ゲノムRe s e q 、変異解析kadota/bioinfo_ngs_sokushu_2015/...2015/08/04 · Illumina CASAVA filter [Y] を除去クオリティ20未満の末端をトリム片側のみのリードを除外

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ゲノム R e s e q 、変異解析

V1

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本講義にあたって

• 代表的な解析の流れを紹介します

– 論文でよく使用されているツールを使用します

• コマンドを沢山実行します

– スペルミスが心配な方は、コマンド例がありますのでコピーして実行してください

• マークのコマンドは実行してください。

– 実行が遅れてもあせらずに、応用や課題の間に追い付いてください

TRY!


本講義の内容

• Reseq解析

公開データ取得

クオリティコントロール

マッピング

変異検出

• RNA-seq解析



マッピング

発現定量

SNVとIndel検出

を行います。 FPKMを算出します。

↓ ↓ ↓

↓ ↓ ↓


R e s e q 解析：検出可能な変異

• ショートリードのシーケンスでも様々な変異を検出可能

SNV InDel Inversion

Duplication Translocation CNV

• 検出アルゴリズムとソフトウェア

Paired-end mapping : BreakDancer、VariationHunter

Split-read mapping : Pindel

Others、Complex : CREST、DELLY

充分に精度が高いとは言えません。


R e s e q 解析：パイプライン

データ取得 → クオリティコントロール → マッピング→変異検出

解析パイプラインとは「あるソフトの出力結果が、次のソフトの入力ファイルとなる」連続した解析処理の流れ。


R e s e q 解析：パイプライン

サンプル間比較、遺伝モデルを使用した絞り込み Genotype imputation など様々。

今日は一部のコマンドを実行します。



R e s e q 解析：データ


• 酵母のゲノムのリファレンス取得 – http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html

リファレンスのfastaのみではなく、マッピングソフトのインデックスファイルや遺伝子情報ファイルも一緒に圧縮されて公開しています。




• 酵母のゲノムのリファレンス取得（実行済み）

$ wget ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-

ftp.illumina.com/Saccharomyces_cerevisiae/NCBI/build3.1/Saccharom

yces_cerevisiae_NCBI_build3.1.tar.gz

$ tar zxvf Saccharomyces_cerevisiae_NCBI_build3.1.tar.gz

※お手元のテストデータでは、使用しないデータを一部削除しています

ダウンロードして、解凍します。



• 酵母のゲノムのリファレンスを確認


$ cd /home/ユーザ名/Desktop/amelieff/Scerevisiae $ ll

TRY!





$ ll WholeGenomeFasta

TRY!





$ less WholeGenomeFasta/genome.fa

「q」で閲覧を終了します。

ヘッダには、コンティグ名が記載されます。

TRY!





$ less WholeGenomeFasta/genome.fa.fai

：

1列目：コンティグ名（fastaファイルのヘッダ） 2列目：コンティグの長さ 3列目：ファイルの先頭から見た、染色体の第一塩基目の位置 4列名： fastaの1行の文字数 5列目：各行のバイト数

インデックスファイルを開きます。SamToolsで作成できます。

TRY!


応用）ヒトリファレンスの話

GRCh Build37 ＋デコイ配列 Version 5

ヒトWhole Genome Sequencing Cloneを「ヒトゲノム＋ヒトヘルペスウイルスHHV-4 」にマッピングして、よくマップできなかったものを集めたもの。サイズ：合計35.4Mb、N50=22.9kb 特徴： 50%はサテライト配列またはシンプルリピート、 20%はレトロトランスポゾン

※現在は、2013/12/24にメジャーアップしたGRCh38が公開されています。


With Decoy

Without Decoy

最大カバレージ： 1112

最大カバレージ： 817

応用）ヒトリファレンスの話

GRCh Build37 ＋デコイ配列 Version 5

Reseq解析は、リファレンスに対して変異検出するので、リファレンス自体がどの程度確かなのかが非常に大切





$ ll Scerevisiae/BWAIndex/ BWAのインデックスファイルを開きます

TRY!

…

リンクの「l」シンボリックリンク名 -> 実体のファイル



• リファレンスのインデックスを作成


$ bwa index

$ mkdir BWAIndex/version0.7.12

$ cd BWAIndex/version0.7.12

BWA バージョン0.7のインデックスファイルを作成します。 BWAの使い方を確認します。

TRY!





$ ln -s ../../WholeGenomeFasta/genome.fa

$ ll

シンボリックリンクを作成します。

$ ln –s 実体のファイル

…

TRY!





$ bwa index genome.fa

$ ll

インデックスを作成します。

…

TRY!



• シーケンスデータ取得


DDBJのSequence Read Archive → Search

http://trace.ddbj.nig.ac.jp/dra/index.html





Accessionに「ERR038793」と入力 → Search





NavigationエリアのExperiment → 「ERX015989」をクリック

実験の詳細

ここからダウンロード





Whole Genome Sequencing

他にも、シーケンサのプラットフォームやリード長などの情報も記載されています。



• シーケンスデータ取得（実行済み）


$ wget

ftp://ftp.ddbj.nig.ac.jp/ddbj_database/dra/fastq/ERA038/ERA038218

/ERX015989/ERR038793_1.fastq.bz2

$ wget

ftp://ftp.ddbj.nig.ac.jp/ddbj_database/dra/fastq/ERA038/ERA038218

/ERX015989/ERR038793_2.fastq.bz2

ダウンロードします。



• シーケンスデータ取得（実行済み）


$ bunzip2 ERR038793_1.fastq.bz2

$ bunzip2 ERR038793_2.fastq.bz2

$ head -4000 ERR038793_1.fastq > 1K_ERR038793_1.fastq

$ head -4000 ERR038793_2.fastq > 1K_ERR038793_2.fastq

解凍して、先頭1000リードを抽出します。



• シーケンスデータを確認


$ cd /home/ユーザ名/Desktop/amelieff/ $ ll

:

$ wc -l 1K_ERR038793_1.fastq

4000 1K_ERR038793_1.fastq

行数を数えます。 1リードは4行で表記されます。

TRY!



$ fastqc -help

R e s e q 解析：クオリティコントロール

$ fastqc -version

• シーケンスデータのクオリティを確認

FastQC v0.10.1

インストールされているFastQCの、バージョンと使い方を確認します。

：

：

Fastqのみではなく、bamとsamも入力可能

複数のファイルも指定可能

TRY!



$ mkdir reseq

$ fastqc -o reseq -f fastq 1K_ERR038793_1.fastq 1K_ERR038793_2.fastq


• シーケンスデータのクオリティを確認

FastQCを実行します。

TRY!

$ firefox reseq/1K_ERR038793_1_fastqc/fastqc_report.html

$ firefox reseq/1K_ERR038793_2_fastqc/fastqc_report.html

fastqc_report.htmlを、ウェブブラウザで開きます。


応用）とあるシーケンスデータの実例

リード末端でクオリティが低下

最初の１塩基の割合が不自然

シーケンス技術が向上しクオリティの高いデータを目にする機会が増えましたが、試料・シーケンス・トリミングなどに、

問題がないか確認することをおすすめします。

マッピング率が低下や、変異の偽陽性が増加するなどの問題を引き起こす。



• クオリティ30以上の塩基が90%未満のリードを削除


TRY!

$ fastq_quality_filter -h

インストールされているfastq_quality_filterの使い方を確認します。



• クオリティ30以上の塩基が90%未満のリードを削除

$ fastq_quality_filter -i 1K_ERR038793_1.fastq

-o reseq/1K_ERR038793_1_qual.fastq -q 30 -p 90 -Q 33 -v


TRY!

Quality cut-off: 30

Minimum percentage: 90

Input: 1000 reads.

Output: 802 reads.

discarded 198 (19%) low-quality reads.

ターミナルに直接解析のサマリーを出力するソフトもあります。

以降の解析は、片側のリードのみ使用します。


データクオリティチェック（FastQC）

クオリティ20未満が80%以上のリードを除去

データクオリティチェック（FastQC）

Illumina CASAVA filter [Y] を除去

クオリティ20未満の末端をトリム

片側のみのリードを除外

配列長が短いリード除去

未知の塩基(N)が多いリード除去

FASTQ形式にマッチするかチェック

応用）クオリティコントロールの順番も大切

ロングリードの場合、リードの大半が除外されてしまう可能性。

ペアエンドリードの場合、ペアが揃っていないとマッピングソフトが停止する可能性。



• Bwa memコマンドの使い方を確認

$ bwa mem

※RG（read groups） platform (PL) および sample (SM)が必要 PLの例：454, LS454, Illumina, Solid, ABI_Solid

R e s e q 解析：マッピング

TRY!



• マッピング

$ cd reseq

$ bwa mem -R "@RG¥tID:1K_ERR038793_1¥tSM:ERR038793¥tPL:Illumina"

/home/ユーザ名/Desktop/amelieff/Scerevisiae/BWAIndex/genome.fa 1K_ERR038793_1_qual.fastq > 1K_ERR038793_1_qual.sam $ ll


TRY!



• SAMをBAMに変換

$ samtools view -Sb 1K_ERR038793_1_qual.sam > 1K_ERR038793_1_qual.bam

$ ll -h


1/4程度にファイルサイズが小さくなりました。

TRY!



• ソートとインデキシング

$ samtools sort 1K_ERR038793_1_qual.bam 1K_ERR038793_1_qual_sorted

$ samtools index 1K_ERR038793_1_qual_sorted.bam

$ ll


TRY!



• マッピングされたリード数

$ samtools idxstats 1K_ERR038793_1_qual_sorted.bam


TRY!

コンティグ名、コンティグの長さ、マッピングされたリード、マッピングされなかったリードの順に表示されます。

3列目を足し合わせると、マッピングされたリード数がわかります。


応用）列の合計を計算するコマンド

$ samtools idxstats 1K_ERR038793_1_qual_sorted.bam > tmp

$ awk '{a += $3} END {print a}' tmp

803 マッピングされたリード

$ awk '{a += $4} END {print a}' tmp

0 マッピングされなかったリード

１行読み込むたびに、３列目を「a」に足す。

802リードのfastqをマッピングしたはずが、1本増えています。マルチヒットしたリードがあると考えられます。



• GATK UnifiedGenotyperコマンドの使い方を確認

$ java -jar /usr/local/src/GenomeAnalysisTK-1.6-13-

g91f02df/GenomeAnalysisTK.jar -T UnifiedGenotyper -h


R e s e q 解析：変異検出

TRY!

SNP, INDEL, BOTH から選べます。デフォルトはSNP



• SNV/Indel検出

$ java -jar /usr/local/src/GenomeAnalysisTK-1.6-13-g91f02df/GenomeAnalysisTK.jar

-T UnifiedGenotyper -glm BOTH

-R /home/ユーザ名/Desktop/amelieff/Scerevisiae/WholeGenomeFasta/genome.fa -I 1K_ERR038793_1_qual_sorted.bam -o 1K_ERR038793_1_qual_sorted.vcf

$ ll



TRY!



• 検出したSNV/Indelを可視化



TRY!

…

ジェノタイプがC/Tのヘテロカバレージが６

$ less 1K_ERR038793_1_qual_sorted.vcf



• 検出したSNV/Indelの数を確認

$ awk '!/^#/' 1K_ERR038793_1_qual_sorted.vcf | wc -l



TRY!

100

100個の変異が検出されました

検出されるSNV/Indel数は、使用するソフトウェアのバージョンやパラメータにより変動します


応用）リアライメント

リアライメントは必要？

BWAでは、 1本のリードに複数の変異が含まれる場合に、アライメントスコアの計算上、SNVやIndelの正確な位置を決めることが出来ません。このような領域を対象領域として抜き出して、改めて丁寧にアライメントを行う。

$ igv.sh


TRY! Genomes → Load Genome from File…

Genome.faファイルを選択

/home/ユーザ名/Desktop/amelieff/Scerevisiae/Wh

oleGenomeFasta/genome.faまで移動


TRY! File → Load from File…

/home/ユーザ名/Desktop/amelieff/reseqまで移動


TRY! 「I:111」と入力

ジェノタイプがC/Tのヘテロ

カバレージが６


応用） I n d e l の見方

…

TTの欠失 TTTの欠失

ジェノタイプは、AT/A

ホモポリマーではシーケンスエラーによって、偽陽性のIndelが検出されやすい。


応用）変異のフィルタリング

$ java -jar /usr/local/src/GenomeAnalysisTK-1.6-13-g91f02df/GenomeAnalysisTK.jar

-T VariantFiltration

–R /home/ユーザ名/Desktop/amelieff/Scerevisiae/WholeGenomeFasta/genome.fa -V 1K_ERR038793_1_qual_sorted.vcf -o 1K_ERR038793_1_qual_sorted_fil.vcf

--clusterWindowSize 10 --filterExpression "DP < 10" --filterName "LowCoverage"

• GATKのVariantFiltrationコマンドでフィルタリングをします

VCFファイルのFILTER列に、条件を通過した場合“PASS”、そうでない場合は “filterName”が記入されます。


応用）遺伝子情報のアノテーション

• snpEff…変異に対して遺伝子名や転写産物の情報、変異の影響などを付与します

snpEffを実行するには、snpEffをインストールした後、対応するゲノムのデータベースをダウンロードしておきます。

例：ヒトhg19データベースをダウンロードする

対応する生物種のデータベースがない場合は、データベースを作成する必要があります。

$ java -jar /usr/local/src/snpEff/snpEff.jar download hg19

$ mkdir data/sacCer

$ cd data/sacCer

$ wget

http://downloads.yeastgenome.org/curation/chromosomal_feature/saccharomyces

_cerevisiae.gff

$ mv saccharomyces_cerevisiae.gff genes.gff

$ echo "sacCer.genome : Yeast" >> snpEff.config

$ java -Xmx1G -jar snpEff.jar build -gff3 sacCer


応用）遺伝子情報のアノテーション

• snpEff…変異に対して遺伝子名や転写産物の情報、変異の影響などを付与します

$ java –Xmx10G –jar /usr/local/src/snpEff/snpEff.jar eff

-c /usr/local/src/snpEff/snpEff.config -i vcf sacCer -o vcf

1K_ERR038793_1_qual_sorted_fil.vcf 1>

1K_ERR038793_1_qual_sorted_fil_snpeff.vcf


本講義の内容

• Reseq解析



マッピング

変異検出

• RNA-seq解析



マッピング

発現定量

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