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> Fixation de l’azote atmosphérique (1h30)
I – ACTIVITE NITROGENASE et COMPLEXE NITROGENASE/REDUCTASE
1°) L’azote moléculaire (N2) est indisponible pour la plupart des êtres vivants, malgré son abondance dans
l’atmosphère (78%). Vous expliquerez pourquoi.
2°) Quelle enzyme clé permet la fixation du N2 par les êtres vivants ? Schématisez sa structure et écrivez
l’équation catalysée par cette enzyme en y faisant apparaître l’ATP et le pouvoir réducteur (d’où provient ce
pouvoir réducteur ?). Comment mesurer l’activité nitrogénase ?
Doc A : Voies biotiques et abiotiques de fixation (réduction) du N2.
Doc B : La nitrogénase.
La nitrogénase est une enzyme complexe, formée de 2 métalloprotéines, nommées protéines I et II, qui
comportent 3 groupements prosthétiques différents. La protéine I est un tétramère (2 et 2β) d’environ
220 kDa qui contient le cofacteur à fer et à molybdène (abrégé Fe-Mo co) au niveau duquel est réduit
l’azote moléculaire en ammoniaque (G0’=- 33,5 kJ/mol). La protéine II est un dimère de 68 kDa, formé
de 2 sous-unités identiques reliées par un groupement prosthétique unique 4Fe-4S qui reçoit
directement les électrons de la ferrédoxine ou d’une flavodoxine et assure leur transfert à la protéine I.
Ce transfert électronique est associé à l’hydrolyse d’ATP. Cette enzyme est codée par de nombreux
gènes, appelés nif, dont la régulation est très complexe. Si certains gènes impliqués dans la fixation de
l’azote, les gènes nif et fix, sont communs à tous les fixateurs symbiotiques, d’autres sont spécifiques de
chaque espèce de Rhizobium, tant au niveau de leur organisation que de leur régulation.
Nature
PHYSIOLOGIE VEGETALE
THEME 1 : Autotrophie - Nutrition carbonée THEME 3 : Relations hydriques THEME 2 : Nutrition minérale
3°) Qui sont les organismes diazotrophes ? Dans quelles structures ou conditions les retrouve-t-on ?
4°) Légendez :
Doc E : Quelques organismes fixateurs de l’azote moléculaire.
Doc C : Fixation biologique de l’azote par le complexe Nitrogénase/Hydrogénase. Pour chaque électron
fourni par l’intermédiaire de la réductase à la nitrogénase pour la réduction de l’azote il y a consommation
de 2 liaisons phosphates riches en énergie (2 ATP). Une molécule de H2 est formée en même temps que
celle de l’ammoniac.
Doc D : Réactions catalysée par la nitrogénase. En présence de N2 comme substrat, la réaction conduit
toujours, en plus de l’ammoniaque, à la production de dihydrogène par la réduction de protons. Le
complexe catalyse également la réduction d’analogues stériques du diazote, comme l’acétylène qui est
réduit en éthylène. L’éthylène produit est facilement dosable par chromatographie en phase gazeuse.
II – MORPHOLOGIE ET FORMATION DES NODOSITES
1°) Comment nomme-t-on le résultat de la symbiose nodulaire à l’échelle cellulaire ? Décrivez cette
structure.
2°) A l’aide de vos connaissances, définissez la rhizosphère. Vous expliciterez ensuite avec la méthode
appropriée la notion de « dialogue moléculaire » entre Rhizobium et les Fabales.
Doc F : Schéma de la libération des bactéries dans les cellules de la zone d’infection (zone II) et formation d’un symbiosome (d’après Kannenberg et Brewin, 1994).
Dans la cellule infectée, les bactéroïdes ne sont pas au contact direct du cytosol, mais isolés de celui-ci par une
membrane, de type plasmique, d’origine végétale, appelée membrane péribactéroïdienne. Elle est issue d’un
phénomène d’endocytose impliquant le système endomembranaire (Roth et Stacey, 1989). Cette vésicule peut
contenir un seul bactéroïde (Medicago, Trifolium, …) ou plusieurs (Glycine, Phaseolus, …) et constitue une entité
dénommée symbiosome (Roth et al, 1988). Chez le soja, les symbiosomes, évalués à environ 8 000 par cellule,
occupent plus de 80% du volume cellulaire. Les bactéroïdes contiennent la nitrogénase, enzyme qui assure la
réduction du N2.
Doc H : Rôle des produits des gènes nod dans la synthèse du principal facteur Nod de R. meliloti.
Doc G : Echange de signal d’infection.
Le processus de nodulation commence par un échange de signaux entre la plante hôte et la bactérie. Les
racines rejettent par leur métabolisme normal, des substances qui ont des effets attracteurs sur certains
microorganismes du sol (chimiotactisme). Certaines d'entre elles appartiennent au groupe des flavonoïdes
tels que les flavones, isoflavones, flavonone (Rasanen, 2002). Ce signal, une fois perçu par le rhizobium,
induit la production de facteurs Nod (Oldroyd, 2001). Ceux-ci sont des signaux de nodulation ciblant le
programme organogénétique de la plante (Patriarca et al.,2004).
3°) Relevez les principales étapes de la formation précoce de la nodosité. Vous construirez un schéma
approprié (vous pourrez compléter celui de la question précédente).
Doc I : Infection.
Les bactéries s'attachent aux racines par l'intermédiaire de la rhicadhésine ainsi que d'autres protéines
spécifiques localisées à la surface des cellules (Dardanelli et al., 2003; Perry et al.,2004). Les facteurs Nod
émis par les rhizobiums, induisent une dépolarisation de la membrane plasmique accompagnée d'une
oscillation du flux de Ca2+. Cette étape se poursuit par une induction de l'expression de gènes spécifiques
(Pelmont, 1995; Gage, 2004) et une modification de la croissance polaire des poils absorbants formant
une structure dite en « crosse de berger» qui enferme les rhizobiums (Esseling et al., 2003).
L'infection qui s'accompagne d'une digestion de la paroi cellulaire du poil racinaire peut avoir lieu à travers
les poils absorbants, les blessures, ou l'espace intercellulaire (Rasanen, 2002).
Doc J : Développement du nodule
Une fois que les parois des cellules de poils sont digérées, une structure tubulaire appelée filament
d'infection est formée. Elle se compose de cellules de la paroi nouvellement synthétisée qui formeront le
matériel entourant le Rhizobium. Le centre du tube est une glycoprotéine contenant quelques produits
bactériens et quelques glycoprotéines de la plante hôte (Gage, 2004).
Ces changements majeurs dans la forme des cellules et la croissance dirigée sont causées par des
altérations significatives dans le cytosquelette de la plante. La dépolymérisation de l'actine est l'un des
effets observés dans les poils absorbants suite à l'exposition au facteur Nod (Gage et Margolin, 2000).
Les bactéries prolifèrent à l'intérieur du cordon et vont se libérer dans le cytoplasme des cellules corticales,
via ce cordon, provoquant ainsi l'apparition du méristème dont l'activité est à l'origine de la formation du
nodule, dans laquelle les bacilles se différencient irréversiblement en bactéroïdes (Lindström et al., 2002).
Doc J : Développement de la nodosité (suite)
Ces dernières, de forme irrégulière, ont un volume supérieur à celui des formes libres. Ils ne se divisent
plus et ne synthétisent plus de protéines Nod mais se concentrent dans la production des nitrogénases
indispensables à la fixation de l'azote atmosphérique.
Les bactéroïdes sont séparés du cytoplasme végétal par une membrane de séquestration, la membrane
péribactéroïde, servant de plaque d'échange entre les bactéries et les cellules de la plante hôte. Dans
cette membrane les bactéries différenciées forment les bactéroïdes de fixation de l'azote (Pelmont, 1995;
Corbière, 2002).
Doc K : Maturation de la nodosité
Le nodule prend forme avec la multiplication des cellules du cortex. Il se charge de pigments appelés
leghémoglobine (LegHB, analogues de l’hémoglobine), synthétisés à l'intérieur du cytoplasme des cellules
de la plante. Le complexe enzymatique Nitrogénase/Hydrogénase est très sensible à l’oxygène. L'action
de la leghémoglobine est de maintenir l'oxygène à faible concentration dans l'environnement de l'enzyme,
compatible avec le fonctionnement de la fixation de l'azote. Les gènes de leghémoglobine sont activés 7 à
8 jours après l'infection chez le soja (Glycine). La première augmentation réelle de la transcription
commence dans les 4 jours apparents plus tard.
Le passage à l'état symbiotique s'accompagne d'une forte répression des gènes du métabolisme basal et
d'une surexpression de ceux impliqués dans la fixation et l'assimilation de l'azote (Becker et al., 2004).
Quelques rares cellules bactériennes quiescentes, de forme bacillaire, sont présentes dans le nodule; ce
sont les cellules qui survivront et se multiplieront dans le sol après la mort de la plante. Elles pourront alors
infecter les racines des plantes introduites dans le même site (Perry et al., 2004).
Doc L : Développement de nodosités fixatrices d’azote.
A : Système racinaire de Vigna radiata couvert de nodules. B : Nodosités de V. unguiculata 36 jours après l’inoculation de
Sinorhizobium fredii NGR234. C : Section d’une nodosité avec en son centre et colorée en rose par la leghémoglobine, la zone
des cellules végétales qui sont infectées par les rhizobia. Principales étapes du processus de formation et d’infection des
nodosités: D : Les rhizobia (rz) symbiotiques induisent la courbure de poils absorbants (rh), et forment un centre d’infection (ic)
puis un cordon d’infection (it); E : En progressant en direction du primordium nodulaire (np) constitué de cellules corticales en
division (c), le cordon d’infection se ramifie (rit); F : A l’extrémité du cordon d’infection (it), les rhizobia (rz) sont libérés dans le
cytoplasme d’une cellule de la nodosité où ils se différencient en bactéroïdes (bc). Un ou plusieurs bactéroïdes entourés par une
membrane végétale péribactéroidienne forment un « symbiosome » (s).
5°) A l’aide des documents suivants et de votre cours, vous comparerez d’une manière adaptée les deux
types de nodosités.
Doc N : Nodosités à forme indéterminée et nodosités à forme déterminée.
Dans la famille des Légumineuses, la morphologie des nodules et le type de nodosité développée est
déterminé par la plante hôte (Dart, 1975; Newcomb et al., 1979; Newcomb et Tandom, 1981).
(A) Nodosités à forme indéterminée où l'activité méristématique se maintient. De nouvelles cellules
apicales sont continuellement infectées. Cela résulte en une forme cylindrique de la nodosité. Ces
nodosités sont connues chez les légumineuses des zones tempérées (sulla, pois, Vicia sp., Medicago
sativa L., etc...).
Plusieurs zones histologiques différentes peuvent être observées sur une coupe longitudinale de nodosité
de Medicago (Vasse et al, 1990). On distinguera, depuis la partie apicale :
- La zone I ou zone méristématique, essentiellement
constituée de petites cellules qui ne sont jamais
envahies par les bactéries à ce niveau ;
- La zone II, riche en cordons d’infection renfermant de
nombreux Rhizobium participant à l’invasion des
cellules sous-jacentes ;
- L’inter-zone II-III, constituée de quelques assises de
cellules en partie envahies par les bactéries et riches en
amyloplastes ;
- La zone III ou zone de fixation, comprend majoritairement des cellules à contenu dense en raison
de la présence de très nombreux bactéroïdes, forme endosymbiotique de Rhizobium et exprimant
Doc M : Coupe longitudinale schématique d’une nodosité à forme indéterminée (A) et à forme déterminée
(B).
I = zone méristématique, Il = zone d’infection, II-III = interzone, III = zone fixatrice d’azote. IV = zone de sénescence. Ce = cortex externe, E = endoderme, Ci = cortex interne, FV = faisceau vasculaire, CF = couche frontière (parenchyme), TC = tissu central, CC = cylindre central de la racine, CI = cellule racinaire infectée par les bactéroïdes, CN = cellule non-infectée.
la nitrogénase qui catalyse la réduction de l’azote moléculaire. C’est également dans cette zone
que se trouve la léghémoglobine, hémoprotéine appartenant à la famille des nodulines, dont les
gènes de synthèse ne s’expriment qu’au sein de la nodosité ;
- La zone IV ou zone de sénescence est situé à la partie la plus basale de la nodosité, où le
brunissement observé sur des préparations extratemporanées, traduit une désorganisation de ce
tissu.
(B) Nodosités à croissance déterminée où l'activité méristématique cesse tôt. Les cellules infectées
engendrent d'autres cellules infectées et la nodosité en grandissant par expansion acquiert une forme
sphérique. Ce type de nodosité existe seulement chez les légumineuses des zones tropicales telles que le
soja et le haricot (Hirsch et al., 2001). Le tissu central est homogène et peut être assimilé à la zone III des
nodosités de type indéterminé.
III – EFFICIENCE DES SOUCHES BACTERIENNES
1°) Quel est le principal facteur limitant l’activité nitrogénase (voir doc K) ? En éliminant ce facteur, on
constate néanmoins une diminution brutale de la teneur en azote au sein de la bactérie, que conclure ?
2°) Quelle solution les Fabales ont-elles adoptée pour s’approvisionner en ce facteur tout en limitant sa
propagation au sein des tissus nodulaires (voir doc K) ?
3°) Cette molécule est une protéine héminique à fer dont l’hème est synthétisé par l’hôte et dont la partie
protéique est synthétisée par la bactérie. Sachant cela, définir l’efficience d’un organisme diazotrophe en y
faisant apparaître le mot « dioxygène ». Qui des symbiontes ou des bactéries diazotrophes libres sont les
fixateurs les plus efficients ?
Doc O
Les rhizobia sont des bactéries du sol, appartenant à la famille des Rhizobiaceae, Gram négatif, strictement
aérobies, possédant une forme de bâtonnets de 0,6 à 0,9 nm de largeur et de 1,2 à 3 jnm de longueur et
non sporulant (Jordan, 1984). Ce sont des bactéries mobiles grâce à un flagelle polaire ou subpolaire ou 2
à 6 flagelles péritriches (Werner, 1992). Leur croissance est optimale à une température de 28 °C et un pH
entre 6 et 7 (Burton, 1985).
Doc P : Efficience des souches.
Les échecs des cultures de légumineuses dans certaines régions sont souvent le résultat d'une insuffisance
ou d'un manque d'efficience des souches de rhizobium. En effet, les souches natives sont généralement
plus efficientes que les exogènes (Mezni et al., 2002).
L'inoculation est très efficace chez le sulla si l'espèce n'a pas été cultivée depuis longtemps sur la même
parcelle (Robson 1991). Dans ce sens, Il a été rapporté qu'une faible fixation biologique de l'azote a été
observée quand le sulla est installé dans des sites non conventionnels à l'espèce (Ewing et al., 2001).
Selon Casella et al.(1984), l'introduction du sulla dans des pays tels que l'Australie, en dehors de la
distribution naturelle du genre Hedysarum, doit être obligatoirement accompagnée d'une inoculation par des
souches spécifiques pour favoriser la nodulation.
4°) En quoi l’effet de sécheresse est-il un paradoxe pour l’efficience des diazotrophes ?
IV – TRANSPORT DE L’AMMONIUM
1°) Après lecture du document ci-dessous, vous compléterez le tableau de la question II-5°).
Doc R : Coupe transversale de nodosités de féveroles. Après sécheresse (B), on constate une diminution
immédiate de l’activité nitrogénase. Toutefois, la plasmolyse des cellules corticales entraîne leur tassement,
réduisant les espaces intercellulaires et ainsi la diffusion des gaz par l’apoplaste. CE : cortex externe, E :
endoderme, CI : cortex interne, TC : tissu central, FV : faisceau vasculaire.
Doc Q : Activité nitrogénase chez les fixateurs libres ou symbiotiques
Activité nitrogénase des f. libres (kg de N fixé/hectare/an)
25
Activité nitrogénase chez les Fabales et Rhizobium (kg de N fixé/hectare/an)
80 à 250
Doc R : Amides et uréides sont les formes de transport de l’azote.
Les procaryotes diazotrophes symbiotiques rejettent de l’ammonium, qui, pour éviter la toxicité, doit rapidement être
converti en formes organiques dans les nodosités racinaires avant d’être transporté jusqu’aux racines par le xylème.
Les Fabacées diazotrophes peuvent être divisées en exportateurs d’amide et en exportateurs d’uréides sur la base de
la composition de leur xylème.
- Les amides (principalement des acides aminés tels que l’asparagine et la glutamine) sont exportés par les
Fabacées des régions tempérées, à nodosités indéterminées (cylindriques), comme le pois (Pisum), le trèfle
(Trifolium), la fève (Vicia) ou la lentille (Lens).
- Les uréides sont exportés par les Fabacées des régions tropicales à nodosités déterminées (sphériques),
comme le soja (Glycine), le haricot rouge (Phaseolus), la cacahuète (Arachis) ou le dolique (Vigna). Les trois
principaux uréides sont l’allantoïne, l’acide allantoïque et la citrulline. L’allantoïne est synthétisée dans les
peroxysomes à partir de l’acide urique issus de la dégradation des purines de la cellule infectée, et l’acide
allantoïque est synthétisé à partir de l’allantoïne dans le réticulum endoplasmique. Le site de synthèse de la
citrulline à partir de l’acide aminé ornithine n’a pas encore été déterminé. Les trois composés sont finalement
libérés dans le xylème et transporté aux parties aériennes, où ils sont rapidement catabolisés en ammonium.
Cet ammonium entre dans la voie d’assimilation décrite précédemment.
Les formules des uréides cités ci-dessus sont fournies en ANNEXE.
ANNEXE – DOCUMENTS SUPPLEMENTAIRES