フローサイトメトリー製品およびリソースガイド

BioProbes Journal and newsletter定評ある『BioProbes Journal』は、印刷版とオンライン版の双方で提供しています。 当社の新しい技術と製品を取り上げて最新の研究成果を紹介します。『BioProbes Journal』の最新版やバックナンバーは、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/bioprobesで閲覧できます。

リファレンスガイド

オンライン ツール いつでも最新の情報を

どこでも利用できるモバイル アプリ

オンライン学習ツール

The Molecular Probes Handbook, 11th Edition既存の蛍光標識と検出技術に関する最も包括的な参考書。幅広い参考文献とテクニカルノートを掲載し、多様な生物標識分子と検出試薬を用いた3,000 種類以上の技術的ソリューションを提供します。『The Molecular Probes Handbook』（オンライン版）は、ウェブサイト www.thermo�sher.com/handbookで無償で閲覧いただけます。

抗体選択ツール使いやすい選択ツールによって幅広い高品質一次および二次抗体コンジュゲート製品群を検索できます。www.thermo�sher.com/antibodies

Fluorescence SpectraViewer（オンライン）14種類のフルオロフォアをひとつのグラフに表示。印刷や保存も可能です。 www.thermo�sher.com/spectraviewer

フローサイトメトリー リソース センタープロトコールや手引き、アプリケーションノート、フルオロフォアや製品の選択ガイド、参考文献その他の幅広い技術的リソースをひとつにまとめました。www.thermo�sher.com/�owresources

フローサイトメーターとアクセサリ細胞を個々に解析するための最先端技術。Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer は、精度と感度を損なうことなくパフォーマンスとスループットを最適化します。www.thermo�sher.com/attune

Flow cytometry guide and protocols試薬選択ガイドで特定のアプリケーションとプロトコールに適した試薬を選択。遠隔操作によるトラブルシューティングも可能です。操作のタイミングを逃さない内臓プロトコールタイマーやアラームも搭載しています。

Fluorescence SpectraViewerフルオロフォアのスペクトルをグラフに表示して比較。スペクトルの適合性をチェックして波形を印刷可能な明瞭なフォーマットで電子メールとして送信します。

DailyCalcs science calculatorモル濃度や希釈率、分子量などを簡単に計算します。

無料オンラインセミナー当社の研究者が多様な技術を共有し、実験のコツやヒントを提供します。ウェブサイトwww.thermo�sher.com/probeswebinars では、既存のウェブセミナーの閲覧や新たなWebinarへのサインアップが可能です。

すべてのモバイルアプリはウェブサイトwww.thermo�sher.com/appsから 無償でダウンロードできます。

詳しくはwww.thermo�sher.com/probes をご覧ください。

BIOPROBES 72MOLECULAR PROBES JOURNAL OF CELL BIOLOGY APPLICATIONS

NOVEMBER 2015

SPECIAL IMAGING ISSUE

Visualize apoptosis in context

with Click-iT Plus TUNEL assays

ALSO FEATURING

Intracellular detection of hypoxiaFormation of uniform 3D cancer spheroidsProtection from photobleaching for live cells

リソース

@ThermoFisherJP

facebook.com/ThermoFisherJapan

蛍光の基礎を学ぼう !

意外に知らない蛍光イメージングの基礎知識を分かりやすく解説。「蛍光とは ?」という基礎から蛍光顕微鏡の仕組み、よりよいイメージング写真をとるコツまで様々な知識をギュッとウェブコンテンツに詰めました。授業に使える素材集もダウンロードできます。ぜひご活用ください。www.thermo�sher.com/imagingbasics

販売店研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続上での使用はできません。記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。標準販売条件はこちらをご覧ください。 www.thermo�sher.com/TCFor Research Use only.Not for use in diagnostic procedures. © 2015 Thermo Fisher Scienti�c Inc. All rights reserved.All trademarks are the property of Thermo Fisher Scienti�c and its subsidiaries unless otherwise speci�ed. Printed in Japan. MP097-B1512OB

www.thermofisher.com

テクニカルサポート 0120-477-392　 jptech@thermofisher.com　オーダーサポート TEL：03-6832-6980　FAX：03-6832-9584営　業　部 TEL：03-6832-9300　FAX：03-6832-9580

サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパン株式会社

facebook.com/ThermoFisherJapan　　 @ThermoFisherJP

〒108-0023　東京都港区芝浦 4-2-8本社：

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Invitrogen™ フローサイトメトリー 製品およびリソースガイド

本書はフローサイトメトリー製品とリソースのガイドで、当社の研究者がフローサイトメトリー用に最適化した一次抗体コンジュゲート、細胞機能アッセイ、その他のツールの概要を説明します。当社の研究チームは、蛍光プローブ開発分野でほぼ 40年間、 最先端にいます。本書では、現在実用化されているあらゆるフローサイトメトリーツールの中でも最も有用な製品をご紹介します。お客様が必要とするプローブやアッセイをフルスペクトルの蛍光色で提供する 当社のフローサイトメトリー製品をご検討ください。

フローサイトメトリー製品とリソースの詳細については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-cytometryをご覧ください。

フローサイトメトリーのワークフロー

サンプル調製細胞保存 ____________________2

細胞溶解 ____________________2

固定および透過処理 __________2

Dynabeads 細胞分離 _________3

細胞解析

サンプル調製

抗原検出

装置のセットアップと校正

装置のセットアップと校正アライメント ________________6

サイズキャリブレーション _____6

セルソーティングのセットアップ ___7

コンペンセーション __________7

細胞の絶対計数 ______________9

細胞解析細胞生存率 ________________ 20

細胞増殖 __________________ 22

細胞周期 __________________ 24

アポトーシス ______________ 25

その他の細胞機能アッセイ ___ 28

抗原検出一次抗体 __________________ 12

フルオロフォアの概要 ______ 12

抗体標識 __________________ 15

二次抗体 __________________ 18

カスタムサービス __________ 19

サンプル調製

2

高品質のデータを収集するには、高品質のサンプルを調製することが必要です。InvitrogenTMサンプル調製試薬は、血球保存用、赤血球溶解用、サンプルの固定および透過処理用などを取り揃え、最高の結果を提供します。これらの製品の詳細とプロトコールの入手については、ウェブサイト www.thermo�sher.com/�ow-sampleをご覧ください。

細胞保存TransFix試薬InvitrogenTM TransFixTM試薬（製品番号 FIX2、FIX20、FIX100）は、細胞解析用の白血球の固定と抗原保持に使用する全血保存剤です。複数のサンプルを簡単にバッチ処理し、ラボのワークフローを最適化します。また TransFix試薬で固定した血液は、解析用に収集して他の場所に移すのも簡単です。

細胞溶解Cal-Lyse Whole Blood Lysing SolutionInvitrogenTM Cal-LyseTMプレミックス溶解液（製品番号 GAS010、GAS010S100）は、全血や骨髄液をモノクローナル抗体染色した後、赤血球を溶解するために作製されました。この試薬で処理すると、赤血球は溶解し、白血球は固定されます。また、処理によって白血球に結合した蛍光標識抗体が影響を受けることはなく、白血球の形態的な散乱光特性にも変化はありません。Cal-Lyse溶解液は、染色における洗浄の要不要に関わらず使用できます。

固定剤不含 High-Yield Lyse InvitrogenTM High-Yield Lyse（製品番号 HYL250）は、固定剤不含の赤血球用プレミックス溶解液です。全血に含まれる赤血球をフローサイトメトリー解析から除去しながら、一方で希少な血液細胞集団のロスを最低限に抑えます。この試薬を使用すると、血液サンプルをモノクローナル抗体染色した後、すぐに赤血球を溶解できます。洗浄手順は必要ありません。

固定および透過処理FIX & PERM試薬とキット• 大半の細胞内抗原の解析に対応

• 細胞の形態的な散乱光に影響なし

• バックグラウンド染色を低減

• バリデーション済みのプロトコール

図 1. FIX & PERM Cell Permeabilization Kitを使用して細胞内と細胞表面の抗原を同時に染色 C57BL/6脾臓細胞を 2つの群に分け、一方をブレフェルジン A の存在下、ホルボールミリステートアセテート（PMA）およびイオノマイシンで 5時間刺激し、他方を未処理のまま残しました。その後、フルオレセイン（FITC）コンジュゲート抗マウス CD4抗体（製品番号 MCD0401）で細胞表面を染色しました。次に FIX & PERM Cell Permeabilization Kit（製品番号 GAS003、GAS004）でサンプルを固定および透過処理しました。透過処理中に、PE-Cy 7タンデムコンジュゲート抗マウスγインターフェロン（IFN-γ）抗体（製品番号 A18713）および Paci�c Blueコンジュゲート抗マウス腫瘍壊死因子 α（TNF-α）抗体（製品番号 RM90128）で細胞内を染色しました。AttuneAcoustic Focusing Cytometer（ブルー /バイオレットレーザー）を使用して 488 nmレーザーで励起後、530/30 nmバンドパスフィルターで FITC蛍光シグナルを、また 640 nmロングパスフィルターで PE-Cy 7タンデム蛍光シグナルを検 出 し、 デ ー タ を 収 集 し ま し た。Paci�c Blue蛍 光 シ グ ナ ル は、 405 nmレーザーで励起し、450/40 nmバンドパスフィルターで検出しました。（A）は、すべてのマウス脾細胞を IFN-γ抗体と TNF-α抗体の双方で染色し、リンパ球でゲーティングしました。未処理細胞が左、ブレフェルジン Aの存在下、PMAとイオノマイシンで刺激した細胞が右です。（B）は、上記と同条件で刺激した後、TNF-α（左）と IFN-γ（右）を発現した CD4+ T細胞 です。

IFN–γ–PE-Cy 7 �uorescence106105104103-103TN

F-α

–Pac

i�c

Blu

e �uo

resc

ence

TNF-α

–Pac

i�c

Blu

e �uo

resc

ence

106

105

104

-103103

IFN–γ–PE-Cy 7 �uorescence

CD4–Fluorescein �uorescence CD4–Fluorescein �uorescence

IFN

–γ–P

E-C

y 7 �

uore

scen

ce

106105104103-103

106

105

104

-103103

106105104103-103

106

105

104

-103103

106105104103-103

106

105

104

-103103

TNF-α

–Pac

i�c

Blu

e �uo

resc

ence

A

B

サンプル調製InvitrogenTM FIX & PERMTM Cell Permeabilization Kit（製品番号 GAS003、GAS004）は、固定用（Medium A）と透過処理用（Medium B）の 2つの試薬を組み合わせ、ひとつの細胞群で細胞内と細胞表面の抗原を同時に分析できるようにします（図 1）。この手法では抗体が容易に細胞内構造に浸入するため、細胞の形態的な散乱光特性が損なわれません。また独自の試薬によりバックグラウンド染色を低減し、透過処理試薬と蛍光標識抗体を同時に浸透させます。固定用試薬（製品番号 GAS001S100）と透過処理用試薬（製品番号 GAS002S100）は、別々に購入することもできます。

サンプル調製

3

Dynabeads 細胞分離• 実用的かつ機能的̶ポジティブ分離、ネガティブ分離、細胞の活性化および不活化向けの製品

• 穏やか̶表面が不活性のビーズによるカラムフリー分離で細胞をこれまでより穏やかに取り扱い、調製時の汚染リスクを低減

• 高収量̶チューブによる分離で優れた細胞回収率を達成

細胞を元の環境から移動させると、実験手順が細胞のフェノタイプや機能に悪影響を及ぼす恐れがあります。そのため下流の実験を成功させるには、正しい細胞分離法を選択する必要があります。DynabeadsTM 磁気ビーズは、磁性物質を薄い不活性ポリマーシェルでコーティングした超常磁性のモノサイズポリマービーズです（図 2）。この設計によって、分離後にサンプルが鉄などの好ましくない物質で汚染されにくくなります。またネガティブ分離用および depletion用ビーズでは細胞はビーズにまったく結合せず、ポジティブ分離用ビーズでは細胞を穏やかに分離した後、磁気ビーズから放出するため、最終的な細胞サンプルは純度と生存率が高く、結果に影響を与える残留物がありません（図 3）。

ヒト細胞分離Dynabeads磁気ビーズは、チューブを用いて全血や単核細胞、バフィーコート、骨髄、組織サンプルから、直接ヒト細胞を穏やかに分離します。分離した細胞は、フローサイトメトリーをはじめ、下流のあらゆるアッセイに使用可能です（図 4）。Dynabeads製品には、ヒト T細胞、B細胞、幹細胞、NK細胞、単球、樹状細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、白血球、顆粒球などの分離用製品群があります。

分離オプション:

• ポジティブ分離と細胞溶出

• ネガティブ分離（細胞はビーズに結合しない）

• 不要な細胞またはポジティブ分離細胞の除去（細胞アプリケーション用）

• お客様独自の抗体を使用した細胞分離

ヒト細胞分離用の既成の製品が見つからない場合は、お客様の選択した抗体を組み合わせて独自の細胞分離用ツールを作製できる幅広い Dynabeads製品（ストレプトアビジン Dynabeads、二次抗体コーティング済 Dynabeads、表面活性化 Dynabeadsなど）を提供しています。詳細については、ウェブサイト www.thermo�sher.com/humancellisolationをご覧ください。

図 2. Dynabeadsは、均一な球体のビーズです。高度に規格化され、製品特性が安定しているため、信頼性と再現性の高い結果を確実に提供します。

1

2

3

図 3. Dynabeads ビーズによるチューブを使用したポジティブまたはネガティブ細胞分離のワークフロー

01,

000

500

2,00

01,

500

CD4 FITC

102 103 104 105

025

075

050

01,

250

1,00

0

CD4 FITC

102 103 104 105

Cou

nt

Cou

nt

図 4. ヒト CD4+ T細胞の純度Dynabeads UntouchedTM Human CD4 T Cells Kitを使用した末梢血単核球のネガティブ分離前（上）と後（下）の純度

01,

000

500

2,00

01,

500

CD4 FITC

102 103 104 105

025

075

050

01,

250

1,00

0

CD4 FITC

102 103 104 105

Cou

nt

Cou

nt

初期サンプルを Dynabeads で インキュベート

ビーズに捕捉された 細胞を Dynal MPC マグネットで分離

ビーズに結合しない 細胞を含む上清を 新しいチューブに移動

ポジティブ分離細胞 （ビーズで捕捉された 細胞）

分子アプリケーション （mRNA/DNA 解析など）

細胞ベース アッセイ、フローサイトメトリー、細胞培養

ビーズを分離

ネガティブ分離細胞 （ビーズに結合しない細胞）

サンプル調製

4

マウス細胞分離Dynabeadsは、チューブを用いて全血や脾臓、リンパ節、胸腺サンプルから、直接マウス細胞を穏やかに分離します。分離した細胞は、フローサイトメトリーをはじめ下流のあらゆるアッセイに使用可能です（図 5）。Dynabeadsには、マウス T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞などの分離用製品群があります。

分離オプション:

• ポジティブ分離と細胞放出

• ビーズに結合しない細胞のネガティブ分離

• 不要な細胞またはポジティブ分離細胞の除去（細胞アプリケーション用）

マウス細胞分離用の既成の製品が見つからない場合は、お客様の選択した抗体を組み合わせて独自の細胞分離用ツールを作製できる幅広い Dynabeads製品（ストレプトアビジン Dynabeads、二次抗体コーティング済 Dynabeads、表面活性化 Dynabeadsなど）を提供しています。詳細については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/mousecellisolationをご覧ください。

オンラインで詳細情報を提供ウェブサイトwww.thermo�sher.com/cellisolationでは、当社のすべての細胞分離製品についての詳細説明と次の情報を提供しています。

• 最適の細胞分離製品を選択するためのガイド

• サンプル調製プロトコールと細胞分離の手引き

• 当社の細胞分離製品を他社の市販製品と比較した性能データ

• 使用するチューブやプレートに最適の分離用磁石を選択するためのヘルプ

• ビデオやパンフレット、アプリケーションノートおよび Dynabeads製品を使用した参考文献へのリンク

図 5. マウス脾細胞からの CD4+ T細胞の分離CD4+ T細胞の分離において Dynabeads FlowComp Mouse CD4 Kit（上）は、カラムベースのポジティブ細胞分離（下） （純度と生存率はそれぞれ 78%と 63%）との比較で大幅に高い純度（97%）と生存率（86%）を示しました。

CD4+

0

50

100

200

150

300

250

350

400

102 103 104 105

CD4+

102

103

104

105

102 103 104 105

CD4+

102 103 104 105

0

100

200

400

300

500

600

CD4+

102

103

104

105

102 103 104 105

Dynabeads® FlowComp™ Mouse CD4 Kit

計　数

ヨウ化プロピジウム

ヨウ化プロピジウム

計　数

Cou

nt

ヨウ化プロピジウム

カラムベース分離

Dynabeads FlowComp Mouse CD4 Kit

純度：97.2%

純度：78.5%

生存率：63%

生存率：86%

ヨウ化プロピジウム

Cou

nt

サンプル調製

5

サンプル調製製品のリスト分類 製品名 生物種 ターゲット

細胞のタイプ容量 製品番号

細胞保存

TransFix 試薬 NA NA

2 mL FIX2

20 mL FIX20

100 mL FIX100

赤血球溶解Cal-Lyse Whole Blood Lysing Solution NA NA

25 mL GAS010

100 mL GAS010S100

High-Yield Lyse NA NA 500 mL HYL250

固定および透過処理 FIX & PERM Cell Permeabilization Kit NA NA 50回分 GAS003

200回分 GAS004

固定用試薬（Medium A） NA NA 100 mL GAS001S100

透過処理用試薬（Medium B） NA NA 100 mL GAS002S100

Dynabeads 細胞分離 Dynabeads FlowComp Human CD4 Kit ヒト T細胞 3 mL 11361D

Dynabeads CD4 Positive Isolation Kit ヒト T細胞 5 mL 11331D

Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ヒト T細胞 1キット 11352D

Dynabeads FlowComp Human CD8 Kit ヒト T細胞 3 mL 11362D

Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ヒト T細胞 5 mL 11333D

Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit ヒト T細胞 1キット 11348D

Dynabeads FlowComp Mouse CD4 Kit マウス T細胞 3 mL 11461D

DETACHaBEAD Mouse CD4 Kit マウス T細胞 5 mL 12406D

Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit マウス T細胞 2 x 10 mL 11415D

Dynabeads FlowComp Mouse CD8 Kit マウス T細胞 1キット 11462D

Dynabeads Untouched Mouse CD8 Cells Kit マウス T細胞 2 x 10 mL 11417D

N/A は該当なしの略。

本カタログにて紹介している各種「Dynabeads製品」は株式会社ベリタスにて取扱いを致しております。●お問い合わせ先株式会社ベリタス　〒 105-0001 東京都港区虎ノ門 2-7-14　八洲ビルTEL 03-3593-3211（代） FAX 03-3593-3216E-mail：veritas@veritastk.co.jpURL：http://www.veritastk.co.jp

装置のセットアップと校正

6

図 6. 488 nmアルゴンイオン レーザーで励起し、3つの蛍光チャネルでモニターした AlignFlow ビーズ3つの蛍光チャネルすべてで明確な蛍光シグナルが検出されました。ビーズの蛍光強度にほとんどばらつきがないことに注目してください（データ提供 : Carleton Stewart, Rosewell Park Cancer Institute）。

粒子の数

緑色 橙色 赤色

蛍光強度

102 104103 102 104103 102 104103

• 日々の装置のパフォーマンスを高い信頼性で最適化

• 一貫したデータ収集でばらつきを最小限に抑制

• どのような装置にも適合

フローサイトメーターは、個々の細胞その他の粒子を、高い精密度と速度、正確度で定量測定するための装置です。他のあらゆる高性能装置と同様、フローサイトメーターも精度と信頼性を確保するため頻繁に校正する必要があります。当社のマイクロスフィア製品は、その安定性と均一性、再現性によってフローサイトメーターのセットアップと校正に不可欠のツールとなっています。マイクロスフィア製品の概要については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-standardsをご覧ください。

アライメントAlignFlow Cytometry Alignment BeadsInvitrogenTM AlignFlowTM Flow Cytometry Alignment Beadsは、フローサイトメーターのアライメント、焦点調節、キャリブレーション用に作製された信頼性の高いリファレンスビーズです。この蛍光染色ポリスチレンマイクロスフィアは、サイズや蛍光強度の均一性に優れ（図 6）、生体サンプルとほぼ同じサイズやシグナルの波長および強度を備えています。AlignFlowは、色素をビーズの表面ではなく内部に含んでいるため、光化学的および物理的安定性に優れ、装置のセットアップ用に信頼性の高いリファレンスシグナルを発します。ビーズの蛍光色素は、通常のフローサイトメトリーで使用されるレーザー源の励起波長を最適化できるよう慎重に選択されています。AlignFlowビーズには、350～ 370 nm励起 UV レーザー用（製品番号 A16502、A16505）、488 nm励起ブルーレーザー用（製品番号 A16500、A16503）、633 nm励起レッドレーザー用（製品番号 A16501、A16504）の 3種類があります。ビーズのサイズはそれぞれ直径 2.5 µmと 6.0 µmの2種類です。

サイズキャリブレーションFlow Cytometry Size Calibration KitInvitrogenTM Flow Cytometry Size Calibration Kit（ 製 品 番 号 F13838）は、信頼性の高いフローサイトメトリー用サイズリファレンスとして作製された非蛍光マイクロスフィア懸濁液のセットです。このキットには未染色ポリスチレンマイクロスフィアの懸濁液が 6種類同梱されています。各マイクロスフィアの直径は、透過電子顕微鏡法で測定済みです。実験サンプルに含まれる細胞のサイズは、前方散乱光（FSC）シグナルをリファレンスビーズと比較することで推定できます。このマイクロスフィアは再現性のあるサイズマーカーとして働き、実験サンプルに混合することも、また並行してランすることも可能です（図 7）。

図 7. Flow Cytometry Size Calibration KitFlow Cytometry Size Calibration Kit（製品番号 F13838）に同梱の 6種類のポリスチレンマイクロスフィアサンプルを使用し、前方散乱光の強度（FSC）を表すログ チャネル値のヒストグラムを解析しました。FSCの測定には励起波長 488 nmの Becton Dickinson FACScanフローサイトメーターを使用しました。

FSC800 10006004002000

300

200

100

0

1.0 µm

2.0 µm

4.0 µm

6.0 µm

10 µm

15 µm

粒子の数

装置のセットアップと校正Flow Cytometry Sub-micron Particle Size Reference Kit InvitrogenTM Flow Cytometry Sub-micron Particle Size Reference Kit（製品番号 F13839）は、信頼性の高いフローサイトメトリー用サイズ リファレンスとして作製された緑色蛍光マイクロスフィア懸濁液のセットです。キットにはポリスチレンマイクロスフィアが 6 種類同梱されています。各マイクロスフィアの直径は、透過電子顕微鏡法で測定済みです。すべてのビーズは、励起および発光プロファイルが Alexa Fluor 488または FITCで染色した細胞とほぼ同一です（最大励起波長 505 nm、最大発光波長 515 nm）。

粒子の数

粒子の数

蛍光強度

FSC

緑色 橙色 赤色

装置のセットアップと校正

7

コンペンセーション 理想的な実験環境では、各フルオロフォアの蛍光プロファイルはきわめて強く、狭いピークを描き、他のシグナルのピークと完全に分離できるはずです。しかし実際には、有機色素や蛍光タンパク質は幅広いシグナルピークを描きます。一般に利用される 2つのフルオロフォアが描くピークの重複を図 9に示しました。これは Alexa Fluor 488色素と R-フィコエリスリン（R-PE）の蛍光プロファイルです。収集したデータを正しく分析するには、Alexa Fluor 488色素で収集した蛍光シグナルが確実にAlexa Fluor 488のものであり、波長領域の一部が重複しているR-PEのシグナルが混じっていないことを確認する必要があります。そのためどのフルオロフォアを使用する場合も、蛍光シグナルを正確に収集するには、すべての色素でシグナルの補正が不可欠となります。この補正がコンペンセーションです。

当社は 2種類のコンペンセーションキットを提供しています（表 1）。InvitrogenTM AbCTM Bead Kitは、蛍光標識抗体を用いたイムノフェノタイピング用蛍光色素のコンペンセーションに使 用 し ま す。 ま た InvitrogenTM ArCTM Amine Reactive Compensation Bead Kitは、InvitrogenTM LIVE/DEADTM Fixable Dead Cell Stain Kitなどのアミン反応性色素を用いた細胞生存率アッセイに使用します（詳細については 20ページの「細胞生存率」を参照）。

AbC compensation bead kits• フローサイトメトリーのコンペンセーションに貴重なサンプルを使用する必要なし

• マウスやラット、ハムスターの免疫グロブリンでは、異なるサブクラスにきわめて高い反応性を発揮

• 迅速でシンプルなビーズベースのフローサイトメトリー用コンペンセーション

• 抗原発現のばらつきによる不安定さを解消

実験サンプルに含まれる生体粒子のサイズ（またはサイズ領域）は、FSCをリファレンスビーズと比較することで推定できます（図 8）。各実験でマイクロスフィアは、再現性のあるサイズマーカーとして機能し、個別（ひとつのサイズのみ）にも、またはプレミックス（2～ 6サイズ）としても使用できる上、実験サンプルに混合することも、平行してランすることもできます。

このキットは、装置のパフォーマンスの確認やサブマイクロ粒子の分析に適したパラメータの設定に利用できます。たとえば次のような項目のチェックに使用します。

• 粒子サイズ測定の際の分解能の上限やダイナミックレンジ

• 光電子増倍管の前方および側方散乱光の感度

• 装置のベースラインノイズのレベル

• レーザーと光学系のアライメントと安定性

• 流体システムの安定性

セルソーティングのセットアップCell Sorting Set-Up Beads Cell Sorting Set-Up Beads（ 製 品 番 号 C16506、C16507、C16508、C16509）は、フローサイトメトリー用セルソーターのセットアップと校正用に作製された信頼性の高いスタンダードです。直径 6 µm（± 10%）のこのビーズは、サイズやシグナルの波長および強度が多くの生物学的サンプルと同等です。そのためドロップディレイや効率（ソーティング中の細胞損失の割合）といったセルソーターの設定のチェックに利用できます。またフローサイトメーターのレーザー源、光学系、流量の校正にも使用できるため、貴重で繊細な実験サンプルを無駄にすることがありません。

図 8. Flow Cytometry Sub-micron Particle Size Reference KitFlow Cytometry Sub-micron Particle Size Reference Kit（製品番号 F13839）には 6 種類のサイズの粒子が同梱されていますが、ここではそのうち 5種類を使用しました。この 5つの粒子のシグナルは、Attune Acoustic Focusing Cytometerを使用して 488 nm レーザーで励起後、530/30 nmバンドパス（BP）フィルターで収集しました。5種類の緑色蛍光マイクロスフィアの直径は、グラフ上で粒子の蛍光シグナルを縦軸、側方散乱光を横軸に取り、特定しました。

図 9. Alexa Fluor 488色素（緑色）と R-PE（オレンジ色）の蛍光プロファイル

Rel

ativ

e in

tens

ity (%

)

(nm)

0

25

50

75

100

300 400 500 600 700 800 900波長

0.1 µm0.2 µm

0.5 µm

1 µm

2 µm

106105103 104102

106

105

104

103

102

101

100530/

30 n

m B

P で収集した粒子の

蛍光シグナル

側方散乱光

530/

30 n

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P で収集した粒子の

蛍光シグナル

側方散乱光

装置のセットアップと校正

8

AbC Bead Kitは、フローサイトメトリーのコンペンセーション用の安定した正確な使いやすいキットとして次の抗体に使用できます。(1)蛍光標識ハムスター、マウス、ウサギまたはラット抗体（AbC Total Antibody Compensation Bead Kit、製品番号 A10497、図 10）、(2)蛍光標識マウス抗体（AbC Anti-Mouse Bead Kit、製品番号 A10344、図 11）、(3)蛍光標識ラットまたはハムスター抗体（AbC Anti-Rat/Hamster Bead Kit、製品番号 A10389）。これら 3つのキットには、いずれも特別に調製されたポリスチレンマイクロスフィアが 2種類同梱されています。一方は特定の免疫グロブリンのアイソタイプすべてに結合する AbCTM捕捉ビーズ（またはポジティブビーズ）、他方は抗体結合能のないネガティブビーズです。この 2種類のビーズは、蛍光標識一次抗体（使用するキットによりハムスター、マウス、ラット、ウサギのいずれか）とインキュベーションすると、明確なポジティブおよびネガティブ群に分かれるため、コンペンセーションに利用できます（図 11）。

細胞の染色に使用した蛍光標識抗体でコンペンセーションを実施することも可能です。ビーズの散乱光の優れた安定性と表面抗体の高い結合能により、どのような蛍光標識一次抗体を組み合わせても、より安定性と精度の高いコンペンセーションが実現します。2つのマイクロスフィア（AbC捕捉ビーズおよびネガティブビーズ）はどちらも直径約 6 µm（各ロットの正確なサイズは容器に表示）です。またビーズ懸濁液は、サンプルに添加しやすいようスポイト容器に封入されています。

製品名 アッセイの種類 ポジティブビーズ ネガティブビーズ 製品番号

AbC Total Antibody Compensation Bead Kit

イムノフェノタイピング

ハムスター、マウス、ウサギ、ラットの抗体 * 非結合 A10513A10497

AbC Anti-Mouse Bead Kit イムノフェノタイピング

マウス モノクローナル抗体 * 非結合 A10344

AbC Anti-Rat/Hamster Bead Kit イムノフェノタイピング

ラットとハムスターのモノクローナル抗体 * 非結合 A10389

ArC Amine Reactive Compensation Bead Kit

細胞生存率アッセイ アミン反応性色素と LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain

非アミン反応性 A10346

* AbC 捕捉ビーズはすべてのアイソタイプに結合します。これらはすべて研究用にのみ使用できる製品です。診断用には使用できません。

表 1. コンペンセーションキット選択ガイド

ArC Amine Reactive Compensation Bead Kit • 細胞の煩雑な熱処理を省略

• すべての LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain kit用に最適化

• 迅速でシンプルなビーズベースのフローサイトメトリー用コンペンセーション

• コンペンセーションに貴重なサンプルを使用する必要なし

• 正確で安定した結果を提供

ArC Amine Reactive Compensation Bead Kit（ 製 品 番 号 A10346）は、フローサイトメトリーのコンペンセーション用の安定した正確な使いやすいキットです。すべての LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kitをはじめ、あらゆるアミン反応性色素に使用できます。LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit（およびアミン反応性色素）は、細胞内のアミンに反応するため、哺乳類細胞の生存率評価に利用されています。これらの反応性色素は、壊死細胞では損傷した細胞膜を通って細胞内に入り、細胞の表面や内部の遊離アミンと反応して強い蛍光シグナルを発します。一方、生細胞では、色素は細胞表面のアミンとのみ反応するため、蛍光シグナルが比較的弱くなります。生細胞群に比べて死細胞群の蛍光シグナルは、通常 50倍以上です。

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

200

100

400

300

600

500

800

700

900

1,000

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

200

100

400

300

600

500

700アルメニアン ハムスター IgG

シリアン ハムスター IgG

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

200

100

400

300

600

500

800

700

900 マウス IgG1

マウス IgG2aマウス IgG2b

マウス IgG3

マウス IgGM

ラット IgG1ラット IgG2a

ラット IgG2bラット IgG2c

ラット IgGM

Cou

ntC

ount

Cou

ntC

ount

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

200

100

400

300

600

500

800

700ウサギ モノクローナル IgG

ウサギ ポリクローナル IgG図 10. AbC Total Antibody Compensation Bead Kit の染色能を示すヒストグラムマウス（A）、ラット（B）、ハムスター（C）のモノクローナル抗体とウサギ（D）のモノクローナルおよびポリクローナル抗体におけるポジティブビーズのシグナル分離。最適量の各 PE抗体コンジュゲートでビーズを標識し、488 nmレーザーで励起後、574/26 nmバンドパスフィルターを使用して Attune Acoustic Focusing Cytometerでシグナルを収集しました。

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

200

100

400

300

600

500

800

700

900

1,000

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

200

100

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300

600

500

700アルメニアン ハムスター IgG

シリアン ハムスター IgG

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

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500

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700

900 マウス IgG1

マウス IgG2aマウス IgG2b

マウス IgG3

マウス IgGM

ラット IgG1ラット IgG2a

ラット IgG2bラット IgG2c

ラット IgGM

Cou

ntC

ount

Cou

ntC

ount

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

200

100

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300

600

500

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700ウサギ モノクローナル IgG

ウサギ ポリクローナル IgG

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

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700

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1,000

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

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100

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700アルメニアン ハムスター IgG

シリアン ハムスター IgG

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

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400

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500

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700

900 マウス IgG1

マウス IgG2aマウス IgG2b

マウス IgG3

マウス IgGM

ラット IgG1ラット IgG2a

ラット IgG2bラット IgG2c

ラット IgGM

Cou

ntC

ount

Cou

ntC

ount

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

200

100

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700ウサギ モノクローナル IgG

ウサギ ポリクローナル IgG

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

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PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

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700アルメニアン ハムスター IgG

シリアン ハムスター IgG

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

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700

900 マウス IgG1

マウス IgG2aマウス IgG2b

マウス IgG3

マウス IgGM

ラット IgG1ラット IgG2a

ラット IgG2bラット IgG2c

ラット IgGM

Cou

ntC

ount

Cou

ntC

ount

PE �uorescence

101 102 103 104 105 1060

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400

300

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500

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700ウサギ モノクローナル IgG

ウサギ ポリクローナル IgG

A B C D

装置のセットアップと校正

9

図 11. AbC Anti-Mouse Bead Kitを使用したコンペンセーション（A）陽性のシグナルを発する AbC 捕捉ビーズと陰性のシグナルを発するネガティブビーズをフィコエリスリン（PE）コンジュゲート マウス抗ヒト CD56抗体（製品番号 MHCD5604）で標識しました。（B）陽性のシグナルを発する AbC 捕捉ビーズと陰性のシグナルを発するネガティブビーズを FITC コンジュゲート マウス抗ヒト CD3抗体（製品番号 MHCD03014）で標識しました。（C）2つのパラメータで作成したプロットは、ゲーティング後の PEコンジュゲート マウス抗ヒト CD56抗体と FITCコンジュゲート マウス抗ヒト CD3抗体で標識したヒト リンパ球です。このプロットは、AbCTM Anti-Mouse Bead Kit（製品番号 A10344）でコンペンセーションした後、作成しました。

50

100

150

200

250

102-102 0 103 104 105

Cou

nt

PE �uorescence

50

0

100

150

200

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102-102-350 0 103 104 105

Cou

nt

FITC �uorescence CD56-PE �uorescence

CD

3-FI

TC �

uore

scen

ce

102-102 0 103 104 105

105

104

103

102

0-102

A B C

ArC Amine Reactive Compensation Bead Kit には、あらゆるアミン反応性色素に結合する ArC反応ビーズ（コンポーネント A）と非反応性の ArCTM ネガティブビーズ（コンポーネント B）が同梱されています。この特別に調製された 2種類のポリスチレンマイクロスフィアが LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stainsのコンペンセーションを簡単にします。この 2種類のビーズは、いずれのアミン反応性色素とインキュベーションしても明確なポジティブおよびネガティブ群に分かれるため、コンペンセーションを設定できます（図 12）。また ArC Amine Reactive Compensation Bead Kitは、AbC Anti-Mouse Bead Kitと組み合わせて蛍光標識マウス抗体に使用すると、LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stainによるマルチカラーイムノフェノタイピング解析用のより安定性と精度の高いコンペンセーションが可能です。

細胞の絶対計数 フローサイトメトリーは、細胞を迅速に定量化する技術です。しかしほとんどのフローサイトメーターは、サンプルに含まれる細胞の濃度を直接測定することも絶対計数することもできません。細胞の絶対計数は、幹細胞研究をはじめとする幅広い分野で細胞群の定量や疾患の進行度の把握に利用されてきました。細胞の絶対計数は通常、血球計数装置による細胞濃度の測定とフローサイトメーターの細胞群データの収集を別々に実行して組み合わせるマルチプラットフォーム法、またはマイクロスフィアの内部計数標準をフローサイトメーターのサンプルに適用するシングルプラットフォーム法のどちらかで行われます。シングルプラットフォームのほうがマルチプラットフォームよりも技術的に簡単であり、ラボ間でのばらつきや過小評価も抑えられるため、望ましいとされています。

当社は細胞計数用製品として InvitrogenTM CountBrightTM Absolute Counting Beadsと AccuCheck Counting Beadsの 2種類を提供しています。次ページの表 2を参考に最適の製品を選択してください。

図 12. 3つの LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kitで染色した ArC Amine Reactive Compensation Bead Kitのプロファイル（A）LIVE/DEAD Fixable Violet Dyeで染色したビーズ（製品番号 L34955）を 405 nmレーザーで励起し、蛍光シグナルは 450/50 nmバンドパスフィルターで収集しました。（B）LIVE/DEAD Fixable Green Dyeで染色したビーズ（製品番号 L23101）を 488 nmレーザーで励起し、蛍光シグナルは 525/50 nmバンドパスフィルターで収集しました。（C）LIVE/DEAD Fixable Far Red Dyeで染色したビーズ（製品番号 L10120）を 633 nmレーザーで励起し、蛍光シグナルは 660/20 nm バンドパスフィルターで収集しました。

LIVE/DEAD Fixable Green stain �uorescence

0

50

100

150

200

350

300

250

102-102-288 0 103 104 105

Cou

nt

LIVE/DEAD Fixable Red stain �uorescence

0

50

100

150

200

350

300

250

102-102-715 0 103 104 105

Cou

nt

LIVE/DEAD Fixable Violet stain �uorescence

0

50

100

150

200

350

400

300

250

102-102 0 103 104 105

Cou

nt

A B C

装置のセットアップと校正

10

製品名 サンプルの種類 ビーズのサイズ 励起波長（nm） 最大発光波長（nm） 測定パラメータ 製品番号

CountBright Absolute Counting Beads

すべてのサンプル 7 µm UV ～ 635 385 to 800 細胞数 C36950

AccuCheck Counting Beads 全血 Bead A: 6.40 µm Bead B: 6.36 µm

Bead A: 488Bead B: 635

Bead A: 575–585Bead B: 660–680

細胞数と ピペッティング精度

PCB100

表 2. 絶対計数用ビーズの選択ガイド

CountBright Absolute Counting Beads• 幅広い蛍光色素を搭載し、あらゆるメーカーの装置に適合

• 使いやすいプロトコールで、溶解 /非洗浄全血などさまざまな細胞に対応

• マルチプラットフォーム法に比べて、高い信頼性を発揮

InvitrogenTM CountBrightTM Absolute Counting Beads（製品番号 C36950）は、幅広い励起および発光波長（励起波長 UV～635 nm、発光波長 385～ 800 nm）で強い蛍光シグナルを発する校正済みのマイクロスフィア懸濁液であり、既知の濃度のマイクロスフィアを含有しています。絶対計数するには、特定の量のマイクロスフィアを特定の量のサンプルに加え、サンプルとマイクロスフィアの量的割合がわかるようにします。分析したサンプル量は、マイクロスフィアのイベント数から算出できます。また細胞のイベント数をもとに細胞の濃度も算出できます。一般に、統計的に有意なサンプル量を測定するには、少なくとも 1,000ビーズイベントが必要です。

CountBright Absolute Counting Beadsは、溶解 /非洗浄全血などのあらゆるサンプルに使用できます。試薬に含まれるマイクロスフィアの直径は約 7 µm、沈降特性はリンパ球と同等です。細胞やマイクロスフィアのロスに繋がりかねないサンプル調製（洗浄など）は避けてください。CountBright ビーズは、散乱光または蛍光に閾値を設けて使用することができます。散乱光に閾値を設ける場合は、マイクロスフィアのシグナルが閾値以上になるようにしてください。マイクロスフィアはパラメータをひとつ設定することでゲーティングできますが、パラメータを複数用いてマイクロスフィアを細胞や他のイベントと分離することもできます。

図 13. CountBright Absolute Counting BeadsJurkat細胞の生細胞と熱処理細胞の混合液を LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit（製品番号 L3224）の試薬で処理しました。このサンプルに CountBright Absolute Counting Beads（製品番号 C36950）を加え、488 nm レーザー励起のフローサイトメトリーで解析しました。カルセイン蛍光シグナルを530/30 nmバンドパスフィルターで収集し、エチジウムホモダイマー 1（EthD-1）蛍光シグナルを 610 nmロングパスフィルターで収集しました。データでは生細胞と死細胞だけでなくカウント ビーズも明確に分離されています。

Eth

D-1

�uo

resc

ence

Calcein �uorescence

カウント ビーズ

死細胞

生細胞

105

105

104

104

103

103

102

102

0

0

AccuCheck Counting Beads• 2色の蛍光ビーズの比率を利用した内部コントロールによって、ピペッティングの精度をチェック

• 結果の安定性を高めるため、マルチプラットフォームよりもシングルプラットフォームを推奨

• 大半の免疫フェノタイピング実験でバリデーションが簡単

AccuCheck Counting Beads（製品番号 PCB100）は、効率的なシングルプラットフォームで細胞を絶対計数します。フローサイトメトリーによる直接免疫フェノタイピングのメリットと2 種類の異なるビーズ（ビーズ Aと B）を使用できる利便性を組み合わせました。この 2つの蛍光マイクロスフィアは、血液量の算出において二重の内部標準となります。既知の量のAccuCheck Counting Beadsを同じく既知の量の染色済み血液サンプル（溶解 /非洗浄）に加えます。ビーズと細胞を計数します。ビーズの濃度がわかっているため、蛍光ビーズの全イベント数とカウントした細胞の数から 1マイクロリットルあたりの細胞数（絶対計数）を割り出すことができます。その後、この細胞数と容積単位あたりの全マイクロスフィアの数を乗じます。AccuCheck Counting Beadsのシステムは、2つの蛍光マイクロスフィアを既知の比率で使用するため、このビーズの比率からアッセイのピペッティングの精度を検証できます。

装置のセットアップと校正

11

N/Aは該当なしの略。*最大励起波長（Ex）と最大発光波長（Em）、単位は nm。

分類 製品名 レーザーの種類 Ex/Em* 容量 製品番号

アライメント AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads for UV Lasers, 2.5 µm

UV 350–370/ 400–470 3 mL

A16502

AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads for UV Lasers, 6.0 µm

A16505

AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads for Blue Lasers, 2.5 µm

ブルー 488/515–660 3 mL

A16500

AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads for Blue Lasers, 6.0 µm

A16503

AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads for Red Lasers, 2.5 µm

レッド 633/645–680 3 mL

A16501

AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads for Red Lasers, 6.0 µm

A16504

サイズキャリブレーション Flow Cytometry Size Calibration Kit （非蛍光マイクロスフィア）

NA NA 1キット F13838

Flow Cytometry Sub-micron Particle Size Reference Kit

ブルー 505/515 1キット F13839

セルソーティングの セットアップ

Cell Sorting Set-Up Beads for UV Lasers UV 350–375/460 3 mL C16506

Cell Sorting Set-Up Beads for Blue Lasers ブルー 488/515 3 mL C16508

Cell Sorting Set-Up Beads for Green-Yellow Lasers

グリーン /イエロー 532, 561/575 3 mL C16509

Cell Sorting Set-Up Beads for Red Lasers レッド 633/680 3 mL C16507

コンペンセーション AbC Total Antibody Compensation Bead Kit NA NA 100 tests 25 tests

A10497A10513

AbC Anti-Mouse Bead Kit NA NA 1キット A10344

AbC Anti-Rat/Hamster Bead Kit NA NA 1キット A10389

ArC Amine Reactive Compensation Bead Kit NA NA 1キット A10346

細胞の絶対計数 AccuCheck Counting Beads ブルー /レッド 488/575-585 （ビーズ A）

10 mL PCB100

CountBright Absolute Counting Beads UV～レッド UV to 635/385 to 800 5 mL C36950

装置のセットアップと校正用製品のリスト

抗原検出

12

抗原検出

図 14. Attune NxT Acoustic Focusing Cytometerによるマウス調節性 T細胞と樹状細胞のマルチパラメータ（10色）解析表 4に挙げた表面抗原用一次抗体で C57BL/6脾細胞の表面を染色しました。 次 に FIX & PERM Cell Permeabilization Kit（ 製 品 番 号 GAS003、GAS004）を用いてサンプルを固定および透過処理しました。透過処理中に、PEコンジュゲート ラット抗マウス Foxp3抗体で細胞内を染色しました。FSC/SSCパラメータ（A、左側）を用いてリンパ細胞をゲーティングし、次の解析から B220 発現 B細胞を除外しました（A、右側）。B220-とCD45.2+のゲート内で CD3 の発現に基づいて T細胞を解析しました（A、下段左側）。共受容体 CD4または CD8の発現に基づいて CD3+ T細胞を 2つの集団に分離しました（B、左側）。CD4+ T細胞の中には、転写因子Foxp3および細胞表面マーカー CD25（IL-2Rα）を発現している抑制性調節性 T細胞サブグループが存在します（B、右側）。CD3-細胞を分離し、レアな CD11c+ MHCII+プロフェッショナル抗原提示樹状細胞群を検出しました（C、左側）。さらに脾臓樹状細胞をそれぞれ特有の抗原提示特性を持つ CD11b+および CD8+樹状細胞サブセットに細分化しました（C、右側）。

A

B

C

一次抗体• 幅広い色素、タンパク質、InvitrogenTM QdotTM 抗体コンジュゲート

• 多様なアプリケーションで広範囲に特異性を発揮

• RUO、ASR、IVD試薬の揃った臨床および研究用の高品質製品

• 20,000 件以上の学術論文に引用

当社は、基礎研究と臨床研究の双方でターゲットに高い選択性を示す多彩な RUO/ASR/IVD一次抗体を提供します。フローサイトメトリー用にバリデーション済みのこれらの抗体は、CDマーカーやサイトカイン、ケモカイン、成長因子だけでなく、腫瘍学や免疫学、細胞シグナル伝達、アポトーシス、細胞増殖、幹細胞などの研究用抗体にも特異性を発揮します。当社の蛍光コンジュゲート一次抗体を用いたマルチカラーフローサイトメトリーは、異種細胞群のサブセットの同定からレアイベントの検出までの多様なアプリケーションにおいて、他の解析法よりも短時間かつ少量のサンプルで複雑な細胞生物学の疑問にお答えします。一次抗体コンジュゲートの検索には、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-searchantibodiesをご利用ください。

フルオロフォアの概要当社の研究チームは 1975年以来、Alexa Fluor色素や Qdot標識、InvitrogenTM ZenonTM標識技術といった革新的な蛍光技術や細胞解析技術を次々と開発しているパイオニアです。当社は近紫外線、可視光線、近赤外線の幅広いスペクトルをカバーする 蛍光標識製品を提供しています。この技術を一次および二次抗体コンジュゲート技術に進化させ、より明るく安定的な蛍光コンジュゲートを開発しました。使用する装置を問わず、すべてのサンプル、すべてのフローサイトメトリーのランで最高のデータを収集するよう作製された多彩な標識を提供します。フルオロフォア製品とその仕様については、表 3のリストをご覧ください。

標準的な蛍光色素とタンデム色素当社は、Alexa Fluor、InvitrogenTM Paci�c BlueTM、Paci�c GreenTM、Paci�c OrangeTMの各色素やフルオレセイン、蛍光タンパク質（PE、PerCP、APC）などを標識した抗体、および 11 種類の組み合わせのタンデム色素といった幅広い蛍光標識一次抗体を取り揃えています（表 3）。この多様な色素製品は、今後装置の技術が進歩し、より多くの蛍光色素が使用できるようになるにつれ、ますます必要とされるでしょう（図 14および表 4）。

抗原検出

13

表 3. フローサイトメトリー用フルオロフォアフルオロフォア レーザー 発光波長（nm）

UV バイオレット405 nm

ブルー488 nm

グリーン532 nm

イエロー561 nm

レッド633/635 nm

抗体コンジュゲートAlexa Fluor 350 442

Alexa Fluor 405 421

Paci�c Blue 455

Paci�c Green 500

Paci�c Orange 551

Alexa Fluor 488 519

フルオレセイン（FITC） 525

Qdot 605 605

Qdot 655 655

Qdot 705 705

Qdot 800 800

ペリジニンクロロフィル（PerCP） 678

PerCP-Cy5.5 695

R-フィコエリスリン（R-PE, PE） 575

PE-Texas Red 615

PE-Alexa Fluor 610 628

TRI-COLOR® (TC, PE-Cy5) 670

PE-Cy 5.5 694

PE-Alexa Fluor 700 723

PE-Cy 7 767

アロフィコシアニン（APC） 660

APC-Cy 5.5 694

APC-Cy 7 767

APC-Alexa Fluor 750 775

Alexa Fluor 647 668

Alexa Fluor 700 719

APC-Alexa Fluor 750 775

表 4. T細胞と樹状細胞のマルチパラメータ解析（図 14）で使用した製品ターゲット 宿主動物 フルオロフォア レーザー 最大発光波長（nm） 製品番号

MHCII ラット Paci�c Blue dye バイオレット 455 A14901

CD4 ラット Paci�c Green dye バイオレット 500 C11207

B220 ラット Paci�c Orange dye バイオレット 551 RM2630

CD11b ラット FITC ブルー 525 RM2801

Foxp3 ラット R-PE ブルー 575 N/A

CD3 ハムスター PerCP-Cy 5.5 ブルー 695 A14784

CD11c ハムスター PE-Cy 7 ブルー 767 A15849

CD25 (IL-2Rα ) ラット APC レッド 660 N/A

CD45.2 マウス APC-Cy 7 レッド 767 A18642

CD8 ラット Alexa Fluor 700 レッド 719 MCD0829

*これらはすべて研究用にのみ使用できる製品です。他に記載のない限り、診断用には使用できません。N/Aは市販されていない製品を示します。

抗原検出

14

ターゲット * クローンコンジュゲート‡

Qdot 605 Qdot 655 Qdot 705 Qdot 800

CD2 S5.5 Q10172 Q22140§ Q22141§ Q22142§

CD3e S4.1 (AKA 7D6) Q10012 Q22149§

Q10484§

Q10054

CD4 S3.5 Q10008 Q10007 _Q10060 Q22153§

S3.5 Q10480§ Q10482§ Q10485§

CD4† RM4-5 Q10092 Q22163§ Q22164§ Q22165§

CD8 3B5 Q10009 Q10055 Q10059 Q22157§

3B5 Q10481§ Q10483§

CD10 MEM-78 Q10481§" Q22136§

CD14 HIT2 Q10053 Q10064

TüK4 Q10013 Q10056 Q22137§ Q22139§

CD19 SJ25-C1 Q10306 Q10179 Q22138§ Q22162§

CD19† 6D5 Q22160§ Q10379 Q22161§

CD27 CLB-27/1 Q10065 Q10066 Q22152§

CD38 HIT2 Q22150§ Q10156

CD45 H130 Q10051 Q22154§ Q10062 Q22168§

CD45R† RA3-6B2 Q22166§ Q10176 Q22167§ Q22156§

CD45RA MEM-56 Q10047 Q10069 Q22155§ Q10063

HLADR（クラス II） Tü36 Q10052 Q22158§ Q22159§

アイソタイプコントロール マウス IgG2a Q10014 Q10015 Q10076

* すべての抗体の宿主動物は、他に記載のない限りマウスです。これらはすべて研究用にのみ使用できる製品です。他に記載のない限り、診断用には使用できません。†宿主動物はラットです。‡すべての製品の容量は、他に記載のない限り 100回分です。§本製品の容量は 25回分です。

Qdot抗体コンジュゲート• 励起波長 405 nmまたは 488 nmでバイオレットレーザーを最大限に利用

• 既存の有機色素と組み合わせ、検出可能なパラメータを拡大• タンデム色素のような経時劣化がなく、高い再現性を確保• 発光スペクトルが狭域のため、単一の励起光源を使用する際の補正が最小限

Qdot抗体コンジュゲートは、微量の細胞外タンパク質の検出に最適の強い蛍光シグナルを発します。R-PEとほぼ同じサイズで既存の有機蛍光標識とも組み合わせ可能な Qdot抗体コンジュゲートは、最大発光波長未満のすべての波長で励起されますが、UVレーザーまたはバイオレットレーザーが最適です。狭い左右対称の発光特性を持つ Qdot抗体コンジュゲートは、単一励起光源を使用する際の補正を最小限に抑えられます。またきわめて長いストークスシフトを示すため、405 nmバイオレットレーザーを使用したより効果的なマルチカラーアッセイが可能です。フローサイトメトリー向けのマルチカラーを取り揃えた Qdot抗体コンジュゲート（図 15および表 5）は、これらのメリットにより抗体の標識と染色に高い性能を発揮します。

Qdotナノクリスタルとそのフローサイトメトリーアプリケーションについては、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-qdotをご覧ください。

図 15. Qdot 標識の吸光および発光プロファイル（A）モル吸光係数で表した Qdot標識の吸光スペクトル。（B）Qdot標識の標準化した発光スペクトル。数字で示した各標識はパネル Aと同じです。

波長（nm）

吸光係数

(cm

–1M

–1)

1,000,000

0

2,000,000

3,000,000

4,000,000

5,000,000

400 450

1

2

3

4

7 6 85

500 550 600 650 700 750 800

1. Qdot® 525

2. Qdot® 565

3. Qdot® 585

4. Qdot® 605

5. Qdot® 625

6. Qdot® 655

7. Qdot® 705

8. Qdot® 800

波長（nm）

蛍光シグナル

450 500 550 650600 700 750 800 900850

4321 5 6 7 8

A

B

表 5. Qdot 一次抗体コンジュゲート選択ガイド

抗原検出

15

mCherryラットモノクローナル抗体コンジュゲートmCherry蛍光タンパク質用にアフィニティー精製した当社のラットモノクローナル抗体用蛍光コンジュゲート（表 6）は、フローサイトメトリーで野生型および変異型の mCherryまたはmCherry融合タンパク質を検出できます（図 16）。完全長のmCherry を免疫原として使用しているため、生成されたモノクローナル IgG2aアイソタイプ抗体は野生型および変異型のmCherryを検出します。mCherry単量体赤色蛍光タンパク質は、その優れた輝度と光安定性、成熟速度によって生理学的プロセスのモニタリングや導入遺伝子発現の検出に不可欠の赤色蛍光タンパク質となりつつあります。

色素コンジュゲート レーザー色 励起 /発光波長（nm） 製品番号

Paci�c Blue dye バイオレット 405/455 M11238

Alexa Fluor 488 ブルー 488/519 M11239

Alexa Fluor 594 レッド 590/617 M11240

Alexa Fluor 647 レッド 650/668 M11241

表 6. mCherryラットモノクローナル抗体（クローン 16D7）コンジュゲート図 16. mCherryタンパク質を発現し、Paci�c Blue色素コンジュゲート ラット抗mCherry抗体（製品番号 M11238）で標識した後、ゲーティングした U2-OS細胞のヒストグラムサ ン プ ル は、Attune Acoustic Focusing Cytometerを使用して 405 nmレーザーで励起、522/31 nmバンドパスフィルターでシグナルを収集し解析しました。

抗体標識 当社は、蛍光シグナルの強い Alexa Fluor色素や Qdotナノクリスタル、R-フィコエリスリン（R-PE）だけでなく、ビオチンまでを 10 µg未満から 1 mg の IgG抗体に直接結合させる多様な標識キットを提供しています。抗体に直接標識すると、１回の染色で 2つ以上の同種の抗体を使用できるようになります。お客様のアプリケーション向けに最適化した標準的な標識試薬や、クリックケミストリ法による部位特異的な標識が使用できます。ここでは、フローサイトメトリー用一次抗体の簡単な標識法を 2種類ご紹介します。詳しい説明と製品群については、ウェブサイト www.thermo�sher.com/�ow-antibodylabelingをご覧ください。

SiteClick抗体標識システム • 100 µgの IgG抗体を標識できる試薬を同梱

• わかりやすい段階的なプロトコール

• 再現性の高い部位特異的な高性能標識試薬

• フローサイトメトリー用 R-PE/Qdot 標識

InvitrogenTM SiteClickTMシステムは、抗体の部位選択的標識を身近なものにする新たな技術を提案します。モジュール式のクリックケミストリによるこの標識法を使用すると、基本的にすべての抗体の重鎖 N結合型グリカンを酵素標識できます。SiteClick部位選択的標識法は、煩雑で不安定になりがちな従来の抗体標識法と異なり、抗体に高い安定性と再現性で標識を結合させます。検出分子の選択肢も多彩です。

SiteClickシステムの部位選択的標識法（図 17）は、従来のアミンまたはチオール反応性標識試薬で起こりやすい抗原結合ドメインのかく乱を抑えます。修飾前に遺伝子操作で標識部位を抗体に組み込む必要もありません。この部位選択的標識法は、特に内部や周辺にリジン残基を含む抗体結合ドメインをモノクローナル抗体で標識する際に効果的です。このようなドメインの標識では、抗原結合がかく乱されやすいためです。またモノクローナル抗体は、還元システイン標識に使用されるジスルフィド結合還元試薬に対する感受性に差があり、部分的に分離した抗体の断片が残ることで抗体との結合能や収量が損なわれる危険もあるためです。

図 17. SiteClick抗体標識システム最初にβ -ガラクトシダーゼで重鎖 N結合型グリカンから末端ガラクトース残基を除去し、修飾可能なすべての GlcNAc残基を露出させます。次に、末端 GlcNAc残基にGalT（Y289L）酵素で GalNAzを酵素結合させ、遊離末端 GlcNAc残基をアジドタグで活性化します。最後にアジド残基をジベンゾシクロオクチン（DIBO）で官能基化したプローブ（Alexa Fluor 488 DIBO alkyneなど）と反応させると標識化抗体を作成できます。抗体 1分子あたり平均 3～ 3.5分子のプローブが結合します。

N3

N3

N3

N3

アジド活性化抗体

抗体 • ポリクローナル抗体 • モノクローナル抗体 • 組み換え抗体

部位選択的に標識された抗体

β-ガラクトシダーゼGalT(Y289L)UDP-GalNAz

DIBO アルキン標識

Paci�c Blue �uorescence106105104103102

Cou

nt

0

100

200

300

400

500

600

700

抗原検出

16

当社は R-PEや幅広い Qdot標識（表 7）を用いた一連の SiteClick抗体標識キットをフローサイトメトリー用に設計し、提供しています。これらのキットは、初心者も熟練研究者も毎回効率的に抗体を標識できるよう、わかりやすいワークフローを特長としています（図 18）。また抗体グリカンは異なる種でも保存性が高いため、SiteClickTM

標識も異なる抗体に対して再現性がきわめて高く、新たな抗体を獲得するたびに標識を最適化する必要がありません。詳しくは、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-siteclickをご覧ください。

ZenonラベリングテクノロジーZenonラベリングテクノロジーは、マウス IgG1、IgG2aおよび IgG2bアイソタイプやウサギ、ヤギ、ヒト IgG抗体用の使いやすい多用途標識システムです。優れた 色素だけでなく、他社製のフルオロフォア、ビオチン、発光タンパク質、酵素などにも使用できます。Zenonは、直接化学標識法に比べて次のようなメリットがあります。

• スピード ̶ ラベリング手順はわずか 10分間

• 効率性 ̶ 溶液中の一次抗体をほぼ 100%標識

• 経済性 ̶ 1マイクログラム未満の抗体を標識

• 簡便性 ̶ 標識前後の抗体の精製不要

• 柔軟性 ̶ 1回の実験に複数の一次抗体を簡単に使用

Zenonラベリングテクノロジーは、フルオロフォア、ビオチン、酵素などを標識したFabフラグメントを使用し、インタクトな IgG抗体の Fc部位と結合して非共有結合の標識複合体を形成します。Zenon標識試薬は、目的の抗体の Fc部位に対する高い親和性と選択性を確保するため、製造過程でアフィニティー精製されています。Zenon標識法は、免疫選択性を利用しているため、複合体形成前に抗体サンプルから外因性タンパク質やアミン含有バッファーを取り除く必要はありません。この技術で標識した抗体複合体は、直接標識した一次抗体と同等の蛍光強度または酵素活性を示します。

Zenon標識試薬は、幅広い色素（表 8）を混合したり組み合わせたりできるため、フローサイトメトリーで複数の色素と抗体を利用した実験が可能となり、柔軟性が高まります。Zenon抗体ラベリングテクノロジーおよびその他の抗体標識製品の詳細については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-antibodylabelingをご覧ください。

CD

4 陽性細胞（

%）

SiteClickR-PE

SiteClickQdot 605

0

20

40

60初心者熟練研究者市販品 ： R-PE

図 18. 初心者にも熟練研究者にも効率的な抗体標識初心者と熟練研究者の双方が SiteClick Qdot 605 Antibody Labeling Kit と SiteClick R-PE Antibody Labeling Kitを使用して抗 CD4モノクローナル抗体を 3つずつ標識しました。これらの標識抗体でひとりのドナーの血液から単離した CD4陽性細胞を標識し、その後フローサイトメトリーで解析しました。リファレンスサンプルには、市販のR-PE抗 CD4抗体コンジュゲートを使用しました。データは細胞全体に対する CD4陽性細胞の割合を、またエラーバーは各ユーザーが 3つずつ標識したサンプルのばらつきを示します。この初心者は、これまでタンパク質の生体共役反応の経験はありませんでしたが、熟練研究者と同等の効率で標識できました。

製品名 レーザー色 発光波長（nm） 製品番号

SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit ブルー 578 S10467

SiteClick Qdot 525 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー 525 S10449

SiteClick Qdot 565 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン 565 S10450

SiteClick Qdot 585 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン、イエロー 585 S10451

SiteClick Qdot 605 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン、イエロー 605 S10469

SiteClick Qdot 625 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン、イエロー 625 S10452

SiteClick Qdot 655 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン、イエロー 655 S10453

SiteClick Qdot 705 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン、イエロー、レッド 705 S10454

SiteClick Qdot 800 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン、イエロー、レッド 800 S10455

表 7. SiteClick 抗体標識キット

抗原検出

17

色素 Ex/Em* マウス IgG1 マウス IgG2a マウス IgG2b ウサギ IgG ヤギ IgG ヒト IgG

Alexa Fluor 色素†

Alexa Fluor 350 346/442 Z25000 Z25100 Z25300

Alexa Fluor 405 402/421 Z25013 Z25113 Z25213 Z25313

Alexa Fluor 488 495/519 Z25002 Z25102 Z25202 Z25302 Z25602 Z25402

Alexa Fluor 546 556/573 Z25004 Z25104 Z25304

Alexa Fluor 555 555/565 Z25005 Z25105 Z25205 Z25305 Z25605

Alexa Fluor 568 578/603 Z25006 Z25106 Z25306

Alexa Fluor 594 590/617 Z25007 Z25107 Z25207 Z25307 Z25607 Z25407

Alexa Fluor 647 650/668 Z25008 Z25108 Z25208 Z25308 Z25608 Z25408

Alexa Fluor 680 679/702 Z25010 Z25110 Z25210

Alexa Fluor 700 696/719 Z25011

Alexa Fluor 750 749/775 Z25312

標準的色素†

Paci�c Blue 410/455 Z25041 Z25156

Paci�c Green 411/500 Z11203

Paci�c Orange 400/551 Z25256

フルオレセイン 494/518 Z25042 Z25342

ビオチン†

ビオチン XX NA Z25052 Z25152 Z25252 Z25352 Z25452

フィコビリタンパク質およびタンデム色素‡

R-PE 496§/578 Z25055 Z25155 Z25255 Z25355 Z25455

R-PE-Alexa Fluor 610 496§/630 Z25020

R-PE-Alexa Fluor 647 496§/668 Z25021

アロフィコシアニン（APC） 650/660 Z25051 Z25151 Z25251 Z25351 Z25451

APC-zAlexa Fluor 750 650/775 Z25031

酵素‡

horseradish peroxidase; HRP NA Z25054 Z25154 Z25254 Z25354 Z25454

* おおよその最大励起波長と最大発光波長、単位は nm。† Alexa Fluor色素、標準的色素、ビオチンなどと組み合わせた各 Zenon標識キットの容量は、標識 50回分です。1回の標識に必要な Zenon試薬の量は、1µgの抗体を標識できる量と定められています。‡ フィコビリタンパク質または酵素と組み合わせた各 Zenon 標識キットの容量は、標識 25回分です。タンデム色素と組み合わせたキットの容量は、標識 10回分です。§ 他にも 546 nmと 565 nmに励起のピークがあります。N/Aは該当なしの略。詳細については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-zenonをご覧ください。

表 8. Zenon標識キット選択ガイド

抗原検出

18

二次検出 当社は、抗体やストレプトアビジンなどの幅広い二次検出試薬を提供しています。これらは優れた Alexa Fluor色素やフィコビリタンパク質、Alexa Fluor色素とフィコビリタンパク質のタンデム色素（図 19）、Qdot標識、ビオチン、酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ）などで標識されています。また、二次抗体を使用して 2つ以上のターゲットを同時に免疫検出するには交差反応が問題となりますが、これを避けるために必要な免疫活性の異なる抗体も取り揃えています。

一部の代表的なコンジュゲートを表 9にリストアップしました。お客様に最適の二次検出試薬については、オンラインの「二次抗体選択ツール」でご確認ください。このツールでは、ターゲット IgGのクラス（および性状）、宿主動物種、反応性、コンジュゲートのタイプを特定し、検索結果を絞り込むことができます。最適の二次抗体については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-secondarydetectionでご確認ください。

図 19. Alexa Fluor 610 R-Phycoerythrin Tandem Streptavidin Conjugate、Alexa Fluor488色素、R-フィコエリスリン標識を使用して 3種類の細胞表面マーカーを同時に検出塩化アンモニウムで赤血球を溶解除去した全血のリンパ球をビオチン化マウス抗ヒト CD3抗体で標識しました。1%のウシ血清アルブミン（BSA）を含むリン酸バッファー（PBS）で洗浄した後、Alexa Fluor 610–R-Phycoerythrin Tandem Dye–labeled Streptavidin（製品番号 S20982）でインキュベートしました。再度細胞を洗浄し、Alexa Fluor 488 色素コンジュゲート抗ヒト CD8抗体と PEコンジュゲート抗ヒト CD4抗体で標識しました。さらに 1% BSA/PBSで洗浄した後、Becton Dickinson FACScan フローサイトメーターを使用して励起波長 488 nmで標識を解析しました。緑色チャネル（525 + 10 nm）で CD8、橙色チャネル（575 + 10 nm）で CD4、赤色チャネル（>650 nm）で CD3が検出されました。それぞれの二変量プロットにおいて、（A）では CD4/CD8 陽性細胞、（B）ではCD3/CD4陽性細胞、（C）では CD3/CD8陽性細胞の細胞群といった形で、予想通りの相互排他的な集団が現れました。

表 9. 二次検出試薬選択ガイド

色素

色素またはラベル

Alexa Fluor 405

Paci�c Blue

Paci�c Green

Paci�c Orange

Alexa Fluor 488

PE Alexa Fluor 610–R-PE

Alexa Fluor 647–R-PE

APC Alexa Fluor 750–APC

抗マウス IgG A31553 P10993 P11204 A11001 P852 A20980 A20990 A865 A21006

抗ウサギ IgG A31556 P10994 P31584 A11008 P2771MP A20981 A20991 A10931

抗ラット IgG A11006 A10545 A10540

ストレプトアビジン S32351 S11222 S11200 S32365 S11223 S866 S20982 S20992 S868S32362*

S21008

*プレミアムグレード

橙色蛍光（

CD

4）

緑色蛍光（CD8） 橙色蛍光（CD4） 緑色蛍光（CD8）

赤色蛍光（

CD

3）

赤色蛍光（

CD

3）

104

104

103

103

102

102

101

101100

100

104

104

103

103

102

102

101

101100

100

104

104

103

103

102

102

101

101100

100

A B C

抗原検出

19

フローサイトメトリー抗体用カスタムサービス当社のカスタム抗体サービスは、効率的で機密保持に優れ、高品質を保証します。また専門のプロジェクトマネージャーがプロセス全般を通してお客様のプロジェクトを管理し、常に進捗状況を報告します。煩雑な作業は、当社のカスタムサービスにお任せください。

当社のカスタム 抗体サービスは、次のようなサービスを受託しています。

• コンジュゲーション ̶ お客様または当社の抗体に幅広い標識を結合

• 調液 ̶ アジドフリーおよび多様なバッファーや濃度の試薬

• パッケージング ̶ バルクサイズ

• 混合 ̶ （RUO）抗体プレミックス

詳細については、カスタムサービスに電子メール（jpcustom@lifetech.com）でお問い合わせください。

19Molecular Probes® | フローサイトメトリー製品

出検原抗

フローサイトメトリー抗体用カスタムサービスMolecular Probes®のカスタム抗体サービスは、効率的で機密保持に優れ、高品質を保証します。また専門のプロジェクトマネージャーがプロセス全般を通してお客様のプロジェクトを管理し、常に進捗状況を報告します。煩雑な作業は、当社のカスタムサービスにお任せください。

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結果まで約 10 秒。細胞カウントが楽しくなる。

Countess Ⅱ FL、Countess Ⅱ 自動セルカウンター

InvitrogenTM CountessTM Ⅱ FL、CountessTM Ⅱ 自動セルカウンターは、細胞カウントを迅速かつ正確に行うことが可能です。タッチスクリーンでの直観的な操作、約 10 秒の正確な細胞数のカウント、オートフォーカス機能による実験誤差の最小化で手間を大幅に削減します。取得したイメージ画像データは画面上で見ることができ、計測が正確に行われているか確認して次の実験に進むことができ、安心です。

製品紹介

細胞解析

20

細胞解析細胞の機能や活性、生存率を評価するため、当社は幅広い色素やキットを開発しました。セルヘルスが実験のおもな目的であっても、または単に他の実験に不可欠な要素のひとつであっても、お客様に最適のソリューションを提供します。詳しい説明と製品群については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-cellhealthをご覧ください。

細胞生存率細胞生存率アッセイは、単に生細胞群と死細胞群を区別するためだけでなく、他の細胞機能や処理と関連付けて使用することも、また死細胞群を解析サンプルから除去するために利用することもできます。ここでは、特にマルチカラーフローサイトメトリーに便利なフローサイトメーターの単一のチャネルを使用する細胞生存率アッセイを 2種類ご紹介します（表 10）。詳細説明と製品群については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-cellviabilityをご覧ください。

LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits• 色素が固定処理後も細胞に残るため、細胞内免疫染色と生死解析が簡単に両立

• ほぼすべての染色法や免疫染色プロトコールに適応

• UV/405/488/633 レーザー用の 7 色から選択可能

LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit（30ページの製品リストを参照）は、アミノ酸を共有結合で標識しますが、正常な生細胞のサイトゾルには結合できません。色素は生細胞と死細胞の双方で表面タンパク質に反応しますが、死細胞では損傷した細胞膜を通って細胞質のタンパク質も標識するため、死細胞の蛍光シグナルは生細胞の 50倍以上となります。標識は共有結合のため、染色後に生死を判別するシグナルを損なうことなく細胞を固定および透過処理できます（図 20）。したがってサンプルを固定および透過処理し、その後の分析中に死細胞を区別する必要がある場合、この試薬は理想的です。LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stainは、幅広い励起レーザー源と検出チャネルに適した製品を取り揃えています。またコンペンセーションコントロールには、LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stainと ArC Amine Reactive Compensation Bead Kit（A10346、 8 ページを参照）の組み合わせが最適です。

実験サンプルに異常な細胞や死細胞がうっかり混入すると、結果に大きな影響を与える恐れがあります。たとえば死細胞がイムノフェノタイピング解析に混入すると、特にレアなフェノタイプの検出でデータが損なわれる可能性があります。Perfettoら（2006）は、白血球のイムノフェノタイピングの際、フローサイトメトリーの散乱光のゲーティングだけでは死細胞を解析から完全に排除できないと述べています（参考資料は図 21を参照）。LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stainを使用すると、解析から効率的に死細胞を除去できるため、大幅にアッセイの精度が向上します。

表 10. 細胞生存率アッセイ選択ガイド製品名 ターゲット 固定処理 * 洗浄の

要不要生細胞の 蛍光強度

死細胞の 蛍光強度

アプリケーション

LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stains

細胞の表面と内部のタンパク質 可 要 非常に弱い 非常に強い イムノフェノタイピング

SYTOX Dead Cell stains 核酸 不可 不要 非常に弱い 非常に強い 生細胞解析、 死細胞除去

Propidium lodide Ready Probes Reagent

核酸 不可 要 非常に弱い 非常に強い 生細胞解析、 死細胞解析

*ホルムアルデヒド固定のみ

図 20. LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stainsの固定処理後の定着性Jurkat細胞の生細胞（左）と熱処理済み細胞（右）の混合液を 2つに分け、LIVE/ DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit（製品番号 L34957）を使用して別々に染色しました。（A）の細胞は未固定、（B）の細胞は染色後 3.7%ホルムアルデヒドで固定しました。サンプルは、励起波長 405 nm、発光波長～525 nmで解析しました。

102 103 104 105

102 103 104 105

25

0

50

75

100

125

0

50

100

150

Cou

nt

未固定

固定処理後

生細胞死細胞

生細胞

死細胞

Cou

nt

LIVE/DEAD Fixable Aqua �uorescence

LIVE/DEAD Fixable Aqua �uorescence

A

B

細胞解析

21

SYTOX Dead Cell Stains• 簡単に死細胞を判別する親和性の高い核酸染色剤

• スペクトルのオーバーラップを抑えたマルチカラーでマルチプレックス解析の性能を向上

• 添加、インキュベート、解析のシンプルなプロトコールによって洗浄ステップが不要

InvitrogenTM SYTOXTM Dead Cell Stains（30ページの製品リストを参照）は、細胞膜に損傷のない細胞は染色しませんが、細胞膜の損なわれた細胞では迅速に内部に浸透して染色します。この色素は、ひとたび細胞に取り込まれると DNAに結合し、蛍光シグナルを大幅に強めます。そのため生細胞は非蛍光のままですが、死細胞は強い蛍光を発します。SYTOX染色剤は、幅広い励起レーザー源に対応します。この染色剤は、その後の解析用に生細胞をゲーティングするための「ダンプチャネル」に多く利用されます（図 22）。また洗浄ステップも不要です。むしろ SYTOX Dead Cell Stainsは DNAに共有結合しないため、解析中に色素の濃度を常に維持する必要があります。

図 22. SYTOX Dead Cell Stainsを用いた生細胞のゲーティング熱処理済みおよび未処理のヒト末梢血白血球を混合し、Alexa Fluor 488色素コンジュゲート抗ヒト CD3抗体と R-PEコンジュゲート抗ヒトCD8抗体、5 nM SYTOX Red Dead Cell Stain（製品番号 S34859）で染色した後、488 nm/635 nmレーザー励起のフローサイトメトリーで解析しました。（A）のヒストグラムは 2つの細胞群の分布を示します。死細胞は SYTOX 赤色蛍光シグナルを強く発していますが、生細胞はほとんど発していません。（B）は生細胞でゲーティングした後の CD8と CD3の 2つの蛍光パラメータによるプロットです。

CD

3–A

lexa

Flu

or 4

88 �

uore

scen

ce

CD8–R-PE �uorescence

Cou

nt 死細胞

生細胞

SYTOX Red �uorescence

50

100

150

200

01020 103     104 105

0

103

104

105

0 103     104 105

A

B

図 21. 死細胞の除去により解析から染色アーチファクトを排除（A）でリンパ球をゲーティングした後、（B）で LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit（製品番号 L34955）を用いて生細胞と死細胞を判別しました。散乱光でゲーティングしたにもかかわらず、多くの死細胞が残っていたことに注目してください。その後、（C）で死細胞を、また（D）で生細胞を解析し、この 2つの細胞群のフェノタイプが明らかに異なることを示しました（Perfetto SP, Chattopadhyay PK, Lamoreaux L, et al. (2006) J Immunol Methods 313:199–208より Elsevier の許可を受けて転載）。

SSC

リンパ球のゲーティング 生存率のゲーティング

CD

4–C

y 5.5

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CD

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CD8–Q705 �uorescenceCD8–Q705 �uorescence

LIVE/DEAD Fixable Violet �uorescence

A B

C D

生細胞 死細胞

SSC

リンパ球のゲーティング 生存率のゲーティング

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LIVE/DEAD Fixable Violet �uorescence

A B

C D

生細胞 死細胞

A B A

B

C D

細胞解析

22

細胞増殖 細胞増殖を促進または抑制する因子を特定する作業は、細胞生物学や創薬研究の分野できわめて重要です。細胞増殖を評価する既存の試薬（InvitrogenTM CellTraceTM Cell Proliferation Kit）と新生 DNA の合成量を測定する最新の技術（InvitrogenTM Click-iTTM Plus EdU標識）の双方を提供しています（表 11）。詳細説明と製品群については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-cellproliferationをご覧ください。

Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits• BrdUアッセイに比べて優れた精度を発揮しつつデータのばらつきは最低限（低い CV値）

• 5段階の円滑なプロトコール

• GFP、mCherr、APC、PerCP、PEその他のフルオロフォアと組み合わせてマルチプレックス解析が可能

細胞群の中で増殖する細胞は、修飾ヌクレオシドを新生 DNAに取り込ませて測定することで間接的に検出できます。EdU（5-エチニル -2́ -デオキシウリジン）は、DNAが合成される過程で取り込まれるヌクレオシド アナログです。Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kit は、アルキンと蛍光標識したピコリルアジドとの間で安定した共有結合を形成する銅触媒反応によって EdU（アルキンを含む）を検出します。使用するピコリルアジド検出試薬は低分子です。これは蛍光標識が効果的にインタクトな DNAに結合し、細胞を強い試薬で処理する必要のないことを意味します。

これまで DNA合成は、ヌクレオシド類似体ブロモデオキシウリジン（BrdU）を DNAに取り込み、抗 BrdU抗体で検出して測定していました。この手法は、開発当時は便利でしたが、BrdUを抗体に曝露するには（酸、熱、DNase などによる）DNA の変性が必要なため、変性処理によってサンプルの品質に悪影響を与える可能性がありました。Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assayは、DNAの変性が不要で、プロトコルを飛躍的に簡略化しながら同等以上の結果を提供します（図 23）。また Click-iT Plus EdU標識は、固定化プロトコールにも対応します。

Click-iT Plus Kitは、蛍光タンパク質と組み合わせて使用できます。従来の Click-iT反応ではアジドを使用していましたが、Click-iT Plus反応では代わりに修飾アジドを使用しているためです。修飾の結果、サンプルに含まれる遊離銅の濃度が大幅に低下するため、蛍光タンパク質（R-PE、R-PEタンデム色素、GFPなど）の発する蛍光シグナルが減弱しません。Click-iT Plus EdU反応のスピードと精度は、従来の Click-iT EdU反応と同等です。キットの種類については、30ページの製品リストをご覧ください。

図 23. Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kitと FxCycle Violet Stain を使用した細胞増殖解析Jurkat細胞を 10 µM EdUで 1時間処理し、Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kitのプロトコール（製品番号 C10632）に従って Alexa Fluor 488 ピコリルアジドで染色した後、FxCycle Violet Stain（製品番号 F10347）で染色しました。次に細胞を励起波長 488 nm（Click-iT EdU Alexa Fluor 488 色素）と 405 nm（FxCycle Violet Stain）のフローサイトメトリーで解析しました。（A）のヒストグラムでは S期の細胞（EdUの取り込みを含む DNA合成）と G2/M期または G0/G1期の細胞が明確に分離されています。（B）のヒストグラムでは、FxCycle Violet Stainを用いた DNA含有量の分布が表示されています。G0/G1期と G2/M期のピークの間に S期の細胞が分布しています。（C）Click-iT Plus EdU と FxCycleの 2つのパラメータによるプロットでは、二重陽性を示す細胞によって S期の細胞の割合が直接測定できます。

0.0 1.00.5 1.5 2.0 0.0 1.00.5 1.5 2.0102

103

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Clic

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488

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FxCycle Violet �uorescence (x106) FxCycle Violet �uorescence (x106)Click-iT EdU plus Alexa Fluor 488 �uorescence

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FxCycle Violet �uorescence (x106) FxCycle Violet �uorescence (x106)Click-iT EdU plus Alexa Fluor 488 �uorescence

A B C

細胞解析

23

20

40

60

80

100

0

20

40

60

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0

2000

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Cou

nt

Cou

nt

Cou

nt

CellTrace CFSE �uorescence CellTrace Far Red �uorescenceCellTrace Violet �uorescence

A B C

表 11. 細胞増殖アッセイ選択ガイド製品名 ターゲット 固定処理 マルチプレックス解析 アプリケーション

Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits 新生 DNAへの取り込み 可 可 細胞増殖

CellTrace Cell Proliferation Kits リジン含有タンパク質 可 可 世代解析

図 24. CellTrace試薬を用いた世代トレーシング（A）CellTrace Violet試薬を用いて 8世代にわたる細胞増殖を追跡しました。ヒト末梢血単核球を採取し、CellTrace Violet試薬で染色しました。その後、マウス抗ヒト CD3抗体（製品番号 MHCD0300）およびインターロイキン 2（製品番号 PHC0027）で 7日間刺激しました。ヒストグラムの各ピークは、CD4陽性生細胞の連続した世代を表します。刺激していない親世代の細胞は、赤で示しました。（B）は CellTrace CFSE、（C）は CellTrace Far Redを用いて 7世代の細胞増殖を追跡しました。ヒト Tリンパ球を採取し、上記の試薬で染色しました。その後、マウス抗ヒト CD3抗体（製品番号 MHCD0300）で 5 日間刺激しました。ヒストグラムの各ピークは、SYTOX Green（製品番号 S34860）陰性生細胞の連続した世代を示します。刺激していない親世代の細胞は、青（CellTrace CFSE）およびバイオレット（CellTrace Far Red）で示しました。すべての解析に Attune Acoustic Focusing Cytometerを使用しました。CellTrace Violetは 405 nmレーザーで励起後 450/40 nmバンドパスフィルターで、また CellTrace CFSEは 488 nmレーザーで励起後 530/30 nmバンドパスフィルターで、CellTrace Far Redは 638 nmレーザーで励起後 660/20 nmバンドパスフィルターでシグナルを検出しました。

CellTrace Cell Proliferation Kits• 明るい単一のピークを形成し、複数の世代を視覚化

• 染色後、細胞内で数日間安定性を保持

• 細胞の増殖能やメカニズムに影響を与える既知の細胞毒性なし

• 細胞機能アッセイ用の抗体やマーカー（GFPなど）との組み合わせが簡単なマルチカラー

• シンプルで信頼性の高い染色プロトコール

CellTrace色素製品は、CellTrace CFSE Dye（製品番号 C34554）と CellTrace Violet Dye（製品番号 C34557）、CellTrace Far Red Dye（製品番号 C34564）の 3種類で構成されています。これらはすべてリジン側鎖と他の有効なアミンとの反応によって細胞タンパク質と自然かつ不可逆的に結合します。細胞が分裂する際、CellTrace標識色素は娘細胞に平等に分配されるため、増殖している細胞群の世代が進むごとに細胞の蛍光シグナル強度が半減します。CellTrace CFSE と CellTrace Violetはどちらも 8～ 10世代の細胞解析が可能です（図 24）。CellTrace 色素は、すべて他の細胞機能解析用プローブやマーカーと組み合わせて使用できます。また CellTrace Violetと CellTrace Far Redは、緑色蛍光とは異なるレーザーと検出チャネルを使用するため、GFPやフルオレセインその他の緑色蛍光プローブとのマルチプレックス解析が可能です。

細胞解析

24

表 12. 細胞周期アッセイ選択ガイド製品名 ターゲット 生細胞への適用 マルチプレックス解析 アプリケーション

Vybrant DyeCycle Stains DNA 可 可 生細胞解析

FxCycle Stains DNA 不可 可 固定細胞解析

図 25. Vybrant DyeCycle Stainsを用いた生細胞のゲーティング培養により異常増殖した Jurkat細胞を Vybrant DyeCycle Green Stain（製品番号 V35004）で染色した後、SYTOX Blue Dead Cell Stain（製品番号 S34857）で染色し、488 nmおよび 405 nm励起のフローサイトメーターで解析しました。（A）で生細胞をゲーティングし、（B）のヒストグラムを作成して生細胞の DNA含量の分布を示しました。G0/G1 期と G2/M期のピークの間に S期の細胞が分布しています。死細胞がデータに含まれていれば異常な結果が現れたと推測されます。

Vybrant DyeCycle Green �uorescence

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0 50 100 150 200 250

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Vybrant DyeCycle Green �uorescence

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Vybrant DyeCycle Green �uorescence

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Vybrant DyeCycle Green �uorescence

SY

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生細胞

死細胞

A B

細胞周期DNA含量を検出することによって、細胞群を異なる細胞周期のステージごとに分けて捉えることができます。フローサイトメトリーは、モデリングアルゴリズムと組み合わせると G0/G1期、S期または G2/M 期にある細胞もしくは倍数性を示す細胞を評価する強力なツールとなります。当社の蛍光色素は、生細胞群でも固定細胞群でも正確に細胞周期を解析できます（表 12）。詳細説明と製品群については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-cellcycleをご覧ください。

Vybrant DyeCycle Stains• 生細胞の細胞周期を正確に解析

• セルソーティングその他の生細胞実験用の低い細胞毒性

• マルチプレックス解析を簡単にするマルチカラー

• 細胞周期の各ステージに基づくソーティングが可能

• バイオレットレーザーによる幹細胞 side populationの同定が可能

InvitrogenTM VybrantTM DyeCycleTM Stainsは、生細胞の DNAプロファイリング用染色剤です。励起光は 405、488、532、633 nmより選択できます。この染色剤は通常、死細胞を解析から除外するため死細胞染色剤（図 25）と組み合わせて使用します。Vybrant DyeCycle Stainsは細胞毒性が低く、染色細胞を細胞周期の各ステージに基づきソーティングした後、培養または機能評価できます。試薬の種類については、30ページの製品リストをご覧ください。

FxCycle Stains• マルチカラー細胞周期研究の柔軟性を向上

• 488 nm励起染色試薬のコンペンセーションはほぼ不要

• 変動係数の小さなデータで正確な解析

InvitrogenTM FxCycleTM Violet Stain（ 製 品 番 号 F10347）、FxCycle PI/RNase Staining Solution（製品番号 F10797）、または FxCycle Far Red Stain（製品番号 F10348）を用いた細胞周期解析は、使用しないレーザーや検出チャネルを細胞増殖（22ページの図 23）やイムノフェノタイピング、アポトーシス、細胞生存率といった他の細胞アッセイに振り分けられるため、マルチプレックスが簡単です。FxCycle Stainsは、固定および透過処理した細胞の染色用に作製され、細胞群に含まれる各細胞の DNA含量に比例した蛍光シグナルを発します。

A

B

細胞解析

25

図 26. CellEvent Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kitを使用した Jurkat細胞のカスパーゼ活性の検出Jurkat細胞（ヒト白血病 T細胞）を（A）は DMSO で、また（B）は10 µMカンプトテシンで 3時間処理した後、CellEvent Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit（製品番号 C10427）で標識しました。染色サンプルは、488 nmレーザー搭載の Attune Acoustic Focusing Cytometerで解析しました。CellEvent試薬には 530/30 nmバンドパスフィルターを、また SYTOX AADvanced染色剤（キットに同梱）には 690/50 nmバンドパスフィルターを使用して蛍光シグナルを収集しました。カンプトテシンで処理した細胞（B）は、コントロール細胞（A）に見られる基礎レベルに比べてアポトーシスの比率が高いことに注目してください。Aはアポトーシス細胞、Nはネクローシス細胞、Vは生細胞を示します。

–103 –102 103 105 105–104

–103102

104

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106

–103 –102 103 105 105–104

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104

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V V

N N

A A

コントロール 誘導A B

CellEvent Caspase-3/7 Green �uorescence

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SY

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CellEvent Caspase-3/7 Green �uorescence

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106

V V

N N

A A

コントロール 誘導A B

CellEvent Caspase-3/7 Green �uorescence

SY

TOX

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SY

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Dva

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CellEvent Caspase-3/7 Green �uorescence

アポトーシスアポトーシスは、生化学的にも、また形態的にもネクローシスとは異なる変化の過程を示します。アポトーシス細胞は、核クロマチンや細胞質の凝縮、膜結合型アポトーシス小体の形成というネクローシス細胞にはない形態学的特徴を備えています。また生化学的には、アポトーシスはゲノムの断片化と特定の細胞タンパク質の分解または劣化によってネクローシスと区別されます。細胞生存率分析と同様、アポトーシス解析でもひとつのパラメータですべての系の細胞死を完全に定義することはできません。そのためアポトーシスを研究する際は、複数の異なる手法を併用すると効果的です。ここではアポトーシスを評価するためのさまざまな手法と当社製品をご紹介します（表 13）。アポトーシスについての詳細説明と製品群については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-apoptosis をご覧ください。

CellEvent Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit• アポトーシス解析のためにカスパーゼ 3/7基質を最適化

• シンプルな洗浄不要のプロトコールで繊細なアポトーシス細胞を保存

• 生細胞の蛍光イメージングにもホルマリン固定にも対応

カスパーゼは、アポトーシスの開始と誘導に重要な役割を果たす一連の酵素です。そのためカスパーゼの活性化は、アポトーシスの初期段階に見られる顕著な特徴です。当社は、多彩なフローサイトメトリー用カスパーゼ アッセイを提供しています。そのひとつであるInvitrogenTM CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit（製品番号 C10427）にはカスパーゼ 3または 7で切断される基質が含まれており、これが切断後に DNAに結合して明るい蛍光を発してカスパーゼ活性を検出します（図 26）。

表 13. アポトーシス アッセイ選択ガイド製品名 ターゲット 固定処理 マルチプレックス解析 使用するチャネル数

CellEvent Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit

カスパーゼ 3/7 可 可 1

アネキシン V コンジュゲート ホスファチジルセリンの露出 可 可 1

MitoProbe JC-1 Assay Kit ミトコンドリア膜電位 不可 可 2

Violet Ratiometric Membrane Asymmetry Probe/Dead Cell Apoptosis Kit

膜非対称性 不可 可 3

A

B

細胞解析

26

xa Fluor 488 �uorescenceAle100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

ヨウ化プロピジウム蛍光

ヨウ化プロピジウム蛍光

xa Fluor 488 �uorescenceAle

100

101

102

103

104

AA

D

V

D

V

アネキシン Vコンジュゲートとキット• InvitrogenTMの色素にコンジュゲートし、優れた感度を実現

• あらゆるレーザーに対応し、マルチプレックス解析の性能を向上

• 単独の試薬としても、また使いやすいキットとしても入手可能

アポトーシスのもうひとつの特徴は、通常は細胞膜の内側に存在するホスファチジルセリン（PS）が細胞表面に露出することです。アポトーシス細胞でひとたびこの露出が始まると、PSは蛍光標識したアネキシン V（PS結合タンパク質）が結合することで検出できるようになります。当社は、明るく光安定性に優れた当社の Alexa Fluor色素コンジュゲート（図 27）をはじめとする多彩な蛍光標識アネキシン Vを提供します。またアネキシンを他の細胞生存率および細胞機能アッセイ用プローブと組み合わせ、フローサイトメトリーを用いたアポトーシス細胞のマルチパラメータ解析ができるよう最適化したキットも提供しています。代表的な 3つのキットとおもなアネキシン V蛍光コンジュゲートを 31ページの製品リストにまとめました。すべてのアポトーシスキットについては、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-annexinをご覧ください。

MitoProbe JC-1 Assay Kit• 使いやすく既存の研究プロトコールに対応

• 多様な細胞に使用可能

• 488 nm励起または 633/635 nm励起の双方を提供

• コンペンセーションの手間を削減できる選択肢あり

InvitrogenTM MitoProbeTM JC-1 Assay Kit（製品番号 M34152）は、ミトコンドリア膜電位の解析用にカチオン性蛍光色素 JC-1、カルボニルシアニド 3-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP、ミトコンドリア膜電位脱共役剤）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、濃縮リン酸バッファー（PBS）を組み合わせました。JC-1は、膜電位の高さに応じてミトコンドリア内に集積し、濃度依存的な J会合体を形成して蛍光シグナルを緑（~529 nm）から赤（~590 nm）に変化させます（図 28）。ミトコンドリアの脱分極が進むと、赤色蛍光の緑色蛍光に対するシグナル強度の低下という形で現れます。この色の変化は膜電位にのみ依存しており、単一成分の蛍光測定では影響を受けやすい他の要素（ミトコンドリアのサイズや形、密度）に影響されません。そのためこの蛍光色の比率検出法は、膜電位測定法のひとつとして活用できるだけでなく、目的の細胞群に刺激剤を添加した場合の反応細胞の割合を判断する指標ともなります。

図 27. Alexa Fluor 488 アネキシン Vコンジュゲートとヨウ化プロピジウムを用いた Jurkat細胞のフローサイトメトリー解析Jurkat細胞（ヒト白血病 T細胞）を（A）は10 µMカンプトテシンで 4時間処理し、（B）はコントロールとして未処理のまま残しました。その後、Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide（製品番号 V13245）に同梱の各試薬で処理し、フローサイトメトリーで解析しました。カンプトテシンで処理した細胞は、コントロール細胞に比べてアポトーシス細胞（プロット内の円 A）の比率が大幅に高いことに注目してください。Vは生細胞、Dは死細胞を示します。

xa Fluor 488 �uorescenceAle100 101 102 103 104

100

101

102

103

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100 101 102 103 104

ヨウ化プロピジウム蛍光

ヨウ化プロピジウム蛍光

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AA

D

V

D

V

A

B

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103

JC-1 緑色蛍光 JC-1 緑色蛍光

JC-1

赤色蛍光

JC-1

赤色蛍光

未処理A

JC-1

red

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- B

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105

105

104

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103 105104103

105

104

103

処理済B

図 28. 2 µM JC-1で染色した Jurkat 細胞MitoProbe JC-1 Assay Kit（製品番号 M34152）に同梱の各試薬で細胞を染色し、37°C、5% CO2で 20分間インキュベートしました。次に PBSで洗浄し、488 nmレーザー搭載の Attune Acoustic Focusing Cytometer で 530/30 nmバンドパスフィルターと >640 nmロングパスフィルターを使用して解析しました。（A）は未処理の培養細胞、（B）は 10 µMカンプトテシンを用いて 37°Cで 5時間処理し、アポトーシスを誘導した細胞です。

細胞解析

27

図 29. Violet Ratiometric Membrane Asymmetry Probe によるアポトーシス検出Jurkat細胞（ヒト白血病 T細胞）を 10 µMカンプトテシンで 4時間処理したサンプル（パネル Bと D）、およびコントロールとして未処理のまま残したサンプル（パネル Aと C）を調製しました。これらのサンプルをフローサイトメーターで解析しました。F2N12Sは 405 nm レーザーで励起後、585 nm および 530 nmバンドパスフィルターで、また SYTOX AADvanced Dead Cell Stain は 488 nmレーザーで励起後、695 nmバンドパスフィルターでシグナルを検出しました。F2N12Sが発する 2つの蛍光波長の相対強度比によって、生細胞とアポトーシス細胞および死細胞が識別できます（A、B）。パネル Cと Dでは、F2N12Sの 2つの蛍光強度から得た比率パラメータ（585/530 nm）を横軸に、また SYTOX AADvanced Dead Cell Stain の蛍光シグナルを縦軸に取り、プロットを作成しました。A = アポトーシス細胞、L = 生細胞、D = 死細胞。

F2N12S 橙色蛍光

F2N

12S

緑色蛍光

0 65,536 131,072 196,608 262,1440

65,536

131,072

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262,144

L

A+D

F2N12S 橙色蛍光

F2N

12S

緑色蛍光

0 65,536 131,072 196,608 262,1440

65,536

131,072

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L

A+D

F2N12S ratio 585 nm/530 nm �uorescence x 1,000

SY

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AA

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105

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0 1,250 2,500 3,750 5,000

F2N12S ratio 585 nm/530 nm �uorescence x 1,000

SY

TOX

AA

Dva

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resc

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0 1,250 2,500 3,750 5,000101

102

103

104

105

L

A

D

A B

C D

膜非対称性プローブ• トリプシン処理細胞の正確なアポトーシス解析が可能

• シンプルな 5分間染色プロトコール

• 他の青色励起アポトーシス染色剤に適合

InvitrogenTM Violet Ratiometric Membrane Asymmetry Probe/Dead Cell Apoptosis Kit（製品番号 A35137）は、バイオレットレーザー搭載のフローサイトメーターを用いて死細胞を識別しながらアポトーシスを検出する使いやすい効率的なキットです（図 29）。Violet Ratiometric Membrane Asymmetry Probeがアポトーシスの過程で起こる膜非対称性の変化を検出します。接着細胞と浮遊細胞の双方で良好に機能し、カスパーゼ検出やミトコンドリア膜電位の変化のような他のアポトーシス指標とも相関性があります。プローブの色素は、励起状態分子内プロトン移動（ESIPT）反応を起こすため、530 nmと 585 nmに相当する 2つの発光波長を持つ二重蛍光を発します。この 2つの蛍光シグナルが、表面電荷の変動に対して 2色のレシオメトリックな反応を示します。F2N12Sプローブを SYTOX AADvanced Dead Cell Stainと組み合わせると、後期アポトーシス細胞またはネクローシス細胞でのみ細胞膜を通過できるため、早期アポトーシス細胞との識別が可能です。

このアッセイは、アネキシンベースのアッセイとは異なり、特殊なバッファーや洗浄ステップを必要としません。そのため接着細胞の解析の際、物理的または化学的な剥離手順で起こりがちな細胞膜の損傷を受けにくく、より品質の高いデータが得られます。

細胞解析

28

その他の細胞機能アッセイCellROX Flow Cytometry Kits• 活性酸素種（ROS）の存在下で酸化し、蛍光を発する蛍光プローブ

• 他の波長のレーザーで励起される蛍光色素とのオーバーラップが少なく、マルチプレックス解析が簡単

• 細胞を完全培地または他の所定のバッファー中で染色できるため、無血清培地が不要

ROSの生成は好気性生物にとって不可避ですが、正常な細胞では制御可能なレベルに抑えられています。しかし酸化ストレスのもとでは ROSの生成が飛躍的に増え、膜脂質やタンパク質、核酸などにダメージを与えます。これらの生体分子は、老化だけでなくさまざまな病理学的理由（アテローム性動脈硬化症や癌、虚血再灌流障害、神経変性疾患など）でも酸化ダメージを受けます。

InvitrogenTM CellROXTM試薬は、細胞の全体的な酸化ストレスを従来型の蛍光顕微鏡やハイコンテントスクリーニング、マイクロプレート蛍光定量、フローサイトメトリーなどで測定するための蛍光プローブです（図 30）。この色素は還元状態では非蛍光ですが、酸化されると明るい蛍光を発します。当社のフローサイトメトリー用キットには、CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit（製品番号 C10492）、CellROX Orange Flow Cytometry Assay Kit（製品番号 C10493）、CellROX Deep Red Flow Cytometry Assay Kit（製品番号 C10491）の 3種類があります。製品の詳細については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-cellroxをご覧ください。

図 30. フローサイトメトリーによる ROS 検出（A）CellROX Deep Red Flow Cytometry Assay Kit（製品番号 C10491）に同梱の CellROX Deep Red Reagentで検出した Jurkat細胞のROSレベル。N-アセチルシステイン（NAC）で培養細胞を前処理した後、酸化処理したサンプルの ROSレベルは、直接酸化処理したサンプルより低下しました。酸化剤の tert-ブチルヒドロペルオキシド（TBHP）で処理した細胞（赤）は、NAC で前処理した後 TBHPで処理した細胞（青）や未処理のコントロール細胞（緑）よりも高い蛍光シグナルを示しました。（B、C）CellROX Deep Red Reagentは、SYTOX Blue Dead Cell Stainと併用すると酸化ストレス下にある生細胞と死細胞とを区別します。Jurkat細胞を （B）PBSまたは（C）200 µM TBHPで 30分間処理した後、CellROX Deep Red Flow Cytometry Assay Kitで標識しました。TBHPで処理した細胞（C）のROSは、基礎レベルのコントロール細胞（B）に比べて多いため、酸化ストレス下にある細胞の比率が高いことに注目してください。

CellROX Deep Red �uorescence

SY

TOX

Blu

e �u

ores

cenc

e

0

102

103

104

105

0 102 103 104 105

CellROX Deep Red �uorescence

SY

TOX

Blu

e �u

ores

cenc

e

0

102

103

104

105

0 102 103 104 1050 102 103 104 105

CellROX Deep Red �uorescence

Cou

nt

死細胞3.01%

++0.021%

++1.25%

生細胞96.1%

生細胞0.901%

ROS+0.852%

ROS+93.1%

死細胞4.74%

A B CA B C

細胞解析

29

図 31. pHrodo Red BioParticlesコンジュゲートで処理した顆粒球の蛍光強度が増大したことを示すフローサイトメトリー解析全血サンプルを採取し、ヘパリンで処理した後、100 µL 分注を 2つ調製しました。pHrodo Red E. coli BioParticles Phagocytosis Kit（製品番号 A10025）に同梱の pHrodo Red E. coli BioParticlesコンジュゲートで 2つのサンプルを処理し、ボルテックスしました。サンプルのひとつを 37°Cのウォーターバスにセットし、他のひとつ（ネガティブコントロール）をアイスバスにセットしました。15分間インキュベーションした後、塩化アンモニウムベースの溶解バッファーで赤血球を溶解しました。2つのサンプルを 500 x gで 5分間スピンダウンし、一度洗浄した後、ハンクス平衡塩で再懸濁しました。次に 488 nmアルゴンレーザー搭載の BD FACSCalibur Cytometer を使用して 564～ 606 nm バンドパスフィルターでサンプルを解析しました。37°Cでインキュベーションしたサンプルは、ファゴサイトーシスにより pHrodo Red BioParticlesコンジュゲート（赤色）の蛍光が増大しました。一方ネガティブコントロールサンプルは氷上に置いたため、ファゴサイトーシスが抑制されました（青色）。

pHrodo dye �uorescence (585 nm)

Cou

nt

120

80

40

0100 101 102 103 104

ネガティブ コントロール

ファゴサイトーシスされた粒子

pHrodo E. coli BioParticles Phagocytosis Kits• ファゴサイトーシスとエンドサイトーシスを特異的に検出およびモニタリング

• pHrodoコンジュゲートが抗体のインターナリゼーションを追跡

• pHrodoコンジュゲートがリガンドのインターナリゼーションを追跡

• 赤色または緑色色素と組み合わせてマルチプレックス解析が可能

高い pH感受性を示す 当社独自の pHrodo色素は、中性 pHではほぼ非蛍光ですが、酸性環境では明るい蛍光を発するため、ファゴサイトーシスやエンドサイトーシスのプロセス解明など多様なアプリケーションで最適の pHインジケーターとして利用できます。InvitrogenTM pHrodoTM Green E. coli BioParticlesTM Phagocytosis Kit（製品番号 P35381）と pHrodo Red E. coli BioParticles Phagocytosis Kit（製品番号 A10025、図 31）は、フローサイトメトリーを使用した全血サンプルや生細胞株のファゴサイトーシス検出が可能です。キットには、食作用や赤血球溶解の評価に必要なすべての試薬が同梱されています。また pHrodo Phagocytosis Particle Labeling Kit（製品番号 A10026）を使用すると、お客様独自の細菌サンプルを pHrodo Red色素で標識することもできます。詳細説明と製品群については、ウェブサイトwww.thermo�sher.com/�ow-phrodoをご覧ください。

細胞解析

30

分類 製品名 レーザーの 種類

Ex/Em* 容量 製品番号

細胞生存率 LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit UV 350/450 200回分 L23105

LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit バイオレット 416/451 200回分 L34955

LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit バイオレット 367/526 200回分 L34957

LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit バイオレット 400/575 200回分 L34959

LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit ブルー 495/520 200回分 L23101

LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit ブルー 595/615 200回分 L23102

LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit

レッド 650/665 200回分 L10120

LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit

レッド 750/775 200回分 L10119

LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Sampler Kit

各種 各種 320回分 L34960

SYTOX Blue Dead Cell Stain UV/ バイオレット

444/480† 1 mL S34857

SYTOX Green Dead Cell Stain ブルー 504/523† 1 mL S34860

SYTOX Orange Dead Cell Stain イエロー 547/570† 1 mL S34861

SYTOX Red Dead Cell Stain レッド 640/658† 1 mL S34859

SYTOX Dead Cell Stain Sampler Kit 各種 各種 1キット S34862

SYTOX AADvanced Dead Cell Stain ブルー 546/647†5 x 0.5 mL S10274

0.2 mL S10349

細胞増殖 Click-iT Plus EdU Paci�c Blue Flow Cytometry Assay Kit

バイオレット 404/450 50回分 C10636

Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit ブルー 495/519

50回分 C10632

100回分 C10633

Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit レッド 650/670

50回分 C10634

100回分 C10635

CellTrace Violet Cell Proliferation Kit バイオレット 405/450 180回分 C34557

CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit ブルー 492/517 1キット C34554

CellTrace Far Red Cell Proliferation Kit レッド 630/661 1キット C34564

細胞の種類 Vybrant DyeCycle Violet Stain バイオレット 369/437† 200 µL V35003

Vybrant DyeCycle Green Stain ブルー 506/534† 400 µL V35004

Vybrant DyeCycle Orange Stain ブルー 519/563† 400 µL V35005

Vybrant DyeCycle Ruby Stain レッド 638/686†100回分 V10309

400回分 V10273

FxCycle Violet Stain バイオレット 358/461 500回分 F10347

FxCycle PI/RNase Staining Solution ブルー 535/617 100 mL F10797

FxCycle Far Red Stain レッド 640⁄658 500回分 F10348

細胞解析製品リスト

* 最大励起波長（Ex）と最大蛍光波長（Em）、単位は nm。† DNA に結合した状態の励起 /発光波長、単位は nm。§ 濃度依存的な J 会合体を形成して蛍光シグナルが緑から赤に変化します。

細胞解析

31

分類 製品名 レーザーの 種類

Ex/Em* 容量 製品番号

アポトーシスCellEvent Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit

ブルー / グリーン

511/533 (CellEvent Green)†

546/647 (SYTOX® AADvanced Stain)†

100回分 C10427

Annexin V, Paci�c Blue conjugate バイオレット 410/455 500 µL A35122

Annexin V, FITC conjugate ブルー 494/518 500 µL A13199

Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate ブルー 495/519 500 µL A13201

Annexin V, PE conjugate ブルー 496, 546, 565/578 250 µL A35111

Annexin V, APC conjugate レッド 650/660 250 µL A35110

Annexin V, Alexa Fluor 647 conjugate レッド 650/665 500 µL A23204

Paci�c Blue Annexin V/SYTOX ADvanced Apoptosis Kit

バイオレット / ブルー

410/455 Paci�c Blue dye

546/647 (SYTOX

AADvanced dye)

50回分 A35136

Dead Cell Apoptosis Kit with Alexa Fluor 488 Annexin V & Propidium Iodide ブルー

495/519 (Alexa Fluor 488 dye) 50回分 V13241

535/617 (PI) 250回分 V13245

Dead Cell Apoptosis Kit with FITC annexin V & Propidium Iodide ブルー

494/519 (FITC)

535/617 (PI)50回分 V13242

Violet Ratiometric Asymmetry Probe/Dead Cell Apoptosis Kit

バイオレット / ブルー

405 ⁄ 530, 585(F2N12S)546/647†

(SYTOX AADvanced dye)

100回分 A35137

MitoProbe JC-1 Assay Kit ブルー 514/529, 590§ 100回分 M34152

その他の細胞機能アッセイ

CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit ブルー508/525

(CellROX Green)640/658

(SYTOX Red)†100回分 C10492

CellROX Orange Flow Cytometry Assay Kit グリーン （532 nm）

545/565(CellROX Orange)

640/658(SYTOX Red)†

100回分 C10493

CellROX Deep Red Flow Cytometry Assay Kit レッド640/665

(CellROX Deep Red)444/480

(SYTOX Blue)†100回分 C10491

pHrodo Green E. coli BioParticles Phagocytosis Kit ブルー 509/533 100 回分 P35381

pHrodo Green S. aureus BioParticles Phagocytosis Kit ブルー 509/533 100回分 P35382

pHrodo Red E. coli BioParticles Phagocytosis Kit ブルー 560/585 100回分 A10025

pHrodo Phagocytosis Particle Labeling Kit ブルー 560/585 100回分 A10026

* 最大励起波長（Ex）と最大蛍光波長（Em）、単位は nm。† DNAに結合した状態の励起 /発光波長、単位は nm。§ 濃度依存的な J会合体を形成して蛍光シグナルが緑から赤に変化します。

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最新フローサイトメーター　最大 4本レーザー搭載、14色検出可能

Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer

主な特長● モジュール式（組み立てユニット）システム採用現場でたった 1日でアップグレード可能な 1～ 4本レーザーシステム。蛍光検出は最大 14色まで可能です。

● 独自のアコースティックフォーカシング技術により速い検出スピード を実現データ精度を全く犠牲にせず、短い解析時間で測定可能です。（≧ 105 cells /mLのサンプルを用いて、10,000 eventsを数秒で解析）● 独自開発の使いやすいソフトウェアお客様と共に開発した独自の優れたソフトウェアは直感的に操作でき、未経験者からベテランユーザーまで満足いただけます。

● ラボに適したコンパクト設計実験ベンチにピッタリ収まるサイズで、限りあるラボのスペースを有効に使えます。

● よりシンプルな流路系流路系がシンプルに設計されているため、詰りにくいです。（測定粒子範囲：0.5–50 µm）

InvitrogenTM AttuneTM NxT Acoustic Focusing Cytometerは音響技術を利用して超音波で細胞をキャピラリーの中心軸に一列に整列させる独自の技術を採用しています。 サンプルスピードに関係なく、レーザー照射の時点で細胞をきちんと集束させることができるので、かつてない高容量のサンプルスループットで高精度の解析を可能にします。

アコースティックフォーカシング= OFF

サンプルはフォーカスされません

アコースティックフォーカシング= ON

サンプルはフォーカスされます

Attune NxT cytometer 14-color laser con�gurations

レーザー 励起 蛍光 共通色素 蛍光タンパク質

Violet 405 nm

440/50 Paci�c Blue ECFP 512/25 Paci�c Green603/48 Paci�c Orange710/50 Qdot 705

Blue 488 nm

NA FSC NA SSC*** 530/30 FITC EGFP, Emerald GFP 574/26* PE EYFP 590/40** PE, PE–Texas Red695/40 PerCP-Cy5.5 780/60* PE-Cy7

Yellow 561 nm

585/16 PE RFP 620/15 PE-Texas Red mCherry, tdTomato, DsRed, mStrawberry695/40 PE-Cy 5.5 780/60 PE-Cy 7

Red 638 nm 670/14 APC 720/30 Alexa Fluor 700 780/60 APC-Alexa Fluor 750

* Yellowレーザーがない組み合わせでのみ設定あり** Yellowレーザーがある組み合わせでのみ設定あり*** 側方散乱光はどのレーザーでも検出可能（デフォルトはブルーレーザー）。「非溶血 /非洗浄」アプリケーションには、バイオレットの側方散乱光を推奨。

機器仕様

本体

設置面積（高さ×幅×奥行き）：おおよそ 40 cm × 58 cm × 43 cm 重量：おおよそ 29 kg 動作温度：15～ 30℃ 動作湿度：10～ 90%、結露しないこと 電源：100～ 240 VAC、50/60 Hz、<150 W 可聴ノイズ：1.0 mで 65 dBA

光学系 光学系の配置は、1～ 4個のレーザシステムから選択された機器の構成に依存します。

励起

レーザー能力 :Blue laser: 488 nm, 50 mW

Violet laser: 405 nm, 50 mW

Red laser: 637 nm, 100 mW

Yellow laser: 561 nm, 50 mW

レーザー概略 :フラットトップレーザー採用。調整が最小限フローセル :クオーツキュベットゲルで接合された 1.2NA 集光レンズアライメント : 固定化されたアライメント , お客様によるメンテナンスは必要ありません。

発光系前方散乱：488/10バンドパスフィルターとフォトダイオード検出器側方散乱：488/10バンドパスフィルターと PMT発光フィルタ：ユーザーによる交換が可能、主要なフィルタを搭載済み

流路系

サンプル流速 : 12.5–1,000 µL/minサンプル送達 :サンプルは、容積測定分析のために明確な排出量のシリンジから送達サンプル添加容量 : 20 µL–4 mL液体保管 :すべての液体は、水位センサー付きで機器本体内に収納標準液タンク : 1.8 Lフォーカシング溶液タンク, 1.8 Lウォータータンク, 175 mLシャットダウン溶液タンク,

175 mLウォッシュ溶液タンク外部タンクオプション：溶液 10 Lのオプション設定液体消費量 : 1日あたり1.8 Lサンプルチューブ : 17 × 100 mm から 8.5 × 45 mmのチューブに適合

ソフトウェア機能

コンペンセーション：完全自動化および手動補正モード 装置のトラッキング：Levey-jennings プロットによる自動化したベースラインとパフォーマンステスト 自動化メンテナンス：≤ 15分の起動とシャットダウン 最大イベントファイル：2000万 ヒートマップ：チューブとプレートの可視化 SmartGate ラベル：QuadStats math calculator：カスタマイズされた統計情報を作成します（Stain Index、S / N比、濃度） ファイル形式：FCS3.1（保存） フィルタ設定：フィルタ構成マネージャを使用して簡単な試薬の選択 グラフィックス解像度：印刷や論文発表に使えるレベルの画像品質 ユーザログと管理および個々のアカウントゲート：スタンダードおよびカスタマイズ可能なゲート

パフォーマンス

データ取得速度：35,000イベント /秒粒子サイズ範囲：0.5–50 µm蛍光感度：≤ 80 MESF FITC

≤ 30 MESF PE ≤ 70 MESF APC

Attune NxT Autosampler主な特長

● 幅広い適合性96/384ウェル プレート、ディープウェル プレートなど、さまざまなフォーマットに対応します。

● 高性能プローブ 目詰まりやキャリーオーバーを最小限（<1%）に抑え、装置の損傷を防ぎます。

● 吸引による混合 サンプルを振盪する代わりに吸引して混合し、均一性と細胞の生存率を維持します。

● 自動クリーニング機能シャットダウン時に装置を自動でクリーニングします。

● 一貫性のあるデータサンプリング法（チューブまたはプレート）や収集レートの違いから生じる変動を最小限に抑えます。

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サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパン株式会社

研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続上での使用はできません。 記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。For Research Use only. Not for use in diagnostic procedures. © 2016 Thermo Fisher Scienti�c Inc. All rights reserved.All trademarks are the property of Thermo Fisher Scienti�c and its subsidiaries unless otherwise speci�ed.価格、製品の仕様、外観、記載内容は予告なしに変更する場合がありますので予めご了承ください。標準販売条件はこちらをご覧ください。 www.thermo�sher.com/jp-tc

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