(57)【要約】　クロストリジウム・ボツリナムの発酵、およびボツリヌス毒素医薬組成物の調製に使用するボツリヌス毒素の取得のための培地および方法。本発明の成長培地は、顕著に低下したレベルの肉副生成物または乳副生成物を含有し得、動物由来生成物の代わりに非動物由来生成物を使用しうる。好ましくは、使用する培地は動物由来生成物を実質的に含まない。

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【 特 許 請 求 の 範 囲 】【 請 求 項 １ 】　 生 物 学 的 に 活 性 な ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 取 得 す る 方 法 で あ っ て 、（ a） 動 物 由 来 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま な い 発 酵 培 地 を 用 意 す る 工 程 、（ b） ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 生 産 を 可 能 に す る 条 件 下 で 発 酵 培 地 中 に ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツリ ナ ム （ Clostridium botulinum） 細 菌 を 培 養 す る 工 程 、 お よ び（ c） 発 酵 培 地 か ら 生 物 学 的 に 活 性 な ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 回 収 す る 工 程を 含 む 方 法 。【 請 求 項 ２ 】　 発 酵 培 地 を 用 意 す る 工 程 に お い て 、 培 地 が 植 物 由 来 の タ ン パ ク 質 生 成 物 を 含 む 、 請 求 項1に 記 載 の 方 法 。【 請 求 項 ３ 】　 植 物 が 大 豆 で あ る 、 請 求 項 2に 記 載 の 方 法 。【 請 求 項 ４ 】　 培 養 工 程 に お い て 、 培 養 物 の 細 胞 密 度 が 細 胞 溶 解 に よ っ て 低 下 す る ま で 培 養 を 行 う 、 請求 項 1に 記 載 の 方 法 。【 請 求 項 ５ 】　 培 養 工 程 に お い て 、 細 胞 密 度 が 細 胞 溶 解 に よ っ て 最 初 に 低 下 し て か ら 少 な く と も 48時 間後 ま で 培 養 を 行 う 、 請 求 項 1に 記 載 の 方 法 。【 請 求 項 ６ 】　 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 生 産 方 法 で あ っ て 、（ a） 動 物 由 来 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま ず 、 か つ 植 物 由 来 の タ ン パ ク 質 生 成 物 を 含 む 第 1培 地を 用 意 す る 工 程 、（ b） ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 成 長 を 可 能 に す る 条 件 下 で 、 第 1培 地 中 に ク ロ ス トリ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 細 菌 を 培 養 す る 工 程 、（ c） 動 物 由 来 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま ず 、 か つ 植 物 由 来 の タ ン パ ク 質 生 成 物 を 含 む 第 2培 地を 用 意 す る 工 程 、（ d） 第 1培 地 を 第 2培 地 に 接 種 す る 工 程 、（ e） ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 生 産 を 可 能 に す る 条 件 下 で 、 第 2培 地 中 に ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツリ ナ ム 細 菌 を 培 養 す る 工 程 、 お よ び（ f） ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 回 収 す る 工 程を 含 む 方 法 。【 請 求 項 ７ 】　 第 1培 地 を 用 意 す る 工 程 に お い て 、 第 1培 地 が 大 豆 由 来 の タ ン パ ク 質 生 成 物 を 含 み 、 か つ第 2培 地 に 接 種 す る 工 程 に お い て 、 第 2培 地 が 大 豆 由 来 の タ ン パ ク 質 生 成 物 を 含 む 、 請 求 項6に 記 載 の 方 法 。【 請 求 項 ８ 】　 第 1培 地 を 用 意 す る 工 程 に お い て 、 第 1培 地 が 加 水 分 解 大 豆 を 含 み 、 か つ 第 2培 地 に 接 種す る 工 程 に お い て 、 発 酵 培 地 が 加 水 分 解 大 豆 を 含 む 、 請 求 項 6に 記 載 の 方 法 。【 請 求 項 ９ 】　 第 1培 地 中 で ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を 培 養 す る 工 程 に お い て 、 条 件 が 約 34℃ の温 度 を 含 む と 共 に 、 培 養 中 に 細 胞 密 度 の 低 下 が 起 こ ら な い こ と を 含 み 、 か つ　 第 1培 地 を 第 2培 地 に 接 種 す る 工 程 に お い て 、 2か ら 4%の 第 1培 地 を 第 2培 地 の 接 種 に 使 用し 、 か つ　 第 2培 地 中 で 細 菌 を 培 養 す る 工 程 に お い て 、 成 長 を 可 能 に す る 条 件 が 約 34℃ の 温 度 を 含む と 共 に 、 培 養 物 の 細 胞 密 度 が 細 胞 溶 解 に よ っ て 低 下 す る ま で 培 養 す る こ と を 含 む 、請 求 項 6に 記 載 の 方 法 。【 請 求 項 １ ０ 】　 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム お よ び ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 生 産 用 培 養 培 地 を 含 む 組 成 物 で あっ て 、 培 地 が 動 物 由 来 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま ず 、 か つ 植 物 由 来 の タ ン パ ク 質 生 成 物 を 含 む

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、 組 成 物 。【 請 求 項 １ １ 】　 植 物 が 大 豆 で あ る 、 請 求 項 10に 記 載 の 組 成 物 。【 請 求 項 １ ２ 】　 加 水 分 解 大 豆 を 含 む 、 請 求 項 10の 組 成 物 。【 請 求 項 １ ３ 】　 活 性 成 分 が ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 で あ る 、 動 物 性 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま な い 医 薬 組 成 物 を 製 造す る 方 法 で あ っ て 、（ a） （ i） 動 物 由 来 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま な い 発 酵 培 地 を 用 意 し 、 （ ii） ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 生 産 を 可 能 に す る 条 件 下 で 、 発 酵 培 地 中 に ク ロ ス ト リ ジ ウム ・ ボ ツ リ ナ ム を 培 養 し 、 そ し て （ iii） 発 酵 培 地 か ら 生 物 学 的 に 活 性 な ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 回 収 す るこ と に よ っ て 生 物 学 的 に 活 性 な ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 取 得 す る 工 程 、（ b） ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 適 切 な 賦 形 剤 と 配 合 す る こ と に よ り 、 活 性 成 分 が ボ ツ リ ヌ ス 毒 素で あ る 、 動 物 性 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま な い 医 薬 組 成 物 を 製 造 す る 工 程を 含 む 方 法 。【 発 明 の 詳 細 な 説 明 】【 技 術 分 野 】【 ０ ０ ０ １ 】　 本 発 明 は 生 物 学 的 に 活 性 な ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 取 得 す る た め の 培 地 お よ び 方 法 に 関 す る 。特 に 本 発 明 は 、 生 物 学 的 に 活 性 な ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 大 量 に 取 得 す る た め の 、 動 物 性 生 成 物を 実 質 的 に 含 ま な い 培 地 、 培 養 物 お よ び 嫌 気 発 酵 法 （ ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム （ Clostridium botulinum） 細 菌 な ど の 生 物 の ） に 関 す る 。【 背 景 技 術 】【 ０ ０ ０ ２ 】　 治 療 、 診 断 、 研 究 ま た は 美 容 を 目 的 と す る ヒ ト ま た は 動 物 へ の 投 与 に 適 し た 医 薬 組 成 物は 活 性 成 分 を 含 む こ と が で き る 。 医 薬 組 成 物 は 1つ 以 上 の 賦 形 剤 、 緩 衝 剤 、 担 体 、 安 定 剤、 保 存 剤 お よ び ／ ま た は 増 量 剤 も 含 む こ と が で き る 。 医 薬 組 成 物 中 の 活 性 成 分 は ボ ツ リ ヌス 毒 素 な ど の 生 物 学 的 物 質 で あ り う る 。 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 1つ 以 上 の 動 物 由 来 生 成 物 （例 え ば 肉 汁 培 地 、 お よ び 血 液 分 画 ま た は 血 液 由 来 の 賦 形 剤 ） を 利 用 す る 培 養 、 発 酵 お よ び配 合 方 法 に よ っ て 取 得 す る こ と が で き る 。 動 物 由 来 生 成 物 を 利 用 す る 方 法 に よ っ て 取 得 した 活 性 成 分 の 生 物 学 的 物 質 を 含 む 医 薬 組 成 物 の 患 者 へ の 投 与 に よ り 、 様 々 な 病 原 体 ま た は感 染 因 子 を も ら う 潜 在 的 危 険 に 、 そ の 患 者 を さ ら す こ と に な り う る 。 例 え ば 医 薬 組 成 物 には プ リ オ ン が 存 在 し う る 。 プ リ オ ン は 、 正 常 タ ン パ ク 質 を 作 る 配 列 と 同 じ 核 酸 配 列 か ら 異常 コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン ア イ ソ フ ォ ー ム と し て 生 じ る と 考 え ら れ て い る タ ン パ ク 質 性 感 染 粒子 で あ る 。 ま た 、 感 染 性 は 、 翻 訳 後 レ ベ ル で の 正 常 ア イ ソ フ ォ ー ム タ ン パ ク 質 か ら プ リ オン タ ン パ ク 質 ア イ ソ フ ォ ー ム へ の 「 補 充 （ recruitment） 反 応 」 に 存 在 す る と も 考 え ら れて い る 。 正 常 な 内 因 性 細 胞 性 タ ン パ ク 質 が 病 原 性 プ リ オ ン コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン へ ミ ス フ ォー ル ド (misfold)す る よ う に 誘 導 さ れ る よ う で あ る 。【 ０ ０ ０ ３ 】　 ク ロ イ ツ フ ェ ル ト ・ ヤ コ ブ 病 は 、 伝 染 性 因 子 が プ リ オ ン タ ン パ ク 質 の 異 常 ア イ ソ フ ォ ーム で あ る ら し い ヒ ト 伝 染 性 海 綿 状 脳 症 の 稀 な 神 経 変 性 障 害 で あ る 。 ク ロ イ ツ フ ェ ル ト ・ ヤコ ブ 病 患 者 は 見 か け 上 の 完 全 な 健 康 状 態 か ら 6ヶ 月 以 内 に 無 動 無 言 状 態 へ と 悪 化 し う る 。し た が っ て 、 動 物 由 来 生 成 物 を 使 っ て 取 得 さ れ た ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 な ど の 生 物 学 的 物 質 を 含有 す る 医 薬 組 成 物 の 投 与 に よ り 、 ク ロ イ ツ フ ェ ル ト ・ ヤ コ ブ 病 な ど の プ リ オ ン 媒 介 疾 患 をも た ら す 潜 在 的 危 険 が 存 在 し う る 。【 ０ ０ ０ ４ 】

　 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム 属 に は 127を 越 え る 種 が あ り 、 形 態 学 お よ び 機 能 に 従 っ て 分 類 さ れ てい る 。 嫌 気 性 グ ラ ム 陽 性 細 菌 で あ る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム は 、 ボ ツ リ ヌ ス 中 毒 と

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ボ ツ リ ヌ ス 毒 素

し て 知 ら れ る 神 経 麻 痺 性 障 害 を ヒ ト お よ び 動 物 に お い て 引 き 起 こ す 強 力 な ポ リ ペ プ チ ド 神経 毒 で あ る ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 産 生 す る 。 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム お よ び そ の 胞 子 は共 に 土 壌 中 に 見 出 さ れ 、 該 細 菌 は 、 滅 菌 と 密 閉 が 不 適 切 な 零 細 缶 詰 工 場 の 食 品 容 器 内 で 増殖 す る 可 能 性 が あ り 、 こ れ が 多 く の ボ ツ リ ヌ ス 中 毒 症 例 の 原 因 で あ る 。 ボ ツ リ ヌ ス 中 毒 の影 響 は 、 通 例 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 培 養 物 ま た は 胞 子 で 汚 染 さ れ た 食 品 を 飲食 し た 18～ 36時 間 後 に 現 れ る 。 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 消 化 管 内 を 弱 毒 化 さ れ な い で 通 過 す るこ と が で き 、 そ し て 末 梢 運 動 ニ ュ ー ロ ン を 攻 撃 す る こ と が で き る よ う で あ る 。 ボ ツ リ ヌ ス毒 素 中 毒 の 症 状 は 、 歩 行 困 難 、 嚥 下 困 難 お よ び 会 話 困 難 か ら 、 呼 吸 筋 の 麻 痺 お よ び 死 に まで 進 行 し 得 る 。【 ０ ０ ０ ５ 】　 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 人 類 に 知 ら れ て い る 最 も 致 死 性 の 天 然 の 生 物 学 的 物 質 で あ る 。ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 （ 精 製 さ れ た 神 経 毒 複 合 体 ） A型 の 約 50ピ コ グ ラ ム が マ ウ ス に お け る LD 5 0で あ る 。 モ ル 基 準 で A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 致 死 力 は ジ フ テ リ ア の 18億 倍 、 シ ア ン 化 ナ ト リウ ム の 6億 倍 、 コ ブ ロ ト キ シ ン の 3000万 倍 、 コ レ ラ の 1200万 倍 で あ る 。 Natuaral Toxins II［ B. R. Singhら 編 、 Plenum Press、 ニ ュ ー ヨ ー ク （ 1976） ］ の Singh、 Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins、 第 63～ 84頁 （ 第 4章 ） （ こ こ で 、 記 載 さ れ る A型 ボ ツ リヌ ス 毒 素 LD 5 0 　 0.3ng＝ 1Uと は 、 BOTOX（ 登 録 商 標 ） 約 0.05ng＝ 1Uと い う 事 実 に 補 正 さ れ る） 。 BOTOX（ 登 録 商 標 ） は 、 Allergan， Inc． （ カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ア ー ビ ン ） か ら 市 販 さ れて い る A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 精 製 神 経 毒 複 合 体 の 商 標 で あ る 。 1単 位 （ U） の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素は 、 そ れ ぞ れ が 18～ 20グ ラ ム の 体 重 を 有 す る メ ス の Swiss Websterマ ウ ス に 腹 腔 内 注 射 され た と き の LD 5 0 と し て 定 義 さ れ る 。【 ０ ０ ０ ６ 】　 7種 類 の 血 清 学 的 に 異 な る ボ ツ リ ヌ ス 神 経 毒 が 特 徴 付 け ら れ て お り 、 こ れ ら は 、 型 特 異的 抗 体 に よ る 中 和 に よ っ て そ の そ れ ぞ れ が 識 別 さ れ る ボ ツ リ ヌ ス 神 経 毒 血 清 型 A、 B、 C 1 、D、 E、 Fお よ び Gで あ る 。 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の こ れ ら の 異 な る 血 清 型 は 、 そ れ ら が 冒 す 動 物 種、 な ら び に そ れ ら が 惹 起 す る 麻 痺 の 重 篤 度 お よ び 継 続 時 間 が 異 な る 。 例 え ば 、 A型 ボ ツ リヌ ス 毒 素 は 、 ラ ッ ト に お い て 生 じ る 麻 痺 率 に よ り 評 価 さ れ た 場 合 、 B型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 より も 500倍 強 力 で あ る こ と が 確 認 さ れ て い る 。 ま た 、 B型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 霊 長 類 で は 480U/kgの 投 与 量 で 非 毒 性 で あ る こ と が 確 認 さ れ て い る 。 こ の 投 与 量 は 、 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素の 霊 長 類 LD 5 0 の 約 12倍 で あ る 。 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 コ リ ン 作 動 性 の 運 動 ニ ュ ー ロ ン に 大 きな 親 和 性 で 結 合 し て 、 ニ ュ ー ロ ン に 移 動 し 、 ア セ チ ル コ リ ン の シ ナ プ ス 前 放 出 を 阻 止 す るよ う で あ る 。【 ０ ０ ０ ７ 】　 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 例 え ば 活 動 過 多 な 骨 格 筋 に よ っ て 特 徴 付 け ら れ る 神 経 筋 障 害 を 処 置す る た め に 臨 床 的 状 況 に お い て 使 用 さ れ て い る 。 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 （ BOTOX（ 登 録 商 標 ）） は 、 本 態 性 眼 瞼 痙 攣 、 斜 視 お よ び 片 側 顔 面 痙 攣 を 12歳 を 越 え る 患 者 に お い て 処 置 す る ため に 、 ま た 頸 部 ジ ス ト ニ ア の 処 置 の た め 、 お よ び 眉 間 （ 顔 面 ） し わ の 処 置 の た め に 、 米 国食 品 医 薬 品 局 に よ っ て 承 認 さ れ て い る 。 FDAは ま た 、 頸 部 ジ ス ト ニ ア の 処 置 の た め の B型 ボツ リ ヌ ス 毒 素 も 承 認 し て い る 。 末 梢 注 射 （ 例 え ば 筋 肉 内 ま た は 皮 下 ） A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素の 臨 床 的 効 果 は 、 通 常 、 注 射 後 1週 間 以 内 お よ び し ば し ば 数 時 間 以 内 に 認 め ら れ る 。 A型 ボツ リ ヌ ス 毒 素 の 単 回 筋 肉 内 注 射 に よ る 症 候 緩 和 （ 例 え ば 弛 緩 性 筋 肉 麻 痺 ） の 典 型 的 な 継 続時 間 は 約 3ヶ 月 ～ 約 6ヶ 月 で あ り 得 る 。【 ０ ０ ０ ８ 】　 す べ て の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 血 清 型 が 神 経 筋 接 合 部 に お け る 神 経 伝 達 物 質 ア セ チ ル コ リ ン の放 出 を 阻 害 す る よ う で あ る が 、 そ の よ う な 阻 害 は 、 種 々 の 神 経 分 泌 タ ン パ ク 質 に 作 用 し 、か つ ／ ま た は こ れ ら の タ ン パ ク 質 を 異 な る 部 位 で 切 断 す る こ と に よ っ て 行 わ れ る 。 A型 ボツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 細 胞 内 小 胞 関 連 タ ン パ ク 質 SNAP-25の ペ プ チ ド 結 合 を 特 異 的 に 加 水 分 解し う る 亜 鉛 エ ン ド ペ プ チ ダ ー ゼ で あ る 。 E型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 も 、 25キ ロ ダ ル ト ン （ kD） のシ ナ プ ト ソ ー ム 関 連 タ ン パ ク 質 （ SNAP-25） を 切 断 す る が 、 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 と は 異 な るタ ン パ ク 質 内 ア ミ ノ 酸 配 列 を 標 的 と す る 。 B型 、 D型 、 F型 お よ び G型 の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 小

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胞 関 連 タ ン パ ク 質 （ VAMP、 こ れ は ま た シ ナ プ ト ブ レ ビ ン と も 呼 ば れ る ） に 作 用 し 、 そ れ ぞれ の 血 清 型 に よ っ て こ の タ ン パ ク 質 は 異 な る 部 位 で 切 断 さ れ る 。 最 後 に 、 C 1 型 ボ ツ リ ヌ ス毒 素 は 、 シ ン タ キ シ ン お よ び SNAP-25の 両 者 を 切 断 す る こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。 作 用機 序 に お け る こ れ ら の 相 違 が 、 様 々 な ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 血 清 型 の 相 対 的 な 効 力 お よ び ／ ま たは 作 用 の 継 続 時 間 に 影 響 し て い る と 考 え ら れ る 。【 ０ ０ ０ ９ 】　 血 清 型 に 関 係 な く 、 毒 素 中 毒 の 分 子 メ カ ニ ズ ム は 類 似 し 、 少 な く と も 3つ の 過 程 ま た は段 階 を 含 む よ う で あ る 。 第 1段 階 に お い て 、 毒 素 は 、 重 鎖 （ H鎖 ） と 細 胞 表 面 受 容 体 と の 特異 的 相 互 作 用 に よ っ て 、 標 的 ニ ュ ー ロ ン の シ ナ プ ス 前 膜 に 結 合 す る 。 受 容 体 は 、 ボ ツ リ ヌス 毒 素 の 各 血 清 型 お よ び ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 で 異 な る と 考 え ら れ る 。 H鎖 の カ ル ボ キ シ ル 末 端セ グ メ ン ト (H C )は 、 毒 素 を 細 胞 表 面 に 指 向 さ せ る の に 重 要 で あ る よ う で あ る 。【 ０ ０ １ ０ 】　 第 2段 階 に お い て 、 毒 素 は 、 冒 し た 細 胞 の 形 質 膜 を 横 切 る 。 毒 素 は 、 初 め に 、 受 容 体 媒介 エ ン ド サ イ ト ー シ ス に よ り 細 胞 に 包 み 込 ま れ 、 毒 素 を 含 有 す る エ ン ド ソ ー ム が 形 成 さ れる 。 次 に 、 毒 素 は 、 エ ン ド ソ ー ム か ら 該 細 胞 の 細 胞 質 中 に 逃 れ 出 る 。 こ の 最 後 の 段 階 は 、約 5.5ま た は そ れ 以 下 の pHに 反 応 し て 毒 素 の コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン 変 化 を 誘 発 す る H鎖 の ア ミノ 末 端 セ グ メ ン ト (H N )に よ っ て 媒 介 さ れ る と 考 え ら れ る 。 エ ン ド ソ ー ム は 、 エ ン ド ソ ー ム内 pHを 低 下 さ せ る プ ロ ト ン ポ ン プ を 有 す る こ と が 既 知 で あ る 。 コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン の シ フト は 毒 素 中 の 疎 水 性 残 基 を 露 出 さ せ 、 こ れ が 、 毒 素 を エ ン ド ソ ー ム 膜 内 に 埋 込 む こ と を 可能 に す る 。 次 に 、 毒 素 が 、 エ ン ド ソ ー ム 膜 を 通 っ て 細 胞 質 ゾ ル に 移 動 す る 。【 ０ ０ １ １ 】　 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 活 性 の メ カ ニ ズ ム の 最 終 段 階 は 、 H鎖 お よ び L鎖 を 結 合 す る ジ ス ル フ ィ ド結 合 の 減 少 を 伴 う よ う で あ る 。 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 お よ び ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 全 毒 素 活 性 は 、 ホロ ト キ シ ン の L鎖 に 含 ま れ る 。 L鎖 は 亜 鉛 (Zn + + )エ ン ド ペ プ チ ダ ー ゼ で あ り 、 こ れ は 、 神 経伝 達 物 質 を 含 有 す る 小 胞 の 認 識 お よ び 形 質 膜 の 細 胞 質 表 面 と の ド ッ キ ン グ な ら び に 小 胞 と形 質 膜 と の 融 合 に 必 須 で あ る タ ン パ ク 質 を 選 択 的 に 開 裂 す る 。 ボ ツ リ ヌ ス 神 経 毒 、 ボ ツ リヌ ス 毒 素 B、 D、 Fお よ び G型 は 、 シ ナ プ ト ソ ー ム 膜 タ ン パ ク 質 で あ る シ ナ プ ト ブ レ ビ ン [小胞 関 連 膜 タ ン パ ク 質 (VAMP)と も 称 さ れ る ]の 分 解 を 引 き 起 こ す 。 シ ナ プ ス 小 胞 の 細 胞 質 表面 に 存 在 す る 大 部 分 の VAMPは 、 こ れ ら の 開 裂 現 象 の い ず れ か の 結 果 と し て 除 去 さ れ る 。 各毒 素 は 異 な る 結 合 を 特 異 的 に 開 裂 す る 。【 ０ ０ １ ２ 】　 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 タ ン パ ク 質 分 子 の 分 子 量 は 、 既 知 の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 血 清 型 の 7つ の す べて に つ い て 約 150kDで あ る 。 興 味 深 い こ と に 、 こ れ ら の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 会 合 す る 非 毒素 タ ン パ ク 質 と と も に 150kDの ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 タ ン パ ク 質 分 子 を 含 む 複 合 体 と し て ク ロ スト リ ジ ウ ム 属 細 菌 に よ っ て 放 出 さ れ る 。 例 え ば 、 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 複 合 体 は 、 900kD、 500kDお よ び 300kDの 形 態 と し て ク ロ ス ト リ ジ ウ ム 属 細 菌 に よ っ て 産 生 さ れ 得 る 。 B型 お よ び C

1 型 の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 500kDの 複 合 体 と し て の み 産 生 さ れ る よ う で あ る 。 D型 ボ ツ リ ヌ ス毒 素 は 300kDお よ び 500kDの 両 方 の 複 合 体 と し て 産 生 さ れ る 。 最 後 に 、 E型 お よ び F型 の ボ ツリ ヌ ス 毒 素 は 約 300kDの 複 合 体 と し て の み 産 生 さ れ る 。 こ れ ら の 複 合 体 （ す な わ ち 、 約 150kDよ り も 大 き な 分 子 量 ） は 、 非 毒 素 の ヘ マ グ ル チ ニ ン タ ン パ ク 質 と 、 非 毒 素 か つ 非 毒 性 の非 ヘ マ グ ル チ ニ ン タ ン パ ク 質 と を 含 む と 考 え ら れ る 。 こ れ ら の 2つ の 非 毒 素 タ ン パ ク 質 （こ れ ら は 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 分 子 と と も に 、 関 連 す る 神 経 毒 複 合 体 を 構 成 し 得 る ） は 、 変 性に 対 す る 安 定 性 を ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 分 子 に 与 え 、 そ し て 毒 素 が 摂 取 さ れ た と き に 消 化 酸 か らの 保 護 を 与 え る よ う に 作 用 す る と 考 え ら れ る 。 ま た 、 よ り 大 き い （ 分 子 量 が 約 150kDよ りも 大 き い ） ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 複 合 体 は 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 複 合 体 の 筋 肉 内 注 射 部 位 か ら の ボ ツリ ヌ ス 毒 素 の 拡 散 速 度 を 低 下 さ せ 得 る と 考 え ら れ る 。 毒 素 複 合 体 は 、 pH7.3に お い て 赤 血球 で 処 理 す る こ と に よ り 、 毒 素 タ ン パ ク 質 と ヘ マ グ ル チ ニ ン タ ン パ ク 質 に 解 離 し う る 。 毒素 タ ン パ ク 質 は 、 ヘ マ グ ル チ ニ ン タ ン パ ク 質 か ら 解 離 す る と 非 常 に 不 安 定 で あ る 。【 ０ ０ １ ３ 】　 す べ て の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 血 清 型 は 、 神 経 活 性 と な る た め に は プ ロ テ ア ー ゼ に よ っ て 切 断

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ま た は ニ ッ キ ン グ さ れ な け れ ば な ら な い 不 活 性 な 単 鎖 タ ン パ ク 質 と し て 、 ク ロ ス ト リ ジ ウム ・ ボ ツ リ ナ ム 細 菌 に よ り 合 成 さ れ る 。 A型 お よ び G型 の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 血 清 型 を 産 生 す る細 菌 株 は 内 因 性 プ ロ テ ア ー ゼ を 有 す る の で 、 A型 お よ び G型 の 血 清 型 は 細 菌 培 養 物 か ら 主 にそ の 活 性 型 で 回 収 す る こ と が で き る 。 こ れ に 対 し て 、 C 1 型 、 D型 お よ び E型 の ボ ツ リ ヌ ス 毒素 血 清 型 は 非 タ ン パ ク 質 分 解 性 菌 株 に よ っ て 合 成 さ れ る の で 、 培 養 か ら 回 収 さ れ た と き には 、 典 型 的 に は 不 活 性 型 で あ る 。 B型 お よ び F型 の 血 清 型 は タ ン パ ク 質 分 解 性 菌 株 お よ び 非タ ン パ ク 質 分 解 性 菌 株 の 両 方 に よ っ て 産 生 さ れ る の で 、 活 性 型 ま た は 不 活 性 型 の い ず れ でも 回 収 す る こ と が で き る 。 し か し 、 例 え ば 、 B型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 産 生 す る タ ン パ ク 質 分解 性 菌 株 で さ え も 、 産 生 さ れ た 毒 素 の 一 部 を 切 断 す る だ け で あ る 。【 ０ ０ １ ４ 】　 切 断 型 分 子 と 非 切 断 型 分 子 と の 正 確 な 比 率 は 培 養 時 間 の 長 さ お よ び 培 養 温 度 に 依 存 す る。 し た が っ て 、 例 え ば B型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 製 剤 は い ず れ も 一 定 割 合 が 不 活 性 で あ る と 考え ら れ 、 こ の こ と が 、 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 と 比 較 し た B型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 知 ら れ て い る 著し く 低 い 効 力 の 原 因 で あ る と 考 え ら れ る 。 臨 床 製 剤 中 に 存 在 す る 不 活 性 な ボ ツ リ ヌ ス 毒 素分 子 は 、 そ の 製 剤 の 総 タ ン パ ク 質 量 の 一 部 を 占 め る こ と に な る が 、 こ の こ と は そ の 臨 床 的効 力 に 寄 与 せ ず 、 抗 原 性 の 増 大 に 関 連 づ け ら れ て い る 。 ま た 、 B型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 筋肉 内 注 射 さ れ た 場 合 、 同 じ 用 量 レ ベ ル の A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 よ り も 、 活 性 の 継 続 期 間 が 短く 、 そ し て ま た 効 力 が 低 い こ と も 知 ら れ て い る 。【 ０ ０ １ ５ 】　 イ ン ビ ト ロ で の 研 究 に よ り 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 が 、 脳 幹 組 織 の 初 代 細 胞 培 養 物 か ら の ア セチ ル コ リ ン お よ び ノ ル エ ピ ネ フ リ ン の 両 方 の 、 カ リ ウ ム カ チ オ ン に よ り 誘 導 さ れ る 放 出 を阻 害 す る こ と が 示 さ れ て い る 。 ま た 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 脊 髄 ニ ュ ー ロ ン の 初 代 培 養 物 にお け る グ リ シ ン お よ び グ ル タ メ ー ト の 両 方 の 誘 発 さ れ た 放 出 を 阻 害 す る こ と 、 そ し て 脳 のシ ナ プ ト ソ ー ム 調 製 物 に お い て 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 が 神 経 伝 達 物 質 の ア セ チ ル コ リ ン 、 ド ーパ ミ ン 、 ノ ル エ ピ ネ フ リ ン 、 CGRPお よ び グ ル タ メ ー ト の そ れ ぞ れ の 放 出 を 阻 害 す る こ と が報 告 さ れ て い る 。【 ０ ０ １ ６ 】　 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の Hall A株 か ら 、 ≧ 3× 10 7 U／ mg、 A 2 6 0 ／ A 2 7 8 0.60未 満、 お よ び ゲ ル 電 気 泳 動 に お け る 明 確 な バ ン ド パ タ ー ン と い う 特 性 を 示 す 高 品 質 結 晶 A型 ボツ リ ヌ ス 毒 素 を 生 成 し 得 る 。 Schantz, E. J.ら 、 Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine、 Microbiol Rev． 56:80-99（ 1992） に記 載 さ れ て い る よ う に 既 知 の Schanz法 を 用 い て 結 晶 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 得 る こ と が で きる 。 通 例 、 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 複 合 体 を 、 適 当 な 培 地 中 で A型 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナム を 培 養 し た 嫌 気 培 養 物 か ら 分 離 お よ び 精 製 し 得 る 。 硫 酸 で の 沈 殿 に よ っ て 粗 毒 素 を 採 り、 限 外 マ イ ク ロ 濾 過 に よ っ て 濃 縮 す る こ と が で き る 。 酸 沈 殿 物 を 塩 化 カ ル シ ウ ム に 溶 解 する こ と に よ っ て 精 製 を 行 い う る 。 次 い で 、 毒 素 を 冷 エ タ ノ ー ル で 沈 殿 さ せ う る 。 沈 殿 物 をリ ン 酸 ナ ト リ ウ ム に 溶 解 し 、 遠 心 し う る 。 次 い で 、 乾 燥 し て 、 比 効 力 3× 10 7 LD 5 0 U／ mgまた は そ れ 以 上 の 900kD結 晶 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 複 合 体 を 得 る こ と が で き る 。 こ の 既 知 の 方 法を 用 い 、 非 毒 素 タ ン パ ク 質 を 分 離 除 去 し て 、 例 え ば 次 の よ う な 純 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 得 る こと も で き る ： 比 効 力 1～ 2× 10 8 LD 5 0 U／ mgま た は そ れ 以 上 の 分 子 量 約 150kDの 精 製 A型 ボ ツ リヌ ス 毒 素 ； 比 効 力 1～ 2× 10 8 LD 5 0 U／ mgま た は そ れ 以 上 の 分 子 量 約 156kDの 精 製 B型 ボ ツ リ ヌス 毒 素 ； お よ び 比 効 力 1～ 2× 10 7 LD 5 0 U／ mgま た は そ れ 以 上 の 分 子 量 約 155kDの 精 製 F型 ボ ツリ ヌ ス 毒 素 。【 ０ ０ １ ７ 】　 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 （ 150kD分 子 ） お よ び ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 複 合 体 （ 300kD～ 900kD） は 例 え ば、 List Biological Laboratories, Inc.（ キ ャ ン ベ ル 、 カ リ フ ォ ル ニ ア ） ； the Centre for Applied Microbiology and Research（ ポ ー ト ン ・ ダ ウ ン 、 イ ギ リ ス ） ； Wako（ 日 本 、大 阪 ） ； お よ び Sigma Chemicals（ セ ン ト ル イ ス 、 ミ ズ ー リ ） か ら 入 手 し 得 る 。 市 販 の ボツ リ ヌ ス 毒 素 含 有 医 薬 組 成 物 に は 、 次 の も の が 包 含 さ れ る ： BOTOX（ 登 録 商 標 ） （ A型 ボ ツリ ヌ ス 毒 素 神 経 毒 複 合 体 と ヒ ト 血 清 ア ル ブ ミ ン お よ び 塩 化 ナ ト リ ウ ム を 含 む 。 使 用 前 に 0.

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9％ 塩 化 ナ ト リ ウ ム で 再 構 成 す る 凍 結 乾 燥 粉 末 と し て 、 100単 位 バ イ ア ル で 、 カ リ フ ォ ル ニア 、 ア ー ヴ ィ ン の Allergan, Inc.か ら 入 手 可 能 。 ） 、 Dysport（ 登 録 商 標 ） （ A型 ボ ツ リ ヌス 毒 素 ヘ マ グ ル チ ニ ン 複 合 体 と ヒ ト 血 清 ア ル ブ ミ ン お よ び ラ ク ト ー ス を 製 剤 中 に 含 む 。 使用 前 に 0.9％ 塩 化 ナ ト リ ウ ム で 再 構 成 す る 粉 末 と し て 、 イ ギ リ ス 、 バ ー ク シ ャ ー の Ipsen Limitedか ら 入 手 可 能 。 ） 、 お よ び MyoBloc（ 登 録 商 標 ） （ B型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 、 ヒ ト 血 清 アル ブ ミ ン 、 コ ハ ク 酸 ナ ト リ ウ ム お よ び 塩 化 ナ ト リ ウ ム を 含 む pH約 5.6の 注 射 可 能 な 溶 液 。ア イ ル ラ ン ド 、 ダ ブ リ ン の Elan Corporationか ら 入 手 可 能 。 ） 。【 ０ ０ １ ８ 】　 種 々 の 臨 床 症 状 の 治 療 に お け る A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 成 功 は 、 他 の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 血 清型 へ の 関 心 を 高 め て い る 。 す な わ ち 、 少 な く と も A型 、 B型 、 E型 お よ び F型 の ボ ツ リ ヌ ス 毒素 が ヒ ト に 対 し 臨 床 的 に 用 い ら れ て い る 。 更 に 、 純 粋 （ 約 150kDa） ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 が ヒ トの 処 置 に 用 い ら れ て い る 。 例 え ば 、 Kohl A. ら 、 Comparison of the effect of botulinum toxin (Botox(R)) with the highly-purified neurotoxin(NT201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000;15(補 遺 3):165参 照 。 す な わ ち 、 純 粋 （約 150kDa） ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 使 用 し て 医 薬 組 成 物 を 調 製 す る こ と が で き る 。【 ０ ０ １ ９ 】　 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は pH4～ 6.8で 希 水 溶 液 に 可 溶 で あ る こ と が 知 ら れ て い る 。 約 7を 越 える pHで は 、 安 定 化 非 毒 性 タ ン パ ク 質 が 神 経 毒 か ら 解 離 し 、 そ の 結 果 、 特 に pHお よ び 温 度 が上 が る ほ ど 、 毒 性 が 徐 々 に 失 わ れ る 。 Jankovic, J.ら 、 Therapy with Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc (1994)の 第 3章 の Schantz E.J.ら 、 Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment（ 特 に 第 44-45頁 ） 。【 ０ ０ ２ ０ 】　 酵 素 一 般 に つ い て 言 え る よ う に 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 （ 細 胞 内 ペ プ チ ダ ー ゼ ） の 生 物 学 的 活性 は 、 少 な く と も 部 分 的 に は そ の 三 次 元 形 状 に 依 存 す る 。 す な わ ち 、 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素は 、 熱 、 種 々 の 化 学 薬 品 、 表 面 の 伸 長 お よ び 表 面 の 乾 燥 に よ っ て 無 毒 化 さ れ る 。 し か も 、既 知 の 培 養 、 発 酵 お よ び 精 製 に よ っ て 得 ら れ た 毒 素 複 合 体 を 、 医 薬 組 成 物 に 使 用 す る 非 常に 低 い 毒 素 濃 度 ま で 希 釈 す る と 、 適 当 な 安 定 剤 が 存 在 し な け れ ば 毒 素 の 無 毒 化 が 急 速 に 起こ る こ と が 知 ら れ て い る 。 毒 素 を mg量 か ら ng／ ml溶 液 へ 希 釈 す る の は 、 そ の よ う な 大 幅 な希 釈 に よ っ て 毒 素 の 比 毒 性 が 急 速 に 低 下 す る 故 に 、 非 常 に 難 し い 。 毒 素 含 有 医 薬 組 成 物 を製 造 後 、 何 箇 月 も 、 ま た は 何 年 も 経 過 し て か ら 毒 素 を 使 用 す る こ と も あ る の で 、 毒 素 を アル ブ ミ ン お よ び ゼ ラ チ ン の よ う な 安 定 剤 で 安 定 化 す る こ と が で き る 。【 ０ ０ ２ １ 】　 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 が 臨 床 的 に 様 々 に 使 用 さ れ て い る こ と が 報 告 さ れ て お り 、 そ の 例 に は 下記 の も の が 含 ま れ る ：（ 1） 頸 部 ジ ス ト ニ ー を 処 置 す る た め の 筋 肉 内 注 射 （ 多 数 の 筋 肉 ） あ た り 約 75単 位 ～ 125単位 の BOTOX（ 登 録 商 標 ） ；（ 2） 眉 間 の し わ を 処 置 す る た め の 筋 肉 内 注 射 あ た り 約 5単 位 ～ 10単 位 の BOTOX（ 登 録 商 標） （ 5単 位 が 鼻 根 筋 に 筋 肉 内 注 射 さ れ 、 10単 位 が そ れ ぞ れ の 皺 眉 筋 に 筋 肉 内 注 射 さ れ る ）；（ 3） 恥 骨 直 腸 筋 の 括 約 筋 内 注 射 に よ る 便 秘 を 処 置 す る た め の 約 30単 位 ～ 80単 位 の BOTOX（登 録 商 標 ） ；（ 4） 上 瞼 の 外 側 瞼 板 前 部 眼 輪 筋 お よ び 下 瞼 の 外 側 瞼 板 前 部 眼 輪 筋 に 注 射 す る こ と に よ って 眼 瞼 痙 攣 を 処 置 す る た め に 筋 肉 あ た り 約 1単 位 ～ 5単 位 の 筋 肉 内 注 射 さ れ る BOTOX（ 登 録商 標 ） ；【 ０ ０ ２ ２ 】（ 5） 斜 視 を 処 置 す る た め に 、 外 眼 筋 に 、 約 1単 位 ～ 5単 位 の BOTOX（ 登 録 商 標 ） が 筋 肉 内 注射 さ れ て い る 。 こ の 場 合 、 注 射 量 は 、 注 射 さ れ る 筋 肉 の サ イ ズ と 所 望 す る 筋 肉 麻 痺 の 程 度（ す な わ ち 、 所 望 す る ジ オ プ タ ー 矯 正 量 ） と の 両 方 に 基 づ い て 変 化 す る 。（ 6） 卒 中 後 の 上 肢 痙 性 を 処 置 す る た め に 、 下 記 の よ う に 5つ の 異 な る 上 肢 屈 筋 に BOTOX（登 録 商 標 ） が 筋 肉 内 注 射 さ れ る ：

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（ a） 深 指 屈 筋 ： 7.5U～ 30U（ b） 浅 指 屈 筋 ： 7.5U～ 30U（ c） 尺 側 手 根 屈 筋 ： 10U～ 40U（ d） 橈 側 手 根 屈 筋 ： 15U～ 60U（ e） 上 腕 二 頭 筋 ： 50U～ 200U。 5つ の 示 さ れ た 筋 肉 の そ れ ぞ れ に は 同 じ 処 置 時 に 注 射 さ れる の で 、 患 者 に は 、 そ れ ぞ れ の 処 置 毎 に 筋 肉 内 注 射 に よ っ て 90U～ 360Uの 上 肢 屈 筋 BOTOX（登 録 商 標 ） が 投 与 さ れ る 。　 (7)偏 頭 痛 を 治 療 す る た め に 、 25Uの BOTOX(登 録 商 標 )を 頭 蓋 周 囲 に 注 射 す る (眉 間 、 前 頭お よ び 側 頭 筋 に 対 称 的 に 注 射 す る )： 該 注 射 は 、 偏 頭 痛 頻 度 、 最 大 重 症 度 、 付 随 嘔 吐 お よび 急 性 薬 剤 使 用 の 減 少 (25U注 射 後 の 3ヶ 月 間 に わ た る )に よ っ て 評 価 し た 場 合 に 、 ビ ヒ ク ルと 比 較 し て 、 偏 頭 痛 の 予 防 療 法 と し て 有 意 な 利 益 を 与 え る 。【 ０ ０ ２ ３ 】　 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 最 大 12ヶ 月 の 有 効 性 を 有 し (European J.Neurology 6(Supp 4), S111-S1150, 1999)、 あ る 場 合 に は 27ヶ 月 間 に も わ た る 有 効 性 を 有 し う る こ と が 既 知 で ある (Laryngoscope 109, 1344-1346, 1999)。 し か し 、 BOTOX (登 録 商 標 )筋 肉 注 射 の 通 常 の持 続 期 間 は 一 般 に 約 3～ 4ヶ 月 間 で あ る 。【 ０ ０ ２ ４ 】　 市 販 の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 含 有 医 薬 組 成 物 は 、 BOTOX（ 登 録 商 標 ） （ カ リ フ ォ ル ニ ア 、 ア ーヴ ィ ン の Allergan， Inc． か ら 入 手 可 能 ） の 名 称 で 市 販 さ れ て い る 。 BOTOX（ 登 録 商 標 ） は、 精 製 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 複 合 体 、 ヒ ト 血 清 ア ル ブ ミ ン お よ び 塩 化 ナ ト リ ウ ム か ら 成 り 、無 菌 の 減 圧 乾 燥 形 態 で 包 装 さ れ て い る 。 こ の A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 N-Zア ミ ン お よ び 酵 母エ キ ス を 含 有 す る 培 地 中 で 増 殖 さ せ た ボ ツ リ ヌ ス 菌 の Hall株 の 培 養 物 か ら 調 製 す る 。 そ のA型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 複 合 体 を 培 養 液 か ら 一 連 の 酸 沈 殿 に よ っ て 精 製 し て 、 活 性 な 高 分 子 量毒 素 タ ン パ ク 質 お よ び 結 合 ヘ マ グ ル チ ニ ン タ ン パ ク 質 か ら 成 る 結 晶 複 合 体 を 得 る 。 結 晶 複合 体 を 、 塩 お よ び ア ル ブ ミ ン を 含 有 す る 溶 液 に 再 溶 解 し 、 滅 菌 濾 過 （ 0.2μ ） し た 後 、 減圧 乾 燥 す る 。 BOTOX（ 登 録 商 標 ） は 、 筋 肉 内 注 射 前 に 、 防 腐 し て い な い 無 菌 塩 類 液 で 再 構成 し 得 る 。 BOTOX（ 登 録 商 標 ） の 各 バ イ ア ル は 、 A型 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 複 合 体 約 100単 位 （ U）、 ヒ ト 血 清 ア ル ブ ミ ン 0.5mgお よ び 塩 化 ナ ト リ ウ ム 0.9mgを 、 防 腐 剤 不 含 有 の 無 菌 減 圧 乾 燥形 態 で 含 有 す る 。【 ０ ０ ２ ５ 】　 減 圧 乾 燥 BOTOX（ 登 録 商 標 ） を 再 構 成 す る に は 、 防 腐 剤 不 含 有 の 無 菌 生 理 食 塩 水 （ 0.9％Sodium Chloride Injection） を 使 用 し 、 適 量 の そ の 希 釈 剤 を 適 当 な 大 き さ の 注 射 器 で 吸い 上 げ る 。 BOTOX（ 登 録 商 標 ） は 、 泡 立 て ま た は 同 様 の 激 し い 撹 拌 に よ っ て 変 性 し う る ので 、 そ の バ イ ア ル に 希 釈 剤 を 穏 や か に 注 入 す る 。 滅 菌 性 の 理 由 か ら 、 BOTOX（ 登 録 商 標 ）は 、 再 構 成 し た 後 4時 間 以 内 に 投 与 す べ き で あ る 。 そ の 間 、 再 構 成 BOTOX（ 登 録 商 標 ） は 冷蔵 庫 （ 2～ 8℃ ） 内 で 保 管 す る 。 再 構 成 BOTOX（ 登 録 商 標 ） は 、 無 色 透 明 で 、 粒 状 物 を 含 まな い 。 減 圧 乾 燥 生 成 物 は 、 冷 凍 庫 内 で -5℃ ま た は そ れ 以 下 の 温 度 で 保 管 す る 。【 ０ ０ ２ ６ 】　 概 ね 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 4つ の 生 理 学 的 分 類 群 (I、 II、 III、 IV)が 認 識さ れ て い る 。 血 清 学 的 に 特 定 の 毒 素 を 産 生 し 得 る 菌 が 、 複 類 の 生 理 学 的 分 類 群 に 属 し 得 る。 例 え ば 、 Bお よ び F型 の 毒 素 は 、 第 I群 ま た は 第 II群 の 株 が 産 生 し 得 る 。 更 に 、 ボ ツ リ ヌス 神 経 毒 を 産 生 し 得 る 他 の ク ロ ス ト リ ジ ウ ム 属 の 株 [ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ バ ラ ッ テ ィ (C． baratii)、 F型 ； ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ブ チ リ カ ム （ C． butyricum)、 E型 ； ク ロ ス ト リ ジ ウ ム・ ノ ビ イ (C． novyi)、 C 1 ま た は D型 ]が 特 定 さ れ て い る 。【 ０ ０ ２ ７ 】　 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 種 の 生 理 学 的 分 類 群 を 、 表 １ に 示 す 。

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【 表 １ 】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　【 ０ ０ ２ ８ 】　 前 記 毒 素 型 は 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 菌 の 適 当 な 生 理 学 的 分 類 群 か ら の 選 択 によ っ て 調 製 し 得 る 。 第 I群 の 菌 は 通 例 、 タ ン パ ク 質 分 解 性 と さ れ 、 A、 Bお よ び F型 の ボ ツ リヌ ス 毒 素 を 産 生 す る 。 第 II群 の 菌 は 糖 分 解 性 で 、 B、 Eお よ び F型 の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 産 生す る 。 第 III群 の 菌 は 、 Cお よ び D型 の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 し か 産 生 せ ず 、 多 量 の プ ロ ピ オ ン 酸を 産 生 す る 点 で 、 第 I群 お よ び 第 II群 の 菌 と 区 別 さ れ る 。 第 IV群 の 菌 は 、 G型 神 経 毒 し か 産生 し な い 。【 ０ ０ ２ ９ 】　 動 物 性 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま な い 特 定 の 培 地 を 用 い て 破 傷 風 毒 素 を 取 得 す る こ と が 知 られ て い る 。 米 国 特 許 6558926号 参 照 。 し か し と り わ け 、 該 特 許 に 開 示 さ れ た 「 動 物 性 生 成物 不 含 有 」 培 地 で さ え も 、 肉 消 化 物 で あ る Bacto-peptoneを 用 い て い る 。 重 要 な こ と に 、ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ テ タ ニ （ Clostridium tetani） に よ る 破 傷 風 毒 素 の 産 生 と 、 ク ロ ス トリ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 細 菌 に よ る ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 産 生 と は 、 必 要 と す る 成 長 、 培 地 お よび 発 酵 パ ラ メ ー タ お よ び 考 慮 す べ き 事 項 に お い て 異 な る 。 例 え ば Johnson, E.A.ら , Clostridium botulinum and its neurotoxins: a metabolic and cellular perspective, Toxicon 39(2001), 1703-1722参 照 。【 発 明 の 開 示 】【 発 明 が 解 決 し よ う と す る 課 題 】【 ０ ０ ３ ０ 】　 し た が っ て 必 要 と さ れ て い る の は 、 生 物 学 的 に 活 性 な ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 取 得 ま た は 生 産す る た め の 、 動 物 由 来 タ ン パ ク 質 な ど の 動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い ま た は 実 質 的 に 含 ま な い、 培 地 お よ び 方 法 で あ る 。【 課 題 を 解 決 す る た め の 手 段 】【 ０ ０ ３ １ 】

　 本 発 明 は こ の 要 求 を 満 た し 、 生 物 学 的 に 活 性 な ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 取 得 ま た は 生 産 す る ため の 、 動 物 由 来 タ ン パ ク 質 な ど の 動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い ま た は 実 質 的 に 含 ま な い 、 培 地お よ び 方 法 を 提 供 す る 。 取 得 さ れ た ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 活 性 成 分 医 薬 組 成

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概 要

物 を 製 造 す る た め に 使 用 す る こ と が で き る 。【 ０ ０ ３ ２ 】

　 本 明 細 書 で 使 用 す る 場 合 、 下 記 の 単 語 ま た は 用 語 は 下 記 の 定 義 を 持 つ 。　 「 約 」 と は 、 そ の よ う に 修 飾 さ れ た 事 項 、 パ ラ メ ー タ ま た は 用 語 が 、 明 記 し た 事 項 、 パラ メ ー タ ま た は 用 語 の 値 の 上 下 に ± 10%の 範 囲 を 包 含 す る こ と を 意 味 す る 。【 ０ ０ ３ ３ 】　 「 投 与 」 ま た は 「 投 与 す る 」 と は 、 医 薬 組 成 物 を 対 象 に 与 え る （ す な わ ち 投 与 す る ） ステ ッ プ を 意 味 す る 。 本 明 細 書 に 開 示 す る 医 薬 組 成 物 は 、 例 え ば 筋 肉 内 （ i.m.） 、 皮 内 、 皮下 投 与 、 髄 腔 内 投 与 、 頭 蓋 内 、 腹 腔 内 （ i.p.） 投 与 、 局 所 外 用 （ 経 皮 ） お よ び イ ン プ ラ ント （ す な わ ち ポ リ マ ー イ ン プ ラ ン ト ま た は ミ ニ 浸 透 圧 ポ ン プ な ど の 徐 放 装 置 の 植 込 み ） 投与 経 路 な ど に よ っ て 「 局 所 投 与 」 さ れ る 。【 ０ ０ ３ ４ 】　 「 動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い 」 ま た は 「 動 物 性 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま な い 」 は 、 そ れ ぞ れ「 動 物 性 タ ン パ ク 質 を 含 ま な い 」 ま た は 「 動 物 性 タ ン パ ク 質 を 実 質 的 に 含 ま な い 」 を 包 含し 、 血 液 由 来 、 血 液 プ ー ル お よ び 他 の 動 物 由 来 生 成 物 ま た は 化 合 物 の 不 在 ま た は 実 質 的 不在 を 意 味 す る 。 「 動 物 」 と は 哺 乳 動 物 （ ヒ ト な ど ） 、 鳥 、 爬 虫 類 、 魚 、 昆 虫 、 ク モ ま た は他 の 動 物 種 を 意 味 す る 。 細 菌 な ど の 微 生 物 は 「 動 物 」 か ら 除 外 さ れ る 。 し た が っ て 、 本 発明 に 包 含 さ れ る 動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い 培 地 も し く は 方 法 ま た は 動 物 性 生 成 物 を 実 質 的 に含 ま な い 培 地 も し く は 方 法 は 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 ま た は ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 細 菌を 含 む こ と が で き る 。 例 え ば 、 動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い 方 法 ま た は 動 物 性 生 成 物 を 実 質 的に 含 ま な い 方 法 と は 、 動 物 由 来 タ ン パ ク 質 、 例 え ば 免 疫 グ ロ ブ リ ン 、 肉 消 化 物 、 肉 副 生 成物 お よ び 乳 汁 ま た は 乳 生 成 物 も し く は 乳 消 化 物 を 実 質 的 に 含 ま な い 、 ま た は 基 本 的 に 含 まな い 、 ま た は 全 く 含 ま な い 方 法 を 意 味 す る 。 し た が っ て 、 動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い 方 法 の一 例 は 、 肉 お よ び 乳 生 成 物 ま た は 肉 も し く は 乳 副 生 成 物 を 排 除 し た 方 法 （ 例 え ば 細 菌 培 養法 ま た は 細 菌 発 酵 法 ） で あ る 。【 ０ ０ ３ ５ 】　 「 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 」 は 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム に よ っ て 産 生 さ れ る 神 経 毒 、 およ び 非 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム 種 に よ っ て 組 換 え 生 産 さ れ た ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 （ ま た は そ の 軽 鎖 もし く は 重 鎖 ） を 意 味 す る 。 本 明 細 書 で 使 用 す る 「 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 」 と い う 表 現 は 、 ボ ツ リヌ ス 毒 素 血 清 型 A、 B、 C、 D、 E、 Fお よ び Gを 包 含 す る 。 ま た 、 本 明 細 書 で 使 用 す る ボ ツ リヌ ス 毒 素 は 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 複 合 体 （ す な わ ち 300、 600お よ び 900kDa複 合 体 ） も 、 精 製 ボツ リ ヌ ス 毒 素 （ す な わ ち 約 150kDa） も 包 含 す る 。 「 精 製 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 」 は 、 ボ ツ リ ヌ ス毒 素 複 合 体 を 形 成 す る タ ン パ ク 質 な ど の 他 の タ ン パ ク 質 か ら 分 離 さ れ た 、 ま た は そ れ ら 他の タ ン パ ク 質 か ら 実 質 的 に 分 離 さ れ た 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 と 定 義 さ れ る 。 精 製 ボ ツ リ ヌ ス 毒素 は 95％ よ り 高 い 純 度 を 持 ち 得 、 好 ま し く は 99％ よ り 高 い 純 度 を 持 つ 。 神 経 毒 で な い ボ ツリ ヌ ス C 2 お よ び C 3 細 胞 毒 は 、 本 発 明 の 範 囲 か ら は 除 外 さ れ る 。【 ０ ０ ３ ６ 】　 「 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム 神 経 毒 」 は 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ブ チ リ カ ム （ Clostridium butyricum） ま た は ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ベ ラ ッ テ ィ （ Clostridium beratti） な ど の ク ロ ス ト リ ジ ウ ム 細 菌 か ら 産 生 さ れ る 神 経 毒 、 ま た は そ れ ら ク ロ ス トリ ジ ウ ム 細 菌 に 固 有 の 神 経 毒 、 お よ び 非 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム 種 に よ っ て 組 換 え 生 産 さ れ た クロ ス ト リ ジ ウ ム 神 経 毒 を 意 味 す る 。【 ０ ０ ３ ７ 】　 「 全 く 含 ま な い 」 （ ま た は 「 か ら な る 」 と い う 用 語 法 ） と は 、 使 用 す る 機 器 ま た は 方 法の 検 出 範 囲 内 で 、 そ の 物 質 を 検 出 す る こ と が で き な い こ と 、 ま た は そ の 存 在 を 確 認 す る こと が で き な い こ と を 意 味 す る 。　 「 基 本 的 に 含 ま な い 」 （ ま た は 「 か ら 基 本 的 に な る 」 ） と は 、 そ の 物 質 が 痕 跡 量 し か 検出 さ れ 得 な い こ と を 意 味 す る 。【 ０ ０ ３ ８ 】

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定 義

　 「 固 定 」 と は 、 対 象 が 1つ 以 上 の 身 体 部 分 を 動 か す の を 妨 げ る ス テ ッ プ を 意 味 す る 。 十分 な 数 の 身 体 部 分 が 固 定 さ れ れ ば 、 そ の 対 象 は 相 応 に 固 定 さ れ る こ と に な る 。 し た が っ て「 固 定 」 は 、 肢 な ど の 身 体 部 分 の 固 定 お よ び ／ ま た は 対 象 の 完 全 な 固 定 を 包 含 す る 。【 ０ ０ ３ ９ 】　 「 修 飾 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 」 と は 、 天 然 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 と 比 較 し て 、 そ の ア ミ ノ 酸 の 少 な くと も 1つ が 欠 失 、 修 飾 、 ま た は 置 換 さ れ た ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 で あ る 。 さ ら に 修 飾 ボ ツ リ ヌ ス毒 素 は 、 組 換 え 生 産 さ れ た 神 経 毒 、 ま た は 組 換 え 生 産 さ れ た 神 経 毒 の 誘 導 体 も し く は 断 片で あ る こ と も で き る 。 修 飾 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 例 え ば ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 受 容 体 に 結 合 す る 能力 ま た は ニ ュ ー ロ ン か ら の 神 経 伝 達 物 質 放 出 を 阻 害 す る 能 力 な ど と い っ た 天 然 ボ ツ リ ヌ ス毒 素 の 生 物 学 的 活 性 を 、 少 な く と も 1つ は 保 持 し て い る 。 修 飾 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 一 例 は 、あ る ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 血 清 型 （ 例 え ば 血 清 型 A） 由 来 の 軽 鎖 お よ び 異 な る ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 血清 型 （ 例 え ば 血 清 型 B） 由 来 の 重 鎖 を 持 つ ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 で あ る 。 修 飾 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 のも う 1つ の 例 は 、 サ ブ ス タ ン ス Pな ど の 神 経 伝 達 物 質 に 結 合 さ れ た ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 で あ る 。【 ０ ０ ４ ０ 】　 「 患 者 」 と は 、 医 療 ま た は 獣 医 療 を 受 け る ヒ ト ま た は 非 ヒ ト 対 象 を 意 味 す る 。 し た が って 、 本 明 細 書 に 開 示 す る 組 成 物 は 、 哺 乳 動 物 な ど の 任 意 の 動 物 の 処 置 に 使 用 し う る 。【 ０ ０ ４ １ 】　 「 医 薬 組 成 物 」 と は 、 製 剤 を 意 味 し 、 そ の 活 性 成 分 は ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 で あ る こ と が で きる 。 「 製 剤 」 と い う 単 語 は 、 そ の 医 薬 組 成 物 中 に 神 経 毒 活 性 成 分 の 他 に 少 な く と も 1つ の追 加 成 分 が 存 在 す る こ と を 意 味 す る 。 し た が っ て 医 薬 組 成 物 は 、 ヒ ト 患 者 な ど の 対 象 へ の診 断 的 ま た は 治 療 的 投 与 （ 例 え ば 筋 肉 内 注 射 も し く は 皮 下 注 射 に よ る 投 与 ま た は デ ポ ー 剤も し く は イ ン プ ラ ン ト の 挿 入 に よ る 投 与 ） に 適 し た 製 剤 で あ る 。 医 薬 組 成 物 は 、 凍 結 乾 燥状 態 も し く は 真 空 乾 燥 状 態 に あ る か 、 凍 結 乾 燥 も し く は 真 空 乾 燥 し た 医 薬 組 成 物 を 食 塩 水も し く は 水 を 使 用 し て 復 元 し た 後 に 生 成 し た 溶 液 で あ る か 、 ま た は 復 元 を 必 要 と し な い 溶液 と し て 存 在 し う る 。 活 性 成 分 は 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 血 清 型 A、 B、 C 1 、 D、 E、 Fも し く は Gの1つ ま た は ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 （ い ず れ も ク ロ ス ト リ ジ ウ ム 細 菌 に よ っ て 自 然 に 産 生 さ れ う るも の ） で あ り う る 。 上 述 の よ う に 、 医 薬 組 成 物 は 液 体 ま た は 固 体 、 例 え ば 真 空 乾 燥 物 で ある こ と が で き る 。 医 薬 組 成 物 の 構 成 成 分 は 、 単 一 組 成 物 （ す な わ ち 、 医 薬 組 成 物 の 初 期 配合 時 に 、 必 要 な 復 元 液 を 除 く 全 て の 構 成 成 分 が 存 在 す る ） に 含 ま れ る か 、 ま た は 二 構 成 要素 系 と し て 、 例 え ば 食 塩 水 な ど の 希 釈 剤 （ こ の 場 合 の 希 釈 剤 は 医 薬 組 成 物 の 初 期 配 合 時 に存 在 し な い 成 分 を 含 有 す る ） で 復 元 さ れ る 真 空 乾 燥 し た 組 成 物 な ど と し て 含 ま れ う る 。 二構 成 要 素 系 に は 、 長 期 間 貯 蔵 す る の に 二 構 成 要 素 系 の 第 1構 成 要 素 と あ ま り 適 合 し な い 成分 を 組 み 込 む こ と が で き る と い う 利 点 が あ る 。 例 え ば 復 元 用 の ビ ヒ ク ル ま た は 希 釈 剤 は 、使 用 期 間 中 （ 例 え ば 1週 間 の 冷 蔵 貯 蔵 中 ） は 微 生 物 成 長 に 対 す る 十 分 な 防 護 を も た ら す が、 毒 素 を 分 解 す る か も し れ な い の で 2年 間 の 冷 凍 貯 蔵 期 間 中 は 存 在 さ せ な い 保 存 剤 を 含 むこ と が で き る 。 長 期 間 は ク ロ ス ト リ ジ ウ ム 毒 素 ま た は 他 の 成 分 と 適 合 し な い か も し れ な い他 の 成 分 は 、 こ の よ う に し て 組 み 込 む こ と が で き る ； す な わ ち 、 使 用 直 前 に 第 2ビ ヒ ク ル（ 例 え ば 復 元 液 ） に 加 え る こ と が で き る 。 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 活 性 成 分 医 薬 組 成 物 を 調 製 す る方 法 は 、 米 国 特 許 出 願 公 開 第 2003/0118598号 （ A1） に 開 示 さ れ て い る 。【 ０ ０ ４ ２ 】　 「 実 質 的 に 含 ま な い 」 と は 、 当 該 医 薬 組 成 物 の 1wt%未 満 の レ ベ ル で 存 在 す る こ と を 意 味す る 。　 「 治 療 製 剤 」 と は 、 あ る 製 剤 が 、 あ る 障 害 ま た は 疾 患 、 例 え ば 末 梢 筋 の 活 動 亢 進 （ す なわ ち 痙 縮 ） を 特 徴 と す る 障 害 ま た は 疾 患 を 、 処 置 お よ び そ れ に よ り 軽 減 す る た め に 使 用 でき る こ と を 意 味 す る 。【 ０ ０ ４ ３ 】　 本 発 明 は 、 動 物 性 副 生 成 物 ま た は 乳 副 生 成 物 の レ ベ ル が 少 な く と も 低 下 し て い る 培 地 、好 ま し く は 動 物 性 副 生 成 物 ま た は 乳 副 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま な い 培 地 を 提 供 す る 。 「 動 物性 副 生 成 物 ま た は 乳 副 生 成 物 」 と は 、 イ ン ビ ボ で あ る か イ ン ビ ト ロ で あ る か に か か わ ら ず、 動 物 細 胞 （ 細 菌 細 胞 を 除 く ） に お い て 、 ま た は 動 物 細 胞 （ 細 菌 細 胞 を 除 く ） に よ っ て 産

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生 さ れ た 、 任 意 の 化 合 物 ま た は 化 合 物 の 組 合 せ を 意 味 す る 。 タ ン パ ク 質 、 ア ミ ノ 酸 、 お よび 窒 素 な ど の 培 地 成 分 の 好 ま し い 非 動 物 性 供 給 源 と し て 、 植 物 、 微 生 物 （ 酵 母 な ど ） お よび 合 成 化 合 物 が 挙 げ ら れ る 。【 ０ ０ ４ ４ 】　 本 発 明 は 、 動 物 性 副 生 成 物 ま た は 乳 副 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま な い 少 な く と も 1つ の 培 地を 使 っ て ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 取 得 す る 方 法 も 提 供 す る 。 例 え ば 、 動 物 性 生 成 物 を 実 質 的 に 含ま な い 発 酵 培 地 中 で ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を 培 養 す る こ と に よ っ て 、 ボ ツ リ ヌ ス毒 素 を 取 得 す る こ と が で き る 。【 ０ ０ ４ ５ 】　 本 発 明 は 、 動 物 性 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま ず 植 物 由 来 生 成 物 を 含 む 発 酵 培 地 で ク ロ ス ト リジ ウ ム ・ ボ ツ リ ヌ ナ ム を 培 養 す る こ と に よ っ て 取 得 さ れ る ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 も 包 含 す る 。 また 、 動 物 性 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま ず い く つ か の 大 豆 系 生 成 物 を 含 む 発 酵 培 地 中 で ク ロ ス トリ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を 培 養 す る こ と に よ っ て 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 取 得 す る こ と も で き る。【 ０ ０ ４ ６ 】　 も う 1つ の 好 ま し い 実 施 形 態 と し て 、 動 物 性 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま ず 、 動 物 由 来 生 成 物の 代 替 物 と し て 加 水 分 解 大 豆 を 含 有 す る 発 酵 培 地 中 で ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を 培養 す る こ と に よ っ て 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 取 得 す る こ と が で き る 。 好 ま し く は 、 発 酵 培 地 にお け る 成 長 は 、 少 な く と も 細 胞 溶 解 が 起 こ る ま で 進 行 す る 。 発 酵 培 地 の 接 種 に 用 い る ク ロス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 源 は 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を 含 有 す る 種 培 地 か ら 得る こ と が で き る 。 種 培 地 中 で 成 長 さ せ て 発 酵 培 地 用 接 種 物 と し て 用 い る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム・ ボ ツ リ ナ ム は 、 好 ま し く は 、 細 胞 溶 解 を 起 こ し て い な い 。 種 培 地 の 接 種 に 用 い る ク ロ スト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 源 は 、 凍 結 乾 燥 培 養 物 か ら 得 る こ と が で き る 。 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム・ ボ ツ リ ナ ム は 、 畜 乳 ま た は 豆 乳 中 の 培 養 物 と し て 凍 結 乾 燥 す る こ と が で き る 。 ク ロ ス トリ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム は 、 好 ま し く は 、 豆 乳 中 の 培 養 物 と し て 凍 結 乾 燥 さ れ る 。【 ０ ０ ４ ７ 】　 本 発 明 は ま た 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を 培 養 す る た め 、 動 物 由 来 生 成 物 を 実 質的 に 含 ま な い 培 地 を 含 む 組 成 物 を 提 供 す る 。【 ０ ０ ４ ８ 】　 一 実 施 形 態 に お い て 、 本 組 成 物 は 、 動 物 由 来 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま ず 、 か つ 少 な く と も1つ の 非 動 物 源 由 来 の 生 成 物 を 含 有 し 、 さ ら に ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を 含 む 培 地を 含 む 。【 ０ ０ ４ ９ 】　 も う 1つ の 実 施 形 態 に お い て 、 本 組 成 物 は 、 動 物 由 来 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま ず 、 か つ 少な く と も 1つ の 植 物 由 来 の 生 成 物 を 含 有 し 、 さ ら に ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を 含 む培 地 を 含 む 。 本 発 明 の も う 1つ の 実 施 形 態 は 、 動 物 由 来 生 成 物 を 実 施 的 に 含 ま ず 、 か つ 少な く と も 1つ の 大 豆 由 来 の 生 成 物 を 含 有 し 、 さ ら に ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を 含 む培 地 を 含 む 組 成 物 で あ り う る 。【 ０ ０ ５ ０ 】

　 本 発 明 は 、 生 物 学 的 に 活 性 な ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 産 生 す る 能 力 を 持 つ 生 物 （ 例 え ば ク ロ スト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 細 菌 ） の 培 養 お よ び 発 酵 に 役 立 つ 、 動 物 性 生 成 物 ま た は 動 物 性 副生 成 物 を 含 ま な い ま た は 実 質 的 に 含 ま な い 培 地 お よ び 方 法 の 発 見 に 基 づ い て い る 。 取 得 され る ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 活 性 成 分 医 薬 組 成 物 の 製 造 に 使 用 す る こ と が で きる 。 し た が っ て 本 明 細 書 に は 肉 副 生 成 物 ま た は 乳 副 生 成 物 の レ ベ ル が 著 し く 低 下 し て い る培 地 を 開 示 し 、 好 ま し い 培 地 実 施 形 態 は そ の よ う な 動 物 性 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま な い 。【 ０ ０ ５ １ 】　 本 発 明 は 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 成 長 用 培 地 に 動 物 系 生 成 物 が 必 要 で な い と いう 本 発 明 者 の 驚 く べ き 発 見 、 特 に 、 そ の よ う な ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 成 長 用 培 地に 通 例 使 用 さ れ る 動 物 系 生 成 物 を 植 物 系 生 成 物 に 代 替 す る こ と が で き る と い う 本 発 明 者 の

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説 明

驚 く べ き 発 見 を 包 含 す る 。【 ０ ０ ５ ２ 】　 細 菌 の 成 長 お よ び 発 酵 に 現 在 使 用 さ れ て い る 培 地 は 、 通 常 、 1つ 以 上 の 動 物 由 来 成 分 を含 む 。 本 発 明 に よ れ ば 、 好 ま し い ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 成 長 用 培 地 は 、 培 地 の 総重 量 の 約 5か ら 約 10%を 越 え な い 量 の 動 物 由 来 成 分 を 含 有 す る 。 よ り 好 ま し く は 、 本 発 明 の範 囲 に 包 含 さ れ る 培 地 は 、 培 地 の 総 重 量 の 約 1%以 下 な い し 約 5%未 満 の 動 物 由 来 生 成 物 を 含む 。 最 も 好 ま し く は 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 生 産 す る た め の ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の成 長 に 使 用 さ れ る 全 て の 培 地 お よ び 培 養 物 は 、 動 物 由 来 生 成 物 を 全 く 含 ま な い 。 こ れ ら の培 地 に は 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 小 規 模 お よ び 大 規 模 発 酵 用 の 培 地 、 種 （ 第 1） 培 地 お よ び 発 酵 （ 第 2） 培 地 の 接 種 に 用 い ら れ る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 培 養 物の 成 長 用 培 地 、 な ら び に ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 培 養 物 （ 例 え ば 保 存 培 養 物 ） の 長期 保 存 に 用 い ら れ る 培 地 が 含 ま れ る が 、 こ れ ら に 限 定 さ れ る わ け で は な い 。【 ０ ０ ５ ３ 】　 本 発 明 の あ る 好 ま し い 実 施 形 態 に お い て 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 成 長 用 お よ びボ ツ リ ヌ ス 毒 素 生 産 用 の 培 地 は 、 動 物 由 来 生 成 物 の 代 わ り に 大 豆 系 生 成 物 を 含 む こ と が でき る 。 あ る い は 、 大 豆 系 生 成 物 の 代 わ り に 、 ル ピ ナ ス ・ カ ン ペ ス ト リ ス （ Lupinus campestris） の 脱 苦 味 種 子 を 使 用 す る こ と が で き る 。 L.カ ン ペ ス ト リ ス 種 子 の タ ン パ ク 質 分 は 大豆 の も の と よ く 似 て い る こ と が 知 ら れ て い る 。 好 ま し く は 、 こ れ ら の 培 地 は 、 加 水 分 解 され る お よ び 水 に 可 溶 で あ る 大 豆 由 来 生 成 物 ま た は L.カ ン ペ ス ト リ ス 由 来 生 成 物 を 含 む 。 しか し 本 発 明 で は 、 不 溶 性 の 大 豆 生 成 物 ま た は L.カ ン ペ ス ト リ ス 生 成 物 も 、 動 物 性 生 成 物 を代 替 す る た め に 使 用 す る こ と が で き る 。 大 豆 生 成 物 ま た は L.カ ン ペ ス ト リ ス 生 成 物 で 代 替す る こ と が で き る 一 般 的 な 動 物 由 来 生 成 物 と し て 、 牛 心 臓 浸 出 液 （ BHI） 、 動 物 由 来 ペ プト ン 生 成 物 、 例 え ば Bacto-peptone、 加 水 分 解 カ ゼ イ ン 、 お よ び 畜 乳 な ど の 乳 副 生 成 物 が挙 げ ら れ る 。【 ０ ０ ５ ４ 】　 好 ま し く は 、 大 豆 系 生 成 物 ま た は L.カ ン ペ ス ト リ ス 系 生 成 物 を 含 有 す る ク ロ ス ト リ ジ ウム ・ ボ ツ リ ナ ム 成 長 用 培 地 は 、 実 質 上 全 て の 動 物 由 来 生 成 物 が 植 物 由 来 生 成 物 で 代 替 さ れる 点 以 外 は 、 動 物 由 来 生 成 物 を 含 有 す る 一 般 に 使 用 さ れ る 成 長 培 地 に 似 て い る 。 例 え ば 大豆 系 発 酵 培 地 は 、 大 豆 系 生 成 物 、 グ ル コ ー ス な ど の 炭 素 源 、 NaClお よ び KClな ど の 塩 、 Na 2HPO 4 、 KH 2 PO 4 な ど の ホ ス フ ェ ー ト 含 有 成 分 、 鉄 お よ び マ グ ネ シ ウ ム な ど の 二 価 カ チ オ ン 、鉄 粉 、 な ら び に L-シ ス テ イ ン お よ び L-チ ロ シ ン な ど の ア ミ ノ 酸 を 含 む こ と が で き る 。 発 酵（ 第 2） 培 地 に 接 種 す る た め の ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 培 養 物 を 成 長 さ せ る た め に用 い ら れ る 培 地 （ す な わ ち 種 培 地 ま た は 第 1培 地 ） は 、 好 ま し く は 、 少 な く と も 、 大 豆 系生 成 物 、 NaClな ど の 塩 源 、 お よ び グ ル コ ー ス な ど の 炭 素 源 を 含 有 す る 。【 ０ ０ ５ ５ 】　 本 発 明 は 、 動 物 由 来 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま な い 培 地 を 使 っ て ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 生 産 量 を最 大 化 す る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 成 長 方 法 を 提 供 す る 。 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボツ リ ナ ム お よ び ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 生 産 の た め の 成 長 は 、 動 物 性 副 生 成 物 に 由 来 す る 成 分 を代 替 す る 大 豆 副 生 成 物 を 含 有 す る 培 地 で の 発 酵 に よ っ て 行 な う こ と が で き る 。 発 酵 培 地 用の 接 種 物 は 、 そ れ よ り 小 規 模 の 成 長 培 地 （ 種 培 地 ） か ら 得 る こ と が で き る 。 培 養 物 の バ イオ マ ス を 増 加 さ せ る た め に 行 な わ れ る 種 培 地 に お け る 継 代 数 は 、 発 酵 工 程 の 大 き さ お よ び体 積 に 応 じ て 変 動 し う る 。 発 酵 培 地 の 接 種 に 適 し た 量 の ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を成 長 さ せ る た め に 、 種 培 地 に お け る 成 長 を 伴 う 一 工 程 ま た は 複 数 工 程 を 行 な う こ と が で きる 。 動 物 由 来 生 成 物 を 含 ま な い ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 成 長 法 に と っ て 、 ク ロ ス トリ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 成 長 は 、 非 動 物 由 来 培 地 に 保 存 さ れ た 培 養 物 か ら 起 こ る こ と が 好ま し い 。 保 存 培 養 物 （ 好 ま し く は 凍 結 乾 燥 物 ） は 、 大 豆 由 来 の タ ン パ ク 質 を 含 有 し 動 物 性副 生 成 物 を 欠 く 培 地 に お け る 成 長 に よ っ て 製 造 さ れ る 。 発 酵 培 地 に お け る ク ロ ス ト リ ジ ウム ・ ボ ツ リ ナ ム の 成 長 は 、 保 存 さ れ た 凍 結 乾 燥 培 養 物 か ら の 直 接 的 な 接 種 に よ っ て 行 な うこ と が で き る 。【 ０ ０ ５ ６ 】

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　 本 発 明 の 好 ま し い 実 施 形 態 で は 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 成 長 が 、 種 成 長 お よび 発 酵 と い う 二 相 で 進 行 す る 。 こ れ ら の 相 は ど ち ら も 嫌 気 環 境 下 で 行 な わ れ る 。 種 成 長 相は 一 般 に 、 微 生 物 の 量 を 保 存 培 養 物 か ら 「 ス ケ ー ル ア ッ プ 」 す る た め に 用 い ら れ る 。 種 成長 相 の 目 的 は 、 発 酵 に 利 用 で き る 微 生 物 の 量 を 増 加 さ せ る こ と で あ る 。 ま た 、 種 成 長 相 によ り 、 保 存 培 養 物 中 の 比 較 的 不 活 発 な 微 生 物 を 、 若 返 ら せ て 活 発 に 成 長 す る 培 養 物 へ と 成長 さ せ る こ と も で き る 。 さ ら に 、 活 発 に 成 長 す る 培 養 物 か ら は 、 保 存 培 養 物 か ら の 場 合 より も 、 発 酵 培 養 物 の 接 種 に 用 い る 生 存 可 能 な 微 生 物 の 体 積 お よ び 量 を 正 確 に 制 御 す る こ とも で き る 。 し た が っ て 、 発 酵 培 地 に 接 種 す る た め の 種 培 養 物 を 成 長 さ せ る こ と が 好 ま し い。 ま た 、 発 酵 培 地 に 接 種 す る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 量 を ス ケ ー ル ア ッ プ す る ため に 、 種 培 地 に お け る 成 長 を 伴 う 連 続 工 程 を 何 回 で も 使 用 す る こ と が で き る 。 発 酵 相 に おけ る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 成 長 は 、 直 接 接 種 に よ っ て 保 存 培 養 物 か ら 直 接 進 行し う る こ と に 注 意 さ れ た い 。【 ０ ０ ５ ７ 】　 発 酵 相 で は 、 種 成 長 に よ っ て 得 ら れ た ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を 含 有 す る 種 培 地の 一 部 ま た は そ の よ う な 種 培 地 の 全 部 を 、 発 酵 培 地 の 接 種 に 使 用 す る 。 好 ま し く は 、 約 2か ら 4％ の 、 種 成 長 相 で 得 ら れ た ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を 有 す る 種 培 地 を 、 発 酵培 地 の 接 種 に 使 用 す る 。 発 酵 は 、 大 規 模 嫌 気 環 境 下 で 最 大 量 の 微 生 物 を 生 産 す る た め に 用い ら れ る （ Ljungdahlら 「 Manual of industrial microbiology and biotechnology」 （ 1986） , Demain ら 編 , American Society for Microbiology, ワ シ ン ト ン D.C., 84頁 ） 。【 ０ ０ ５ ８ 】　 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 は 、 タ ン パ ク 質 精 製 技 術 分 野 の 当 業 者 に 周 知 の タ ン パ ク 質 精 製 方 法 を 使っ て 分 離 し 精 製 す る こ と が で き る （ Coligan ら 「 Current Protocols in Protein Science」 Wiley & Sons、 Ozutsumi ら , Appl. Environ. Microbiol. 49 ; 939-943: 1985） 。【 ０ ０ ５ ９ 】　 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 生 産 す る た め に 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 培 養 物 を 、 発 酵 培地 に 接 種 す る た め の 種 培 地 中 で 成 長 さ せ る こ と が で き る 。 種 培 地 に お け る 成 長 を 伴 う 継 代工 程 数 は 、 発 酵 相 に お け る ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 生 産 規 模 に 応 じ て 変 動 し う る 。 た だ し 、 上 述の よ う に 、 発 酵 相 で の 成 長 は 、 保 存 培 養 物 か ら の 接 種 に よ り 、 直 接 進 行 す る こ と も で き る。 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 成 長 用 の 動 物 系 種 培 地 は 一 般 に BHI、 bacto-peptone、 NaCl、 お よ び グ ル コ ー ス か ら 構 成 さ れ る 。 上 述 の よ う に 、 本 発 明 に 従 っ て 、 動 物 系 成 分 を 非動 物 系 成 分 で 置 き 換 え た 代 替 種 培 地 を 調 製 す る こ と も で き る 。 例 え ば 、 限 定 す る わ け で はな い が 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 成 長 用 お よ び ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 生 産 用 の 種 培 地 に はBHIお よ び bacto-peptoneの 代 わ り に 大 豆 系 生 成 物 を 使 用 す る こ と が で き る 。 好 ま し く は 、大 豆 系 生 成 物 は 水 溶 性 で あ り 、 加 水 分 解 大 豆 を 含 む が 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の培 養 物 は 、 不 溶 性 大 豆 を 含 有 す る 培 地 中 で も 成 長 し う る 。 た だ し 、 成 長 レ ベ ル お よ び そ れに 続 く 毒 素 の 生 産 レ ベ ル は 、 可 溶 性 大 豆 生 成 物 を 用 い た 培 地 の 方 が 高 い 。【 ０ ０ ６ ０ 】　 本 発 明 で は 任 意 の 大 豆 系 生 成 物 源 を 使 用 す る こ と が で き る 。 好 ま し く は 大 豆 は 加 水 分 解大 豆 で あ る 。 加 水 分 解 大 豆 源 は 様 々 な 供 給 業 者 か ら 入 手 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 Hy-Soy（ Quest International） 、 Soy peptone（ Gibco） 、 Bac-Soytone（ Difco） 、 AMISOY（ Quest） 、 NZ soy（ Quest） 、 NZ soy BL4、 NZ soy BL7、 SE50M（ DMV International Nutritionals、 ニ ュ ー ヨ ー ク 州 フ レ ー ザ ー ） 、 お よ び SE50MK（ DMV） な ど が あ る が 、 こ れ ら に 限定 さ れ る わ け で は な い 。 最 も 好 ま し く は 、 加 水 分 解 大 豆 源 は Hy-Soyま た は SE50MKで あ る 。他 の 使 用 可 能 性 の あ る 加 水 分 解 大 豆 源 も 知 ら れ て い る 。【 ０ ０ ６ １ 】　 本 発 明 の 種 培 地 に お け る Hy-Soyの 濃 度 は 25か ら 200g/Lの 範 囲 で あ る 。 好 ま し く は 、 種 培地 中 の Hy-Soy濃 度 は 50か ら 150g/Lの 範 囲 で あ る 。 最 も 好 ま し く は 、 種 培 地 中 の Hy-Soy濃 度は 約 100g/Lで あ る 。 ま た 、 NaClの 濃 度 は 0.1か ら 2.0g/Lの 範 囲 で あ る 。 好 ま し く は 、 NaCl濃 度 は 0.2か ら 1.0g/Lの 範 囲 で あ る 。 最 も 好 ま し く は 種 培 地 中 の NaCl濃 度 は 約 0.5g/Lで ある 。 グ ル コ ー ス の 濃 度 は 0.1g/Lか ら 5.0g/Lの 範 囲 で あ る 。 好 ま し く は 、 グ ル コ ー ス 濃 度 は

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0.5か ら 2.0g/Lの 範 囲 で あ る 。 最 も 好 ま し く は 、 種 培 地 中 の グ ル コ ー ス 濃 度 は 約 1.0g/Lであ る 。 種 培 地 の 他 の 成 分 と 一 緒 に オ ー ト ク レ ー ブ 処 理 す る こ と に よ っ て グ ル コ ー ス を 滅 菌す る こ と も 好 ま し い が 、 そ れ は 本 発 明 に と っ て 必 須 で は な い 。 成 長 前 の 種 培 地 の 好 ま し いpHレ ベ ル は 7.5か ら 8.5の 範 囲 で あ る 。 最 も 好 ま し く は 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム が成 長 す る 前 の 種 培 地 の pHは 約 8.1で あ る 。【 ０ ０ ６ ２ 】　 種 培 地 に お け る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 成 長 は 1つ 以 上 の 段 階 で 進 行 し う る 。好 ま し く は 、 種 培 地 に お け る 成 長 は 二 段 階 で 進 行 す る 。 第 1段 階 で は 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム・ ボ ツ リ ナ ム の 培 養 物 を あ る 量 の 種 培 地 に 懸 濁 し 、 嫌 気 環 境 下 に 34± 1℃ で 24か ら 48時 間イ ン キ ュ ベ ー ト す る 。 好 ま し く は 、 第 1段 階 で の 成 長 は 約 48時 間 行 な う 。 第 2段 階 で は 、 クロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム を 含 有 す る 第 1段 階 培 地 の 一 部 ま た は 全 部 を 、 さ ら な る 成 長の た め に 第 2段 階 種 培 地 の 接 種 に 使 用 す る 。 接 種 後 、 第 2段 階 培 地 を 嫌 気 環 境 下 に 34± 1℃で 約 1か ら 4日 間 イ ン キ ュ ベ ー ト す る 。 好 ま し く は 、 第 2段 階 種 培 地 で の 成 長 は 約 3日 間 行 なう 。 ま た 、 ど の 段 階 で も 、 種 培 地 に お け る 成 長 は 、 種 培 地 で の 最 終 成 長 物 を 発 酵 培 地 に 接種 す る 前 に 細 胞 溶 解 を 起 こ さ な い こ と が 好 ま し い 。【 ０ ０ ６ ３ 】　 動 物 性 副 生 成 物 を 含 有 す る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 成 長 用 の 標 準 的 発 酵 培 地 は 、Muellerお よ び Millerの 配 合 （ MM； J. Bactgeriol. 67:271, 1954） に 基 づ く こ と が で き る。 動 物 性 副 生 成 物 を 含 有 す る MM培 地 中 の 成 分 と し て 、 BHIお よ び NZ-CaseTTが 挙 げ ら れ る 。NZ-CaseTTは 、 カ ゼ イ ン （ 畜 乳 中 に 見 い だ さ れ る 一 群 の タ ン パ ク 質 ） の 酵 素 消 化 物 に 由 来す る 市 販 の ペ プ チ ド お よ び ア ミ ノ 酸 源 で あ る 。 本 発 明 は 、 発 酵 培 地 中 の BHIお よ び NZ-CaseTTの 代 わ り に 非 動 物 系 生 成 物 を 使 用 す る こ と が で き る こ と を 実 証 す る 。 例 え ば 、 限 定 す るわ け で は な い が 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 発 酵 に 用 い ら れ る MM培 地 の 動 物 系 成 分を 、 大 豆 系 生 成 物 で 代 替 す る こ と が で き る 。 好 ま し く は 、 大 豆 系 生 成 物 は 水 溶 性 で あ り 、加 水 分 解 大 豆 に 由 来 す る が 、 上 述 の よ う に 、 不 溶 性 大 豆 生 成 物 を 使 っ て 本 発 明 を 実 施 す るこ と も で き る 。【 ０ ０ ６ ４ 】　 本 発 明 で は 任 意 の 大 豆 系 生 成 物 源 を 使 用 す る こ と が で き る 。 好 ま し く は 、 加 水 分 解 大 豆を Quest International（ シ ェ フ ィ ー ル ド ） か ら Hy-Soyと い う 商 標 で 入 手 す る か 、 DMV International Nutritionals（ ニ ュ ー ヨ ー ク 州 フ レ ー ザ ー ） か ら SE50MKと い う 商 標 で 入 手 する 。 可 溶 性 大 豆 生 成 物 は 、 例 え ば Soy peptone（ Gibco） 、 Bac-Soytone（ Difco） 、 AMISOY（ Quest） 、 NZ soy（ Quest） 、 NZ soy BL4、 NZ soy BL7、 お よ び SE50MK（ DMV International Nutritionals、 ニ ュ ー ヨ ー ク 州 フ レ ー ザ ー ） な ど と い っ た （ た だ し こ れ ら に 限 定 さ れる わ け で は な い ） 様 々 な 供 給 源 か ら 入 手 す る こ と も で き る 。【 ０ ０ ６ ５ 】　 本 発 明 の も う 1つ の 好 ま し い 実 施 形 態 で は 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 発 酵 に 用い ら れ る 培 地 が 、 動 物 性 副 生 成 物 を 含 ま ず 、 加 水 分 解 大 豆 、 グ ル コ ー ス 、 NaCl、 Na 2 HPO 4、 MgSO 4 7H 2 O、 KH 2 PO 4 、 L-シ ス テ イ ン 、 L-チ ロ シ ン 、 お よ び 鉄 粉 を 含 む 。 種 培 地 に 関 し て開 示 し た よ う に 、 発 酵 培 地 中 の 動 物 性 副 生 成 物 は 加 水 分 解 大 豆 で 代 替 す る こ と が で き る 。こ れ ら の 動 物 性 副 生 成 物 と し て 、 BHIお よ び NZ-CaseTT（ 酵 素 消 化 カ ゼ イ ン ） が 挙 げ ら れ る。【 ０ ０ ６ ６ 】　 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 を 生 産 す る た め の 発 酵 培 地 に お け る Hy-Soyの 濃 度 は 、 好 ま し く は 約 10から 100g/Lの 範 囲 で あ る 。 好 ま し く は 、 Hy-Soy濃 度 は 約 20か ら 60g/Lの 範 囲 で あ る 。 最 も 好ま し く は 、 発 酵 培 地 中 の Hy-Soy濃 度 は 約 35g/Lで あ る 。 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 生 産 量 を 最 大 にす る に は 、 発 酵 培 地 中 の 成 分 の 特 に 好 ま し い 濃 度 は 、 約 7.5g/L グ ル コ ー ス 、 5.0g/L NaCl、 0.5g/L Na 2 HPO 4 、 175mg/L KH 2 PO 4 、 50mg/L MgSO 4 7H 2 O、 125mg/L L-シ ス テ イ ン 、 お よ び125mg/L L-チ ロ シ ン で あ る 。 鉄 粉 の 使 用 量 は 50mg/Lか ら 2000mg/Lの 範 囲 で あ る こ と が で きる 。 好 ま し く は 、 鉄 粉 の 量 は 約 100mg/Lか ら 1000mg/Lの 範 囲 で あ る 。 最 も 好 ま し く は 、 発酵 培 地 中 に 用 い る 鉄 粉 の 量 は 約 200mg/Lか ら 600mg/Lの 範 囲 で あ る 。

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【 ０ ０ ６ ７ 】　 毒 素 生 産 レ ベ ル を 最 適 に す る た め に 、 大 豆 系 発 酵 培 地 の 初 期 pH（ オ ー ト ク レ ー ブ 処 理 ）は 好 ま し く は 約 5.5か ら 7.1の 範 囲 で あ る 。 好 ま し く は 、 発 酵 培 地 の 初 期 pHは 約 6.0か ら 6.2で あ る 。 種 培 地 に 関 し て 述 べ た よ う に 、 グ ル コ ー ス お よ び 鉄 を 包 含 す る 発 酵 培 地 の 成 分 は、 好 ま し く は 、 滅 菌 の た め に 一 緒 に オ ー ト ク レ ー ブ 処 理 さ れ る 。【 ０ ０ ６ ８ 】　 好 ま し く は 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 成 長 に 使 用 し た 第 2段 階 種 培 地 の 一 部 を、 発 酵 培 地 の 接 種 に 使 用 す る 。 発 酵 は 嫌 気 チ ャ ン バ ー 中 、 約 34± 1℃ で 約 7か ら 9日 間 行 なわ れ る 。 成 長 は 培 地 の 光 学 密 度 （ O.D.） を 測 定 す る こ と に よ っ て 監 視 さ れ る 。 発 酵 は 、 好ま し く は 、 成 長 測 定 （ 光 学 密 度 ） に よ る 決 定 で 、 細 胞 溶 解 が 少 な く と も 48時 間 進 行 し た 後に 、 停 止 す る 。 細 胞 が 溶 解 す る に つ れ て 、 培 地 の O.D.は 低 下 す る だ ろ う 。【 ０ ０ ６ ９ 】　 本 発 明 の 好 ま し い 実 施 形 態 で は 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 長 期 保 存 お よ び 種 培地 の 接 種 に 用 い ら れ る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 培 養 物 を 、 豆 乳 中 で 成 長 さ せ て 、凍 結 乾 燥 し た 後 、 4℃ で 保 存 す る 。 保 存 用 に 凍 結 乾 燥 さ れ た 畜 乳 中 の ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ボ ツ リ ナ ム 培 養 物 も 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 生 産 に 使 用 す る こ と が で き る 。 し か し 、 ボ ツ リ ヌス 毒 素 生 産 の 全 工 程 に わ た っ て 、 動 物 性 副 生 成 物 を 実 質 的 に 含 ま な い 培 地 を 維 持 す る た めに 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 初 期 培 養 物 は 、 畜 乳 で は な く 豆 乳 中 に 保 存 さ れ る こと が 好 ま し い 。【 ０ ０ ７ ０ 】

　 以 下 の 実 施 例 は 、 本 発 明 に 包 含 さ れ る 特 定 の 方 法 を 説 明 す る も の で あ り 、 本 発 明 の 範 囲を 限 定 し よ う と す る も の で は な い 。 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 培 養 物 は 、 List Laboratories（ カ リ フ ォ ル ニ ア 州 キ ャ ン ベ ル ） を 含 む い く つ か の 供 給 源 か ら 入 手 す る こ と が でき る 。 全 て の 実 験 お よ び 培 地 は 再 蒸 留 水 を 使 っ て 調 製 す る こ と が で き る 。 以 下 の 全 て の 実施 例 に お い て 「 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 」 と は 、 A型 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナム の Hall A（ ATCC 登 録 番 号 3502） 株 を 意 味 す る 。【 実 施 例 １ 】【 ０ ０ ７ １ 】

　 対 照 種 培 地 は 培 地 各 1リ ッ ト ル に つ き 以 下 の 成 分 を 使 っ て 調 製 す る こ と が で き る ： NaCl（ 5g） 、 Bacto-peptone（ 10g） 、 グ ル コ ー ス （ 10g） 、 BHI（ 1リ ッ ト ル に な る 量 ） 、 pH8.1（ 5N NaOHで 調 整 ） 。【 ０ ０ ７ ２ 】　 試 験 （ 動 物 性 生 成 物 不 含 有 ） 種 培 地 は 培 地 各 1リ ッ ト ル に つ き 以 下 の 成 分 を 使 っ て 調 製す る こ と が で き る ： NaCl（ 5g） 、 Soy-peptone（ 10g） 、 グ ル コ ー ス （ 10g） 、 Hy-Soy（ 35g/リ ッ ト ル 、 培 地 液 を 1リ ッ ト ル に す る 量 ） 、 pH8.1（ 5N NaOHで 調 整 ） 。【 実 施 例 ２ 】【 ０ ０ ７ ３ 】

　 実 施 例 1の 対 照 種 培 地 お よ び 試 験 種 培 地 各 1mlに ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 凍 結 乾燥 培 養 物 を 懸 濁 し 、 （ 各 種 培 地 を ） そ れ ぞ れ が そ れ ぞ れ の 種 培 地 10mlを 含 有 す る 2本 の 試験 管 に 分 割 し た 後 、 34℃ で 約 24か ら 48時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト す る こ と が で き る 。 次 に 、 培 養物 1mlを 、 40mlの （ 各 ） 種 培 地 を 含 有 す る 125ml DeLong Bellco培 養 フ ラ ス コ の 接 種 に 使 用す る こ と が で き る 。 接 種 さ れ た 培 養 物 を 、 Coy嫌 気 チ ャ ン バ ー （ Coy Laboratory Products Inc.、 ミ シ ガ ン 州 グ ラ ス レ イ ク ） 中 、 33℃ ± 1℃ で 24時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト す る こ と が で きる 。【 実 施 例 ３ 】【 ０ ０ ７ ４ 】

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実 施 例

動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 用 種 培 地 の 調 製

動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い 種 培 地 に お け る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 培 養

動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 用 発 酵 培 地 の 調 製

　 基 礎 発 酵 培 地 は 培 地 各 2リ ッ ト ル に つ き 以 下 の 成 分 を 使 っ て 調 製 す る こ と が で き る ： グル コ ー ス （ 15g） 、 NaCl（ 10g） 、 NaH 2 PO 4 （ 1g） 、 KH 2 PO 4 （ 0.350g） 、 MgSO 4 7H 2 O（ 0.1g）、 シ ス テ イ ン -HC（ 0.250g） 、 チ ロ シ ン -HCl（ 0.250g） 、 鉄 粉 （ 1g） 、 ZnCl 2 （ 0.250g） 、お よ び MnCl 2 （ 0.4g） 。【 ０ ０ ７ ５ 】　 対 照 発 酵 培 地 は 、 調 製 さ れ る 培 地 各 2リ ッ ト ル に つ き 以 下 の 成 分 を 使 っ て 調 製 す る こ とが で き る ： BHI（ 500ml； こ れ は 牛 心 臓 浸 出 液 乾 燥 重 量 約 45.5gに 相 当 す る ） 、 NZ-CaseTT（30g） 、 お よ び 基 礎 培 地 （ 2リ ッ ト ル に な る 量 ） 、 pH6.8。【 ０ ０ ７ ６ 】　 基 礎 発 酵 培 地 を ま ず 調 製 し 、 そ れ を pH6.8に 調 整 す る こ と が で き る 。 次 に 、 牛 心 臓 浸 出液 （ BHI） BHIを 調 製 し 、 5N NaOHで そ の pHを 8に 調 整 す る こ と が で き る 。 次 に 、 BHIを 基 礎培 地 に 加 え る こ と が で き る 。 次 に NZ-CaseTTを 調 製 す る こ と が で き る 。 次 に 、 牛 心 臓 浸 出液 が 既 に 加 え ら れ て い る 基 礎 培 地 に 、 NZ-CaseTTを 加 え 、 HClの 添 加 に よ っ て 溶 解 さ せ る 。次 に 5N NaOHで pHを 6.8に 調 整 す る こ と が で き る 。 次 に 、 こ の 培 地 を 16本 の 100mm試 験 管 に 8mlず つ 分 注 し た 後 、 120℃ で 25分 間 オ ー ト ク レ ー ブ 処 理 す る こ と が で き る 。【 ０ ０ ７ ７ 】　 試 験 発 酵 培 地 （ 動 物 性 生 成 物 不 含 有 ） は 、 対 照 発 酵 培 地 中 に 存 在 す る BHIの 代 わ り に 試験 窒 素 源 を 使 用 す る こ と に よ っ て 調 製 す る こ と が で き る 。 好 適 な 試 験 発 酵 培 地 窒 素 源 に は、 Hy-Soy（ Quest） 、 AMI-Soy（ Quest） 、 NZ-Soy（ Quest） 、 NZ-Soy BL4（ Quest） 、 NZ-Soy BL7（ Quest） 、 Sheftone D（ Sheffield） 、 SE50M（ DMV） 、 SE50（ DMV） 、 SE%)MK（ DMV） 、 Soy Peptone（ Gibco） 、 Bacto-Soyton（ Difco） 、 Nutrisoy 2207（ ADM） 、 Bakes Nutrisoy（ ADM） 、 Nutrisoy flour、 Soybean meal、 Bacto-Yeast Extract（ Difco） 、 Yeast Extract（ Gibco） 、 Hy-Yest 412（ Quest） 、 Hy-Yest 441（ Quest） 、 Hy-Yest 444（ Quest） 、 Hy-Yest 455（ Quest） 、 Bacto-Malt Extract（ Difco） 、 Corn Steep、 お よ び Proflo（ Traders） な ど が あ る 。【 ０ ０ ７ ８ 】　 試 験 発 酵 培 地 は 、 BHIを 除 外 す る 点 以 外 は 、 対 照 発 酵 培 地 に つ い て 上 述 し た よ う に 調 製す る こ と が で き 、 適 切 な 窒 素 源 を ま ず 3N HClま た は 5N NaOHで pH6.8に 調 整 す る こ と が で きる 。 培 地 は 16本 の 100mm試 験 管 に 8mlず つ 配 分 し た 後 、 120℃ で 20か ら 30分 間 オ ー ト ク レ ーブ 処 理 す る こ と が で き る 。【 実 施 例 ４ 】【 ０ ０ ７ ９ 】

　 試 験 種 培 地 培 養 物 （ 動 物 性 生 成 物 不 含 有 ） を 40μ lず つ 使 っ て 、 8ml 16本 の 100mm試 験 管中 の 対 照 ま た は 試 験 発 酵 培 地 各 8mlに 接 種 す る こ と が で き る 。 次 に 、 培 養 物 を 33± 1℃ で 24時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト す る こ と が で き る 。 次 に 、 細 菌 を 成 長 さ せ る た め に 、 試 験 管 を 嫌 気 チャ ン バ ー 中 で イ ン キ ュ ベ ー ト す る こ と が で き る 。 各 培 地 ア ッ セ イ は 三 重 に 行 な う こ と が でき （ す な わ ち 同 じ 培 地 に 独 立 し て 3回 の 接 種 を 行 な う こ と が で き る ） 。 非 接 種 対 照 を （ 分光 光 度 計 用 の ブ ラ ン ク と し て 使 用 す る こ と が で き る ） を 含 め る こ と も で き る 。 成 長 （ 光 学密 度 OD に よ っ て 測 定 さ れ る ） は 、 Turner分 光 光 度 計 （ 330型 ） を 使 っ て 660nmで 24時 間 ごと に 測 定 す る こ と が で き る 。 細 胞 溶 解 が 約 48時 間 続 い た 後 に 培 養 は 停 止 す べ き で あ り 、 その 後 、 ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 生 産 量 を 測 定 す る こ と が で き る 。【 ０ ０ ８ ０ 】　 培 地 各 500mlに つ き 以 下 の 成 分 を 含 有 す る Hy-Soy発 酵 培 地 を 使 っ て 、 追 加 実 験 を 行 な うこ と が で き る ： Hy-Soy（ 17.5g） 、 グ ル コ ー ス （ 3.75g） 、 NaCl（ 2.5g） 、 Na 2 HPO 4 （ 0.25g） 、 MgSO 4 7H 2 O（ 0.025g） 、 KH 2 PO 4 （ 0.0875g） 、 L-シ ス テ イ ン （ 0.0625g） 、 L-チ ロ シ ン（ 0.0625g） 、 鉄 粉 （ 0.25g） 、 pH6.8。【 実 施 例 ５ 】【 ０ ０ ８ １ 】

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動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い 発 酵 培 地 に お け る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 成 長

動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い 発 酵 培 地 に お け る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 成 長 に よ る ボ ツ

　 実 施 例 4の 培 養 細 胞 を 遠 心 分 離 し た 後 、 上 清 の pHを 測 定 す る こ と が で き る 。 与 え ら れ た試 料 中 の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の レ ベ ル は 、 標 準 抗 毒 素 を 添 加 し 、 フ ロ キ ュ レ ー シ ョ ン ま で の 経過 時 間 を 測 定 す る こ と に よ っ て 、 測 定 す る こ と が で き る 。 Kf（ フ ロ キ ュ レ ー シ ョ ン が 起 こる の に 要 す る 時 間 、 単 位 ： 分 ） お よ び Lf（ フ ロ キ ュ レ ー シ ョ ン 限 界 、 フ ロ キ ュ レ ー シ ョ ンに よ っ て 確 立 さ れ る 1国 際 単 位 の 標 準 抗 毒 素 に 相 当 ） を ど ち ら も 測 定 す る こ と が で き る 。与 え ら れ た 培 養 物 に つ い て 発 酵 ブ ロ ス 4mlを 各 発 酵 管 か ら 採 取 し 、 合 計 12mlを 15ml遠 心 管中 で 混 合 す る こ と が で き る よ う に 、 そ れ ら を 合 わ せ る こ と が で き る 。 遠 心 管 を 4℃ 、 5000rpm（ 3400g） で 30分 間 遠 心 分 離 す る こ と が で き る 。 上 清 を 1mlず つ 、 0.1か ら 0.6mlの 標 準 ボツ リ ヌ ス 毒 素 抗 血 清 を 含 有 す る 試 験 管 に 加 え 、 内 容 物 を 混 合 す る た め に 試 験 管 を 注 意 深 く振 と う す る こ と が で き る 。 次 に 試 験 管 を 45± 1℃ の 水 槽 に 入 れ 、 開 始 時 刻 を 記 録 す る こ とが で き る 。 試 験 管 を 頻 繁 に 調 べ て 、 フ ロ キ ュ レ ー シ ョ ン が 始 ま っ た 時 間 を Kfと し て 記 録 する こ と が で き る 。 フ ロ キ ュ レ ー シ ョ ン を 1番 目 に 開 始 す る こ と が で き る 試 験 管 内 の 毒 素 濃度 を LfFFと 指 名 す る こ と が で き る 。 2番 目 に フ ロ キ ュ レ ー シ ョ ン を 開 始 す る こ と が で き る試 験 管 中 の 毒 素 濃 度 を LfFと 指 定 す る こ と が で き る 。【 ０ ０ ８ ２ 】　 並 行 発 酵 、 成 長 お よ び 毒 素 生 産 量 ア ッ セ イ は 、 （ a） 対 照 種 培 地 （ 対 照 発 酵 培 地 の 接 種に 使 用 ） お よ び 対 照 発 酵 培 地 な ら び に （ 2） （ 動 物 性 生 成 物 不 含 有 ） 試 験 種 培 地 （ 試 験 発酵 培 地 の 接 種 に 使 用 ） お よ び （ 動 物 性 生 成 物 不 含 有 ） 試 験 発 酵 培 地 の 両 方 に つ い て 行 な うこ と が で き る 。 重 要 な こ と に 、 動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い 培 養 物 か ら 接 種 さ れ た 動 物 性 生 成物 を 含 ま な い 培 地 に お け る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 発 酵 （ 大 豆 系 生 成 物 で 動 物 性生 成 物 を 代 替 し た も の ） は 、 約 50以 上 の Lf t o x i n を も た ら す こ と が で き る と 決 定 す る こ とが で き る 。 最 小 と し て 、 Lf t o x i n は 約 10で あ る 。 好 ま し く は Lf t o x i n は 20以 上 で あ る 。 最 も好 ま し く は Lf t o x i n は 50よ り 大 き い 。【 ０ ０ ８ ３ 】　 ま た 、 様 々 な 大 豆 生 成 物 が BHIを 欠 く 発 酵 培 地 に お け る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ムの 成 長 を 支 え る こ と を 決 定 す る こ と が で き る 。 す な わ ち 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ムの 成 長 に 、 BHIを 可 溶 性 大 豆 調 製 物 で 代 替 す る こ と が で き る 。 最 適 濃 度 は 12.5ま た は 25g/Lで あ る 。 Hy-Soy（ Scheffield） は 最 高 の 成 長 を も た ら す こ と が で き る 。 不 溶 性 大 豆 調 製 物は そ れ よ り 有 効 性 が 低 い 場 合 が あ る 。【 ０ ０ ８ ４ 】　 さ ら に 、 Quest Hy-Soy、 DMV SE50MK、 お よ び Quest NZ-Soyが 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツリ ナ ム の 成 長 に 関 し て BHIに 代 替 し う る 点 で 、 有 効 な 大 豆 生 成 物 で あ り う る こ と を 示 す 結果 を 得 る こ と も で き る 。 こ れ ら の 結 果 は 、 成 長 に 最 適 で あ り う る 大 豆 生 成 物 （ 例 え ば Quest Hy-Soy、 DMV SE50MK、 お よ び Quest NZ-Soy） は 、 毒 素 生 産 に 関 し て BHIに 代 替 す る の にも 有 効 で あ る こ と が で き る こ と を 明 ら か に す る 。 毒 素 生 産 に と っ て 最 適 な 大 豆 生 成 物 は 22.75g/lの Quest Hy-Soyで あ る 。 こ の 生 成 物 を さ ら に 高 濃 度 で 使 用 し た 場 合 、 成 長 は よ く なっ て も 毒 素 生 産 量 は 改 善 さ れ な い と い う こ と が あ り う る 。 同 様 の 結 果 は SE50MKで も 得 る こと が で き る と 考 え ら れ 、 そ の 濃 度 を 上 げ る と 成 長 は 増 加 し て も 毒 素 生 産 量 は 増 加 し な い とい う こ と が あ り う る 。 こ れ に 対 し て NZ-Soyは 、 濃 度 を 上 げ る と 成 長 お よ び 毒 素 生 産 量 が 向上 し う る 。【 ０ ０ ８ ５ 】　 最 後 に 、 大 豆 生 成 物 が BHIお よ び NZ-CaseTTに 効 果 的 に 代 替 で き る こ と を 決 定 す る こ と がで き る 。 大 豆 系 培 地 か ら NZ-CaseTTを 除 去 す る と 、 成 長 が 約 2分 の 1か ら 4分 の 1に 抑 制 さ れう る 。 NZ-CaseTTの 存 在 下 で も 不 在 下 で も 成 長 に と っ て 最 適 な 大 豆 生 成 物 は SE50MKで あ りう る 。 毒 素 生 産 に 関 し て 、 HY-Soyは BHIお よ び NZ-caseTTの ど ち ら に も 代 替 す る こ と が で きる 。 た だ し 1日 ま た は 2日 と い う 長 い 発 酵 周 期 が 必 要 に な り う る 。 HY-Soyは 毒 素 生 産 用 培 地中 の BHIお よ び NZ-CaseTTを ど ち ら に も 代 替 し う る 。 し か し 酵 母 抽 出 物 は 毒 素 生 産 に と っ て阻 害 的 で あ り う る こ と を 決 定 す る こ と が で き る 。【 ０ ０ ８ ６ 】

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リ ヌ ス 毒 素 生 産 量 の 決 定

　 毒 素 生 産 に 関 し て 、 HY-Soyは 22.75g/lで BHIお よ び HY-CaseTTの ど ち ら に も 完 全 に 代 替 しう る こ と を 決 定 す る こ と が で き る 。 成 長 に 対 す る 作 用 （ こ の 場 合 は 56.88g/lの HY-Soyが 最適 で あ り う る ） と は 異 な り 、 毒 素 生 産 相 に は 34.13g/lの HY-Soyが 最 適 で あ る こ と が で き る。【 ０ ０ ８ ７ 】　 こ の よ う に 本 発 明 者 は 、 驚 く べ き こ と に 、 Hy-Soyま た は ［ Hy-Soy＋ Hy-Yest］ が ク ロ スト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム 種 成 長 用 培 地 中 の BHIお よ び Bacto-peptoneに 代 替 で き る か ど う かを 決 定 し た 。 ま た 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム に よ る ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 生 産 レ ベ ル を 最大 に す る べ く 、 種 培 地 の 成 分 の 最 適 濃 度 を 決 定 す る た め の 実 験 を 計 画 す る こ と が で き る 。BHIお よ び NZ-CaseTTを 含 ま な い 種 培 地 お よ び 発 酵 培 地 で 成 長 さ せ た ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボツ リ ナ ム に よ る 毒 素 生 産 量 は 、 BHIお よ び NZ-CaseTTを 含 有 す る 培 地 で 達 成 さ れ る レ ベ ル に達 す る か 、 そ れ を 越 え る こ と が で き る 。【 ０ ０ ８ ８ 】　 種 培 地 中 の 成 長 の た め の Hy-Soyま た は ［ Hy-Soy＋ Hy-Yest］ の 最 適 濃 度 を 決 定 す る こ とが で き る 。 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 成 長 お よ び そ の 後 の 発 酵 相 に お け る ボ ツ リ ヌス 毒 素 の 生 産 に 関 し て 、 種 培 地 中 の 窒 素 源 と し て 、 Hy-Soyが BHIお よ び Bacto-peptoneに 代替 で き る こ と は 、 実 験 で 確 認 す る こ と が で き る 。 ま た 、 種 培 地 中 の 窒 素 源 と し て の Hy-Soyは 、 Hy-Soy＋ Hy-Yestと 比 較 し て 、 後 の 発 酵 工 程 で 高 レ ベ ル の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 生 産 を も たら す こ と が で き る 。 最 適 な 毒 素 レ ベ ル を も た ら す 種 培 地 中 の Hy-Soyの 濃 度 は 、 約 62.5g/Lか ら 100g/Lの 範 囲 で あ る 。【 ０ ０ ８ ９ 】　 追 加 実 験 が 、 発 酵 に よ る ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 生 産 量 を 最 大に す る た め の 種 培 地 中 の 最 適 Hy-Soy濃 度 を 決 定 す る た め に 計 画 さ れ る 。 例 え ば 、 種 培 地 中の Hy-Soy 30g、 50g、 75gお よ び 100gは 、 い ず れ も 、 ク ロ ス ト リ ジ ウ ム ・ ボ ツ リ ナ ム の 発 酵に よ る ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の 生 産 を も た ら す こ と が で き 、 そ れ は BHIお よ び Bacto-peptoneを 窒素 源 と し て 含 有 す る 種 培 地 で 作 ら れ る ボ ツ リ ヌ ス 毒 素 の レ ベ ル と 同 等 ま た は そ れ 以 上 で ある 。【 ０ ０ ９ ０ 】　 種 培 地 中 の 濃 度 100g/Lの Hy-Soyは 、 後 の 発 酵 工 程 に お い て 、 最 も 高 い 毒 素 生 産 レ ベ ル をも た ら し た こ と が わ か る 。 ま た 、 Hy-Soy種 培 地 の 種 工 程 1は 、 24時 間 後 よ り も 48時 間 後 の方 が 大 き い 成 長 を も た ら し た こ と を 、 デ ー タ は 示 し て い る 。【 ０ ０ ９ １ 】　 本 明 細 書 で は 様 々 な 刊 行 物 、 特 許 お よ び ／ ま た は 参 考 文 献 に 言 及 し た が 、 そ の 内 容 は 参照 に よ り そ の ま ま 本 明 細 書 に 組 み 入 れ ら れ る 。　 本 発 明 を 特 定 の 好 ま し い 方 法 に 関 し て 詳 細 に 説 明 し た が 、 本 発 明 の 範 囲 内 で 他 の 実 施 形態 、 変 形 、 お よ び 変 更 形 態 も 可 能 で あ る 。 例 え ば 、 動 物 性 生 成 物 を 含 ま な い 多 種 多 様 な 方法 が 本 発 明 の 範 囲 に 包 含 さ れ る 。　 し た が っ て 特 許 請 求 の 範 囲 の 要 旨 お よ び 範 囲 は 、 上 述 し た 好 ま し い 実 施 形 態 の 説 明 に 限定 さ れ る べ き で は な い 。

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【 国 際 調 査 報 告 】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

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(51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード（参考） Ａ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１Ｐ 1/10 (2006.01) 1/10 (2006.01) 1/10 (2006.01) 1/10 (2006.01) 1/10 (2006.01) 1/10 (2006.01) 1/10 (2006.01) 1/10 (2006.01) Ａ６１Ｐ 1/10 　　　　 　　　　　 Ａ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１Ｐ 25/08 (2006.01) 25/08 (2006.01) 25/08 (2006.01) 25/08 (2006.01) 25/08 (2006.01) 25/08 (2006.01) 25/08 (2006.01) 25/08 (2006.01) Ａ６１Ｐ 25/08 　　　　 　　　　　 Ａ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１ＰＡ６１Ｐ 27/02 (2006.01) 27/02 (2006.01) 27/02 (2006.01) 27/02 (2006.01) 27/02 (2006.01) 27/02 (2006.01) 27/02 (2006.01) 27/02 (2006.01) Ａ６１Ｐ 27/02 　　　　 　　　　　

(81)指定国　　　　 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IT,LU,MC,NL,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NA,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,YU,ZA,ZM,ZW

(72)発明者 スティーブン・ドノバン アメリカ合衆国９２６２４カリフォルニア州カピストラーノ・ビーチ、カリェ・アネホ２７２５２ 番Ｆターム(参考) 4B050 CC01 DD02 EE02 LL01 　　　　 　　 4C084 AA06 BA44 CA04 DA33 NA07 ZA022 ZA232 ZA332 ZA722 ZA942　　　　 　　 4H045 AA20 AA30 BA72 CA11 DA83 DA89 EA20 FA73

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