 球 に 対 す る機 能 阻 害 を報 告 して い る.ま た す で

に私 た ち はA. calcoaceticusのslimeに つ い て,

マ ウス に 対 す る 致 死 活 性,貧 食 細 胞 に対 す る強 い

機 能 阻 害 作 用 を 報 告 して きた4)～6).今 回検 討 を 行

な ったSauzeusお よ びS. ePidermidisのslime

に も 同 じ よ うな 白血 球 に対 す る機 能 阻 害 作 用 の あ

る こ と が 認 め られ た が,そ の 作 用 はA. calcoa-

ceticusに 比 べ あ ま り強 くな い もの で あ る と推 察

で きた.今 回 用 いたslimeは 未精 製 の粗 雑 な もの

で あ りslime本 体 の 作 用 を知 るた め に は さ ら に精

製 した も の を用 い な けれ ば な ら な い と思 わ れ る.

しか し な が らPetersら13)や 濱 田 ら14)は種 々 の 方

法 で精 製 を 行 な って い る が,物 質 中 に はDNA,蛋

白 お よび 糖 な どが 含 まれ,単 離 精 製 は比 較 的 困 難

で あ る と思 わ れ た.ま た 生 体 内 で は本 物 質 は あ く

まで も粗 雑 な状 態 で存 在 して お り,こ れ らの 物 質

が 生 体 内 に 入 る こ とに よ り生 体 防 御 反 応 の変 化 が

生 じ,本 菌 種 あ る い は 他 菌 種 の感 染 が 助 長 され る

こ とが 予 想 され13),臨 床 上 特 にslime産 生 性 の あ

る ブ ドウ球 菌 に よ る感 染 症 に は注 意 を 払 う必 要 が

あ る もの と思 わ れ る.さ ら にSepidermidisで は

slime産 生 株 は 非 産 生 株 に 比 べ て 有 意 に感 染 が 惹

起 され や す い とい う報 告 が あ り2)3)13),slime産 生

株 の カテ ー テ ル な どへ の付 着 に つ い て も留 意 す べ

きで あ る.

文 献

1) Christensen, G. D., Simpson, W. A., Bisno, A. L.

& Beachey, E. H.: Adherence of slime-

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平成元年9月20日

996 尾花 芳樹 他

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14) 濱 田 育 男, 金 子 克, 横 田光 正: Staplylococcus

epidermidisの 産 生 す るslimeに 関 す る研 究. 岩 医

大 歯誌, 9: 168-178, 1984.

Studies on the Biological Activity of Slime Isolated from Staphylococci

Yoshiki OBANA & Takeshi NISHINO

Department of Microbiology, Kyoto Pharmaceutical University

The biological characteristic and activity of slime isolated from Staphylococcus aureus No. 71 andStaphylococcus epidermidis No. 2 was studied.

The slime isolated from both strains had high contents of protein, RNA (orcinol reaction-positivesubstances) and sugar. The slime showed low toxic effect when it was injected intravenously andintraperitoneally into mice. It, however, exhibited potent cytotoxic effect against mouse neutrophils inboth ex vivo and in vivo experiments. The enhancement of virulence of Escherichia coli by slimeisolated from staphylococci was due to neutrophil-impairing effect. It is suggested that the slimeisolated from S. aureus and S. epidermidis may act as an virulence factor.

感染症学雑誌 第63巻 第9号