タンパク質の同定と質量分析タンパク質の同定と質量分析

横浜市立大学・高山光男横浜市立大学・高山光男

１．プロテオーム解析１．プロテオーム解析

２．タンパク質イオンのフラグメンテーション２．タンパク質イオンのフラグメンテーション

３．タンパク質の高次構造とフラグメンテーション３．タンパク質の高次構造とフラグメンテーション

４．４．MSMS情報の正確な使用と情報の正確な使用と Rational MSRational MS

MASSPECSMASSPECS（本内容の無断転載を禁じます）（本内容の無断転載を禁じます）

１．プロテオーム解析１．プロテオーム解析

発現するタンパク質

生命現象を理解するには、生物の発生・分化の歴史を決め生命現象を理解するには、生物の発生・分化の歴史を決めているＤＮＡの塩基配列の解読だけでは不十分だ。ているＤＮＡの塩基配列の解読だけでは不十分だ。

そうだ、そうだ、GenGenomeome から発現するから発現する ProteProtein in をすべてをすべて同定してしまおう。同定してしまおう。

Dr. Marc Wilkins said at the Siena 2Dr. Marc Wilkins said at the Siena 2--DE meeting in 1994, when DE meeting in 1994, when he was a graduate student.he was a graduate student.

MASSPECSMASSPECS

プロテオーム解析に適したプロテオーム解析に適したMSMSイオン化の原理イオン化の原理ペプチドペプチド//タンパク質を高効率でイオン化できることがタンパク質を高効率でイオン化できることが必要条件必要条件

・・ Electrospray IonizationElectrospray Ionization ((ESIESI))

・・ MatrixMatrix--assisted Laserassisted LaserDesorption/IonizationDesorption/Ionization ((MALDIMALDI))

MASSPECSMASSPECS

Electrospray IonizationElectrospray Ionization ((ESIESI))

+ 3,000 VMASSPECSMASSPECS

馬心筋アポミオグロビンの馬心筋アポミオグロビンのESIESI--MSMS

タンパク質研究に欠かせないソフトイオン化法タンパク質研究に欠かせないソフトイオン化法

MatrixMatrix--assisted Laserassisted LaserDesorption/IonizationDesorption/Ionization ((MALDIMALDI))

O

HO

HO OH

O

HO

HO OH

O

HO

HO OH

337 nm photonH

H

MASSPECSMASSPECS

馬心筋アポミオグロビンの馬心筋アポミオグロビンのMALDIMALDI--TOF MSTOF MS

MASSPECSMASSPECS

フラグメントイオンからアミノ酸配列もわかるフラグメントイオンからアミノ酸配列もわかる

MASSPECSMASSPECS

タンパク質のタンパク質のMSMS情報情報

mm//zz が基本情報が基本情報MASSPECSMASSPECS

プロテオーム解析におけるプロテオーム解析におけるMSMSの役割の役割

・各生物種の全発現タンパク質の同定・各生物種の全発現タンパク質の同定・ペプチドマスフィンガープリンティング・ペプチドマスフィンガープリンティング

・アミノ酸配列解析・アミノ酸配列解析

・翻訳後修飾タンパク質の構造解析・翻訳後修飾タンパク質の構造解析

・相互作用解析・相互作用解析

MASSPECSMASSPECS

MS MS を使うタンパク質の同定を使うタンパク質の同定

PeptidePeptide--mass fingerprintingmass fingerprinting

AminoAmino--acid sequencingacid sequencing

最もよく使われるタンパク質同定法最もよく使われるタンパク質同定法PeptidePeptide--mass fingerprintingmass fingerprinting

MASSPECSMASSPECS

PeptidePeptide--mass fingerprintingmass fingerprinting

ペプチドイオンのペプチドイオンの mm//zz 値の集合値の集合

MASSPECSMASSPECS

アミノ酸配列情報を利用するタンパク質同定法アミノ酸配列情報を利用するタンパク質同定法酵素消化と酵素消化とMS/MSMS/MSの組み合わせの組み合わせ

またはまたは EdmanEdman 法法

MASSPECSMASSPECS

アミノ酸配列解析のための分解法アミノ酸配列解析のための分解法

MASSPECSMASSPECS

CID CID またはまたは PSD PSD を使うアミノ酸配列解析：を使うアミノ酸配列解析：ペプチド結合の分解が特徴ペプチド結合の分解が特徴

MASSPECSMASSPECS

タンパク質の同定にはアミノ酸配列が最高の情報タンパク質の同定にはアミノ酸配列が最高の情報

ＭＳでアミノ酸配列情報を得るのは思ったほど楽ではないＭＳでアミノ酸配列情報を得るのは思ったほど楽ではない

MALDIMALDI--PSD PSD でも難しいでも難しい !!

MASSPECSMASSPECS

２．タンパク質イオンのフラグメンテーション２．タンパク質イオンのフラグメンテーション

Horse heart Horse heart apomyoglobinapomyoglobin

InIn--source Decaysource Decay oror hydrogenhydrogen--attachment dissociationattachment dissociation

MALDI MALDI を使うタンパク質の直接シーケンシングを使うタンパク質の直接シーケンシング

MASSPECSMASSPECS

MALDIMALDIのイオン化機構のイオン化機構

MASSPECSMASSPECS

タンパク質タンパク質//ペプチド分子はマトリックス結晶表面をペプチド分子はマトリックス結晶表面を覆っている覆っている

MASSPECSMASSPECS

2,52,5--DHBDHBの結晶表面（左）とペプチド試料を導入したの結晶表面（左）とペプチド試料を導入した結晶表面（右）の原子間力顕微鏡像結晶表面（右）の原子間力顕微鏡像

2,52,5--DHBDHBの結晶表面のステップ構造はペプチドの導入によの結晶表面のステップ構造はペプチドの導入によってスムースになるが、結晶の内部構造は変わらない。ってスムースになるが、結晶の内部構造は変わらない。

337nm 337nm のレーザー光照射によりマトリックスが励起さのレーザー光照射によりマトリックスが励起され、結晶表面を覆っているタンパク質に水素原子が移れ、結晶表面を覆っているタンパク質に水素原子が移

動する動する

MASSPECSMASSPECS

MALDIMALDIを使うタンパク質のラジカル誘導型フラグメンテーを使うタンパク質のラジカル誘導型フラグメンテーションション

MASSPECSMASSPECS

ラジカル誘起によるタンパク質のラジカル誘起によるタンパク質のαα開裂（単純開裂）開裂（単純開裂）

αα開裂はイオン化室で生じる速い過程であるため、開裂はイオン化室で生じる速い過程であるため、アミン結合の特異的な分解を可能にしているアミン結合の特異的な分解を可能にしている

InIn--source Decay (ISD)source Decay (ISD)

MALDIMALDI--TOF MS TOF MS 装置におけるイオンの分解位置装置におけるイオンの分解位置: : InIn--source Decay source Decay とと PostPost--source decaysource decay

MASSPECSMASSPECS

PSDPSD（上段）（上段） とと ISD ISD （下段）の比較（下段）の比較

ACTH18ACTH18--3939, , MMrr 2465.72465.7 RPVKVYPNGAEDESAEAFPLEFRPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF

MASSPECSMASSPECS

ISDISD（上段）（上段） とと PSD PSD （下段）のスペクトルの比較（下段）のスペクトルの比較Substance PSubstance P, , MMr 1347.7r 1347.7 R P K P Q Q F F G L MR P K P Q Q F F G L M--NHNH22

MASSPECSMASSPECS

PSD PSD とと ISD ISD の分解の特徴の分解の特徴

PSDPSD

ISDISD

MASSPECSMASSPECS

ペプチド断片イオンの名称ペプチド断片イオンの名称

MASSPECSMASSPECS

ISDISD を使うプロテオーム解析を使うプロテオーム解析

ペプチドシーケンシングペプチドシーケンシング １１::塩基性アミノ酸塩基性アミノ酸 (Arg or Lys) (Arg or Lys) がが NN--末端側にあると、末端側にあると、45 u45 u 差差のの

cc--イオンとイオンと aa--イオンの対ピークが観測される。イオンの対ピークが観測される。

ペプチドシーケンシングペプチドシーケンシング ２２::塩基性アミノ酸塩基性アミノ酸 (Arg or Lys) (Arg or Lys) がが CC--末端側にあると、末端側にあると、15 u15 u 差差のの z+2z+2--イオンとイオンと yy--イオンの対ピークが観測される。イオンの対ピークが観測される。

タンパク質の直接シーケンシングタンパク質の直接シーケンシング １１：：馬のアポミオグロビン馬のアポミオグロビン ((MMr 16951)r 16951)

フラグメントイオンの解析フラグメントイオンの解析低質量領域に低質量領域に cc--イオンが、より低質量領域にはイオンが、より低質量領域には 15u15u差の差の

zz+2+2 とと yy--イオンが観測される。イオンが観測される。

MASSPECSMASSPECS

タンパク質同定の手順タンパク質同定の手順 その１その１cc--イオンのピーク間質量差にアミノ酸を割り当て、部分イオンのピーク間質量差にアミノ酸を割り当て、部分

アミノ酸配列候補を得る。アミノ酸配列候補を得る。

タンパク質同定の手順タンパク質同定の手順 その２その２得られた部分アミノ酸配列を、データベース検索ソフトに入力する。得られた部分アミノ酸配列を、データベース検索ソフトに入力する。

MASSPECSMASSPECS

タンパク質同定の手順タンパク質同定の手順 その３その３入力されたアミノ酸配列を持つタンパク質の候補が得られる。入力されたアミノ酸配列を持つタンパク質の候補が得られる。

MASSPECSMASSPECS

タンパク質の直接シーケンシングタンパク質の直接シーケンシング 22::

マッコウクジラのアポミオグロビンのマッコウクジラのアポミオグロビンのISDISDスペクトルスペクトル

MASSPECSMASSPECS

タンパク質の直接シーケンシングタンパク質の直接シーケンシング 33::CGMMVCGMMVコートタンパク質のコートタンパク質のISDISDスペクトルスペクトル

MASSPECSMASSPECS

タンパク質の直接シーケンシングタンパク質の直接シーケンシング 44::馬チトクロム馬チトクロムc c ののISDISDスペクトルスペクトル

MASSPECSMASSPECS

３．タンパク質の高次構造とフラグメンテーション３．タンパク質の高次構造とフラグメンテーション

ミオグロビンのミオグロビンの cc35 イオンはなぜ高い？イオンはなぜ高い？

MALDIMALDI--TOF mass spectra of Equine TOF mass spectra of Equine apomyoglobinapomyoglobin ((MrMr 16951)16951)

↓↓

MASSPECSMASSPECS

ミオグロビンのミオグロビンの cc35 イオンはなぜ高い？イオンはなぜ高い？

二次構造では，二次構造では，His36His36ははへへリックスに挟まれたターン部分リックスに挟まれたターン部分

↓↓

MASSPECSMASSPECS

ミオグロビンのミオグロビンの cc35 イオンはなぜ高い？イオンはなぜ高い？GlyGly--HisHisは，へリックスに挟まれたターン部分は，へリックスに挟まれたターン部分

↓↓

MASSPECSMASSPECS

O

HO

OH

OH

OH O

OH

OH

O

HO

OH

OH

OH O

OH

OH

HNCH

C

CH3

NHCH2 C

HN

O

CH C

H2C

NH

O

CHC

H3C NH

O

HO

OH

OH

OHO

OH

OH

O

HO

OH

OH

OHO

OH

OH

NHN CH

CH2C

OHOCH

C CH

HO

O

H3C CH2CH3

OO

ミオグロビンのミオグロビンの cc35 イオンはなぜ高い？イオンはなぜ高い？

helixhelixhelixhelix

turnturn

へリックス領域のへリックス領域のCOCOはマトリックスのはマトリックスのOHOHと結合できないと結合できない

MASSPECSMASSPECS

３．正確な３．正確なMSMS情報の使用と情報の使用とRational MSRational MS

19981998年、年、TOF MS TOF MS の性能は格段に向上し、の性能は格段に向上し、10%10%谷分解能谷分解能はは 3,000 3,000 以上になった以上になった！！

MASSPECSMASSPECS

19921992年、年、TOF MS TOF MS の性能は、の性能は、mm//zz 720720 とと 759759 を分を分離できる程度だった。離できる程度だった。1010％谷分解能は％谷分解能は １０１０ 以下以下！！

MASSPECSMASSPECS

From Empirical Mass Spectrometry From Empirical Mass Spectrometry to Rational Mass Spectrometryto Rational Mass Spectrometry

・・MSMS装置の高精度化に伴う正確な装置の高精度化に伴う正確なMSMS情報情報の使用と厳密な解析の使用と厳密な解析

・・MSMS学学 ((MASSPECSMASSPECS) ) の体系化の体系化

MASSPECSMASSPECS

１．プロテオーム解析生命現象を理解するには、生物の発生・分化の歴史を決めているＤＮＡの塩基配列の解読だけでは不十分だ。プロテオーム解析に適したMSイオン化の原理Electrospray Ionization (ESI)馬心筋アポミオグロビンのESI-MSタンパク質研究に欠かせないソフトイオン化法Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)馬心筋アポミオグロビンのMALDI-TOF MSフラグメントイオンからアミノ酸配列もわかるタンパク質のMS情報プロテオーム解析におけるMSの役割MS を使うタンパク質の同定最もよく使われるタンパク質同定法Peptide-mass fingerprintingPeptide-mass fingerprintingアミノ酸配列情報を利用するタンパク質同定法　酵素消化とMS/MSの組み合わせ または Edman 法アミノ酸配列解析のための分解法CID または PSD を使うアミノ酸配列解析：ペプチド結合の分解が特徴タンパク質の同定にはアミノ酸配列が最高の情報ＭＳでアミノ酸配列情報を得るのは思ったほど楽ではない２．タンパク質イオンのフラグメンテーションMALDI を使うタンパク質の直接シーケンシングMALDIのイオン化機構タンパク質/ペプチド分子はマトリックス結晶表面を覆っている2,5-DHBの結晶表面（左）とペプチド試料を導入した結晶表面（右）の原子間力顕微鏡像337nm のレーザー光照射によりマトリックスが励起され、結晶表面を覆っているタンパク質に水素原子が移動するMALDIを使うタンパク質のラジカル誘導型フラグメンテーションラジカル誘起によるタンパク質のα開裂（単純開裂）MALDI-TOF MS 装置におけるイオンの分解位置: 　　　In-source Decay と Post-source decayPSD（上段） と ISD （下段）の比較ISD（上段） と PSD （下段）のスペクトルの比較Substance P, Mr 1347.7 R P K P Q Q F F G L M-NH2PSD と ISD の分解の特徴ペプチド断片イオンの名称ISD を使うプロテオーム解析ペプチドシーケンシング １:　塩基性アミノ酸 (Arg or Lys) が N-末端側にあると、45 u 差の　c-イオンと a-イオンの対ピークが観測される。ペプチドシーケンシング ２:　塩基性アミノ酸 (Arg or Lys) が C-末端側にあると、15 u 差の　z+2-イオンと y-イオンの対ピークが観測される。タンパク質の直接シーケンシング　１：　　　　　　馬のアポミオグロビン (Mr 16951)フラグメントイオンの解析　低質量領域に c-イオンが、より低質量領域には 15u差のz+2 と y-イオンが観測される。タンパク質同定の手順　その１　　c-イオンのピーク間質量差にアミノ酸を割り当て、部分アミノ酸配列候補を得る。タンパク質同定の手順　その２　得られた部分アミノ酸配列を、データベース検索ソフトに入力する。タンパク質同定の手順　その３　入力されたアミノ酸配列を持つタンパク質の候補が得られる。タンパク質の直接シーケンシング　2:CGMMVコートタンパク質のISDスペクトル馬チトクロムc のISDスペクトル３．タンパク質の高次構造とフラグメンテーションミオグロビンの c35 イオンはなぜ高い？ミオグロビンの c35 イオンはなぜ高い？ミオグロビンの c35 イオンはなぜ高い？３．正確なMS情報の使用とRational MS1992年、TOF MS の性能は、m/z 720 と 759 を分離できる程度だった。10％谷分解能は １０ 以下！From Empirical Mass Spectrometry to Rational Mass Spectrometry