トマト果実の成熟機構に関する分子生物学的研究―マクロアレイとVIGS

法を用いた解析

バイオサイエンス専攻

51422408 閻 瑞 2013年 9月

目 次

第1章 緒 論 ┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉1

第2章 マクロアレイ解析による成熟関連遺伝子

の機能解析

材料および方法 ┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉ 7

結果および考察 ┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉ 16

まとめ ┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉ 30

第3章 ジーンサイレンシング(VIGS)と形質転換

による成熟関連転写因子の機能解析

材料および方法 ┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉ 54

結果および考察 ┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉ 57

まとめ ┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉ 60

第 4章 摘要 ┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉ 71

謝辞 ┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉ 73

参考文献 ┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉ 74

試薬一覧 ┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉┉ 91

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第一章 緒 論

果実の成熟に伴う変化は、実用的な観点から見ると、商品の鮮度および品質

にとってはネガティブな側面もある。世界的な食糧問題解決への一つ方向性と

して、生鮮野菜を低コストで鮮度を保って輸送できれば、大切な栄養素を減ら

すことなくそれぞれの地域に供給する可能性を開くことになり、栄養事情の改

善に役立つ。したがって、鮮度保持のための技術開発は様々な面において必要

性が高く、大変重要な研究課題である。ここまでの二、三十年間には、成熟に

関わる分子機構、特に細胞壁メタボリズム、またはエチレン生合成および応答

性について、様々な研究の進展が見られた(Giovannoni, 2001)。 我々の研究に密接に関わるエチレンは、植物において気体で働く唯一のホル

モンであり、植物の生長や分化、環境対応に重要な役割を持っている。クライ

マクテリック型果実ではエチレン生成が、果実の成熟の開始直前に始まり、果

実の成熟を制御しているが、他の生理現象、例えば葉や花の老化、落葉や落果、

根毛の発生などにも関与している。すなわち、エチレンは果実の成熟に関連し

た遺伝子や病原菌の感染応答に関与した遺伝子などを含む様々な遺伝子の発現

も制御している。成熟に伴い生成されるエチレンは、クロロフィル分解関連遺

伝子、カロテノイド合成酵素などの色素合成に関わる遺伝子、果肉軟化を引き

起こす細胞壁分解関連遺伝子などの発現を誘導・活性化させる(Trebitsh et al., 1993; Hiwasa et al., 2003; Marty et al., 2005)。その結果、クロロフィルの分解やカロテノイド等色素の合成、果肉硬度の低下、香気成分の増加などが起こり、

果実の成熟が促進される(Alexander and Grierson. 2002)。 果実は、成熟に伴う呼吸量の変化を指標として、成熟の前に特徴的な呼吸の

上昇が見られるクライマクテリック型と呼吸やエチレン生成が上昇しないノン

クライマクテリック型に区別され、トマト、リンゴ、モモ、セイヨウナシ等は

前者に、カンキツ、ブトウ、オウトウ、イチゴ等は後者に分類される。クライ

マクテリック型果実は、エチレン生成量増加に伴い呼吸量も増大し、このエチ

レンによって成熟が加速される(Lelievre et al., 1997)。エチレンはクライマクテリック型果実の中で、以下の手法を用い、エチレンが成熟の調節または完了に

必要であることを証明された。エチレン生合成およびエチレン感受の阻害剤を

用いたクライマクテリック型果実での分析(Yang, 1985; Tucker et al., 1987)、エチレン生合成をブロックされた形質転換植物での分析(Klee et al., 1991; Oeller et al., 1991; Picton et al., 1993)、またはエチレンレセプターに関わるトマト変異体Never-ripe (Nr)での研究(Tucker et al., 1984; Lanahan et al., 1994; Wilkinson et al., 1995; Yen et al., 1995)では、いずれでも果実成熟が顕著に抑制され、果実成熟にはエチレンの作用が必須であることが確認された。

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ノンクライマクテリック型果実は成熟にエチレンを必要としないと考えられ

てきたが、成熟に伴うエチレン生成量は樹種や品種によって大きく異なる。例

えば、カンキツでは、フラベドにおけるエチレン誘導するmRNAまたは色素の蓄積の報告があった(Alonso et al., 1995)。近年の研究により、ノンクライマクテリック型果実の成熟にもエチレンが関与する可能性が報告されている

(El-Kereamy et al., 2003; Chervin et al., 2004; Tesniere et al., 2004; Trainotti et al., 2005; Pietro et al., 2006)。これらの果実でもエチレンが成熟過程で生成され、それにより成熟が促進される可能性も示唆されている。 クライマクテリック型果実は、一定の発育段階に達っすると、未熟な段階で

収穫しても、一定の期間が経過すれば、人工的にエチレン処理をしなくても、

自らエチレンを生成し成熟する。このような収穫後の成熟現象は、樹上での成

熟(maturation)と区別して追熟(ripening)と呼ばれている。クライマクテリック型果実では成熟に伴い呼吸活性が一時的に急増する。この急増により生成する

エネルギーは、細胞壁による軟化、着色、芳香成分の生成、デンプンの糖への

分解、有機酸の減少などの多様な成分の変化からなる果実の成熟現象の進行に

使われていると考えられている。 農産物の追熟は商品の鮮度および品質に大きな影響を及ぼす。追熟による変

化は果実の品種によって違いがあるが、一般に細胞壁の超微細構造および組成

が変化し、デンプンから糖への転換が促進され、病原菌に感受性が高まり、病

気に感染しやすい状態になる。また、色素の生合成の変化および蓄積、または

風味に関わる物質と揮発性の芳香族化合物の増加などの大きな変化が起こる

(Rhodes, 1980; Seymour et al., 1993)。 果実発育研究の長い歴史の中で、クライマクテリック型ナス科に属するトマ

トは世界的に重要な作物であり、最も研究に扱いやすい、産業上も主な果実研

究におけるモデル植物となってきた。その生理学的な根拠は、トマトが二倍体

で、種子が容易に採れること、純系繁殖または効率的な交配をでき、ライフサ

イクルが短いこと（～45‐100日、品種および季節によって異なる）、一年生植物であるため、温室で育成可能であることなどである。また、遺伝学的および

分子生物学的な研究の観点から見ると、トマトが相対的に小さいゲノムを持つ

こと(0.9pg/一倍体のゲノム)(Arumuganathan et al., 1991)、1000個以上の分子マーカーが確認され、マーカー間の物理的距離が平均 2cM以下であることも背景にある(Tanksley et al., 1992)。また、トマトの成熟に関わる変異体が数多く知られており、その基礎的な研究が行われてきた点も、モデル作物として撰ば

れた大きな理由である。 2002年 NSF(National Science Foundation, 全米科学財団)が支援し、異なる組 織 で 単 離 さ れ た 26 個 ト マ ト の cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を 基 に

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(http://ted.bti.cornell.edu/)重複しない、27274 の共通配列(unigenes)の情報を集め、cDNAライブラリーごとに 2000～10000個クローン(5′末端シングルの部分、または花の組織 3′末端の 5898 個も含む )をシーケンシングし、EST(Expressed Sequence Tag)データベースを構築した。これによって、様々なステージでシーケンスの検索、またはホモロジーの検索をできるようになっ

た(Quackenbush et al., 2000; Van der Hoeven et al., 2002)。また、同データベースではクライマクテリック型果実およびノンクライマクテリック型果実の両

者の遺伝子発現の多量の研究データを蓄積し(http://ted.bti.cornell.edu/)、効率的かつ連続的に遺伝子発現分析を進めることができるようになった。例えば、

ノンクライマクテリック型果実とクライマクテリック型果実の最近の成熟関連

遺伝子の比較によって新たな成熟関連転写因子が同定されている。すなわち、

成熟関連転写因子と想定された 20 個近くの因子の中、三つの転写因子MADS-boxファミリー、b-ZIPと zinc-fingerファミリーのメンバーはシーケンス比較において、クライマクテリック型果実（トマト）とノンクライマクテリ

ック型果実（ブドウ）両方において高いホモロジーを示し、両果実グループに

共通する新規の成熟関連転写因子であることが示された。 トマトの成熟不全を示す自然変異体 rinおよび norトマトでは、クライマクテリック的な急激な呼吸活性の促進が起らず、エチレン生合成も起らない。また

にエチレン処理を行っても成熟を進まない。しかし、これらの成熟不全変異体

でも、エチレン処理によって少なくとも一部のエチレン関連遺伝子発現が誘導

されたことが報告されている(Tigchelaar et al., 1978; Yen et al., 1995)。また、rinおよびnorトマトでも傷害に対する反応としてエチレンに合成が誘導されることが報告されている(Lincoln and Fischer 1988)。これらの結果は、クライマクテリック型果実ではエチレン生合成およびシグナル伝達以外にも成熟制御機

構が存在していることを示唆している。 ポジショナルクローニングにより、rinおよび norトマトの成熟不全の原因となる遺伝子が単離された。トマト rin変異体ではMADS-box転写因子に属するLeMADS-RIN の最後のエキソンが欠失していることがわかった(Vrebalov et al., 2002; Giovannoni, 2004)。nor変異体トマトは明確的な報告がないが、nor遺伝子座内部に一つの転写因子の構造の特徴を持つ、非MADS-boxファミリーである転写因子が存在しているとされている (Vrebalov and Giovannoni, unpublished)。 種々の変異体トマトにおいて幅広く研究が行われ、成熟制御に関与する重要

な遺伝子を同定され、果実成熟生理研究に多大な貢献をしている(Vrebalov et al., 2002; Manning et al., 2006; for review, see Giovannoni, 2007; Matas et al., 2009; Wang et al., 2009; Chung et al., 2010; Nashilevitz et al., 2010; Karlova

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et al., 2011)。さらに、近年ではトマトにおいてはトランスクリプトーム解析(Alba et al., 2005; Lemaire-Chamley et al., 2005; Carrari et al., 2006; Vriezen et al., 2008; Wang et al., 2009); プロテオーム解析(Saravanan and Rose, 2004; Faurobert et al., 2007; Page et al., 2010); およびメタボローム解析(Roessner-Tunali et al., 2003; Carrari and Fernie, 2006; Fraser et al., 2007; Moco et al., 2007)などの網羅的な解析が行われ、多量のデータが蓄積しつつある。 トマト遺伝子組換え技術によりACC合成酵素やACC酸化酵素の発現を抑制することによってエチレン生成量が低下した形質転換体(Hamilton et al., 1990; Oeller et al., 1991; Picton et al., 1993)や、エチレン結合能力が欠損したエチレン受容体遺伝子を大量発現させることによりエチレン感受性を低下させた形質

転換体(Wilkinson et al., 1997)が作出されている。これらの形質転換体では果実の成熟が野生型と比べ大幅に遅延することが報告されている。 エチレン以外の植物ホルモンについては、果実成熟制御生理においては必ず

しも十分に研究が進んでいると言えないが、オーキシンやジベレレンなどもク

ライマクテリック型果実の成熟に影響する可能性が示されている(Martineau et al., 1994; Cohen, 1996)。 シロイヌナズナはモデル植物として、分子的な調節のレベルにおいて果実の

形態や発育研究のモデルとして利用されてきた(Pinyopich et al., 2003; Roeder et al., 2003)。さらに、エチレンおよび光シグナル伝達経路に関連する研究では、主にシロイヌナズナ変異体を用いて得られた研究によって重要な遺伝子が発見

され(Wang and Deng, 2003; Guo et al., 2004)、果実におけるエチレン信号伝達系因子または成熟制御因子の研究に極めて大きな貢献がなされている(Chang and Shockey 1999; Bleecker and Kende, 2000; Wang et al., 2002; Guo et al., 2004)。特にトマトなどでは、日持ち性のよい品種の開発、育種にとって重要な因子の発見につながっている。 シロイヌナズナのエチレン非感受性変異体の解析から、5つのエチレン受容体

ETR1, ETR2, ERS1, ERS2, EIN4が同定されている(Bleecker, 1999; Chang and Stadler 2001) 。 そ の う ち 一 つ の 受 容 体 遺 伝 子 に 機 能 獲 得 型(gain-of-function)の変異が起った場合、植物体にエチレン非感受性を与えたが、二重、三重、四重の多重破壊株(機能欠失型, loss-of-function)では恒常的なエチレン応答性を示した。これらの結果から受容体遺伝子が重複して働いているこ

とおよびエチレンシグナル伝達系を負に制御していることが明らかになった

(Hua and Meyerowitz 1998; Hall and Bleecker, 2003; Wang et al., 2003)。 成熟制御ネットワークのすべての働きが明らかになったわけではないが、ク

ローニングされた多数の重要な遺伝子の研究から、それぞれ成熟に関わる役割、

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またはそれらの階層的な相互作用を洞察することができる(Giovannoni, 2004)。成熟現象は、様々なプロセスの調節および相乗作用によることは明らかであり、

未解明なところが多いが、最近ではゲノムおよびプロテオミクスの手法によっ

て、徐々に解明されつつある(Giovannoni, 2001)。トマトの成熟開始にエチレンが必須であることは明白であるが、個々の成熟関連遺伝子の発現がエチレンに

直接制御されているか、間接的制御によるかは明らかではない。トマト成熟不

全変異体 rinや norの解析から LeMADS-RINや NORなど、エチレン以外にも成熟現象に必須の因子も知られている。したがって、多数の成熟関連遺伝子が

エチレンや RINおよび NOR信号伝達系によって巧妙に制御されていると考えられているが、その詳細は明らかではない。 本研究では、トマト果実の成熟について、かずさ DNA研究所で開発されたトマト DNAマクロアレイを用い、成熟関連遺伝子をスクリーニングし、それらのエチレン、RIN、NOR因子への依存性を調査するとともに、トマト遺伝子データベースを活用して機能分類した。さらに、抽出された成熟関連転写因子につ

いて、遺伝子機能の迅速・簡易解析法である VIGS(Virus Induced Gene Silencing)法を用いて解析およびトマトの遺伝子組換えによる形質転換体の育成を行った。

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第二章 マクロアレイ解析による成熟関連遺伝子の機能解析

アレイ分析の基礎は DNA の相互鎖作用によってハイブリダイズするサザンブロットである(Southern, 1975)。マイクロアレイは、一回の実験で大規模な遺伝子分析を行うことが可能であり、かずさ DNA研究所が作成した DNAアレイでは一回で約 12000個の遺伝子の発現を同時に解析することができる。 トマトの研究において、様々な表現型を示す変異体を用い、その原因遺伝子

および、その機能が徐々に明らかになってきた(Giovannoni, 2001)。我々の研究では自然成熟不全変異体 rinと norを用い、マクロアレイ解析によって RINとNOR依存性について分析を行った。エチレン阻害剤である 1‐メチルシクロプロペン(1-methylcyclopropene; 1-MCP)はエチレン受容体と結合することによって、エチレン作用を強力に抑制する(Blankenship and Dole, 2003)。そこで、果実成熟におけるエチレンの役割を 1-MCP 処理に対する種々の遺伝子の反応によって解析した。

DNA アレイは、ナイロンメンブレンフィルターなどの支持体に多数の DNAの断片（あるいは、合成 DNA）をアレイ状に配置したものである。かずさ DNA研究所と筑波大学が中心となってマイクロトムトマトにおいてESTに基づいて多数の遺伝子発現を調べるゲノム DNAアレイを開発した。この方法は、ゲノムシークエンス解析で使用した約 3kb の DNA クローンを用いて、特定の染色体領域をカバーしたコンティグを作成し、DNAアレイに用いることを特徴としている。近年、トマトナショナルバイオリソース計画が進行しており、cDNA クローンの蓄積とデータベース化、マクロアレイの開発と配布、変異体集団の収

集と維持、効率的な形質転換技術の開発などが行われている。我々は、バイオ

メック 2000(Beckman社)を用い、かずさ DNA研究所で作製されたナイロンメンブレンフィルターに高密度で DNAを固定したアレイ、実験に用いた。 エチレン作用を阻害する 1-MCPをトマトの Turningステージ(着色が始まった段階 )で処理すると、エチレン生成量および着色を有効に抑制される(Nakatsuka et al., 1998)。我々は各遺伝子のエチレン依存性の解析のために1-MCP処理を用いた。また、第 1章で述べたように、トマトについて rin, nor, Nrなど様々な成熟不全変異体が知られている。これまでの多くのトマト変異体研究では、単に成育ステージに伴う変化を調査したものが多い。そこで、我々

の研究では、rinおよび nor変異体にエチレン処理を行い、無処理果および野生型果実と比較することによって、エチレンと RIN、NOR因子の相互作用を明確にしようとした。野生型トマト果実ではステージごとに MG(mature green)、Turning、Pink(Turning後 2日)段階の果実および Turning段階で 1-MCP処理を行い、2日間保持した果実を用意した。また、rin, nor変異体ではMG段階と

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考えられるステージで果実採取し、エチレン処理した果実と無処理果実を用意

した。それぞれのサンプルから、RNAを抽出し、マクロアレイ解析を行った。

材料および方法

【実験１ マクロアレイ解析およびエチレン応答性遺伝子における RIN, NOR依存性の解析】

開花 35日後(MG段階に相当)に収穫した野生型のトマト‘Ailsa Craig’および Turninng段階トマトの果実組織をサンプリングし、Hot Brate法を用いて全RNAを抽出した(6反復)。DNAマクロアレイを用いて、多数の遺伝子発現レベルを比較し、MG 段階に対しエチレン処理した果実での発現量が 3 倍以上に増加もしくは 1/3 以下に減少し、ｔ-検定で有意差がみられた遺伝子を成熟関連遺伝子とした。解析はそれぞれ異なる果実から抽出したRNAを用いて6回のDNAマクロアレイ分析を行った。野生型トマトの MG 段階トマトの発現量に対するエチレン処理果実の発現量を調べ、エチレン応答性遺伝子における RIN, NOR依存性を調査した。解析はそれぞれ異なる果実から抽出した RNAを用いて 3回の DNAマクロアレイ分析を行った。

【実験２ 数種の転写因子の抽出および発現解析】

発育段階ごとに収穫した‘Ailsa Craig’野生型トマト、rin, nor変異体トマトおよび 1-MCP処理した野生型トマトを用い、マクロアレイデータの解析を行い、成熟に伴い発現量が 3 倍以上に増加、あるいは 1/3 以下に減少した遺伝子を成熟関連遺伝子として抽出した。さらに、興味深い候補遺伝子については、

発現変化を詳しく解析した。

【実験３ シーケンス確認解析】 ト マ ト マ ク ロ ア レ イ に よ り 抽 出 し た 候 補 転 写 因 子 bZip, S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, BTB, GRAS, Trihelix, TF-other, MADS-BOX については、かずさ DNA 研究所からプラスミド cDNA を入手した。これらを大腸菌に導入し、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systemを用い、抽出および精製した後、Big Dye XTerminator Kitによるシークエンス反応を行い、シーケンス解析を行った。 【実験４ トマト EST再解析】 マクロアレイに用いられている SOLトマトゲノム情報および KaFTOM全長cDNA 情報を活用し、シーケンスに対応する全長クローンを基に重複していた

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遺伝子を除いた。また、抽出された成熟関連遺伝子群において｢unknown｣アノーテーションされたクローンについて、かずさ DNA研究所から 94個のプラスミドを入手し、再解析した。これによって、アレイデータ全体的にアップデー

トした。さらに、アノーテーションデータとデータベース検索を行い、成熟関

連遺伝子の機能分類を行った。アップデートされたアレイデータに対し、エチ

レン依存性または RINと NOR依存性を求めた。 【エチレンの測定】 1果実を 1400mlの容器に入れ、1時間以上密封した後、ヘッドスペースガスを注射器を用い抜き取り、ガスクロマトグラフ（島津、GC- 4CM）でエチレン生成量を測定した。 使用した GCの条件を以下に示す。 GC ： 島津製 GC- 4CM 検出器 ： FID (Flame ionization detector) カラム ： Ф3mm×1m 充填剤 ： 活性アルミナ カラム槽の温度 ： 80℃ 60/80 mesh 検出器の温度 ： 150℃ キャリアーガス ： N2 40ml/min 水素圧力 ： 0.7kg/cm2 酸素圧力 ： 0.3 kg/cm2 【Total RNAの抽出】 Hot Borate法 ↓抽出 Bufferに DTT、ノニデット P-40、PVPを加えて、80～90℃に保温 ↓1gのサンプルを乳鉢で液体窒素中十分粉砕し、2mlチューブに移す ↓熱した抽出 Buffer 3mlを加え、よく混ぜる ↓100μlのプロテナーゼ K（20mg/ml）を加える ↓42℃のウォーターバスで 1.5時間インキュベート ↓360μlの 2M KClを加え、混和 ↓氷中で 1時間インキュベート ↓遠心分離（20000rpm, 30min, 4℃） ↓上清を新しい 2mlチューブに移す、再度遠心（20000rpm, 20min, 4℃） ↓上清を新しい 2mlチューブに移す、上清をとり液量の 1/3量の 8M LiClを加える

↓インキュベート（12～16時間，4℃） ↓遠心分離（20000rpm, 30min, 4℃）

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↓上清を捨てる、1mlの 2M LiClを加え、軽く vortex ↓遠心分離（20000rpm, 20min, 4℃） ↓上清を軽く捨て、沈殿に1ml の2M LiClを加え、遠心分離（20000rpm, 20min,

4℃） ↓上清を捨て、300μl の 10mM Tris-HCl を加え、ボルテックスで沈殿を完全に溶解

↓1/10量の 2M酢酸カリウム（pH 5.5）を加え、氷中で 20minインキュベート ↓遠心分離（20000rpm, 20min, 4℃） ↓上清を 1.5mlチューブに移す ↓2.5倍量の 100%エタノール（̶20℃で保存）を加える、よく混ぜる ↓‐80℃で 2時間インキュベート ↓遠心分離（20000rpm, 20min, 4℃） ↓上清を捨て、100μlの 70％エタノール（‐20℃で保存）を加え洗浄 ↓遠心分離（20000rpm, 10min, 4℃） ↓上清を捨て、30分減圧乾燥 ↓100μlの 10mM Tris-HClを沈殿に溶解、ボルテックスで溶解 ↓吸光度を測定 ▲RNA含量( μg/μl)＝(260nm̶320nm)×0.04×希釈倍率

【RNAの電気泳動】 1.0% SeaKem 1×Mopsゲル(60ml)の作成 滅菌水 54 ml アガロース 0.72 g 20×Mops 3 ml ↓以上を三角フラスコに入れ、電子レンジで加熱 ↓50～60℃になってから、3mlのホルムアルデヒド液を加える ↓プレートに流し込み、サンプルコームをセット ↓ラップでカバーし、室温でゲルが固まるまで放置 ↓サンプルコームを抜いて、泳動層にセット ↓1×Mopsを満たす ↓泳動用 RNAをロード ↓電気泳動 【DNAマクロアレイ】 Ⅰ【ハイブリバッファーの調整】

以下の試薬を混和する（使用量に応じてスケールアップ）

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試薬 量

1 M 50ml 0.5 M EDTA 200μl SDS 7g 滅菌水 up to 100ml total 100ml Ⅱ【1μg/μl poly(dA)溶液】 アデニン(A)の 12~18merを最終濃度が 1μg/μlとなるように TEに溶かす、分注して‐20℃で保存 Ⅲ【ラベリング用 dNTP mix】 dATP, dTTP, dGTPの最終濃度が 20mM、dCTPは 0.125mMとなるようにdNTP mixを作製する 【プレハイブリダイゼーション】 1 セットのアレイ（メンブラン 2 枚）につき 5ml のハイブリバッファーを使用する

以下の試薬を混和する（使用量に応じてスケールアップ）

試薬 量

ハイブリバッファー 5ml 1μg/μl poly(dA)溶液 5μl ハイブリバッグにアレイフィルターを入れ、シールする バッグの一角を切り、上で作製したハイブリバッファーを入れる 空気を抜き、角をシールする 65℃、シーソー振とう 【ハイブリ】へ 【ラベリング】

Super Script First-strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)の試薬を使用した。しかし、dCTPの割合を低くした dNTP mixは自作した。ラベリング用 dNTP mix（最終濃度 20mM dATP, dTTP, dGTP 0.125mM dCTP） ① RNA-primer mixの作製 以下の試薬を混和する 試薬 量

Oligo(dT)プライマー 1μl RNA(1μl/μg) 5μl

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ラベリング用 dNTP mix 1μl SDW 1μl total 8μl 65℃, 5min 氷上 2min ② Buffer-RTase mixの作製 以下の試薬を混和する 試薬 量

10×buffer 2.5μl 25mM MgCl2 5μl 0.1 M DTT 2.5μl RNaseOUT 1μl 33P dCTP 5μl ①液に加える 42℃, 2min 1μlの Super ScriptⅡを加える 42℃, 50min 70℃, 15min, 氷上 1μlの RNaseHを加える 37℃, 20min

【ターゲットの精製】 ターゲットの精製には QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を使用した。 逆転写反応溶液(26μl)に、130μl(5vol)の Buffer PBを加え、混合する QIAquick spin columnに混合液を入れる 遠心(15000rpm, 1min) カラムに 300μlの Buffer PEを加える 遠心(15000rpm, 1min) カラムをはずし、flowthroughをピペットで吸出し、廃液専用容器に捨てる カラムを collection tubeに戻す カラムに 450μlの Buffer PEを加える 遠心(15000rpm, 2min) 新しい 1.5ml チューブにカラムを移す カラムに 100μlの Buffer EBを加える 遠心(15000rpm, 1min)

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もう一回カラムに 100μlの Buffer EBを加える 遠心(15000rpm, 2min) シンチレーションカウンターでカウントを調べる 【ハイブリダイゼーション】 ターゲットのディネーチャー ヒートブロットを 95℃にセットする 精製したターゲットの入ったチューブをヒートブロックに挿し、5分間置く 氷上 2min スピンダウン アレイフィルター1枚につき 1mlのハイブリバッファーを使用する 以下の試薬を混合する。使用量に合わせて、スケールアップする 試薬 量 ハイブリバッファー 1ml 1μg/μl poly(dA)溶液 1μl プレハイブリしていたバッグの一角を切り、液を捨て ディネーチャーしたターゲット溶液と上記のハイブリ液を混合し、バッグに入れる バッグの角をシールし、よく液を混合する シーソー振とう、65℃、16時間 【洗浄】 wash液 1×SSC, 0.1%SDS液 0.1×SSC, 0.1%SDS液 wash液を 65℃に温めておく ハイブリバックの一角を切り、ハイブリ液を捨てる アレイフィルターを取り出し、1×SSC、0.1%SDS 液で 2 回すすぎ、wash液を入れ、シーソー振とう、65℃、15分 アレイフィルターを取り出し、0.1×SSC、0.1%SDS液で 1回すすぎ、wash液を入れ、シーソー振とう、65℃、30分 アレイフィルターを取り出し、0.1×SSC、0.1%SDS 液を入れ、シーソー振とう、65℃、30分 アレイフィルターをキムワイプ上に置き乾燥させ薄いビニールに挟みイメージングプレート(FUJIFILM BAS-MS 2325)にあてる 24時間、イメージングプレートに当てる

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【イメージの取り込み】

BAS-1800(FUJIFILM)にイメージングプレートをセットし、取り込みソフトImage Gauge(FUJIFILM)でコンピュータに取り込む

Image Reader(FUJIFILM)でフォーマットを変更する 取り込みが済んだイメージングプレートは、IP Eraser BASで初期化する 【イメージの数値化】 ソフト Array Vision(Amersham Bioscience)を使い、イメージを数値化、Excelファイルに変更した 【データの解析】 成熟関連遺伝子の抽出

MG段階から Turning段階を経て、Pink段階どちらの段階にかけて発現量が3倍以上増加したもの、あるいは 1/3以下に減少したものを成熟関連遺伝子とした。

依存率及び依存性の統計 成熟関連遺伝子についてそれぞれエチレン依存性、RIN 依存性と NOR 依存性を求めた。依存率 70%以上のものを依存的、30%~70%の間のものを部分的に依存、30%以下のものを非依存的と分類した。 エチレン依存率（%）＝{1-(MCP-MG)/(Pink-MG)}×100(%) MCP: 果実 Turning段階での 1-MCP処理した発現量 MG: MG段階における発現量 Pink: Pink段階における発現量 RIN依存率（%）＝[1-{(rinE/rinC-1)/(TR-MG)}]×100(%) rinE: rin 自然変異体トマト開花後 35 日に収穫した果実に 2 日間エチレン処理を行った発現量

rinC: rin 自然変異体トマト開花後 35 日に収穫したコントロールとした果実における発現量

TR: 野生型トマト Turning段階における発現量 MG: 野生型トマトMG段階における発現量 NOR依存率（%）＝[1-{(norE/norC-1)/(TR-MG)}]×100(%)

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norE: nor自然変異体トマト開花後 35日に収穫した果実に 2日間エチレン処理を行った発現量

norC: nor自然変異体トマト開花後 35日に収穫したコントロールとした果実における発現量

TR: 野生型トマト Turning段階における発現量 MG: 野生型トマトMG段階における発現量 【遺伝子の機能解析】 遺 伝 子 機 能 の 分 類 、 解 析 に は 、 ト マ ト デ ー タ ベ ー ス Mibase

(http://www.kazusa.or.jp/jsol/microtom/indexj.html)の EST 情報及び GO Search、トマトゲノムのデータベースである SOL(http://solgenomics.net/)および NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を用いた。

【大腸菌の形質転換】

かずさ DNA研究所から届いたプラスミドを 100μl TEを入れ、よく混ぜる、1.5mlチューブを用意、1μlを取る ↓̶70℃から competent cell (E.coli DH5α)を氷の中に移す、ゆっくり溶けてからチューブに移す ↓やさしく混ぜ、氷中で 20分インキュベート ↓42℃のウォーターバス中で 45～50秒のヒートショック ↓すぐに氷中に移す、2分間インキュベート ↓competent cell入れた 10倍量の液体 LB培地を加える ↓37℃の振とう培養器で 1.5時間インキュベート ↓アンピシリンを含む LB 培地に 100μlをまく、12～16時間培養 ＜Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System＞ 【大腸菌の準備】 ↓増殖した LB培地から単一コロニーを採り、アンピシリンを含む LB 培地に接種、37℃で 12～16時間培養する ↓2本ずつのガラスチューブに 2.5mlアンピシリンを含む液体 LB培地を入れ、シングルコロニーを接種し、37℃の振とう培養器で一晩(12～16時間)培養

【大腸菌溶解液の調製】 ↓一晩培養した大腸菌培養液を集めて(total 5ml)、15mlチューブに移す、遠心機で 10,000rpm, 5分間遠心し、菌を回収する、上清を捨て ↓250μlの Cell Resuspension Solutionを加え、ボルテックスまたはピペッテ

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ィングにより大腸菌のペレットを完全に攪拌する ↓攪拌した大腸菌を滅菌済み 1.5ml微量遠心チューブに移す ↓250μlの Cell Lysis Solutionを加え、4回の転倒混和により混合する。細胞溶解液が透明になるまで、約 1～5分間インキュベート ↓10μl のAlkaline Protease Solutionを加え、4回の転倒混和により混合する。室温で 5分間インキュベート ↓350μl の Neutralization Solution を加え、すぐに 4 回の転倒混和により混合する ↓大腸菌溶解液をトップスピードで室温(10,000rpm, 20℃)、10分間遠心 【プラスミド DNAの単離および精製】

Spin Columnを 2ml Collection Tubeに差し込み、各サンプルにつきプラスミド DNA精製ユニットを準備する ↓大腸菌溶解液の上清を準備した Spin Columnにクリアーライセートをデカンテション ↓上清をトップスピードで室温(10,000rpm, 20℃)、1分間遠心。2ml Collection

Tubeから Spin Columnをはずし、通過した溶液を Collection Tubeから捨てる。Collection Tubeに Spin Columnを再び挿入する ↓750μl の Column Wash Solutionを Spin Columnに加え、トップスピードで 1分間遠心。通過した溶液を捨て、Columnを再度 Collection Tubeに挿入 ↓250μl の Column Wash Solutionを加え、もう一度洗浄する ↓トップスピードで室温、2分間遠心 ↓上清を捨て、もう一度トップスピードで室温、2分間遠心 ↓Spin Columnを新しい滅菌済みの 1.5mlマイクロ遠心チューブに移す ↓100μlの Nuclease-Free Waterを Spin Columnに加え、1分間待つ、プラスミド DNAを溶出する。トップスピードで室温、1分間遠心 ↓DNA を溶出した後、Spin Column を 1.5ml マイクロ遠心チューブからはずし、廃棄する ↓吸光度を測定し、サンプルは‐20℃またはそれ以下の温度で保存 ＜Big Dye XTerminator TM Purification Kit＞ 【シークエンス反応】 プラスミド DNAサンプルを 100ng/μlの濃度に調整 反応組成（単位：μl）

5×Sequencing Buffer 1.875 Primer 0.5

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Plasmid 1 H2O 6.375

Big Dye 0.25 Total 10

条件

94℃ 1分 ↓ 94℃ 10秒 50℃ 5秒 40サイクル 60℃ 2分 30秒

↓ 10℃ ∞

【Big Dye XTerminator精製】 シークエンス反応済みサンプル 10μl

SAM 45μl XTerminator 10μl

Total volume 65μl Ⅰ．チューブにアルミ二ウムホイルをする Ⅱ．回転数 1800rpmで 30分攪拌する Ⅲ．1000×gで 2分間遠心 Ⅳ．96 wellプレートに 45μlを移す

◆ XTerminator溶液はビーズの懸濁液、すぐに沈殿を始め、不均一になるため、

使う直前ごとに攪拌し、ピペッティングしながら、サンプリングする。

結果および考察

トマトはクライマクテリック型果実に分類され、果実成熟に伴って呼吸の上

昇とエチレン生成量の急激な増加がおこることが知られている。我々は成熟開

始直後の時点(Turning)で 1-MCP 処理を行い、エチレン生成量の変化を記録した(Fig.1)。また、かずさ DNA 研究所が開発したマクロアレイを用い、11,520個の非重複(nonredundant)遺伝子の発現を網羅的に解析した。それらのデータを基に成熟関連遺伝子を抽出し、エチレンに対する依存性または RIN と NORに対する依存性を算出した。成熟関連遺伝子の抽出と特性解析より、成熟に伴

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って発現パターンが顕著に変化する成熟関連遺伝子を 419 個特定した。それらは、成熟に伴い 3 倍以上に増加した遺伝子 224 個、1/3 以下に減少した遺伝子195 個から構成されている(Fig.2)。さらに、トマト果実未熟、成熟開始後および 1-MCP 処理した果実についてのアレイデータを基にエチレンの依存率を計算した。成熟に伴ってアップレギュレートされた遺伝子の中で、エチレン依存

率が 70%以上、Pink段階の発現量が顕著に上昇(基準はMG段階より 2倍以上増加)を基準とすると、159 個(約 71％)の遺伝子が 1-MCP 処理によってその発現が明確に抑制され、エチレン信号に高い関与性を示し、エチレン依存グルー

プに分類された。一方、エチレン依存率が 30%以下あるいは遺伝子発現がTurning 段階で顕著に上昇した後、1-MCP 処理をしなくても Pink 段階での発現量が低下し、エチレン非依存と考えられた遺伝子が 42個あり、アップレギュレート遺伝子の約 19％を占めた。また、成熟に伴い発現増加はあったが、1-MCP処理に対する反応が中間的で、エチレン依存または非依存どちらにも分類でき

ない、エチレン部分的依存と考えられた遺伝子は 23 個あり、全体の約 10％を占めた(Fig.2A)。一方、発現量が成熟に伴って低下するダウンレギュレート遺伝子において明確なエチレン依存を示した遺伝子が約 23％の割合で 45 個であった。エチレン非依存に分類される遺伝子は半分以上を超え約 53％、103 個を示し、エチレン部分的依存に分類される遺伝子は 47個、24％の割合だった(Fig.2B)。したがって、419個成熟関連遺伝子のうち、少なくともある程度のエチレン依存性を示し、1-MCP処理によって影響を受けた遺伝子の数は 274個となり全体の約 65%を占めた。 以前、トマト果実において、cDNA マイクロアレイによるトランスクリプトームのプロファイルより、発育段階で発現パターンが変化する 869 個の遺伝子が同定された(Alba et al., 2005)。その中で、エチレンレセプターの変異によってエチレン非感受性を示し、成熟が抑制される変異体である Nr(Never-ripe)において、発現が変化した遺伝子は 869個の中 37％あり、これらはエチレン制御下にあると判断された。モモのマイクロアレイ分析では、未熟から成熟開始段

階で約 4800 個オリゴヌクレオチドプローブを用いたプロファイルを行ったところ、分子的な機能および生物プロセスによって分類した遺伝子の中で、いく

つかの転写因子をコードする遺伝子およびエチレン生合成関連遺伝子が成熟に

伴って著しくアップレギュレートされたと報告されている(Livio et al., 2006)。キウイフルーツにおいては、最近、約 17472 個の遺伝子を用いたマイクロアレイ分析で、細胞壁に関わる PG(polygalacturonase), PL(pectate lyase)を含む401 個の遺伝子がエチレン処理によって反応するエチレン応答性遺伝子として同定された。また、エチレン生合成経路の ACC経路に属する ACC酸化酵素である ACO(ACC oxidase)の AcACOをノックダウンさせた形質転換系(TK2)は、

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エチレンを生成せず、エチレン処理を行ってもコントロールと比べて顕著にエ

チレン生成量および軟化が抑えられていた(Atkinson et al., 2011)。イチゴにおいて 1701 個 cDNA クローンからなるマイクロアレイによって、成熟に伴って発現レベルが有意に変化する遺伝子として 401個が同定された(Aharoni et al., 2000)。ノンマクテリック型果実では、カンキツ(Citrus clementina)において、ほぼゲノム全体のESTコレクションを利用したラージスケールマイクロアレイ解析では、3588 個マイクロアレイのプローブの中で、1088 個プローブが果実の発育および成熟段階で転写レベルが連続的な上昇を示した。一方で連続的な

減少パターンを示したプローブは 1253個だった(Cercos et al., 2006)。 rinとnor変異体はライフサイクルの中でエチレン生成量および呼吸活性のクライマクテリックライズを示さず、成熟過程がブロックされ、外生エチレン処

理でも成熟しないことが知られている(Giovannoni, 2007)。この現象より RINと NOR を介するシグナル伝達経路はエチレン生合成伝達経路の上流に存在していることが推測でき、同時に果実の成熟制御システムにはエチレン依存と非

依存の両方が存在していることが示唆されている(Giovannoni, 2004)。しかし、これらの変異体でもエチレン処理に反応し、エチレン誘導性遺伝子である E8の発現は顕著に促進され、呼吸活性も上昇した(Yokotani et al., 2004; Giovannoni, 2007)。もちろん、RINと NOR伝達経路がすべての成熟および成熟関連遺伝子を調節しているわけではないが、成熟関連遺伝子についての RIN および NOR依存性の評価は、果実における成熟生理の解明に基礎的かつ重要な情報である。

最近、野生型トマトおよび rin変異体の間で発現レベルを比較したマクロアレイ解析が報告され、この解析によって、果実においてMG段階と Pink段階またはPink段階相当(MG＋4日)のマクロアレイによる遺伝子発現調査について、RINにポジティブにレギュレートされた遺伝子 342 個、ネガティブレギュレートされた遺伝子 473個が同定されている(Fujisawa et al., 2012)。また、クロマチン(chromatin)のイムノプレシピテーション(immunoprecipitation; 免疫沈殿法)とマイクロアレイ解析を組み合せ、241個の RINのターゲット遺伝子が同定されたと報告されている(Fujisawa et al., 2013)。しかし、この解析法では rinトマトでは自己触媒的なエチレンはほとんど生成しないため、‘RINによって調節されるとされた遺伝子’の中に、成熟開始に RINの調節ではなく、内生エチレン単独でも制御される遺伝子も含まれていたと推測される。 我々の研究では、rinおよび norトマトにエチレン処理を行い、成熟関連遺伝子の発現レベルを調査することによって、それぞれの遺伝子の RINと NOR依存性を算出した(RIN-Fig.3; NOR-Fig.4)。トマトを代表とするクライマクテリック型の果実は、成熟開始時に大量に内生エチレンを生成する。緑熟段階から成

熟開始(Turning)のステージで発現量が 3倍以上に増加、または 1/3以下に減少

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した合計 353 個の遺伝子を成熟関連遺伝子として抽出した。成熟に伴って発現が増加する 194 個遺伝子の中、143 個（約 74％）と 140 個（約 72％）の遺伝子がそれぞれ rin と nor 変異体においてエチレン処理に有意な反応を示さずRINあるいは NOR依存率が 70％以上となり、RINと NORに強く依存と考えられた(RIN-Fig.3A; NOR-Fig.4A)。それに対し、rin および nor トマトにおいてもエチレン処理によって転写量が顕著に変化した遺伝子は、それぞれ 9個（約4%）、12個（約 6%）と少数であったが、これらの遺伝子は RINと NORに非依存と考えられた。また、エチレン処理に対して弱い反応を示し、RINと NORに部分的に依存のグループに属した遺伝子数は、両変異体でも42個で（約22%）の割合を占めた。成熟に伴ってアップレギュレートされる遺伝子の大部分は

RIN と NOR シグナル伝達に対する調節がほぼ同じようなパターンを示した。一方、ダウンレギュレートされる 159遺伝子の中で、それぞれ 72個（約 45％）遺伝子、38個（約 24％）遺伝子が RINおよび NORに高い依存性(依存率 70％以上)を示し、60 個（約 38%）、63 個（約 40%）が部分的な依存性を示した。RIN と NOR から独立し、変異体でもエチレンに明確な反応性を示した遺伝子は 27個（約 17%）、58個（約 36%）が見い出された(RIN-Fig.3B; NOR-Fig.4B)。また、エチレンに調節される成熟関連遺伝子のほぼ半分がそのエチレン応答に、

RIN と NOR の健全性が必要であることが明らかになった。さらに、RIN 依存性を示す 143個の成熟に伴って発現が増加する遺伝子のうち、112個（約 78％）の遺伝子が同時に NORに依存性を示した。一方、RIN依存性を示す 72個の成熟に伴って発現が低下する遺伝子のうち、18個（約 25％）遺伝子が NOR依存性を示した。したがって、RIN および NOR のシグナル伝達系を制御するカスケードの一部は共通していることが示唆された。 トマト成熟制御機構の網羅的分子生物的な研究を目指し、本研究のマクロア

レイに用いた EST のアノーテーションデータ、トマトゲノムのデータベースSOL(http://solgenomics.net/)によって、各遺伝子を分子的な機能を基づいて分類した。Table 1は成熟関連遺伝子をカテゴリーによって分類し、各分類項目でのエチレン依存性を示したものである。Table 2と Table 3はそれぞれ成熟関連遺伝子のカテゴリーについてRINとNOR依存性をまとめたものである。また、Fig.5 から Fig.11 まではそれぞれカテゴリーごとに代表的な遺伝子について発現パターンを示している。

エチレン生合成系の制御関連遺伝子

植物ホルモンについての研究は、近年広範に行なわれ、特に分子レベルでの

理解が急速に進展している。エチレンはクライマクテリック型果実の成熟制御

にとって鍵因子とされているので、エチレン生合成およびシングナル伝達経路

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の研究が集中的に行なわれてきた(Adam-Phillips et al., 2004a, b)。アミノ酸誘導体のSAM(アデノシルメチオニン)はACC合成酵素(ACC synthase; ACS)によって、エチレンの前駆体であるACC(1-aminocyclo propane-1-carboxylic acid; 1-アミノシクロプロパンカルボン酸)に変換され、ACC酸化酵素(ACC oxidase; ACO)によってエチレンを生じる。この経路ではACSがエチレン生合成の律速段階としてよく知られている(Yang and Hoffman, 1984; Lin et al., 2009)。Fig.1に示すように、トマト成熟開始時にエチレン生成量が爆発な増加を示すことは

よく知られている。エチレン生合成経路の中でACC合成酵素およびACC酸化酵素をコードしているLeACS2, LeACS4とLeACO1遺伝子の発現は成熟開始時に顕著に増加し、1-MCP処理によって抑制された(Nakatsuka et al., 1998)。今回のアレイ解析でもほぼ同じような結果が得られた(Fig.5)。したがって、それらの遺伝子はエチレン生合成制御においてポジティブフィードバック制御を受け

ていると考えられた。セイヨウナシ(Hiwasa et al., 2003)、バナナ(Inaba et al., 2006)、キウイフルーツ(Mworia et al., 2010)でもACSとACO遺伝子の発現は成熟に伴って顕著に増加し、1-MCP処理によって抑制されるという類似した結果が得られ、共通して自己触媒的な発現調節が存在していると考えられている。

E4とE8はトマトにおいてエチレンに顕著に応答する遺伝子として知られているが、それぞれの生理学的な機能は必ずしも明確にはなっていない。我々の実

験でも以前の報告と同様に、E4およびE8遺伝子の発現が成熟に伴い急激に増加し、1-MCP処理によって顕著に抑制されたことから、これらの遺伝子は明確なエチレン依存性を示すことが明らかになった(Fig.5)。E4はエチレン生合成経路の中で必要なメチオニンスルホキシドレダクターゼをコードすることが推測さ

れており、E8もエチレン生合成制御上に関与することが示唆されている(Alexander and Grierson, 2002)。以前、アンチセンスまたはコサプレッション(co-suppression)によってE8の遺伝子発現とタンパク質レベルを抑制すると、成熟に伴うエチレン生成量が増加したことより、E8遺伝子はエチレン生合成の調節にネガティブな役割果していることが示唆された(Peñarrubia et al., 1992; Kneissl and Deikman, 1996)。また、エチレン生合成経路において、SAM(S-adenosyl-L- methionine synthetase)合成酵素は、ヤン回路(Yang cycle)の中で、エチレン生合成へのSAMを連続的に提供すると提唱されている。今回の実験ではSAM合成酵素遺伝子の発現は、未熟な段階で活発であったが、成熟開始とともに大幅な減少が見られ、1-MCP処理によって顕著に回復した(Fig.5)。トマトにおいて成熟に伴ってSAM発現が減少することはマイクロアレイ(Alba et al., 2005)、およびラージスケールEST分析(Fei et al., 2004)でも報告された。これらの観察は、SAM合成酵素遺伝子がエチレンによってネガティブなフィードバック制御を受けていることを示している。エチレン生合成の最終段階では、

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ACO酵素がACCをエチレンに変換する反応を触媒するが、この時には、シアン化水素が副産物として生成され、シアン化水素がβ-シアノアラニン合成酵素によって代謝され、無毒化されると報告されている(Lin et al., 2009)。今回の研究では、β-シアノアラニン合成酵素をコードする遺伝子が成熟に伴って増加し、1-MCP処理によって抑制された(Fig.5)。この遺伝子はエチレン依存性を示し、エチレンの生成に伴い生じたシアン化水素の解毒に重要な役割を担っていると

考えられる。 エチレン信号伝達系遺伝子

エチレンシングナル伝達経路の開始は、エチレンがエチレン受容体と結合す

ることであり、エチレン信号はCTR1とEIN2を経て、EIN3/EILが受け取り、さらにその下流に位置するERF(ethylene response factor)ファミリーの転写調節につながっている(Lin et al., 2009)。ETR1およびCTR1はそれぞれシロイヌナズナの突然変異体の研究より、エチレンシングナル伝達経路を負に制御する因

子と考えられている。ETR1はエチレン受容体として同定され、トマトでは機能が重複した５つのエチレン受容体遺伝子を存在していると考えられている。エ

チレン受容体がエチレンと結合すると、CTR1が持っているキナーゼ活性を失うことによって、エチレン応答シグナルが下流に伝わっていく。エチレンシング

ナル伝達経路の中で、EIN3が受けていたいくつかの制御の一つとして、EIN3-結合F-boxタンパク質(EIN3-binding F-box; EBF1/EBF2)がエチレン非存在下で常にEIN3/EILを分解し、負に制御していると考えられている(Yang et al., 2010)。今回の実験では、エチレン受容体遺伝子の発現(ethylene receptor homolog –FA27AG02)は成熟に伴い増加した(Fig.5)。EBF1(EIN3-binding F-box protein 1 –FA21AG10)は成熟開始にともに増加し、Pink段階で未熟段階の発現レベルに戻った(Fig.5)。トマトにおいて成熟開始にそのような発現変化がエチレン受容体の一つであるLe-ETR3/NR遺伝子(Lashbrook et al., 1998)およびEBFタンパク質に属するSl-EBF1とSl-EBF2について報告されている(Yang et al., 2010)。したがって、それらの遺伝子はエチレンシングナル伝達経路の中でネガティブなフィードバック制御の一端を担っていることが推察され

る。果実成熟はポジティブまたはネガティブなフィードバックによって制御さ

れ、エチレン生合成とシグナル伝達関連遺伝子が巧妙に調節されていると推測

されている。 エチレン以外の植物ホルモン関連遺伝子

エチレン以外の植物ホルモンにおける成熟制御に関する研究が近年大きく発

展した。オーキシン(Jones et al., 2002)、アブシジン酸(ABA; Zhang et al., 2009)

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などのホルモンも、その生合成および信号伝達系関連遺伝子発現の調節によっ

て、果実の成熟過程に影響を及ぼすと報告されている。ジャスモン酸の生合成

遺伝子であるジャスモン酸2(jasmonic acid 2 –FB17CD11)の発現は成熟開始とともに減少し、1-MCP処理すると顕著に回復した(Fig.6)。トマト変異体rinとnorではかなり高い発現レベルを示し、野生型トマト成熟開始時期（開花後35日）に相当する段階でエチレン処理すると大幅に減少した(Fig.6)。このようにジャスモン酸2遺伝子はエチレンに依存しているが、RINおよびNORの信号伝達系には依存していないと考えられた。ジャスモン酸は最初に植物生長阻害物質とし

て単離され、その後、ジャスモン酸による遺伝子発現の誘導が報告された。現

在知られているジャスモン酸類の生理作用は、ストレス応答、老化および形態

形成などの多岐に渡っている。ジベレリンは細胞伸長と細胞分裂、休眠打破、

発芽促進、花芽形成、開花の促進、果実の生長促進、加水分解酵素の活性化な

どの多様な生理作用を持っている。ジベレリン生合成の活性化において、重要

な役割を持つ酵素GA20 oxydaseをコードする遺伝子(gibberellin 20-oxydase-1: 20ox-1 –FA21DE10)の発現が成熟とともに高まり、1-MCP処理によって一定程度は減少した。興味深いことに、rinとnorトマトではエチレン処理に対し、検出できる変化が見られなかった(Fig.6)。キウイフルーツでのマイクロアレイ解析では、ジベレリンの不活性化酵素であるGA2 oxydaseをコードする遺伝子発現がエチレン処理による成熟に伴い上昇したと報告されている(Atkinson et al., 2011)。サリチル酸結合タンパク質(salicylic acid-binding protein, SABP)は以前タバコで単離され、防御反応におけるサリチル酸の認識およびシグナル伝達に

関与していることが示唆された(Chen and Klessig, 1991; Chen et al., 1993)。植物の病原抵抗性の一種である過敏感反応はサリチル酸に深い関係がある。防御

反応において、サリチル酸が生成され、植物全体に渡ることによって、植物病

原菌に対する抵抗性が誘導される。今回の解析の中でこの遺伝子(salicylic acid-binding protein 2–FA04DC02)発現は成熟に伴い顕著に増加し、1-MCP処理によって未熟段階の発現と同じレベルに戻った。また、rinとnor変異体ではエチレン処理に対し、検出できる変化が観察されず、両方とも野生型トマト果実

未熟段階と同様な低い発現レベルを維持した(Fig.6)。このような遺伝子発現パターンは、これらの遺伝子発現の誘導にエチレンシグナル伝達系、RINおよびNORの信号伝達系の両方を必要とすること示している。植物の病害抵抗性には、サリチル酸、ジャスモン酸、エチレンが関わることが知られているが、アブシ

ジン酸はこれら3種のホルモン作用を抑えることにより、病原菌に対する抵抗性遺伝子の発現を抑制すると考えられている(西谷和彦, 2004)。アブシジン酸は種子の成熟に必須な植物ホルモンであり、種子の形態が完成した頃に最も多く蓄

積し、成熟過程で次第に減少する。アブシジン酸の生理作用には種子の成熟、

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種子の休眠形成と発芽抑制、落葉促進、伸長生長阻害、気孔の開口阻害、水ス

トレス耐性などが知られている。シロイヌナズナにおいてアブシジン酸生合成

経路の最終段階として、キサントキシン→アブシジンアルデヒド→アブシジン

酸への転換が確認され、ABA2がコードする短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ(short-chain alcohol dehydrogenase)はキサントキシンからアブシジンアルデヒドへの転換ステップを触媒することが報告されている(González-Guzmán et al., 2002)。我々の解析の中では、その遺伝子のホモローグである短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は(putative short-chain type alcohol dehydrogenase–FA25AD07)成熟に伴いアップレギュレートされ、1-MCP処理によって顕著に抑制された(Fig.6)。また、トマトの果肉と種においてABA含量の増加はエチレン生合成および成熟開始と平行して進むことが報告されている

(Zhang et al., 2009)。セイヨウナシでも、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現が成熟に伴い急激な上昇を行ったことが報告されている(Fonseca et al., 2004)。以上を総合すると、果実の成熟はエチレンおよびほかの植物ホルモンシグナル伝達系とも相互作用し、RINまたはNORの信号伝達系とも密接に関連し、高度に協調していると考えられる。 エネルギー代謝関連遺伝子

植物における主要な代謝エネルギー代謝系は、光合成、解糖、クエン酸回路

とペントースリン酸回路の四つである(桜井ら, 2008)。これらの代謝は生物に共通の基本的な一次代謝として、特定の生物や特定の生長段階、特定の組織や細

胞で行われる代謝は二次代謝として定義されている。一次代謝の産物は核酸、

アミノ酸、タンパク質、脂質など生命維持に直接関係する。我々のアレイ解析

の中で、一次代謝である炭水化物代謝やエネルギー代謝に属する遺伝子の多く

は、成熟に伴いアップレギュレートされ、エチレン依存の傾向を示した(Table 1; Fig.7, 8)。呼吸は生物の生存にとって最も重要な代謝経路であり、そのATPの合成には、基質分子からADPへリン酸基が転位する基質レベルのリン酸化とミトコンドリア内膜を介した酸化的リン酸化がある。呼吸は細胞質基質に局在する

解糖系、ミトコンドリアのマトリックスに局在するトリカルボン酸(TCA)回路、ミトコンドリア内膜で行われる電子伝達系、ATP合成酵素に分けられる(桜井ら, 2008)。解糖系とTCA回路と共役した電子伝達系で、ATP合成酵素での反応が行われる。呼吸代謝という一連の反応は、物質の移動によって、これらの反応が、

密接に関連し合って行われる。呼吸の直接の基質であるグルコースは、解糖系、

TCA回路、電子伝達系を経て、CO2と水に酸化され、それと共役した反応によ

り、ADPとリン酸からATPが生成される。Fig.7にフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ(fructose-1,6-bisphosphatase)、フルクトース2リン酸アルドラーゼ

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(fructose-bisphosphate aldolase)、ピルビン酸キナーゼ(pyruvate kinase)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(phosphoenolpyruvate carboxykinase)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(aldehyde dehydrogenase; NAD+)などの5つの解糖系酵素、スクロースを加水分解してフルクトースを遊離する酵素であるβ‐フルクトフラノシダーゼ(beta-fructofuranosidase: vaculolar invertase)TCA回路の酵素であるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(malate dehydrogenase)とイソクエン酸デヒドロゲナーゼ(isocitrate dehydrogenase)および酸化的リン酸化でのATP合成酵素(ATP synthase beta subunit)についてアレイによる発現解析を示している。これらの酵素をコードする遺伝子発現は成

熟開始時(Turning)に緑熟段階(MG)に比べると明らかな上昇を示した。Pink段階でもフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ(fructose-1,6-bisphosphatase)、ピルビン酸キナーゼ(pyruvate kinase)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(phosphoenolpyruvate carboxykinase)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(malate dehydrogenase)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(isocitrate dehydrogenase)とATP合成酵素(ATP synthase beta subunit)をコードする遺伝子の発現量は高いレベルを維持していたが、1-MCP処理によって顕著に抑制された。この観察から、これらの遺伝子発現が明確なエチレン依存性を示すこ

とが明らかになった。一方、フルクトース2リン酸アルドラーゼ(fructose-bisphosphate aldolase)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(aldehyde dehydrogenase)およびβ‐フルクトフラノシダーゼ(beta-fructofuranosidase)をコードする遺伝子の発現レベルは成熟開始に顕著に増加し、その後、Pink段階で大幅に低下し、未熟段階の発現量とほぼ同じレベルに戻り、1-MCP処理してもMG段階とほぼ同じ低いレベルを維持した(Fig.7; まん中)。これらの遺伝子はエチレン伝達系に直接支配されているのではなく、むしろ発育ステージによっ

て調節されていると考えられる。大量のESTデータに基づく分析より、フルクトース2リン酸アルドラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼとATP合成酵素をコードする遺伝子がトマトの成熟誘導遺伝子として報告された(Fei et al., 2004)。また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼはキウイフルーツにおいてエチレンによって誘導されたと報告された(Atkinson et al., 2011)。これらのことから、成熟に伴う急激な呼吸活性の増加は呼吸代謝に関わる遺伝子の転写制御によって起こることが示唆された。また、変異体トマ

トrinとnorにおいては、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ(fructose-1,6-bisphosphatase)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(phosphoenolpyruvate carboxykinase)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(malate dehydrogenase)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(isocitrate dehydrogenase)とATP合成酵素(ATP synthase beta subunit)をコードする遺伝子発現がコントロ

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ールと比べ、エチレン処理によって促進された(Fig.7)。以前、rinとnorトマト変異体でも外生エチレン処理によって呼吸活性が野生型トマトと同じような上

昇されたことが報告されている(Yokotani et al., 2004)。したがって、rinとnorトマトにおいてもエチレン処理によって呼吸活性が上昇し、それらの遺伝子発

現も促進されたことから、これらの遺伝子はRINとNORに非依存性的に呼吸代謝の制御に関与していることが示唆された。

脂質代謝関連遺伝子

脂質は、長い炭化水素鎖を持ち、水に溶けにくい化合物の総称であり、植物

の主要構成成分の一つである。生体膜構成成分やエネルギー貯蔵、葉や果実の

表皮の保護などに関わっている。植物組織からの水の消失を抑える脂質には、

保護的な作用のあるクチクラを形成するワックスや、光合成に関わっているカ

ロテノイドを含むテルペノイド、植物の多くの生体膜に存在するステロールが

含まれている(桜井ら, 2008)。今回のアレイ解析の中で、成熟関連遺伝子としてスクリーニングされた脂質代謝に関係する10個の遺伝子は、すべてエチレンに依存し(エチレン依存率30%以上)、成熟に伴い増加するパターンを示した(Table 1)。Fig.8はNAD+(グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ; glycerol-3-phosphate dehydrogenase)など5つの酵素をコードする遺伝子の発現を示している。これらの遺伝子の発現は未熟段階と比べ、成熟開始時に顕著

に増加したが、Pink段階で脂肪酸ヒドロキシラーゼ(cytochrome P450-dependent fatty acid hydroxylase)以外の遺伝子発現は減少した。5つの遺伝子の発現は1-MCP処理によって未熟段階とほぼ同じレベルに大幅に抑制された。rinとnor変異体ではNAD+(グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ; glycerol-3-phosphate dehydrogenase)と脂肪酸ヒドロキシラーゼ(cytochrome P450-dependent fatty acid hydroxylase)の発現がエチレン処理によって増加した。脂質代謝に関わる遺伝子が成熟に伴って増加したことは、以前にセイヨウ

ナシのマイクロアレイ解析によっても報告されている(Fonseca et al., 2004)。したがって、脂質代謝関連遺伝子はクライマクテリック的な呼吸の急増、または

成熟に伴う多数の代謝産物の集中的な変化との関与が示唆された。 細胞壁代謝関連遺伝子

成熟に伴い果実は細胞壁の微細構造や組成の変化によって、病原菌に対する

感受性が高まるとともに果肉が軟化し、大きな肉質の変化が起こる(Seymour et al., 1993)。これらの青果物品質の特性に関わる急激な変化は、特異的な成熟関連遺伝子の働きによると考えられている。細胞壁の様々な変化が成熟中に進行

するため、細胞壁関連修飾は果実にとって、特別な重要性を持つ過程の一つで

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あり、硬度の変化および菌の感染に対する抵抗性が大きく変化する(Matas et al., 2009)。様々な果実において細胞壁メタボリズムの研究が成熟関連研究として、広範に進んできた(Brummell, 2006)。細胞壁構造の主な成分である多糖類の分解は、果実成熟に重要な過程の一つであり、軟化を導く。以前からトマトにお

いて細胞壁加水分解酵素の一つであるPG(polygalacturonase)は、最も広く研究されてきた。その大きな理由は成熟に伴ってエンド型‐PG(endo-PG)の活性が顕著な上昇を示したことである。エンド型‐PG遺伝子が注目を集め、成熟に関わる組織構造上の調節に重要な役割を立つと仮説された(Giovannoni et al., 1991)。また、トマトにおいてPG遺伝子を持つプロモーターがエチレンによって誘導されたと報告された(Nicholass et al., 1995)。今回の実験では、PGをコードする遺伝子(polygalacturonase–FA34BG07)発現は成熟開始時に急激に上昇し、Pink段階でやや低下したが、1-MCP処理によってより顕著に抑制された。変異体rinとnorでの発現量はエチレン処理にも関わらず、ほぼ検出されないレベルであった(Fig.9)。このような結果は、以前の報告と一致する(Sitrit and Bennett, 1998; Yokotani et al., 2004)。形質転換体によるPGの機能解析では、単純にPGの活性を抑えることでは、軟化に十分な影響を得られなかった(Sheehy et al., 1988; Smith et al., 1988; Giovannoni et al., 1989)。PGの発現を抑制した形質転換トマト、またはPGを異所的に発現させた変異体rinトマトの研究によって、PGを介するペクチンの脱重合作用はトマトの正常な成熟および軟化に必須でも十分でもなかった(Giovannoni et al., 1989; Hadfield and Bennett 1998)。もう一つの細胞壁分解に関わるペクチン分解酵素であるペクチン酸リアーゼ(pectate-lyase, PL)をコードする遺伝子の発現は、高いエチレン依存性を示し、成熟に伴いアップレギュレートされた。rinとnorトマトでのエチレン処理によってPLの発現がやや上昇する反応を示した(Fig.9)。PGおよびPL遺伝子の成熟中の発現のアップレギュレーションはトマトにおいてEST分析(Fei et al., 2004)、またキウイフルーツのマイクロアレイ解析によっても報告されている(Atkinson et al., 2011)。イチゴでアンチセンスによってPL遺伝子を抑制された果実は成熟時に野生型イチゴ果実より硬度がかなり高かったことが報告さ

れている(Jiménez-Bermúdez et al., 2002)。マンノシダーゼは細胞壁の構成成分または架橋として機能している多糖類マンナンを分解する酵素である。我々

の解析の中、その遺伝子(mannan endo-1,4-beta-mannosidase–FA12AD08)発現は興味深いことに成熟開始に一過的に大幅な上昇を示し、その後Pink段階で大幅に低下したが、1-MCP処理によりむしろ促進され(Fig.9)、エチレン非依存性を示した。一方で、グルカナーゼ(membrane-anchored endo-1,4-beta-glucanase–FA33DH02)や、ポリガラクツロナーゼ-1-ベータユニット(polygalacturonase isoenzyme 1 beta–FA21DG06)またはエクスパンシン

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(Expansin 18–FA57BE05)をコードする遺伝子発現は、それぞれ成熟に伴いダウンレギュレートされたパターンを明確に示し、1-MCP処理によって顕著に上昇した(Fig.9)。これらの遺伝子はエチレンによりネガティブに制御されていたと考えられる。これらの遺伝子は果実の発育または病害耐性に関連すると考え

られている。実際に、エンド-1,4-β-グルカナーゼについて、トマトのセルロース生合成に関わっていると報告された(Brummell et al., 1997)。また、エクスパンシンのmRNAは成熟中のトマトの果実で発現していることから、細胞壁の分解に一役担っていると思われる(Rose et al., 1997)。

二次代謝関連遺伝子

二次代謝はカロテノイド、フラボノイド、揮発性芳香族化合物などの合成に

関与し、果実成熟に特徴的な成分変化に深く関与している。これらの代謝は青

果物の栄養に関わる重要な品質または商品性を決定する重要な要因である。リ

コピンの蓄積は、トマト果実成熟のシンボル的プロセスの一つであり、フィト

エン合成酵素を含む関連生合成遺伝子の転写制御によって調節されている

(Fray and Grierson, 1993; Lois et al., 2000; Alba et al., 2005)。我々の研究の中で、フィトエン合成酵素をコードする遺伝子(phytoene synthase–LC08AF04)発現は成熟開始時に急激的に上昇し、Pink段階で大幅に落下し、1-MCP処理によってほぼ緑熟段階と同じ発現レベルまで戻った(Fig.9)。このような発現パターンはアルコール・アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(alcohol acyl transferase–FA03CG01)でも見られた(Fig.9)。この酵素はエステルを生成する最終段階を触媒し、アルコールのアセチル化反応は果実成熟に伴う、揮発性芳

香族化合物の生合成において主な役割を果たしているとされている(Yahyaoui et al., 2002)。これらの遺伝子の発現は rinと norトマトにおいてエチレン処理にほとんど反応しなかった(Fig.9)。成熟阻害変異体トマト rin と nor はリコピンの蓄積および芳香性物質の生合成しないことが、この遺伝子発現パターンと

一致する。また、二次代謝に関わる物質であり、フラボノール合成酵素をコー

ドする遺伝子(putative flavonol synthase–FA17AD02)発現の成熟に伴うアップレギュレーション、およびビオラキサンチン・脱エポキシダーゼ遺伝子

(violaxanthin de-epoxidaseprecursor–FA42CF04)発現のダウンレギュレーションが観察された(Fig.9)。トマト果実緑熟段階蓄積し、成熟ステージで検出されなかったというビオラキサンチン・脱エポキシダーゼのダウンレギュレーシ

ョンは他でも報告されている(Ronen et al., 1999)。 光合成代謝関連遺伝子

トマト果実では食べ頃に向かう成熟に伴い特徴的な色素リコピンを蓄積する

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一方で、クロロフィル含量は減少する(Fray and Grierson, 1993; Ronen et al., 1999)。成熟した果実の葉緑体の中で、多くの色素関連遺伝子の発現は低いレベルになる。クロロフィルはタンパク質に結合しているが、タンパク質部分が分

解すると色素が不安定となり、クロロフィラーゼによる加水分解によってフィ

トールを遊離してクロロフィリドとなる。我々のアレイ解析でも、4つの異なるクロロフィル結合タンパク質遺伝子 (Chlorophyll a-b binding protein 25–LB14BF06)、(Chlorophyll a-b binding protein 3C–LA28CG10)、(light harvesting chlorophyll a/b-binding protein –LA18CC09)と(Chlorophyll a-b binding protein 1B–LB13DC03)(Fig.10)の遺伝子発現は成熟に伴い、明らかな減少を示したが、1-MCP処理に対する反応を示さなかった。このような結果は、これらの遺伝子発現がエチレンによる直接な制御ではなく、むしろ発育段階に

よって調節されていることを示している。一方、おもしろいことに、葉緑体チ

アゾール生合成タンパク質 (putative chloroplast thiazole biosynthetic protein–LA20DB07)およびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(Phosphoenolpyruvate carboxylase–FB08AG03)をコードする遺伝子の発現も成熟に伴って低下したが、1-MCP処理によってほぼ未熟段階の高い発現レベルに回復した(Fig.10)。この発現パターンは、これらの遺伝子がエチレンによるネガティブレギュレーションを受けていることを示している。また、rinと norトマトでエチレン処理に対する反応は、これらの遺伝子発現が rinトマトにおいては減少が見られたが、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子では

norトマトにおいて減少が検出できず、RINのシグナル伝達に依存するが、NORのシグナル伝達には依存していないと考えられる。したがって、光合成反応に

関わる遺伝子の成熟に伴う低下は遺伝子によってエチレンによる制御、ステー

ジによる調節の両方によると考えられる。 転写因子とシグナル伝達因子

アレイ解析を用いた遺伝子発現プロファイルによってスクリーニングされた

成熟関連遺伝子の中には、シグナル伝達系遺伝子が 17個、成熟関連転写因子が20個をあった(Table.1)。MADS-Box遺伝子グループに属するMADS-RIN転写因子(MADS-box transcription factor MADS-RIN–FA26AF12)については、今回のアレイ解析による成熟に伴う発現の変化は、以前の報告(Vrebalov et al., 2002)と一致し、成熟中にアップレギュレートされていた。また、1-MCP 処理によってほぼ無処理果の発現レベルの約半分に抑制された。rinと norトマトにおいて、エチレン処理によって上昇がみられ(Fig.11)、MADS-RIN 転写因子とエチレンシグナルは相互作用をしていたことを示唆された。同様にMADS-Boxをもつ成熟関連転写因子 TDR4 遺伝子の発現 (MADS-box protein

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TDR4–FA20BA03)は、MADS-RIN 転写因子遺伝子の発現と同じような傾向を示し、成熟に伴い明確な上昇を示し、1-MCP 処理によって顕著に抑制され(Fig.11)、エチレンに高い依存性を示した。TDR4転写因子の成熟に伴う増加は、トマト果実の SBP-box に属する転写因子 CNR によって制御されていると報告されている(Eriksson et al., 2004; Manning et al., 2006)。最近、TDR4転写因子は RIN遺伝子と相互作用することによってトマト果実の成熟を調節しているという観点が提出された(Bemer et al., 2012)。GRAS、bZIP、NORおよび RIN自身を含む 31 個転写因子が直接 RIN のターゲットであることが提唱されている(Fujisawa et al., 2013)。転写因子 GRAS遺伝子発現(GRAS–FA16DF12)は成熟に伴い顕著に上昇し、1-MCP処理によって未熟段階のレベルまで大幅に抑制された(Fig.11)。GRAS転写因子は植物体特異的な転写活性化因子あるいは活性化補助因子として、細胞の分裂組織の維持や植物ホルモンオーキシンとジベレ

リンのシグナル伝達のプロセスに関わっていることが示唆されている(Bolle, 2004)。シロイヌナズナの変異体分析より、GRASタンパク質は根及びシュートの形成に関与すると示唆された(Bolle, 2004)。S-アデノシル-L-ホモシステインヒドロラーゼは細胞内のメチル化反応を調節する重要な酵素である(Tanaka et al., 1997) 。 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お い て ジ ー ン サ イ レ ン シ ン グ(homology-dependent gene silencing or HDG silencing)によって機能解析が行われている(Rocha et al., 2005)。スレオニンキナーゼ BNK1はセイヨウアブラナで単離され、植物のタンパク質キナーゼ NAK(subfamily)に最も密接に関連した と 報 告 さ れ た (Silva et al., 2001) 。 そ の 二 つ の 酵 素

(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase–LC01CB04, SAHH と putative protein serine/threonine kinase BNK1–FA31CA02)をコードする遺伝子は同じような発現パターンを示し、成熟に伴い激しく増加し、1-MCP処理によって顕著に抑制された。rinと norトマトでもその発現はエチレン処理に顕著に反応した(Fig.11)。以前のトマト果実でのマイクロアレイ解析では、セリン／スレオニンタンパク質脱リン酸化酵素 PP2A(serine/threonine protein phosphatase 2A regulatory chain)遺伝子の発現は、エチレンに制御され、成熟に伴い減少したと報告された(Alba et al., 2005)。今回の結果では、bZIP(bZip–FA27AG03)、ロイシンジッパータンパク質(leucine zipper-containing protein–FA16DD07)と BTB および TAZ ドメインをもつタンパク質 (BTB and TAZ domain protein1–LA12CD06)の遺伝子発現が成熟に伴い著しい減少を示し三つの転写因子、1-MCP処理によって bZIPと BTBおよび TAZドメインをもつタンパク質 1をコードする遺伝発現は顕著に回復し(Fig.11)、エチレンに依存することを示した。bZIP1(basic leucine zipper1)は以前トマトの葉の組織で単離され、傷害を受けると急速に誘導されるパターン示した(Stanković et al., 2000)。また、

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タバコの葉において bZIP1のホモログ(basic leucine zipper F)はエチレンによって誘導されたと報告されている(Yang et al., 2001)。タバコとイネにおいてbZIP6 のホモログは師部に特有な発現を示すことが報告されている(Yin et al., 1997; Jakoby et al., 2002)。トマトマイクロアレイ分析において成熟に伴ってbZIP1 と bZIP61 をコードする遺伝発現がそれぞれ成熟に伴いアップレギュレートおよびダウンレギュレートされたことが報告されている(Alba et al., 2005)。セイヨウナシでは bZIP 転写因子をコードする遺伝子発現が成熟に伴い低下したと報告されている(Fonseca et al., 2004)。BTB and TAZドメインタンパク質はシロイヌナズナおよびイネにおいて、それぞれ 80と 149個のホモローグの存在が示され、その中の一部がオーキシンに反応することが示唆され、オーキシ

ン応答遺伝子が発育にとって重要な役割を果たすと報告された(Robert et al., 2009)。ところで、変異体 rinと norトマトにおいてエチレン処理に対する反応は、GRAS、bZIPと BTB転写因子(BTB and TAZ domain protein1)の発現にわずかな影響をあったため(Fig.11)、これらの転写因子が RINと NORに依存したことが示唆された。一方、SAHHと BNK1をコードする遺伝子発現は rinと norトマトでのエチレン処理によって顕著に誘導された(Fig.11)。 まとめ

これらの転写因子および信号伝達関連因子の成熟に関わる生理的な機能研究

については、現時点までに明らかになっている情報は乏しい。今回成熟関連遺

伝子として同定された信号伝達関連因子や転写因子の多くは、エチレンにかな

り強く依存性を示し、一部は RINおよび NORによって制御され、他は RINとNORに非依存性を示した。エチレン、RINおよび NORのシグナル伝達はトマト果実の成熟にとって必須であることはよく知られており、1-MCP処理はトマト果実の成熟進行を阻害し、成熟不全自然変異体 rinと norトマトではエチレン処理しても成熟が誘導されない。我々のアレイ解析より、数百個の成熟関連遺

伝子が確認でき、その中の多くがエチレンによって直接に制御され、半分以上

の遺伝子が RINおよび NORに依存性を示した。したがって、分子生物学的手法を用いたエチレン制御または RINおよび NORシグナル伝達系に関する変異体と成熟阻害剤の利用はトマト果実成熟の多様な面に大きな影響を与えること

が示された。したがって、農産物の貯蔵期間や商品としての棚持ちの延長につ

ながる｡しかし、同時に果実の着色および香りの形成も同時に抑制され、品質面

では劣る場合もある。今後、成熟について生理学的に詳細な機構解明を進め、

成熟現象の特定のターゲットの面だけに特異的な制御をできることが望ましい。

例えば、揮発性の香り成分の蓄積を抑制せず、果実の軟化を遅延することも実

現するかもしれない。その段階になるためには、さらなる遺伝的な手段や方法

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を駆使して詳細な解析を行う必要がある。マクロアレイを用いた今回の研究は、

一次代謝、二次代謝、植物ホルモンの生合成および反応、光合成、着色と細胞

壁の調節など、様々な成熟に関わる生理段階の遺伝子発現変化および調節に関

れる遺伝子を整理し、エチレン、RIN と NOR シグナル伝達系の分子レベルの転写制御に関する基礎的なデータとして貢献できると確信している。

GRAS、bZIP、BNK1と BTBなどの転写因子および信号伝達関連因子は今回の結果より、エチレンまたは RINと NOR信号伝達系の下流に位置することが示唆された。成熟の特異的な面に関与していたことも含め、さらなる研究の候

補として注目する価値があると考えられる。これらの転写因子の詳しい解析に

ついて、第三章より RNAi 法であるジーンサイレンシング(VIGS)および遺伝子組換えを行った研究を紹介する。

Supplementary Table 1. Relative expression level of upregulated genes (224 genes) during ripening and dependence rates to ethylene, RIN, and NOR.

No. MG Turning Pink MCP Ethylene dependence rateCont. ethylene-treatedNOR dependentce rateCont. ethylene-treatedRIN dependence rateFunctional category Clone name SNG No. Anotation05242 0.61 60.92 30.64 0.56 100.00 0.55 4.49 92.85 0.49 2.11 96.68 Amino acid metabolismFA30AE11 SGN-U580314 Histidine decarboxylase (HDC)02938 0.95 9.68 6.47 1.24 94.76 0.66 3.43 54.22 0.68 0.80 98.03 Amino acid metabolismFA07CD11 SGN-U315586 branched-chain amino acid aminotransferase02857 0.83 3.34 1.14 0.65 100.00 0.71 1.40 67.90 0.87 2.07 54.36 Amino acid metabolismFA31DA04 SGN-U318402 L-asparaginase04096 1.50 6.07 2.86 1.15 100.00 1.22 2.26 71.93 1.55 1.86 93.55 Amino acid metabolismFA20BB02 SGN-U320631 alanine--glyoxylate aminotransferase02213 4.05 19.33 24.65 8.21 79.80 5.05 7.33 88.02 5.45 13.02 63.16 Amino acid metabolismFA23AD10 SGN-U313459 2-isopropylmalate synthase A (Alpha-isopropylmalate synthase A) (Alpha-IPM synthetase A)04650 5.63 57.92 26.80 15.87 51.59 5.90 7.83 96.48 10.05 22.11 87.08 Amino acid metabolismFA27DF12 SGN-U337038 unnamed protein product [Oryza sativa (japonica cultivar-group)]06080 0.55 39.70 13.96 3.83 75.56 0.46 0.49 99.93 0.63 0.68 99.89 Amino acid metabolismFA27DH08 SGN-U315147 Glycine dehydrogenase [decarboxylating]13605 4.14 13.72 15.48 4.24 99.13 2.55 6.09 39.84 2.35 6.04 31.88 Carbohydrate metabolismFB09BB05 SGN-U312507 fructose-1,6-bisphosphatase02730 1.76 25.74 21.22 2.69 95.21 1.44 13.13 40.39 4.43 9.13 92.21 Carbohydrate metabolismFA27DD12 SGN-U315486 isocitrate dehydrogenase, putative / NAD+ isocitrate dehydrogenase, putative, strong similarity to isocitrate dehydrogenase (NAD+)13193 1.10 2.41 4.17 1.87 74.75 1.50 2.41 49.21 1.33 5.43 0.00 Carbohydrate metabolismLA20AC10 SGN-U315793 phosphoenolpyruvate carboxykinase04100 7.55 20.52 32.36 9.32 92.87 7.45 12.21 62.81 9.65 6.74 100.00 Carbohydrate metabolismFA26DE02 SGN-U314331 fructose-bisphosphate aldolase-like protein07372 1.98 7.47 2.60 3.66 0.00 2.07 3.77 70.28 2.68 2.76 98.90 Carbohydrate metabolismFA14AD11 SGN-U338580 fructose-bisphosphate aldolase01033 1.25 2.13 4.03 1.26 99.39 1.31 1.47 81.94 1.13 2.35 0.00 Carbohydrate metabolismFA08AB06 SGN-U317062 Malate dehydrogenase, glyoxysomal precursor04348 1.75 7.62 3.63 2.04 84.42 1.97 2.86 86.47 2.53 1.62 100.00 Carbohydrate metabolismFA06BB11 SGN-U318293 SSY1_SOLTU Starch synthase I, chloroplast precursor (SS I) (Soluble starch synthase I)06840 7.60 66.31 22.51 10.29 81.98 8.15 15.97 87.56 16.45 43.62 78.62 Carbohydrate metabolismFA13BG04 SGN-U321518 putative glycerol-3-phosphate dehydrogenase12776 1.46 2.66 5.39 2.07 84.54 1.37 1.46 92.49 1.30 1.54 77.41 Carbohydrate metabolismFA21CE07 SGN-U313639 putative pyruvate kinase03759 3.94 120.20 20.50 10.23 62.00 6.12 15.55 94.78 14.87 12.22 100.00 Carbohydrate metabolismFA33DD02 SGN-U338936 beta-fructofuranosidase: vaculolar invertase04448 1.11 5.89 1.22 1.95 0.00 1.23 1.42 96.35 1.40 0.74 100.00 Carbohydrate metabolismLB11AE12 SGN-U314223 aldehyde dehydrogenase (NAD+)14708 3.30 37.89 7.79 7.73 1.50 6.07 7.78 97.31 10.31 8.68 100.00 Carbohydrate metabolismFA06AE01 SGN-U314663 beta-fructofuranosidase: vaculolar invertase03339 0.85 10.98 4.25 0.86 99.76 1.01 2.53 87.39 1.07 3.82 78.40 Carbohydrate metabolismFA34AF10 SGN-U603481 aldose 1-epimerase family protein02378 0.75 4.51 0.73 2.38 100.00 1.11 0.99 100.00 1.07 1.00 100.00 Carbohydrate metabolismLC21DD03 SGN-U314222 aldehyde dehydrogenase 1 precursor10176 4.44 63.20 14.36 11.34 30.41 12.27 33.90 86.69 11.86 11.41 100.00 Carbohydrate metabolismFA51CD02 SGN-U578305 Acid beta-fructofuranosidase03870 2.21 8.64 8.87 1.90 100.00 2.12 3.74 73.71 2.13 3.21 82.52 Cell structure FA10DA10 SGN-U583094 putative RAE1 (RNA export 1, S.pombe) homolog00212 1.99 7.02 6.95 1.94 100.00 1.44 1.76 91.35 1.40 3.29 46.68 Cell structure FA15AC11 SGN-U315713 small nuclear ribonucleoprotein04573 1.05 3.36 1.77 0.92 100.00 0.91 1.00 95.59 1.08 1.10 99.08 Cell structure FA22AC12 SGN-U316444 ATP-dependent Clp proteinase (EC 3.4.21.-) 07926 1.74 5.76 3.32 2.08 78.56 1.32 1.16 100.00 1.50 0.79 100.00 Cell structure FA01AG03 SGN-U327237 glycosyl transferase, putative03347 0.67 38.82 13.23 5.01 65.41 0.79 0.77 100.00 0.73 0.64 100.00 Cell structure FA31CG07 SGN-U313353 putative 40S ribosomal protein S807274 0.66 2.03 1.03 0.81 60.48 0.70 1.05 75.69 0.71 0.91 85.73 Cell wall LA27CG08 SGN-U314906 putative polygalacturonase01959 0.79 2.49 0.69 0.66 0.00 0.75 1.11 77.64 0.78 0.81 98.27 Cell wall LA26AF02 SGN-U313233 At1g11580/T23J18_33 [Arabidopsis thaliana]07199 3.92 39.98 23.86 2.96 100.00 2.77 8.04 79.39 1.91 6.56 73.60 Cell wall FA35BB05 SGN-U333541 putative pectate-lyase02537 4.41 60.04 48.17 2.82 100.00 2.61 6.49 88.23 2.35 5.26 90.18 Cell wall FA13BC12 SGN-U315768 pectate lyase family protein13592 1.51 4.61 28.73 3.01 94.50 1.30 1.43 95.24 1.01 1.63 70.09 Cell wall FB04DF03 SGN-U313904 Caffeoyl-CoA O-methyltransferase (Trans-caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase) (CCoAMT) (CCoAOMT) 04231 1.00 3.16 2.44 1.14 90.33 1.48 1.50 99.59 1.20 1.84 75.46 Cell wall LC14BE11 SGN-U315107 beta-galactosidase07290 0.87 11.46 2.28 7.46 0.00 1.32 1.38 99.67 2.99 1.22 100.00 Cell wall FA12AD08 SGN-U313742 mannan endo-1,4-beta-mannosidase04769 0.83 31.42 12.21 4.16 70.71 0.65 0.70 99.81 0.53 0.69 99.18 Cell wall FA34BG07 SGN-U312703 Polygalacturonase 2A precursor08245 1.05 4.03 7.69 2.01 85.53 1.00 1.70 75.56 1.35 0.77 100.00 Cell wall FB01BE04 SGN-U578473 expansin 107329 1.80 5.15 8.33 1.23 100.00 0.91 6.23 0.00 0.90 5.51 0.00 Defense response FA16CF11 SGN-U312654 pathogenesis-related protein osmotin precursor 12791 0.76 2.19 3.95 1.34 81.82 0.72 2.54 0.00 0.70 1.30 53.74 Defense response FA26BE10 SGN-U312562 chitinase12172 2.19 5.54 8.76 16.51 0.00 1.23 1.95 62.02 1.00 0.90 100.00 Defense response FB05BE01 SGN-U336144 wound-induced protein Sn-1, vacuolar membrane12536 1.67 6.73 8.09 1.79 98.20 1.69 2.45 85.34 1.62 4.69 37.36 Defense response FA36DD12 SGN-U317144 GSH1_LYCES Glutamate--cysteine ligase, chloroplast precursor (Gamma-glutamylcysteine synthetase) (Gamma-ECS) (GCS)11090 0.73 2.01 2.56 0.95 87.76 0.74 0.87 90.56 0.88 0.87 100.00 Defense response FA57BE03 SGN-U345088 putative disease resistance protein Prf13005 3.42 61.42 11.78 8.07 44.39 5.72 9.17 96.44 11.56 10.14 100.00 Defense response FA57DG01 SGN-U578305 plus agglutinin08767 2.47 2.28 10.05 1.41 100.00 0.99 1.03 100.00 0.99 1.49 100.00 Defense response FB03CC01 SGN-U314797 Pathogenesis-related leaf protein 6 precursor (P6) (Ethylene-induced protein P1)14477 52.30 24.55 171.69 29.06 100.00 6.18 7.52 100.00 7.19 18.35 100.00 Defense response FB16AH08 SGN-U579908 basic chitinase 2-1 04183 4.65 30.78 17.40 6.89 82.45 4.72 10.58 77.88 8.51 25.98 63.50 Energy pathway FA25BD03 SGN-U313361 ATP synthase beta subunit01228 1.28 5.35 8.21 1.25 100.00 0.96 1.50 82.21 1.18 1.45 92.68 Energy pathway FA23AC03 SGN-U316812 putative cytochrome P45012173 0.89 1.80 3.41 1.03 94.43 0.63 0.69 90.42 0.84 1.08 71.93 Energy pathway LA19CD02 SGN-U315367 alternative oxidase 1a04341 2.02 25.08 20.68 7.01 73.26 0.70 0.96 96.65 1.34 1.66 97.89 Energy pathway FA03DA02 SGN-U317800 hypothetical protein T5K18.16007480 0.93 3.72 2.39 1.63 52.22 1.04 0.90 100.00 1.17 0.80 100.00 Energy pathway FA26DE09 SGN-U316134 P450 hydroxylase07470 1.41 7.55 5.74 1.13 100.00 0.86 1.90 71.87 1.07 1.75 85.29 Hormon related (ABA)FA26AC07 SGN-U318631 immediate-early salicylate-induced glucosyltransferase02493 2.19 11.04 7.12 1.85 100.00 1.97 24.54 0.00 2.89 6.26 71.03 Hormon related (ethylene)FA09CB02 SGN-U315203 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase04469 0.79 5.10 2.34 0.67 100.00 0.88 8.64 0.00 0.96 3.11 59.08 Hormon related (ethylene)FA17BG04 SGN-U316305 EIN3-binding F-box protein 104641 0.84 2.99 0.99 0.68 100.00 0.96 3.65 0.00 0.82 2.52 19.72 Hormon related (ethylene)FA21AG10 SGN-U315243 EIN3-binding F-box protein 101735 1.76 6.15 6.78 1.01 100.00 0.86 4.16 0.00 1.38 4.82 0.66 Hormon related (ethylene)FA27AG02 SGN-U315568 ethylene receptor homolog12596 4.94 66.70 97.68 11.31 93.13 6.62 65.62 28.80 5.91 61.07 83.47 Hormon related (ethylene)FA51CH09 SGN-U314506 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase homolog (Protein E8)10121 1.33 7.88 10.48 1.58 97.25 1.22 4.45 46.16 1.09 2.99 64.94 Hormon related (ethylene)FA36CF08 SGN-U313832 putative ethylene receptor02513 0.95 7.56 3.28 0.83 100.00 1.36 5.27 58.95 1.03 2.48 80.00 Hormon related (ethylene)FA09DH10 SGN-U314204 beta-cyanoalanine synthase like protein11709 1.67 35.30 23.01 1.75 99.62 2.03 10.20 79.98 1.81 5.40 90.19 Hormon related (ethylene)FB11CA05 SGN-U312568 Peptide methionine sulfoxide reductase (Fruit-ripening protein E4)00217 3.18 28.15 27.74 3.31 99.48 1.48 3.47 82.95 1.83 14.47 11.78 Hormon related (ethylene)FA15DE12 SGN-U314592 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase 1 (ACC oxidase 1) (Ethylene-forming enzyme) (EFE) (Protein pTOM 13)03779 0.78 3.81 2.34 1.60 47.88 0.76 0.86 96.59 0.64 0.60 100.00 Hormon related (ethylene)FA33BB08 SGN-U317952 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 4 (ACC synthase 4) (S-adenosyl-L-methionine methylthioadenosine-lyase 4) (ACS-4) (Le-ACS4)05085 0.66 6.91 6.22 1.14 91.32 0.56 0.53 100.00 0.83 1.21 95.25 Hormon related (ethylene)FA26AE10 SGN-U316692 1-aminocyclopropane 1-carboxylate synthase02059 1.69 8.97 8.69 1.55 100.00 0.89 1.70 78.77 1.63 1.13 100.00 Hormon related (GA)FA16DF12 SGN-U318410 GRAS11353 0.60 4.47 3.23 2.20 39.10 0.77 0.67 100.00 0.72 0.59 100.00 Hormon related (GA)FA21DE10 SGN-U322646 gibberellin 20-oxidase-1: 20ox-105763 3.70 12.17 8.31 5.39 63.45 2.35 6.17 28.78 5.23 7.36 82.13 Hormon related(Cytokinin)FA06BB01 SGN-U312947 cold-induced glucosyl transferase02411 1.36 27.10 14.75 1.29 100.00 0.66 2.80 82.80 1.40 0.87 100.00 Hormon related(Cytokinin)FA02CE10 SGN-U313479 glucuronosyl transferase homolog, ripening-related07701 9.77 56.97 45.34 11.32 95.65 10.13 15.09 89.86 15.97 32.12 79.06 Hormon related(Cytokinin)FA36AC01 SGN-U313726 putative glucosyl transferase04330 8.26 102.51 42.85 11.79 89.80 8.86 17.14 91.81 13.96 30.89 89.37 Hormon related(Cytokinin)FA10AG04 SGN-U590965 Cytokinin-O-glucosyltransferase 301016 0.82 7.84 3.94 0.86 98.86 0.62 0.77 97.10 0.88 0.66 100.00 Hormon related(Slicylic acid)FA04DC02 SGN-U315921 salicylic acid-binding protein 205540 0.90 25.31 8.58 0.95 99.35 0.70 1.27 96.97 0.99 0.92 100.00 Lipid metablism FA26CC04 SGN-U318160 triacylglycerol/steryl ester lipase-like protein06254 1.27 4.92 2.17 1.10 100.00 1.02 2.28 57.16 1.56 1.60 98.96 Lipid metabolism LA25BD04 SGN-U320192 acetyl-CoA carboxylase, putative: 9984-2227605917 1.77 4.46 5.56 1.93 95.86 1.52 2.41 61.48 1.65 1.43 100.00 Lipid metabolism FA14CE06 SGN-U313182 obtusifoliol-14-demethylase04328 0.99 9.90 5.56 1.04 98.91 0.71 2.54 71.34 1.07 2.34 86.94 Lipid metabolism FA06CC04 SGN-U573196 putative lipase05479 1.06 15.54 13.94 0.84 100.00 0.83 3.52 76.27 0.92 5.79 61.30 Lipid metabolism FA18CC09 SGN-U315299 cytochrome P450-dependent fatty acid hydroxylase07414 3.07 14.44 8.07 2.90 100.00 3.26 6.12 76.30 5.21 6.71 92.26 Lipid metabolism FA19BD01 SGN-U312631 3-ketoacyl-CoA thiolase: acetyl-CoA acyltransferase06854 0.74 5.24 1.36 0.63 100.00 0.52 1.16 79.30 0.81 1.12 93.49 Lipid metabolism FA16DG11 SGN-U318609 steroleosin02389 0.99 4.28 2.12 1.23 78.60 1.13 1.69 84.97 1.26 2.01 82.27 Lipid metabolism FA35BD01 SGN-U316868 beta-ketoacyl-ACP synthase IIIA06624 1.14 45.50 24.10 0.70 100.00 0.85 1.79 97.17 1.01 3.11 94.64 Lipid metabolism FA32AE09 SGN-U313979 CER1 protein04697 0.74 75.86 22.60 9.98 57.71 0.73 0.79 99.92 0.73 0.68 100.00 Lipid metabolism FA29DE04 SGN-U317489 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A hydrolase-like protein14413 9.20 71.48 44.13 16.01 80.51 6.41 7.33 97.87 12.30 12.72 99.49 Lipid metabolism FA52BH02 SGN-U578028 Lipoxygenase B08200 7.82 54.81 34.63 11.37 86.74 4.21 3.66 100.00 9.71 18.79 84.45 Lipid metabolism FA56DE11 SGN-U578028 Lipoxygenase B

Expression in wild type fruit Expression in nor fruit Expression in rin fruit

03334 2.92 67.74 59.74 4.95 96.44 2.85 26.59 62.44 10.29 18.82 96.26 Lipid metabolism FA34CH08 SGN-U566654 glycerophosphoryl diester phosphodiesterase family protein00487 3.10 19.56 9.78 2.79 100.00 2.87 5.73 81.27 3.48 4.81 92.77 Lipid metabolism LA21BE02 SGN-U581270 Inositol-3-phosphate synthase07242 0.61 2.18 2.10 0.49 100.00 0.54 0.81 80.37 0.77 0.79 99.03 No data LA22AB05 No hits found10651 2.27 27.03 34.05 3.53 96.03 2.75 16.75 53.36 6.57 16.62 86.01 No data FA42DF11 SGN-U322844 No hits found04029 13.04 70.17 65.71 10.58 100.00 8.38 30.55 39.55 12.16 46.71 35.12 Other FA18BC04 SGN-U580018 brefeldin A-sensitive golgi protein01174 6.49 25.99 17.91 5.21 100.00 5.49 9.41 76.21 4.45 13.96 28.74 Other FA18CH12 SGN-U588731 glucuronosyl transferase homolog00071 1.19 12.06 15.67 1.09 100.00 0.82 1.28 93.81 0.81 2.42 78.39 Other FA04AF07 SGN-U577978 sodium symporter-related11093 9.75 19.73 41.33 20.39 66.32 15.05 78.70 0.00 25.61 21.38 100.00 Other FA53CF08 SGN-U313747 vacuolar processing enzyme-1b12563 2.93 11.08 11.71 2.40 100.00 2.81 7.27 42.75 3.22 9.44 30.41 Other FA54AD06 SGN-U313791 14-3-3 family protein04500 0.62 1.99 1.47 0.48 100.00 0.65 1.23 58.67 0.61 0.97 72.83 Other LC04BC06 SGN-U324427 putative DNA mismatch repair protein00650 1.12 3.07 5.54 1.00 100.00 1.29 1.94 71.12 1.07 3.29 0.00 Other LC04AG02 SGN-U315267 uroporphyrinogen decarboxylase04782 3.34 35.40 28.81 3.05 100.00 2.37 6.86 80.29 1.63 7.37 63.31 Other FA31CG06 SGN-U314898 putative epimerase/dehydratase07609 1.14 3.88 1.72 0.64 100.00 0.62 0.81 87.57 0.74 2.57 0.00 Other FA33AA06 SGN-U321255 tyrosine aminotransferase04814 0.94 11.26 9.29 1.65 91.51 0.84 1.83 89.32 0.74 0.44 100.00 Other LA25BA02 SGN-U315182 putative allantoinase04832 0.81 2.71 2.44 1.02 87.23 1.08 1.35 89.34 0.83 1.52 65.13 Other LA21BA12 SGN-U314200 dihydrolipoamide dehydrogenase precursor10586 14.90 58.09 46.31 17.65 91.23 9.67 10.87 95.70 12.84 18.04 86.05 Other FA36BH03 SGN-U314626 adenine phosphoribosyltransferase 1 (APT1)04302 0.83 4.39 1.27 0.85 96.87 0.90 1.00 97.33 0.85 1.10 93.29 Other FA31DF05 SGN-U570478 putative ADH glutamate dehydrogenase05555 2.47 49.95 11.29 3.19 91.87 1.68 2.18 98.44 2.74 7.37 91.22 Other FA26CE08 SGN-U338822 lipoxygenase (LOX)04175 1.26 3.80 2.43 1.06 100.00 0.91 1.92 44.08 1.44 2.50 63.43 Other FA28DA01 SGN-U313298 putative embryo-abundant protein03178 1.56 13.49 12.04 5.34 63.96 0.90 0.88 100.00 1.56 1.73 98.53 Other FA23DA11 SGN-U572126 alcohol oxidase-related04059 1.16 6.06 3.29 3.48 0.00 1.92 1.79 100.00 3.35 7.22 72.54 Photosynthesis FA19AF02 SGN-U316068 hypothetical protein06731 5.13 17.25 10.35 6.53 73.18 5.39 11.46 52.38 11.20 6.80 100.00 Photosynthesis FA02CF09 SGN-U577193 Glutamine synthetase04239 34.29 102.42 152.57 26.31 100.00 10.57 35.93 0.00 10.59 14.10 83.33 Protein degradation FA33AA02 SGN-U577949 ubiquitin conjugating enzyme06025 1.41 4.84 2.51 1.65 78.13 1.88 5.16 28.58 2.20 2.66 91.36 Protein degradation FA26CD05 SGN-U581531 F-box family protein(FBL6)07124 3.84 40.06 17.49 5.00 91.52 2.73 2.84 99.58 4.97 6.89 95.90 Protein degradation FA33BH03 SGN-U317163 ring domain containing protein10341 1.55 3.34 4.95 1.12 100.00 1.15 2.83 0.00 1.14 2.20 19.23 Secondary metabolismFA08DH10 SGN-U313288 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase02119 3.07 13.83 21.97 4.51 92.37 1.21 7.38 0.00 2.04 9.28 0.00 Secondary metabolismFA18BC07 SGN-U314009 monooxygenase03024 1.79 7.66 4.95 1.42 100.00 1.10 4.32 10.59 1.41 2.18 83.59 Secondary metabolismFA17AD02 SGN-U316234 putative flavonol synthase00519 2.56 5.08 9.58 4.27 75.66 5.01 8.52 29.03 5.51 4.95 100.00 Secondary metabolismLA26CB03 SGN-U315346 hydroxycinnamoyl CoA quinate transferase04136 1.53 4.82 5.40 1.30 100.00 1.07 2.41 42.02 1.25 2.41 57.13 Secondary metabolismFA21CG02 SGN-U3149974-coumarate--CoA ligase 1 (4CL 1) (4-coumaroyl-CoA synthase 1)04821 2.25 9.77 4.65 3.83 34.01 2.00 2.75 88.75 2.17 1.94 100.00 Secondary metabolismFA03CG01 SGN-U312515 alcohol acyl transferase05582 0.96 12.36 2.44 1.45 66.97 0.93 2.14 89.13 0.98 1.43 96.20 Secondary metabolismLC08AF04 SGN-U314887 phytoene synthase05435 1.18 5.19 3.98 0.78 100.00 1.26 1.68 90.29 0.86 1.50 77.99 Secondary metabolismLC03BD08 SGN-U316258 1-D-deoxyxylulose 5-phosphate synthase03252 2.11 16.45 14.54 2.02 100.00 1.62 2.56 91.55 1.61 4.45 74.08 Secondary metabolismFA29AB02 SGN-U576405 coumarate 3-hydroxylase02753 0.92 20.35 10.55 1.43 94.71 1.16 2.71 93.70 1.75 8.00 83.05 Secondary metabolismFA25AD07 SGN-U313474 putative short-chain type alcohol dehydrogenase13990 7.40 34.16 41.64 11.95 86.70 9.21 6.91 100.00 10.63 39.33 25.39 Secondary metabolismFA57BB10 SGN-U578227 UDP-glucoronosyl and UDP-glucosyl transferase,flavonoid glucoyltransferase UGT73E203333 0.90 4.10 2.89 0.79 100.00 0.96 2.80 46.14 0.98 3.02 42.23 Signal transduction LC21BA01 SGN-U320736 LSTK-1-like kinase03332 4.31 114.04 91.35 4.76 99.48 4.39 59.60 50.68 16.18 32.99 95.92 Signal transduction FA31CA02 SGN-U320508 putative protein serine/threonine kinase BNK107584 1.41 4.25 1.54 0.79 100.00 1.04 1.97 55.24 1.37 1.74 86.19 Signal transduction FA32AG09 SGN-U325266 SOS2-like protein kinase02507 0.85 3.46 1.19 1.31 0.00 1.45 2.97 65.70 0.85 4.59 0.00 Signal transduction LA24CH06 SGN-U346107 Protein kinase04949 1.67 10.81 9.99 1.88 97.46 1.84 5.00 68.57 1.73 3.49 81.32 Signal transduction FA17CG04 SGN-U313696 probable calcium-binding protein (clone Y8)09740 4.94 32.87 38.87 3.07 100.00 2.53 5.20 81.25 2.04 3.07 91.10 Signal transduction FB02DE04 SGN-U321376 putative protein kinase04921 1.90 6.73 4.35 1.69 100.00 1.38 1.91 84.98 1.29 1.40 96.92 Signal transduction LB01AG04 SGN-U316095 Unknown protein 04039 13.54 140.76 94.93 15.44 97.66 12.58 27.62 87.29 18.17 86.41 60.02 Signal transduction FA18BH07 SGN-U314915 SAHH_LUPLU Adenosylhomocysteinase (S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase) (AdoHcyase)05388 0.93 2.84 0.97 1.11 0.00 1.04 1.26 89.46 1.11 0.98 100.00 Signal transduction FA09CE09 SGN-U320114 zinc finger (C3HC4-type RING finger) family protein05172 0.87 2.82 0.97 1.03 0.00 0.98 1.19 90.47 0.94 0.93 100.00 Signal transduction FA29CE02 SGN-U323232 GTP-binding protein SAR1 homolog06603 1.89 12.72 6.57 1.10 100.00 1.14 3.91 57.65 1.15 4.54 48.35 Signal transduction LC18CB03 SGN-U584943 14-3-3 protein06283 18.93 209.65 127.37 12.10 100.00 10.35 49.26 62.70 18.42 62.51 76.25 Signal, Hormon(ABA)FA07BF06 SGN-U320448 Avr9/Cf-9 rapidly elicited protein 28401919 6.31 30.43 30.22 8.51 90.81 3.14 16.12 0.00 1.98 6.52 39.99 Stress response FA35DC05 SGN-U331300 wound induced protein10594 3.34 5.13 12.50 3.41 99.26 2.47 3.16 47.19 2.37 2.95 54.32 Stress response FB19BD05 SGN-U315143 Probable phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx)00004 1.23 4.68 2.78 1.05 100.00 0.94 2.08 56.65 1.16 1.41 92.36 Stress response LA24BG10 SGN-U335642 hypothetical protein06159 1.99 5.99 2.72 1.73 100.00 2.00 3.26 68.77 1.66 2.80 66.17 Stress response FA33CD02 SGN-U316462 putative DNAJ protein10185 1.38 24.43 23.81 1.54 99.29 1.22 6.74 72.84 1.40 5.88 80.84 Stress response FB02CA01 SGN-U327118 Encodes a protein containing a domain with significant homology to the MACPF11654 2.57 10.32 5.32 1.52 100.00 6.45 11.61 73.48 3.67 1.02 100.00 Stress response FB08AG12 SGN-U316206 chloroplast small heat shock protein class I 03871 1.62 4.85 4.20 1.37 100.00 1.38 2.05 75.79 1.39 3.08 38.98 Stress response FA03AF05 SGN-U316100 unnamed protein product10587 10.50 39.90 35.14 10.20 100.00 29.60 43.83 82.83 16.89 5.88 100.00 Stress response FB14BB10 SGN-U312454 17.6 kD class I small heat shock protein11182 4.20 21.92 10.81 4.24 99.38 10.57 17.10 85.36 4.98 3.18 100.00 Stress response FB03BE11 SGN-U312455 Hsp20.1 protein07387 1.59 7.43 2.24 2.13 17.14 2.76 3.66 91.16 2.10 3.26 85.06 Stress response FA15DG03 SGN-U323759 leaf catalase12201 0.97 3.56 3.03 0.79 100.00 0.78 0.96 91.82 0.95 1.72 70.06 Stress response LA15BH10 SGN-U581974 glutathione reductase05608 1.94 6.13 3.27 2.31 72.35 3.05 3.58 91.97 1.15 1.99 66.22 Stress response FA24BH10 SGN-U312669 chaperonin 21 precursor01169 3.00 7.22 12.23 4.48 83.97 2.56 2.73 95.46 2.35 13.64 0.00 Stress response FA18BE10 SGN-U313386 glutathione S-transferase-like protein11704 1.02 3.42 1.73 1.50 33.05 2.00 2.17 96.27 1.96 0.87 100.00 Stress response FB11AF02 SGN-U318540 small heat shock protein12341 1.86 5.65 3.24 2.67 41.49 5.53 5.59 99.42 1.90 2.22 91.77 Stress response FA36CG10 SGN-U313363 heat shock protein 8310797 44.02 27.00 148.33 28.98 100.00 15.87 18.06 100.00 11.22 14.81 100.00 Stress response FB08DC05 SGN-U316208 chloroplast small heat shock protein class I13251 1.42 4.93 1.84 1.14 100.00 2.34 1.57 100.00 1.48 1.57 97.50 Stress response FA19CD01 SGN-U327684 heat shock protein 70 12132 1.65 5.89 6.01 2.22 86.93 3.18 2.24 100.00 3.29 1.19 100.00 Stress response FB03CF05 SGN-U314000 heat shock protein 2100490 9.35 32.96 21.75 7.60 100.00 8.04 33.93 0.00 8.27 9.40 94.55 Stress response FA10CA04 SGN-U578777 Probable aquaporin PIP-type12106 5.76 17.95 19.05 7.91 83.83 19.05 19.66 98.49 11.63 10.08 100.00 Stress response FA51AE06 SGN-U577367 Probable aquaporin PIP-type pTOM7512500 1.85 5.83 6.85 1.87 99.74 1.18 2.30 56.20 1.93 1.52 100.00 Transcription factor FA56DH02 SGN-U574351 scarecrow transcription factor family protein, lateral suppressor protein03616 3.79 11.62 13.31 4.68 90.65 2.49 5.84 34.95 2.38 4.11 64.74 Transcription factor FA20BA03 SGN-U334387 MADS box protein TDR402169 1.74 7.76 4.28 1.77 98.83 1.20 3.06 54.96 1.71 1.94 96.14 Transcription factor LC10CF03 SGN-U314860 LIPLESS1, ERF13236 1.41 4.77 4.20 1.55 95.16 1.05 1.98 62.73 1.07 1.32 90.50 Transcription factor FA15BD11 SGN-U314859 PHAP2A protein , ERF05657 13.04 46.74 22.83 9.65 100.00 14.55 28.26 63.53 10.37 10.71 98.73 Transcription factor FA29DF04 SGN-U320097 putative DNA-directed RNA polymerase04645 4.25 82.09 40.70 6.70 93.27 4.12 26.15 70.85 12.40 30.35 92.10 Transcription factor FA27AF11 SGN-U316682 TDR605584 0.83 3.19 1.02 0.81 100.00 0.53 0.88 77.18 0.69 1.07 81.02 Transcription factor LC12AF01 SGN-U339558 similar to BEL1-like homeobox 4 protein (BLH4)02690 1.15 8.01 9.14 3.82 66.56 0.65 1.35 81.83 1.01 3.87 52.43 Transcription factor FA26AF12 SGN-U338727 MADS-box transcription factor factor MADS-RIN01748 10.34 36.96 27.49 16.46 64.29 14.02 15.54 95.78 13.06 20.06 79.18 Transcription factor FA24BC03 SGN-U317355 hypothetical protein p85RF03373 1.29 6.32 2.85 1.58 81.64 2.14 2.22 99.01 1.75 1.36 100.00 Transcription factor FA06BH05 SGN-U563240 cyclophilin-RNA interacting protein02162 0.78 2.72 1.87 0.79 99.02 1.05 1.94 66.10 0.93 1.40 79.98 Transcription factor LC06BD03 SGN-U313862 transcription factor, homeobox, BEL104684 2.90 10.35 4.66 1.91 100.00 2.95 8.05 32.77 2.62 4.59 70.89 Transcription factor(ARF)FA32DC03 SGN-U314233 auxin response factor-like protein 01332 7.22 20.37 28.69 12.63 74.81 5.93 13.02 34.44 9.09 8.31 100.00 Transcription factor(ARF)FA29DF01 SGN-U324618 auxin response factor ARF1712598 1.08 3.84 4.96 1.30 94.50 1.37 3.77 30.86 1.64 1.99 91.73 Transport FA55AF07 SGN-U565848 oligopeptide transporter OPT family protein01349 3.24 11.48 10.12 2.05 100.00 2.18 4.77 53.38 2.07 5.47 35.04 Transport FA32BA09 SGN-U317238 phosphatidylinositol transfer-like protein III

01347 3.63 27.28 23.14 2.36 100.00 2.45 8.30 63.32 2.96 11.79 54.19 Transport FA29DG06 SGN-U314194 putative permease 111234 2.57 8.02 9.70 5.25 62.40 2.10 3.58 66.66 2.69 4.43 69.46 Transport FB11AA08 SGN-U313836 outer membrane lipoprotein-like07000 3.50 12.42 11.04 2.23 100.00 2.66 4.86 67.62 2.64 4.77 68.55 Transport FA26CC09 SGN-U315777 vacuolar sorting receptor protein homolog PV7206702 1.00 3.53 1.31 1.39 0.00 1.04 1.81 71.08 1.41 1.29 100.00 Transport FA31DD06 SGN-U313023 purine permease family protein06251 1.57 7.15 1.17 1.52 86.67 1.58 3.11 72.80 1.16 1.34 95.72 Transport FA02DE10 SGN-U581389 plasma membrane integral protein ZmPIP2-414951 9.23 45.87 58.21 9.39 99.67 6.67 12.45 78.18 8.50 27.00 45.16 Transport FA42AA07 SGN-U566380 ABC transporter family protein13140 1.34 5.44 7.38 2.22 85.42 1.18 1.93 78.96 1.36 2.05 83.46 Transport FB12AH12 SGN-U339311 proton-dependent oligopeptide transport (POT) family protein06137 0.97 8.44 2.30 0.85 100.00 0.60 1.26 85.58 1.26 0.90 100.00 Transport FA29CC04 SGN-U340646 putative transporter NIC104689 1.51 5.32 2.80 1.60 93.19 2.34 3.04 88.04 1.64 1.93 92.92 Transport FA32CC05 SGN-U313091 Probable vacuolar ATP synthase subunit d 213971 2.99 8.90 9.70 3.15 97.56 2.62 3.19 89.07 4.48 6.37 78.66 Transport FA36AA12 SGN-U321039 putative oligopeptide transporter protein09240 1.19 2.19 6.29 3.34 57.88 1.12 1.18 93.20 1.19 0.60 100.00 Transport FB02BH09 SGN-U330560 organic anion transporter-like protein04618 1.12 9.33 6.09 1.28 96.82 0.88 1.16 95.68 2.51 5.43 84.10 Transport FA23AF12 SGN-U317948 ABC transporter family protein12007 3.53 31.45 27.24 1.20 100.00 5.36 6.68 96.88 1.06 5.94 41.86 Transport FB14DB02SGN-U338877 Nonspecific lipid-transfer protein A (NS-LTP A) (Phospholipid transfer protein) (PLTP)07235 0.99 13.46 3.86 0.82 100.00 0.98 1.16 98.51 0.84 4.30 67.48 Transport FA10DC12 SGN-U314123 ripening regulated protein DDTFR1809755 1.27 13.95 14.23 1.30 99.78 1.26 1.32 99.56 1.17 1.46 97.51 Transport FB06BC11 SGN-U316232 sodium symporter-related11559 9.94 66.58 79.41 9.64 100.00 5.13 26.99 25.20 9.17 28.32 63.33 Unknown FB19CE08 SGN-U580066 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein14938 4.62 13.58 20.19 4.23 100.00 2.46 5.20 42.66 2.87 10.07 0.00 Unknown FA53BE10 SGN-U583880 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase03212 0.85 2.00 5.02 0.74 100.00 0.66 1.16 44.03 0.89 1.28 68.08 Unknown LC09BB03 SGN-U567817 Anther-specific protein LAT52 OS04881 4.96 31.33 20.79 3.85 100.00 2.90 7.67 69.03 2.96 12.83 37.27 Unknown FA04BE11 SGN-U334164 short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) family protein 05182 0.72 5.28 1.02 0.56 100.00 0.80 0.96 97.00 0.63 1.07 88.71 Unknown FA29DD05 SGN-U316474 SAND family protein 00513 4.61 14.68 11.83 2.79 100.00 3.31 19.57 0.00 4.03 8.03 54.64 unknown FA07BA01 SGN-U325568 unknown protein07407 0.92 4.96 3.25 0.87 100.00 0.67 3.74 0.00 0.70 2.09 54.40 unknown FA15DH10 SGN-U341773 Lycopersicon esculentum maturing fruit Solanum lycopersicum cDNA clone 07820 6.01 34.55 33.10 5.80 100.00 4.06 21.51 9.49 7.79 16.72 75.83 unknown FB02CD03 SGN-U320529 ubiquitin-specific protease 23, putative (UBP23)04620 6.22 106.23 111.56 5.83 100.00 3.94 57.65 15.34 13.54 51.35 82.65 unknown FA27DE03 SGN-U322273 expressed protein [Arabidopsis thaliana]03331 0.70 1.91 3.78 0.75 98.37 0.64 1.53 19.23 0.89 4.81 0.00 unknown LC16BE12 SGN-U331342 expressed protein [Arabidopsis thaliana] 07713 10.66 60.07 71.37 9.25 100.00 7.11 29.79 31.19 11.57 19.85 84.57 Unknown FA52BD10 SGN-U565455 FAD binding / oxidoreductase 10178 0.86 4.51 1.26 1.71 0.00 1.02 3.76 37.32 1.46 1.87 93.50 Unknown FA55CD01 SGN-U320620 prenylated rab acceptor (PRA1) family protein 00147 3.55 18.54 14.48 4.03 95.56 3.33 11.52 41.77 3.51 6.20 81.89 Unknown FA14BG02 SGN-U318502 chaperone protein dnaJ-related-like01677 12.34 69.98 67.18 14.31 96.42 11.51 34.59 57.04 13.63 57.92 30.40 Unknown FA16AH07 SGN-U323130 hypothetical protein13060 1.72 26.76 22.44 1.94 98.95 1.19 7.66 62.61 1.44 5.35 81.43 Unknown FB01BE11 SGN-U314597 unknown03214 0.75 2.32 1.54 0.70 100.00 0.60 1.01 67.67 0.90 1.07 90.59 Unknown LC12AE12 SGN-U335888 Lycopersicon esculentum leaf Solanum lycopersicum cDNA clone LC12AE12 12321 14.61 88.93 88.02 15.57 98.69 9.62 25.41 67.73 19.44 76.27 42.54 Unknown FA29AH10 SGN-U578912 putative methyltransferase07036 2.21 12.39 9.22 2.99 88.87 2.35 5.72 68.83 3.24 4.90 88.84 Unknown FA21AF08 SGN-U316490 hypothetical protein11542 1.91 5.96 10.10 2.19 96.65 1.52 2.45 71.07 1.98 3.89 54.34 Unknown FB14AF08 SGN-U324607 unknown protein06658 1.31 4.07 1.02 1.45 100.00 1.42 2.26 71.87 1.12 1.74 73.52 Unknown LC19DE11 SGN-U314882 glycine-rich protein TomR206495 5.15 45.60 30.16 4.91 100.00 3.96 12.49 72.57 5.56 13.70 81.39 Unknown FA26AC02 SGN-U324443 P0076O17.9 [Oryza sativa ]05426 1.06 3.23 1.03 0.79 0.00 0.98 1.51 73.50 0.84 1.19 79.58 Unknown LB02CE06 SGN-U319106 hypothetical protein F204252 1.36 5.84 5.76 1.30 100.00 1.15 2.07 75.49 1.50 2.41 81.58 Unknown FA30BH01 SGN-U345462 expressed protein00778 0.86 2.66 1.80 0.75 100.00 0.58 0.88 76.01 0.71 0.74 97.54 Unknown FA23AB12 SGN-U597349 Lycopersicon esculentum maturing fruit Solanum lycopersicum cDNA clone04856 0.76 2.51 1.09 0.70 100.00 0.66 1.01 76.31 0.76 1.12 79.18 Unknown FA04AB03 SGN-U599248 glycosyl hydrolase family 20 protein08751 8.40 41.87 56.20 12.25 91.96 9.09 17.10 77.85 12.33 19.96 84.47 Unknown FA51DC06 SGN-U568275 expressed protein [Arabidopsis thaliana]07094 1.05 5.27 3.83 1.07 99.33 0.98 1.84 78.10 1.09 2.87 59.63 Unknown FA32AA06 SGN-U316895 unnamed06492 13.32 40.49 21.63 5.07 100.00 31.42 44.63 79.40 112.86 12.81 100.00 Unknown LC06DC08 SGN-U322540 Unknown01849 3.16 25.14 31.59 2.15 100.00 1.73 4.06 80.70 1.82 3.82 84.26 Unknown FA33DC05 SGN-U333352 Expressed protein04858 2.69 21.69 7.83 2.89 95.97 1.72 3.99 81.32 2.29 1.52 100.00 Unknown FA07AG11 SGN-U315995 MtN1905628 0.91 12.72 4.68 1.16 93.30 1.02 3.47 81.48 1.33 4.88 79.41 Unknown FA25CH06 SGN-U315753 unknown protein04607 0.77 1.49 2.56 0.55 100.00 0.62 0.69 86.93 0.64 0.49 100.00 Unknown LC07CC10 SGN-U567817 Anther-specific protein LAT5204423 1.22 28.99 5.70 0.76 100.00 0.88 2.80 90.37 1.20 11.69 61.78 Unknown FA09AG07 SGN-U589003 Stem-specific protein TSJT106520 0.85 6.20 4.13 1.45 81.64 0.99 1.53 91.38 1.92 2.94 91.55 Unknown FA26DD09 SGN-U315967 unknown protein06572 5.67 17.72 3.63 5.29 81.54 16.97 19.54 92.86 24.07 6.38 100.00 Unknown LC09DB04 SGN-U578016 Hypothetical mitochondrial protein03529 0.95 2.69 3.69 1.25 88.95 1.11 1.22 94.81 1.24 1.73 78.63 Unknown FA17CE11 SGN-U330178 unknown03420 0.98 3.30 3.13 1.07 95.67 1.21 1.31 96.56 1.25 1.94 77.16 Unknown FA11DB08 SGN-U318802 hypothetical protein F3H9.703690 2.77 42.34 21.97 5.72 84.65 3.08 3.78 98.41 5.89 8.59 96.78 Unknown FA27DE12 SGN-U312745 unknown protein14452 4.54 11.14 14.83 4.19 100.00 3.95 4.03 98.70 2.93 6.38 19.07 Unknown FB15DA09 SGN-U581197 mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim17/Tim22/Tim23 family protein 04079 1.21 26.09 14.26 5.02 70.81 1.13 1.32 99.19 1.41 1.38 100.00 Unknown FA19AD09 SGN-U321834 unknown protein01414 0.68 28.33 14.42 7.01 53.91 0.71 0.77 99.81 0.65 0.76 99.61 Unknown FA34AG08 SGN-U332169 centromere protein homolog from Arabidopsis thaliana chromosome 4 contig 13587 1.04 2.45 4.41 1.03 100.00 1.23 0.76 100.00 0.98 0.81 100.00 Unknown FB04BA01 SGN-U338643 early light inducible protein07815 0.91 2.90 0.97 0.85 100.00 0.86 0.57 100.00 0.56 0.51 100.00 Unknown FB02AB09 SGN-U332453 upload_account_name:france Solanum lycopersicum chromosome 712046 4.12 19.19 20.14 5.09 93.90 5.94 4.22 100.00 6.42 13.97 67.88 Unknown FA36AE10 SGN-U324214 unnamed00588 3.60 23.82 13.40 8.38 51.23 3.76 3.60 100.00 3.94 8.08 81.23 Unknown FA09DA08 SGN-U586067 MA3 domain-containing protei04262 1.18 7.17 4.11 3.37 25.11 11.68 5.05 100.00 12.03 2.85 100.00 Unknown FA30BH04 SGN-U326100 IQ domain-containing protein / BAG domain-containing protein, contains Pfam profiles PF00612: IQ calmodulin-binding motif, PF02179: BAG (Apoptosis regulator Bcl-2 protein) domain

In case where caluculated dependence rate exceeded 100%, it turnd to 100%.

In case where caluculated dependence rate was below 0%, it turnd to 0%.

No. MG Turning Pink MCP Ethylene dependent ratenor(Cont) nor (ethylene-treated)NOR dependent raterin(Cont.) rin(Ethylene treated)RIN dependent rateFunctional category Clone name SNG No. Anotation

00689 4.82 1.35 1.46 5.74 100.00 2.87 2.69 91.44 2.62 1.70 51.17 Amino acid metabolism FA18DA11 SGN-U313537 dehydroascorbate reductase08391 2.01 0.70 0.61 1.24 44.76 2.28 1.26 31.18 2.12 0.97 16.39 Amino acid metabolism LA16BA12 SGN-U339211 glutamate decarboxylase00590 4.86 0.73 0.38 0.63 5.68 11.98 4.38 25.42 0.68 1.14 100.00 Amino acid metabolism FA13BF01 SGN-U335452 S-adenosylmethionine decarboxylase leader13626 1.69 0.33 0.58 0.46 0.00 1.19 0.56 33.58 0.82 0.44 41.90 Amino acid metabolism LA15AC05 SGN-U314517 putative senescence-associated protein09121 8.07 1.91 2.87 2.46 0.00 4.33 2.09 32.32 6.15 1.76 6.37 Amino acid metabolism FA35BA07 SGN-U316717 D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, chloroplast precursor (3-PGDH)09315 2.74 0.87 1.16 2.79 100.00 2.86 2.25 68.37 2.39 1.90 70.19 Carbohydrate metabolismFB15AB12 SGN-U313578 putative ATP citrate lyase13609 3.70 0.75 1.04 1.79 28.21 2.02 2.40 100.00 1.90 1.23 55.51 Carbohydrate metabolismFB10DB06 SGN-U316416 Alpha-1,4 glucan phosphorylase, L-1 isozyme, chloroplast precursor (Starch phosphorylase L-1)14548 2.60 0.61 0.64 0.90 13.59 2.63 1.63 50.18 2.29 1.34 46.03 Carbohydrate metabolismLA18CG03 SGN-U312857 Inositol-3-phosphate synthase (Myo-inositol-1-phosphate synthase) (MI-1-P synthase) (IPS)02714 3.97 2.66 1.26 1.56 11.07 5.78 6.15 100.00 2.93 5.94 100.00 Carbohydrate metabolismLC12DC05 SGN-U312608 plastidic aldolase NPALDP113623 4.53 0.95 0.79 1.02 6.06 2.56 1.28 36.69 1.48 1.65 100.00 Carbohydrate metabolismLA19CE05 SGN-U333485 plastidic aldolase12143 5.07 0.80 1.04 1.12 1.89 7.63 4.34 48.85 7.26 3.12 32.33 Carbohydrate metabolismLA18CB01 SGN-U312856 Inositol-3-phosphate synthase (Myo-inositol-1-phosphate synthase) (MI-1-P synthase) (IPS)15193 3.64 1.07 1.86 1.76 0.00 2.38 1.72 60.79 1.67 2.74 100.00 Carbohydrate metabolismFB16AF08 SGN-U313491 fructokinase14501 7.67 2.44 3.91 8.91 100.00 9.60 5.57 38.35 6.85 6.90 100.00 Cell structure FA51AB04 SGN-U334540 ribosomal protein L34 homolog14895 2.97 0.91 1.07 3.27 100.00 2.67 1.48 35.49 2.08 1.27 44.04 Cell structure FA56AG02 SGN-U318915 ARP2 (actin-related protein 2)09673 6.13 1.55 2.52 15.53 100.00 10.20 8.96 83.70 11.91 2.97 0.00 Cell structure FA54DH01 SGN-U313082 alpha-tubulin 11710 34.74 5.85 8.66 34.07 97.45 73.80 31.27 30.72 36.82 20.92 48.10 Cell structure FB14CC03 SGN-U312776 40S ribosomal protein S2504418 8.10 6.21 2.06 7.77 94.49 9.02 13.90 100.00 5.60 11.17 100.00 Cell structure FA09DA04 SGN-U339400 diaphanous homologue-like15012 5.74 1.88 2.32 5.08 80.80 4.08 3.55 80.76 2.33 2.62 100.00 Cell structure FB03DF05 SGN-U314643 ribosomal protein L3801362 5.44 1.88 1.16 4.29 73.12 2.43 4.30 100.00 2.64 1.14 13.08 Cell structure FA29DG10 SGN-U313634 histone H108192 16.27 2.53 3.35 12.15 68.12 25.60 10.30 29.19 16.21 11.18 63.25 Cell structure FB15AC01 SGN-U314999 histone H2B12723 0.48 0.15 0.20 0.27 26.00 0.33 0.40 100.00 0.39 0.29 61.77 Cell structure LC22AD04 SGN-U313414 putative ribosomal protein09654 4.64 0.72 1.13 1.31 5.02 3.48 1.94 47.58 2.26 1.15 41.68 Cell structure LA11AC03 SGN-U333685 ribosomal protein L3 08324 25.49 7.23 8.66 9.19 3.12 7.90 9.20 100.00 7.83 10.36 100.00 Cell structure FB10CC04 SGN-U312732 ribosomal Pr 11713176 1.62 0.49 0.60 0.63 2.84 0.88 0.71 72.98 0.96 0.91 93.48 Cell structure LA16DA06 SGN-U581447 putative 40S ribosomal protein S1408303 2.67 0.89 0.97 1.30 19.51 2.84 1.73 41.60 2.42 1.19 23.83 Cell structure LA17AH12 SGN-U577578 Inositol-3-phosphate synthase04358 6.34 0.98 0.53 0.54 0.31 10.46 0.98 0.00 0.66 0.72 100.00 Cell structure FA07AD04 SGN-U590307 11S globulin seed storage protein 210636 2.62 0.74 0.80 3.37 100.00 1.74 1.29 64.32 2.01 1.05 33.63 Cell wall FA42CC07 SGN-U334331 endo-1,4-beta-glucanase14731 5.51 1.33 1.73 6.67 100.00 5.32 2.17 21.94 3.53 1.65 29.85 Cell wall FA33DH02 SGN-U571690 membrane-anchored endo-1,4-beta-glucanase14276 1.20 0.40 0.83 1.47 100.00 1.48 1.23 74.66 1.13 0.53 20.85 Cell wall FA55BH09 SGN-U316315 putative pollen surface protein08721 3.73 1.24 2.15 6.42 100.00 5.26 2.18 12.42 3.69 1.72 20.04 Cell wall FA42DA08 SGN-U316238 xyloglucan endotransglycosylase07740 4.58 1.03 1.29 2.71 43.10 6.95 2.48 16.97 2.13 1.24 46.21 Cell wall FA57BE05 SGN-U578487 Expansin 1804631 7.19 0.63 0.44 2.78 34.60 6.87 1.48 13.96 5.52 0.90 8.19 Cell wall FA21DG06 SGN-U313432 polygalacturonase isoenzyme 1 beta subunit07890 7.37 2.17 3.20 3.90 16.72 10.38 7.08 54.91 7.32 4.48 45.01 Cell wall FB18AG08 SGN-U318997 Putative glycosyltransferase 208867 116.43 8.49 8.75 66.61 53.73 275.94 118.72 38.54 135.75 27.98 14.37 Cell wall FB08CF01 SGN-U580888 glycosyl hydrolase family 3 protein, Alpha-L-arabinofuranosidase11544 24.73 7.07 6.41 19.13 69.42 12.62 3.41 0.00 8.60 4.58 34.48 Cell wall FB19DF01 SGN-U586676 Endochitinase WIN807710 8.59 0.94 0.85 3.93 39.80 8.72 1.68 9.30 6.34 1.26 9.97 Cell wall FA56BF05 SGN-U586540 Polygalacturonase-1 non-catalytic subunit beta10112 11.97 2.90 2.95 11.72 97.22 6.39 1.74 3.91 5.30 1.91 15.49 Defence response FB15AF01 SGN-U328147 Pathogenesis-related protein 1 precursor (PR-1)08179 130.52 25.53 14.50 69.70 47.58 54.38 14.24 8.23 43.04 12.68 12.31 Defence response FB18CD12 SGN-U577521 Sn-1, vacuolar membrane03599 3.09 0.74 0.40 0.59 6.96 11.43 4.02 14.59 0.78 1.39 100.00 Defence response FA19BD09 SGN-U312537 Vicilin-like antimicrobial peptides 2-110152 9.65 2.71 3.85 19.44 100.00 2.14 2.99 100.00 4.55 6.72 100.00 Defense response FB16DG06 SGN-U314266 pseudothionin St1 precursor07917 7.71 1.51 0.91 10.74 100.00 3.71 1.81 36.27 3.14 3.97 100.00 Defense response FB08AG05 SGN-U577872 gamma-thionin05709 1.97 0.87 0.63 2.96 100.00 2.15 1.28 26.86 1.32 0.95 49.72 Defense response FA33DA12 SGN-U335920 polygalacturonase inhibitor-like protein04404 9.16 4.14 2.13 12.93 100.00 5.24 2.28 0.00 3.38 2.02 26.83 Defense response LA27BD12 SGN-U568266 class1 chitinase04853 12.71 6.02 4.03 11.20 82.63 6.87 3.21 0.00 3.68 3.19 75.09 Defense response FA07AH09 SGN-U317588 ORF: able to induce HR-like lesions07704 21.87 3.10 3.95 11.41 41.61 11.46 11.13 96.60 8.44 4.14 40.59 Defense response FB19CA01 SGN-U319164 feebly-like protein 04509 36.34 11.28 3.20 14.45 33.95 20.55 6.68 2.12 22.70 1.70 0.00 Defense response FA18CG05 SGN-U319531 Chitin-binding lectin 1 precursor (PL-I)03205 1.70 0.72 0.53 0.57 2.81 5.78 0.92 0.00 0.64 0.69 100.00 Defense response FA27CC10 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein13106 7.86 1.37 2.61 2.75 2.72 5.14 1.98 25.42 2.99 2.06 62.28 Defense response LA14CB03 SGN-U315202 elicitor-inducible protein EIG-J700769 7.58 1.27 1.92 1.63 0.00 4.48 2.43 45.17 2.68 1.77 59.19 Defense response LC11CG07 SGN-U315761 putative disease resistance protein Prf13046 6.25 0.91 1.13 1.35 4.24 12.91 4.59 24.65 1.57 1.65 100.00 Defense response FA42BA11 SGN-U578487 vicilin13534 13.86 1.30 2.79 1.12 0.00 21.17 5.30 17.29 6.07 12.03 100.00 Energy pathway LA12BH04 SGN-U312724 glycolate oxidase07900 5.73 1.18 1.17 3.12 42.69 4.59 4.56 99.28 5.64 1.47 6.91 Hormon (Auxin) FB19DB08 SGN-U336310 auxin efflux carrier family protein15182 7.87 1.04 1.89 2.32 7.07 4.33 2.88 61.55 3.64 4.16 100.00 Hormon (Auxin) LB04BF01 SGN-U315029 putative auxin-repressed protein00188 31.90 6.38 12.04 12.01 0.00 23.98 10.93 31.99 18.77 22.48 100.00 Hormon (Auxin) LB14AG01 SGN-U334029 auxin-repressed protein05000 1.18 0.27 0.28 0.37 10.16 0.66 0.42 53.54 0.42 0.28 57.53 Hormon (GA) LC04BA11 SGN-U585865 peptide N-acetylglucosaminyltransferase SPINDLY07792 8.14 2.48 2.53 10.73 100.00 18.37 5.76 1.32 14.31 2.83 0.00 Hormon (Jasmonic acid) FB17CD11 SGN-U317043 jasmonic acid 209438 16.55 3.69 4.01 11.55 60.11 20.92 11.68 43.17 11.56 5.13 28.46 Hormon related (ethylene)LA24AH11 SGN-U312527 S-adenosylmethionine synthetase 1 (Methionine adenosyltransferase 1) (AdoMet synthetase 1)10637 2.72 0.80 0.94 1.14 11.16 3.55 1.32 11.38 1.15 0.69 42.87 Hormon related (ethylene)FB16AA08 SGN-U339449 hypothetical protein07827 3.02 0.48 0.62 2.03 58.73 2.76 0.86 18.25 2.08 0.57 13.75 No data FB03DA12 No hits found08715 1.71 0.27 0.50 1.11 50.70 2.45 1.17 38.28 1.42 1.31 91.35 No data FA57CD11 No hits found09123 5.15 1.62 1.60 1.77 4.89 3.46 2.08 41.83 4.27 1.53 6.32 No data FA51BE11 No hits found14902 8.91 1.99 2.51 2.16 0.00 22.17 2.44 0.00 1.97 1.38 61.37 No hit FB14CD10 SGN-U581274 No hits found00591 7.67 1.47 0.76 2.90 31.03 17.61 2.54 0.00 2.00 1.70 81.07 Other FA05CF10 SGN-U590307 legumin precursor07179 2.39 0.76 0.53 0.75 11.59 10.26 1.82 0.00 0.75 1.22 100.00 Other FA34DE10 SGN-U333550 legumin precursor08382 4.52 0.75 0.71 1.08 9.73 3.59 1.60 33.70 1.14 0.72 56.11 Other FB06CG11 SGN-U333551 11S globulin precursor13256 3.79 0.55 0.68 0.68 0.03 11.44 0.95 0.00 0.69 0.58 81.50 Other FA21CG05 SGN-U313371 11S globulin00506 5.89 1.97 1.29 2.94 35.85 12.78 2.20 0.00 2.00 1.17 37.75 Other FA03AA04 SGN-U593500 11S globulin seed storage protein G314025 4.78 1.13 1.88 6.57 100.00 8.77 4.33 33.62 5.56 2.61 30.38 Other FB02BH01 SGN-U341082 adenylosuccinate lyase11758 2.63 0.67 0.62 2.59 97.85 2.71 3.12 100.00 2.69 1.53 42.10 Other LA20AD11 SGN-U317534 amine oxidase11685 86.75 12.91 19.94 46.90 40.37 143.35 55.00 27.59 73.46 86.40 100.00 Other FB09AG05 SGN-U314212 OTU-like cysteine protease family protein

Supplementary Table 2. Relative expression level of downregulated genes (195 genes) during ripening and dependence rates to ethylene, RIN, and NOR.Expression in wild type fruit Expression in nor fruit Expression in rin fruit

09314 77.27 6.09 10.56 26.69 24.18 117.20 52.40 39.98 73.87 33.80 41.11 Other FB11DE07 SGN-U321143 Deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase (dUTPase) (dUTP pyrophosphatase) (P18)08187 3.44 0.95 0.85 1.12 10.42 3.43 1.84 35.60 1.35 0.67 29.75 Other FB14CC11 SGN-U339171 Em H5 protein12642 7.51 2.48 3.33 3.77 10.34 5.82 3.87 49.92 3.38 2.60 65.43 Other FB04AF08 SGN-U338537 Em protein10225 3.99 1.17 1.23 1.41 6.75 2.99 2.02 53.96 1.05 1.29 100.00 Other FB04AH10 SGN-U339202 gene le25 protein03497 22.91 7.99 6.52 7.17 4.02 26.05 20.35 66.37 14.99 17.08 100.00 Other FA13BE12 SGN-U319550 beta-carbonic anhydrase15060 5.76 0.72 0.84 1.00 3.43 2.61 1.07 32.67 1.77 1.23 65.17 Other FB12CB02 SGN-U326730 hypothetical protein02728 2.04 0.72 0.64 0.59 0.00 9.67 1.19 0.00 0.65 0.87 100.00 Other FA24BC10 SGN-U340320 putative endonuclease14564 41.98 11.64 35.93 22.14 0.00 34.24 19.24 39.38 22.06 19.90 86.49 Other FB10AB04 SGN-U321302 Similar to Streptomyces clavuligerus isopenicillin epimerase (P18549)01681 2.62 0.84 0.47 0.46 0.00 11.17 1.23 0.00 0.53 0.48 85.09 Other FA19CB11 SGN-U338608 allergen Ana 0 213165 86.26 27.51 60.15 45.64 0.00 79.44 65.43 74.09 53.29 46.23 80.54 Other FB17CF11 SGN-U314622 metallothionein-like protein08491 24.04 7.29 9.53 17.21 52.90 31.05 25.82 75.83 16.01 7.59 24.51 Other FA31CH02 SGN-U324121 ALG2-interacting protein X12027 71.35 10.89 18.02 40.03 41.28 198.84 63.89 19.91 71.38 84.76 100.00 Other FB14DC11 SGN-U580139 Late embryogenesis abundant protein Lea502755 3.26 1.62 0.91 1.56 27.37 2.76 1.43 4.31 2.38 1.94 63.25 Other FA28CA09 SGN-U326332 transducin family protein / WD-40 repeat family protein00068 3.33 1.04 1.34 1.14 0.00 1.48 2.27 100.00 1.45 2.50 100.00 Other FA08DD03 SGN-U585067 aminotransferase class I and II family protein14597 10.31 3.17 7.86 3.71 0.00 7.18 1.96 0.00 6.35 2.14 4.30 Other FB05BA10 SGN-U314344 methionine sulfoxide reductase A12573 4.10 1.00 1.66 7.10 100.00 7.29 4.03 40.98 6.43 1.63 1.53 Photosynthesis FA54DC10 SGN-U570998 phosphoenolpyruvate13646 4.45 0.52 0.71 1.05 8.88 2.94 1.14 30.76 1.89 1.16 56.19 Photosynthesis LA15CB12 SGN-U577305 Chlorophyll a-b binding protein 1B, chloroplastic05336 18.12 6.51 4.20 4.77 4.09 21.62 17.31 68.84 11.53 14.18 100.00 Photosynthesis FA04AD04 SGN-U580022 plastidic aldolase NPALDP114470 16.80 4.00 5.81 5.88 0.56 20.09 10.16 35.15 8.68 13.45 100.00 Photosynthesis FA57BC09 SGN-U580022 plastidic aldolase NPALDP112713 5.01 1.49 1.98 5.85 100.00 6.90 1.92 0.00 3.33 2.15 49.53 Photosynthesis LA20AH09 SGN-U578246 ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase08868 25.66 4.15 1.73 26.01 100.00 51.65 34.63 60.68 28.26 3.95 0.00 photosynthesis LA20DB07 SGN-U333806 putative chloroplast thiazole biosynthetic protein12160 5.83 1.21 1.71 5.76 98.38 4.76 5.35 100.00 6.94 1.40 0.00 Photosynthesis FB08AG03 SGN-U317854 Phosphoenolpyruvate carboxylase09780 10.65 1.61 1.60 7.74 67.90 7.12 6.21 84.88 8.38 2.41 16.04 Photosynthesis FB11DB12 SGN-U314026 phosphoenolpyruvate carboxylase 206342 1.82 1.44 0.60 1.02 34.60 2.18 1.23 0.00 1.40 1.94 100.00 Photosynthesis LA24DF04 SGN-U312531 chloroplast precursor (OEE1) (33 kDa subunit of oxygen evolving system of photosystem II)11684 3.23 1.06 1.27 1.89 31.65 4.95 1.51 0.00 2.76 2.19 69.17 Photosynthesis FB10BC03 SGN-U313179 photosystem I reaction centre subunit psaN precursor00436 1.83 0.76 0.60 0.94 27.50 1.08 1.08 100.00 0.87 0.77 80.02 Photosynthesis LC16DC05 SGN-U339010 chlorophyll a/b-binding protein type III precursor (cab-13)06599 2.95 1.81 0.94 1.28 17.01 2.55 1.80 24.39 2.36 3.97 100.00 Photosynthesis LC13CG11 SGN-U313447 Photosystem I reaction center subunit IV B, chloroplast precursor (PSI-E B)03490 2.67 1.22 0.87 1.07 10.87 1.88 1.06 19.61 1.43 0.74 11.40 Photosynthesis LC02AB10 SGN-U314748 chlorophyll a/b-binding protein type III precursor (cab-13)06031 2.80 0.75 0.72 0.91 9.01 1.63 1.33 74.86 1.20 1.13 91.64 Photosynthesis FA20AA07 SGN-U312843 chlorophyll a/b-binding protein type III precursor08796 3.19 0.56 0.79 1.00 8.87 1.75 1.05 51.46 1.74 2.00 100.00 Photosynthesis LA14AE05 SGN-U333861 chlorophyll a/b-binding protein type I precursor (cab-6A)02034 16.47 1.58 1.33 2.52 7.84 7.80 4.56 54.05 9.15 3.43 30.89 Photosynthesis LA28CG10 SGN-U313214 chlorophyll a/b-binding protein 3C precursor03472 4.30 1.32 1.10 1.33 7.06 2.57 1.97 66.09 4.02 3.60 84.93 Photosynthesis LA24AH08 SGN-U333814 chlorophyll a/b-binding protein type II (cab-7)09733 2.24 0.65 0.77 0.88 6.89 1.25 0.82 52.05 0.97 0.98 100.00 Photosynthesis LA17AH06 SGN-U334377 geranylgeranyl reductase14662 2.01 0.61 0.63 0.71 5.80 1.15 0.83 60.12 0.81 0.64 69.95 Photosynthesis LA19BB08 SGN-U312438 chlorophyll a/b-binding protein precursor07447 3.50 1.66 0.98 1.00 0.88 2.37 1.67 44.11 1.31 0.96 50.01 Photosynthesis LC06DC06 SGN-U336114 chlorophyll a/b-binding protein 1B precursor01128 12.08 1.00 1.26 1.27 0.06 4.34 2.24 47.35 2.96 1.54 47.88 photosynthesis LB13DC03 SGN-U313210 chlorophyll a/b-binding protein 1B precursor05886 4.38 1.77 1.15 1.05 0.00 2.15 1.65 60.48 1.58 3.00 100.00 Photosynthesis LB01AB07 SGN-U313195 photosystem I reaction center subunit X psaK14042 3.14 0.83 0.93 0.92 0.00 2.43 1.11 26.52 1.41 2.54 100.00 Photosynthesis FB03AA01 SGN-U312648 photosystem I subunit XI09325 3.92 1.46 1.22 0.91 0.00 3.13 1.21 2.08 1.50 2.05 100.00 Photosynthesis FB16DH11 SGN-U338973 ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase06262 3.16 1.38 0.88 0.86 0.00 1.74 1.32 57.02 1.17 1.10 89.29 Photosynthesis LA21BB09 SGN-U312437 chlorophyll a/b-binding protein precursor00678 5.16 0.90 1.11 1.09 0.00 3.37 1.95 48.86 1.82 1.34 68.13 Photosynthesis LB14BF06 SGN-U313221 Chlorophyll a-b binding protein 25, chloroplast precursor (LHCII type I CAB-25) (LHCP)09763 9.42 0.80 1.57 1.56 0.00 5.22 2.44 41.78 4.91 1.53 24.74 Photosynthesis LA18CC09 SGN-U579213 light harvesting chlorophyll a/b-binding protein00496 27.33 9.83 2.63 28.17 100.00 26.07 32.86 100.00 20.33 14.84 57.85 Photosynthesis FA02CF12 SGN-U592837 putative chloroplast thiazole biosynthetic protein06847 15.30 3.25 2.06 7.50 41.11 8.04 11.78 100.00 9.86 4.21 27.14 Photosynthesis FA13AA09 SGN-U576244 phosphoenolpyruvate carboxylase 206076 15.55 2.70 4.32 5.14 7.26 7.60 6.26 78.75 5.62 3.70 58.60 Photosynthesis FA21CD08 SGN-U577227 Chlorophyll a-b binding protein 50, chloroplast precursor (LHCII type I CAB-50) (LHCP)01121 8.09 1.08 1.86 1.24 0.00 5.57 2.43 34.86 2.75 1.72 56.57 Photosynthesis LB02AB12 SGN-U593165 Chlorophyll a-b binding protein 22L, chloroplast precursor (LHCII type I CAB-22L) (LHCP)04687 6.13 1.89 1.01 1.01 0.00 12.68 3.74 0.00 0.94 1.21 100.00 Protein degradation FA29DA01 SGN-U322242 cysteine proteinase precursor02071 19.10 4.10 4.39 10.36 40.53 35.86 14.66 24.75 19.25 18.02 91.90 Protein degradation LB02DD06 SGN-U344915 F-box family protein-related |09402 5.65 1.85 1.70 6.04 100.00 6.39 4.01 44.53 4.17 3.15 63.87 Secondary metabolism LA26AA09 SGN-U323930 WD-repeat protein GhTTG211549 4.17 1.33 1.16 6.25 100.00 2.58 2.94 100.00 2.57 1.04 12.43 Secondary metabolism FB19CH03 SGN-U581475 similar to dihydroflavonol reductase13506 8.51 2.17 3.50 6.40 57.99 15.04 5.82 17.70 4.54 3.83 78.94 Secondary metabolism FA42CF04 SGN-U578487 violaxanthin de-epoxidase precursor13670 2.09 0.62 0.76 1.47 53.40 4.90 3.15 49.35 1.67 1.51 85.84 Secondary metabolism LA05CB09 SGN-U331971 unknown protein [Arabidopsis thaliana]13550 110.68 7.10 12.61 63.02 51.41 250.97 92.66 32.60 72.95 94.42 100.00 Signal transduction FB02CF04 SGN-U579481 calmodulin cam-20608178 2.82 0.87 0.87 1.80 47.66 1.64 0.73 19.97 1.07 0.69 48.81 Signal transduction FA52DB04 SGN-U340607 transducin family protein / WD-40 repeat family protein02301 2.63 0.87 0.66 1.37 36.08 2.51 1.01 10.61 1.76 0.82 20.38 Signal transduction LC14CH07 SGN-U320785 phototropin 113203 0.35 0.23 0.11 0.16 19.18 0.24 0.44 100.00 0.28 0.24 56.32 Signal transduction LC22CB05 SGN-U330002 WAK-like kinase11226 2.20 0.60 0.67 0.95 18.35 1.54 0.91 43.81 1.58 1.90 100.00 Signal transduction LA15BB05 SGN-U319878 unnamed protein product [Arabidopsis thaliana]00872 3.19 0.85 0.65 0.63 0.00 11.83 1.05 0.00 0.77 0.50 52.35 Signal transduction FA29DD08 SGN-U312762 calmodulin 806914 5.62 2.69 1.36 2.94 37.08 4.62 3.21 41.32 3.72 4.21 100.00 Signal transduction FA18BF06 SGN-U315209 leucine-rich repeat transmembrane protein kinase, putative, receptor-like protein kinase PRK107750 14.85 3.26 3.36 13.13 85.00 3.96 3.25 77.23 4.56 1.94 26.45 Stress response FA57BH08 SGN-U586674 Basic endochitinase B13630 8.15 1.95 4.85 8.30 100.00 6.90 2.96 24.91 5.21 3.75 63.20 Stress response FB14DE08 SGN-U313907 annexin p3412655 100.87 9.75 16.32 87.01 83.61 174.68 88.43 45.34 88.37 90.15 100.00 Stress response FB11AB01 SGN-U314283 late-embryogenesis protein homolog09265 156.14 35.06 18.30 98.80 58.40 53.50 16.16 9.99 46.62 11.31 2.33 Stress response FB03DD03 SGN-U312981 wound-induced protein Sn-1, vacuolar membrane13562 22.73 3.13 4.84 9.36 25.25 18.12 11.06 54.82 6.70 4.95 69.73 Stress response FB02DF11 SGN-U576525 101 kDa heat shock protein: HSP10101671 4.25 4.23 1.29 2.01 24.52 3.04 9.37 100.00 1.42 1.40 0.00 Stress response LB11CC05 SGN-U316987 heat shock protein 17.607296 16.49 7.76 4.11 6.76 21.36 24.97 20.42 65.55 17.15 15.38 80.45 Stress response FA05DH05 SGN-U580022 plastidic aldolase NPALDP112481 5.33 1.10 1.37 1.88 12.98 1.99 1.35 59.51 1.69 1.04 51.38 Stress response FA35BF06 SGN-U315120 putative annexin06739 1.57 0.88 0.46 0.53 6.02 1.13 0.71 16.88 0.88 0.67 47.60 Stress response LA25DE05 SGN-U595625 epoxide hydrolase01069 99.29 30.42 60.26 45.41 0.00 101.46 55.47 34.65 42.67 38.47 85.81 Stress response LA28DG08 SGN-U579165 metallothionein-like protein04017 2.47 0.81 0.74 0.67 0.00 8.41 1.34 0.00 0.81 0.67 74.03 Stress response FA14BB11 SGN-U329263 J-domain protein D303966 2.30 2.85 0.76 1.22 30.15 1.54 1.82 22.63 1.66 1.13 100.00 Stress response LB01DE06 SGN-U318215 putative chaperon P13.912565 11.93 3.04 2.23 6.14 40.31 4.46 3.61 74.26 5.28 3.47 53.93 Transcription factor FB01CC04 SGN-U581473 zinc finger homeobox family protein06060 15.05 4.39 2.28 18.49 100.00 14.64 12.89 83.07 9.83 6.91 57.98 Transcription factor FA27AG03 SGN-U315205 transcription factor factor bZIP29

14896 3.29 1.02 1.48 5.78 100.00 3.99 1.45 7.58 3.41 1.50 18.82 Transcription factor FA36CB01 SGN-U345860 BP887151 Lycopersicon esculentum maturing fruit C2C2(Zn)00770 6.49 1.78 1.65 5.46 78.52 5.21 5.53 100.00 3.99 4.22 100.00 Transcription factor FA26AC12 SGN-U335369 BTB and TAZ domain protein 102997 3.25 1.24 0.77 2.36 64.10 1.65 1.25 60.35 1.49 1.88 100.00 Transcription factor LA24AG09 SGN-U317731 zinc finger protein10265 4.70 0.87 0.94 3.03 55.49 7.00 1.51 3.74 1.70 1.21 65.03 Transcription factor FB12DE06 SGN-U318365 tuber-specific protein07852 12.53 3.31 2.48 5.46 29.63 2.82 3.29 100.00 5.29 2.32 23.86 Transcription factor FB04DG11 SGN-U315629 zinc finger homeobox family protein / ZF-HD homeobox family protein11287 3.64 0.90 1.02 1.36 12.93 3.11 1.42 27.62 1.19 1.13 93.10 Transcription factor LA12BC06 SGN-U314476 transcription factor factor factor Myb107437 11.15 2.02 1.10 1.74 6.37 4.96 2.98 51.34 8.26 2.68 17.49 Transcription factor FA16DD07 SGN-U574472 leucine zipper-containing protein01248 6.29 2.05 2.70 2.12 0.00 2.78 5.46 100.00 2.32 3.36 100.00 Transcription factor FA23AH08 SGN-U313718 histone deacetylase, puta,C2H2(Zn)09774 7.29 7.47 2.33 9.73 100.00 3.06 3.76 0.00 3.55 1.31 100.00 Transport FB10CC08 SGN-U314565 protease inhibitor/seed storage/lipid transfer protein (LTP) family12307 57.65 5.15 7.91 58.10 100.00 126.58 40.04 24.92 59.74 29.82 45.01 Transport LB10AH03 SGN-U329264 ABC1 family protein08272 4.80 1.23 1.37 5.49 100.00 9.05 3.88 23.10 4.35 0.85 0.00 Transport FB17CA12 SGN-U314587 Nonspecific lipid-transfer protein A (NS-LTP A) (Phospholipid transfer protein) (PLTP)10320 2.02 0.45 0.47 1.29 52.60 1.80 1.33 66.61 2.18 1.41 54.37 Transport LA08CG06 SGN-U344627 Potential phospholipid-transporting ATPase 12 (Aminophospholipid flippase 12)12635 71.10 8.04 14.12 37.94 41.81 127.58 52.74 33.85 68.69 47.55 65.30 Transport FB06CF04 SGN-U314257 PPF-1 protein00653 2.74 0.68 0.56 1.20 29.52 1.88 0.92 32.05 1.15 0.67 45.27 Transport LB13AE06 SGN-U314384 lipid transfer protein 207991 4.12 0.94 0.71 0.90 5.50 4.05 1.95 32.88 1.08 1.12 100.00 Transport FA25BH01 SGN-U326592 boron transporter00998 6.89 0.89 0.65 0.70 0.80 19.63 1.62 0.00 0.64 0.67 100.00 Transport FA07AD02 SGN-U317584 cytosolic factor family protein / phosphoglyceride transfer family protein07797 6.88 2.11 2.60 4.28 39.22 4.34 3.21 62.51 5.43 2.58 24.48 Transport FB18DD01 SGN-U577585 ATPase00973 17.59 4.66 4.12 4.02 0.00 14.44 7.11 30.95 9.80 17.11 100.00 unknown FA06DH04 SGN-U579320 Probable peroxisomal (S)-2-hydroxy-acid oxidase 208203 5.55 1.77 3.05 5.87 100.00 4.98 7.73 100.00 2.88 2.82 96.84 Unknown FA53AE03 SGN-U313413 hypothetical protein At2g4617015010 6.94 2.14 2.63 11.18 100.00 7.36 3.55 25.10 3.41 2.30 52.82 Unknown FB02AB08 SGN-U318838 leucine-rich repeat family protein11281 4.32 1.41 1.44 4.60 100.00 3.88 2.21 36.10 3.28 1.80 33.22 Unknown FA01AC12 SGN-U563694 unknown protein 08877 11.11 2.34 3.13 11.93 100.00 5.20 3.19 50.98 4.00 1.85 31.95 Unknown FB08BA05 SGN-U577529 unknown protein 14001 6.09 1.99 2.31 8.32 100.00 7.63 2.92 8.40 5.68 2.28 11.08 Unknown FA42BG09 SGN-U337315 BP887476 Lycopersicon esculentum maturing fruit protein08257 4.40 1.46 1.78 8.66 100.00 8.97 3.28 5.17 5.81 1.82 0.00 Unknown FB17DH05 SGN-U324527 unknown protein00663 2.35 0.63 0.69 2.19 90.26 1.36 1.06 69.58 1.53 0.98 51.13 Unknown LB13AA12 SGN-U312534 C2 domain-containing protein07028 5.98 3.78 1.31 5.51 90.00 6.46 3.28 0.00 6.70 2.80 0.00 Unknown FA24CG03 SGN-U316410 unnamed protein product08669 3.58 1.18 1.71 3.34 86.78 5.95 2.28 7.85 2.28 1.26 33.46 Unknown FB19CB03 SGN-U326729 hypothetical protein T1E3.3010729 3.65 1.19 1.62 3.36 85.94 5.79 2.86 25.02 3.89 2.87 60.92 Unknown FB10AC06 SGN-U318128 expressed protein, weak similarity to Septation ring formation regulator (Swiss-Prot:O34894)08345 5.80 1.35 1.86 5.06 81.22 3.45 4.13 100.00 3.29 1.68 36.24 Unknown FB12CC07 SGN-U317361 unknown protein09657 6.73 2.52 2.05 5.74 78.83 5.32 3.92 58.05 7.44 4.18 30.05 Unknown FB15BG10 SGN-U313797 OSJNBa0093F12.1409302 28.95 3.89 5.48 20.77 65.12 51.58 20.36 30.08 25.79 26.32 100.00 Unknown FB05DA05 SGN-U577595 hypothetical protein12234 4.71 1.35 2.18 3.58 55.13 5.80 3.97 55.77 3.02 2.91 94.87 Unknown FB13DH03 SGN-U312767 BP893782 Lycopersicon esculentum maturing fruit protein 13507 3.36 0.97 1.10 2.30 53.24 1.49 1.12 65.42 1.70 0.81 26.52 Unknown FB16DD03 SGN-U326186 unknown protein14995 59.50 3.62 7.86 29.12 41.17 110.77 37.08 29.16 48.97 47.70 97.25 Unknown FB02BD08 SGN-U326881 senescence-associated protein-related08755 6.45 1.45 2.37 4.04 40.94 5.01 4.57 88.78 6.44 1.59 2.78 Unknown FB02DD06 SGN-U314818 unknown protein06326 2.31 2.41 0.65 1.32 40.27 2.00 2.35 0.00 1.72 4.10 0.00 Unknown FA05AG02 SGN-U320240 unknown protein00683 3.63 0.95 0.84 1.82 35.04 3.15 1.70 37.74 1.67 2.13 100.00 Unknown LB14AF10 SGN-U314509 OSJNBa0093F12.14 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)]13563 16.30 2.30 3.27 7.83 35.00 15.27 8.19 45.98 6.67 4.46 61.42 Unknown LA17BA03 Solanum lycopersicum cv Micro-Tom root Solanum lycopersicum cDNA clone LEFL3168D04 14579 8.73 2.49 5.76 6.71 31.86 6.08 3.48 40.20 5.68 3.06 35.47 Unknown FB10AD12 SGN-U323605 expressed protein09747 11.58 1.43 1.91 4.81 29.94 8.59 3.27 29.29 8.31 2.42 19.10 Unknown FB03DH12 SGN-U317957 unknown protein08390 1.57 0.49 0.43 0.63 17.69 0.91 0.92 100.00 1.00 0.74 62.56 Unknown LA05AD01 SGN-U343416 amine oxidase-related14069 4.46 1.34 0.82 1.43 16.76 2.50 2.15 80.05 1.36 1.66 100.00 Unknown FB09CH10 SGN-U337061 expressed protein09218 2.07 0.52 0.45 0.70 15.12 0.63 0.87 100.00 0.64 0.71 100.00 Unknown FA55AD01 SGN-U345332 maturing fruit protein Solanum lycopersicum 03839 2.39 0.83 0.79 0.95 10.17 1.78 1.40 67.77 1.75 1.37 66.71 Unknown FA35DG05 SGN-U324007 unknown05028 9.84 1.30 1.09 1.85 8.63 9.62 2.67 16.78 5.82 2.62 36.62 Unknown LC01DH10 proline-rich salivary protein05400 3.92 0.83 0.48 0.67 5.66 8.66 4.09 33.00 0.89 1.17 100.00 Unknown FA13BA05 SGN-U324382 P0031D02.12 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] 05120 3.94 0.78 0.45 0.64 5.45 10.12 1.14 0.00 0.77 0.76 98.51 Unknown FA27DG08 SGN-U317447 OSJNBa0068L06.10 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] 05796 2.23 1.07 0.54 0.60 3.36 6.57 0.84 0.00 0.74 0.90 100.00 Unknown FA03CA07 SGN-U331223 phosphate-responsive 1 family protein13631 3.84 0.71 1.00 1.09 3.27 3.70 1.58 29.85 1.87 1.09 48.94 Unknown LA15BD06 SGN-U320601 hypothetical protein T29A15.11013164 4.50 1.49 2.07 2.11 1.99 3.44 1.88 32.24 2.35 1.83 67.23 Unknown FB12AH01 SGN-U325406 unknown protein15104 12.55 3.96 7.31 5.98 0.00 8.12 4.41 33.21 2.06 9.02 100.00 Unknown FB12CH11 SGN-U314344 unknown protein03962 12.16 25.10 4.03 3.40 0.00 7.16 8.82 78.24 7.00 14.39 0.87 Unknown FA13BB06 SGN-U314069 Nascent polypeptide-associated complex subunit alpha-like protein 3

In case where caluculated dependence rate exceeded 100%, it turnd to 100%.

In case where caluculated dependence rate was below 0%, it turnd to 0%.

Ethylene  dependence      Ethylene  dependence

Classifica1on >70% 30%-­‐70% <30% Total >70% 30%-­‐70% <30% Total

Amino  acid  metabolism

up 4 1 2 7 Photo  synthesis

up 0 0 1 1

down 1 1 3 5 down 3 3 17 23

Carbohydrate  metabolism

up 8 1 3 12 Cell  structure

up 2 1 2 5

down 1 0 6 7 down 6 2 8 16

Lipid  metabolism

up 8 2 0 10 Protein  degrada1on

up 2 0 1 3

down 0 0 0 0 down 0 0 1 1

Energy  pathway up 4 1 0 5

Transport up 11 2 3 16

down 0 0 1 1 down 3 2 3 8

Stress  response up 12 2 4 18 Signal  

transduc1on up 7 0 4 11

down 1 1 8 10 down 0 3 3 6

Defense  response

up 6 1 1 8 Transcrip1on  factor

up 6 2 3 11

down 5 2 3 10 down 3 2 4 9

Cell  wall up 5 1 2 8

Other up 8 1 2 11

down 2 2 3 7 down 2 1 10 13

Secondary  metabolism

up 8 2 0 10 Unknown up 55 4 11 70

down 2 2 0 4 down 15 24 30 69

Hormone  related up 14 3 1 18

down 1 2 3 6

Total 84 28 34 146 Total 132 56 85 273

up: upregulated with ripening, down: downregulated with ripening.

Supplementary Table  3.  Func-onal  classifica-on  of  selected  fruit  ripening-­‐associated  genes  and  their  dependence  to  ethylene

Ethylene  dependence      Ethylene  dependence Classifica1on

Dependent Par1ally  

dependent Independent Total Dependent Par1ally  

dependent Independent Total

Amino  acid  metabolism

up 4 1 2 7 Photo  synthesis

up 1 0 1 2

down 1 1 3 5 down 5 4 22 31

Carbohydrate  metabolism

up 9 2 4 15 Cell  structure

up 2 1 2 5

down 1 0 6 7 down 6 1 6 13

Lipid  metabolism

up 11 1 2 14 Protein  degrada1on

up 2 0 1 3

down 0 0 0 0 down 0 1 1 2

Energy  pathway

up 4 1 0 5 Transport

up 12 2 3 17

down 0 0 1 1 down 3 3 3 9

Stress  response

up 14 2 4 20 Signal  transduc1on

up 8 0 4 12

down 2 2 8 12 down 0 4 3 7

Defense  response

up 6 1 1 8 Transcrip1on  factor

up 8 2 3 13

down 6 3 5 14 down 3 3 4 10

Cell  wall up 6 1 2 9

Other up 11 2 3 16

down 2 5 3 10 down 2 5 16 23

Secondary  metabolism

up 9 2 0 11 Unknown up 37 2 9 48

down 2 2 0 4 down 10 12 18 40

Hormone  related

up 15 3 1 19

down 1 2 4 7

Total 203 71 145 419

38

RIN    dependence RIN    dependence

Classifica1on Dependent Par1ally  

dependent Independent Total Dependent Par1ally  

dependent Independent Total

Amino  acid  metabolism

up 5 2 0 7 Photo  

synthesis up 2 0 0 2

down 1 2 1 4 down 7 10 6 23

Carbohydrate  metabolism

up 10 1 0 11 Cell  structure

up 4 1 0 5

down 3 3 0 6 down 5 5 1 11

Lipid  metabolism

up 12 1 0 13 Protein  degrada1on

up 2 0 0 2

down 0 0 0 0 down 2 0 0 2

Energy  pathway

up 3 1 0 4 Transport

up 8 7 0 15

down 1 0 0 1 down 2 4 2 8

Stress  response

up 13 4 0 17 Signal  transduc1on

up 8 3 1 12

down 3 3 2 8 down 2 2 1 5

Defense  response

up 1 1 0 2 Transcrip1on  factor

up 10 2 0 12

down 4 3 3 10 down 3 3 3 9

Cell  wall

up 9 0 0 9 Other

up 7 5 2 14

down 0 4 6 10 down 10 7 3 20

Secondary  metabolism

up 6 1 2 9 Unknown

up 31 10 0 41

down 2 1 1 4 down 11 13 8 32

Hormone  related

up 14 3 4 21

down 2 2 3 7

Total 203 104 49 356

Supplementary  Table  4.  Func-onal  classifica-on  of  selected  fruit  ethylene-­‐regulated  genes  and  their  dependence  to  RIN

up: upregulated at turning stage, down: downregulated at turning stage.

39

NOR    dependence NOR    dependence Classifica1on Dependent Par1ally  

dependent Independent Total Dependent Par1ally  

dependent Independent Total

Amino  acid  metabolism

up 5 2 0 7 Photo  synthesis

up 1 1 0 2

down 6 14 3 23 down 1 2 1 4

Carbohydrate  metabolism

up 9 2 0 11 Cell  structure

up 5 0 0 5

down 1 5 0 6 down 5 4 2 11

Lipid  metabolism

up 11 2 0 13 Protein  degrada1on

up 1 0 1 2

down 0 0 0 0 down 0 0 2 2

Energy  pathway

up 4 0 0 4 Transport

up 10 5 0 15

down 0 0 1 1 down 0 5 3 8

Stress  response

up 13 2 2 17 Signal  transduc1on

up 5 7 0 12

down 1 4 3 8 down 0 2 3 5

Defense  response

up 2 0 0 2 Transcrip1on  factor

up 5 7 0 12

down 2 2 6 10 down 5 1 3 9

Cell  wall

up 9 0 0 9 Other

up 10 4 0 14

down 1 3 6 10 down 4 8 8 20

Secondary  metabolism

up 6 1 2 9 Unknown

up 26 10 5 41

down 1 2 1 4 down 5 15 12 32

Hormone  related

up 11 3 7 21

down 1 4 2 7

Total 166 117 73 356

Supplementary  Table  5.  Func-onal  classifica-on  of  selected  fruit  ethylene-­‐regulated  genes  and  their  dependence  to  NOR

up: upregulated at turning stage, down: downregulated at turning stage.

40

0

1.0

2.0

3.0

1-MCP

MG Turning Pink

Ethylene Production (nl/g/h)

Cont

1-MCP

Fig. 1. Effect of 1-MCP treatment on ethylene production Vertical bars represent SE (n=6).

41

Fig. 2 Ethylene dependence of ripening associated genes Ethylene dependent: ethylene dependence rate > 70% Ethylene partially dependent: 70%> ethylene dependence rate > 30% Ethylene independent: 30% > ethylene dependence rate or turning specific change

Ethylene  Dependent  159  genes  (71%)  

Ethylene  Par8ally  

Dependent  23  genes  (10%)  

Ethylene  Independent  42  genes  (19%)  

A: Up-regulated during ripening

Ethylene  Dependent  45  genes  (23%)  

Ethylene  Par8ally  

Dependent  47  genes  (24%)  

Ethylene  Independent  103  genes  (53%)  

195 genes

B: Down-regulated during ripening

42

Fig.3 RIN dependence of ripening associated genes RIN dependent: RIN dependence rate > 70% RIN partially dependent: 70%> RIN dependence rate > 30% RIN independent: 30% > RIN dependence rate

RIN-­‐Dependent  143  genes  (74%)  

RIN-­‐Par8ally  dependent  42  genes  (22%)  

RIN-­‐Independent  9  genes  (4%)  

RIN-­‐Dependent  72  genes  (45%)  

RIN-­‐Par8ally  dependent  60  genes  (38%)  

RIN-­‐Independent  27  genes  (17%)  

159 genes

A: Up-regulated at turning stage

B: Down-regulated at turning stage

43

Fig.4 NOR dependence of ripening associated genes NOR dependent: NOR dependence rate > 70% NOR partially dependent: 70%> NOR dependence rate > 30% NOR independent: 30% > NOR dependence rate

NOR-­‐Dependent  140  genes  (72%)  

NOR-­‐Par8ally  dependent  42  genes  (22%)  

NOR-­‐Independent  12  genes  (6%)  

NOR-­‐Dependent  38  genes  (24%)  

NOR-­‐Par8ally  

dependent  63  genes  (40%)  

NOR-­‐Independent  58  genes  (36%)  

159 genes

A: Up-regulated at turning stage

B: Down-regulated at turning stage

44

0  

5  

10  ACS2  (ACC  synthase)

(SGN-­‐U316692)    

0  1  2  3  4  5  

ACS4  (ACC  synthase) (SGN-­‐U317952)    

0

10

20

30

40 ACO1  (ACC  oxidase) (SGN-­‐U314592)    

0  

5  

10  ETR4  (ethylene  receptor)

(SGN-­‐U315568)    

0 1 2 3 4 5

EBF1  (EIN3-­‐binding  F-­‐box  protein)  

(SGN-­‐U315243)    

0  5  

10  15  20  

SAM  (S-­‐adenosyl-­‐L-­‐methionine  synthetase)  

(SGN-­‐U312527)    

0  

5  

10  

beta-­‐cyanoalanine  synthase  like  protein  

(SGN-­‐U314204)    

0  

50  

100  

150  

E8  (1-­‐aminocyclopropane-­‐1-­‐carboxylate  oxidase  homolog)  

(SGN-­‐U314506)    

0 10 20 30 40

E4  (pepJde  methionine  sulfoxide  reductase)  (SGN-­‐U312568)    

Rel

ativ

e ex

pres

sion

Rel

ativ

e ex

pres

sion

Rel

ativ

e ex

pres

sion

C E

rin

C E

nor

C E

rin

C E

nor

C E

rin

C E

nor

Fig.5. Expression profiles for selected ripening-associated genes involved in ethylene biosynthesis and signaling Vertical bars represent ±SE (n=3) MG: mature green (harvested at 35 days after anthesis.), Tur: turning, Pink: pink, MCP: fruit treated with 1-MCP at turning stage, then stored for 3 days, equivalent to pink stage. MG – MCP represent expression in wild-type fruit. Ripening-impaired mutant fruit, rin and nor were harvested at 35 days after anthesis and stored for 2 days in air (C: control) or 1000 µL L-1 ethylene (E).

45

0  

10  

20  

30  

jasmonic  acid  2  (SGN-­‐U317043)  

0  1  2  3  4  5  

gibberellin  20-­‐oxidase-­‐1:  20ox-­‐1  

(SGN-­‐U322646)    

0  

5  

10  

 salicylic  acid-­‐binding  protein  2  

(SGN-­‐U315921)    

0  5  10  15  20  25  

putaJve  short-­‐chain  type  alcohol  dehydrogenase  

(SGN-­‐U313474)    

C E

rin

C E

nor

C E

rin

C E

nor

Rel

ativ

e ex

pres

sion

Rel

ativ

e ex

pres

sion

C E

rin

C E

nor

Fig.6. Expression profiles for selected ripening-associated genes involved in plant hormone and stress response See legends in Figure 5.

46

0  

5  

10  

fructose-­‐bisphosphate  aldolase  

(SGN-­‐U338580)  

0  

5  

10  

15  

20  

fructose-­‐1,6-­‐bisphosphatase    (SGN-­‐U312507)    

0  

5  

10  putaJve  pyruvate  kinase  

(SGN-­‐U313639)    

0  

5  

10  phosphoenolpyruvate  

carboxykinase    (SGN-­‐U315793)    

0  

5  

10  aldehyde  dehydrogenase  

(NAD+)  (SGN-­‐U314223)    

0  1  2  3  4  5  

malate  dehydrogenase  (SGN-­‐U317062)    

0  

10  

20  

30  

40  isocitrate  dehydrogenase  

 (SGN-­‐U315486)    

0  

40  

80  

120  

160  

beta-­‐fructofuranosidase:  vaculolar  invertase    (SGN-­‐U338936)    

0  

10  

20  

30  

40  

ATP  synthase  beta  subunit  (SGN-­‐U313361)    

Fig.7. Expression profiles for selected ripening-associated genes involved in glycolysis and TCA cycle See legends in Figure 5.

Rel

ativ

e ex

pres

sion

Rel

ativ

e ex

pres

sion

Rel

ativ

e ex

pres

sion

C E

rin

C E

nor

C E

rin

C E

nor

C E

rin

C E

nor

47

0 20 40 60 80

putaJve  glycerol-­‐3-­‐phosphate  dehydrogenase  

(SGN-­‐U321518)  

0 10 20 30 40

triacylglycerol/steryl  ester  lipase-­‐like  protein  (SGN-­‐U318160)    

0 20 40 60 80

100

3-­‐hydroxyisobutyryl-­‐coenzyme    A  hydrolase-­‐like  protein  

(SGN-­‐U317489)    

Lipid metabolism related genes

0 15 30 45 60 75

CER1  protein  (SGN-­‐U313979)  

0 5

10 15 20

cytochrome  P450-­‐dependent  faZy  acid  hydroxylase  

(SGN-­‐U315299)    

Rel

ativ

e ex

pres

sion

Rel

ativ

e ex

pres

sion

C E

rin

C E

nor

C E

rin

C E

nor

Fig.8. Expression profiles for selected ripening-associated genes involved in lipid metabolism See legends in Figure 5.

C E

rin

C E

nor

0  

25  

50  

75  

LOX  (Lipoxygenase)      (SGN-­‐U338822)  

48

0  

10  

20  

30  

40  PG2a  (polygalacturonase)

(SGN-­‐U312703)    

0  10  20  30  40  50  

PL  (pectate-­‐lyase)  (SGN-­‐U333541)    

0  

5  

10  

15  

20  mannan  endo-­‐1,4-­‐beta-­‐

mannosidase  (SGN-­‐U313742)    

0  

5  

10  

membrane-­‐anchored    endo-­‐1,4-­‐beta-­‐glucanase  

(SGN-­‐U571690)    

0  

5  

10  

polygalacturonase  isoenzyme  1  beta  (SGN-­‐U313432)    

Rel

ativ

e ex

pres

sion

Rel

ativ

e ex

pres

sion

0

5

10

15

20 phytoene  synthase  (SGN-­‐U314887)    

0  

5  

10  

15  alcohol  acyl  transferase  

(SGN-­‐U312515)    

0  

5  

10  

15  

putaJve  flavonol  synthase  (SGN-­‐U316234)    

0 5

10 15 20 25

violaxanthin  de-­‐epoxidaseprecursor  (SGN-­‐U578487)    

Rel

ativ

e ex

pres

sion

C E

rin

C E

nor

C E

rin

C E

nor

C E

rin

C E

nor

Rel

ativ

e ex

pres

sion

Fig.9. Expression profiles for selected ripening-associated genes involved in cell wall modification and secondary metabolism See legends in Figure 5.

0  

5  

10  

15  Expansin  18  

(SGN-­‐U578487)  

49

0  

5  

10  Chlorophyll  a-­‐b  

bindingprotein  25  (SGN-­‐U313221)    

0 5

10 15 20 25

Chlorophyll  a-­‐b  binding  protein  3C  

(SGN-­‐U313214)    

0  

5  

10  

15  

light  harvesJng  chlorophyll  a/b-­‐binding  protein  (SGN-­‐U579213)    

0  

5  

10  

15  

20  Chlorophyll  a-­‐b  binding  

protein  1B  (SGN-­‐U313210)    

0 20 40 60 80

putaJve  chloroplast  thiazole  biosyntheJc  protein  

(SGN-­‐U333806)    

0

5

10

Phosphoenolpyruvate  carboxylase  

(SGN-­‐U317854)    

C E

rin

C E

nor

C E

rin

C E

nor

C E

rin

C E

nor

Rel

ativ

e ex

pres

sion

Rel

ativ

e ex

pres

sion

Fig.10. Expression profiles for selected ripening-associated genes involved in photosynthesis See legends in Figure 5.

50

0

5

10

15

MADS-­‐RIN  (SGN-­‐U338727)    

0

5

10

15 GRAS  

(SGN-­‐U318410)    

0  

50  

100  

150  

S-­‐adenosyl-­‐L-­‐homocysteine  hydrolase  

(SGN-­‐U314915)  

0 40 80

120 160

BNK1 (putaJve  protein  serine/threonine  kinase)  

(SGN-­‐U320508)    

0 5

10 15 20 25

 bZip  (SGN-­‐U315205)  

0  

5  

10  

15  

leucine  zipper-­‐containing  protein  

(SGN-­‐U574472)    

0  

5  

10  

15  

 BTB  and  TAZ  domain  protein  1  

(SGN-­‐U335369)  

0

5

10

15 ARF  (auxin  response  factor)  

(SGN-­‐U314233)    

C E

rin

C E

nor

C E

rin

C E

nor C E

rin

C E

nor

Rel

ativ

e ex

pres

sion

Rel

ativ

e ex

pres

sion

Rel

ativ

e ex

pres

sion

0

5

10

15

TDR4  (MADS  box  protein  )  (SGN-­‐U334387)    

Fig.11. Expression profiles for selected ripening-associated genes involved in transcription factors and signal transduction See legends in Figure 5.

51

52

第三章 ジーンサイレンシング(VIGS)と形質転換による

成熟関連転写因子の機能解析

植物に RNAウイルスが感染すると、その防御応答としてゲノム RNAの複製型 2本鎖RNAあるいはゲノムRNA内で部分的に形成された 2次構造がRNase III-type dsRNA endonuclease活性を持つ Dicer-like enzyme(DCL)により 20数塩基の siRNA (small interfering RNA)に切断される(Lu et al., 2003)。これらのウイルスゲノム配列由来の siRNA は RNA-induced silencing complexes (RISC)に取り込まれ、siRNA と相補的な配列を持つ標的 RNA（ウイルスゲノム RNA）を RISCが分解する(Purkayastha and Dasgupta, 2009)。RNA干渉(RNA interference： RNAi)とは、21塩基程度の二本鎖 RNA(siRNA)が、その塩基配列と相補的な配列をもつメッセンジャーRNA(mRNA)の全長を分解し、その標的となる遺伝子の発現を抑制する現象である。この RNA干渉は遺伝子機能抑制法として広く利用され、生物学研究の有力な研究手法となっている。

microRNA(miRNA)は内在的に存在する約 22塩基程度の短い RNAであり、多くの場合、miRNAの前駆体が不完全な二本鎖を形成している。ジーンサイレンシングのうち転写後に起こる発現抑制では二本鎖 RNA が重要な役割を果たしている。外来遺伝子の mRNAの一部が二本鎖を形成すると RNA依存 RNAポリメラーゼにより二本鎖 RNAが合成される。二本鎖 RNAは細胞内のヌクレアーゼにより 21~25 ヌクレオチドに断片化される。その短い RNA がガイドとなり、標的mRNAの特異的な分解または翻訳阻害が起こる。その二本鎖 RNAを介した転写後抑制(RNAi)は、アカパンカビ、線虫、マウスなど真核生物に広く見られる現象である。植物では、転写後のジーンサイレンシングのメカニズム

は二本鎖 RNA を中間体として増殖するウイルスに対する防御機構として進化したと考えられている。このようなメカニズムを応用して、特定のmRNAと同じ配列を持つ短い二本鎖 RNA を細胞や個体に導入するかまたは発現させることで、そのmRNAの機能を特異的に抑制することでできる。 一般的なクローン化に、最も広く、我々の研究の中にも使われている宿主が

大腸菌 E. coliである。遺伝子を宿主の細胞に導入するための“運び屋”をアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)を介して植物に導入することができる。VIGS(Virus-induced gene silencing)用に構築されたウイルスベクター（VIGSウイルスベクター）に植物遺伝子の一部を連結し、これを植物に感染させると、上で述べたようにRNAサイレンシング機構が誘導されてウイルスRNAが RISC の標的になると同時に、ベクター内に連結されていた植物遺伝子配列に相同な植物mRNA が分解されるため、そのターゲット遺伝子の発現は特異的

53

にノックダウンされることになる(Purkayastha and Dasgupta, 2009)。 “VIGS”という術語は最初に van Kammen 氏がウイルス感染後の回復という現象を記述したきっかけとなった(van Kammen. 1997)。初めての RNAウイルスはタバコモザイクウイルス(Tobacco mosaic virus; TMV)をサイレンシングベクターとして用いた。初期の研究は VIGS 法を主に野生型タバコ(Nicotiana benthamiana)を対象に進められた。タバコの利用はウイルス感染に対して感受性が高く、VIGSによるノックダウンの表現型が現れやすいという特性によるものであった(Godge et al., 2008)。トマトでの研究では、タバコラットルウイルス(tobacco rattle virus; TRV)が安定的に VIGSを誘導できるベクターとして用いられた(Liu et al., 2002)。植物体に対して遺伝子機能解析のため、よく使われているほかの VIGS ベクターはジャガイモウイルス X(potato virus X)(Faivre-Rampant et al., 2004)およびムギ斑葉モザイクウイルス(barley stripe mosaic virus)(Holzberg et al., 2002)などである。VIGSウイルスベクターに必要とされる条件は 4つある：①植物に対する病原性が弱いこと(標的遺伝子のノックダウンによる表現型が明確に識別できるようにウイルス感染の影響

が無いこと)②感染植物に均一に全身感染すること③安定した(効率的な)接種法が確立していること④農作物においては栄養生長期の茎葉だけではなく収穫物

となる果実や種子の解析も重要であるため、長期間にわたって遺伝的に安定な

ことなどが挙げられる。 VIGS法は遺伝的に形質転換するのではなく、標的遺伝子配列の一部を VIGS 用ウイルスベクターに連結し、迅速かつは選択的な遺伝子ノックアウトによっ

てターゲット遺伝子発現を抑制する特徴を持つ、宿主から一部の配列を運んで

きた組換え型のウイルスを植物体に感染させる(Liu et al., 2002)。理論的には、その後ウイルスが植物の全体に拡散し、ウイルスのベクター(VIGS-vector)を持つインサートと対応する植物内生のホモログ転写をジーンサイレンシング

(post-transcriptional silencing; PTGS)によって低下させ、その遺伝子の植物体内での発現および生理機能を抑制することができる(Baulcombe, 1999)。VIGS法は遺伝子の機能分析手法として、ベンサミアナタバコ(Ratcliff et al., 2001; Liu et al., 2004)、シロイヌナズナ(Turnage et al., 2002)、トマト(Liu et al., 2002)、オオムギ(Holzberg et al., 2002)、コショウ(Chung et al., 2004)、ジャガイモ (Brigneti et al., 2004; Faivre-Rampant et al., 2004)、マメ科植物(Constantin et al., 2004)、キャッサバ(Fofana et al., 2004)、ペチュニア(Chen et al., 2004b)などで利用されている。 本研究では成熟関連転写因子の機能解析を行うために、カリフラワーモザイ

クウイルス 35Sプロモーターを用いたウイルスゲノムの感染性 cDNAクローンを構築した。さらに、35Sプロモーターと Tiプラスミドを用いて、プラスミド

54

を含む Rhizobium radiobacter 培養液をインフィルトレーション法などで直接植物の葉や根に導入し、ウイルスを感染させた。

材料および方法

【実験１ シーケンス確認解析】

トマトマクロアレイにより選び出した成熟関連転写因子である bZip, S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, BTB, GRASについて、かずさ DNA研究所から入手した cDNA プラスミドを大腸菌に形質転換し、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systemを用い、Big Dye XTerminator Kitによるシークエンス反応および DNA精製を行い、シーケンス解析によって確認した。

【実験 2 VIGS法による遺伝子機能解析】 ポジティブコントロールとして PDS, LeEIL, ネガティブコントロールとしてGUSを用い、成熟関連転写因子bZip, S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, BTB, GRASの VIGS実験を行った。 果実での VIGS実験では、Micro-Tomおよび野生型 Ailsa Craigトマトを用い、果実開花 20日後の果実にインジェクションを行った。作成した菌液は針付注射器を用いトマト果実の赤道部に Agroinjectionを行い、果実の反応による表現型を調査した。また、追熟実験では、開花 20日の Ailsa Craigトマトを収穫し、果実赤道面 4カ所に Agroinjectionを行い、室温で追熟させ、成熟様相を観察した。 成熟関連転写因子遺伝子の VIGS サイレンシングは効果が不明確な面もあるため、Micro-Tomトマトを用い、発芽約 2週間後葉への VIGS Agroinjectionも行った。 インジェクションへの準備について、作成しておいたグリセロールストック

を 20μl取り、LBプレートにまき、30℃で 4日間インキュベートした。菌を 2～3cm2程度取り、Induction Medium (I. M)液に懸濁し、OD 2.0に調整した液を作成した。この Injection液を室温で 2時間以上振とう培養した。VIGSベクターpTRV2(ターゲット遺伝子の塩基配列を含む)とpTRV1を持つアグロバクテリウムを 1：1の割合で混ぜ合わせた。 【VIGSに用いた pTRV2コンストラクト】

LeEILs forward: 5-GTG GAGGGA TCG AATG-3 reverse: 5-TAC CGC CGT CAG AACA-3

55

fragment size: 478 bp GUS forward: 5-GATGAAACTGCTGCTGTCGG-3 reverse: 5-ATCCGGTTCGTTGGCAATAC-3 fragment size: 198 bp GRAS クローン名: FA16DF12 forward: 5-GGAGACCACAAGTTCC-3 reverse: 5-TATGTCGCGAGACGAAAGTG-3 fragment size: 260 bp bZIP クローン名: FA27AG03 forward: TTGCAGACTGAAGCAACCAC reverse: AACTTGGAAGCGTCTGCACT fragment size: 212 bp BTB クローン名: LA12CD06 forward: 5-CCGCAGCTGAAACAGAGATG-3 reverse: 5-AACAATCCATCGCTTCGCTT-3 fragment size: 310 bp S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase クローン名: FA15AC11 forward: 5-AGTGCTGCTGTCTTTGCCTG-3 reverse: 5-GGGATCTGGGACTGTTCCATT-3 fragment size: 192 bp 【VIGSコンストラクト作成】 【プライマーのリン酸化】 Primer (50μM) 各 3.5μl H2O 7μl 10×protruding Forward Kinase Buffer 2μl 10mM rATP 2μl T4 Polynucleotide kinase 2μl Total 50μl 37℃, 1h反応 95℃, 5min (T4 Polynucleotide kinaseを失活) 5μMに調整 PCRによる増殖

56

【PCRによりプライマー配列の増殖】 H2O 12.2μl 5×buffer 4μl

dNTP 1.6μl リン酸化プライマー(5μM) 1μl cDNA 1μl primer star 0.2μl Total 20μl

PCR条件 95℃, 5min 95℃, 15sec 60℃, 25sec 32 cycle 68℃, 8min

10℃

【DNA Ligation】 プラスミドベクター pTRV2 1μl PCR産物 1μl H2O 3μl Solution 1 5μl Total 10μl 16℃, 30min～1h インキュベート

【アグロバクテリウムの形質転換】 アグロバクテリウム(LBA4404, C58)を YEP プレートにストリークし、28℃で 2日間置いてコロニーを形成させ コロニーを突いて 50mlの YEP培地に加え

28℃で一晩振とう培養する OD 値 0.5 前後の培養液を 50ml チューブに移し、氷上で 10min インキュベートする 遠心(4000rpm, 4℃, 5min)し、上澄みを捨て 沈殿を冷やした 20mM CaCl2懸濁し、1.5mlチューブに 100μlずつ分注する

57

菌の懸濁液に 0.5μgのVIGSベクターpTRV2プラスミドDNAを入れる 液体窒素中で迅速に凍結させ 37℃のウォーターバス中で 5minインキュベートして融解する 各チューブに室温に置いておいた YEP培地を 1ml加え、28℃で 2h振とう培養する 遠心(4000rpm, 5min)した後、900μl の上澄み液を捨て、残りの上澄みに菌液を懸濁する 50mg/Lカナマイシンと YEPプレート培地に広げる 28℃で 2日間静置し、コロニーを確認し、4℃に移す

使用するまでグリセロールストックにして保存した（菌液:50%グリセロール＝7:3）

【インジェクションへの準備】 作成しておいたグリセロールストックを 20μl 採り YEP プレートにまき30℃で 4日間インキュベートする 菌を 1cm2程度取り、Induction Medium(I.M)液に懸濁し、OD値 2.0に調整する 作成した Injection液を室温で 2～4h振とう培養する VIGSベクターpTRV2と pTRV1(ウィルスの複製と細胞間移動に必要な情報を含む)を持つアグロバクテリウムを 1:1の割合で混ぜ合わせる

【Infiltration Mediumの作成法】 1M MgCl2 0.5ml 0.5M MES-KOH 1ml 200mM アセトシリンゴン 5μl SDW 48.495ml Total 50ml

結果および考察

植物における VIGSウイルスベクターの最初の報告は、1995年にタバコモザイクウイルス (TMV)ベクターを用いたベンサミアーナタバコ (Nicotiana benthamiana)において phytoene desaturase(PDS)遺伝子の発現が抑制され、植物体が光退色した表現型が示されたことである(Kumagai et al., 1995)。TIGR(The Institute of Genomic Research)のデータベースでは、100,000個以上トマトの EST に応じて、29,000 個ユニーク配列のクローン(Uni ESTs)が登

58

録されている。伝統的な手法でトマトの EST配列を pTRV2ベクターに挿入するのは大量の作業と時間をかかるため、GATEWAY システム(Invitrogen, CA, USA)を用いた方法では、制限酵素およびライゲーションを処理せず、迅速・簡易にひとまとめに(en masse; エンマッセコンベヤ)Uni EST らのクローンがpTRV2のベクターに入り込むことができ、トマトの機能が迅速な分析を可能になると報告されている(Liu et al., 2002)。我々はこの GATEWAYシステムを用いて VIGS実験を行った。 最初の実験では、TRV-RNA1(pTRV1)と T-DNA コンストラクトを導入した

TRV-RNA2(pTRV2)を 1:1 の比率で混和したアグロバクテリウム培養液を注射器を用い、発芽約 3 週間後のマイクロトムトマト(‘L. esculentum cultivar’; Micro-tom)の若葉に注入した。pTRV2はターゲット遺伝子の塩基配列が入ったコンストラクトを含む菌液である。導入した遺伝子フラグメントごとにそれぞ

れの対応する遺伝子の機能を調査できる。 β -グルクロニダーゼ (β -glucuronidase; GUS)遺伝子は最初大腸菌

(Escherichia coli)から単離され(Jefferson et al., 1986; Kim et al., 2006)、様々なバクテリアにおいてもその存在が確認された(Jefferson and Mayer, 2003)が、広い範囲の高等植物においてはこの酵素の内生活性が検出できなかった

(Jefferson et al., 1987)。植物研究にこの酵素遺伝子を用いる際の第１に有利な点は、アミノ基末端に大きな断片付加を行っても、翻訳産物が酵素活性を失わ

ない点である。また、もう１つの有利な点は、広い範囲のグルコロナイドのグ

リコサイド結合を加水分解することが可能であり、この広い基質許容性が遺伝

子発現パターンの量的、質的評価に適している(Naleway, 1992)。これらの技術上の利点があるため、GUS遺伝子はレポーター遺伝子として植物のバイオロジー研究において広範に用いられている(Kim et al., 2006)。今回の実験では GUS遺伝子をネガティブコントロールとして用いた。GUS遺伝子を導入したトマト果実は着色遅れが観察され、アグロバクテリウムの繁殖のみによっても、見か

けの成熟遅延が現れることが明らかになった。したがって、導入遺伝子の効果

を見るためにはネガティブコントロールの GUS 区と比較する必要があることが示された(Fig. 13)。ただし、以前のトマトの葉および果実に TRVウイルスのみの注入実験で、LeACS2 がサイレンシングされたトマト果実では明らかな着色および成熟の抑制の表現型を示した一方で、TRV のみを注入された果実では野生型トマト果実と同じような着色を起ったことを報告された(Fu et al., 2005)ため、今回の実験では、TRV のみの注入実験は省略した。また、水のみを処理した果実では処理の影響は見られず正常に成熟し、果実への処理によるストレ

スが原因で成熟促進されることは少ないことが確認された(data not shown)。カロテノイド生合成に関わるPDS遺伝子(phytoene desaturase gene; フィトエン

59

不飽和化酵素)発現がノックダウンされると、組織が白色化し VIGS効果を視覚的に確認できるため、今回の研究で VIGS の有効性の判断のためにポジティブコントロールとして用いた。トマトの PDS 遺伝子(pTRV2-tPDS)を含む混和したアグロバクテリウム培養液を葉に接種したトマトにおいて葉や花組織に白化

部位が見られ、一部の果実でも未熟段階で局部的な白化部位が見られた(Fig. 12)。また、PDSをサイレンシングされた部位を持つ 4つの果実は成熟が進行しても(開花後約 60 日)その部分がオレンジ色を呈していた(Fig. 12)。 アレイ解析より、GRASと SAHHは果実成熟の転写因子および信号伝達因子に属し、ポジティブレギュレーターとして、bZIP, BTB はネガティブレギュレーターとしての役割を持っていることが示唆された。今回の VIGS 実験のターゲット遺伝子は、GRAS, bZIP, SAHH(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase)と BTB とした。これらの遺伝子の機能について現在のところ明確ではないが、第 2 章で述べたように、GRAS は、植物特異的な転写因子ファミリーに属しており、植物の成長発育やジベレリンシグナル伝達、光シグナル伝達などに関与

しているとされている(Lee et al., 2008)。若葉より GRAS遺伝子配列を導入したマイクロトムトマトはいくつかの果実において、開花 60日目の果実写真(Fig. 13)で示されるように、局部的な成熟遅延が観察され、果実着色がやや抑制される傾向が示された。転写因子 bZIP(basic leucine zipper)ファミリーは真核生物において重要な生理プロセスを制御していると考えられている(Corrêa et al., 2008)。bZIP は病原抵抗性や光およびストレスシグナル伝達、光形態形成、種子成熟、花の発達、エネルギーの恒常性維持などの主な生育および生理過程を

関与していると指摘されている(Jakoby et al., 2002; Corrêa et al., 2008)。SAHH(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase; S-アデノシル-L-ホモシステインヒドロラーゼ)遺伝子をアンチセンスによって作成した形質転換体タバコは花の形態形成がコントロールと比べ、異なった表現型を示した。この形質転換で

は、この酵素をコードする遺伝子の発現変化によって起った DNAの低メチル化が関与し、サイトカイニンの生成量を上昇させたと推測されている(Tanaka et al., 1997)。また、SAHH遺伝子抑制により開花の遅れ、葉の肥大、種子収量の増加が報告されている(Godge et al., 2008)。しかし、今回の SAHH 遺伝子のVIGS実験では、顕著な効果は見られなかった(Fig. 13―SAHH fruit of dpa60)。bZIP および BTB の VIGS 実験ではわずかに着色早まる傾向が見られたが、ネガティブコントロールの GUS 遺伝子の導入効果と大きく差が見られなかった(Fig. 13)。 植物体の幼果(授粉から10日後)にTRVベクターを注射することによってより効率的にサイレンシングを起こったと報告されている(Fu et al., 2005)。第 2段階の実験では、TRV-RNA1(pTRV1)と T-DNA コンストラクトを導入した

60

TRV-RNA2(pTRV2)を 1:1 の比率で混和したアグロバクテリウム培養液が注射器を用い、樹上で開花 20日の未熟野生型トマト(Ailsa Crag)果実に注入した。EIN3は、エチレン信号伝達系の下流に位置する転写因子であり、そのホモログである LeEIL1，LeEIL2，LeEIL3，LeEIL4はエチレン信号転達経路の中でポジティブレギュレーターとして働いている(Tieman et al., 2001)。LeEILsの発現を抑制された形質転換体トマトは、葉の上偏生長や花の器官脱離果実着色お

よび老化が遅延し、エチレンに対する非感受性の表現型を示し、果実の成熟も

顕著に抑制された(Tieman et al., 2001; Chen et al., 2004a)。我々の研究室で育成した LeEILsを抑制した形質転換体(Ri:EIL)も、果実でのエチレン生成量が低く、自己触媒的な増加を示さなかった。また、エチレン処理を行っても応答性

をほとんど示さず、果実着色および花の老化が顕著に抑制された(Yokotani et al., 2004)。LeEILs についての VIGS 実験を行ったところ、果実の着色および成熟を顕著に抑制された。したがって、LeEILs遺伝子がトマト果実の成熟にとって必須である指摘を支持した(Fu et al., 2005)。これらのことから、今回のVIGS実験ではLeEILs遺伝子もトマト果実のポジティブコントロールとして用いた。LeEILs をサイレンシングさせた果実では、ほぼすべて(4 つの果実)で、開花 60日後にしても顕著的な着色抑制が見られ、その抑制はコントロール果実(野生型トマト)が成熟に伴い赤くなった時点でも長く続き、効果的な成熟抑制を導いたことを示した(Fig. 14)。また、ポジティブコントロールとした PDS区でも果実の着色を顕著に抑制され、4つの異なる果実では青い丸で示した接種部位周辺が開花 50日後でも赤化せずオレンジ色を呈していた(Fig. 15)。一方、BTB, bZIP区では着色がわずかに早まる傾向が見られた一方で、GRAS区では一部の果実の表現型に局部的な成熟および着色遅延が観察された(Fig. 16)。 また、第 3段階の実験は、野生型トマト果実開花後 20日に収穫し、室温で追熟させ、遺伝子を導入したアグロバクテリウムを果実赤道面４カ所に感染し、

その成熟様相を観察した。処理後 20日の様子を見ると、EIL区では GUS区と比較して、接種部位に顕著な着色抑制が見られ、GRASおよび PDS区でも着色遅延が見られた(Fig. 17)。一方、BTB, bZipでは、わずかに着色早まる傾向が見られた(Fig. 17)。そして、観察が実験後約 2ケ月を続いたところ、いずれの遺伝子の VIGS効果でも処理後 50日(開花後 70日)長時間維持した(Fig. 18̶20)。 いくつかの成熟に関連した表現型が確認でき、これらの遺伝子については

PCR によって定量的な確認および調査、または恒常的に遺伝子発現を抑制した形質転換体を作成しさらなる表現型の調査を進める必要があると考える。

まとめ

61

GRAS、 bZIP、 BNK1 と BTB などの転写因子および信号伝達関連因子は今回の結果より、エチレンまたは RINと NOR信号伝達系の下流に位置することが示唆された。さらに、ポジティブレギュレーターとして GRAS と SAHH、ネガティブレギュレーターとして bZIP と BTB を想定して、VIGS 法による機能解析によって、GRAS 遺伝子を導入した個体では、果実着色がやや抑制される傾向が示され、この転写因子が成熟制御の一翼を担っていることが示唆され

た。 今後、恒常的に遺伝子発現を抑制した形質転換体を作成しさらなる表現型の

調査を進めることが期待される。

62

PDS(flower) PDS(fruit of dpa30)

PDS(fruit of dpa60) PDS(fruit of dpa60)

PDS(fruit of dpa60) PDS(fruit of dpa60)

Fig. 12 Color changes by inhibition of PDS gene by VIGS

63

GUS(fruit of dpa60) GRAS(fruit of dpa60)

EIL (fruit of dpa60)

S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase(fruit of dpa60)

BTB(fruit of dpa60) bZIP(fruit of dpa60)

Fig. 13 Phenotype in fruit treated with VIGS to inhibit several candidates for ripening related transcription factor

64

EIL EIL

EIL EIL

GUS GUS

(3 weeks after treated)

Fig. 14 Color changes by inhibition of selected genes by VIGS —Positive control

65

PDS PDS

PDS PDS

S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase (3 weeks after treated)

Fig. 15 Phenotype in fruit treated with VIGS to inhibit several candidates for ripening related transcription factor

66

GRAS GRAS

BTB BTB

bZIP bZIP

(3 weeks after treated)

Fig. 16 Phenotype in fruit treated with VIGS to inhibit several candidates for ripening related transcription factor

67

Fig. 17 Phenotype in fruit treated with VIGS to inhibit several

candidates for ripening related transcription factor —20 days after treated

68

Fig. 18 Phenotype in fruit treated with VIGS to inhibit several

candidates for ripening related transcription factor —30 days after treated

69

Fig. 19 Phenotype in fruit treated with VIGS to inhibit several

candidates for ripening related transcription factor —40 days after treated

70

Fig. 20 Phenotype in fruit treated with VIGS to inhibit several candidates for ripening related transcription factor

—50 days after treated

71

第四章 摘 要

トマトはエチレンの作用によって成熟する代表的なクライマクテリック型果

実であり、その果実成熟は顕著なエチレン依存性を示す。トマト成熟不全変異

体 rinや norの解析から LeMADS-RINや NORなど、エチレン以外にも成熟現象に必須の因子も知られている。したがって、MADS 等のエチレン信号伝達とは独立した因子も成熟制御に重要であることが示されている。すなわち、成熟

現象は多様な成分の代謝を担う多数の成熟関連遺伝子がエチレンや

LeMADS-RIN信号伝達系によって巧妙に制御されていると考えられている。しかしながら、成熟関連遺伝子がどれくらい存在し、その内のどれだけがエチレ

ンまたは RIN遺伝子に直接支配されているかは明らかでない。最近、トマトが果実研究のモデル植物として取り上げられ、ゲノムプロジェクトや国際的共同

研究が進んでおり、トマトゲノム配列ベータベースが整備、公開された。最近

では、多数の ESTクローンの解析に基づいたマイクロアレイやマクロアレイ解析や簡易に遺伝子機能解析ができる VIGS(Virus Induced Gene Silencing)技術も開発され、普及してきた。

本研究では、トマト果実の成熟生理、特にエチレン生合成制御について解析

を進めるため、エチレン作用阻害剤 1-MCP(1-methylcyclopropen)処理および成熟不全変異体 rin、 norトマト、かずさ DNA研究所開発した DNAマクロアレイ技術を用いて、約 11520 遺伝子を網羅的に解析した。これに基づいて、成熟関連遺伝子をスクリーニングし、それらのエチレン、RIN、NOR因子への依存性を調査するとともに、エチレン信号伝達系の EIN3 よりも下流に位置する転写因子を抽出した。マクロアレイを用いて成熟関連遺伝子の抽出と特性解析を

行ったところ、成熟に伴って発現パターンが顕著に変化する 419 個の成熟関連遺伝子を特定した。これらは、成熟に伴い 3倍以上増加した遺伝子 224個、1/3以下減少した遺伝子 195 個から構成されている。トマト果実成熟開始時に1-MCP処理によって成熟に伴い増加した遺伝子 224個うちの 159個、または成熟に伴い減少した遺伝子 195個うちの 45個が明確に抑制され、エチレン信号に高い関与性を示し、エチレン依存のグループに分類された。また、成熟に伴っ

て増加する遺伝子の中で、143個（約 74％）と 140個（約 72％）の遺伝子がそれぞれ rin と nor 変異体においてエチレン処理に有意な反応を示さず、RIN あるいは NOR依存率が 70％以上となり、RINと NOR信号伝達系が必須であることが示唆された。一方、rinおよび norトマトにおいてもエチレン処理によって転写量が顕著に変化した遺伝子は、それぞれ 9個、12個と少数であったが、これらの遺伝子は RINおよび NORに非依存と考えられた。成熟に伴って発現が増加する遺伝子の多くは、エチレン、RIN、NOR に強い依存性を示したが、

72

成熟に伴って発現が減少する遺伝子の約半分ではエチレン非依存的で RIN、NOR依存性も小さかった。 また、本研究はトマト成熟制御機構の網羅的分子生物的な研究を目指し、マ

クロアレイに用いた ESTのアノーテーションデータ、トマトゲノムのデータベース SOLによって、各遺伝子を分子的な機能を基づいて分類した。成熟に伴って発現が変化する遺伝子の中で炭水化物、脂質およびエネルギー代謝に関連す

る遺伝子では、その多くが成熟に伴って発現が増加し、エチレンによる直接的

な制御を受けていた。一方、光合成関連遺伝子ではほとんどが成熟に伴って発

現レベルが低下し、その一部がエチレンによるネガティブレギュレーションを

受けていることを示し、光合成反応に関わる遺伝子の成熟に伴う低下は遺伝子

によってエチレンによる制御、ステージによる調節の両方によると考えられる。

細胞壁関連遺伝子では、成熟に伴って顕著に増加する因子として PG (polygalacturonase) 、 PL(pectatelyase) お よ び mannan endo-1,4-beta-mannosidase が、逆に低下する因子としては PG、 Expansin、 endo-1,4-beta-glucanaseがスクリーニングされた。成熟を調節するシグナル伝達系に機能する遺伝子が 17 個、成熟関連転写因子が 20 個をあった。基礎的代謝、二次代謝、植物ホルモン、光合成、着色と細胞壁の調節など、様々な成熟

に関わる生理変化について、関連遺伝子を整理したところ、成熟に伴う呼吸代

謝の制御には、イソクエン酸脱水素酵素および ATP合成酵素遺伝子が重要な因子であることが示唆された。 新規の成熟関連転写因子として、GRAS、b-ZIP遺伝子、信号伝達系因子として SAHH,BNK1,BTB 因子が抽出された。抽出された成熟関連転写因子を検索したところ、既に成熟に伴って発現が増加することが報告されている

MADS-RINや TDR6に加えて GRASや SAHH遺伝子が、逆に成熟に伴って発現レベルが顕著に低下する因子として BTB や b-ZIP が見いだされた。GRAS、 bZIP、 BNK1と BTBなどの転写因子および信号伝達関連因子は今回の結果より、エチレンまたは RINと NOR信号伝達系の下流に位置することが示唆された。さらに、ポジティブレギュレーターとして GRASと SAHH、ネガティブレギュレーターとして bZIPと BTBを想定して、遺伝子機能の迅速・簡易解析法である VIGS 法を行った。その結果、ジベレリン信号伝達系の転写因子であるGRAS 遺伝子を導入した個体では、果実着色がやや抑制される傾向が示され、この転写因子が成熟制御の一翼を担っていることが示唆された。

73

謝 辞

本研究の計画および実施にあたり、御丁寧な御指導、御指導してくださいま

した、岡山大学大学院環境生命科学研究科久保康隆教授に心から御礼申し上げ

ます。また、物心両面から私を支えてくださいました家族にも深く感謝いたし

ます。 また、6年間超え日本での留学生活の間に、小林外来留学生奨学金団体および日本学生支援機構（私費外国人留学生学習奨励費支給団体）の懇親交流会およ

び経済的な支援を心より感謝します。岡山大学大学院環境生命科学研究科田原

誠教授にも御礼申し上げます。

74

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試 薬 一 覧

XT Buffer 使用直前に以下の試薬を XT Buffer（ストック）に加える 10mM DTT 1% ノニデット 40 2% PVP-40 XT Buffer（ストック）

0.2M 四ホウ酸ナトリウム十水和物 30mM EGTA 1% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） 1% デオキシコール酸ナトリウム 20×MOPS 83.7g/L MOPS 13.61g/L 酢酸ナトリウム 4.75g/L EDTA LB液体培地 1% Bactro Triputon 0.5% Yeast Extract 1% NaCl TE 10mM Tris-HCl (pH8.0) 1mM EDTA 20×SSC 3M NaCl 0.3M クエン酸ナトリウム (pH7.0)