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Universidade de Aveiro
2013
Departamento de Engenharia de Materiais e
Cerâmica
Flávia Rosana Vieira Pinto
Citocompatibilidade de matrizes de quitosano/ fosfato de cálcio
Universidade de Aveiro
2013
Departamento de Engenharia de Materiais e
Cerâmica
Flávia Rosana Vieira Pinto
Citocompatibilidade de matrizes de quitosano/ fosfato de cálcio
Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento
dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Materiais e
Dispositivos Biomédicos, realizada sob a orientação científica das
Doutoras Maria Margarida Tavares Lopes de Almeida e Maria Elizabete
Jorge Vieira da Costa, Professoras Auxiliares do Departamento de
Engenharia de Materiais e Cerâmica da Universidade de Aveiro e do
Doutor Pedro de Sousa Gomes, Professor Auxiliar da Faculdade de
Medicina Dentária da Universidade do Porto.
À memória dos meus avós Maria Emília Soares e Francisco Caetano.
o júri
presidente Prof. Doutor José Maria da Fonte Ferreira Professor associado com agregação no Departamento de Engenharia de Materiais e Cerâmica
Prof.ª Doutora Maria Filomena Rabaça Roque Botelho Professora Catedrática da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
Prof.ª Doutora Maria Margarida Tavares Lopes de Almeida Professora auxiliar no Departamento de Engenharia de Materiais e Cerâmica
agradecimentos
Embora uma tese seja, pela sua finalidade académica, um trabalho individual,
há contributos de natureza diversa que não podem e nem devem deixar de ser
realçados. Por essa razão, desejo expressar os meus sinceros
agradecimentos:
Aos meus orientadores, a Prof. Dra. Margarida Almeida, a Prof. Dra. Elizabete
Costa e o Prof. Dr. Pedro Gomes pela forma como me orientaram e
acompanharam neste trabalho, pela competência científica, disponibilidade e
generosidade reveladas ao longo destes meses, assim como pelas críticas,
correcções e sugestões relevantes feitas durante a orientação.
À Prof. Dra. Maria Helena Fernandes do Laboratório de Farmacologia e
Biocompatibilidade Celular por toda a disponibilidade e pelos conhecimentos
transmitidos a nível do comportamento celular.
À Eng. Mónica do Laboratório de Farmacologia e Biocompatibilidade Celular
por todo o apoio prestado com os ensaios celulares.
Ao Prof. José António e à Susana Pinto pela disponibilização e ajuda na
medição dos ângulos de contacto e ao Nuno Carvalho pela incansável
disponibilidade com o liofilizador.
À Cristina Mesquita por toda a ajuda inicial com o trabalho experimental.
A todos os técnicos do DEMaC por toda ajuda e disponibilidade prestada na
caracterização das minhas amostras.
Aos meus colegas de laboratório pela maneira como me acolheram, pela ajuda
e por todo o apoio.
Aos meus colegas do mestrado por estes dois anos de convivência, amizade e
companheirismo.
A todos os meus amigos, em especial ao Guilherme por ter sido a chave de
todo o incentivo, pela infinita ajuda, dedicação e paciência.
À minha irmã, por todo o carinho e amizade.
E, por fim, agradeço aos meus pais por me concederem mais uma realização
pessoal e profissional, por todo o apoio, compreensão, paciência, carinho e
amor demonstrado ao longo da minha vida.
palavras-chave
resumo
Quitosano, Hidroxiapatite, β-TCP, Glutaraldeído, Scaffolds, Propriedades
mecânicas, Molhabilidade, Rugosidade, Citocompatibilidade
A concepção de estruturas adequadas para suportar o restauro ou melhorar a
função de tecidos é um dos maiores desafios da engenharia de tecidos. Essas
estruturas ou scaffolds são materiais porosos tridimensionais que servem de
matrizes para a adesão e proliferação das células bem como para a produção
de matriz extracelular à taxa a que decorre a degradação do scaffold.
Trabalhos anteriormente realizados no Departamento de Engenharia de
Materiais e Cerâmica [15] estabeleceram as condições de preparação de
scaffolds compósitos à base de quitosano reticulado com glutaraldeído (GA)
combinado com grânulos de diferentes fosfatos de cálcio (hidroxiapatite (HAp),
β-fosfato tricálcico (β-TCP) ou misturas bifásicas) para aplicações em
reparação óssea.
O presente estudo teve como objectivo avaliar o impacto das características
dos scaffolds compósitos (porosidade, hidrofilicidade, rugosidade e
propriedades mecânicas) na resposta celular (células MG-63). Para tal
prepararam-se por atomização grânulos de HAp e de misturas bifásicas para
posterior incorporação em scaffolds compósitos à base de quitosano
reticulado. Todos os materiais produzidos foram caracterizados do ponto de
vista estrutural, microestrutural e de comportamento mecânico. Prepararam-se
também membranas com composição igual à dos scaffolds para avaliação da
molhabilidade e da rugosidade. A resposta celular aos scaffolds preparados foi
avaliada em termos de viabilidade, proliferação, adesão e morfologia celular
bem como da actividade da fosfatase alcalina.
Os scaffolds compósitos obtidos são estruturas porosas, de poros
interconectados e com tamanhos apropriados para regeneração de tecido
ósseo. Observou-se uma melhoria significativa da resistência mecânica dos
scaffolds com a reticulação, sobretudo após tratamento térmico à temperatura
de 50ºC, que indicia ser esta a temperatura óptima para reticulação. As
medidas de ângulo de contacto e de rugosidade revelaram que as superfícies
dos materiais compósitos em análise são maioritariamente hidrofóbicas e com
rugosidades micrométricas, na gama dos 1,5-5,1μm. A resposta celular
(linhagem celular MG-63) aos scaffolds compósitos, com grânulos de HAp ou
bifásicos, evidenciou ser a concentração de glutaraldeído a variável com maior
impacto na resposta biológica: 0.2% é a concentração de GA para a qual se
registam os melhores níveis de adesão, proliferação e viabilidade celular.
Embora as membranas compósitas com grânulos bifásicos tivessem
evidenciado uma hidrofobicidade superior à das membranas com
hidroxiapatite, tal diferença não se reflectiu significativamente no
comportamento biológico dos scaffolds correspondentes. Apesar de
evidenciarem melhores propriedades mecânicas, os scaffolds compósitos com
elevado teor de reticulante (1%) apresentaram um pior desempenho biológico,
confirmando ser a percentagem de reticulante o parâmetro que mais
condiciona a resposta celular. Em conclusão, os scaffolds que induziram
melhor resposta biológica foram os que apresentaram menor concentração de
GA (0,2%) apresentando-se estes como as estruturas mais promissoras para
aplicação em ET ósseo.
keywords abstract
Chitosan, Hydroxyapatite, β-TCP, Glutaraldehyde, Scaffolds, Mechanical
Properties, Wettability, Roughness, Citocompatibility
The design of appropriate structures to restore or to improve tissue function is
a major challenge in tissue engineering. Such structures are three-dimensional
scaffolds or porous materials that support cells adhesion, proliferation and
production of extracellular matrix at a rate that ideally should match the scaffold
degradation.
Previous studies at the Department of Materials and Ceramics Engineering [15]
have established the conditions for the preparation of composite scaffolds
based on chitosan crosslinked with glutaraldehyde (GA) combined with
granules of different calcium phosphates (hydroxyapatite ( HAp ), β - tricalcium
phosphate (β-TCP) or biphasic mixtures) for applications in bone repair.
The present study aimed to assess the impact of the characteristics of the
composite scaffolds (porosity, hydrophilicity, roughness and mechanical
properties) in the cellular response (MG -63 cells). For this purpose, granules
of HAp or of biphasic mixtures were prepared by spray drying and
subsequently incorporated into composites scaffolds based on crosslinked
chitosan. All the produced materials were characterized in terms of structure,
microstructure and mechanical behavior. Composite membranes with same
composition as the scaffolds were also prepared for the evaluation of the
wettability and surface roughness. The cellular response to the produced
scaffolds was evaluated in terms of viability, proliferation, adhesion and cell
morphology as well as alkaline phosphatase activity.
The obtained composite scaffolds are porous structures made of
interconnected pores having suitable sizes for bone tissue regeneration. A
significant improvement of the scaffolds mechanical strength was observed
upon crosslinking, especially after heat treatment at a temperature of 50 ° C,
which indicates that this is the optimum temperature for crosslinking. Contact
angle and surface roughness measurements showed that the composite
materials under analysis are mostly hydrophobic and with a micrometric
roughness in the range of 1.5- 5.1μm. The cellular response (MG -63 cell line)
to composite scaffolds with HAp or biphasic granules evidenced that GA
concentration is the variable with the greatest impact on the biological
response: 0.2 % is the concentration of GA to which correspond the best levels
of cell adhesion, proliferation and viability. Although the composite membranes
with biphasic granules have shown a higher hydrophobicity than membranes
with hydroxyapatite, such difference is not significantly reflected by the
biological behavior of the corresponding scaffolds. While evidencing better
mechanical properties, composites scaffolds with high content of crosslinker
(1%) showed a worse biological performance confirming the percentage of
crosslinking as the parameter that most influences the cellular response. In
conclusion, the scaffolds that induce the better biological performance were
those having low concentration of GA (0.2 %), being these the most promising
structures for application in bone tissue engineering.
i
Índice
Índice de Tabelas ........................................................................................................................... vii
Abreviaturas ..................................................................................................................................... ix
Capítulo 1.......................................................................................................................................... 1
1. Introdução .................................................................................................................................... 3
1.1. Objectivos ............................................................................................................................. 5
1.2. Estrutura da tese .................................................................................................................. 5
Capítulo 2.......................................................................................................................................... 7
2. Revisão da Literatura ................................................................................................................. 9
2.1. Tecido ósseo – Estrutura e Propriedades ....................................................................... 9
2.2. Engenharia de tecidos aplicada ao tecido ósseo ......................................................... 14
2.2.1. Scaffolds para engenharia de tecidos ósseos ...................................................... 15
2.2.2. Materiais ...................................................................................................................... 16
2.3. Resposta celular à superfície e arquitectura dos scaffolds ........................................ 20
2.3.1. Adsorção de proteínas .............................................................................................. 21
2.3.2. Molhabilidade ............................................................................................................. 22
2.3.3. Carga e energia de superfície ................................................................................. 25
2.3.4. Rigidez ........................................................................................................................ 26
2.3.5. Rugosidade................................................................................................................. 28
2.3.6. Porosidade e tamanho dos poros ........................................................................... 30
2.4. Testes de Biocompatibilidade .......................................................................................... 32
2.4.1. Sistemas de testes estabelecidos ........................................................................... 32
2.4.2. Testes in vitro para avaliação da biocompatibilidade .......................................... 33
Capítulo 3........................................................................................................................................ 39
3. Procedimento Experimental ................................................................................................. 41
3.1. Materiais e células ......................................................................................................... 41
3.2. Métodos de Preparação ................................................................................................... 41
3.2.1. Preparação dos grânulos de CaP ............................................................................ 41
3.2.2. Preparação das matrizes de CH reticuladas e dos scaffolds compósitos ......... 42
3.2.3. Preparação das membranas compósitas ............................................................... 44
3.3. Caracterização ................................................................................................................... 45
ii
3.3.1. Caracterização dos grânulos de CaP...................................................................... 45
3.3.2. Caracterização dos scaffolds ................................................................................... 45
3.3.3. Caracterização das membranas compósitas ......................................................... 48
3.4. Estudos de citocompatibilidade dos scaffolds ............................................................... 49
3.4.1. Estabelecimento e manutenção das culturas celulares ....................................... 50
3.4.2. Caracterização das culturas celulares .................................................................... 50
3.4.2.1. Viabilidade/proliferação celular (Resazurina) ..................................................... 50
3.4.2.2. Actividade da Fosfatase Alcalina .......................................................................... 51
3.4.2.3. Avaliação da adesão e morfologia celular por microscopia electrónica de
varrimento (SEM)................................................................................................................... 52
3.4.2.4. Análise estatística ................................................................................................... 52
Capítulo 4........................................................................................................................................ 53
4. Resultados e Discussão ....................................................................................................... 55
4.1 Caracterização dos grânulos de CaP .............................................................................. 55
4.2. Caracterização das matrizes de CH reticuladas ........................................................... 60
4.3 Caracterização das membranas compósitas ................................................................. 73
4.3.1 Rugosidade .................................................................................................................. 74
4.3.2 Molhabilidade ............................................................................................................... 78
4.4 Caracterização dos scaffolds compósitos ....................................................................... 83
4.3. Citocompatibilidade dos scaffolds compósitos.............................................................. 90
Capítulo 5........................................................................................................................................ 95
5. Conclusões e Futuros Desenvolvimentos ......................................................................... 97
Referências .................................................................................................................................. 100
iii
Índice de Imagens
Figura 1- Secção do fémur, mostrando o osso cortical e osso esponjoso. Micrografias do
osso esponjoso e do osso cortical, onde é visível a estrutura trabecular e cortical,
respectivamente. .............................................................................................................10
Figura 2 - Representação esquemática do processo de remodelação óssea. .................13
Figura 3 – Representação esquemática das três estratégias principais da engenharia de
tecidos que podem ser usadas para regenerar defeitos nos tecidos ósseos. ...................15
Figura 4 – Ilustração da reticulação da molécula de quitosano pelo glutaraldeído ...........19
Figura 5 - Ilustração da ligação das células à superfície do material. ...............................22
Figura 6 - Ângulo de contacto, , para (a) superfícies hidrofóbicas e (b) superfícies
hidrofílicas. ......................................................................................................................23
Figura 7 - Micrografias SEM da adesão celular de fibroblastos em superfícies de PE após
1 e 2 dias de cultura com diferentes ângulos de contacto (magnificação original x400) ...24
Figura 8 - As densidades de carga positiva em hidrogéis HEMA suportam uma melhor
fixação e espalhamento celular em relação às cargas negativas e neutra. ......................26
Figura 9 – Ilustrações que descrevem a ligação de uma célula a substratos frágeis e
rígidos ..............................................................................................................................27
Figura 10 - Sequência temporal dos processos associados à resposta celular face à
rigidez do substrato. As células sondam continuamente as propriedades mecânicas do
seu substrato, induzindo a sinais que têm rapidamente impacto na organização do
citoesqueleto e na matriz. Estas alterações induzem distintas respostas numa vasta gama
de funções celulares. .......................................................................................................28
Figura 11 - Scaffolds com diferentes tipos de porosidades ..............................................30
Figura 12 – Conversão da resazurina a resofurina por células viáveis, resultando num
produto fluorescente. A fluorescência produzida é proporcional ao número de células
viáveis .............................................................................................................................34
Figura 13 - Ensaio colorimétrico – MTT ...........................................................................34
Figura 14 - Exemplos de imagens de microscopia de fluorescência (A,B) e de microscopia
electrónica de varrimento (C,D) de células MG63 ............................................................35
Figura 15 - Representação esquemática de um ciclo da técnica de PCR. .......................36
Figura 16 – Atomizador laboratorial Mini Spray Dryer Bushi-191 e respectivas condições
de utilização. ....................................................................................................................42
Figura 17 – Moldes cilíndricos utilizados no fabrico dos scaffolds. ...................................43
Figura 18 - Liofilizador Labconco freeze DrySystem. .......................................................44
iv
Figura 19 - Cálculo da área dos poros usando o ImageJ 1.45. ........................................46
Figura 20 - Cálculo do tamanho médio dos poros usando o ImageJ 1.45. .......................46
Figura 21 - Equipamento de ensaios mecânicos Zwick/Roell Z020 e respectiva célula de
carga utilizada..................................................................................................................47
Figura 22 - Profilómetro (Perthometer M1, Mahr) utilizado nas medições de rugosidade
das membranas. ..............................................................................................................48
Figura 23 - Aparelho de medição de ângulos de contacto Dataphysics – contact angle
sistem OCA. ....................................................................................................................49
Figura 24 - Imagens SEM de HAp: a) partículas da suspensão inicial de HAp e b)
grânulos de HAp atomizados. ..........................................................................................55
Figura 25 - Imagens SEM de β-TCP: a) partículas da suspensão inicial de β-TCP e b)
grânulos de β-TCP atomizados. .......................................................................................56
Figura 26 - Imagens SEM de misturas bifásicas: a) e c) partículas da suspensão bifásica
inicial e b) e d) grânulos bifásicos atomizados. ................................................................56
Figura 27 - Difractograma de raio-X dos grânulos de HAp, β-TCP e dos grânulos
Bifásicos, obtidos por atomização ....................................................................................58
Figura 28 - Micrografias de SEM dos grânulos: a), c), e) e g) de HAp e b), d), f) e h)
bifásicos. ..........................................................................................................................59
Figura 29 - Micrografias de SEM de scaffolds de CH. ......................................................61
Figura 30 - - Micrografias de SEM dos scaffolds de quitosano com a adição de diferentes
teores de glutaraldeído e respectivos valores para o tamanho médio de poro: 0,2% (a, b);
0,5% (c, d); 1% (e, f); 5% (g, h) e 10%(i, j). ......................................................................62
Figura 31 - Comportamento mecânico dos scaffolds de quitosano com a adição de
diferentes percentagens de glutaraldeído. .......................................................................63
Figura 32 – Actividade metabólica das culturas estabelecidas nos diferentes scaffolds de
quitosano sem e com as diferentes percentagens de GA, ensaio da resazurina. .............65
Figura 33 – Imagens de SEM das culturas celulares estabelecidas nos diferentes
scaffolds em estudo. ........................................................................................................67
Figura 34 - Ilustração do processo de interacção célula/substrato: adesão, espalhamento
e proliferação e imagem SEM que ilustra a morfologia típica das células MG-63. ...........68
Figura 35 - Micrografias obtidas por SEM dos scaffolds de quitosano com 0,5% de GA
sem tratamento e submetidos a tratamento térmico de 40°, 50° e 60°. ............................69
Figura 36 - Distribuição do tamanho de poros dos scaffolds de quitosano com 0,5% de
GA após tratamento térmico de 40°C, 50°C e 60°C. ........................................................70
v
Figura 37 - Comportamento mecânico dos scaffolds de quitosano com 0.5% de GA
submetidos a tratamento térmico de 40°, 50° e 60°. ........................................................71
Figura 38 - Micrografia obtida por SEM da membrana de quitosano. ...............................75
Figura 39 – Imagens de SEM da secção transversal das membranas de quitosano com
(a) 0.2%GA e (b) 0,5%GA. A imagem (c) representa a superfície da membrana de
CH+0,5%GA. ...................................................................................................................76
Figura 40 - Imagens SEM da superfície e da secção transversal das membranas de
quitosano com grânulos bifásicos (a) e (c) e de HAp (b) e (d). As imagens (e) e (f)
correspondem a um pormenor de um aglomerado da membrana de HAp. ......................77
Figura 41 - Curvas tendência das medições do ângulo de contacto ao longo do tempo
para as diferentes membranas. .......................................................................................82
Figura 42 - Micrografias obtidas por SEM dos scaffolds de HAp com: a), b), c) 0,2% de
GA, d), e), f) 0,5% de GA, g) h), i) 1% de GA e j), k), l) com tratamento térmico, com os
respectivos valores do tamanho médio de poro. ..............................................................84
Figura 43 - Comportamento mecânico dos diferentes scaffolds de HAp. .........................85
Figura 44 - Micrografias obtidas por SEM dos scaffolds bifásicos com: a), b), c) 0,2% de
GA, d), e), f) 0,5% de GA, g) h), i) 1% de GA e j), k), l) com tratamento térmico, com os
respectivos valores médios para o tamanho de poro. ......................................................87
Figura 45 - Comportamento mecânico dos diferentes scaffolds bifásicos. .......................88
Figura 46 - Comportamento dos diferentes scaffolds de HAp e bifásicos face à presença
de células através do ensaio de viabilidade celular - resazurina. .....................................90
Figura 47 - Actividade da fosfatase alcalina das culturas estabelecidas nos diferentes
scaffolds de HAp e bifásicos. ...........................................................................................91
Figura 48 - Imagens SEM da cultura celular presente nos scaffolds de HAp com 0,2%GA
ao final de 1 dia de experiência. ......................................................................................92
Figura 49 - Imagens SEM da cultura celular presente nos scaffolds bifásicos com 0,2%GA
ao final de 1 dia (a, b) e 7 dias (c, d) de experiência. .......................................................93
vi
vii
Índice de Tabelas
Tabela 1 - Diferenças entre o osso cortical e trabecular. .................................................11
Tabela 2 - Tipos de células ósseas e respectivas funções. ..............................................11
Tabela 3 - Requisitos para um scaffold ideal para engenharia de tecido ósseo. ..............16
Tabela 4 - Principais variáveis que podem influenciar a resposta do hospedeiro .............21
Tabela 5 – Tamanho(s) do(s) poro(s) desejados em scaffolds destinados a diferentes
tipos de células. ...............................................................................................................31
Tabela 6 - Áreas superficiais específicas obtidas por BET das diferentes partículas antes
e depois de atomizadas (grânulos). .................................................................................57
Tabela 7 - Módulos de Young dos scaffolds de quitosano com os diferentes teores de GA.
........................................................................................................................................64
Tabela 8 - Módulos de Young dos diferentes scaffolds tratados termicamente. ...............71
Tabela 9 – Composição das membranas e respectiva designação. .................................73
Tabela 10- Valores médios das medições das rugosidades, Ra, das diferentes
membranas. .....................................................................................................................74
Tabela 11 - Ângulo de contacto médio medido das diferentes membranas. ....................79
Tabela 12 - Descrição dos scaffolds e dos materiais utilizados no respectivo fabrico. .....83
Tabela 13 - Módulos de Young dos diferentes scaffolds de HAp. ....................................86
Tabela 14 - Módulos de Young dos diferentes scaffolds com grânulos bifásicos. ............88
Tabela 15 - Quadro resumo de todos os resultados obtidos na caracterização dos
scaffolds e das membranas compósitos(as). ...................................................................94
viii
ix
Abreviaturas
3D – Tridimensional
ALP – Fosfatase alcalina
BET - modelo de Brunauer, Emmet e Teller
BMPs - Proteínas morfogenéticas ósseas
CaP – Fosfatos de Cálcio
DNA - Ácido desoxirribonucleico
CH - Quitosano
DRX - Difracção de raio-X
ET - Engenharia de Tecidos
ETO – Engenharia de tecido ósseo
FDA - Food and Drug Administration
FGFs - Factores de crescimento fibroblásticos
GA - Glutaraldeído
HAp - Hidroxiapatite
HCA - Hidroxiapatite carbonatada
ISO - International Standard Organization
LDH – Desidrogenase do lactato
MEC – Matriz extra celular
OBLs - Osteoblastos
OCL - Osteoclasto
OECD - Organization for Economic Cooperation and Development
PA – Poliacrilamida
PCR – Reacção em cadeia da polimerase
PGA – Ácido poliglicólico
PLA – Ácido polilático
PLGA - Poli(ácido láctico-co-glicólico)
PTH – Hormona da paratiróide
SEM - Microscopia electrónica de varrimento
TGFβ - Factores transformadores de crescimento β
UV – Ultravioleta
β-TCP - β-fosfato tricálcico
x
1
Capítulo 1
Introdução e Objectivos
2
Capítulo 1 – Introdução e Objectivos
3
1. Introdução
O osso é um tecido dinâmico altamente vascularizado e que desempenha diversas
funções essenciais ao equilíbrio vital: fornece o apoio estrutural ao corpo, serve de
reservatório mineral, apoia a contracção muscular e protege os órgãos internos. Quando se
verificam grandes danos na sua estrutura, devido a lesão ou doença, dá-se uma alteração
drástica do equilíbrio fisiológico deste tecido e do próprio organismo, que pode afectar a
qualidade de vida [1].
Ao longo dos últimos anos, embora se tenham registado importantes avanços no
campo da medicina regenerativa do tecido ósseo, as terapias actuais, como o recurso aos
enxertos ósseos, ainda apresentam várias limitações. Além disso, e apesar da ciência e
engenharia dos materiais ter vindo a proporcionar excelentes resultados no desenvolvimento
de substitutos sintéticos, nenhum substituto ósseo apresenta ainda propriedades ideais para
a generalidade das aplicações clínicas. Assim, a maioria das lesões graves relacionadas
com o osso são ainda irrecuperáveis ou tratadas de forma limitada [1].
É neste contexto que surge a engenharia de tecidos (ET), fundamentalmente descrita
como um novo domínio multidisciplinar que tem como objectivo desenvolver substitutos
biológicos capazes de restaurar, substituir ou regenerar a forma e função dos tecidos. As
células, os scaffolds e factores de crescimento são os principais componentes da ET. Os
scaffolds servem como estruturas de suporte temporário, proporcionando não só o suporte
tridimensional para o crescimento de tecido e sua formação adequada mas também um
ambiente biológico favorável para o crescimento e diferenciação das células [2, 3].
Aos materiais usados para fabrico de scaffolds exigem-se assim propriedades
adequadas para obtenção das matrizes com os requisitos atrás referidos. Neste contexto,
soluções que combinem polímeros naturais, biocompatíveis e biodegradáveis com materiais
cerâmicos, bioactivos, e com composição semelhante à do componente mineral do osso,
são um ponto de partida promissor face a outros materiais.
Nos últimos 40 anos observou-se o desenvolvimento de uma variedade espantosa de
biomateriais para a fabricação de scaffolds “ideais” para o crescimento e diferenciação
celular, embora poucos se tenham revelado clinicamente relevantes. Os biomateriais,
permanentes ou biodegradáveis, naturais ou sintéticos, têm de ser biocompatíveis, de
preferência osteoindutores, osteocondutores e mecanicamente compatíveis com o osso
nativo, para cumprirem a função desejada. Do mesmo modo, devem apresentar outras
Capítulo 1 – Introdução e Objectivos
4
características relevantes, tais como: propriedades de superfície adequadas (rugosidade,
molhabilidade, energia e carga de superfície), estrutura de poros propensa às várias
interacções celulares e à angiogénese, biodegradabilidade, facilidade de fabrico através de
técnicas de processamento apropriadas para adequar o scaffold às características
geométricas do defeito ósseo e, por fim, serem esterilizáveis. Todos estes requisitos são
importantes pois têm influência não só na sobrevivência, sinalização, adesão, proliferação e
reorganização das células, mas também na sua expressão de genes e
preservação/desenvolvimento do seu fenótipo (diferenciação) [4-6].
Os materiais destinados à produção de scaffolds devem idealmente imitar a estrutura
e as funções biológicas do osso nativo, tanto em termos da composição química como das
propriedades físicas [3].
O uso de materiais compósitos de polímero/cerâmico é, numa perspectiva biológica,
uma estratégia natural, uma vez que o osso nativo é também uma combinação natural entre
um polímero (colagénio) e apatite biológica. Por outro lado, um scaffold de polímero (natural
e biocompatível) e fosfato de cálcio poderá combinar as vantagens de ambos os materiais
de modo a atender às exigências mecânicas e fisiológicas do tecido ósseo, ou seja,
apresentando comportamento semelhante ao do osso, em matéria de deformação e
resistência à fractura e obviando problemas de biocompatibilidade associados à utilização
de polímeros puros, nomeadamente à toxicidade dos seus produtos de degradação [7, 8].
Um material é definido como biocompatível se não induzir resposta inflamatória, não
for imunogénico e não for citotóxico para as células e os tecidos. A biocompatibilidade é
uma característica que o material deve ter aquando da sua implantação mas também
durante a sua vida útil como implante, ou seja, os produtos da sua degradação também
devem ser biocompatíveis [4].
As respostas celulares variam significativamente consoante as características
químicas, físicas e biomecânicas do scaffold, tanto a nível da superfície, como é o caso das
cargas e energia livre de superfície, molhabilidade e rugosidade, como a nível da
arquitectura do scaffold traduzida na porosidade, tamanho e distribuição de tamanho de
poro e sua interconectividade que condiciona essencialmente as suas propriedades
mecânicas (a rigidez por exemplo). Dependendo do tipo de células, estas podem preferir
substratos mais ou menos rígidos. A porosidade do scaffold, o tamanho dos poros, a sua
morfologia e interconectividade são propriedades essenciais para uma boa adesão e
proliferação celulares e, consequentemente para a formação de um novo tecido a três
dimensões. Os scaffolds para aplicações no tecido ósseo devem mimetizar a morfologia,
estrutura e função do osso, a fim de optimizar a integração no tecido circundante [3, 9, 10].
Capítulo 1 – Introdução e Objectivos
5
Na caracterização de um biomaterial para aplicação em ETO, a biocompatibilidade
deve ser testada preferencialmente in vitro antes de ser avaliada in vivo. A compatibilidade
in vitro pode ser testada por uma via directa, expondo a superfície do material ao contacto
com as células ou, por uma via indirecta em que as células contactam com produtos
derivados do material ou usando uma camada interposta entre as células e os materiais. É
assim possível, através destes testes, estudar a viabilidade celular/proliferação, a adesão e
morfologia celular e a sua funcionalidade, obtendo uma informação rápida que permite
descartar materiais não biocompatíveis numa fase prévia aos testes in vivo [11-14].
1.1. Objectivos
Trabalhos anteriores desenvolvidos da Universidade de Aveiro [15] estabeleceram as
condições apropriadas para produção de matrizes compósitas de polímero (quitosano) e
fosfato de cálcio com características promissoras para a engenharia de tecido ósseo (ETO).
A resposta celular às referidas matrizes não foi porém ainda estudada, desconhecendo-se
assim a forma como diversos parâmetros, designadamente a composição, a microestrutura
(morfologia, propriedades mecânicas) e as propriedades de superfície (rugosidade e
molhabilidade) condicionam a interacção scaffold/células. O objectivo da presente tese
centra-se pois no estudo in vitro da biocompatibilidade de scaffolds para ETO. As matrizes
combinarão um polímero natural, o quitosano reticulado (com Glutaraldeído), com diferentes
fostatos de cálcio, designadamente a hidroxiapatite (HAp), o β-TCP e misturas bifásicas de
ambos (HAp e β-TCP). Pretende-se correlacionar a resposta celular suscitada com as
propriedades de superfície e arquitectura de scaffolds por forma a optimizar a
biocompatibilidade das estruturas compósitas em análise.
1.2. Estrutura da tese
A presente tese está organizada em cinco capítulos. O capítulo 1 introduz o tema
da tese e apresenta os objectivos que presidem ao presente trabalho bem como a
estrutura da mesma. No capítulo 2 é feita uma revisão da bibliografia para a
contextualização e para um melhor entendimento deste trabalho. No capítulo 3 está
descrito detalhadamente todo o procedimento experimental, bem como as técnicas de
caracterização utilizadas. O capítulo 4 apresenta todos os resultados experimentais
Capítulo 1 – Introdução e Objectivos
6
obtidos, focando-se na sua análise e discussão. Por fim, no capítulo 5, intitulado
“Conclusão e futuros desenvolvimentos”, é feita uma síntese do trabalho realizado e
apresentam-se algumas sugestões/recomendações para trabalho futuro.
7
Capítulo 2
Revisão da Literatura
8
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
9
2. Revisão da Literatura
2.1. Tecido ósseo – Estrutura e Propriedades
O osso é um tecido conjuntivo constituído por uma matriz orgânica mineralizada
com células vivas (população heterogénea de condrócitos, osteoblastos, osteócitos,
osteoclastos, células endoteliais, monócitos, macrófagos, linfócitos e células
hematopoiéticas) incorporadas, que proporciona ao indivíduo o suporte mecânico ao
movimento e a protecção dos seus órgãos vitais. Além disso, o osso é um reservatório de
muitos minerais essenciais e desempenha um papel importante na regulação das
concentrações de iões no fluido extracelular [16-18].
Do ponto de vista composicional, a parte mineral compreende 50% a 70% do osso
adulto, a matriz orgânica cerca de 20% a 40%, possuindo ainda água (cerca de 5 a 10%)
e lípidos (1 a 5%) na sua composição. Cerca de 90% da matriz orgânica do osso é
composta por colagénio do tipo I. A parte mineral óssea é composta principalmente por
cristais de hidroxiapatite (HAp), responsáveis pela rigidez e resistência mecânica. A
percentagem de minerais no osso aumenta com a idade do indivíduo, ao mesmo tempo
que diminui a quantidade de matriz orgânica, o que explica que os ossos de indivíduos
jovens sejam mais resistentes e os dos indivíduos mais velhos, mais frágeis [19].
A um nível macroscópico, os ossos compõe-se de dois tipos de tecido: osso
cortical ou compacto e osso esponjoso ou trabecular (Figura 1). O osso cortical está
localizado na parede exterior, sendo principalmente encontrado na diáfise dos ossos
longos. Apresenta uma grande dureza e elevada densidade e, consequentemente, uma
baixa porosidade (cerca de 10%). Organiza-se em forma de finas lâminas concêntricas
alinhadas na direcção longitudinal do osso, que fazem parte dos denominados sistemas
heversianos (ou osteons). O osso cortical representa quase 80% da massa óssea. Tem
uma taxa de remodelação lenta (cujo valor anual é de cerca de 3%) e uma alta
resistência à flexão e à torção [18-20].
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
10
Figura 1- Secção do fémur, mostrando o osso cortical e osso esponjoso. Micrografias do osso esponjoso e do osso cortical, onde é visível a estrutura trabecular e cortical, respectivamente.
O osso trabecular encontra-se nas metáfises e epífises dos ossos longos e na
parte interior dos ossos não regulares. É constituído por uma rede de trabéculas ósseas
interligadas com os espaços preenchidos com medula óssea e vasos, proporcionando
comparativamente com o osso cortical, um suporte mecânico menor. O osso trabecular é
menos denso, menos rígido e mais elástico do que o osso cortical. Devido à sua estrutura
trabecular, o osso esponjoso resiste bem a cargas compressivas. Este tipo de osso
representa apenas 20% da massa óssea, sendo esta uma das razões para a sua
remodelação mais rápida, cuja taxa de anual é de 25%. A maior dinâmica de
remodelação óssea pode explicar a menor rigidez deste tipo de osso devido ao facto de o
seu período de maturação ser mais curto relativamente ao osso cortical [18-20].
As propriedades mecânicas do osso vão variar com o paciente (i.e., idade,
género, condição sistémica), a sua localização anatómica, com a direcção da carga
aplicada (longitudinal, transversal) e com a velocidade de aplicação desta, bem como
com o tipo de carga (compressão, tracção ou corte). O osso é um material não
homogéneo devido ao facto de ser constituído por várias substâncias orgânicas e
inorgânicas, com diferentes propriedades mecânicas. Estes factos justificam a
diversidade de valores das propriedades mecânicas encontrados na literatura [19].
A maior resistência do osso observa-se essencialmente ao longo do seu eixo, que
é aproximadamente paralelo ao eixo das fibras de colagénio e dos cristais minerais.
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
11
Embora sejam aparentemente rígidos, os ossos exibem um grau considerável de
elasticidade que é importante na capacidade do esqueleto suportar impactos [17].
Na Tabela 1 estão caracterizadas as principais diferenças entre o osso cortical e
trabecular.
Tabela 1 - Diferenças entre o osso cortical e trabecular. Adaptado de: [21-25].
Osso cortical Osso trabecular
Superfície / Volume de osso (mm
2/mm
3)
2,5 20
Volume total de osso 80% 20%
Superfície interna total (mm2) 33% 67%
Função Maioritariamente biomecânica,
mas também serve de suporte e protecção.
Maioritariamente homeostase mineral, mas também ajuda no
suporte.
Porosidade Baixa (5 a 10%) Alta (75 a 90%)
Módulo de elasticidade (GPa) 17 0,1 a 2
Módulo de rigidez (GPa) 8,7-14,1 0,02-0,5
Resistência à compressão (MPa) 131-224 2-12
Resistência à flexão (MPa) 135-193 -
Resistência à tracção (MPa) 50-151 1-5
A síntese, manutenção e reabsorção do tecido ósseo resultam da interacção de
três tipos de células: os osteoblastos, os osteócitos e os osteoclastos. Todas elas têm
tarefas definidas e são, portanto, essenciais para a manutenção de um tecido ósseo
saudável [1]. As suas características e funções estão sumarizadas na Tabela 2.
Tabela 2 - Tipos de células ósseas e respectivas funções. Adaptado de: [1].
Tipo de célula Características morfológicas Função
Osteoblastos
Forma cúbica, polarizada e localizada - Os seus precursores organizam-se na superfície do osso, onde formam uma camada estreita de células.
Síntese e regulação da deposição e mineralização da MEC óssea;
Osteócitos Em forma de estrela; Possuem menos organelos que os osteoblastos.
Homeostase mineral
Osteoclastos Células polarizadas e multinucleadas. Reabsorção óssea.
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
12
Ao longo da vida, a remodelação fisiológica, remoção e substituição óssea ocorrem
sem afectar a forma ou a densidade do osso, através de uma sequência de eventos ou
fases, que incluem (i) a fase de activação dos osteoclastos, (ii) a fase de reabsorção de
osso, (iii) fase reversa e a (iv) fase de formação de osso novo no local de reabsorção
[17]. Estas fases são discutidas seguidamente e apresentadas esquematicamente na
Figura 2.
Fase de activação – Esta primeira fase envolve a detecção de um sinal que pode
assumir diversas formas como por exemplo uma tensão mecânica directa sobre o osso
que resulta em danos estruturais ou uma acção hormonal sobre as células ósseas (por
ex. estrogénio, hormona paratiroideia (PTH)) em resposta a alterações na homeostase.
Na presença de qualquer destes sinais, as células de revestimento aumentam a
expressão de RANKL (Receptor Activador do ligante nuclear kB) à superfície, que por
sua vez interage com o seu receptor RANK (Receptor activador nuclear kB), expresso
pelos pré-osteoclastos. Esta interacção leva à activação, diferenciação e fusão dos
osteoclastos, iniciando-se o processo de reabsorção.
Fase de reabsorção - Uma vez diferenciados, os osteoclastos polarizam e aderem à
superfície do osso, começando a dissolvê-lo através da libertação de enzimas
(responsáveis pela degradação da componente orgânica da MEC) e secreções ácidas
(responsáveis pela degradação da componente mineral da MEC).
Fase reversa – Preparação da superfície do osso para a formação óssea, havendo
a remoção dos detritos produzidos durante a degradação da matriz.
Fase de formação – A reabsorção da matriz óssea leva à libertação de vários
factores de crescimento armazenados na matriz, responsáveis pelo recrutamento de
osteoblastos e seus precursores na área reabsorvida. Estes produzem a nova matriz
óssea, inicialmente não calcificada (osteóide) e, em seguida, provem a mineralização,
completando assim o processo de remodelação óssea [26-28].
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
13
Figura 2 - Representação esquemática do processo de remodelação óssea. A remodelação óssea começa quando diferentes factores levam à activação de células de revestimento, o que aumenta a expressão de superfície de RANKL. RANKL interage com o seu receptor RANK desencadeando assim a diferenciação dos osteoclastos (Fase de Activação). Os osteoclastos reabsorvem o osso (Fase de Reabsorção), permitindo assim a libertação de
factores normalmente armazenados na matriz óssea (e.g., proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), factores
transformadores de crescimento β (TGFβ), factores de crescimento fibroblásticos (FGFs)) que recrutam os osteoblastos na área reabsorvida. Dá-se então a produção da nova matriz óssea e consequente mineralização por parte dos osteoblastos (Fase de Formação), completando assim o processo de remodelação. (pre-OCLS= pré-osteoclastos; OCL= osteoclastos; OBLs= osteoblastos). Adaptado de: [26].
Havendo um desequilíbrio entre a reabsorção e a formação do novo osso, é de
esperar uma remodelação óssea incorrecta, que por sua vez afecta a massa óssea,
levando a uma condição patológica, como por exemplo osteopenia (diminuição da
densidade mineral óssea, que frequentemente antecede o estado patológico de
osteoporose), osteoporose (condição patológica caracterizada pela diminuição da massa
e densidade do tecido ósseo) e a osteopetrose (condição patológica caracterizada pelo
aumento anormal da densidade óssea) [26, 29].
Além disso, existem outras condições em cirurgia ortopédica nas quais é
necessária a regeneração do osso em grande quantidade (para além do potencial normal
de auto-regeneração) que pode complicar a osteossíntese e levar à não-união da
fractura, como é o caso, por exemplo, da reconstrução de grandes defeitos ósseos
criados por trauma, infecção, ressecções tumorais ou anormalidades esqueléticas [30].
Para todos estes casos, em que o processo fisiológico de regeneração é
insuficiente, é necessário recorrer a metodologias que ajudem à regeneração, entre as
quais a engenharia de tecido ósseo, que pode trazer a solução definitiva e esperança
para muitos pacientes que sofrem desses problemas [31].
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
14
2.2. Engenharia de tecidos aplicada ao tecido ósseo
A engenharia de tecidos é uma estratégia promissora que assenta num novo
domínio interdisciplinar e que utiliza princípios de engenharia e tecnologias com o
objectivo de criar suportes biológicos capazes de restaurar, manter ou melhorar a função
dos tecidos. Estes suportes denominados “scaffolds” são estruturas porosas
maioritariamente tridimensionais que, quando implantadas in vivo, servem como suportes
para a adesão e proliferação de células e para a deposição de matriz extracelular e,
consequentemente, para o crescimento dos tecidos [4, 30, 32, 33].
A engenharia de tecidos pode reunir contributos de estratégias diferentes: (1)
estratégias com base celular; (2) com base em factores de crescimento; (3) estratégias
baseadas na matriz e (4) estratégias mistas. No campo da engenharia de tecido ósseo,
estes contributos exigem interacção entre elementos osteogénicos, osteoindutores e
osteocondutores. Componentes osteogénicos incluem células aptas para a produção de
tecido ósseo mineralizado, tais como células osteoprogenitoras e osteoblastos
diferenciados. Factores osteindutores incluem produtos bioactivos que induzem o
recrutamento, a diferenciação e a proliferação dos tipos de células adequadas à
reparação de uma lesão. Um material que suporta em si o crescimento do osso
demonstra osteocondutividade. Um scaffold osteocondutivo deve providenciar um suporte
mecânico, locais para a ligação, proliferação e migração celular e permitir a adsorção e
libertação de factores de crescimento [34].
Na sua essência, a engenharia de tecido ósseo combina as células progenitoras,
tais como células estaminais mesenquimais ou células maduras (para a osteogénese),
semeadas em scaffolds biocompatíveis e com estruturas tridimensionais semelhantes à
do osso nativo (osteocondução), com factores de crescimento adequados (osteoindução),
a fim de gerar e manter o tecido ósseo formado [30].
Foram adoptadas três abordagens gerais (que estão esquematicamente
representadas na Figura 3) para a reparação óssea utilizando células osteogénicas e
scaffolds. A primeira abordagem consiste na implantação directa das células
osteogénicas. (Figura 3A). A segunda abordagem baseia-se na implantação directa in
vivo do scaffold poroso, onde ocorre o crescimento do tecido e das células (Figura 3B).
Na terceira abordagem, considera-se primeiro um período de cultura num ambiente in
vitro (num bioreactor) onde se realiza a expansão celular e a pré-diferenciação
osteogénica, que demonstra obter uma melhor regeneração e cicatrização do defeito
ósseo em relação às abordagens anteriores (Figura 3C). Várias outras etapas podem ser
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
15
adicionadas nestas abordagens, tanto na preparação da suspensão de células como na
preparação do scaffold [3, 5, 31].
Figura 3 – Representação esquemática das três estratégias principais da engenharia de tecidos que podem ser usadas para regenerar defeitos nos tecidos ósseos. Adaptado de: [31].
2.2.1. Scaffolds para engenharia de tecidos ósseos
Qualquer tecido biológico está organizado numa matriz em que se inserem um ou
vários tipos de células. A matriz é, in vivo, um scaffold 3D que proporciona às células a
arquitectura específica para o seu desenvolvimento. Por outro lado, serve como um
reservatório de água, nutrientes, citocinas e factores de crescimento. Neste sentido, e
com o fim de favorecer ou acelerar o restabelecimento da função ou da regeneração dos
tecidos lesados é necessário um molde, um scaffold, normalmente feito de material
poroso degradável, que irá funcionar como uma matriz temporária para a proliferação
celular e deposição de matriz extracelular, com consequente crescimento ósseo, até que
o novo tecido seja completamente restaurado/regenerado. Os requisitos para um scaffold
ideal estão em destaque na Tabela 3 e têm uma influência não só na sobrevivência das
células, sinalização, crescimento, propagação e reorganização, mas também na sua
expressão de genes e preservação do seu fenótipo [1, 35].
A
B
C
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
16
Tabela 3 - Requisitos para um scaffold ideal para engenharia de tecido ósseo.
Um scaffold ideal para reparação óssea deve:
Ser biocompatível, isto é, tem a capacidade para suportar a actividade celular normal, sem qualquer
efeito tóxico local ou sistémico, para o hospedeiro [1, 35, 36].
Possuir propriedades de superfície adequadas, tais como rugosidade, molhabilidade, energia e carga
de superfície, que promovam a adesão e diferenciação de células, bem como a adsorção dos metabólitos biológicos [5, 6].
Ser bioactivo, ou seja, deve possuir biomateriais capazes de formar uma camada de hidroxiapatite
carbonatada à sua superfície que permita uma ligação química com o osso nativo [4, 6].
Apresentar propriedades mecânicas semelhantes às do osso hospedeiro, de modo a proporcionar
estabilidade estrutural no local da lesão. Neste caso, o biomaterial escolhido deve possuir resistência mecânica suficiente para suportar a carga fisiológica do corpo, e absorver os estímulos mecânicos necessários para o crescimento natural na área afectada [1, 34, 36].
Apresentar uma estrutura de poros com diâmetro adequado e uma geometria totalmente interligada
que proporcione ao implante uma distribuição adequada das células para facilitar a nova vascularização. Para além disso, é importante haver uma grande área disponível para as inúmeras interacções celulares [1, 37].
Ser biodegradável, ou seja, fornece inicialmente uma estrutura estável para a formação do tecido, mas
degrada-se controladamente, permitindo uma transferência de carga gradual do osso, aumentando o espaço para a regeneração do novo tecido, de tal modo que no momento em que o local da lesão esteja totalmente regenerado, o scaffold deva estar totalmente degradado. Os produtos de degradação deverão ser não tóxicos e facilmente excretados pelo corpo [1, 6, 34, 38].
Ser conformável por técnicas de processamento capazes de moldar o scaffold de acordo com a
geometria do defeito no osso do paciente [6, 36].
Ser esterilizável e cumprir os requisitos legais para utilização clínica [36].
2.2.2. Materiais
A escolha do material mais apropriado para a produção de um scaffold é um
passo muito importante na construção de um produto da engenharia de tecidos, uma vez
que as suas propriedades irão determinar, em grande parte, o desempenho do scaffold
[1].
A matriz óssea natural engloba, na sua composição, um composto de cerâmico
(apatite natural) e um polímero biológico (colagénio). A hidroxiapatite carbonatada
representa cerca de dois terços do peso do osso e a parte restante corresponde às fibras
de colagénio. Estas são resistentes e flexíveis, suportando assim o alongamento, a
torção e a flexão. Têm sido desenvolvidos inúmeros scaffolds para a engenharia de
tecidos ósseos ao longo dos anos, recorrendo a uma vasta gama de materiais e
processos de fabrico. Os metais e a maioria dos cerâmicos não são biodegradáveis, o
que limita o campo de escolha no qual os polímeros continuam a ser os compostos mais
investigados, seguidos dos cerâmicos e, muitas vezes, sendo utilizados em combinações
compósitas [1, 8, 22].
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
17
Alguns cerâmicos têm uma longa história de utilização clínica em cimentos
ósseos por serem biocompatíveis, osteocondutores e bioactivos, e ligam-se
quimicamente ao osso quando implantado. Os cerâmicos mais estudados são a HAp e o
β-TCP (fosfato tricálcico de origem sintética) devido à sua semelhança com a fase
mineral do osso. Foram testadas várias formulações destes cerâmicos, incluindo misturas
bifásicas, com biocompatibilidade e osteocondução comprovada, mas com integridade
estrutural limitada. Os principais inconvenientes destes materiais cerâmicos são a sua
fragilidade e a falta de elasticidade, oferecendo assim uma baixa estabilidade mecânica,
o que impede a sua utilização na regeneração de grandes defeitos ósseos. Além disso,
devido a factores biológicos que se verificam após a implantação in vivo, como a
actividade dos osteoclastos, o controlo da degradação e da dissolução do scaffold, a
predictibilidade clínica da sua aplicação é, por vezes, limitada. Estas limitações podem
comprometer a estabilidade mecânica do local implantado e aumentar eventualmente as
concentrações extracelulares de Ca e P, o que pode ter um efeito citotóxico [1, 5, 18].
Como uma alternativa aos materiais acima referidos, existem polímeros naturais
ou sintéticos, inertes e biodegradáveis e, portanto, com propriedades ideais para o uso
em scaffolds para a medicina regenerativa. Adicionalmente, os polímeros oferecem uma
grande vantagem em relação aos cerâmicos: a flexibilidade [1, 22, 34].
Os polímeros naturais tais como o colagénio, a fibrina, o ácido hialurónico e o
quitosano são utilizados em engenharia de tecidos devido à sua biocompatibilidade, ao
seu potencial comportamento bioactivo, à sua versatilidade química e, em alguns casos,
devido à sua disponibilidade (tal como o quitosano) que é quase ilimitada. No entanto, a
utilização destes materiais é limitada pela sua baixa estabilidade mecânica, já que se
degradam rapidamente em meio biológico [1, 5, 39].
Os polímeros sintéticos biodegradáveis oferecem uma enorme versatilidade,
pois as suas propriedades mecânicas e degradação podem ser modificadas através da
manipulação da sua composição e condições de processamento. São exemplos deste
tipo de polímeros os poli(α-hidroxiésteres), que inclui o poli(ácido láctico) (PLA), o
poli(ácido glicólico) (PGA) e o seu co-polímero poli(ácido láctico-co-ácido glicólico)
(PLGA). Estes degradam-se por hidrólise e os seus produtos de decomposição podem
ser removidos por vias metabólicas fisiológicas. No entanto, os polímeros têm
capacidades limitadas em conseguir uma boa ligação e integração com o osso e, tal
como os polímeros naturais, possuem fracas propriedades mecânicas. Os polímeros
exibem um módulo de elasticidade tipicamente entre 7 MPa para os materiais elásticos e
4 GPa para polímeros rígidos, valores estes inferiores ao do osso cortical, que apresenta
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
18
módulos de elasticidade de cerca de 17 GPa. Adicionalmente, os polímeros estão
sujeitos a mecanismos de deformação, que podem ser significativos à temperatura
corporal e sob pressões abaixo dos limites de elasticidade individuais. Assim, os
polímeros são frequentemente reforçados com outros materiais e utilizados como
compostos [5, 8, 18, 22, 34, 39].
Os materiais compósitos são, de uma perspectiva biológica, uma estratégia
interessante que pode combinar polímeros e cerâmicos no fabrico de scaffolds para
regeneração óssea, uma vez que o osso nativo é já uma combinação entre um polímero
(i.e., colagénio fibrilar) e um material cerâmico (apatite biológica) que ocorre
naturalmente. O desenvolvimento de um scaffold de polímero e fosfato de cálcio visa
reter as vantagens de ambos os materiais de modo a atender às exigências mecânicas e
fisiológicas de um tecido semelhante ao osso. [7, 8].
Estudos realizados por Ito et al. [40] demonstram que membranas compósitas de
Quitosano/HAp implantadas na calvária de ratos são biologicamente bem toleradas, com
a presença de encapsulação fibrosa pouco significativa e ocorrência de osteogénese.
Zhang et al. [41] demonstraram também que a adição de β-TCP a estruturas de
quitosano, que isoladamente são mecanicamente fracas, melhora bastante o módulo de
compressão e tensão de cedência dos scaffolds compósitos.
Uma outra forma de tornar estas estruturas mecanicamente mais resistentes é a
adição de um agente reticulante do quitosano à sua composição. Os reticulantes são
moléculas com pelo menos dois grupos funcionais reactivos que permitem a formação de
pontes entre as cadeias poliméricas, sendo os mais comuns, no caso do quitosano, os
dialdeídos, entre os quais se destaca o glutaraldeído [42, 43].
O quitosano é reticulado pelo glutaraldeído através do seu grupo livre –NH2, que
reage facilmente com o grupo –C=O do glutaraldeído formando compostos com uma
base de Schiff (C=N), como se ilustra na Figura 4. A reticulação irreversível do
glutaraldeído através das bases de Schiff confere uma alta estabilidade operacional ao
quitosano [44, 45].
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
19
Figura 4 – Ilustração da reticulação da molécula de quitosano pelo glutaraldeído [42].
As estruturas de quitosano reticuladas são mais estáveis quimicamente, exibem
uma melhor distribuição do tamanho dos poros e uma maior resistência mecânica. Li et
al. [46] desenvolveram scaffolds de CH/HAp reticulados com glutaraldeído e mostraram
que uma reticulação apropriada pode aumentar a resistência mecânica dos scaffolds em
45% em comparação com os não reticulados [42].
(Glutaraldeído)
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
20
2.3. Resposta celular à superfície e arquitectura dos scaffolds
Todos os biomateriais devem satisfazer certos critérios e requisitos regulamentares
antes de poderem ser qualificados para o uso em aplicações médicas [47].
O pré-requisito essencial para qualificar um material como biomaterial é a
biocompatibilidade. Esta é definida como a capacidade do material em desempenhar a
função desejada no que diz respeito a uma terapia médica, sem provocar quaisquer
efeitos locais ou sistémicos indesejáveis no destinatário ou benificiário dessa terapia.
Deve gerar a resposta mais adequada, tanto a nível celular como tecidular, na situação
específica de aplicação e apresentar um relevante desempenho clínico no contexto da
terapia em apreço. A biocompatibilidade de um scaffold refere-se à capacidade deste se
comportar de forma apropriada como estrutura e suporte inicial para as células aderirem,
proliferarem e se diferenciarem, bem como para permitir a formação de uma matriz
extracelular (MEC) adequada com o tecido de implantação [9, 48, 49].
A interacção das células com a MEC é fundamental para os processos de
diferenciação e função celular. Esta é um meio complexo composto por várias moléculas
(incluindo péptidos, glicoproteínas, factores de crescimento, hormonas, colagénio e
outras proteínas) que, para além de proporcionar uma estrutura na qual as células
aderem e migram, influencia quase toda a actividade celular, incluindo a arquitectura e
movimento celular, a expressão de genes e as respostas a estímulos externos [18, 50].
As respostas celulares face ao biomaterial implantado são diversas e de grande
complexidade, variando significativamente consoante as características químicas, físicas
e biomecânicas dos scaffolds, bem como com o tipo de célula que interage com o
material [51].
Na Tabela 4, estão listadas as principais variáveis que podem influenciar
significativamente a resposta do hospedeiro.
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
21
Tabela 4 - Principais variáveis que podem influenciar a resposta do hospedeiro. Adaptado de: [52].
Principais variáveis que influenciam a resposta do hospedeiro.
Composição do material
Microestrutura do material (à escala micro ou nanométrica)
Teor de água, balanço hidrofobicidade-hidrofílicidade
Composição química da superfície
Rugosidade da superfície
Energia de superfície
Constantes elásticas
Perfil de dissolução/degradação, libertação de produtos de degradação tóxicos (como, por exemplo, iões metálicos para materiais metálicos)
Aditivos, catalisadores, contaminantes e a sua toxicidade (para materiais poliméricos)
Todas estas propriedades dependem do tempo de implantação, temperatura e
condições do ambiente, e podem mudar com o ambiente fisiológico durante a aplicação
do biomaterial [47].
Seguidamente serão apresentados e discutidos os principais parâmetros que
influenciam a biocompatibilidade e que devem ser tidos em consideração no
desenvolvimento de scaffolds para regeneração de tecido ósseo. É importante entender o
comportamento das células em contacto com o scaffold no interior da construção 3D, de
modo a conceber o design mais apropriado do mesmo para engenharia de tecidos.
2.3.1. Adsorção de proteínas
O estudo das interacções entre as proteínas e a superfície dos scaffolds
representa um dos tópicos mais importantes na área dos biomateriais, uma vez que a
resposta biológica dos biomateriais implantados in vivo é condicionada pela resposta
celular inicial, que por sua vez é mediada pela concentração, composição e forma das
proteínas adsorvidas na superfície do implante [53, 54].
Quando um material sólido, como é o exemplo do scaffold, entra em contacto com
um fluido que contém as proteínas solúveis (por exemplo, sangue, fluído intersticial,
meios de cultura de células), as proteínas são rapidamente adsorvidas na superfície do
material, saturando a superfície num intervalo de tempo de segundos a minutos.
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
22
Portanto, quando as células abordam a superfície do biomaterial, entram em contacto
não com a sua estrutura molecular de forma directa, mas sim com a camada de proteínas
adsorvidas à superfície (ver Figura 5) [53].
Figura 5 - Ilustração da ligação das células à superfície do material. Adaptado de: [55].
A superfície das proteínas é heterogénea e normalmente expõe cargas positivas e
negativas, grupos com propensão para ligações de hidrogénio, bem como regiões não
polares. Uma consequência desta complexidade é a de que cada tipo de proteína pode
interagir com outras moléculas e superfícies de distintas formas. Existem possibilidade de
interacções iónicas (tanto repulsivas como atractivas), ligações de hidrogénio,
interacções hidrofóbicas, interacções ácido-base e, claro, as sempre presentes forças de
Van der Waals. As forças motrizes mais importantes para a adsorção de proteínas são
muitas vezes consideradas como as interacções hidrofóbicas e iónicas, combinadas com
o aumento de entropia causado pelas alterações da forma da proteína durante a
adsorção [56].
As propriedades das proteínas (tamanho, carga e a sua estrutura) e as
propriedades das superfícies (molhabilidade, carga e energia de superfície e rugosidade)
com as quais as biomoléculas interagem podem influenciar os eventos interfaciais, como
será detalhado nos subcapítulos seguintes [57].
2.3.2. Molhabilidade
O efeito da molhabilidade nas interacções entre células e biomateriais tem sido
extensivamente estudado devido à sua importância no design destes [58]. A
molhabilidade reflecte a hidrofilicidade ou hidrofobicidade do material, que pode ser
medida através do ângulo de contacto. Considerando uma gota de líquido em repouso
sobre a superfície (ver Figura 6), o ângulo de contacto é definido como o ângulo formado
Proteínas Célula
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
23
pela intersecção da interface sólido-líquido e a interface líquido-vapor (geometricamente
adquirido através da aplicação de uma recta tangente entre a superfície da gota e o ponto
de inserção com o material [9, 59-62].
Quanto mais baixo for o ângulo de contacto, mais hidrofílica é a superfície (ver
Figura 6) [9].
Figura 6 - Ângulo de contacto, , para (a) superfícies hidrofóbicas e (b) superfícies hidrofílicas. Adaptado de: [63].
A hidrofobicidade/hidrofilicidade é o parâmetro inicial que poderá afectar a
adsorção das proteínas [64]. Dependendo do tipo de proteínas e células, estas podem
preferir superfícies mais hidrofílicas ou mais hidrofóbicas mas, na generalidade e
segundo alguns autores, as superfícies mais hidrofílicas são mais propensas a induzir
uma boa adsorção de proteínas e, consequentemente, favorecer a adesão celular [65].
As proteínas em contacto com superfícies hidrofóbicas são submetidas a uma
alteração conformacional para se aderirem, o que conduz a uma diminuição da
acessibilidade dos locais de adesão. Uma alta hidrofobicidade pode também afectar a
acessibilidade aos poros do scaffold por parte das células, uma vez que a penetração da
suspensão aquosa de células é retardada, ocorrendo uma distribuição celular irregular
[63, 64].
No entanto, superfícies altamente hidrofílicas não conduzem necessariamente a
superfícies mais biocompatíveis. Por exemplo, estudos realizados com a introdução de
células osteoblásticas (células MG-63) em superfícies de diamante nanocristalino com
Líquido
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
24
terminações de oxigénio (ângulo de contacto entre 20º-35º) demonstraram uma alta
tendência para desprendimentos espontâneos das células [61, 63, 66].
Faucheux et al. [67] usaram a auto-montagem de monocamadas de organosilanos
na preparação de superfícies com diferentes ângulos de contacto, para testar o seu efeito
na adesão celular. Foram criadas monocamadas hidrofóbicas (ângulo de contacto de
80º), moderadamente hidrofílicas (ângulo de contacto entre 48º- 62º) e hidrofílicas (35º).
Estas superfícies foram expostas a proteínas plasmáticas (fibronectina e vitronectina). Os
resultados mostraram que houve uma boa adesão para as superfícies moderadamente
hidrofílicas, enquanto a adesão das proteínas foi limitada nas restantes superfícies.
Posteriormente expuseram-se os biomateriais a células fibroblásticas humanas. As
células que aderiram às superfícies moderadamente hidrofílicas mostraram um
crescimento linear enquanto que nas superfícies “altamente” hidrofóbicas e hidrofílicas, o
crescimento dos fibroblastos foi bastante reduzido. Isto demonstra que a adesão das
células é claramente mediada pela adesão das proteínas, que são significativamente
influenciadas pela molhabilidade da superfície. Lee et al. [68], através de estudos in vitro
também com fibroblastos, indicam que o máximo de adesão celular destas células se dá
em torno do ângulo de contacto de 55° (ver Figura 7).
Figura 7 - Micrografias SEM da adesão celular de fibroblastos em superfícies de PE após 1 e 2 dias de cultura com diferentes ângulos de contacto (magnificação original x400) [57]. Como se pode verificar, o máximo de adesão celular dos fibroblastos dá-se ao segundo dia, com o ângulo de contacto de 55º.
Deste modo, verifica-se que superfícies com molhabilidade moderada são
capazes de absorver uma quantidade adequada de proteínas e ao mesmo tempo
86° 68° 55° 45°
1 dia
2 dias
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
25
preservar a sua conformação natural, o que resulta numa resposta celular positiva [58,
61].
Uma vez que a maioria dos polímeros é hidrofóbica, criou-se a necessidade de
manipular a sua superfície, de modo a controlar a hidrofobicidade do material. Uma
metodologia parece ser o tratamento com plasma, através do qual se pode facilmente
introduzir nas superfícies dos polímeros grupos polarizáveis, como é o caso dos grupos
hidroxilo, carboxilo e amina usando diferentes reacções de gases. Um outro método
utilizado é a deposição de polímeros hidrofílicos nas superfícies dos biomateriais, através
da co-polimerização [61].
2.3.3. Carga e energia de superfície
Sabe-se que o comportamento celular, em termos de adesão e proliferação,
depende da propensão físico-química da superfície, o que pode ser também descrito em
termos de carga e energia de superfície. Os iões presentes nas superfícies dos materiais
podem interagir com receptores celulares provocando a adesão celular e o crescimento
[69].
Muitos estudos recentes revelaram que o tipo e a composição de grupos
funcionais da superfície desempenham um papel importante no controlo da adesão de
proteínas, das células e nas respostas do tecido aos biomateriais [70, 71].
Em geral, grupos que contêm oxigénio (-OH e –COOH por exemplo) aumentam a
componente da energia livre da superfície, tornando-a mais hidrofílica e assim mais
susceptível à adsorção e adesão das proteínas da MEC (por exemplo, vitronectina,
fibronectina e colagénio). Em contraste, a adição de grupos metil (CH3-) confere à
superfície funcionalidade hidrofóbica [71, 72]. Keselowsky et al. [73] relataram que as
superfícies carregadas com diferentes grupos funcionais (-CH3, -OH, -COOH e -NH2)
modularam de forma diferente a adsorção da proteína fibronectina, tendo esta seguido
uma tendência para se ligar a -OH > -COOH = -NH2 > -CH3.
Um material com uma carga de superfície positiva ou negativa é considerado
hidrófilico, enquanto uma superfície com uma carga neutra é maioritariamente hidrofóbica
[70].
Muitos investigadores descreveram que a funcionalidade celular ocorre quando se
utilizam cargas positivas e/ou cargas negativas (ou seja, em materiais hidrofílicos) [34].
Por exemplo, Schneider et al. [74] mostraram que os hidrogéis HEMA que incorporam
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
26
cargas positivas suportam significativamente melhor a adesão e o espalhamento dos
osteoblastos e fibroblastos comparando com os hidrogéis com cargas neutras e
negativas (Figura 8).
Figura 8 - As densidades de carga positiva em hidrogéis HEMA suportam uma melhor fixação e espalhamento celular em relação às cargas negativas e neutra. Adaptado de: [74].
Por outro lado, Thevenot et al. [71] mencionaram que a incorporação de cargas
negativas também pode facilitar a adsorção de proteínas que promovem a adesão
celular.
2.3.4. Rigidez
As propriedades mecânicas do substrato também desempenham um papel
importante na resposta das células [3]. Diversos estudos relataram que a adesão celular,
proliferação e diferenciação são moduladas pela rigidez do substrato. Os tecidos sólidos
exibem uma variação na rigidez, que pode ser medida através do módulo de elasticidade,
E, também conhecido como módulo de Young [9, 75].
A adesão das células e a sua interacção com o substrato dão-se através de
receptores incorporados na sua superfície, que são maioritariamente integrinas (Figura
9). As células respondem à rigidez alterando a expressão de integrinas e a organização
do citoesqueleto (criando fibras de stress de actina-miosina) para estabelecerem um
equilíbrio de forças entre a força gerada pela célula e a resistência originada pelo
substrato. O aparecimento de fibras de stress de actina é abrupto e completo apenas
quando a célula se encontra num substrato com um intervalo de rigidez adequado [76,
77].
Carga Neutra Carga negativa Carga positiva
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
27
Figura 9 – Ilustrações que descrevem a ligação de uma célula a substratos frágeis e rígidos. Adaptado de: [78].
Para além disso, as células demonstram respostas mecanotransductoras sondando
a rigidez do seu substrato, entre outras propriedades mecânicas internas, reagindo
através de mediadores bioquímicos e adaptando o seu citoesqueleto, que têm a
capacidade de alterar a estabilidade celular, a morfologia e a expressão génica [79, 80].
A Figura 10 representa a sequência temporal dos principais processos associados à
resposta celular face à rigidez do substrato.
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
28
Figura 10 - Sequência temporal dos processos associados à resposta celular face à rigidez do substrato. As células sondam continuamente as propriedades mecânicas do seu substrato, induzindo a sinais que têm rapidamente impacto na organização do citoesqueleto e na matriz. Estas alterações induzem distintas respostas numa vasta gama de funções celulares. Adaptado de: [77].
A difusão e a mobilidade das células são mais elevadas em substratos rígidos, o
que favorece as interacções célula-célula e célula-material, levando a agregados
celulares mais organizados. Para além disso, no caso de existir um gradiente de rigidez
no substrato, as células migram para as regiões mais rígidas [3]. Engler et al. [75]
prepararam géis de poliacrilamida (PA) com diferentes módulos de elasticidade para
estudar a relação entre a área de difusão de células do músculo liso e a rigidez dos
substratos, onde se verificou que as células demonstraram uma melhor adesão para o
substrato mais rígido.
Em contraste, scaffolds com uma superfície flexível não conseguem induzir uma
organização adequada do citoesqueleto, promovendo a retracção do corpo celular, que
induz a inibição da proliferação e diferenciação [32].
2.3.5. Rugosidade
A rugosidade da superfície do material (ou topografia) corresponde à escala de
irregularidades da superfície. Este é outro factor importante que afecta a adesão celular e
o seu comportamento, tendo uma influência directa tanto in vitro como in vivo na
morfologia celular, proliferação e expressão fenotípica [9, 66].
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
29
O parâmetro mais utilizado para caracterizar a rugosidade da superfície é Ra, que
consiste na medição média dos picos e dos vales das irregularidades presentes na
superfície do material. No entanto, esta medida não dá qualquer registo do tipo de
topografia da superfície como, por exemplo, o espaçamento entre as irregularidades, as
suas formas diferentes (pirâmides, cones, cristas, sulcos), a curvatura dos vales e,
especialmente, o aguçamento dos picos na superfície do material, sendo por vezes
necessário recorrer a outros parâmetros (como, por ex. a rugosidade máxima e a
rugosidade de profundidade média) [66].
Dependendo da escala de irregularidades à superfície do material, esta varia entre
macro-rugosidades (de 100 µm a milímetros), micro-rugosidades (de 100 nm a 100 µm) e
nano-rugosidades (menos de 100 nm), cada uma com a sua influência específica no
comportamento biológico do implante. Para cada tipo de células acredita-se que existe
uma gama de valores de rugosidades preferida, em termos da sua actividade funcional
[66, 81].
Várias investigações têm relatado que células com maior dimensão (por exemplo
osteoblastos e neurónios) cultivadas em superfícies com micro-rugosidades
apresentaram bons resultados na diferenciação celular em comparação com superfícies
lisas. Por exemplo, os osteoblastos de ratazanas apresentaram maior proliferação e
aumento da síntese de fosfatase alcalina (ALP) e expressão da osteocalcina em
superfícies rugosas (0,81 µm) em comparação com as lisas (Hatano et al. [82]). No caso
de células osteoblásticas fetais humanas (hFOB 1,19), foi relatado um aumento
semelhante da adesão e proliferação celular em superfícies rugosas (Lime et al. [83]).
No entanto, existem também trabalhos que demonstram que a funcionalidade das
células osteoblásticas aumenta nas nanosuperfícies. Como é conhecido, o osso é um
nanocompósito formado por proteínas com constituintes em nanoescala e por
hidroxiapatite carbonatada (HCA) nanocristalina [84, 85]. Assim, postulou-se que a
rugosidade à nanoescala da superfície do material também pode ser vantajosa pois
assemelha-se à nanoarquitectura natural [86].
Para células menores, tais como células endoteliais da veia humana, a rugosidade
em escala nanométrica da superfície dos biomateriais é preferível para uma boa adesão
e proliferação celular (Chung et al. [87]).
Deste modo, a selectividade das células na rugosidade pode ser altamente
vantajosa para o desenvolvimento de novos biomateriais.
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
30
2.3.6. Porosidade e tamanho dos poros
A migração celular é modulada por um conjunto complexo de mecanismos
biofísicos que são influenciados não só pela bioquímica da sinalização extracelular e
intracelular, mas também pelo ambiente extracelular circundante. Deste modo, a
porosidade do scaffold, o tamanho dos poros, a sua morfologia e interconectividade são
propriedades essenciais para uma boa fixação, crescimento e motilidade das células e,
assim, para a formação de um novo tecido a três dimensões [9, 10].
Os scaffolds para osteogénese devem mimetizar a morfologia, estrutura e função
do osso, a fim de optimizar a integração no tecido circundante. Existem diversos métodos
de processamento de materiais onde é possível obter scaffolds com diferentes tipos de
porosidades (Figura 11).
Figura 11 - Scaffolds com diferentes tipos de porosidades. Adaptado de: [88].
O tecido ósseo é composto pelo osso trabecular com 50-90% de porosidade e
tamanho dos poros na ordem de 1mm de diâmetro e pelo osso cortical (com cerca de 5-
13% de porosidade). A dimensão mínima do poro exigida para regenerar osso
mineralizado é aproximadamente de 100 µm, como comprovado pelo estudo de Hulbert
et al.[89]. No entanto, o tamanho dos poros na gama dos 200-350 µm é o mais indicado
para suportar uma vascularização suficiente para o tecido. Além disto, estudos recentes
têm indicado que as multi-escalas de matrizes porosas, envolvendo tanto porosidades na
escala micro como macro, podem ser mais eficazes do que apenas matrizes porosas
numa só escala [22, 23, 90, 91].
Os estudos de Holly et al. descrevem um conceito diferente. Os autores acreditam
que a reconstrução óssea só será alcançada se a matriz 3D apresentar uma estrutura
macroporosa, com grande interligação dos poros que devem variar entre 1,2 – 2.0 mm.
Esta abordagem apresenta vantagens evidentes, pois permite a existência de espaço
para o crescimento tecidular. No entanto, as propriedades mecânicas são severamente
afectadas [92].
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
31
Diferentes células respondem de modo diferente ao tamanho de poros do scaffold,
devido às diferenças no tamanho da célula e no mecanismo de adesão celular. Por
exemplo, os fibroblastos (tamanho da célula 20-50 µm) sendo menores que as células
endoteliais (tamanho da célula 60-200 µm) podem colmatar poros menores presentes nas
estruturas [81]. Na tabela seguinte encontram-se os tamanhos de poros preferidos para
diferentes tipos de células.
Tabela 5 – Tamanho(s) do(s) poro(s) desejados em scaffolds destinados a diferentes tipos de células. Adaptado de:[81].
Células Tamanho da célula
(µm) Diâmetro do poro preferencial
(µm)
Hepatócitos 20-40 20
Fibroblastos 20-50 90-360
Osteoblastos 20-30 100-350
A interconectividade dos poros influencia positivamente a taxa de deposição
óssea e a profundidade de infiltração celular, in vitro e in vivo. Os poros interconectados
regularmente fornecem espaço para o suprimento de nutrientes, remoção de resíduos e
permite a troca de oxigénio nas regiões internas da matriz, mantendo a viabilidade das
células. A combinação do tamanho do poro e a interligação necessária para a
osteocondutividade ideal têm ainda de ser determinadas, tornando o ajuste destes
parâmetros um aspecto importante para a produção do scaffold [9, 91].
Apesar dos scaffolds com alta porosidade (cerca de 90%) serem os que facilitam
o melhor crescimento celular e deposição da MEC, a porosidade faz diminuir as
propriedades mecânicas, aumentando a complexidade da fabricação do scaffold. Por
outro lado, materiais biocerâmicos porosos podem apresentar porosidades próximas da
do osso cortical e os polímeros porosidades próximas da do osso trabecular, quando
devidamente processados. Assim, a combinação destes dois biomateriais pode permitir a
manipulação da porosidade total, ajustando-se assim aos requisitos específicos do local
onde se pretende implantar o scaffold [35, 81, 91].
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
32
2.4. Testes de Biocompatibilidade
Todos os materiais que são colocados em contacto com o tecido humano devem,
numa fase inicial, ser testados in vitro e in vivo de modo a avaliar a sua
biocompatibilidade a partir do conhecimento das respostas biológicas obtidas [12].
A biocompatibilidade deve ser testada preferencialmente in vitro antes de ser
avaliada in vivo. Para aplicações em engenharia de tecidos, a citocompatibilidade do
biomaterial é particularmente importante dado que se avalia a resposta das células que
estão em contacto directo com o material. A compatibilidade in vitro pode ser testada pela
exposição directa das células com a superfície do scaffold, indirectamente pela exposição
celular aos produtos de degradação do scaffold ou, indirectamente, com uma camada
interposta entre as células e os biomateriais. É assim possível, através destes testes,
estudar a viabilidade, proliferação e diferenciação celulares, obtendo uma rápida
avaliação com base em dados quantitativos e comparáveis e, devido à sensibilidade dos
testes, descartar num período inicial de caracterização, os materiais não biocompatíveis
[11-13].
Os ensaios de biocompatibilidade in vitro são experimentalmente controláveis,
facilmente reprodutíveis, de processamento relativamente rápido e relativamente
económicos. A somar a estas vantagens, estes testes evitam geralmente os problemas
éticos e legais que se colocam no uso de animais e seres humano em testes. A principal
desvantagem dos testes de biocompatibilidade in vitro é a sua relevância clínica que
pode ser questionada, necessitando de ser posteriormente confirmados, por
metodologias in vivo, os resultados in vitro [93].
O sub-capítulo que se segue resume algumas das metodologias in vitro utilizadas
na avaliação da biocompatibilidade de novos scaffolds para regeneração óssea.
2.4.1. Sistemas de testes estabelecidos
A existência de testes standard é fundamental para estabelecer uma série de
orientações e permitir comparações entre diferentes estudos. A International Standard
Organization (ISO) estabeleceu um conjunto de directrizes para garantir a segurança dos
dispositivos médicos. As normas ISO 10993, com 18 partes, descrevem os testes
biológicos que se devem ser realizados para a validação da utilização de dispositivos
médicos. Os ensaios in vitro de citotoxicidade são os primeiros testes para avaliar a
biocompatibilidade de qualquer tipo de material para uso como dispositivo médico,
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
33
reconhecido em 1987 pela Organization for Economic Cooperation and Development
(OECD), e em 1993 pela Food and Drug Administration (FDA). Só depois de se provar a
ausência total de citotoxicidade é que se efectuam os estudos subsequentes de
biocompatibilidade, geralmente recorrendo a modelos animais [14, 94].
Nestas normas, a citocompatibilidade é analisada a partir de: (a) avaliação dos
danos celulares por meios morfológicos, (b) medições do dano celular, (c) medições do
crescimento celular e (d) medições de aspectos específicos do metabolismo celular [95].
2.4.2. Testes in vitro para avaliação da biocompatibilidade
Existe uma variedade de métodos para testar a citotoxicidade a resposta biológica.
Para a avaliação de todos os fenómenos mencionados na secção anterior, existem
diversas metodologias que se encontram seguidamente detalhadas.
Ensaios de viabilidade/proliferação
LDH - Consiste na libertação de uma enzima (lactato-desidrogenase), usualmente
intra-celular, que chega até ao meio de cultura (ambiente extracelular), quando ocorre
lesão da membrana citoplasmática. É assim possível medir com precisão a integridade
da membrana celular e, consequentemente, a viabilidade celular [14].
Glutationa - É um ensaio luminescente baseado na detecção e quantificação de
glutationa (GSH) nas células ou em várias amostras biológicas. A alteração nos níveis de
GSH é importante na avaliação das respostas toxicológicas e é um indicador de stress
oxidativo, o que pode conduzir à apoptose ou morte celular [96].
Fluorometria - Utilização de corantes fluorescentes que se ligam especificamente
ao DNA e RNA. A fluorescência dos corantes aumenta quando estes se ligam aos ácidos
nucleicos, havendo possibilidade de assim fazer a quantificação do DNA [97].
Ensaio de actividade metabólica
Alamar Blue (Resazurina) - Alamar Blue é um corante solúvel em água que
quando adicionado a células viáveis, a sua forma oxidada entra no citosol e é convertido
para a sua forma reduzida pela actividade das enzimas mitocondriais bem como a partir
dos citocromos (Figura 12). Esta reacção é acompanhada por uma mudança de cor do
meio de cultura, que pode ser facilmente medida pela leitura colorimétrica ou fluorimétrica
[98].
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
34
Figura 12 – Conversão da resazurina a resofurina por células viáveis, resultando num produto fluorescente. A fluorescência produzida é proporcional ao número de células viáveis. Adaptado de:
[99].
MTT - É um ensaio colorimétrico que tende em reflectir a actividade mitocondrial
pela redução metabólica de um sal amarelo solúvel de tetrazólio num produto insolúvel
azul – o formazano (Figura 13). Os sais de tetrazólio aceitam electrões de substratos
oxidados ou enzimas adequadas, tais como NADH e NADPH. Esta reacção converte os
sais de amarelo para azul de formazano, que podem ser dissolvidos num solvente
orgânico. Assim, qualquer aumento ou diminuição no número das células viáveis pode
ser detectado pela medição da concentração de formazano reflectido através de um
espectrofotómetro [100-102].
Figura 13 - Ensaio colorimétrico – MTT. Adaptado de: [103].
Método de Bradford – É um ensaio de quantificação da proteína total. O ensaio é
baseado na observação das mudanças da absorvância máxima para uma solução ácida
de Coomassie Brilliant Blue G-250, entre 465 nm a 595 nm, que é quando a ligação
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
35
proteica ocorre. Tanto as interacções hidrofóbicas como as iónicas estabilizam a forma
aniónica do corante, provocando uma alteração de cor visível [104].
Avaliação da morfologia
A avaliação da morfologia é normalmente efectuada com base em técnicas de
microscopia, designadamente a microscopia electrónica de varrimento (SEM) e a
microscopia de fuorescência/confocal após marcação fluorescente.
Ambas permitem a contagem celular e a sua observação morfológica. A Figura 14
mostra exemplos de imagens possíveis de obter através dos tipos de microscopia
descritos.
Figura 14 - Exemplos de imagens de microscopia de fluorescência (A,B) e de microscopia electrónica de varrimento (C,D) de células MG63. Adaptado de:[105].
Actividade funcional
PCR - Esta técnica baseia-se na amplificação exponencial selectiva de uma
pequena quantidade de DNA de um determinado conjunto de células, através de um
mecanismo de síntese artificial de DNA num processo em cadeia que imita a replicação
do DNA. Trata-se de um método rápido e eficiente para amplificação de sequências
específicas a partir de uma mistura complexa de sequências genómicas ou DNA
A B
C D
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
36
complementar. A reacção da PCR envolve três fases: a fase de desnaturação pelo calor,
a fase de annealing e a fase de extensão que podem ser observadas na Figura 15. Com
este método é possível amplificar milhões de vezes e em poucas horas pequenas
quantidades de material genético [106].
Figura 15 - Representação esquemática de um ciclo da técnica de PCR. Adaptado de: [106].
rt-PCR (PCR em tempo real) – O procedimento desta técnica é semelhante ao
descrito anteriormente. No entanto possibilita a quantificação em tempo real do DNA
amplificado, em cada ciclo de amplificação. Neste método, as fases de amplificação,
detecção e quantificação são totalmente automatizadas, ocorrendo em simultâneo e em
tempo real [106].
Immunoblotting – Esta técnica permite identificar e quantificar proteínas
específicas a partir de uma mistura complexa de proteínas extraídas a partir de células.
A técnica utiliza três elementos para realizar esta tarefa: (a) a separação das proteínas
por tamanho a partir da electroforese em gel de prolicrilamida bi-dimensional, (2) a
transferência das proteínas para um suporte sólido (geralmente membranas de
nitrocelulose), e (3) a aplicação de um anticorpo (primário e secundário) adequado para
identificar e permitir a quantificação da proteína alvo [107, 108].
Capítulo 2 – Revisão da Literatura
37
Para uniformizar os métodos e comparar os seus resultados, as variáveis tais
como o número de células, a fase de crescimento das células (período de frequência da
sua replicação), tipo de célula, duração da exposição, o tamanho da amostra (isto é,
geometria, densidade, forma e espessura) e a área de superfície da amostra, devem ser
cuidadosamente controladas [32].
A avaliação biológica a partir das metodologias in vitro são fundamentais para o
desenvolvimento de novos biomateriais. No entanto, esta avaliação não é suficiente,
sendo extremamente importante a complementação destes resultados com outros
ensaios (como a experimentação em animais - testes in vivo e ensaios clínicos) uma vez
que, por exemplo, um óptimo desempenho in vitro pode não corresponder ao melhor
desempenho in vivo [109].
38
39
Capítulo 3
Procedimento Experimental
40
Capítulo 3 – Procedimento experimental
41
3. Procedimento Experimental
3.1. Materiais e células
Para a produção de grânulos de CaP, utilizou-se uma suspensão comercial de
nanopartículas de HAp (nanoXIM, Fluidinova S.A) com diâmetro médio de partícula <50
nm, a uma concentração de 5% (peso/volume) e uma suspensão de fosfato tricálcico (β-
TCP) (Fluka) a 30% (peso/volume). Para produzir os grânulos atomizados, diluíram-se
ambas as suspensões de modo a obter uma concentração de fosfatos de cálcio de 0,1%
(peso/volume).
Para o fabrico dos scaffolds utilizou-se, para além dos grânulos atomizados,
quitosano (Sigma-Aldrich), com grau de desacetilação de 80%, aproximadamente) e
ácido acético (Merck, 100%) diluído a 0,2M. Como agente reticulante do quitosano, usou-
se o glutaraldeído (Grade II 25% em H2O) da Sigma-Aldrich.
Para os ensaios de interacção com células utilizaram-se células MG-63 (obtidas de
osteossarcoma humano) (ATCC). Como meio de cultura foi utilizado o meio α-MEM
(Gibco), suplementado com soro bovino fetal (Gibco 10108-165), penincilina (Sigma-
Aldrich), fungizona (Gibco) e ácido ascórbico (Sigma-Aldrich). Nos procedimentos de
caracterização das culturas celulares foram utilizados os seguintes reagentes: tripsina
(Gibco), ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) (Sigma-Aldrich), Alamar Blue
(Life Technologies), solução tampão de fosfato (PBS) estéril e não estéril (Gibco), Triton
(Sigma-Aldrich), NaOH 5M (Sigma-Aldrich), glutaraldeído a 1,5% (Sigma-Aldrich) e
cacodilato de sódio 0,14M (Sigma-Aldrich).
3.2. Métodos de Preparação
3.2.1. Preparação dos grânulos de CaP
No âmbito deste trabalho, foram produzidos dois tipos de grânulos: grânulos de Hap
e misturas bifásicas de β-TCP/HAp com razão mássica de 50/50. Para tal, prepararam-se
suspensões aquosas com uma concentração de 0,1% (peso/volume) de HAp e de
misturas bifásicas de β-TCP/HAp num volume total de 500mL.
Capítulo 3 – Procedimento experimental
42
O pó de β-TCP, antes de utilizado na atomização, foi moído num moinho planetário
durante 48 horas por forma a obter-se um pó com distribuição granulométrica apertada e
com tamanho médio de partícula ≤1 μm [15].
Os grânulos foram obtidos a partir da atomização das suspensões de fosfato de
cálcio num atomizador laboratorial Mini Spray Dryer Bushi-191 (Figura 16), utilizando um
bico de 73 μm, uma bomba a 20%, um aspirador a 80% e uma temperatura de secagem
no interior da câmara de atomização de 180ºC (condições já optimizadas em trabalhos
anteriores) [15, 110].
Figura 16 – Atomizador laboratorial Mini Spray Dryer Bushi-191 e respectivas condições de utilização.
3.2.2. Preparação das matrizes de CH reticuladas e dos scaffolds
compósitos
Matrizes de CH reticuladas
Preparou-se uma solução de quitosano, dissolvendo o CH numa solução de ácido
acético 0,2M sob agitação e em condições de pH aproximadamente igual a 5, por forma a
Temperatura
Aspirador
Bomba
Capítulo 3 – Procedimento experimental
43
obter uma solução polimérica com concentração de 2% [(massa de CH/ massa total de
solução)*100)].
Numa tentativa de melhorar as propriedades mecânicas dos scaffolds compósitos,
adicionaram-se à solução diferentes percentagens de glutaraldeído: 0,2%, 0,5%, 1%, 5%
e 10% [%=(massa de GA/massa de polímero) x 100].
A solução resultante foi repartida por moldes cilíndricos com aproximadamente 10
ml de capacidade (Figura 17) que foram posteriormente colocados numa arca frigorífica a
uma temperatura de -20ºC durante um período mínimo de 24 horas.
Figura 17 – Moldes cilíndricos utilizados no fabrico dos scaffolds.
Scaffolds compósitos
A solução de quitosano com reticulante é preparada da forma descrita
anteriormente. Acrescentam-se os grânulos atomizados à solução enquanto esta ainda
se encontra sob agitação. A quantidade de grânulos adicionados corresponde a uma
razão de [2:1] de [quitosano: fosfatos de cálcio], obtendo-se uma suspensão com
concentração mássica de 1% [(massa de grânulos/ massa total da suspensão)*100].
Procedeu-se então à repartição da suspensão pelos moldes e à sua congelação em
condições semelhantes às usadas para as matrizes de CH reticuladas.
As matrizes e os scaffolds compósitos foram posteriormente sujeitos a liofilização,
colocando os moldes num liofilizador Labconco freeze DrySystem (Figura 18) com
pressão 12x10-3 mbar e temperatura -52ºC durante 4 dias por forma a remover o solvente
por sublimação.
Capítulo 3 – Procedimento experimental
44
Figura 18 - Liofilizador Labconco freeze DrySystem.
Após esse período, as amostras foram sujeitas a um tratamento com etanol segundo
o procedimento descrito por Madihally et al. [111] envolvendo os seguintes passos:
1) Mergulham-se os scaffolds em etanol absoluto durante 60 minutos;
2) Dilui-se o etanol para uma concentração de 70% (volume/volume). Os scaffolds
permanecem nesta solução durante mais 30 minutos;
3) Por fim, volta-se a diluir a solução etanólica até 30% (volume/volume) e prolonga-
se o tratamento durante mais 30 minutos.
Finalizado o tratamento em etanol, as amostras são imediatamente congeladas em
azoto líquido (-196ºC) e colocadas novamente no liofilizador por mais 24 horas.
Concluído o tempo de liofilização, retiraram-se as amostras dos moldes e colocaram-
se num excicador para sua conservação e posterior caracterização.
3.2.3. Preparação das membranas compósitas
As suspensões necessárias à preparação das membranas compósitas foram
preparadas seguindo o mesmo procedimento referido na secção anterior. Cada
suspensão foi depositada, por sua vez, em cima de uma lâmina sobre uma placa de Petri
e posteriormente colocada sob vácuo durante duas horas por forma a remover grande
parte das bolhas formadas na solução durante a agitação.
Colocaram-se então as membranas a secar numa estufa a 40ºC durante 24 horas.
Forma-se assim uma membrana sobre a lâmina que se desloca da placa de Petri e se
conserva num excicador.
Capítulo 3 – Procedimento experimental
45
3.3. Caracterização
3.3.1. Caracterização dos grânulos de CaP
Os grânulos preparados por atomização foram caracterizados quanto à área
superficial específica, composição de fases cristalinas e morfologia.
A área superficial específica foi determinada com a ajuda do equipamento
Micromeritis Gemini 2370 V5.00 (Norcross, USA) por adsorção física de azoto, usando a
isotérmica de adsorção Brunauer, Emmett e Tellerum (BET).
Os grânulos foram também analisados por difracção de Raio-X (DRX) num
difratómetro Rigaku Geigerfle D/Max-SérieC, equipado com um monocromador curvo de
grafite, com uma voltagem de 40 kV e uma corrente de 30 mA, usando a radiação Kα
(λ=1,54056 Å), de modo a poder identificar as fases cristalinas dos diferentes pós.
A análise morfológica dos grânulos de CaP foi efectuada por microscopia
electrónica de varrimento (SEM), num microscópio HITACHI, modelo S-4100 provido de
um sistema de emissões de electrões com um filamento de tungsténio com potencial de
aceleração de 10 kV e resolução máxima de 15 Å.
Para preparação das amostras para microscopia electrónica, fixou-se fita-cola de
dupla face de num porta-amostras de alumínio sobre a qual se dispersou uma pequena
quantidade de pó. Ambas as amostras foram revestidas com um filme fino de carbono
depositado no equipamento EMITECH K950.
3.3.2. Caracterização dos scaffolds
Os scaffolds produzidos neste trabalho foram caracterizados quanto à sua
microestrutura e resistência mecânica à compressão.
A microestrutura foi observada por microscopia electrónica de varrimento (SEM)
usando o mesmo microscópio referido na secção 3.3.1. Para observação das amostras,
foram realizados cortes transversais nos diferentes scaffolds e posteriormente fixadas
com cola de dupla face de carbono em porta-amostras de alumínio. As amostras foram
revestidas com um filme de carbono obtido no depositador de carbono (EMITECH K950).
A partir das micrografias obtidas e com a ajuda do programa ImageJ 1.45, foram
medidas as áreas dos poros em determinadas amostras (Figura 19).
Capítulo 3 – Procedimento experimental
46
Figura 19 - Cálculo da área dos poros usando o ImageJ 1.45.
As micrografias sofrem um tratamento de imagem, gerando-se uma imagem binária
onde as formas pretas correspondem aos poros, sendo a área de cada poro calculada
automaticamente. Para este processo, foram utilizadas três imagens com a mesma
amplificação para cada amostra, o que corresponde a cerca de 300 poros.
Gerados os valores das áreas dos poros foi calculado o diâmetro equivalente e a
distribuição de tamanho dos mesmos.
Nos casos em que não se evidenciavam grandes variações no tamanho do poro, foi
calculado apenas o tamanho médio do poro com o mesmo programa. Usando imagens
SEM, fizeram-se medições em todos os poros das imagens, avaliando-se os seus
diâmetros em diferentes direcções, uma vez que os poros não apresentam uma secção
recta perfeitamente circular (Figura 20). Esta metodologia já foi utilizada de um modo
semelhante em trabalhos anteriores [110].
Figura 20 - Cálculo do tamanho médio dos poros usando o ImageJ 1.45.
O conjunto de valores medido foi usado para cálculo do diâmetro, da média e do
desvio padrão das diferentes amostras.
Os diferentes scaffolds compósitos foram também submetidos a ensaios de
compressão para avaliação do módulo de Young e da resistência mecânica à
compressão. Para isso, utilizou-se um equipamento universal de ensaios mecânicos
Capítulo 3 – Procedimento experimental
47
Zwick/Roell Z020 (Figura 21), com velocidade de aplicação de carga de 1 mm/min e uma
célula de carga 20 KN.
Figura 21 - Equipamento de ensaios mecânicos Zwick/Roell Z020 e respectiva célula de carga utilizada.
Os ensaios foram realizados em três amostras de scaffolds preparados nas
mesmas condições até se obter uma deformação de cerca de 50%. Com a ajuda do
programa de aquisição de dados “testXpert”, efectuou-se o registo simultâneo da força e
do deslocamento do prato. Com esses dados, construíram-se as respectivas curvas de
tensão-deformação para cada tipo de scaffold, que descrevem o comportamento do
material ao longo do ensaio.
A tensão mede a força por unidade de área e calcula-se através do quociente
entre a força aplicada e a área da secção transversal à direcção de aplicação da força,
usando a seguinte expressão:
( )
onde é a tensão de compressão resultante, F é a força de compressão uniaxial e A é a
área inicial da superfície que suporta a força aplicada.
Capítulo 3 – Procedimento experimental
48
A deformação do material ( ) é expressada pelo quociente entre a variação da
altura ( ) e a altura inicial da amostra ( ):
3.3.3. Caracterização das membranas compósitas
As membranas compósitas foram caracterizadas quanto à sua rugosidade e
molhabilidade.
Um dos parâmetros mais importantes para a caracterização da superfície é a
rugosidade das membranas. Na avaliação deste parâmetro, utilizou-se um profilómetro –
Perthometer M1, Mahr (Figura 22), que permite fazer medições de rugosidade em
diferentes pontos das membranas, varrendo um comprimento de 5,6mm.
Figura 22 - Profilómetro (Perthometer M1, Mahr) utilizado nas medições de rugosidade das membranas.
Este aparelho permite a quantificação da rugosidade média (Ra). Para cada
membrana realizaram-se oito medições para obter a média de cada parâmetro.
As membranas foram também caracterizadas por SEM para análise da sua
morfologia e espessura, usando o mesmo microscópio electrónico de varrimento referido
na secção 3.3.1.
De forma a poder ter-se uma percepção de quão hidrofílica ou hidrofóbica é a
superfície do scaffold, produziram-se membranas com a mesma composição dos
scaffolds compósitos e mediram-se os respectivos ângulos de contacto. Estes foram
mensurados com o aparelho de medição de ângulos de contacto Dataphysics – contact
angle sistem OCA (Figura 23) que depositava uma gota de água de 1,5 µl sobre a
superfície da membrana.
Capítulo 3 – Procedimento experimental
49
Figura 23 - Aparelho de medição de ângulos de contacto Dataphysics – contact angle sistem OCA.
Com a ajuda do software SCA20, mediram-se os ângulos de contacto para t=0 (ou
seja, o ângulo de contacto considerado foi o primeiro valor obtido pelo aparelho).
Registaram-se também os valores dos mesmos ao longo do tempo (aproximadamente 50
s), repetindo-se sete medições para cada membrana.
3.4. Estudos de citocompatibilidade dos scaffolds
Os scaffolds foram submetidos a ensaios de interacção com células para
caracterizar a sua resposta biológica, nomeadamente a viabilidade celular/proliferação,
adesão, morfologia celular e funcionalidade. Todo este trabalho foi realizado no
Laboratório de Metabolismo e Regeneração Óssea da Faculdade de Medicina Dentária
da Universidade do Porto.
Todos os materiais submetidos a estes ensaios foram esterilizados por radiações
UV num período mínimo de 12 horas.
A população celular utilizada foi a linhagem celular MG-63 (ATCC), obtida de
osteossarcoma humano. Esta linha celular apresenta características fenotípicas
semelhantes às populações osteoblásticas, nomeadamente a expressão de elevados
níveis de fosfatase alcalina, osteocalcina, colagénio tipo I e osteoprotegerina (marcadores
específicos do fenótipo osteoblástico. Esta linha celular é frequentemente utilizada na
avaliação da citotoxicidade de biomateriais que visam o contacto com o tecido ósseo
[112-114].
Capítulo 3 – Procedimento experimental
50
3.4.1. Estabelecimento e manutenção das culturas celulares
As células MG-63 foram cultivadas em placas de culturas standard num meio de
cultura composto por α-Minimum Essential Medium (α-MEM, GIBCO) suplementado com
10% (volume/volume) de soro bovino fetal (Gibco® 10108-165), penincilina-
estreptomicina (100 UI/ml e 100 µg/ml, respectivamente), fungizona (2,5 mg/ml), ácido
ascórbico (50 µg/mL), à temperatura de 37ºC e em atmosfera humidificada com 95% de
ar e 5% de CO2.
Para realização das experiências, as células aderidas foram enzimaticamente
libertadas com a ajuda de uma solução de tripsina a 0,05% (massa/volume) e 0,5 mM
EDTA durante aproximadamente 10 minutos. A acção da tripsina foi então interrompida
com a adição de meio completo, obtendo-se uma suspensão com células cuja
concentração foi determinada num hematocitómetro (Nihon Koheden®, Celltac MEK-
5103K). Entretanto, as amostras dos diferentes scaffolds foram introduzidas em placas
com 48 poços, com 1 ml de meio completo em cada poço e incubaram durante 30
minutos.
Seguidamente removeu-se o meio de cultura de cada poço e introduziu-se a
suspensão celular (5x105 células/cm2), em meio de cultura com a composição acima
descrita. As células foram incubadas nas mesmas condições de cultura referidas
anteriormente.
3.4.2. Caracterização das culturas celulares
As culturas celulares foram avaliadas quanto à sua viabilidade/proliferação celular
(ensaio da resazurina), à actividade enzimática da fostatase alcalina e foram observadas
a nível da sua morfologia celular e adesão (por microscopia electrónica de varrimento).
3.4.2.1. Viabilidade/proliferação celular (Resazurina)
A resazurina, conhecida comercialmente por Alamar Blue, é utilizada como um
indicador de oxidação-redução que permite a avaliação da actividade metabólica das
células viáveis. A sua forma oxidada apresenta-se não fluorescente com uma coloração
azul. Este composto pode ser reduzido, pelas células viáveis, a resofurina, de cor rosa e
Capítulo 3 – Procedimento experimental
51
fluorescente. Esta mudança de cor do meio de cultura é posteriormente medida pela
determinação da fluorescência emitida e é proporcional à actividade metabólica das
células viáveis em cultura.
Para realizar a experiência, removeu-se o meio às culturas e adicionou-se novo
meio com resazurina (10 µg/ml) a cada poço. As placas foram de seguida incubadas
durante 3 horas (à temperatura de 37ºC e em atmosfera humidificada com 95% de ar e
5% de CO2) para permitir condições óptimas de oxidação-redução. A redução da
resazurina foi determinada pela medição de fluorescência (λex= 530 nm, λem= 590 nm) num
leitor de ELISA (Synergy HT, Biotek). O valor do controlo (scaffolds mantidos em meio de
cultura sem adição de células) foi subtraído. Em cada tempo de cultura, cada material foi
testado em triplicado.
3.4.2.2. Actividade da Fosfatase Alcalina
A fosfatase alcalina (ALP) é uma proteína com actividade enzimática capaz de
remover grupos fosfato de um grande número de moléculas diferentes em ambiente
alcalino, resultando na formação de um radical fosfato orgânico e inorgânico.
Em aplicações da engenharia de tecido ósseo é importante a avaliação desta
enzima, uma vez que esta se encontra em elevadas quantidades no tecido ósseo,
secretada essencialmente pelos osteoblastos, sendo um componente importante na
osteogénese. A síntese da ALP é um marcador característico da diferenciação dos
osteoblastos, sendo a sua actividade essencial para o inicio da mineralização da osteóide
[115, 116].
Para detectar a actividade desta enzima, sabe-se que esta catalisa a transferência
do grupo fosfato do substrato p-nitrofenilfosfato (p-NFF) para o 2-Amino-2-Metil-1-
Propanol (AMP), formando o p-nitrofenol de acordo com a equação abaixo:
p-NFF + AMP → p-Nitrofenol + AMP-Fosfato
A velocidade de libertação do p-Nitrofenol, que possui elevada absorbância a
405nm numa solução tampão alcalina, é assim proporcional à actividade enzimática da
fosfatase alcalina da amostra.
Após um tratamento das culturas com Triton a 0,1%, deu-se a lise das células
mantendo-se a conformação estrutural da maioria das proteínas. A actividade da ALP foi,
assim, analisada por determinação colorimétrica do produto do p-nitrofenol a λ=400 nm
num leitor de ELISA (Synergy HT, Biotek). A hidrólise do fosfato p-nitrofenil (pH 10,3) foi
Capítulo 3 – Procedimento experimental
52
realizada durante 60 minutos a 37°C que posteriormente foi interrompida com a adição de
NaOH 5M. A actividade da ALP de cada amostra foi normalizada para a sua
concentração de proteína e os resultados foram expressos em nanomoles de p-nitrofenol
produzido por minuto por µg de proteína (nmol/min-1 µg proteína-1). A quantificação da
proteína total foi realizada pelo método de Lowry.
3.4.2.3. Avaliação da adesão e morfologia celular por microscopia electrónica de
varrimento (SEM)
Para avaliar a adesão e detectar possíveis alterações na morfologia das células
MG-63 cultivadas sobre os diferentes scaffolds, recorreu-se à observação das
micrografias obtidas por SEM. Para isso, as culturas foram inicialmente fixadas com
glutaraldeído a 1,5% durante 10 minutos, lavadas com PBS e mantidas numa solução
tampão de cacodilato de sódio 0.14M. As amostras foram desidratadas em diferentes
concentrações de álcool (70%, 80%, 90% e 100%), por 10 minutos. Para simular a
secagem ao ponto crítico, as amostras foram incubadas por 10 minutos em diferentes
concentrações de hexametildisilazano (50%, 60%, 70%, 90%, 100%, em álcool).
Seguidamente, foram revestidas com filme fino de Au/Pd, por pulverizacão catódica
(sputtering), utilizando o equipamento SPI Module Sputter Coater. O exame SEM / EDS
foi realizado utilizando o Microscópio Eletrónico de Varrimento ambiental, de alta
resolução (Schottky), com Microanálise por Raios X e Análise de Padrões de Difracção
de Electrões Rectrodundidos: Quanta 400FEG ESEM / EDAX Genesis X4M.
3.4.2.4. Análise estatística
Os resultados apresentados relativamente à caracterização biológica com culturas
celulares resultam da realização de 3 experiências independentes. Nos testes
bioquímicos (Resazurina e actividade da fosfatase alcalina), cada valor representa a
média e o desvio padrão de 5 ensaios independentes. A análise estatística foi realizada
com recurso à análise de variância (ANOVA one-way), tendo sido considerados
significativos os resultados com p ≤ 0,05.
53
Capítulo 4
Resultados e Discussão
54
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
55
4. Resultados e Discussão
4.1 Caracterização dos grânulos de CaP
Foram obtidos por atomização grânulos de HAp, β-TCP e da mistura de ambos
(mistura bifásica) [(massa de HAp/massa de β-TCP)=1].
Segundo a literatura, materiais granulares de fosfato de cálcio demonstraram
potencialidade para substituição do osso, por serem fáceis de implantar e por
estabelecerem uma óptima biocompatibilidade e osteocondutividade [117].
A Figura 24 apresenta as imagens obtidas por SEM das partículas da suspensão
inicial de HAp (comercial) e do respectivo pó atomizado.
Figura 24 - Imagens SEM de HAp: a) partículas da suspensão inicial de HAp e b) grânulos de HAp atomizados.
Pode-se observar, através da micrografia da Figura 24 (a), que as partículas da
suspensão inicial apresentam um tamanho nanométrico, com tamanho médio de 0,058
µm e com uma distribuição uniforme. Observa-se também que os grânulos formados por
atomização são micrométricos com uma forma esférica e cerca de 3 µm de diâmetro
médio, o que é indicativo de uma aglomeração das nanopartículas iniciais durante a
atomização.
A Figura 25 apresenta as micrografias obtidas por SEM das partículas da
suspensão inicial de β-TCP e do respectivo pó após a atomização.
a b
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
56
Figura 25 - Imagens SEM de β-TCP: a) partículas da suspensão inicial de β-TCP e b) grânulos de β-TCP atomizados.
As partículas da suspensão inicial de β-TCP apresentam-se com dimensões
consideravelmente maiores do que as das partículas iniciais de HAp e com o tamanho
não uniforme. Com a atomização, dá-se uma agregação das partículas, obtendo-se
grânulos de tamanhos também irregulares, com uma formas esféricas assimétricas
(Figura 25b).
Na Figura 26 pode comparar-se a morfologia das partículas da mistura bifásica com
a do pó após atomização.
Figura 26 - Imagens SEM de misturas bifásicas: a) e c) partículas da suspensão bifásica inicial e b) e d) grânulos bifásicos atomizados.
a b
b a
c d
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
57
Detecta-se na mistura inicial bifásica a presença das partículas nanométricas de
HAp e a das partículas de β-TCP que são um pouco maiores e com uma forma mais
irregular. A junção destes dois tipos de partículas originou, após atomização, grânulos
bifásicos com uma forma esférica menos regular do que a dos grânulos de HAp e com
tamanho maior e menos uniforme.
A Tabela 6 apresenta as áreas superficiais específicas dos vários pós, antes e
após atomização.
Tabela 6 - Áreas superficiais específicas obtidas por BET das diferentes partículas antes e depois de atomizadas (grânulos).
Suspensões
de CaP
Área Superficial Específica das
partículas da suspensão inicial
(BET) (m2/g)
Área Superficial Específica
dos grânulos (BET) (m2/g)
HAp 124 106
β-TCP 48 17
Bifásicos HAp +
β-TCP (50:50) 65 60
Ao observar os resultados obtidos, verifica-se uma certa diferença entre as áreas
das partículas iniciais e as dos grânulos. As áreas superficiais específicas das partículas
da suspensão inicial de HAp e de β-TCP são relativamente maiores do que as áreas
superficiais dos respectivos grânulos atomizados, o que sugere tratar-se de uma
agregação com perda de superfície.
As partículas bifásicas da suspensão inicial apresentam uma área superficial
intermédia entre a da HAp e do β-TCP. A área superficial específica do seu pó atomizado
é semelhante à do pó inicial, o que indica tratar-se de uma agregação leve com pouca
perda de superfície.
As fases cristalinas dos grânulos atomizados foram identificadas por difracção de
raio-X, apresentando-se na Figura 27 os difractogramas obtidos.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
58
Figura 27 - Difractograma de raio-X dos grânulos de HAp, β-TCP e dos grânulos Bifásicos, obtidos por atomização
Os resultados apresentados revelam que, no caso da HAp atomizada, todos os
picos correspondem à fase cristalina da HAp, sendo este difractograma idêntico ao das
nanopartículas usadas na suspensão inicial, o que indica que a cristalinidade da HAp não
sofreu alteração durante o processo de atomização. O mesmo se verifica no
difractograma do β-TCP, onde se detecta também apenas a fase cristalina deste material.
No caso do DRX dos grânulos bifásicos, observa-se a presença de picos
correspondentes tanto à HAp como ao β-TCP, o que está de acordo com o facto de se
tratar de uma mistura bifásica de ambos.
No presente trabalho, utilizaram-se apenas os grânulos de HAp e grânulos da
mistura bifásica entre β-TCP e HAp (proporção mássica 50:50) para o fabrico dos
scaffolds uma vez que são os que apresentam uma morfologia mais adequada. Este é
um parâmetro que deve ser seleccionado cuidadosamente e, segundo a literatura, a
forma esférica (conseguida nos grânulos de HAp e bifásicos) tem sido recomendada para
evitar processos inflamatórios e melhorar a osteointegração [118, 119].
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Inte
nsid
ad
e (
u.a
.)
2 Theta (º)
* - HAp # - B-TCP
*
*
*
*
* * * * *
*
*
*
#
#
# #
#
# #
# # #
#
# # #
Grânulos de HAp
Grânulos de β-TCP
Grânulos Bifásicos
*
# #
# # #
#
#
#
#
# # #
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
59
Na Figura 28 apresentam-se as imagens obtidas por microscopia electrónica de
varrimento dos dois tipos de grânulos atomizados utilizados no presente trabalho.
Grânulos de HAp Grânulos Bifásicos
Figura 28 - Micrografias de SEM dos grânulos: a), c), e) e g) de HAp e b), d), f) e h) bifásicos.
Comparando as imagens, verifica-se que os grânulos de HAp apresentam uma
morfologia esférica, com ligeiras irregularidades à superfície, ao passo que os grânulos
bifásicos exibem maiores irregularidades, que tornam a sua superfície menos esférica.
Como se viu anteriormente, os grânulos de β-TCP após atomização apresentam uma
a b
c d
e f
g h
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
60
forma bastante irregular. Deste modo, quando o β-TCP é atomizado conjuntamente com
a HAp, formam-se grânulos esféricos mais regulares do que os do β-TCP, embora menos
perfeitos do que os de HAp. Superfícies com irregularidades ou rugosidades como as dos
grânulos obtidos no presente trabalho têm sido recomendadas uma vez que favorecem a
adesão celular [120, 121].
4.2. Caracterização das matrizes de CH reticuladas
Os scaffolds de quitosano com grânulos de fosfato de cálcio já estudados em
trabalhos anteriores apresentavam ainda algumas limitações ao nível da resistência
mecânica. Tornou-se, assim, necessário implementar uma medida que melhorasse o
comportamento mecânico do scaffold, de modo a que este se aproximasse ao
comportamento do osso.
Incorporou-se na matriz polimérica um agente reticulante, o glutaraldeído (GA),
capaz de formar ligações com os grupos amina do quitosano, conferindo rigidez à
estrutura final do scaffold. A taxa de reticulação do glutaraldeído está dependente da sua
concentração, do pH e da temperatura [122]. Adicionaram-se pois diferentes quantidades
de glutaraldeído à composição (0,2%, 0,5%, 1%, 5% e 10%) de modo a estudar a
influência da concentração nas propriedades mecânicas, na morfologia e na resposta
celular.
O scaffold de quitosano resultante da liofilização de uma solução congelada de
quitosano em ácido acético é, na verdade, um sal de quitosano com iões de acetato
ligados quimicamente aos grupos amina que é bastante solúvel em água [111].
Macroscopicamente os scaffolds de quitosano apresentam uma estrutura flexível e
esponjosa. Nas imagens que se seguem (Figura 29), é possível observar a
microestrutura das matrizes de quitosano.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
61
Figura 29 - Micrografias de SEM de scaffolds de CH.
As micrografias de SEM revelam a existência de poros interconectados, com um
tamanho médio de poro situado entre 50 a 200 μm.
Na Figura 30 apresenta-se as micrografias dos scaffolds de CH com as diferentes
percentagens de reticulante.
a b
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
62
Quitosano +
0,2%GA
Quitosano +
0,5%GA
Quitosano +
1%GA
Quitosano +
5%GA
Quitosano +
10%GA
Figura 30 - - Micrografias de SEM dos scaffolds de quitosano com a adição de diferentes teores de
glutaraldeído e respectivos valores para o tamanho médio de poro: 0,2% (a, b); 0,5% (c, d); 1% (e, f); 5% (g, h) e 10%(i, j).
c d
e f
g h
i j
a b Øméd.= 120μm
Øméd.= 130μm
Øméd.= 135μm
Øméd.= 140 μm
Øméd.= 155 μm
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
63
Observa-se que a adição de glutaraldeído não altera significativamente a estrutura
de poros, mantendo-se a boa interconectividade dos mesmos. Relativamente à
porosidade, as micrografias revelam que o tamanho médio de poro não se altera
significativamente para os baixos teores de reticulante. Para o teor de 10%, o tamanho
médio de poro é claramente superior ao observado nos casos em que o teor de
glutaraldeído é inferior.
O comportamento mecânico das diferentes estruturas de quitosano foi avaliado
através de ensaios de compressão. A Figura 31 apresenta as diferentes curvas de
tensão-deformação obtidas.
Figura 31 - Comportamento mecânico dos scaffolds de quitosano com a adição de diferentes percentagens de glutaraldeído.
Pela análise da figura pode-se verificar que a adição de GA aumenta claramente a
resistência dos scaffolds à compressão. Pode verificar-se que para os scaffolds de
quitosano não reticulado se obtiveram valores de resistência à compressão de
aproximadamente 0,08 MPa para uma deformação de 50%. Este valor é comparável com
valores obtidos por Zhang et al. [123], os quais também produziram scaffolds de CH em
condições comparáveis às do presente trabalho (2% de CH em 0,2% de ácido acético),
os quais obtiveram valores de resistência à compressão na ordem dos 0,11 MPa para
uma deformação de 60%. Como reportado [42, 46], o glutaraldeído reage com o
quitosano, tornando a estrutura mais rígida e mecanicamente mais resistente. Através
das curvas de tensão-deformação apresentadas, verifica-se que à medida que se
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
64
aumenta a concentração de GA, os scaffolds vão exibindo melhores propriedades
mecânicas, o que indica uma intensificação de ligações entre o GA e o quitosano.
Scaffolds com 1, 5 e 10% de GA são os que suportam cargas maiores, a rondar os 0,19
MPa.
A partir das curvas tensão-deformação, calcularam-se os respectivos módulos de
Young para os diferentes scaffolds (Tabela 7). O módulo de Young corresponde à
inclinação inicial da curva, ou seja, ao declive da tangente à parte inicial da curva.
Tabela 7 - Módulos de Young dos scaffolds de quitosano com os diferentes teores de GA.
Scaffolds Módulo de Young (MPa)
CH 0,27
CH+0,2%GA 0,53
CH+0,5%GA 0,76
CH+1%GA 0,84
CH+5%GA 1,73
CH+10%GA 1,7
Como seria de esperar, através da observação das curvas de tensão-deformação
obtidas, verifica-se também um aumento progressivo do módulo de Young à medida que
se aumenta o teor do agente de reticulação, o que traduz uma rigidez cada vez maior por
parte dos scaffolds.
Quando se eleva a concentração de GA de 5% para 10%, não se verificam
diferenças significativas no módulo de Young, o que pode indicar que o grau de
reticulação desses scaffolds não se alterou substancialmente, maximizando-se a
reticulação com percentagens de GA a rondar os 5%.
Apesar das concentrações mais elevadas de GA serem as que conduzem às
melhores propriedades mecânicas, é fundamental que o GA não prejudique a
biocompatibilidade dos biomateriais reticulados.
Para estudar esse comportamento, submeteram-se, então, os scaffolds a ensaios
celulares de viabilidade e proliferação celular por forma a seleccionar as concentrações
mais indicadas para serem utilizadas na fabricação dos scaffolds.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
65
A viabilidade e a proliferação celular foram avaliadas através do método da
resazurina, definindo-se como controlo os scaffolds de quitosano sem adição de GA.
Na Figura 32 pode observar-se a actividade metabólica das culturas estabelecidas
nos diferentes scaffolds mantidas durante 1, 4 e 7 dias.
Figura 32 – Actividade metabólica das culturas estabelecidas nos diferentes scaffolds de quitosano sem e com as diferentes percentagens de GA, ensaio da resazurina. * Diferença estatisticamente
significativa comparativamente ao controlo (p<0,05).
Pode observar-se, através da análise da Figura 32, que o material controlo (scaffold
de CH sem GA) permite a adesão e proliferação das células ao longo do tempo, apesar
do valor obtido ao dia 1 ser significativamente inferior ao dos restantes scaffolds
avaliados.
A adição do glutaraldeído na composição dos scaffolds melhorou significativamente
o desempenho biológico relativamente ao controlo. Em todas as condições com GA
verificou-se uma melhor adesão celular, justificada pelo aumento dos valores da
actividade metabólica ao dia 1.
Nos scaffolds reticulados com uma baixa concentração de GA, verificou-se uma
evidente proliferação das células ao longo dos 7 dias de cultura, particularmente nos
scaffolds com 0,2% e 0,5% de GA. Para estes casos, sugere-se que a maioria dos
grupos funcionais do aldeído estão reticulados com a rede polimérica, não induzindo
efeitos citotóxicos [43, 124].
As estruturas com a concentração de 1% de GA apenas mantêm a viabilidade das
células, não havendo proliferação por parte das mesmas ao longo do tempo. No que diz
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Dia 1 Dia 4 Dia 7
Inte
nsid
ad
e d
e flu
ore
scê
ncia
Controlo (CH)
CH + 0.2% GA
CH + 0.5% GA
CH + 1% GA
CH + 5% GA
CH + 10% GA
*
* *
*
* * *
*
*
*
*
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
66
respeito às concentrações mais elevadas de GA (5% e 10%), verifica-se uma diminuição
progressiva do número de células ao longo dos dias de cultura, indiciando um baixo
desempenho biológico por parte destes scaffolds, possivelmente devido a um excesso de
dialdeídos livres, o que sugere que quantidades menores de GA favorecem o
desempenho biológico destes materiais.
Na Figura 33 apresentam-se as imagens obtidas por SEM das culturas celulares
na presença dos diferentes biomateriais. Não foi possível incluir imagens do material
controlo colonizado, uma vez que as suas propriedades mecânicas não permitiram a
manutenção da sua integridade durante o tempo de cultura.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
67
Dia 1 Dia 7
Figura 33 – Imagens de SEM das culturas celulares estabelecidas nos diferentes scaffolds em estudo.
Na avaliação por SEM verificou-se a adesão de um número considerável de
células em todos os scaffolds (1 dia de cultura), com morfologias bastante semelhantes
CH
+ 0
,2%
GA
C
H +
0,5
%G
A
CH
+ 1
0%
GA
C
H +
1%
GA
a b c
d e f
i h g
k j l
m n o
CH
+ 5
%G
A
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
68
entre si, ou seja, com forma arredondada e com reduzidos prolongamentos
citoplasmáticos.
Após uma semana de cultura, observa-se uma alteração no número e morfologia
celulares, nos scaffolds avaliados. Nas estruturas com 0,2%, 0,5% e 1% de GA verifica-
se a presença de um maior número de células. Os scaffolds de quitosano com 0,2% e
0,5% da GA apresentam as células com a morfologia mais alongada e exibem uma forma
achatada e com numerosas prolongações citoplasmáticas, que são características do
fenótipo desta população celular.
As estruturas com 5% e 10% de GA aos 7 dias de cultura apresentaram um
número reduzido de células, não se detectando diferenças significativas na sua
morfologia em relação ao primeiro dia, isto é, mantendo uma morfologia essencialmente
esférica.
Segundo a literatura, o espalhamento das células é geralmente dividido em três
principais níveis de interacção: (a) não espalhadas: as células apresentam ainda uma
forma esférica sem qualquer tipo de extensão da membrana plasmática, (b) parcialmente
distribuídas: nesta fase, as células começam a espalhar-se lentamente por um ou mais
lados, no entanto ainda há uma divergência nas extensões da membrana e (c) totalmente
espalhadas. O último modelo (c) representa o melhor resultado a nível do desempenho
biológico [124]. Na Figura 34 está representado um desenho esquemático da interacção
célula-substrato.
Figura 34 - Ilustração do processo de interacção célula/substrato: adesão, espalhamento e proliferação e imagem SEM que ilustra a morfologia típica das células MG-63. Adaptado de: [124].
Face a todos estes resultados, conclui-se que os scaffolds com as concentrações
de 0,2%, 0,5% e 1% de GA, apesar de não possuírem as melhores propriedades
mecânicas, são os que apresentam o melhor comportamento celular, em termos de
a b
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
69
proliferação e morfologia de célula. Comprova-se, assim, que uma concentração elevada
desde agente reticulante influencia negativamente o desempenho biológico.
Numa tentativa de optimizar a resistência mecânica dos scaffolds em questão,
aplicou-se um tratamento térmico durante o seu processo de fabrico por forma a avaliar
se ocorrem efectivamente alterações na reticulação e, consequentemente, na estrutura
final dos scaffolds.
Para tal, fabricaram-se scaffolds de quitosano com a concentração média de GA
(0,5%) e posteriormente submeteram-se estes scaffolds a um tratamento térmico a três
temperaturas diferentes (40º, 50º e 60ºC) durante 2 horas.
As diferenças microestruturais destes scaffolds estão evidenciadas nas
micrografias obtidas por SEM apresentadas na Figura 35.
Figura 35 - Micrografias obtidas por SEM dos scaffolds de quitosano com 0,5% de GA sem tratamento
e submetidos a tratamento térmico de 40°, 50° e 60°, durante 2 horas.
Verifica-se que todos os scaffolds apresentam poros bem definidos e interligados,
não se detectando alteração significativa da sua forma com o aumento da temperatura.
Na figura seguinte comparam-se graficamente as curvas de distribuição de
tamanho dos poro dos scaffolds sujeitos aos diferentes tratamentos térmicos.
Sem TT
50º
40º
60º
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
70
Figura 36 - Distribuição do tamanho de poros dos scaffolds de quitosano com 0,5% de GA após tratamento térmico de 40°C, 50°C e 60°C.
Pela análise da figura, é possível afirmar que os scaffolds com os diferentes
tratamentos térmicos apresentam uma elevada concentração de poros com o tamanho
correspondente a 110 µm. Com o tratamento térmico, a população de poros finos
aumenta e tendencionalmente verifica-se uma ligeira diminuição de tamanho de poro. A
menor porosidade foi obtida para os scaffolds tratados termicamente a 50ºC, seguida dos
scaffolds com tratamento térmico a 60°C e 40°C, respectivamente.
Na Figura 37 estão representadas as curvas de tensão-deformação que ilustram o
comportamento mecânico à compressão dos scaffolds tratados termicamente. Para
efeitos comparativos incluiu-se na mesma figura a curva relativa ao scaffold não tratado
termicamente.
0
10
20
30
40
50
60
0 200 400 600 800 1000
% d
e p
oro
s
Diâmetro do poro (µm)
40º
50º
60º
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
71
Figura 37 - Comportamento mecânico dos scaffolds de quitosano com 0.5% de GA submetidos a tratamento térmico de 40°, 50° e 60°.
Pela análise dos resultados, observa-se genericamente uma melhoria do
comportamento mecânico dos scaffolds com o tratamento térmico, o que sugere que o
tratamento térmico influencia positivamente a reticulação do quitosano.
As alterações na estrutura do quitosano induzidas pelo calor também foram
observadas por Lim et al. [125], os quais produziram filmes de quitosano reticulado com
GA e observaram alterações nas características dos filmes, apresentando uma
resistência melhorada atribuída a uma maior formação de ligações entre quitosano e
glutaraldeído.
A partir das curvas tensão-deformação, calcularam-se os módulos de Young dos
diferentes scaffolds (Tabela 8).
Tabela 8 - Módulos de Young dos diferentes scaffolds tratados termicamente.
Scaffolds Módulo de Young (MPa)
CH+0,5%GA 0,76
CH+0,5%GA+ TT 40ºC 0,79
CH+0,5%GA+ TT 50ºC 1,66
CH+0,5%GA+ TT 60ºC 0,95
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0% 10% 20% 30% 40% 50%
Ten
são
(M
Pa)
Deformação
40º
50º
60º
Sem TT
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
72
A temperatura a que se obtiveram os maiores valores de módulo de Young foi a de
50°C. Estes resultados estão de acordo com curva de distribuição de tamanho de poro
deste scaffold que, comparativamente com as dos restantes, reflecte uma distribuição de
tamanhos mais estreita, com menor contribuição de poros largos, o que beneficia as
propriedades mecânicas do scaffold.
Face a estes resultados a temperatura de tratamento térmico escolhida para aplicar
aos scaffolds reforçados com os grânulos foi a de 50°C.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
73
4.3 Caracterização das membranas compósitas
Para avaliar o comportamento de superfície dos scaffolds compósitos, prepararam-
se membranas com composições idênticas à dos scaffolds (quitosano + reticulante +
grânulos). No seguimento dos resultados obtidos nos ensaios citotóxicos, que
evidenciaram que a resposta celular mais adequada foi obtida para os scaffolds com
0,2% e 0,5% de GA, escolheram-se as concentrações de 0,2% e de 0,5% de reticulante
para a preparação das membranas. Estas foram caracterizadas quanto à sua rugosidade
e molhabilidade.
Na Tabela 9 apresentam-se as diferentes composições das membranas preparadas
bem como a sua identificação.
Tabela 9 – Composição das membranas e respectiva designação.
Membranas CH Grânulos Glutaraldeído
HAp Bifásicos Β-TCP 0,2% 0,5%
Quitosano (CH)
CH + 0,2%GA
CH + 0,5%GA
CH+ HAp
CH+ B-TCP
CH+ Bifásicos
CH+ HAp + 0,2%GA
CH+ HAp + 0,5%GA
CH+ Bifásicos + 0,2%GA
CH+ Bifásicos + 0,5%GA
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
74
4.3.1 Rugosidade
A rugosidade das superfícies é outro parâmetro que tem elevada influência na
biocompatibilidade pois pode alterar a força de adesão das células à superfície e
modificar a conexão entre as mesmas [126].
Através de um profilómetro foi possível medir a rugosidade média das membranas
preparadas. Na Tabela 10 encontram-se registados os respectivos valores para as
diferentes membranas.
Tabela 10- Valores médios das medições das rugosidades, Ra, das diferentes membranas.
Membrana Ra (µm)
Quitosano 1,5 0,6
Quitosano+ 0,2%GA 2,0 0,5
Quitosano+ 0,5%GA 2,9 0,6
Quitosano + HAp >8,0
Quitosano + Bifásicos >8,0
Quitosano + β-TCP >8,0
Quitosano+ HAp+ 0,2%GA 3,6 1,2
Quitosano+HAp+0,5%GA 4,5 1,3
Quitosano+ Bifásicos+
0,2%GA 4,3 1,2
Quitosano+ Bifásicos+
0,5%GA 5,1 2,1
Através da tabela é possível constatar que todas as membranas produzidas
apresentam valores de rugosidade na microescala. As membranas de quitosano são as
que apresentam a rugosidade menor, atingindo uma rugosidade média de
aproximadamente 1,5 µm. Na Figura 38 é possível observar a morfologia da membrana
de quitosano.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
75
Figura 38 - Micrografia obtida por SEM da membrana de quitosano.
Através da imagem obtida por SEM da membrana de quitosano, é possível
observar a superfície praticamente plana e uniforme, com aproximadamente 40 µm de
espessura.
Com a incorporação do glutaraldeído na composição, verifica-se um aumento
gradual da rugosidade, aumentando quase para o dobro no caso da membrana com
0,5% de GA. Quando se adiciona o GA, este inicia de imediato a reticulação
estabelecendo ligações entre cadeias. A solução fica mais viscosa dificultando o seu
espalhamento na lamela, obtendo-se assim membranas mais espessas e com uma
superfície menos uniforme, o que pode explicar estes resultados. Na Figura 39 estão
representadas as micrografias obtidas por SEM das membranas de quitosano com 0,2%
e 0,5% de glutaraldeído.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
76
Figura 39 – Imagens de SEM da secção transversal das membranas de quitosano com (a) 0.2%GA e
(b) 0,5%GA. A imagem (c) representa a superfície da membrana de CH+0,5%GA.
As membranas representadas apresentam uma estrutura densa, sendo possível
observar que a espessura aumenta com o aumento da percentagem de GA, rondando os
valores médios de 60 µm e 100 µm de espessura para 0,2% e 0,5% de GA
respectivamente.
Como se pode comprovar também através da Figura 39 (c), é notória a presença de
pequenas irregularidades na superfície da membrana de CH com 0,5% de GA,
aumentando para 2,9 µm a rugosidade média da membrana.
Quando se incorporam grânulos nas membranas é de esperar que a rugosidade
das suas superfícies aumente, uma vez que estes ficam dispersos por toda a membrana
(ver Figura 40). Não foi possível medir a rugosidade das membranas de quitosano que
continham apenas os grânulos uma vez que estas excediam o limite máximo de
rugosidade admitido. No entanto, foi possível observar a sua morfologia através das
imagens obtidas por SEM, apresentadas na Figura 40.
a b
c
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
77
Figura 40 - Imagens SEM da superfície e da secção transversal das membranas de quitosano com grânulos bifásicos (a) e (c) e de HAp (b) e (d). As imagens (e) e (f) correspondem a um pormenor de um aglomerado da membrana de HAp.
Através da Figura 40 (a), (b), (c) e (d) é possível observar o perfil rugoso das
membranas com grânulos de HAp e Bifásicos, verificando-se que esta última apresenta
c d
e
f
a b
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
78
uma maior rugosidade à superfície, com imensos agregados irregulares, maiores do que
os da membrana com HAp. Na Figura 40 (e) e (f) é possível observar
pormenorizadamente a morfologia e a constituição desses aglomerados.
Os grânulos bifásicos, como já caracterizados anteriormente, apresentam um
tamanho menor e uma superfície mais irregular comparativamente com os grânulos de
HAp. O seu reduzido tamanho faz com que estes apresentem uma maior energia de
superfície, tornando-os mais propícios à agregação; por isso, quando aplicados nestas
membranas induzem maiores valores de rugosidade.
Quando se introduz GA e grânulos em simultâneo nas membranas, os valores da
sua rugosidade diminuem, pelo que já são possíveis as medições com o profilómetro.
Essa diminuição da rugosidade pode atribuir-se, possivelmente, à reticulação do
quitosano que, envolvendo a matriz em redor dos grânulos, contribui para a formação de
uma estrutura mais densa e menos susceptível a irregularidades na superfície.
4.3.2 Molhabilidade
Fabricaram-se membranas de quitosano reticulado, de quitosano com grânulos e
de quitosano com a adição conjunta de grânulos e GA. Pretendeu-se avaliar a influência
do reticulante (para tal utilizaram-se concentrações de 0,2% e de 0,5% de glutaraldeido)
na molhabilidade bem como a dos grânulos de HAp, dos grânulos bifásicos e do β-TCP.
Esta última membrana apenas foi preparada para validar a possível influência do β-TCP
na composição dos grânulos bifásicos.
Avaliou-se também o comportamento das membranas de quitosano com a adição
conjunta de grânulos (HAp e Bifásicos) e glutaraldeído (0,2% e 0,5%). Os resultados
obtidos das medições dos ângulos de contacto das diferentes membranas apresentam-se
na Tabela 11.
Tabela 11 - Ângulo de contacto médio medido das diferentes membranas.
Quitosano + Agente Reticulante (GA) Quitosano + Grânulos de CaP Quitosano + GA + Grânulos de CaP
Membrana Ângulo de contacto médio Membrana Ângulo de contacto médio Membrana Ângulo de contacto médio
Quitosano
Quitosano +
HAp
Quitosano +
HAp +
0,2%GA
Quitosano +
0,2%GA
Quitosano +
Bifásicos
Quitosano +
HAp +
0,5%GA
Quitosano +
0,5%GA
Quitosano +
β-TCP
Quitosano +
Bifásicos +
0,2%GA
Quitosano +
Bifásicos +
0,5%GA
79° ± 1,6
92° ± 6,2
105° ± 3,1
102° ± 4,4
107° ± 4,5
108° ± 4,9
78° ± 4,0
93° ± 3,3
89° ± 6,6
95° ± 5,0
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
80
Observa-se que as membranas de quitosano possuem valores de ângulos de
contacto inferiores a 90°, sendo por isso consideradas hidrofílicas. Do ponto de vista da
reactividade química, o quitosano apresenta propriedades hidrofílicas devido à presença
de grupos reactivos amino e hidroxilo na sua estrutura [42].
A literatura relata uma série valores de ângulos de contacto para membranas de
quitosano puro que vão de 60º a 83º. Estes valores dependem da pureza do material
percursor e da rugosidade final da membrana [127]. No trabalho de Wanichapichart et al.
[128] membranas de quitosano puro com rugosidades à nanoescala apresentaram um
ângulo de contacto em torno de 65º. Este valor é inferior ao obtido no presente estudo
(79º), o que pode dever-se às diferenças do grau de acetilação do quitosano utilizado,
bem como aos valores superiores de rugosidade (à escala micrométrica) das membranas
produzidas neste trabalho.
O comportamento das membranas de quitosano com reticulante adicionado pode
ser considerado hidrofóbico uma vez que possuem valores de ângulos de contacto
superiores a 90°, com um aumento de 12° e 25° para adições de 0,2% e 0,5% de GA em
comparação com membrana de quitosano. Por conseguinte, a adição do agente de
reticulação além de alterar a estrutura dos scaffolds, como já anteriormente referido,
altera também a molhabilidade, observando-se uma diminuição da hidrofilicidade da
superfície com o aumento da percentagem de GA.
Este comportamento está de acordo com resultados obtidos por outros autores,
segundo os quais o glutaraldeído diminui a capacidade do quitosano formar ligações de
hidrogénio com moléculas de água uma vez que os grupos amina do quitosano ficam
imobilizados com a acção da reticulação, tornando as membranas mais hidrofóbicas [43,
129]. É assim possível afirmar que à medida que se aumenta a concentração de GA, as
superfícies tornam-se progressivamente mais hidrofóbicas, sugerindo que para
concentrações superiores a 0,5% os valores dos ângulos de contacto sejam superiores a
105°.
A partir da Tabela 11 é também possível constatar que a introdução de grânulos
na matriz de quitosano induz uma alteração significativa na molhabilidade da membrana,
ocasionando a diminuição da sua hidrofilicidade. Quando se incorporam grânulos
bifásicos nas membranas de quitosano verifica-se um ligeiro aumento da hidrofobicidade
da superfície quando comparadas com as membranas de HAp. Esses resultados foram
validados com a medição dos ângulos de contacto em membranas com grânulos de β-
TCP, verificando-se um aumento do valor médio do ângulo de contacto para 108°.
Conclui-se deste modo que a membrana de HAp, apesar de apresentar um ângulo de
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
81
contacto médio superior a 90°, é a que apresenta valores de hidrofobicidade mais baixos,
se comparada com as membranas com grânulos bifásicos e com β-TCP.
Observando a Tabela 11 novamente, observa-se que a incorporação conjunta de
grânulos e de glutaraldeído é menos penalizante para o ângulo de contacto do que a
adição isolada de cada um dos componentes (GA ou grânulos).
A adição de um componente estranho (o grânulo) à membrana de CH com
glutaraldeído perturba a reticulação uma vez que o grupo –NH2 do quitosano e o grupo -
COOH do GA deixarão de interacionar regularmente devido à presença dos grânulos
dispersos na matriz que dificultam a ligação desses mesmos grupos. Com uma menor
reticulação é de esperar que as superfícies da membrana apresentem propriedades mais
hidrofílicas (comparativamente às membranas reticuladas) devido a uma maior presença
de grupos –NH2 livres à superfície. Por outro lado deve referir-se que estas membranas
apresentam uma rugosidade média inferior à das membranas com grânulos, não
reticuladas. Daub et al. [130] fizeram estudos de molhabilidade em superfícies
quimicamente equivalentes mas com diferentes rugosidades e observaram que, para
superfícies mais hidrofóbicas, o aumento da rugosidade se traduziu num aumento do
ângulo de contacto, ou seja, no aumento da hidrofobicidade da superfície. Os presentes
resultados estão em linha com este comportamento pois a diminuição da rugosidade das
membranas com grânulos induzida pela reticulação fez-se acompanhar de uma
diminuição da hidrofobicidade das mesmas.
A Figura 41 ilustra as curvas de tendência (ou seja, a curva média obtida a partir
das sete medições efectuadas para cada membrana) da variação do comportamento
hidrofóbico/hidrofílico da membrana de quitosano e das membranas com a composição
semelhante aos scaffolds compósitos. A avaliação ao longo do tempo é fundamental
quando, por exemplo, se pretende caracterizar biomateriais uma vez que estes, quando
implantados, serão envolvidos permanentemente por fluídos corporais, o que é o caso. É
importante que estes assumam um comportamento hidrofílico, uma vez que, como
reportado anteriormente, as proteínas e as células tendem a ligar-se a superfícies
hidrofílicas.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
82
Figura 41 - Curvas tendência das medições do ângulo de contacto ao longo do tempo para as diferentes membranas.
Através deste gráfico é possível concluir que as membranas tendem a adquirir um
comportamento hidrofílico ao longo do tempo, verificando-se uma diminuição progressiva
do ângulo de contacto. Segundo a literatura, esta diminuição do ângulo deve-se à
acomodação da gota na superfície das membranas [131].
Estes resultados indicam que a gota de água interage com as membranas através
dos grupos hidroxilo e anima do quitosano, espalhando-se gradualmente pela superfície.
Quanto mais grupos livres existirem na superfície da membrana, mais interacções
ocorrerão entre a água e esses grupos [132]. Com a adição conjunta do agente
reticulante e dos grânulos, existirão menos grupos disponíveis à superfície, o que se
traduz numa menor interacção água-superfície comparativamente com a situação da
membrana de quitosano puro.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
83
4.4 Caracterização dos scaffolds compósitos
Na Tabela 12 apresentam-se as condições de preparação e composição dos vários
tipos de scaffolds compósitos e a respectiva designação.
Tabela 12 - Descrição dos scaffolds e dos materiais utilizados no respectivo fabrico.
Scaffolds CH Grânulos GA Tratamento
térmico HAp Bifásicos 0,2% 0,5% 1%
HAp + 0,2% GA
HAp + 0,5% GA
HAp + 1% GA
HAp + Tratamento
térmico
Bifásicos + 0,2% GA
Bifásicos + 0,5% GA
Bifásicos + 1% GA
Bifásicos +
Tratamento térmico
Na Figura 42 apresentam-se as microestruturas dos diferentes tipos de scaffolds de
HAp.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
84
Figura 42 - Micrografias obtidas por SEM dos scaffolds de HAp com: a), b), c) 0,2% de GA, d), e), f)
0,5% de GA, g) h), i) 1% de GA e j), k), l) com tratamento térmico, com os respectivos valores do tamanho médio de poro.
Da análise das figuras pode verificar-se a presença de uma estrutura com poros
bem organizados e definidos, observando-se uma boa conexão entre eles, o que pode
constituir um factor com influência positiva na taxa de deposição óssea. É ainda possível
constatar que os grânulos se encontram distribuídos de uma forma uniforme nas paredes
dos poros, verificando-se um aumento da espessura das paredes. Pode observar-se,
também, que os grânulos mantêm a sua morfologia quando inseridos nos scaffolds como
se pode verificar na Figura 42 c), f) i) e l).
No que se refere ao tamanho de poros, verifica-se uma ligeira redução de
tamanho à medida que se aumenta a concentração de glutaraldeído. Com o tratamento
térmico, há um ligeiro aumento do tamanho de poro em relação aos scaffolds sem
tratamento.
HA
p +
0,2
%G
A
HA
p +
0,5
%G
A
HA
p +
1%
GA
H
Ap
+ T
T
a b c
d e f
g h i
j k l
Øméd.= 230μm
Øméd.= 185μm
Øméd.= 155μm
Øméd.= 250 μm
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
85
O comportamento mecânico dos scaffolds compósitos com grânulos de HAp nos
ensaios de compressão está ilustrado na Figura 43 através das respectivas curvas de
tensão-deformação.
Figura 43 - Comportamento mecânico dos diferentes scaffolds de HAp.
Como se verificou anteriormente e como se comprova com estes resultados, à
medida que se aumenta a percentagem de glutaraldeído, verifica-se uma melhoria das
propriedades mecânicas dos scaffolds devido à sua acção reticulante sobre o quitosano;
da mesma forma o tratamento térmico também ajuda na reticulação, verificando-se
também melhorias significativas comparativamente com mesmo scaffold sem o
tratamento (HAp+0,5%GA).
Na Tabela 13 estão apresentados os valores dos módulos de Young calculados a
partir das curvas de tensão-deformação para os diferentes scaffolds de HAp.
Ten
são
(M
Pa)
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
86
Tabela 13 - Módulos de Young dos diferentes scaffolds de HAp.
Scaffolds Módulo de Young (MPa)
HAp+0,2%GA 0,35
HAp+0,5%GA 0,53
HAp+1%GA 1,28
HAp+ TT (0,5%GA) 1,72
Os valores obtidos revelam o aumento do módulo de Young com o aumento do
teor de reticulante. Os scaffolds de HAp com 0,2% e 0,5% de GA apresentam valores
inferiores às matrizes reticuladas com as mesmas concentrações de GA (Tabela 7).
Estes resultados devem-se à dificuldade do quitosano em reticular na presença dos
grânulos, o que diminui consideravelmente as propriedades mecânicas das estruturas. O
défice de reticulação apenas é compensado com o aumento de concentração de GA ou
com a aplicação do tratamento térmico aos scaffolds. Para estes casos, os scaffolds com
grânulos incorporados apresentam módulos de Young superiores comparativamente aos
mesmos sem os grânulos (Tabela 7). Os grânulos distribuem-se pelas paredes dos poros
do scaffold, tornando-as mais espessas, tornando a estrutura mais resistente.
Na Figura 44 apresentam-se as micrografias obtidas por SEM dos diferentes
scaffolds com grânulos bifásicos.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
87
Figura 44 - Micrografias obtidas por SEM dos scaffolds bifásicos com: a), b), c) 0,2% de GA, d), e), f) 0,5% de GA, g) h), i) 1% de GA e j), k), l) com tratamento térmico, com os respectivos valores médios
para o tamanho de poro.
Os scaffolds com grânulos bifásicos de HAp e β-TCP [50:50] incorporados
apresentam uma microestrutura idêntica ao nível da estrutura de poro quando
comparados com os mesmos com grânulos de HAp. A morfologia dos grânulos bifásicos
também não se altera após todos os processos de fabrico dos presentes scaffolds.
O tamanho de poros deste tipo de scaffolds exibe uma gama idêntica à dos
scaffolds de HAp, com um tamanho médio a rondar também os 200 µm. Os valores
obtidos de ambos os tipos de scaffolds apresentam o tamanho considerado apropriado
para promover o bom desempenho das células osteoblásticas, que está referenciado na
gama dos 100-350 µm [81].
Bif.+
0,2
%G
A
Bif.+
0,5
%G
A
Bif.+
1%
GA
B
if.+
TT
a b c
d e f
g h i
j k l Øméd.= 220 μm
Øméd.= 175μm
Øméd.= 210μm
Øméd.= 220μm
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
88
Quando se aplica o tratamento térmico a estes scaffolds, verifica-se um tamanho
médio de poros inferior ao dos de HAp sujeitos ao mesmo tratamento, passando de 250
µm para 215 µm.
Na figura seguinte estão representadas as curvas de tensão-deformação dos
scaffolds bifásicos referentes aos ensaios de compressão a que foram sujeitos.
Figura 45 - Comportamento mecânico dos diferentes scaffolds bifásicos.
Pela análise das curvas da Figura 45 pode confirmar-se que as propriedades
mecânicas são melhoradas com o aumento progressivo da concentração de glutaraldeído
na composição dos scaffolds, bem como com a aplicação do tratamento térmico.
Na Tabela 14 estão apresentados os valores dos módulos de Young calculados a
partir das curvas de tensão-deformação para os diferentes scaffolds com HAp.
Tabela 14 - Módulos de Young dos diferentes scaffolds com grânulos bifásicos.
Scaffolds Módulo de Young (MPa)
Bif.+0,2% GA 0,32
Bif.+0,5% GA 0,52
Bif.+1% GA 1,42
Bif.+ TT 3,43
Ten
são
(M
Pa)
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
89
Verifica-se que a introdução de β-TCP nos grânulos faz melhorar
significativamente o comportamento mecânico das estruturas com glutaraldeído acima
dos 0,5% (comparativamente aos scaffolds de HAp), em que, por exemplo, se regista um
aumento do módulo de Young de 1,28 MPa (scaffolds de HAp com 1% GA) para 1,42
MPa (scaffolds bifásicos com 1% GA).
Para baixas concentrações de GA, verifica-se a mesma situação dos scaffolds
com HAp, em que se verifica um módulo de Young inferior comparativamente às matrizes
de CH reticuladas com as mesmas concentrações (0,2 e 0,5% de GA).
O tratamento térmico aplicado a este tipo de scaffolds torna a estrutura mais
resistente comparativamente a todos os outros produzidos, exibindo um módulo de
Young de 3,43 MPa.
Em conclusão, as propriedades mecânicas dos scaffolds compósitos (quitosano
reticulado + grânulos) obtidas no presente trabalho apresentaram-se inferiores às
referidas para o osso esponjoso apresentadas na Tabela 1, nomeadamente entre 2 a 12
MPa para a resistência à compressão e 0,1 a 2 GPA para o módulo de Young. No
entanto, os valores medidos são semelhantes aos reportados na literatura,
particularmente para scaffolds preparados por métodos idênticos aos utilizados neste
trabalho. Por exemplo, Zhang et al. [41] produziram scaffolds de CH reforçados com β-
TCP com uma razão mássica de CH/ β-TCP de [50/50] e obtiveram valores de resistência
à compressão de 2,191 MPa. Este valor encontra-se situado na gama de valores das
resistência à compressão obtidas pelos scaffolds com grânulos bifásicos de HAp e β-TCP
[50:50].
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
90
4.3. Citocompatibilidade dos scaffolds compósitos
Feitas todas as caracterizações a nível da morfologia e propriedades mecânicas
aos scaffolds compósitos com os grânulos, avaliou-se então o seu desempenho biológico
quando cultivados com células osteoblásticas.
Realizou-se, inicialmente, o teste da resazurina para avaliar a viabilidade e
proliferação celular, tendo sido utilizado como controlo scaffolds de quitosano com 0,5%
de GA. A Figura 46 apresenta os resultados obtidos aos dias 1, 4 e 7.
Figura 46 - Comportamento dos diferentes scaffolds de HAp e bifásicos face à presença de células através do ensaio de viabilidade celular - resazurina. * Diferença estatisticamente significativa
comparativamente ao controlo (p<0.05).
Ao analisar a figura, verifica-se que o comportamento biológico é melhorado com a
adição dos grânulos de CaP. Ao primeiro dia da experiência verifica-se um aumento
significativo da actividade metabólica das culturas estabelecidas nos scaffolds de HAp +
0,2%GA e BIf + 0,2%GA, comparativamente com o controlo e com os restantes scaffolds.
Ao 4º dia, verifica-se que as células mantêm a sua viabilidade em todos os materiais,
dando-se um aumento significativo da viabilidade/proliferação celular nos scaffolds de
HAp e Bifásicos com as menores concentrações de GA, ou seja 0,2% e 0,5%. Ao 7º dia
verifica-se um aumento da redução da resazurina, destacando-se, pelo aumento
significativo, os scaffolds com 0,2% de GA, quer para HAp quer para os bifásicos.
Outro ensaio realizado neste estudo de biocompatibilidade foi a determinação da
actividade da fosfatase alcalina (ALP). Tratando-se estes scaffolds de potenciais
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Dia 1 Dia 4 Dia 7
Inte
nsid
ade d
a f
luore
scência
Controlo
HAp+0.2%GA
HAp+0.5% GA
HAp+1%GA
HAp + TT
Bif + 0.2% GA
Bif+0.5%GA
Bif+1%GA
Bif+TT
*
*
*
*
*
*
*
* * *
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
91
estruturas para aplicação em engenharia de tecido ósseo, é interessante determinar a
actividade da ALP, uma vez que se trata de uma enzima presente em elevada
concentração no tecido ósseo, essencialmente secretada pelos osteoblastos, exibindo
funções essenciais na formação do osso. Posto isto, avaliou-se a actividade da ALP das
culturas em que estão presentes os diferentes scaffolds aos dias 4 e 7. Os resultados
obtidos estão representados graficamente na Figura 47, apresentando-se estes em
percentagem relativamente ao controlo (scaffolds de quitosano com 0,5% de GA), ou
seja, quer para o dia 4 quer para o dia 7, o controlo corresponde a 100% e as restantes
condições são variações relativamente a esse valor.
Figura 47 - Actividade da fosfatase alcalina das culturas estabelecidas nos diferentes scaffolds de HAp e bifásicos. Todos os resultados estão apresentados em percentagem relativamente o controlo,
correspondendo este a 100% quer para o dia 4 quer para o dia 7. * Diferença estatisticamente significativa comparativamente ao controlo (p<0.05).
Através desta caracterização é possível verificar que a actividade da ALP
aumenta de forma significativa na condição de Bif+ 0,2%GA, ao dia 4 e dia 7, verificando-
se também um aumento da expressão desta enzima ao dia 7 para os scaffolds de HAp +
0,2% de GA.
Estes resultados sugerem que os scaffolds com menor concentração de GA
(0,2%) parecem induzir um aumento da expressão fenotípica desta população
osteoblástica, particularmente os scaffolds Bif+0,2%GA, em que se verifica um aumento
significativo da expressão da enzima ao dia 4 e 7 de cultura.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Dia 4 Dia 7
Perc
enta
gem
(%
)
Controlo
HAp+0.2%GA
HAp+0.5% GA
HAp+1%GA
HAp + TT
Bif + 0.2% GA
Bif+0.5%GA
Bif+1%GA
Bif+TT
* * *
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
92
Na Figura 48 é possível observar o comportamento (morfologia e adesão) celular
das culturas estabelecidas nos scaffolds de HAp com 0,2%GA ao final dos 7 dias de
experiência.
Figura 48 - Imagens SEM da cultura celular presente nos scaffolds de HAp com 0,2%GA ao final de 1 dia de experiência.
As células exibem uma boa adesão ao scaffold ao final de 7 dias, verificando-se a
existência de agregados celulares (sinal de proliferação activa no material), apresentando
a sua morfologia de acordo com as características do fenótipo desta população celular,
ou seja, com a sua forma bem achatada e com elevado número de prolongamentos
citoplasmáticos.
Na Figura 49, apresentam-se micrografias obtidas por SEM das culturas celulares
estabelecidas nos scaffolds bifásicos com 0,2% de GA, ao dia 1 e 7 de cultura.
a b
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
93
Figura 49 - Imagens SEM da cultura celular presente nos scaffolds bifásicos com 0,2%GA ao final de 1
dia (a, b) e 7 dias (c, d) de experiência.
Como se pode verificar, encontra-se um número elevado de células aderidas à
superfície do scaffold ao final do primeiro dia, apresentando estas uma forma
arredondada com pequenos alongamentos do citoplasma. Por sua vez, aos 7 dias, a
morfologia das células é alterada, verificando-se um alongamento das células pela
superfície, demonstrando uma boa adesão por parte destas ao material.
A Tabela 15 apresenta um quadro resumo das características dos scaffolds
compósitos avaliados biologicamente, designadamente das suas características de
superfície, microestruturais e de comportamento mecânico.
a
c d
b
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
94
Tabela 15 - Quadro resumo de todos os resultados obtidos na caracterização dos scaffolds e das membranas compósitos(as).
Scaffolds/ Membranas Compósitos(as)
HAp Bifásicos
0,2% GA
0,5% GA
1% GA
0,5% GA + TT
0,2% GA
0,5% GA
1% GA
0,5% GA + TT
Tamanho médio dos
poros (µm) 184 155 227 252 218 175 209 217
Módulo de Young (MPa)
0,35 0,53 1,28 1,72 0,32 0,52 1,42 3,43
Resistência à compressão
0,14 0,16 0,17 0,22 0,13 0,15 0,2 0,41
Molhabilidade – Ângulos de Contacto
78° 93° - - 89° 95° - -
Rugosidade (µm) 3,6 4,5 - - 4,3 5,1 - -
Os resultados obtidos permitem assim concluir que:
- Os scaffolds com grânulos de HAp ou grânulos bifásicos, com a percentagem de 0,2%
de reticulante, destacam-se entre os demais no que se refere ao desempenho biológico,
ao passo que o pior desempenho foi registado para os scaffolds com 1% de
glutaraldeído. Estes factos indiciam que a característica mais impactante na resposta
celular é, no caso dos presentes scaffolds, a concentração de reticulante: quanto menor,
melhor é a resposta celular.
- Embora as membranas compósitas com grânulos bifásicos tivessem evidenciado uma
hidrofobicidade superior à das membranas com hidroxiapatite, tal diferença não se
verifica de forma significativa no comportamento biológico dos scaffolds correspondentes.
-Apesar das propriedades mecânicas melhoradas que foram evidenciadas pelos scaffolds
sujeitos a tratamento térmico, a resposta biológica destes não foi a mais interessante. Tal
facto deve reflectir a relativamente elevada concentração de reticulante (0,5%).
Me
mb
rana
s
Sca
ffo
lds
95
Capítulo 5
Conclusões e Futuros Desenvolvimentos
96
Capítulo 5 – Conclusões e Futuros desenvolvimentos
97
5. Conclusões e Futuros Desenvolvimentos
Com o presente trabalho foi possível obter scaffolds compósitos de quitosano e
grânulos de fosfato de cálcio para aplicações na regeneração óssea, com o principal
objectivo de estudar o impacto de diversas características desses scaffolds na resposta
celular. Avaliou-se o impacto da porosidade, hidrofilicidade, rugosidade e propriedades
mecânicas em culturas celulares da linhagem MG-63 a nível da sua viabilidade,
proliferação, adesão, morfologia e nível da actividade da fosfatase alcalina.
O estudo contemplou as seguintes etapas: (1) produção e caracterização de
grânulos de HAp e de misturas bifásicas por atomização de suspensões; (2) produção de
scaffolds compósitos de quitosano com variações na sua reticulação e grânulos de CaP
por congelamento e liofilização, com respectiva caracterização morfológica (SEM) e
comportamento mecânico; (3) preparação de membranas com as mesmas composições
dos scaffolds por forma a avaliar parâmetros da sua superfície, designadamente
molhabilidade (ângulos de contacto) e rugosidade; (4) avaliação da resposta celular aos
scaffolds produzidos, nomeadamente a viabilidade e proliferação celular através do
método da resazurina, a adesão e morfologia celular através da observação de
micrografias obtidas por SEM e a actividade enzimática da fosfatase alcalina
(ALP/Proteína).
Na etapa de produção e caracterização de grânulos de CaP, obtiveram-se grânulos
atomizados com tamanho micrométrico, tendo-se evidenciado uma ligeira aglomeração
das partículas iniciais com perda de área superfícial específica. Os grânulos apresentam
forma esférica no caso da HAp e uma forma mais irregular com a incorporação do β-TCP
na composição do grânulo (grânulos bifásicos). A cristalinidade dos CaP não foi alterada
com o processo de atomização.
O estudo da resposta celular às matrizes de quitosano reticuladas com diferentes
teores de GA evidenciou que as concentrações mais baixas de GA (0,2%, 0,5% e 1%)
são as que apresentam um melhor desempenho biológico, diminuindo este com o
aumento progressivo de reticulante.
Verificou-se, também, que a aplicação de um tratamento térmico durante o
processo de fabrico dos scaffolds resulta num desempenho mecânico melhorado o que
indicia uma optimização da reticulação sob tratamento térmico.
Capítulo 5 – Conclusões e Futuros desenvolvimentos
98
As medições da rugosidade indicam irregularidades micrométricas na superfície das
membranas compósitas, na gama dos 1,5 a 5,1 μm, irregularidades estas que aumentam
notoriamente com a introdução dos grânulos.
As medidas dos ângulos de contacto das membranas revelaram superfícies mais
ou menos hidrofóbicas dependendo da composição da membrana. Verificou-se uma
diminuição da hidrofilicidade das membranas de quitosano com o aumento da
percentagem de reticulante. Membranas de CH e grânulos na constituição evidenciaram
ser superfícies hidrofóbicas, possivelmente reflectindo a influência de outras propriedades
de superfície como é o caso da rugosidade. A incorporação de β-TCP indiciou uma maior
hidrofobicidade da superfície. A reticulação das matrizes compósitas traduziu-se numa
diminuição da hidrofobicidade e da rugosidade quando comparadas com as membranas
equivalentes não reticuladas.
No que se refere ao desempenho biológico dos scaffolds compósitos, observou-se
que independentemente da composição dos seus grânulos (HAp ou grânulos bifásicos),
os scaffolds com 0,2% de reticulante, são os que se destacam em termos de
desempenho biológico ao passo que os scaffolds com 1% de glutaraldeído apresentam o
pior desempenho. Estes factos indiciam que a característica mais impactante na resposta
celular é a concentração de reticulante. Embora as membranas compósitas com grânulos
bifásicos tivessem evidenciado uma hidrofobicidade superior à das membranas com
hidroxiapatite, tal diferença não se reflectiu de forma significativa no comportamento
biológico dos scaffolds correspondentes. Apesar das propriedades mecânicas
melhoradas que foram evidenciadas pelos scaffolds sujeitos a tratamento térmico, a
resposta biológica destes scaffolds não foi a mais interessante. Tal facto reflecte a
relativamente elevada concentração de reticulante (0,5%).
Pode assim concluir-se que as células têm preferência por matrizes reticuladas com
baixa concentração de reticulante.
Pode pois afirmar-se que os scaffolds produzidos no presente trabalho, quer os de
HAp quer os bifásicos com baixas concentrações de GA, demonstraram evidências de
propriedades e de desempenho biológico que os apontam como as estruturas mais
promissoras para aplicação em ET ósseo.
Capítulo 5 – Conclusões e Futuros desenvolvimentos
99
Trabalho futuro
Os resultados obtidos no presente trabalho remeteram a algumas sugestões para a
continuação deste trabalho, bem como ao aprofundamento de certos aspectos no sentido
de clarificar certos resultados. Deste modo sugere-se:
Avaliar pormenorizadamente todos os parâmetros que influenciam a reticulação,
optimizando esta de forma a que concentrações baixas de GA reticulem o máximo
de quitosano.
Aplicar um tratamento aos scaffolds de remoção do glutaraldeído que não foi
utilizado na reticulação por forma a aumentar o desempenho biológico.
Estudar as propriedades mecânicas dos scaffolds com estes submersos num
líquido simulador corporal, uma vez que se observam diferenças significativas nas
propriedades mecânicas ao mergulhar os scaffolds num fluido.
Prosseguir com mais caracterizações a nível biológico, como por exemplo avaliar
a expressão de genes característicos do fenótipo osteoblástico através de
metodologias de rt-PCR.
Investigar a possibilidade de incorporar outro tipo de biomaterial na composição,
capaz de elevar as propriedades a nível mecânico sem alterar consideravelmente
a arquitectura e superfície dos scaffolds.
Testar os scaffolds in vivo em animais de experimentação.
Referências
100
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