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PROTEÍNAS
La verdadera educación consiste en obtener lo mejor
de uno mismo. ¿Qué otro libro se puede estudiar
mejor que el de la Humanidad? Mahatma Gandhi
22/10/2012.
REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA
MINISTERIO DEL PODER POPULAR PARA LA EDUCACIÓN SUPERIOR
UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE BIOANÁLISIS
CÁTEDRA DE BIOQUIMICA I
UNIDAD I: PROTEÍNAS
INTEGRANTES:
GORDON, JENNIFER C.I. 19.967.638
HERNÁNDEZ, STEFANI C.I. 18.995.884
MÁRQUEZ, VALERIA C.I. 21.323.888
OLIVEROS, MARÍA J. C.I 19.314.631
Caracas, 22 de Octubre de 2012.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son polímeros de 20 α-aminoácidos unidos mediante
enlaces peptídicos y van a mostrar una amplia variación en sus tamaños y
formas. Sus propiedades químicas y fisiológicas dependen no sólo de su
tamaño y forma, sino también de las propiedades de los aminoácidos que las
componen.
Las proteínas son moléculas extremadamente complejas con el fin de
mantener la multiplicidad de sus funciones. Desempeñan una enorme
variedad de funciones: unas transportan y almacenan moléculas pequeñas;
otras constituyen gran parte de la organización estructural de las células y
tejidos. La contracción muscular, la respuesta inmunitaria y la coagulación de
la sangre se producen mediante proteínas.
Todas las proteínas son polímeros, y los α-aminoácidos son los
monómeros que se combinan para formarlas, en donde el grupo amino esta
unido al carbono α, el carbono contiguo al grupo carboxilo; de allí proviene el
nombre de α-aminoácidos. Al carbono α de cada aminoácido también están
unidos un átomo de hidrogeno y una cadena lateral ®. La variedad de
cadenas laterales permite que las proteínas gocen de una gran versatilidad
estructural.
Los distintos α-aminoácidos se diferencian por sus cadenas laterales.
En condiciones fisiológicas los aminoácidos se encuentran como formas
zwitterion a pH neutro en las que el grupo carboxilo ha perdido un protón y el
grupo amino ha ganado uno.
En los genes de todos los organismos están codificados veinte
aminoácidos diferentes que incorporan a las proteínas y poseen una
preferencia absoluta del isómero L.
Los aminoácidos pueden unirse entre ellos de modo covalente por
formación de un enlace amida entre el grupo α-carboxilo de un aminoácido y
el grupo α-amino de otro; producida por eliminación de los elementos del
agua.
Esta unión covalente se denomina enlace pepitico y los productos que
se forman a partir de esta unión se llaman péptidos. El enlace peptídico se
encuentra en un plano, y la forma trans es favorecida. Este enlace es
metaestable y puede hidrolizarse fácilmente en presencia de catalizadores.
Los oligopéptidos y los polipéptidos se forman por la polimerización de los
aminoácidos mediante estos enlaces.
Para estudiar las Proteínas se aprovechan las diferencias que existen
entre ellas. Tales diferencias pueden ser de solubilidad, tamaño, masa, carga
eléctrica o afinidad con otras moléculas, por consiguiente existen diversas
técnicas que permiten analizar desde un punto de vista cualitativo y
cuantitativo, el contenido proteico de diferentes muestras entre ellas las de
carácter biológico.
Cualitativas:
Factores que afectan la solubilidad: El estudio de los factores
que afectan la solubilidad de las proteínas, ha permitido idear
gran cantidad de métodos para precipitar estas sustancias de
sus soluciones.
Reacciones de coloración: Son debida a la interacción entre
uno o más radicales ® de los aminoácidos que constituyen una
proteína y los reactivos que se emplean en cada una de las
pruebas.
Cuantitativas:
Método de Lowry: Es un método colorimétrico de valoración
en donde a las muestras se le añade un reactivo que forma un
complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de
color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley
de Lambert-Beer.
Método de Biutet: Se basa en la formación de un complejo
coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces
peptídicos en medio básico. La intensidad de coloración es
directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces
peptídicos).
Estos son los comúnmente empleados para la determinación y
cuantificación de las Proteínas, en donde ambos requieren la realización de
una curva de calibración.
Técnicas de Separación y Análisis
Cromatografía: Permite separar uno o varios componentes
presentes en mezclas proteicas y en general depende de las
afinidades diferenciales de los solutos entre dos fases
inmiscibles.
Electroforesis: Permite caracterizar diversas proteínas
basándose en los pesos moleculares, carga, forma y tamaño
de las mismas.
El trabajo en el laboratorio implicó:
Reconocer las características generales de aminoácidos, péptidos y
proteínas como factores que afectan su solubilidad y reacciones de
coloración generales y especificas
Desarrollar procedimientos básicos para el aislamiento de la caseína
de la leche y su respectiva valoración.
Conocer los fundamento y el manejo de las metodologías generales
que permitan separar y cuantificar diversas moléculas presentes en
diversas muestras.
En donde se requirió del total dominio de algunos conceptos básicos
en relación con el tema, conocer teóricamente las experiencias que se
desarrollaron y los posibles resultados.
SEMANA I – PARTE I: FACTORES QUE
AFECTAN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS.
FUNDAMENTO TEÓRICO
Para entender más la siguiente practica debemos considerar y
conocer los siguientes conceptos:
Un péptido: son un tipo de moléculas formadas por la unión de varios
aminoácidos mediante enlaces péptidos.
Aminoácido: es una molécula orgánica con un grupo amino y un
grupo carboxilo unidos a un carbono central.
La unión de varios aminoácidos da lugar a cadenas llamadas
polipéptidos o simplemente péptidos, que se denominan proteínas cuando la
cadena polipéptida supera a los 50 aminoácidos. Aunque se han descrito
más de 300 aminoácidos diferentes, solo 20 de ellos suelen encontrarse
como sustituyentes de las proteínas.
Las proteínas: Las proteínas son macromoléculas formadas por
cadenas lineales de aminoácidos. Las proteínas desempeñan un papel
fundamental para la vida y son las biomoléculas más versátiles y más
diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo. Realizan
una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan:
Estructural. Esta es la función más importante de una proteína (Ej:
colágeno).
Inmunológica (anticuerpos).
Enzimática (Ej: pepsina).
Contráctil (actina y miosina).
Homeostática: colaboran en el mantenimiento del pH (ya que actúan
como un tampón químico).
Transducción de señales (Ej: rodopsina).
Protectora o defensiva (Ej: trombina y fibrinógeno).
También hay que resaltar los niveles de organización de las proteínas:
REACCIONES DE PRECIPITACIÓN
Si en una disolución de proteínas se producen cambios de pH,
alteraciones en la concentración, agitación molecular o variaciones bruscas
de temperatura, la solubilidad de las proteínas puede verse reducida hasta el
punto de producirse su precipitación.
1. ACCIÓN DE LA TEMPERATURA.
La mayoría de las proteínas son solubles en el intervalo de 0°C y 40°C,
pero a temperaturas superiores de 40 °C se hacen inestables y comienzan a
desnaturalizarse con pérdida de la solubilidad ocurriendo en consecuencia la
precipitación.
Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las
moléculas con la que se desorganiza la envoltura acuosa de la proteína y se
desnaturaliza; así mismo con un aumento de la temperatura las interacciones
débiles ocasionan la desorganización de la proteína de forma que el interior
hidrófobo interacciona con el medio acuoso y se produce la agregación y
precipitación de la proteína desnaturalizada.
3 ml Sol. Albúmina 5%. T°= 4°C. t= 15min.
SOLUBLE
3 ml Sol. Albúmina 5%. T°= 25°C. t= 15min.
SOLUBLE
3 ml Sol. Albúmina 5%. T°= 60°C. t= 15min.
PRECIPITADO BLANCO TURBIO
3 ml Sol. Albúmina 5%.
T°= 100°C. t= 15min.
PRECIPITADO BLANCO COMPACTO
2. ACCIÓN DE LOS ALCOHOLES.
Con la adición de los solventes orgánicos que sean neutros y miscibles
en agua como la acetona y etanol el cual fue el reactivo a utilizar; estos
solventes disminuyen la solubilidad en agua de muchas proteínas de la
disolución.
La polaridad del disolvente disminuye cuando se le añaden sustancias
menos polares que el agua como el etanol o la acetona con ello disminuye el
grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la molécula
proteica, provocando la agregación y precipitación. Los disolventes orgánicos
interaccionan con el interior hidrófobo de las proteínas y desorganizan la
estructura terciaria de la proteína provocando su desnaturalización y
precipitando.
Otro punto de vista es respecto a la constante dieléctrica (propiedad física
que refleja el número de dipolos de un solvente); los solventes causan
precipitación de las proteínas ya que disminuye la constante dieléctrica y por
lo tanto aumentan las interacciones proteina-proteina.
Dado que la constante dieléctrica del etanol (32.7) es menor que la del
agua (78.5), su adicción a una solución acuosa de proteína incrementa la
fuerza de atracción entre cargas opuestas y de esta forma se disminuye el
grado de ionización de los grupos R de las proteínas como anteriormente lo
mencionamos provocando agregados y la precipitación.
3 ml Sol. Albúmina 5%.
3 ml de Etanol 95%.
T°= 25°C. t= 5min.
Precipitado blanco en la interfase,
(separados por dos líquidos de diferentes
densidades).
3 ml Sol. Albúmina 5%.
3 ml de Etanol 95%.
T°= 40°C. t= 5min.
PRECIPITADO GRANULAR.
3. ACCIÓN DE SALES.
La adición de sales neutras a una solución de proteínas disminuye la
atracción de las moléculas proteícas aumentando así su solubilidad, todo lo
contrario con respecto a la adición de solventes orgánicos donde aumenta
daba la atracción. En el caso de las sales hablamos del fenómeno conocido
como “salting in o “solubilización por salado”; en este caso si se sigue
agregando sal se alcanza una concentración en la que por causa de la
competición de los iones salinos por las moléculas de agua, las proteínas se
deshidratan, ocasionando una disminución de su solubilidad produciendo una
“precipitación salina” o “ salting out”. En el momento que los iones compiten
por las moléculas de agua hay rompimiento de los puentes de hidrogeno o
de las interacciones electroestáticas, de forma que las moléculas proteicas
se agreguen y precipiten.
La reacción que se ve involucrada en la parte experimental es la
Reacción de Robert donde se nota un aumento de la fuerza iónica del medio
por la adición de la solución ácida de sulfato de magnesio también provoca
una disminución en el grado de hidratación de los grupos iónicos
superficiales de la proteína ya que estos compiten por el agua y rompen los
puentes de hidrogeno o las interacciones electroestáticas provocando que
las moléculas proteicas precipiten o se agregan.
2 ml Sol. Albúmina 5%. 2 ml de Reactivo de
Robert.
Precipitado blanco (velloso) consistente.
2 ml Sol. Caseína 2%.
2 ml de Reactivo de Robert.
Precipitado blanco (velloso globular) formación de un
sólido en el fondo.
2 ml Sol. Gelatina 2%.
2 ml de Reactivo de Robert.
NO PRECIPITO (SOLUBLE)
2 ml Sol. Glicina 1%.
2 ml de Reactivo de Robert.
NO PRECIPITO (SOLUBLE)
2 ml Sol. Resorcina 1%.
2 ml de Reactivo de Robert.
NO PRECIPITO (SOLUBLE)
4. ACCIÓN DE ÁCIDOS
Algunas proteínas en presencia de ácidos forman sales insolubles. En el
caso que el ácido actue con la forma catiónica de la molécula de proteína se
produce un enlace tipo salino entre los grupos aminos (de la proteína) y el
radical negativo del ácido por lo tanto el medio debe presentar un pH por
debajo del punto isoeléctrico. De igual manera está el caso donde el ácido
actúa con la forma anionica de la proteína con los grupos carboxilos y el
radical positivo del ácido formando un enlace tipo salino y por lo tanto el
medio debe tener un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína.
Solución A: 0.66N de H2SO4
Solución B: NA2WO4 10 %
2 ml Sol. Albúmina 5%.
1 ml de Sol A. 1 ml Sol B.
Precipitado blanco flocular.
2 ml Sol. Caseína 2%.
1 ml de Sol A.
1 ml Sol B.
Precipitado blanco compacto.
2 ml Sol. Gelatina 2%.
1 ml de Sol A.
1 ml Sol B.
Precipitado blanco globular velloso.
2 ml Sol. Glicina 1%.
1 ml de Sol A.
1 ml Sol B.
NO PRECIPITO.
2 ml Sol. Resorcina 1%.
1 ml de Sol A.
1 ml Sol B.
NO PRECIPITO.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
FACTORES QUE AFECTAN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS
Cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con
el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa. Se
llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de
orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena
polipeptídica reducida a un polímero sin ninguna estructura tridimensional
fija.
Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el
disolvente disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la
precipitación. Así, la desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la
neutralización de las cargas eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los
puentes de hidrógeno facilitarán la agregación intermolecular y provocará la
precipitación. La precipitación suele ser consecuencia del fenómeno
llamado desnaturalización.
En una proteína cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada
tan sólo tienen en común la estructura primaria, es decir, la secuencia de
aminoácidos que la componen. En estos casos las proteínas se transforman
en filamentos lineales y delgados que se entrelazan hasta formar
compuestos fibrosos e insolubles en agua. Los demás niveles de
organización estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada.
La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína:
1. Cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta
la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión.
2. Drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos
hidrofóbicos del interior aparecen en la superficie.
3. Pérdida de las propiedades biológicas.
Una proteína desnaturalizada cuenta únicamente con su estructura
primaria. Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalización es
reversible ya que es la estructura primaria la que contiene la información
necesaria y suficiente para adoptar niveles superiores de estructuración. El
proceso mediante el cual la proteína desnaturalizada recupera su estructura
nativa se llama renaturalización.
Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y
purificación de proteínas, ya que no todas la proteínas reaccionan de igual
forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta. En algunos
casos, la desnaturalización conduce a la pérdida total de la solubilidad, con lo
que la proteína precipita. La formación de agregados fuertemente
hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que el proceso
sea irreversible.
Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se
llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes físicos (calor)
y químicos (disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica). Como en algunos
casos el fenómeno de la desnaturalización es reversible, es posible precipitar
proteínas de manera selectiva mediante cambios en:
Polaridad del disolvente.
Fuerza iónica.
El pH.
Temperatura.
El estudio de los factores que afectan la solubilidad de las proteínas, ha
permitido idear gran cantidad de métodos para precipitar estas sustancias de
sus soluciones. Tales cambios fueron estudiados y se explicaran a
continuación:
Acción de la temperatura.
La solución de albumina al 5% fue la muestra a ensayar y al
someterla a una temperatura primero de 4°C y luego a 25°C se obtuvó que
fueron solubles ya que ambas estaban en el intervalo de O°C y 40°C, en
donde la mayoría de las proteínas globulares experimentan solubilidad.
Cuando la temperatura supera este intervalo como lo fue en el caso de 60°C
y 100°C la albumina precipitó, esto como consecuencia del aumento de la
energía cinética de las moléculas con lo que se desorganizo la envoltura
acuosa de la proteína, y se desnaturalizó.
El aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y
desorganiza la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrófobo
interacciona con el medio acuoso, afectando la solubilidad de la misma,
debido a que los iones H+ y OH- afectan la carga eléctrica de los grupos ® de
los aminoácidos, lo que ocasiona la ruptura de las interacciones
electrostáticas y se produce la precipitación de la proteína desnaturalizada.
Acción de Solventes orgánicos.
La solución de albumina al 5% al adicionarle etanol a una temperatura
de 25°C se obtuvo un precipitado y como consecuencia disminuyó la
solubilidad en agua de gran parte de la proteína cuando se le agregó una
sustancia menos polar como el etanol, así también el grado de hidratación de
los grupos iónicos superficiales de la molécula proteica, provocando la
agregación y precipitación.
Los disolventes orgánicos interaccionan con el interior hidrófobo de
las proteínas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su
desnaturalización y precipitación. El principal efecto es la reducción del poder
de solvatación del agua (asociación de moléculas de un disolvente con
moléculas o iones de un soluto) que puede ser explicado en términos de una
disminución de la constante dieléctrica del agua.
Acción de las sales.
Se empleó el reactivo de Robert (sal ácida de sulfato de magnesio)
que es una prueba cualitativa para observar si hay proteínas, en donde dos
de las soluciones empleadas: Albumina 5% y Caseína 2% Precipitaron.
Esto se debe a que al agregar el reactivo se saturará la capacidad de
solubilización del solvente y las moléculas de sal tienden a competir con las
moléculas de proteínas por el solvente con el objeto de mantenerse en
solución. Al ser la sal más soluble que la proteína, está se une al solvente
por consiguiente la proteína deshidratada y precipita.
Hay que acotar que la solución de gelatina debió precipitar ya que se
trataba de una proteína al igual que las otras dos soluciones mencionadas
anteriormente, pero por problemas en la muestra no se observó dicho
precipitado. Las dos muestras restantes no precipitaron ya que la glicina se
trataba de un aminoácido libre y la resorcina de un compuesto aromático no
proteico.
Acción de Ácidos (Túngstico).
Se empleó para acidificar las soluciones de ácido Túngstico, en
donde tres de las muestras empleadas: Albumina 5%, caseína 2% y
gelatina 2% Precipitaron. Esto se debió a que por ser un precipitante
aniónico formó sales insolubles con las formas catiónicas de la molécula
proteica, en donde se produjo un enlace de tipo salino entre los grupos
aminos de la proteína y el radical del ácido. Presentando el medio un valor
de pH por debajo del punto isoeléctrico ya que es una condición
indispensable para que se dé la precipitación.
Las dos muestras restantes no precipitaron ya que la glicina se trataba
de un aminoácido libre y la resorcina de un compuesto aromático no proteico;
no es como tal unas proteínas.
SEMANA I- PARTE II: AISLAMIENTO DE LA
CASEÍNA.
FUNDAMENTO TEÓRICO.
200 ml de leche LOS ANDES.
20 ml de agua. HCL gota a gota hasta
obtener pH aproximadamente de 4,8.
REPOSAR 15
MINUTOS.
Filtrar con un pañuelo 3 lavados al sólido
(caseína) con alcohol.
Un lavado con éter. Recoger la caseína y
colocarla en un vidrio de
reloj a temperatura
ambiente.
Proteínas Totales
(Cantidad gr/dl)
Teórico
Caseína
Práctico
Caseína
Leche los Andes
3gr/100ml
gr/100ml % gr/100ml %
2.40 100 6,36 265
Aislamiento de la Caseína de la leche
Información Nutricional
Energía (cal) 130
Grasa (g) 7 11%
Carbohidratos (g) 10 3%
Proteínas (g) 6 13%
Calcio (mg) 240 45%
*Tamaño de 200 ml
Proteínas Totales
6g -------------- 200ml
X -------------- 100ml
2.40g -------------- 200 %
6,36g-------------- X
2.40g/100ml
530% / 200ml
265% / 100ml
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Aislamiento de la caseína de la leche
La leche es una secreción nutritiva de color blanquecino opaco
producida por las glándulas mamarias de las hembras de los mamíferos y
sirve de alimento nutritivo, ya que contiene: proteínas, lípidos, lactosa, sales
inorgánicas y vitaminas. La caseína es una fosfoproteína presente en
la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el
yogur o el queso), esta proteína conjugada que posee fósforo como grupo
prostético.
En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato
de calcio) en un complejo que se ha denominado caseinógeno. Como
muchas otras proteínas de origen animal, esta es de un alto valor biológico,
ya que posee todos los aminoácidos esenciales para el desarrollo y
crecimiento normal del ser humano. Por otro lado, existen otros tipos de
proteínas contenidas en la leche como la lactoalbúmina y la lactoglobulína.
La separación de la caseína se realizó mediante la precipitación con
ácido y junto a ésta, cierta cantidad de grasa que se extrajo con solventes
orgánicos en los que la caseína fue insoluble. La grasa se extrajo con éter y
el alcohol para deshidratar.
Al acidificar se evidencia, que al disminuir el pH de la leche se van
rompiendo los enlaces entre los grupos fosfato y el ion calcio, al reducirse la
ionización de los fosfatos. Luego, las repulsiones entre las micelas se
reducen, al acercarse el pH al punto isoeléctrico de la caseína (4.7).
El pH de la leche es aproximadamente 6,6 estando a ese pH la
caseína se encuentra cargada negativamente y solubilizada como sal
cálcica. Al añadir el ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la
micela se neutralizó (los grupos fosfato se protonaron) y la proteína neutra
precipitó.
Ca2+ Caseinato + 2HCl Caseína + CaCl2
El rendimiento de caseína obtenido experimentalmente fue muy
elevado en comparación con los datos que suministraba la información
nutricional de la leche con la que se trabajó, obteniéndose un porcentaje
mayor de lo esperado, con una diferencia de 3,96 g/100ml del valor teórico.
Los posibles factores que influyeron en los valores obtenidos se
atribuyen a la presencia de: H2O y grasas, ya que se trabajó con leche
pasteurizada y no descremada; debido a que esta evitaba en gran parte que
interfiera la grasa en el proceso de aislamiento.
Por otro lado, la notable variación de resultados puede atribuirse a
posibles fallas cometidas por parte de los experimentadores durante la
ejecución del procedimiento. Las fallas más comunes en el proceso de
aislamiento son las asociadas a la incorrecta extracción de grasas.
Reacciones de coloración:
SEMANA II- PARTE I: REACCIONES DE
COLORACIÓN.
REACCIONES DE COLORACIÓN: GENERALES Y ESPECÍFICAS
FUNDAMENTO TEÓRICO.
Las reacciones de coloración se deben a los enlaces de los radicales
“R” que forman los aminoácidos que constituyen las proteínas. Estas pueden
ser especificas o generales.
Reacciones Generales:
Se utilizan para reconocer la presencia de proteínas y o sus derivados
en materiales biológicos entre estas tenemos:
Reacción de Biuret:
Los péptidos y proteínas producen una reacción coloreada muy usada
para la valoración de los mismos, llamada reacción de Biuret
molécula formada a partir del calentamiento de la urea 180ºC.
La reacción se basa en la formación de un compuesto de color
violeta, debido a la formación de un complejo en medio alcalino
entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos
del nitrógeno y el oxígeno que forma parte de los enlaces peptídicos (- CO-
NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos por lo que estos no dan
positivo.
Se necesitan 2 ó más uniones peptídicas para que se forme el
complejo coloreado es por ello que esta prueba sirve para la identificación de
tripéptidos en adelante, la cantidad de color producido es proporcional a la
concentración de enlaces peptídicos en las proteínas.
Solución A: Hidróxido de sodio 40%.
Solución B: Sulfato de cobre 1%
2 ml Sol. Albúmina 5%.
2 ml Sol A. 2 ml Sol B.
Coloración Violeta Intenso (positivo)
2 ml Sol. Caseína 2%.
2 ml Sol A. 2 ml Sol B.
Coloración Violeta Claro (positivo)
2 ml Sol. Gelatina 2%.
2 ml Sol A.
2 ml Sol B.
Coloración Violeta Intenso (positivo)
2 ml Sol. Glicina 1%.
2 ml Sol A. 2 ml Sol B.
Coloración Azul (negativo)
2 ml Sol. Resorcina 1%.
2 ml Sol A. 2 ml Sol B.
Coloración Verde (negativo)
2 ml Sol. Histidina 1%.
2 ml Sol A. 2 ml Sol B.
Coloración Azul (negativo)
2 ml Sol. Arginina 1%.
2 ml Sol A. 2 ml Sol B.
Coloración Azul (negativo)
2 ml Sol. Tirosina 1%.
2 ml Sol A. 2 ml Sol B.
Coloración Azul (negativo)
Reacción de Ninhidrina:
Es un agente oxidante poderoso y lleva a cabo la determinación
oxidativa de los grupos alfa-amino, liberando amoniaco, bióxido
de carbono y el correspondiente aldehído, así como la forma
reducida de la ninhidrina. El amoniaco entonces reacciona con
un mol adicional de ninhidrina oxidada y un mol de ninhidrina
reducida para dar una sustancia de color azul violeta, todas las
proteínas, peptonas, péptidos y aminoácidos que tengan un grupo carboxilo y
amino libre darán positivos.
Solución: Ninhidrina 1% en alcohol.
2 ml Sol. Albúmina 5%.
8 gotas de Ninhidrina.
5 min en agua a 100 °C
Coloración Azul (positivo).
2 ml Sol. Caseína 2%,
8 gotas de Ninhidrina.
5 min en agua a 100 °C
Coloración Violeta (positivo).
2 ml Sol. Gelatina 2%,
8 gotas de Ninhidrina.
5 min en agua a 100 °C
Coloración Violeta (anillo)
(positivo)
2 ml Sol.Resorcina 1%,
8 gotas de Ninhidrina.
5 min en agua a 100 °C
Incoloro (negativo)
2 ml Sol.Arginina 1%,
8 gotas de Ninhidrina.
5 min en agua a 100 °C.
Coloración Violeta (positivo)
2 ml Sol.Histidina 1%,
8 gotas de Ninhidrina.
5 min en agua a 100 °C.
Coloración Violeta (positivo)
2 ml Sol. Glicina 1%.
2 ml Sol A. 2 ml Sol B.
Coloración Violeta (positivo)
2 ml Sol. Tirosina 1%.
2 ml Sol A. 2 ml Sol B.
Coloración Violeta (positivo)
Reacciones Específicas:
Son aquellas que se utilizan para determinar la presencia de proteínas
y sus derivados en la muestra. Entre ellas tenemos:
Reacción Xantoproteica:
Se utiliza para la identificación del grupo hidroxibenceno, la reacción
es debida a la nitración del anillo bencénico con el ácido nítrico concentrado,
para dar productos de color amarillo, que se tornan anaranjados al añadir
álcali, debido a la formación de sales. En las
condiciones del experimento solo la tirosina y el
triptófano darán positivo a la prueba la fenilalanina no
porque es más difícil de nitrar por lo que requeriría de
ácido sulfúrico como catalizador.
Formándose primero un precipitado blanco al añadir el
ácido nítrico concentrado al calentar, ese precipitado de vuelve amarillo y si
la solución se hace alcalina, el precipitado finalmente se torna anaranjado.
Solución A: Hidróxido de sodio 40%.
Solución B: Ácido Nítrico concentrado
Reacción Xantoproteica
Al mezclar la
muestra con HNO3
Al calentar 4
min a 100ºC
Al agregar 1
gota de NaOH
Grupo R Aminoácidos
Presentes.
2 ml
Albumina
Coloración
Amarilla.
Coloración
Amarilla
Coloración
Naranja
(Positivo)
Anillo
bencénico
Tyr.
Trp.
Phe.
2 ml
Caseína
Coloración
Amarilla.
Coloración
Amarilla.
Coloración
Naranja
(Positivo)
Anillo
bencénico
Tyr.
Trp.
Phe.
2 ml
Gelatina
Incoloro
(negativo)
Incoloro
(negativo)
Coloración
Naranja
(Positivo)
Anillo
bencénico
Tyr.
Trp.
Phe.
2 ml
Glicina
Incoloro
(negativo)
Incoloro
(negativo)
Incoloro
(negativo)
-
-
2 ml
Resorcina
Coloración
Vinotinto.
Coloración
Vinotinto
Coloración
Naranja
(Positivo)
Anillo
bencénico
-
2 ml
Histidina
Incoloro
(negativo)
Incoloro
(negativo)
Incoloro
(negativo)
-
-
2 ml
Arginina
Incoloro
(negativo)
Incoloro
(negativo)
Incoloro
(negativo)
-
-
2 ml
Tirosina
Coloración
amarilla
Coloración
amarilla
Coloración
Naranja
(Positivo)
Anillo
Bencénico
tirosina.
Reacción de Million:
Llamada también de Hofmann, es específica para determinar tirosina,
aunque lo que se determina son los grupos hidroxifenilos que pueden
nitrarse fácilmente. El reactivo es una solución de nitrato mercúrico con acido
nítrico; el color rojo que se forma al reaccionar la tirosina con el reactivo se
cree que se debe al complejo mercúrico con los derivados
nitrofenol.
Cuando se añade el reactivo a una solución proteica, se forma
primero un precipitado blanco, que corresponde a la proteína
coagulada por el calor, pero si la proteína contiene tirosina, ese
coágulo tomara un color rojo al prolongar el calentamiento.
Solución A: Mercurio Metálico 100g.
Solución B: Ácido Nítrico 140 ml.
Reacción de Millón
Al mezclar la muestra
con 5 gotas del
reactivo de Millón.
Al calentar 2
min a 100ºC Grupo R
Aminoácidos
Presentes.
2 ml
Albumina Precipitado Blanco
Precipitado
Rojo.
(Positivo)
Hidroxibenceno. Tyr.
2 ml Caseína Precipitado Blanco.
Precipitado
Rojo.
(Positivo)
Hidroxibenceno. Tyr.
2 ml Gelatina Precipitado Blanco. Negativo
2 ml Glicina Incoloro (negativo) Incoloro
(negativo)
-
-
2 ml
Resorcina Precipitado Blanco.
Incoloro
(negativo) Hidroxibenceno.
-
2 ml
Histidina Incoloro (negativo)
Incoloro
(negativo)
-
-
2 ml Arginina Incoloro (negativo) Incoloro
(negativo)
-
-
2 ml Tirosina Precipitado Blanco.
Precipitado
Rojo.
(Positivo)
Hidroxibenceno. Tirosina
Reacción de HopsKings-Cole:
Los derivados indol dan productos de condensación
cuando se tratan con aldehídos aromáticos en presencia de
ácido sulfúrico o clorhídrico; el aminoácido triptófano contiene un
grupo indol y por eso la reacción es específica para el triptófano.
Cuando se agrega el reactivo a una solución y se añade lentamente
una capa de ácido sulfúrico concentrado, se formara un anillo de color violeta
en la interface de los líquidos.
Reactivo Glioxílico(p/v): Mg 10g en 250 ml sol. Sat. Ac. Oxálico.
Ácido sulfúrico concentrado.
Reacción Hopkins- Cole
Al mezclar la muestra con 2
ml del Reactivo Glioxílico y
con 2 ml acido sulfúrico
Grupo R Aminoácidos
Presentes.
2 ml Albumina
Formación de interfase
violeta
(Positivo)
Anillo Indol Trp.
2 ml Caseína
Formación de interfase
violeta
(Positivo)
Anillo Indol. Trp.
2 ml Gelatina No se Formó una interfase
Anillo Indol.
Trp.
2 ml Glicina No se Formó una interfase
Reacción de Sakaguchi:
Es una reacción de los compuestos que contengan grupo
guanido o guanidino. De ahí que sea una indicación de la presencia
de arginina libre o en proteínas. La prueba consiste en tratar la
muestra con alfa-naftol e hipoclorito de sodio o hipobromito de sodio
con lo cual se desarrollara un color rojo pardusco.
Hidróxido de Sodio 40%.
Hipoclorito de Sodio 5%.
α-naftol en etanol 1%
- -
2 ml Resorcina No se Formó una interfase Anillo Indol
-
2 ml Histidina No se Formó una interfase
-
-
2 ml Arginina No se Formó una interfase
-
-
2 ml Tirosina No se Formó una interfase
-
.
Reacción de Sakaguchi.
Al mezclar la muestra con
10 gotas de NaOH , 3
gotas de α-naftol y 20
gotas de NaOCl
Grupo R Aminoácidos
Presentes.
3 ml
Albumina
Coloración Rojo
parduzco.
(Positivo)
guanidino Arg.
3ml Caseína
Coloración Rojo
parduzco.
(Positivo)
guanidino Arg.
3ml Gelatina
Coloración Rojo
parduzco.
(Positivo)
guanidino Arg.
.
3ml Glicina Incoloro (negativo)
-
-
3ml
Resorcina Incoloro (negativo) -
-
3ml
Histidina Incoloro (negativo)
-
-
3ml
Arginina
Coloración Rojo
parduzco.
(Positivo)
guanidino
Arg.
3ml Tirosina Incoloro (negativo) - -
Reacción de Tiogrupos:
Esta reacción dará positiva con aquellos
aminoácidos que presenten azufre en su estructura, como
son la cisteína, cistina y metionina. La reacción consiste
en someter la muestra a una hidrólisis alcalina con
hidróxido de sodio según la siguiente ecuación; de esta manera el sulfuro de
sodio se encuentra libre para reaccionar con el acetato de plomo
obteniéndose una coloración negra o marrón evidenciando la presencia de
azufre en la muestra.
Solución A: Hidróxido de sodio 40%.
Solución B: Acetato de plomo 10%
Reacción de Tiogrupos
Al mezclar la muestra con
0.5 ml de NaOH y 2 gotas
de Acetato de Plomo.
Grupo R Aminoácidos
Presentes.
0.5 ml
Albumina
Precipitado Negro
(Positivo) Azufre (S).
Cys.
Met.
0.5 ml
Caseína
Precipitado Negro
(Positivo) Azufre (S).
Cys.
Met.
0.5 ml
Gelatina Incoloro (negativo) Azufre (S).
Cys.
Met.
Reacción de Pauly:
Las moléculas proteicas que poseen grupos imidazol
(Histidina) e Hidroxibenceno (tirosina) en su estructura
reaccionan con el reactivo de ácido sulfanilíco diazotizado
formando compuestos de diazonio naranja y amarillo.
0.5 ml
Glicina Incoloro (negativo)
-
-
0.5 ml
Resorcina Incoloro (negativo) -
-
0.5 ml
Histidina Incoloro (negativo)
-
-
0.5 ml
Arginina Incoloro (negativo)
-
-
0.5 ml
Tirosina Incoloro (negativo) -
-
Nitrato de sodio al 5%
Carbonato de Sodio 1%
Ácido Sulfanilico 1% en HCL 1N
Reacción de Pauly
Al mezclar la muestra con
1 ml de ácido sulfanilico,
1 ml de NaNO2 y 2ml de
Na2CO3
Grupo R Aminoácidos
Presentes.
2 ml
Albumina
Coloración Amarillo
(Positivo)
imidazol e
Hidroxibenceno
His.
Tyr.
2 ml
Caseína
Coloración Amarillo
(Positivo)
imidazol e
Hidroxibenceno
His.
Tyr.
2 ml
Gelatina
Coloración Amarillo
(Positivo)
imidazol e
Hidroxibenceno
His.
Tyr.
2 ml
Glicina Incoloro (negativo) - -
2 ml
Resorcina
Coloración amarillo
tenue
(Positivo)
Hidroxibenceno
-
2 ml
Histidina
Coloración amarillo
(Positivo) imidazol Histidina
2 ml
Arginina Incoloro (negativo)
2 ml
Tirosina
Coloración amarillo
(Positivo) Hidroxibenceno
tirosina
SEMANA II- PARTE II: CROMATOGRAFÍA EN
PAPEL.
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS.
La cromatografía, permite separar uno o varios componentes
presentes en mezclas moleculares, mediante una serie de procedimientos.
Se basa en una diferencia de afinidades de los solutos entre dos fases
inmiscibles.
Una fase es estacionaria, la cual puede ser un sólido poroso,
finamente dividido o un líquido puesto en capas delgadas sobre un material
de soporte inerte. La fase móvil puede ser un líquido puro o una mezcla de
soluciones o puede ser un gas. Existen muchos tipos de cromatográfias en la
presente practica se estudiara la cromatografía en papel y de exclusión
molecular.
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL:
FUNDAMENTO:
Es un método de separación que consta de una fase móvil que se
desplaza por capilaridad en el papel de filtro, dicha fase la constituye la
mezcla orgánica saturada con agua. Y el papel de filtro conforma la fase
estacionaria.
PROCEDIMIENTO:
MUESTRAS REACTIVOS
o Tirosina 1% (p/v) en agua. o Arginina1% (p/v) en agua.
o Mezcla de ambos aminoácidos
Solvente Fase Móvil: Butanol 8ml.
Ácido acético 2ml. Agua 10ml.
Ninhidrina 0.5% en acetona
1. Cortar el papel de filtro del tamaño rectangular, luego trazar una
raya horizontal de 1cm en uno de los extremos.
2. Marcar tres “x” de distancias iguales.
3. Luego se siembra la muestra usando una pipeta automática.
4. A medida que se va sembrando se va secando con el secador.
5. Se prepara la parte orgánica, luego se deja reposar para
decantarlo y separarlo de la parte acuosa.
6. Se decanta y se vierte en la cubeta.
7. Se enrollan los papeles de filtro en los tubos de vidrio q se
encuentran en la parte superior dejando que donde se colocó la
muestra toque la solución.
8. Se deja por un tiempo determinado y luego se saca para que
sequen y se revelan con una solución de ninhidrina.
REVELADO:
Una vez esperadas las 24 horas sacar el papel y dejar sacar al aire. Al
papel de filtro se le salpica solución de ninhidrina, luego se seca usando aire
caliente con el secador y se procede a leer.
Luego proceder a determinar el Rf de cada muestra y comparar Rf de
patrones con las muestras.
Resultados
Muestra Distancia recorrida
por la muestra
Distancia del
frente del
solvente
Rf
Tirosina 1% (p/v) en agua.
7.6 cm 14 cm 0.54
Arginina 1% (p/v) en agua.
4.5 cm 14 cm 0.32
ANÁLISIS DE RESULTADOS
REACCIONES DE COLORACIÓN Y CROMATOGRAFÍA EN PAPEL.
Se realizaron dos experimentos, los cuales fueron las reacciones de
coloración generales, así como una gran variedad de reacciones
específicas; el otro experimento fue la cromatografía de papel.
En el caso de las reacciones de coloración, específicamente en las
generales, se practicaron 2 tipos: la reacción de Biuret y la reacción de
Ninhidrina.
En la reacción de Biuret los resultados positivos fueron: la albumina,
caseína y gelatina, esto se debe a que poseen 2 o más enlaces peptídicos,
ya que esta reacción es específica para las proteínas que presenten estas
características. Las demás muestras fueron negativas: glicina, Histidina,
arginina y tirosina, esto se debe a que se tratan de aminoácidos, los cuales
no poseen enlaces peptídicos como para que den positivo en la reacción. En
el caso de la resorcina, dio también un resultado negativo, ya que no se trata
de un aminoácido, péptido o proteína, sino que es un compuesto aromático
no proteico.
En cambio, en el caso de la reacción de Ninhidrina dio positivo para:
albumina, caseína, gelatina, glicina, Histidina, arginina y tirosina, ya que son
tanto: aminoácidos, péptidos o proteínas, esto se debe a que poseen un
extremo amino libre y un extremo carboxilo libre, para los que la Ninhidrina
reacciona. En el caso de la resorcina obtuvo un resultado negativo, ya que,
es un compuesto aromático no proteico y no posee los extremos terminales a
los cuales reacciona dicha reacción.
Ambas reacciones generales demostraron ser eficaces para el
reconocimiento de proteínas, pero la Ninhidrina es más general ya que
abarca tanto: aminoácidos, péptidos y proteínas, en cambio la reacción de
Biuret es más específica, porque solo reacciona con los péptidos que posean
2 o más enlaces peptídicos.
Por otra parte, en las reacciones especificas se practicaron diversas
de ellas las cuales fueron: la reacción Xantoproteica, Millón, Hopkins-cole,
Tiogrupos, Sakaguchi y Pauly, los resultados fueron diversos ya que estas
reacciones se rebelan en presencia de compuestos químicos en las cadenas
laterales de: los aminoácidos, péptidos o proteínas. En el caso de la reacción
Xantoproteica, las muestras que dieron positivos fueron: albumina, caseína,
gelatina, resorcina y tirosina; esto se debe a que estas proteínas y
aminoácidos poseen en sus cadenas laterales un anillo bencénico, por
consiguiente estas muestras poseen los aminoácidos: Fenilalanina, Tirosina
y Triptófano, ya que son aminoácidos aromáticos; en el caso de las muestras
que dieron negativas en esta reacción se debe a que no poseen dicha
estructura en sus cadenas laterales. Cabe destacar que la resorcina a pesar
de no ser ni aminoácido o proteína, arrojo un resultado positivo ya que es un
compuesto aromático.
En el caso de la reacción de Millón los resultados positivos fueron de:
albumina, caseína, gelatina y tirosina, esto se debe a que en sus cadenas
laterales poseen un radical de Hidroxibenceno, característico de la tirosina al
este reactivo es específico. Las otras Muestras dieron negativo, ya que no
poseen dicho aminoácido.
En cambio en el caso de la reacción de Hopkins-Cole, las muestras
cuyo resultado fue positivo fueron: albumina, caseína y gelatina. Esto se
debe a que estas proteínas poseen el grupo químico del anillo indol,
especifico del aminoácido Triptófano. Las muestras que dieron negativo, se
debe a que no poseen ni el anillo indol ni el aminoácido triptófano.
En la otra reacción específica, la cual fue la reacción de Tiogrupos, la
muestra que dio un resultado positivo fue la albumina, esto se debe a que
en su estructura presenta azufre, la cual es característica de los aminoácidos
como cisteína y metionina. Las demás muestras dieron negativo, a pesar de
que en el caso de la caseína y la gelatina poseen cisteína y metionina pero
en pocas cantidades, lo que hace que no reaccione el reactivo con las
proteínas.
En el caso de la reacción de Sakaguchi, las muestras que dieron
positivo fueron: albumina, caseína, gelatina y arginina. En este momento
esta reacción positiva se debe a la presencia del grupo guanidino, el cual es
específico para el aminoácido arginina, por consiguiente quiere decir que en
las estructura de estas muestra presentan dicho aminoácido. Las demás
muestras reaccionaron negativas por no poseer arginina.
La reacción de Pauly da un resultado positivo en el caso de que en la
estructura de las proteínas o aminoácidos presenten: el grupo imidazol, el
cual es característico del aminoácido Histidina, las muestras que poseen ese
aminoácido fueron: albumina, caseína y gelatina, pero solo dieron positivo
para la reacción la albumina y la caseína, ya que la gelatina posee en pocas
cantidades. El otro grupo al cual la reacción de Pauly es específica, es al
hidroxibenceno característico de la tirosina, y en este caso dieron positivo:
albumina, caseína, gelatina, resorcina y tirosina, recordando una vez más
que la resorcina no es un aminoácido pero igual da positivo por poseer el
grupo hidroxibenceno en su estructura. Las muestras que dieron negativo, es
porque no poseen ninguno de los dos aminoácidos.
Estas reacciones tanto generales como específicas, son de gran
utilidad en el Laboratorio clínico, ya que pueden determinar cualitativamente
la presencia de proteínas, péptidos o aminoácidos, presentes en una
muestra biológica, lo cual podría estar relacionado a alguna patología, por lo
que ayudaría al diagnóstico y a la búsqueda del tratamiento más adecuado
para el paciente.
El otro experimento realizado fue la de la cromatografía en papel, la
cual es fundamental para el análisis bioquímico, debido a su capacidad de
separar de manera eficiente moléculas pequeñas como aminoácidos,
oligopéptidos, nucleótidos y oligonucleótidos.
En esta cromatografía el solvente moja al papel por capilaridad
debido a su naturaleza fibrosa; el componente acuoso del solvente se une a
la celulosa del papel y forma con este una fase estacionaria de tipo gel. El
componente orgánico del solvente continúa migrando lo que constituye la
fase móvil. Las velocidades de migración de las distintas sustancias que se
requieren separar están gobernadas por sus solubilidades relativas en la fase
estacionaria polar y la fase móvil no polar; en un solo paso del proceso de
separación cada soluto se distribuye de acuerdo a su coeficiente de partición
por lo tanto, las moléculas se separan de acuerdo a sus polaridades, de
manera que las nos polares se mueven más rápido que las polares.
Las muestras usadas para este experimento fueron metionina y
glicina como patrón y una mezcla de ambas para comparar y confirmar la
presencia de esos aminoácidos en la dicha mezcla. Partiendo de que la
metionina es un aminoácido esencial y por el contrario la glicina es un
aminoácido no esencial pero ambas son no polares, se tomó este
fundamento para colocarlos a recorrer por capilaridad en la fase estacionaria
que fue un soporte de papel de filtro junto con las muestras sembradas, de
este modo se determinara la velocidad de migración de una sustancia que
puede expresarse según la relación Rf que es la distancia recorrida por la
sustancia considerada y distancia recorrida por el frente del solvente. Para
un sistema de solventes y un tipo de papel determinado cada sustancia tiene
un valor de Rf característico y en este caso fue de 14cm.
Al revelar la cromatografía con Ninhidrina, la metionina recorrió
una distancia de 7.6 cm, por lo que obtuvo un Rf de 0.54, lo que indica que
la muestra de metionina que compone la fase móvil, es más soluble a la fase
móvil que era una solución de: butanol, ácido acético y agua, por lo que
subió por capilar una mayor distancia.
En el caso de la glicina, la distancia que recorrió fue de 4.5cm y su Rf
fue de 0.32, lo que indica que este aminoácido es menos soluble en la fase
móvil que la metionina. Así como también en el caso de la mezcla, las
distancias recorridas fueron la misma, confirmando entonces la presencia de
dichos aminoácidos en la mezcla.
SEMANA III: CUANTIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS Y
CROMATOGRAFÍADE
EXCLUSIÓN MOLECULAR.
PARTE I: CROMATOGRAFÍA DE EXTRACCIÓN MOLECULAR
Mezclar: 0,4 ml Gelatina 3% (p/v) +
0,2 ml. Riboflavina 0,3 %
(p/v).
En la Bureta: Sephadex G-25. Agua destilada
PREPARACIÓN DE LA COLUMNA CROMATOGRAFICA
PROCEDIMIENTO:
1. Marcar 10 tubos de ensayo 3,5 ml.
2. Lentamente agregar la mezcla a separar por las paredes de la
columna.
3. Colectar el eluido, manteniendo hidratada la columna hasta obtener la
décima fracción.
4. Leer la D.O y Positividad de Biuret.
Suspender 4g de
Sephadex G-25 en NaCl
0,85%
Con varilla de vidrio y lana
de vidrio: Obturar la punta
de la columna
.
PASADAS LAS 3 HORAS: Vertir por la
pared de la columna la suspención del
gel, manteniendolo HIDRATADO.
Biuret D.O
1º Fracción - 0,00
2º Fracción - 0,24
3º Fracción - 0,11
4º Fracción - 1,4
5º Fracción - 0,69
6º Fracción - 0,37
7º Fracción - 0
8º Fracción - 0.35
9º Fracción
10º Fracción
GRÁFICO DE POSITIVIDAD DE BIURET Y D.O
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Biuret
D.O
SEMANA III – PARTE II:
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
(MÉTODO DE BIURET Y MÉTODO
DE LOWRY).
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las
moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente
todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de
este tipo de moléculas.
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es
una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación
de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica
de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así
como para muchos otros propósitos. Existen diferentes métodos para la
cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la
propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la
formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas
de unir ciertos colorantes.
MÉTODO DE BIURET.
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los
grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. La intensidad de coloración
es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la
reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La
sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de
proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
Las características más importantes de la reacción son:
La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los
péptidos y proteínas.
Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml.
No depende de la composición de aminoácidos.
Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción.
La reacción de biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la
formación de un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen
más de un enlace peptidico, como las proteínas.
Reacción de Biuret.
MUESTRA REACTIVOS
Patrón de Proteínas 5,4g/dl
Suero Sanguíneo (100µL + 400 µL
H2O)
Reactivo de Biuret
Tubo 0 1 2 3 4 5 6
Patrón (µL) 0 10 20 30 50 65 100
Agua (µL) 500 490 480 470 450 435 400
Biuret (mL) 5 5 5 5 5 5 5
O.D 0 0.17 0.18 0.19 0.20 0.23 0.28
Concentración
Patrón
0 0.54 1.08 1.62 2.7 3.51 5.40
O.D Muestra de Suero: 0.21
R² = 0,6911
Calibración:
MÉTODO DE LOWRY
El método de Lowry utiliza el reactivo de fenol-Folin-Ciocalteu. En este
método se desarrollan dos reacciones coloridas: primero se desarrolla un
color de poca intensidad con el cobre en medio alcalino; después se forma
un color azul-verde con el reactivo mencionado, que contiene molibdato de
sodio y tungstato de sodio en presencia de ácido fosfórico y clorhídrico, que
reacciona con los aminoácidos aromáticos (tirosina), fenilalanina y triptófano
de la proteína.
En este experimento se preparará una curva de calibración utilizando
albúmina. La curva de calibración se construye llevando a cabo la reacción
de Lowry con concentraciones crecientes de albúmina, lo que genera tubos
con intensidad creciente de color. La intensidad del color formado se puede
interpolar en la curva de calibración de la albúmina, y así determinar un valor
aproximado.
MUESTRA REACTIVOS
Patrón de
Albúmina 1mg/ml
Orina
Sol A: Na2CO3 4% p/v en NaOH
0,1 N, CuSO4 2%, C4H4O6KNa
4% (100:1:1)
Sol B: Reactivo Folin -
Ciocalteau
Tubo 1 2 3 4 5 6
Patrón (µL) 0 20 40 60 80 100
Agua (µL) 500 480 460 440 420 400
Sol. A (mL) 5 5 5 5 5 5
Agitar y calentar por 15 min a 40ºC
Sol. B (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Mezclar vigorosamente y dejar a temperatura ambiente 30 min
O.D 0 0,39 0,60 0,75 1 1,2
Concentración
Patrón
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
O.D Muestra de Orina Concentrada: 0,39
O.D Muestra de Orina Diluida: 0,09
Calibración: A = m* C + b
C orina concentrada = A– b
m
Lo mismo se aplica para la diluida.
ELECTROFORESIS.
La electroforesis es una técnica para separación de moléculas según la
movilidad de estas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse
sobre la superficie hidratada de un soporte solido (electroforesis en papel), o
bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en
disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la
separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas
y a su masa. Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más
pequeñas han llegado al ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la
adición de un colorante específico para hacerlas visibles.
Factores que afectan a la electroforesis.
En general la electroforesis depende directamente del campo eléctrico y
este depende de distintos parámetros. Basándose en la ley de ohm se tiene
que:
V=IR
Diferencia de Potencial (V): define el campo eléctrico; la velocidad de
avance es directamente proporcional a ella.
Resistencia (R): la movilidad de las moléculas es inversamente
proporcional a ella.
Intensidad (I): cuantifica el flujo de carga eléctrica, se relaciona
directamente con la distancia recorrida por las moléculas.
Por último, otro factor que afecta significativamente a la electroforesis es
la temperatura, esta es importante puesto que por el efecto Joule el paso de
una corriente eléctrica va a producir calor y este es directamente proporcional
a la diferencia de potencial y a la resistencia. Por lo tanto, es necesario
controlar de manera estricta la temperatura para que esta no afecte a la
muestra desnaturalizándola, y otros factores como el pH ya que definirá la
carga de la proteína, fuerza iónica del medio, forma tamaño y estructura
primaria, intensidad del campo eléctrico.
Tipos de electroforesis.
Electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas por los
científicos para separar moléculas basándose en propiedades como el
tamaño, la forma o el punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se utiliza
generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica
preparativa para purificar moléculas.
Electroforesis de zona: las proteínas son moléculas anfóteras su
carga neta depende del pH del medio. Normalmente, la separación
electroforética de proteínas se hace a pH alcalino, en el que la mayoría de
las proteínas presentan una carga global negativa. También se puede
trabajar a pH ácidos, pero no demasiado bajos, ya que las proteínas
precipitan en medio ácido (básicamente se usa en la detección de variantes
de la hemoglobina).
Isoelectroenfoque: en lugar de separar las proteínas en función de
su carga a un pH dado, se separan en función de su punto isoeléctrico (pI): el
pI es el pH en el que la carga neta de la proteína es nula, y depende de la
composición aminoacídica de la proteína. Se crea un gradiente de pH
mediante anfolitos (estabilizan el pH a lo largo del gel). Cada proteína
migrará hasta alcanzar su pI, punto en el cual precipitará al acumularse (de
ahí el nombre, isoelectroenfoque).
Separación por tamaño: permite separar proteínas y ácidos
nucleicos. En el caso de las proteínas, deben ser tratadas con SDS (sodio
dodecil sulfato) para que su carga sea negativa y todas migren hacia el
ánodo (no es necesario hacer eso con los ácidos nucleicos, ya que tienen
carga negativa); la separación se hace en medios de soporte en el que se ha
creado un tamiz molecular (matriz), que hace que las proteínas más
pequeñas corran más que las más grandes.
Electroforesis en suero sanguíneo: la electroforesis es una técnica
de laboratorio, en la cual el suero sanguíneo (la parte líquida de la sangre sin
células) se coloca en un papel especialmente tratado y luego se expone a
una corriente eléctrica. Las proteínas en el suero se mueven en el papel para
formar bandas que muestran la proporción de cada fracción de proteína. Una
fracción puede contener varios tipos diferentes de proteínas.
Las proteínas individuales, con excepción de la albumina,
generalmente no se miden; sin embargo, sí se miden las fracciones o grupos
de proteínas. Los niveles de las fracciones de proteínas se pueden calcular
midiendo la proteína sérica total y luego multiplicando eso por el porcentaje
relativo de cada fracción de proteína.
Las proteínas séricas se clasifican como albúmina y globulinas. La
albúmina es la proteína de mayor concentración en el suero. Trasporta
muchas moléculas pequeñas, pero también es importante para impedir que
el líquido se escape de los vasos sanguíneos hacia los tejidos.
Las globulinas se dividen en alfa-1, alfa-2, beta y gammaglobulinas. En
general, los niveles de las proteínas alfa y gammaglobulinas aumentan
cuando hay inflamación en el cuerpo.
Valores normales:
Proteína total: 6.4 a 8.3 g/dL
Albúmina: 3.5 a 5.0 g/dL
Alfa-1 globulina: 0.1 a 0.3 g/dL
Alfa-2 globulina: 0.6 a 1.0 g/dL
Beta globulina: 0.7 a 1.2 g/dL
Gammaglobulina: 0.7 a 1.6 g/dL
Algunas enfermedades al alterarse los valores normales:
La disminución de la proteína total puede indicar:
Cirrosis.
Desnutrición.
Síndrome nefrótico.
Enteropatía gastrointestinal por pérdida de proteínas.
El aumento de las proteínas alpha-1 globulina puede deberse a:
Enfermedad inflamatoria aguda.
Cáncer.
Enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo artritis reumatoidea).
El aumento de las proteínas alfa-2 globulinas puede indicar:
Inflamación aguda.
Inflamación crónica.
La disminución de las proteínas alfa-2 globulinas puede indicar:
Hemolisis.
El aumento de las proteínas beta globulinas puede indicar:
Hiperlipoproteinemia.
Terapia de estrógenos.
La disminución de las proteínas beta globulinas puede indicar:
Trastorno de coagulación congénito.
Coagutopatía de consumo.
Coagulación intravascular diseminada.
El aumento de las proteínas gama globulinas puede indicar:
Mieloma múltiple.
Enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo, artritis reumatoidea,
LES).
Hiperinmunización.
Infección aguda.
CÁLCULOS:
Albúmina Alfa 1
2,9 ----------- 100% 2,9 ----------- 100%
x ----------- 58,88% 0,11 ----------- 3,87%
x=1,7 x=0,11
Alfa 2 Beta 1
2,9 ----------- 100% 2,9 ----------- 100%
x ----------- 12,55% x ----------- 12,28
x=0,36 x=0,35
Beta 2 Gamma
2,9 ----------- 100% 2,9 ----------- 100%
x ----------- 1,55% x ----------- 10,87%
x=0,044 x=0,31
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Cromatografía de extracción molecular
La cromatografía de filtración en gel, también denominada de
exclusión por tamaño o de tamiz molecular, las moléculas se separan según
su forma y tamaño. En esta técnica, la fase estacionaria está compuesta por
microesferas de un material hidratado esponjoso que contiene poros con un
rango relativamente estrecho de diámetro. Si en una columna esos tamices
moleculares se pasa una solución acuosa con moléculas de distintos
tamaños, las que son demasiado grandes para ingresar a los poros se
excluyen del volumen de solvente ubicado en el interior de las microesferas.
Por lo tanto, estas moléculas grandes atraviesan la columna con más
rapidez, esto es, en un volumen menor de eluyente, que las moléculas que
logran ingresar en los poros
Las especies químicas con masas moleculares por debajo del límite
de exclusión de un gel se eluirán de el en el orden de sus masas; las más
grandes se eluirán en primer término. Esto se debe a que el tamaño de los
poros en todo el gel varia dentro de un rango limitado, de manera que las
moléculas más grandes tienen a su disposición menor volumen interior del
gel que las pequeñas. Este efecto es la base de dicha cromatografía.
En el laboratorio se procedió a separar un mezcla de Gelatina al 3%
(p/v) que es una proteína cuyo peso molecular es de aproximadamente de
300.000 Dalton y Riboflavina al 0.3% (p/v) que es la vitamina B2 el cuál tiene
un color amarillo característico, cuyo peso molecular es de 376,37 Dalton.
Para saber en cuál de las fracciones obtenidas se encontraba la
Riboflavina, por lo que se procedió a leer su absorbancia a una γ de 430 nm,
específico para el color amarillo característico en este caso de la vitamina. El
mayor pico de absorbancia de observó en la 4° fracción del eluido. Cabe
resaltar que la Riboflavina se obtuvo en las primeras alícuotas por tener un
mayor peso molecular.
Gráficamente se puede observar la separación de los dos
compuestos, ya que uno se encontró en la fracción número cuatro y la otra
en la fracción número. Esto ocurrió debido a que las moléculas mayores que
los poros (Riboflavina) no pueden entrar en ellos, por lo que "pasan de largo"
y avanzan por la columna con mayor rapidez que las de tamaño menor, que
pueden entrar en los poros y así realizan un recorrido mayor, avanzando más
lentamente a lo largo de la columna; en este caso la molécula que entró
dentro del Sephadex fue la Gelatina, en consecuencia fue la última en eluir.
Cuantificación de proteínas
Algunos de los métodos que permiten cuantificar la cantidad de
proteínas que se encuentran presentes en una muestra biológica es el
método de Lowry. Tiene la ventaja de ser extremadamente sensible, capaz
de detectar cantidades del orden de 10 microgramos de proteína; por eso es
un buen método para analizar las proteínas en la orina, ya que ésta, debe
poseer cantidades muy bajas de proteína. Cuando se trata con mezclas
biológicas complejas, se puede perfectamente calibrar el método con alguna
proteína comercial, como se realizó con la solución patrón de Albúmina 1
mg/ml
La reacción que tiene lugar en el método de Lowry es bastante
compleja. Se desarrolla en las siguientes fases:
1.-Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+, en
presencia de tartrato para evitar la precipitación. Es esencialmente idéntica a
la reacción del Biuret, formándose un complejo de coordinación entre el
cobre y el nitrógeno peptídico.
2.-Reacción con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles (ácido
fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol (y en
menor medida imidazol e indol) presentes en la proteína a un complejo de
color azul oscuro, que se mide colorimétricamente. El complejo coloreado,
cuya composición es desconocida, se puede cuantificar con una curva de
calibración que se hace a partir de la albúmina patrón, midiendo la
absorbancia a 660 nm.
Conclusión:
Los picos obtenidos en la gráfica, después de la cromatografía
resultado de la prueba de Biuret y la absorbancia; representaron zonas
individuales de la Gelatina y de la Riboflavina, que al compararlas se pudo
observar que hay diferencias en sus dimensiones moleculares. Por lo cual la
técnica de separación por medio de la Cromatografía por exclusión molecular
fue conveniente.
El método de Lowry nos indica la cantidad de proteínas que se
encuentran presente en la orina, la concentración obtenida es de 0,28 para la
concentración la cual corresponde con los valores normales de las proteína
en orina.
Otro método de cuantificación de proteína fue Buiret, donde se pudo
valorar cuantitativamente las proteínas presentes en el suero sanguíneo,
obteniéndose una concentración 2,9 mg/ml . Sin embargo debemos tomar en
cuenta los valores normales de las proteínas en el suero sanguíneo , al
compararlos con el resultado obtenido presenta un error, debido a que este
no es compatible con la vida humana. Este margen de error es producto de
un mal manejo de la utilización de las pipetas al realizar el experimento.
GLOSARIO
Albúmina: es una proteína que se encuentra en gran proporción en el
plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre y una de las más
abundantes en el ser humano. Es sintetizada en el hígado.
Aminoácido: es una molécula orgánica con un grupo amino (-NH2) y
un grupo carboxilo (-COOH ) unidos a un carbona central.
Anfótero: es aquella sustancia que puede reaccionar ya sea como un
ácido o como una base.
Arginina (arg o R) es uno de los 20 aminoácidos que se encuentran
formando parte de las proteínas. En el tejido hepático, la arginina puede ser
sintetizada en el ciclo de la ornitina (o ciclo de la urea). Se clasifica, en
población pediátrica, como un aminoácido esencial. Este aminoácido se
encuentra involucrado en muchas de las actividades de la glándulas
endocrinas.
Caseína: (del latín caseus, "queso") es una fosfoproteína (un tipo de
heteroproteína) presente en la leche y en algunos de sus derivados
(productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra
en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que
se ha denominado caseinógeno.
Cisteína: es un α-aminoácido con la fórmula química
HO2CCH(NH2)CH2SH. Se trata de un aminoácido no esencial, lo que
significa que puede ser sintetizado por los humanos.
Coloide: en física y química un coloide, sistema coloidal, suspensión
coloidal o dispersión coloidal es un sistema fisicoquímico formado por dos o
más fases, principalmente: una continua, normalmente fluida, y otra dispersa
en forma de partículas; por lo general sólidas.
Desnaturalización: es un cambio estructural de las proteínas o ácidos
nucleicos, donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su óptimo
funcionamiento y a veces también cambian sus propiedades físico-químicas.
Enlace peptídico: es un enlace entre el grupo amino (–NH2) de un
aminoácido y el grupo carboxilo (–COOH) de otro aminoácido.
Fenilalanina: es un aminoácido. Se encuentra en las proteínas como
L-fenilalanina (LFA), siendo uno de los ocho aminoácidos esenciales para
humanos.
Gelatina: es una mezcla coloide (sustancia semisólida), incolora,
translúcida, quebradiza e insípida, que se obtiene a partir del colágeno
procedente del tejido conectivo de animales hervidos con agua.
Glicina o glicocola: es uno de los aminoácidos que forman las
proteínas de los seres vivos.
Histidina: es un aminoácido esencial (no puede ser fabricado por el
propio organismo y debe ser ingerido en la dieta). Es uno de los 22
aminoácidos que forman parte de las proteínas codificada genéticamente.
Péptidos: son un tipo de molécula formadas por la unión de varios
aminoácidos mediante enlaces peptídicos.
Plasma: es la fracción líquida y acelular de la sangre, es decir, se
obtiene al dejar a la sangre desprovista de células como los glóbulos rojos y
los glóbulos blancos. Está compuesto por un 90% de agua, un 7% de
proteínas, y el 3% restante por grasa, glucosa, vitaminas, hormonas,
oxigeno, gas carbónico y nitrógeno, además de productos de desecho del
metabolismo como el ácido úrico.
Proteínas: son macromoléculas formadas por cadenas lineales de
aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
Punto isoeléctrico: es el pH en el cual la sustancia anfótera tiene
carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los
aminoácidos y también en las proteínas.
Renaturalización: al proceso en la cual una proteína desnaturalizada
(cuando la proteína ha sido alterada y ha cambiado su estructura terciaria
pero mantiene su estructura primaria). Regresa a su conformación anterior
que se conoce como estructura nativa (original).
Tirosina: es uno de los 20 aminoácidos que forman las proteínas. Se
clasifica como un aminoácido no esencial en los mamíferos ya que su
síntesis se produce a partir de la hidroxilación de otro aminoácido.
REFERENCIAS BIBLOGRAFICAS
